Colossoma macropomum - PPGCF
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Colossoma macropomum - PPGCF
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PARA APLICAÇÃO EM SANIDADE DE TAMBAQUIS AMAZÔNICOS (Colossoma macropomum) ANA CAROLINA DA SILVA COSTA BELÉM - PARÁ 2013 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PARA APLICAÇÃO EM SANIDADE DE TAMBAQUIS AMAZÔNICOS (Colossoma macropomum) Autor: Ana Carolina da Silva Costa Orientador (a): Profa Dra Roseane Maria Ribeiro Costa Co-Orientador: Profº Dr. Humberto de Mello Brandão Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração em Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. BELÉM - PARÁ 2013 FOLHA DE APROVAÇÃO ANA CAROLINA DA SILVA COSTA “NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA PARA APLICAÇÃO EM SANIDADE DE TAMBAQUIS AMAZÔNICOS (Colossoma macropomum)” Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos. Aprovado em: ____/____/_____ BANCA EXAMINADORA Profa Dra Roseane Maria Ribeiro Costa (Orientador) Instituição: Universidade Federal do Pará (UFPA) Assinatura:_____________________________________ Profª Drª Alexandra Regina Bentes de Sousa Instituição: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa Amazônia Oriental. Assinatura:_____________________________________ Profª Drª Jaqueline Rodrigues da Silva Instituição: Universidade Federal do Pará (UFPA) Assinatura:____________________________________ Dedico este trabalho, em especial aos meus pais José Nazareno Costa e Juscelina Costa e a todos aqueles que de alguma maneira colaboraram para tornar este sonho realidade. AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus por ter me proporcionado o dom da vida, permitindo estar aqui neste momento. Aos primeiros mestres, meus pais José Nazareno Costa e Juscelina Costa pelo apoio, compreensão e dedicação incondicional disponibilizada durante toda a minha vida. Às minhas queridas irmãs, Camila Costa e Giovanna Costa, pelo carinho e apoio dado em muitos momentos. Ao meu namorado, Thyago da Costa Vilhena pela amizade, momentos de descontração e carinho e apoio durante toda fase de construção deste trabalho. À professora orientadora Dra Roseane Maria Ribeiro Costa, pela oportunidade de convívio, amizade, pelo incentivo, revisão, paciência e compreensão. Ao professor Co-orientador Dr. Humberto de Mello Brandão pelas sugestões, apoio e incentivo dado. A professora Dra Alexandra Bentes de Sousa pela amizade, apoio e colaboração com os tambaquis estudados e pela orientação sobre manejo e sanidade de peixes. A professora Drª Marly de Fátima Carvalho Melo pela amizade e ajuda nos conhecimentos de necropsia e tratamento de parasitoses de peixes. Ao Professor Dr. Edilson Matos e a equipe do Laboratório de Pesquisa Carlos Azevedo da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), por me introduzir no âmbito da medicina veterinária e por me possibilitar aprendizado importante de necropsia e processamento histológico de peixes. Ao Professor Dr. João de Jesus Pinheiro pela atenção e disponibilizar sempre que possível o microscópio de fluorescência. Ao Professor Dr. José Antônio Picanço, pela ajuda na microscopia eletrônica de transmissão (MET). Aos amigos do Laboratório de Controle de Qualidade Físico-Químico e do Laboratório de Planejamento e Desenvolvimento de Fármacos da UFPA Suellen Sanches, Taylon Aguiar, Raimundo Silva, Polyane Alencar, Eliana Nascimento, Marcos Pena e Marina Costa pela amizade e ajuda em muitos momentos do dia a dia do laboratório. Aos amigos de graduação Cristina Pereira, Izabelle Camões e Thiago Leite pela amizade e carinho. Ao laboratório de Oleoquímica da Faculdade de Química da UFPA, por me disponibilizarem analisador térmico. Aos amigos da Estação de Piscicultura da EMBRAPA Amazônia Oriental pela convivência e pelo auxilio durante os testes com alevinos de tambaqui. Aos participantes da banca examinadora por disponibilizarem seu valioso tempo, contribuindo com seus conhecimentos para a melhoria deste trabalho. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (PPGCF/UFPA). A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro. E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste estudo, meus sinceros agradecimentos. “De tudo ficaram três coisas: A certeza de que estamos sempre começando... A certeza de que precisamos continuar... A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar... Portanto devemos: Fazer da interrupção, um caminho novo... Da queda, um passo de dança... Do medo, uma escada... Do sonho, uma ponte... “Da procura, um encontro...” (Fernando Pessoa) RESUMO COSTA, A. C. S. Nanopartículas de quitosana para aplicação em sanidade de tambaquis amazônicos (Colossoma macropomum). 2013. 90f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia/ICS, Universidade Federal do Pará, 2013. O Tambaqui (Colossoma macropomum) é um peixe de água doce com grande potencial econômico para o agronegócio tropical amazônico, porém, em criações comerciais o aumento da densidade animal favorece a manutenção e disseminação de agentes infecciosos e parasitários, bem como, a produção de efluentes contaminados por drogas e produtos químicos de uso veterinário que podem interferir nos ecossistemas aquáticos. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar um sistema nanoparticulado de quitosana e analisar sua mucoadesividade em tecidos de tambaquis amazônicos a partir de banhos de exposição das nanopartículas fluorescentes em tempos de 30, 60 e 90 minutos. As nanopartículas fluorescentes de quitosana reticulada com tripolifosfato de sódio (NPFITC) foram preparadas pelo método de gelatinização ionotrópica e caracterizadas por FT-IR, TG/DTG, DTA, MET, tamanho de partícula e carga superficial. A espectroscopia FT-IR demonstrou grupos NH2 e OH característicos da quitosana em 3434 cm–1, assim como, espectro em 1154 cm–1 que corresponde a reticulação do grupo tripolifosfato (TPP) com os grupos amínicos da quitosana nas NP-FITC. As curvas de termodecomposição revelaram degradação térmica da quitosana pura em 300°C e nas NP-FITC evidenciou uma menor estabilidade térmica em função da neutralização de grupos aminos positivos da quitosana com os grupos fosfóricos aniônicos do TPP. As NP- FITC revelaram tamanho e carga superficial de 211,1nm e +32,51mV, respectivamente. A quantificação da fluorescência apresentou significância estatística para os tecidos de brânquias, pele, estômago e intestino garantindo a excelente interação dos grupos amino da quitosana com grupamentos aniônicos da mucina. Esses resultados favorecem a aplicação desse sistema nanoparticulado como potencial veículo para a liberação modificada de fármacos relacionados a sanidades de peixes. Palavras-chave: Tambaquis, Nanopartículas, Quitosana, FITC, TPP. ABSTRACT COSTA, A. C. S. Chitosan nanoparticles for application in sanity tambaquis Amazon (Colossoma macropomum). 2013. 90f. Master's Dissertation - Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy / ICS, Federal University of Pará, in 2013. Tambaqui (Colossoma macropomum) is a freshwater fish with great economic potential for Amazonian tropical agrobusiness, but in commercial flocks, the increased in the fish population favors the maintenance and spread of infectious and parasitic agents, as well as the production of effluents contaminated by drugs and chemicals for veterinary use that can interfere with aquatic ecosystems. This way, the aim of this study was to develop and characterize a chitosan nanoparticulate system and analyze its mucoadhesive in tissues from Amazon tambaquis from baths of fluorescent nanoparticles in exposure times of 30, 60 and 90 minutes. The fluorescent nanoparticles of crosslinked chitosan with sodium tripolyphosphate (NPFITC) were prepared by the ionotropic gelation method and characterized by FT-IR, TG / DTG, DTA, TEM, particle size and surface charge. The FT-IR spectroscopy showed characteristic OH and NH2 groups of chitosan in 3434 cm spectrum 1154 cm -1 -1 , as well as which corresponds to the crosslinked group tripolyphosphate (TPP) with the amine groups of chitosan in NP-FITC. Thermodecomposition curves showed thermal degradation of pure chitosan at 300 °C and the NP -FITC showed a lower thermal stability due to the neutralization of positive amino groups of chitosan with anionic groups of the phosphoric TPP. The NP - FITC revealed size and surface charge of 211.1 nm and + 32.51 mV respectively. The quantification of fluorescence showed statistical significance for gills, skin, stomach and intestine tissue ensuring excellent interaction of the amino groups of chitosan with anionic groups of mucin. These results favor the application of nanoparticulate as a potential vehicle for the modified fish sanities related drug delivery system. Keywords: Tambaquis, Nanoparticles, Chitosan, FITC, TPP LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Tambaqui (Colossoma macropomum)................................................................................. 20 Figura 2 - Diferença entre o perfil de liberação controlada de fármacos ............................................. 25 Figura 3 - Nanopartículas: (A) esfera (sistema matricial) e (B) (sistema reservatório ......................... 26 Figura 4 - Representação estrutural da quitina (A) e quitosana (B)..................................................... 29 Figura 5 - Esquema da síntese de marcação da Quitosana com FITC ............................................... 33 Figura 6 - Estrutura química do Tripolifosfato (TPP) ............................................................................ 34 Figura 7 - Gelatinização da quitosana com Tripolifosfato de Sódio .................................................... 34 Figura 8 - Tipos de vibrações ............................................................................................................... 35 Figura 9 - Esquema de um interferômetro de Michelson ..................................................................... 36 Figura 10 - Desenho de um equipamento de termogravimetria ........................................................... 39 Figura 11 - Esquema da Analise térmica diferencial ............................................................................ 41 Figura 12 - Potencial Zeta .................................................................................................................... 42 Figura 13 - Componentes de um microscópio eletrônico de transmissão (MET) ................................ 43 Figura 14 - Espectros de FT-IR das Quitosana (A); TPP(B); FITC (C); NP-FITC (D) ......................... 55 Figura 15 - Curvas TG de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ................................................................................ 57 Figura 16 - Curvas DTG de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ................................................................................ 58 Figura 17 - Curvas DTA de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ................................................................................ 58 Figura 18 - Curvas TG-DTG e DTA do TPP obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) na razão de aquecimento de 10°C/min. ............................................................................................... 60 Figura 19 - Curvas TG –DTG e DTA de FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) na razão de aquecimento de 10°C/min ................................................................................... 61 Figura 20 - Curvas TG de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ................................................................................ 63 Figura 21 - Curvas DTG de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ........................................................................... 63 Figura 22 - Curvas DTA de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min ........................................................................... 64 Figura 23 - Micrografia de MET de nanopartículas fluorescentes de quitosana; aumento 35.000x .... 66 Figura 24 - Distribuição do tamanho médio de nanopartículas fluorescentes em função dos percentuais acumulativo e da intensidade ............................................................................................ 67 Figura 25A - Seção longitudinal de filamento de branquial de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X ............................................................................................................................................................... 70 Figura 25B - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NPFITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 70 Figura 25C - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10X .......................................................................................................................... 70 Figura 25D - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10X .......................................................................................................................... 70 Figura 26A - Seção longitudinal de pele de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X ....................... 71 Figura 26B - Seção transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10X ........................................................................................................................................... 71 Figura 26C - Seção transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10X ........................................................................................................................................... 71 Figura 26D - Seção transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NPFITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 71 Figura 27A - Seção longitudinal de estômago de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X .............. 72 Figura 27B - Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NPFITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 72 Figura 27C - Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10X .......................................................................................................................... 72 Figura 27D - Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10X .......................................................................................................................... 72 Figura 28A - Seção longitudinal de intestino de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X ................. 73 Figura 28B - Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NPFITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 73 Figura 28C - Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NPFITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 73 Figura 28D - Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NPFITC; objetiva 10X ................................................................................................................................. 73 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Lista de polímeros disponíveis para uso em sistemas de liberação de fármacos .............. 28 Tabela 2 - Valores de referência para PDI ........................................................................................... 49 1 Tabela 3 - Principais bandas de Infravermelho (cm- ) da quitosana e nanopartículas fluorescentes . 55 Tabela 4 - O efeito do calor, durante a degradação térmica de quitosana nas razões de 5, 10 e 15ºC/min ................................................................................................................................................ 59 Tabela 5 - O efeito do calor, durante a degradação térmica de NP-FITC nas razões de 5, 10 e 15ºC/min ................................................................................................................................................ 65 Tabela 6 - Valores médios e desvio padrão dos parâmetros de qualidade da água do tanque de tambaquis .............................................................................................................................................. 69 Tabela 7 - Intensidade de fluorescência de brânquias, pele, estômago e porções iniciais de intestino de alevinos de tambaqui expostos a 0,1 g/L de NFQ nos tempos (0- controle negativo, 30 60 e 90 minutos). ................................................................................................................................................ 75 LISTA DE SIGLAS DLS Espalhamento dinâmico da luz DTG Termogravimetria derivada DTA Análise Térmica Diferencial EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária FITC Isotiocianato de Fluoresceína FT-IR Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier IBAMA Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Renováveis KBr Brometo de Potássio MG Miligrama Ml Mililitros mV Milivolts MET Microscopia eletrônica de Transmissão MPA Ministério da Pesca e Aquicultura NP-FITC Nanopartículas fluorescentes de quitosana reticuladas com TPP Nm Nanômetros OECD Organisation for economic Co-operation and development pH Potencial Hidrogeniônico PTA Ácido fosfotúngstico PIB Produto Interno Bruto PDI Índice de Polidispersão QTS Quitosana SUFRAMA Superintendência da zona franca de Manaus TG Termogravimetria TPP Tripolifosfato de Sódio UV-Visível Ultravioleta visível UFRA Universidade Federal Rural da Amazônia UFPA Universidade Federal do Pará SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 16 2 REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................................... 18 2.1 O agronegócio da piscicultura no Brasil................................................................................ 18 2.2 Tambaqui (Colossoma macropomum) .................................................................................. 20 2.2.1 DOENÇAS ENCONTRADAS EM CRIAÇÕES COMERCIAIS DE TAMBAQUIS (Colossoma macropomum) ....................................................................................................................................... 21 2.3 Nanotecnologia...................................................................................................................... 23 2.3.1 CONCEITOS E APLICAÇÕES .................................................................................................... 23 2.3.2 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS...................................................... 24 2.3.3 VEÍCULOS POLIMÉRICOS ....................................................................................................... 27 2.3.4 QUITOSANA ........................................................................................................................... 29 2.3.5 APLICAÇÕES DA QUITOSANA COMO VEÍCULO DE LIBERAÇÃO NA ÁREA VETERINÁRIA ....... 32 2.3.6 NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA FLUORESCENTES PREPARADAS PELO MÉTODO DE GELATINIZAÇÃO IONOTROPICA............................................................................................................. 33 2.3.7 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO .......................................................................................... 35 2.3.7.1Espectroscopia do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) ................................... 35 2.3.7.2 Análises Térmicas ....................................................................................................................... 38 2.3.7.2.1 Termogravimetria e Termogravimetria Derivada .................................................................. 38 2.3.7.2.2 Análise Térmica Diferencial .................................................................................................... 40 2.3.7.3 Potencial Zeta ............................................................................................................................ 42 2.3.7.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ......................................................................... 43 3 OBJETIVOS.............................................................................................................................. 45 3.1 Objetivos Geral ...................................................................................................................... 45 3.2 Objetivos específicos ............................................................................................................ 45 4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................................... 46 4.1 Material.................................................................................................................................. 46 4.1.1 SOLVENTES E REAGENTES ..................................................................................................... 46 4.1.2 EQUIPAMENTOS .................................................................................................................... 46 4.2 Métodos ................................................................................................................................ 47 4.2.1 MARCAÇÃO DA QUITOSANA COM FITC ................................................................................ 47 4.2.2 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS PELO MÉTODO DE GELATINIZAÇÃO IONOTRÓPICA . 47 4.2.3 CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DA QTS, FITC, TPP E DAS NP- FITC .............. 48 4.2.3.1 Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) ................. 48 4.2.3.2 Análise térmica: termogravimetria e análise térmica diferencial ............................................. 48 4.2.3.3 Medidas de tamanho (diâmetro médio), e polidispersividade ................................................. 48 4.2.3.4 Medidas de carga superficial (potencial zeta).......................................................................... 49 4.2.3.5 Microscopia eletrônica de Transmissão (MET) ........................................................................ 50 4.2.4 TAMBAQUIS........................................................................................................................... 50 4.2.4.1 Exposição dos tambaquis amazônicos aos banhos contendo NP-FITC ..................................... 51 4.2.4.2 Avaliação da biodistribuição de nanopartículas mucoadesivas em tecidos de tambaquis amazônicos............................................................................................................................................ 51 4.2.4.3 Estatística .................................................................................................................................. 52 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................... 53 5.1 Síntese de nanopartículas fluorescentes por Gelatinização Ionotrópica ............................ 53 5.2 Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR)............. 54 5.3 Análises Térmicas .................................................................................................................. 56 5.3.1 QUITOSANA ........................................................................................................................... 56 5.3.2 TRIPOLIFOSFATO DE SÓDIO E ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA ...................................... 60 5.3.3 NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES ............................................................................................ 61 5.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ..................................................................... 66 5.5 Análise doTamanho e Polidispersividade das NP-FITC ........................................................ 67 5.6 Análise da Carga Superficial das Nanopartículas ................................................................. 68 5.7 Ensaio de NP-FITC em tecido de tambaquis ........................................................................ 69 5.7.1 ANÁLISE DA QUALIDADE DE ÁGUA DO TANQUE DOS TAMBAQUIS..................................... 69 5.7.2 AVALIAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO DA FLUORESCÊNCIA EM TECIDOS DE TAMBAQUIS ........ 70 6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 76 REFERENCIAS ............................................................................................................................... 77 16 1 INTRODUÇÃO A fauna de peixes de água doce do Brasil é a mais rica do mundo, com cerca de 2.587 espécies (GODINHO, 2007). Segundo dados do Ministério de Pesca e Aquicultura, o Brasil gera um PIB pesqueiro de R$ 5 bilhões com potencial para se tornar um dos maiores produtores mundiais de pescado (BRASIL, 2011). Dentre os peixes de grande interesse econômico para a aquicultura comercial amazônica, o Tambaqui (Colossoma macropomum) vem emergindo com grande potencial de cultivo, devido as suas características zootécnicas favoráveis, qualidade, palatabilidade da carne e valor comercial alcançado (ARAUJO-LIMA & GOULDING, 1997). Em face desse aumento significativo da piscicultura no país, a valorização de tecnologias para a sanidade em peixes, torna-se importante ferramenta para a minimização das perdas econômicas substanciais geradas com a evolução das enfermidades provocadas por parasitoses, bacterioses e doenças fungicas comumente encontradas em ambiente de cultivo e que se tornam fatores limitantes para a criação de peixes (LUQUE, 2004, PIZOLLATI, 2000). Nesse contexto, a nanotecnologia relacionada a sistemas de liberação de fármacos, mesmo estando em fase precoce em aquicultura, se destaca como ferramenta para o desenvolvimento de novas formulações e a liberação do principio ativo com potencial terapêutico aumentado. Seu uso a partir de sistemas poliméricos possibilita uma liberação lenta e gradual do fármaco e o direciona a alvos específicos do organismo possibilitando a redução de número de mortes (AULTON, 2005; BRAUN, 2005; DAVIS, 2004, RATHER et al. 2011). Os sistemas poliméricos de liberação de drogas são largamente utilizados e não só permitem uma liberação lenta e gradual do principio ativo, como também possibilitam o direcionamento a alvos específicos do organismo (LOPES et al. 2005). A Quitosana é um biopolímero natural derivado da quitina e tem se tornado muito atraente em medicina veterinária, sua utilização como veículo de liberação de fármacos é devida as suas características de atoxicidade, biocompatibilidade, biodegradabilidade e mucoadesão, propiciada pelo grande número de grupos hidroxila e grupos amino presentes em sua cadeia polimérica, que realçam suas propriedades de permeação (KUMAR, 2008; GÜNBEYAZA et al. 2010) 17 A aplicação de sistemas de liberação controlada em peixes é capaz de reduzir o estresse animal provocado pela administração e manipulação, fator predisponente a baixa de imunidade e susceptibilidade dos peixes a infecções, além da redução dos custos em tempo e dinheiro devido essa tecnologia reduzir a necessidade de doses múltiplas. Esse estudo trata do desenvolvimento tecnológico de nanopartículas mucoadesivas de quitosana, bem como, a avaliação de sua biodistribuição em tecidos de tambaquis amazônicos, para aplicação como sistema de liberação controlada de fármacos relacionados à sanidade de peixes. 18 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 O agronegócio da piscicultura no Brasil O Brasil é um dos líderes mundiais na produção e exportação de vários produtos agropecuários com projeções que indicam sua liderança em vários insumos, com destaque para o algodão e biocombustíveis, feitos a partir de cana-deaçúcar e óleos vegetais, milho, arroz, frutas frescas, cacau, castanhas, nozes; além de suínos e dentre eles o pescado (BRASIL, 2012a; FILHO et al. 2012). A aquicultura é praticada em todos os Estados brasileiros e corresponde a diferentes modalidades que vão desde a piscicultura (criação de peixes), à carcinicultura (camarões), à ranicultura (rãs) e à malacocultura (moluscos: ostras, mexilhões, escargot) (FILHO, 2012). Após a criação pelo Governo Federal, em 2009 do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA), foi aumentada a ênfase do aproveitamento do extenso potencial hídrico disponível no Brasil para a criação de organismos aquáticos. São mais de cinco milhões de hectares de laminas d’água, oito mil quilômetros de litoral, 12% da água doce do mundo, clima e disponibilidade de mão de obra (FILHO & FRASCÁSCORVO, 2011). A produção de pescados tem crescido no país desde a década de 90 e, atualmente, se consolida como grande fornecedor de proteína de qualidade para a população. Segundo dados do Ministério de Pesca e Aquicultura, o Brasil gera um Produto Interno Bruto (PIB) pesqueiro de R$ 5 bilhões com potencial para se tornar um dos maiores produtores mundiais de pescado (BRASIL, 2010). No ano de 2010, a piscicultura conseguiu índices de crescimento relativo em torno de 68% com destaque para a produção de tilápia, tambaqui e tambacu. Os estados que mais se destacaram foram Santa Catarina, Pará e Bahia que detém 37% da produção nacional, conforme levantamento da Produção Pesqueira e Aquícola do Brasil publicado em 2010 pelo Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA) (BRASIL, 2011). A piscicultura mostra que os produtores têm-se preocupado, à exceção das tilápias, com a criação de novas espécies com os mais variados hábitos alimentares 19 e ambientes de vida, indo desde espécies de clima tropical (em sua grande maioria) até aquelas de climas temperado e frio (FILHO, 2012). Em função do aumento da população global e de mudanças de hábito alimentar, houve aumento da demanda por pescados. A Amazônia possui grande potencial para criação de peixes, com recursos hídricos abundantes, clima favorável o ano todo, grande diversidade de espécies valorizadas no mercado e oferta de alevinos das principais espécies (FILHO, 2012; ONO, 2005; SANTOS, 2010). A pesca é o alicerce da economia da região amazônica e não só se destaca em relação às demais regiões brasileiras pela riqueza das espécies exploradas, mas pela quantidade de pescado anualmente e pela dependência da população tradicional a esta atividade. Dessa forma, há um elo cultural, econômico e social com a população (COSTA, 2006). Esse contexto de crescimento da piscicultura no país prevê a adoção de várias medidas destinadas a minimização de perdas econômicas geradas em ambiente de cultivo. Dentre os principais desafios que acompanham a intensificação desses sistemas produtivos, pode-se destacar o aumento da densidade animal que favorece a manutenção e disseminação de agentes infecciosos e parasitários, bem como, a produção de efluentes contaminados por drogas e produtos químicos de uso veterinário que podem interferir nos ecossistemas aquáticos (OECD, 2011). Assim, para manter o crescimento sustentável da atividade pesqueira e para que a mesma se mantenha nos próximos anos, novas formulações farmacêuticas mais eficientes devem ser desenvolvidas para o setor. Como modelo de estudo, foi utilizado o Tambaqui (Colossoma macropomum) (Cuvier,1818), uma espécie nativa da região amazônica com grande potencial produtivo. 20 2.2 Tambaqui (Colossoma macropomum) O Tambaqui (Colossoma macropomum) (Cuvier, 1818) (Figura 1), é a maior espécie da ordem dos Characiformes, pertence à família Characidae e gênero Colossoma (BALDISSEROTO, 2006) é uma espécie frequentemente encontrada na foz do rio Xingu, no estado do Pará, até o médio rio Ucaiali no Peru e também ao longo dos tributários de águas barrentas do rio Amazonas e nas partes baixas dos tributários claras e negras (ARAÚJO- LIMA& GOULDING, 1977, ISAAC & RUFINO, 1996). Figura 1 - Tambaqui (Colossoma macropomum) Em ambiente natural atinge porte máximo de 100 cm e acima de 30 kg de peso. Possui dentição forte, que permite quebrar os frutos e sementes que caem na água no período de cheia dos rios. O hábito alimentar é baseado no consumo de frutos e sementes. Mas também, pode-se alimentar de insetos, caramujos e raramente de outros peixes. Na fase de pós-larva, o alevino, alimenta-se de plâncton. Em cativeiro aceita bem ração, grãos e subprodutos agro-industriais, o que garante sucesso da adaptação do tambaqui para o cultivo em cativeiro, além a sua capacidade de filtrador de plâncton (SUFRAMA, 2003). O Tambaqui é uma das espécies que mais desperta interesse na piscicultura no Brasil (ARAÚJO-LIMA e GOULDING, 1997; COSTA, 2006; GRAEF, 1987). Apesar de ser uma espécie nativa da bacia Amazônica, seu cultivo também é crescente em outras regiões do Brasil como nordeste, centro-oeste e sudeste. Isso é 21 dado em função das boas condições para a criação do animal como: rápido crescimento, alta produtividade, além de consumo e aceitabilidade elevada (ALMEIDA et al. 2006). Uma qualidade primordial é a consistência, bem como, o sabor de sua carne muito apreciada pelo consumidor. Esses atrativos lhe conferem um alto valor comercial e importância para a economia regional (ARAÚJO-LIMA & GOULDING, 1997; IBAMA, 2007; VAL & HONCZARYK, 1995). 2.2.1 DOENÇAS ENCONTRADAS EM CRIAÇÕES COMERCIAIS DE TAMBAQUIS (Colossoma macropomum) A sanidade é um dos aspectos mais relevantes para a produção comercial de animais aquáticos. Doenças comprometem o bom desempenho zootécnico dos animais gerando prejuízos consideráveis ao piscicultor. Em criações os peixes são submetidos a condições estressantes, como por exemplo, pequenas áreas com altas densidades ocasionam a concentração de espécies parasitas e vários patógenos como bactérias e fungos que podem causar doenças e grandes mortalidades de peixes (LIMA, 2007). Silva (2001) em estudo encontrou 22 espécies bacterianas em tambaquis, das quais, as 19 espécies descritas a seguir foram mais representativas em brânquias: Aeromonas sp., Flavobacterium sp., Alcaligenes sp., Moraxella sp., Pasteurella sp., Rochalimae henselae, Xenorhabdus sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Actinobacillus sp., Haemophilus sp., Proteus sp., Cardiobacterium sp., Chromobacterium violaceum, Klebsiela sp, Escherichia coli, Hafnia sp., Providencia sp., Pseudomonas sp. Entretanto, em trabalhos como Chagas (2010); Belem-Costa & Cirino (2006 apud CHAGAS, 2010, p.12); Vimal et al (2012), que desenvolveram trabalho com criação de peixes de água doce, a principal espécie bacteriana encontrada foi Aeromonas hydrophila, responsável por grande mortalidade de tambaquis em cultivo. Silva-Junior e Ferreira (2007) identificaram os gêneros de fungos: Rhyzophydium, Chytriomyces e Podochytrium que são pertencentes ao Filo 22 Chytridiomycota e o gênero Achlya pertencente à classe Oomycota. Destes, apenas o gênero Achlya é considerado possível causador de prejuízos à piscicultura. Para o Tambaqui são relatadas espécies de metazoários parasitos: os monogenóides Anacanthorus spathulatus, Linguadactyloides brinkmanni, Notozothecium janauachensis, Mymarothecium boegeri, Gyrodactylus sp. Um digenético da família Paramphistomida, larvas de plerocercóides de Cestoda da família Proteocephalidae, o acantocéfalo Neoechinorhynchus buttnerae, os nematóides Spirocamallanus inoinatus, espirocamallanus spp. (FERRARIS, 2003). O número de parasitas necessários para causar danos em um peixe pode variar com seu estado de saúde, com a espécie do peixe em estudo e com o tamanho do hospedeiro (LEMOS et al. 2007, LIMA, 2007;. NUNES, 2007; PIAZZA et al. 2006). FISHER et al (2003) em trabalho realizado no Baixo Rio Amazonas (Estado do Pará) e no médio Rio Solimões (estado do Amazonas) identificaram nove espécies de parasitas em tambaqui, entre os quais, três parasitas foram da classe dos Monogenoidea (o Anacanthorus spathulatus, Linguadactyloides brinkmanni e Nothozothecium sp), uma espécie trematoda da família Paraphistosmidae, uma do filo Acanthocefala, Neoechinorhyncus buttnerae, duas do filo nematoda Spirocamallanus sp e Procamallanus sp e duas da classe da subclasse Copepoda, Gamydactylus jaraquensis e Perularneae gamitanae. Com registro do monogenético Notozotheciumsp., espécies imaturas da família Paramtophistomidade, larvas do nematoide Promallanus sp., e o copépodo Gamidactylus jaraquensis. MORAIS et al (2009) caracterizaram a fauna de parasitos em juvenis de tambaquis da Amazona central. Das espécies encontradas Anacanthorus spathulatus foi a espécie de Monogenenoidea que apresentou maiores índices parasitários, principalmente localizados em brânquias e pele. Notozothecium janauachensis foi à segunda, com infecção em fossas nasais e brânquias e Mymarothecium boegeri foi à terceira espécie que mais parasitou os tambaquis, sendo encontrada somente nos filamentos branquiais. SANTOS et al (2012) em trabalho realizado para descrever a fauna parasitária de tambaquis em tanques de rede no estado do Amapá verificaram maiores taxas de infecção por protozoários Ichthyophthirius multifiliis e Piscinoodinium pillulare, seguido por monogenoideas Mymarothecium boegeri Anacanthorus spathulatus. Infecções por esses agentes causadores de doenças 23 podem reduzir a sobrevivência dos peixes, causando prejuízos econômicos aos produtores. A busca por tecnologias em piscicultura comercial são de grande importância para a minimização de doenças em ambientes de cultivo. 2.3 Nanotecnologia 2.3.1 CONCEITOS E APLICAÇÕES O termo nanotecnologia se fundamenta em tecnologias que possibilitam a construção de materiais ou estruturas na escala de nanômetros (10 -9 nm). Em 1959, o físico Richard Feynman sugeriu átomos manipulados como forma de construir novos materiais. Em 1974, O termo Nanotecnologia, foi criado, na Universidade de Ciências de Tókio pelo então professor Norio Taniguchi para descrever a manufatura precisa de materiais com tolerâncias nanométricas (ARAKI, 2007; FEYNMAN, 1960). A manipulação atômica através de elementos nanotecnológicos traz a possibilidade de construção de estruturas átomo a átomo, que possibilita a criação de materiais com estruturas químicas novas. O rearranjo destas estruturas traz mudanças às características físico-químicas, tais como resistência mecânica ou pontos de fusão e condução de calor e eletricidade, variáveis muito importantes (ARAYANE, 2006). Atualmente, os países desenvolvidos que investem grandes quantias em dinheiro no desenvolvimento de nanotecnologia são os Estados Unidos, seguidos da Alemanha e Japão. O objetivo desse investimento é a criação de novos materiais e desenvolver novos produtos e processos baseados na crescente capacidade tecnológica moderna de manipulação atômica e molecular. A nanotecnologia é transdisciplinar envolvendo profissionais como físicos químicos, engenheiros e farmacêuticos (HAMIDI et al. 2008). 24 O incentivo a nanotecnologia é crescente no nosso país. A portaria n° 245 de 5 de abril de 2012, do Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação publicada em 09 de abril de 2012 em Diário Oficial, anuncia a criação do Sistema Nacional de Laboratórios em Nanotecnologias (SisNano), para o aumento do peso da atividade industrial no Produto Interno Bruto do país. Esse apelo é principalmente voltado à indústria farmacêutica e de cosméticos (BRASIL, 2012b; INOVAÇÃO TECNOLOGICA, 2012). 2.3.2 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS Com a revolução da ciência e tecnologia, o medicamento evoluiu e possibilitou que a terapêutica moderna permitisse a liberação controlada e alta especificidade de compostos de fármacos, contribuindo para a saúde humana e animal. Na terapia convencional, a concentração sanguínea de fármacos oscila em picos máximos e mínimos de declínio, o que pode ocasionar toxicidade em altas concentrações ou a ineficiência do tratamento em baixas concentrações sanguíneas (AULTON, 2005) (Figura 2). Um sistema de liberação controlada, objetiva manter a concentração do fármaco na faixa terapêutica a partir de uma única dosagem (AZEVEDO, 2002). As vantagens desses sistemas são numerosas, entre elas: liberação modificada da ação do fármaco, administração segura (sem reações inflamatórias locais) e conveniente (menor número de doses). Dessa forma, essa tecnologia visa à diminuição de efeitos tóxicos e/ou aumento do índice terapêutico (AZEVEDO, 2002; BARBUCCI, 2002). 25 Figura 2 - Diferença entre o perfil de liberação controlada de fármacos Fonte: LQES - Laboratório de Química do Estado Sólido – Instituto de Química – UNICAMP (http://lqes.iqm.unicamp.br). Sistemas nanoparticulados são muito úteis na manutenção da dose terapêutica em níveis seguros, na diminuição dos picos e valores plasmáticos, além de conferir proteção e economia de fármaco (LIMA, 1999; KREUTER, 2001). A nanotecnologia aplicada a sistemas de liberação faz uso e pesquisa novas estratégias para a liberação do princípio ativo. Entre os comumente usados em liberação controlada estão: lipossomas, nanopartículas, microcápsulas, microesferas, táxis ou bioadesivos. Em conceito, nanopartículas apresentam tamanho entre 1 a 1000 nm, e podem ser constituídas de polímeros naturais e/ou sintéticos, lipídios ou fosfolipídios, até mesmo metais (LIMA, 1999; KREUTER, 2001). O termo nanopartículas faz referência a dois tipos de estruturas: nanoesferas (Figura 3A) e nanocápsulas (Figura 3B). Nanoesferas são sistemas em que o fármaco encontra-se disperso homogeneamente ou solubilizado na matriz polimérica ou cerosa (AZEVEDO, 2002). Dessa forma, obtém-se um sistema matricial, onde não é possível identificar um núcleo diferenciado. Nanocápsulas são definidos como sistemas reservatórios, sendo possível a identificação de um núcleo diferenciado, que pode ser sólido ou líquido. Neste caso, a substância encontra-se envolvida por uma membrana, geralmente polimérica, isolando o núcleo do meio externo (AULTON, 2005). 26 Figura 3 - Nanopartículas: (A) esfera (sistema matricial) e (B) (sistema reservatório Fonte: Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37. As vantagens da utilização das nanopartículas poliméricas como sistemas de liberação de fármacos são dadas por diversas razões como: proteção do fármaco, direcionamento a sítios específicos, estabilidade física e biológica suficiente para reter o fármaco e promover a liberação controlada, boa tolerabilidade dos componentes, simplicidade do processo de formulação e possibilidade do escalonamento do processo. Outra vantagem é o aumento da estabilidade de fármacos voláteis (KAYSER et al. 2005) Os sistemas de liberação poliméricos são ferramentas de grande importância para a tecnologia farmacêutica com a finalidade de conseguir um controle temporal ou espacial da liberação do fármaco (AULTON, 2005; BRAUN, 2005; DAVIS, 2004). 27 2.3.3 VEÍCULOS POLIMÉRICOS A ciência dos polímeros tem exercido grande importância para o desenvolvimento de novos sistemas de liberação controlada. Dentre as várias propriedades dos polímeros, algumas se demonstram mais importantes quando na elaboração de um sistema de liberação de fármacos, como a permeabilidade propriedades de superfície como hidrofilicidade, lubrificação, lisura, energia de superfície adesão, solubilidade e temperatura de transição vítrea (BRAUN, 2005; DAVIS, 2004). Outra característica físico-química importante é o peso molecular de um polímero. Um aumento no peso molecular, bem como uma distribuição estreita de massas moleculares, traz uma melhoria em relação a algumas propriedades do material, como rigidez e resistência à tensão, à abrasão, a agentes químicos e à degradação térmica, porém isso ocasiona uma diminuição na solubilidade e nas propriedades de adesão (DAVIS, 2004). Materiais poliméricos sintéticos e ou naturais podem ser utilizados como veículos carreadores para liberar uma grande variedade de fármacos (OLIVEIRA, 2006). A Tabela 1 demonstra lista de polímeros disponíveis para uso em sistemas de liberação de fármacos. 28 Tabela 1 - Lista de polímeros disponíveis para uso em sistemas de liberação de fármacos CLASSIFICAÇÃO POLÍMEROS NATURAIS POLÍMEROS SINTÉTICOS POLÍMERO - Polímeros a base de proteína - Colágeno, Albumina e gelatina - Polissacarídeo - Agarose, Alginato, Carragenina, Ácido hialurônico, Dextrana, Quitosana, Ciclodextrinas, Sulfato de condroitina - Biodegradáveis - Poli(ácido) lático, Poli(ácido) glicólico, PLGA (copolimero de acido láctico e glicolico) - Poliéster -Poli(hidroxibutirato),Poli(ecaprolactona), Poli(ácido β-málico), poli(dioxanonas) - Polianidro - Poliamidas - Polímeros Fosforosos NÃO BIODEGRADÁVEIS - Poli(ácido sebálico), Poli(ácidoadipico), Poli(ácido terftálico) e vários copolímeros - Poliminocarbonatos, Poliminoácidos - Polifosfato, Polifosfanatos e Polifosfazenos - Outros - Poli(cianoacrilatos), Poliuretanos, éster Poliorto, Polihidropirans, poliacetais - Derivados da celulose -Carboximetilcelulose,Etilcelulose, Celuloseacetato, Hidroxipropilmetilcelulose - Silicones - Polimetilsiloxano, Sílica coloidal - Polímeros Acrílicos - Polimetacrilatos, Polimetilmetacrilato NIPAM; NIPAM) Polietilhidrometacrilato - Polivinilpirrolidona, Etilvinilacetato, Poloxameros, Poloxaminas Fonte: OLIVEIRA, 2006 (* com adaptações) (N- 29 Polímeros biodegradáveis são cada vez mais importantes para a liberação controlada de agentes terapêuticos como fármacos ou enzimas, com a finalidade de interagir com as diversas partes do corpo humano e/ou do animal, e com capacidade de garantia da liberação do princípio ativo durante um longo período de tempo sob um período constante. Embora um polímero para algumas aplicações deva ser absolutamente estável contra a degradação, em sistemas de liberação controlada, a biodegradação fácil é necessária, para que após ter desempenhado sua funções, o polímero seja adsorvido ou eliminado por uma via metabólica (BRAUN, 2005; DAVIS, 2004). Polímeros naturais e sintéticos são empregados na medicina como materiais biodegradáveis (DAVIS, 2004) 2.3.4 QUITOSANA A quitosana é definida como um copolímero de 2-amino-2-desoxi-Dglicopiranose e 2-acetamida-2-desoxi-D-glicopiranose, de composição variável em função do grau residual de acetilação, cujas unidades também são unidas por ligações glicosídicas β-(1,4). A quitosana é um polissacarídeo linear obtido a partir da reação de desacetilação da quitina em soluções alcalinas (DAMIAN, 2005; KUMAR, 2008, MUZZARELLI, 1978), conforme Figura 4. Figura 4 - Representação estrutural da quitina (A) e quitosana (B) Fonte: GUIMARAES, 2005 30 A quitina é um polissacarídeo nitrogenado, natural, branco, duro e inelástico presente nas carapaças dos crustáceos, nos exoesqueletos de insetos, em nematoides e nas paredes celulares de fungos e de leveduras (MUZZARELLI, 1978). Durante a reação de desacetilação, os grupamentos acetamido (-NHCOCH3) da quitina são transformados, em graus variados, em grupos amino (NH2), dando origem a quitosana. Essa característica somada a linearidade do polímero e grupos hidroxilas reativos de quitosana confere um caráter mais versátil em relação quitina, como a formação de quelatos com substâncias como o colesterol, gorduras, proteínas e células tumorais (GOY, 2004). A quitina e a quitosana são considerados biopolímeros distintos. O grau de desacetilação é um parâmetro que define a fração de unidades desacetiladas contidas na cadeia polimérica. Assim, a quantidade de monômeros desacetiladas faz distinção entre esses dois biopolímeros. Quando a desacetilação é maior que 40% o polímero é quitosana (BARROS et al. 2006; DE SOUZA, 2009). A quitosana é um biopolímero cujo grau de desacetilação, distribuição de massa molar e conteúdo de impurezas dependem das fontes naturais de matériaprima e dos métodos de preparação. A massa molar média da quitina nativa é geralmente maior do que 106 Daltons, enquanto a quitosana comercial tem uma massa molar média na faixa de 1,0 x 10 – 1,2 x106 Daltons (DUTTA, 2004; DAMIAN, 2005). Valores altos de grau desacetilação encontrado em quitosanas demonstram que essa possui uma grande quantidade de grupos aminos e grupos hidroxila disponíveis na cadeia polimérica, que justificam a sua alta hidrofilicidade. A determinação do grau de desacetilação é importante já que permite o uso do biomaterial nas suas várias formas de aplicações como micropartículas, géis, membranas e como veículo de liberação de fármacos (LARANJEIRA; 2009). Na literatura valores do grau de desacetilação foram encontrados variando de 50 a 92,3% (DE SOUZA, 2009) e de 70 a 96% (JANEGITZ et al. 2007;CANELLA; 2001). A quitosana exibe comportamento catiônico moderadamente básico (pka=6,3). Em relação ao parâmetro solubilidade, é insolúvel em soluções neutras e alcalinas e soluvel em soluções ácidas diluidas, como ácido acético, cloridrico, 31 perclorico, que desprotonam os grupamentos amino do polímero (HORN, 2008; GUIMARAES, 2005). A presença de uma alta porcentagem de grupos amino reativos distribuídos na matriz polimérica permite inúmeras modificações químicas, tais como imobilização de agentes quelantes, quaternização, carboxilação, acilação, sulfonação, amidação, formação de complexo polieletrolítico (LARANJEIRA, 2009). Recentemente, muita atenção tem sido dada à quitosana e aos seus oligômeros como materiais bioativos. Dentre as principais vantagens da quitosana em relação a outros polissacarídeos são: sua sensibilidade ao pH, biocompatibilidade, bioadesão, atoxicidade e permeabilidade. Além de ser bactericida,fungicida e biodegradável, age como composto cicatrizante, apresentando vantagem em relação aos polímeros sintéticos que, na sua grande maioria, são tóxicos (AJUN,2009;CALVO et al. 1997;KUMAR, 2008). Seu caráter biodegradável é devido a sua metabolização por enzimas como a lisozima (PRABAHARAN, 2008). A alta hidrofilicidade da quitosana, devida ao grande número de grupos hidroxila e grupos amino presentes na cadeia polimérica, permite sua utilização como biomaterial na forma de nanopartículas, e como veículo de liberação de fármacos (CANELLA, 2001; MAURO, 2009; SENEL, 2004). Estas características tornam a quitosana atrativa para aplicação na área veterinária. A quitosana tem provado ser um excipiente polimérico seguro em formulações farmacêuticas, sendo empregada como veículo carreador de fármacos, peptídeos, proteínas e vacinas de DNA (GAVINI et al. 2002; GÜNBEYAZ et al. 2010; VIMAL et al. 2012). 32 2.3.5 APLICAÇÕES DA QUITOSANA COMO VEÍCULO DE LIBERAÇÃO NA ÁREA VETERINÁRIA Na área veterinária, o desenvolvimento de sistemas de liberação controlada é muito interessante, uma vez que, proporcionam um melhor manejo do animal com redução do estresse provocado pela administração e manipulação e redução dos custos em tempo e dinheiro. Na literatura são reportados diversos trabalhos que relatam o crescente apelo para o desenvolvimento tecnológico de sistemas de liberação de fármacos e vacinas voltados para aplicação em animais sejam de grande ou pequeno porte. No artigo de revisão realizada por Sun et al (2004), eles reportam a necessidade de desenvolver formulações de ação prolongada de antibióticos voltados para uso na área veterinária. Em outro trabalho de revisão, Vandamme e Ellis (2004) analisaram os conceitos necessários, as questões e os desafios para a construção de sistemas de distribuição de fármacos em ruminantes. Segundo Gavini et al (2002), as principais áreas de aplicação da tecnologia liberação controlada no domínio veterinário são: a prevenção de doenças e controle através da entrega de anti-helmínticos, antibióticos, antiparasitários, promotores de crescimento, agentes nutricionais e vitaminas e à produção de alimentos para animais. A literatura relata a possibilidade de utilizar vacinas de DNA em piscicultura, Kumar e colaboradores (2008) fizeram um trabalho com uso de nanopartículas de quitosana para liberação oral de vacinas de DNA em robalo Asiático, para proteção contra Vibrio (Listonella anguillarum). A quitosana também é vista como adjuvante de vacinação mucosa, Günbeyaz et al (2010) desenvolveram uma vacina de quitosana contendo BHV-1, para imunização das mucosas contra o herpesvirus BHV-1 bovina. Gavini et al (2002) utilizaram comprimidos vaginais mucoadesivos para liberação controlada de um fármaco antimicrobiano, acriflavina, à partir de microsferas de quitosana. Os autores verificaram através dos ensaios in vitro de mucoadesão que esse sistema demonstrou uma boa capacidade mucoadesiva. 33 2.3.6 NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA FLUORESCENTES PREPARADAS PELO MÉTODO DE GELATINIZAÇÃO IONOTROPICA A quitosana é um polissacarídeo linear catiônico, devido aos seus grupamentos amino livres, principal vantagem em relação a outros biopolímeros. Sua capacidade de formar sais em presença de ácidos faz com que a quitosana seja reativa e solúvel (CAMPOS et al. 2004). Os grupos amino primários da cadeia polimérica da quitosana facilitam seu acoplamento a vários tipos de biomoléculas, tais como: proteínas, enzimas, anticorpos, assim como moléculas fluorescentes como o FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) (ZHAO &WU, 2006). A reação entre o grupamento isotiocianato do FITC e o grupo amino primário da quitosana é demonstrado na Figura 5. Quitosana Fluoresceína-5Isotiocianato (FITC) Quitosana marcada com FITC Figura 5 - Esquema da síntese de marcação da Quitosana com FITC Fonte: ZHAO& WU, 2006 O método de gelatinização ionotrópica consiste na reticulação iônica da quitosana com contra-íons multivalentes, como o TPP (tripolifosfato de sódio). As partículas resultantes da gelatinização ionotrópica possuem tamanhos da ordem de nanômetros (CAMPOS et al. 2004). Para promoção de uma melhor estabilidade física e química de veículos poliméricos utilizados como biomateriais, vários agentes reticulantes podem ser usados, entre eles: glutaraldeído, epicloridrina, diglicil etilenoglicol, porém, estes 34 apresentam toxicidade (MI et al. 2002). Dessa forma, o uso do TPP como agente de reticulação iônica, possui vantagem em relação aos reticulantes citados anteriormente, devido ao fato de ser atóxico (SHU & ZHU, 2000; SILVA, 2006). O TPP (Figura 6) apresenta-se na forma de pó branco, com pouca com peso com molecular de 367, 86 e pouca higroscopicidade (GUIMARAES 2005 apud MERCK, INDEX, 2001). Figura 6 - Estrutura química do Tripolifosfato (TPP) Fonte: GUIMARAES, 2005 A preparação das nanopartículas é realizada a partir da adição de uma fase alcalina contendo TPP (pH= 7-9) e uma fase ácida contendo quitosana (pH= 4-6). A formação das partículas após adição dessas fases é concretizada a partir de ligações intermoleculares que ocorreram entre o grupamento amino da quitosana e grupo fosfato do TPP (BODMEIER et al.1989). A facilidade de reticulação iônica do TPP com a quitosana é devida ao seu grande número de cargas negativas (Figura 7). Figura 7 - Gelatinização da quitosana com Tripolifosfato de Sódio Fonte: Silva, 2006 35 2.3.7 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO 2.3.7.1Espectroscopia do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) A espectroscopia do infravermelho é um importante método analítico para a identificação de grupos funcionais de moléculas orgânicas no estado sólido, líquido e gasoso. A faixa espectral de 4000 a 400 cm-1 corresponde à região espectral do infravermelho médio no qual a espectroscopia estuda a interação da radiação eletromagnética para as moléculas orgânicas. Dessa forma, quando a radiação na região do infravermelho interage com as moléculas, há alterações nos modos vibracionais e rotacionais das mesmas, gerando variação de seu momento dipolo. Em função disso, o campo elétrico alternante da radiação incidente interage com a molécula e origina os espectros (FREITAS, 2009; NASCIMENTO, 2011). As vibrações moleculares podem ser classificadas pelo seu estiramento, ou seja, pela deformação axial, além dos tipos de deformação angular divididas em simétricas ou assimétricas (ALMEIDA, 2009; PAVIA & LIZ, 2001). As vibrações angulares podem ainda ser classificadas como no plano ou fora do plano. Os diferentes tipos de vibração são mostrados na Figura 8. Deformação Angular Estiramento Assimétrico Simétrico Assimétrico no plano Figura 8 - Tipos de vibrações Fonte: PUC- Rio de Janeiro- Certificação digital N ° 0114349 CA Assimétrico Simétrico Simétrica fora do fora do no plano plano plano 36 Ate a década de 1980, a maioria dos espectrômetros era do tipo dispersivo, baseados nas redes de difração. Após esse período, esses espectrofotômetros foram substituídos pelos equipamentos com transformadas de Fourier (FT-IR), devido à sua velocidade e conveniência (FREITAS, 2009; NASCIMENTO, 2011). O principio de todo espectro de FT-IR é o interferômetro de Michelson, onde os espectros são obtidos pelo cálculo da transformada de Fourier do referido interferograma Um espectrômetro baseado no princípio interferométrico atua em sistema de mono ou duplo feixe, constituindo-se de uma fonte, um interferômetro, um compartimento de amostra, um detector e um computador (Figura 9). Figura 9 - Esquema de um interferômetro de Michelson Fonte: Helfer et al.2006 A radiação policromática, oriunda da fonte é dividido em duas fontes de intensidade aproximadamente iguais (fonte fixa e fonte móvel). Assim conforme Figura 10, o feixe da fonte fixa é refletido pelo espelho fixo, e o feixe da fonte móvel pelo espelho móvel. Após as reflexões no espelho fixo e espelho móvel, os feixes da fonte fixa e fontes móveis são recombinados no divisor de feixe, dando origem a um interferograma. Dessa forma, esse é formado pela soma de todas as ondas de diferentes amplitudes e frequências que chegam ao interferômetro e possui todas as informações espectrais NASCIMENTO, 2011). da amostra (ALMEIDA, 2009; FREITAS, 2009; 37 A relação entre o interferograma e o espectro é dada pela equação1: (1) Onde B(ν) é a intensidade do espectro em função da frequência. Os espectros FT-IR possuem inúmeras vantagens: Possuem um único componente em movimento, o espelho móvel, que resulta em medidas com menor desgaste e alta confiabilidade; Um grande número de amostras podem ser medidas; Uma única varredura, mesmo em velocidade baixa, dura poucos segundos e fornece a mesma sensibilidade em relação sinal/ruído, devido o sinal de o interferograma ser multiplexado; Quanto maior o número de varreduras maior a relação sinal/ruído; Os aparelhos com FT-IR possuem uma maior abertura óptica resultando em sistemas com uma maior entrada de energia quando comparados aos sistemas dispersivos. 38 2.3.7.2 Análises Térmicas Segundo a Confederação Internacional de Análise Térmica e Calorimetria (ICTAC), a definição do termo análise térmica é dado a um grupo de técnicas, onde a propriedade física de uma substância e/ou seus produtos de reação é medida em função da temperatura ou tempo, enquanto, a substância é submetida a uma programação controlada de temperatura (ANTONINO, 2007; GIOLITO, 2003). Várias são as técnicas termoanalíticas, dentre as mais utilizadas tem-se: a Termogravimetria e sua Derivada (TG e DTG), Análise Térmica Diferencial (DTA), a Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Detecção de gás desprendido (EGA), Análise termomecânica (TMA), etc. Essas técnicas permitem ao analista obter informações sobre variação de massa, estabilidade térmica; água livre e; água ligada; pureza, ponto de fusão, ponto de ebulição, calores de transição, calores específicos, diagramas de fase, cinética da reação, estudos de catalisadores, transições vítreas (GIOLITO, 2003; HATAKEYAMA & QUINN 1994). Na literatura, encontram-se diversos trabalhos que utilizaram métodos termoanalíticos para avaliar a estabilidade térmica de nanomateriais e veículos poliméricos visando o controle de qualidade dos constituintes da formulação (SINHA et al. 2004; XU& DU, 2003; HASSAN et al. 2012) 2.3.7.2.1 Termogravimetria e Termogravimetria Derivada A termogravimetria é uma técnica onde a massa é medida como uma função de temperatura ou tempo, enquanto, a amostra é submetida a um programa de temperatura e atmosfera controladas (GIOLITO, 2005). A principal ferramenta de um analisador termogravimétrico é a termobalança, junto a ela estão acoplados um forno, termopares e um sistema de fluxo de gás que possibilitam a medição da massa da amostra em função da temperatura e do tempo (Figura 10) (WENDHOUSEN et al. 2004). 39 Figura 10 - Desenho de um equipamento de termogravimetria Fonte: WENDHOUSEN et al.2004. Os fatores que podem influenciar o aspecto das curvas TG, pertencem a dois grandes grupos (ANTONINO, 2007; GIOLITO, 2003): Fatores instrumentais - razão de aquecimento e atmosfera do forno, geometria do suporte de amostras e do forno; Fatores associados às características da amostra - tamanho de partículas, quantidade de amostra, solubilidade dos gases liberados na própria amostra, calor de reação, compactação da amostra, natureza da amostra, condutividade térmica da amostra. A termogravimetria derivada é a relação da variação de massa em função da temperatura ou tempo (dm/dt), equação 2. dm/dt= f (T ou t) (2) Dessa forma, são obtidas curvas que correspondem à primeira derivada da curva TG, que equivalem a picos que delimitam áreas proporcionais às alterações de massa sofridas pela amostra. 40 Como principais vantagens, a DTG apresenta: Curvas que indicam temperaturas exatas no inicio e no instante em que a velocidade máxima de reação é ocorrida; A visualização de picos agudos para a distinção de uma sucessão de reações que muitas vezes não são evidenciadas nas curvas TG; Áreas de picos que correspondem a real perda ou ganho de massa e dessa forma são utilizadas em determinações quantitativas. 2.3.7.2.2 Análise Térmica Diferencial A análise térmica diferencial caracteriza-se como uma técnica termoanalítica de medição contínua entre as temperaturas da amostra e de um material de referência termicamente inerte (Figura 11). Ambos vão sendo aquecidos ou resfriados em um forno e registrado a diferença entre a temperatura da referência (Tr) e da amostra (Ta) em função da temperatura ou do tempo do aquecimento ou resfriamento, conforme equação 3 (CRAIG & READING, 2007; GIOLITO, 2003) (Tr – Ta = ΔT), em ritmo linear (dT/dt = Cte) (3) 41 Figura 11 - Esquema da Analise térmica diferencial Fonte: ANTONINO, 2007 Através desta técnica, podem-se acompanhar os efeitos de calor associados com alterações físicas ou químicas da amostra, dentre as quais se destacam: transições de fase (fusão ebulição, sublimação, congelação, inversões de estruturas cristalinas) e/ou reações (cristalização, desidratação, dissociação, decomposição, óxido-redução) que são capazes de causar variações de calor. De modo geral, as transições de fase como desidratações produzem efeitos endotérmicos, por outro lado às reações de cristalizações, oxidações, algumas reações de decomposição produzem efeitos exotérmicos (ANTONINO, 2007; GIOLITO, 2003). 42 2.3.7.3 Potencial Zeta O estado de dispersão de uma suspensão nanométrica pode ser caracterizado pelo potencial elétrico da superfície das partículas. Em meio aquoso, as partículas possuem uma carga superficial formando uma camada que difere do meio dispersante. Quando uma partícula se move (movimento browniano), os íons dentro do limite (camada de superfície da partícula e do meio dispersante) se moverão com ela, mas os íons para além do limite não iram se mover com a partícula. Este limite é chamado de superfície de plano hidrodinâmico de cisalhamento (MORAES, 2009; PAPINI, 2003). Portanto, o potencial zeta é calculado pela medida do potencial elétrico aplicado na superfície de cisalhamento (Figura 12). Dupla elétrica camada Plano hidrodinâmico de cisalhamento Partícula negativa com carga Potencial do meio dispersante Potencial de superfície da partícula Potencial Zeta Figura 12 - Potencial Zeta Fonte: Zeta Potential Overview, da empresa Brookhaven Instruments 43 Determina-se o potencial zeta através da mobilidade eletroforética, sendo também calculado em equipamento de espalhamento de luz, uma vez que a variação na frequência de luz espalhada equivale à mobilidade eletroforética (PAPINI, 2003). 2.3.7.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) Microscopia eletrônica de transmissão é uma importante ferramenta de caracterização morfológica de compostos nanométricos. Utiliza-se a MET para a visualização dessas estruturas com resolução espacial de tamanho entre 2 nm a 1 µm (PAPINI, 2003). Um microscópio eletrônico de transmissão é composto por: um canhão de elétrons, lentes condensadoras, lente objetiva, conjunto de lentes intermediarias e um sistema de detecção (Figura 13). Figura 13 - Componentes de um microscópio eletrônico de transmissão (MET) Fonte: TIZEI, 2008. 44 O equipamento é mantido em alto vácuo (10-5 Pa). Além disso, é utilizado nitrogênio liquido como forma de eliminar possíveis contaminantes que venham dessorver das amostras (TIZEI, 2008). Assim, a formação da imagem é acompanhada por um sistema de projeção, aonde uma onda plana de elétrons é transmitida através de uma coluna composta por lentes eletromagnéticas e aberturas que direcionam a intensidade e colimação do feixe antes e após o atravessamento da amostra até atingir o filme fotográfico ou a tela de observação. A onda resultante da transmissão, responsável pela formação da imagem, encontra-se na faixa típica de voltagens de aceleração dos elétrons de 100kV-400kV (PAPINI, 2003; TIZEI, 2008). Neste trabalho, desenvolveu-se uma nanoformulação de quitosana, a qual foi caracterizada pelas técnicas descritas nesta revisão, voltada para aplicação da sanidade de peixes de grande importância para o agronegócio da piscicultura. 45 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivos Geral O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e caracterizar um sistema carreador nanoparticulado de quitosana com aplicação voltada para sanidade de Tambaquis Amazônicos. 3.2 Objetivos específicos Analisar as características físico-químicas da quitosana (QTS), do tripolifosfato de sódio (TPP) e do Isotiocianato de fluoresceína (FITC) por análise térmica e espectrometria na região do infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR); Obter os sistemas nanoestruturados de QTS marcados com FITC; Realizar a caracterização físico-química das nanopartículas de QTS marcadas com FITC pelo método de gelatinização ionotrópica, através das análises: termoanalíticas, FT-IR, distribuição do tamanho de partícula, análise da carga superficial e microscopia eletrônica de transmissão; Avaliar a biodistribuição das partículas fluorescentes em tecidos de tambaquis; Quantificar a fluorescência em tecidos de tambaquis amazônicos. 46 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Material Quitosana obtida da Sigma, Baixo Peso molecular, grau de desacetilação 94,15% Tripolifosfato de sódio (TPP) SIGMA® Isoticiocianato de Fluoresceína (FITC) SIGMA® 4.1.1 SOLVENTES E REAGENTES Ácido acético (Vetec ®) Metanol desidratado (Merck ®) Hidróxido de sódio (Vetec ®) Brometo de Potássio (KBr)(Vetec ®) 4.1.2 EQUIPAMENTOS Analisador de partículas ZetasizerNano ZS- Malvern e software DTS nano. Liofilizador FreeZone® 4.5 Liter Freezer Dry Systms – Labconco Corporation (Kansas City- MO, USA); Termobalança Shimadzu DTG-60H Analisador Térmico Shimadzu modelo DSC- 60 Espectrofotômetro na região do infravermelho Perkin Elmer modelo1760 X FT- IR; Peagâmetro HANNA ® Microscópio de fluorescência Axioplan I (Carl Zeiss, Germany) equipado com filtro BP450-490 e LP515 e câmera AxioCam ERc Microscópio FEI Tecnai G20 47 4.2 Métodos 4.2.1 MARCAÇÃO DA QUITOSANA COM FITC Inicialmente, preparou-se uma solução de FITC (100 mg) em 150 mL de metanol desidratado. Em seguida, esta solução foi adicionada a um volume de 100 mL de solução de quitosana (1%) em ácido acético 0,1M, permanecendo essa reação em repouso durante 3 horas protegida da luz, tempo necessário para que ocorra a ligação entre o grupo isotiocianato da fluoresceína e o grupo amino primário da quitosana.A quitosana marcada com FITC foi então precipitada por elevação do pH do meio de 8 a 9 com solução de hidróxido de sódio 0,5M. A remoção do excesso de FITC não conjugada foi retirada através de sucessivos ciclos de lavagem e centrifugação (40.000g durante 10 min), até que a não fluorescência foi detectada no sobrenadante por espectrofotometria na faixa do UV-Visível (ƛ exc 490 nm e ƛ exc 520 nm). A quitosana marcada com FITC (QTS-FITC) foi dissolvida em 80 mL de uma solução de acido acético 0,1M e colocada em membrana de diálise, para então, ser dialisada durante três dias em ambiente escuro com uso de 5L de água destilada substituída diariamente (MA et al. 2003). 4.2.2 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS PELO MÉTODO DE GELATINIZAÇÃO IONOTRÓPICA As nanopartículas fluorescentes de quitosana reticulada com tripolifosfato de sódio (NP-FITC) foram preparadas através da metodologia de Calvo et al (1997) com adaptações. Uma solução de 2 mL de TPP (0,1% em hidróxido de sódio a 0,05M) foi gotejada em 4 mL de uma solução de QTS-FITC (0,2% em 0,25% de ácido acético) sob agitação magnética (SARMENTO et al. 2006). A solução final foi congelada para posterior liofilização das NP-FITC. 48 4.2.3 CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA DA QTS, FITC, TPP E DAS NP- FITC 4.2.3.1 Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) Os espectros de infravermelho foram obtidos a partir das amostras de QTS, FITC, TPP e NP-FITC, que foram misturadas com Brometo de Potássio (KBr) e prensadas em alta pressão para a formação das pastilhas. Os espectros foram obtidos através do registro de 128 varreduras de 400 a 4000 cm -1, com resolução de 2 cm-1 (VIMAL et al. 2012) 4.2.3.2 Análise térmica: termogravimetria e análise térmica diferencial As amostras de QTS, FITC, TPP e NP-FITC foram submetidas aos ensaios térmicos TG-DTG e DTA em termobalança Shimadzu DTG 60H. Uma quantidade de 4mg de cada amostra foi colocada em cadinho de alumina, sob as seguintes condições termoanalíticas: razão de aquecimento de 5°C/min, 10°C/min e 15°C/min; atmosfera dinâmica de nitrogênio (fluxo de 50mL/min); e intervalo de temperatura entre 25 a 600°C (CHAVES et al. 2009 ; SARMENTO et al. 2006). 4.2.3.3 Medidas de tamanho (diâmetro médio), e polidispersividade A técnica de espalhamento dinâmico da Luz “Dynamic light scattering” (DLS), foi utilizado para determinação do tamanho médio das partículas (diâmetro 49 hidrodinâmico) e índice de polidispersão (PDI) (MENDES, 2013; SILVA, 2010; TRIERWEILER, 2009). O índice de polidispersão fornece informações sobre a homogeneidade distribuição dos tamanhos das partículas. A Tabela 2 a seguir mostra os valores de referência para PDI. Tabela 2 - Valores de referência para PDI PDI CARACTERISTICAS 0,00 a 0,05 Usual e somente para medidas encontradas para padrão de látex e/ou partículas produzidas e classificadas como monodispersas 0,05 a 0,08 Amostra quase monodispersa 0,08 a 0,7 Faixa de polidispersividade média Amostra muito polidispersa: Toma-se cautela na interpretação dos resultados, 0,7 pois amostra pode não ser adequada para a técnica de DLS, como por exemplo, deve haver quantidade significativa de partículas maiores. Fonte: COSTA, 2012 As NP-FITC foram dispersas em água de um afluente do rio Amazonas, previamente filtrada em um sistema PELLICON (Millipore Co. Billerica, MA) com membrana 0,1 micron PVDF. As análises foram determinadas diluindo (1/10 v/v) das suspensões de nanopartículas. O diâmetro médio e a polidispersividade das NPFITC foram determinados em triplicata no equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited- Worcestershire, UK) e os resultados foram obtidos em nanômetros para as medidas em tamanho médio (SILVA, 2010). 4.2.3.4 Medidas de carga superficial (potencial zeta) As NP-FITC foram dispersas em água de um afluente do rio Amazonas, previamente filtrada em um sistema PELLICON (Millipore Co. Billerica, MA) com 50 membrana 0,1 micron PVDF. As análises foram determinadas diluindo (1/10 v/v) das suspensões de nanopartículas. A carga superficial das NP-FITC foi determinada em triplicata no equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments LimitedWorcestershire, UK) e os resultados foram obtidos em mV (SILVA, 2010). 4.2.3.5 Microscopia eletrônica de Transmissão (MET) A microscopia eletrônica de transmissão foi realizada para verificar a forma e homogeneidade das NP-FICT, no microscópio FEI Tecnai G20, com fonte de 200 kV. Grades de cobre aderidas a um filme de formivar (0,5 %) foram previamente metalizadas com ouro. A suspensão das NP-FITC foi sonicada por 5 minutos, para melhorar dispersão e evitar a sua aglomeração. Em seguida, uma gota da suspensão foi adicionada sobre a grade de cobre por 30 segundos, retirando-se, o excesso com papel-filtro para então ser adicionada uma gota da solução de ácido fosfotúngstico (PTA) a 2% como contraste (como excesso também retirado com papel-filtro) (MOURA, 2008). 4.2.4 TAMBAQUIS Foram utilizados para realização desse estudo 40 alevinos de tambaquis advindos da região de Santarém/PA, conforme autorização do IBAMA n° 27119-1, emitida em 25 de fevereiro de 2011 (Anexo 1). 51 4.2.4.1 Exposição dos tambaquis amazônicos aos banhos contendo NP-FITC O estudo foi realizado na Estação de Piscicultura da Embrapa Amazônia Oriental, localizada no parque ambiental do Utinga no Estado do Pará durante o mês de janeiro de 2012. Foram utilizados alevinos de Tambaqui (Colossoma macropomum) previamente submetidos à biometria (± 5 cm). Os tambaquis foram aclimatados em tanques de polietileno com volume de 20L por um período de 72 horas, antes da exposição aos banhos contendo NP-FITC. Os tambaquis foram divididos em quatro grupos, contendo sete alevinos, em tanques de polietileno com volume fixo de 500 mL. Os grupos foram identificados de acordo com os diferentes períodos de exposição dos tambaquis frente aos banhos de NP-FITC nos tempos de 30, 60 e 90 minutos e o grupo controle. As NP-FITC (0,2 g) foram ressuspensas em 30 mL de água do Lago Bolonha e Água Preta (afluentes do rio Amazonas). Os parâmetros físico-químicos das unidades experimentais, como temperatura, pH, oxigênio dissolvido, condutividade elétrica e transparência da água foram monitorados. As partículas ressuspendidas foram então expostas aos diferentes grupos de banho de tambaquis. Após cada período de exposição, os peixes de cada grupo foram transferidos vivos em sacos plásticos contendo oxigênio para o Laboratório de Histologia da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA). 4.2.4.2 Avaliação da biodistribuição de nanopartículas mucoadesivas em tecidos de tambaquis amazônicos A preparação histológica foi realizada no Laboratório de Pesquisa Carlos Azevedo/UFRA, sob a coordenação do Dr. Edilson Rodrigues Matos. Os tambaquis foram submetidos à analgesia com água gelada, e em seguida, eutanasiados através da secção da medula espinhal após o período de 3,5 horas de manutenção dos peixes em água livre de NP-FITC. A necropsia foi realizada com remoção dos arcos branquiais, pele, estômago e segmento inicial de intestino delgado com 52 fixação dos materiais em solução de formalina tamponada a 10% para posterior processamento histológico. Os tecidos de cada órgão foram processados em parafina e submetidos a cortes utilizando o micrótomo rotativo. Os cortes histológicos de ± 6 cm de espessura foram dispostos em lâminas de vidro e encaminhados à microscopia de fluorescência do Laboratório de Microscopia de Cultivo Celular da UFPA, a fim de verificar a presença das nanopartículas mucoadesivas de quitosana aderidas aos tecidos de tambaquis dos órgãos analisados. A intensidade de fluorescência foi determinada com auxílio do programa Image J conforme metodologia descrita por Burgess et al (2010). 4.2.4.3 Estatística Toda estatística foi realizada com o auxílio do programa Bioestatic 5.0, utilizando Análise de Variância Kruska-Walis a partir da comparação entre as médias pelo método de Dunn. 53 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Síntese de nanopartículas fluorescentes por Gelatinização Ionotrópica A quitosana é um polímero que apresenta a característica de um polieletrólito positivo quando em solução, devido à grande quantidade de grupos aminos presentes ao longo da cadeia polimérica. A marcação QTS-FITC foi realizada a partir da reação entre o grupo amino primário da quitosana e o grupamento isotiocianato do TPP e observou-se que após os sucessivos ciclos de lavagem e centrifugação, foi detectada ausência de fluorescência no sobrenadante por uv-vis. O que significa que o processo de diálise, o qual fora submetido às nanopartículas removeu o excesso de FITC não conjugada. Segundo Calvo et al (1997), a formação das nanopartículas após adição da solução de QTS-FITC com a solução de TPP foi resultante das ligações intermoleculares que ocorreram entre o grupamento amino da quitosana e grupo fosfato do TPP, observando-se um composto de aspecto levemente turvo, e com pH final de síntese corrigido para 6,6. O pH foi corrigido para tal valor, devido ser o pH das águas dos lagos Bolonha e Água Preta, no qual as partículas foram ressuspendidas para realização dos banhos e posterior avaliação de biodistribuição das mesmas em alevinos tambaquis. 54 5.2 Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) A técnica da espectroscopia do infravermelho objetiva a identificação dos grupos funcionais característicos dos compostos. Para analisar a formação de nanopartículas fluorescentes, os espectros de infravermelho (FT-IR) da QTS, FITC, TPP e das NP-FITC foram analisados (Figura 14). A Tabela 3 registra as principais bandas que confirmam a formação de NP-FITC. Na Figura 14A, uma pequena banda que aparece em 2880 cm–1 é decorrente do estiramento dos grupos -CH2 presentes no polímero quitosana (CHAVES et al. 2009). O pico em 662,18 cm-1 refere-se às vibrações dos anéis piranosídicos da quitosana (AOUADA, 2009). Outras bandas também são evidenciadas em 3434 cm–1, que caracterizam o estiramento axial de -OH e NH2 , comumente estudado em quitosana pura (CHAVES et al. 2009; QI, 2004; XU et al. 2003). Porém, quando comparado com o espectro de nanopartículas fluorescentes (Figura14D), percebe-se um deslocamento da banda de 3434 para 3400 cm–1, resultado também verificado por Xu et al (2003) em seu trabalho com nanopartículas de quitosana preparadas por reticulação iônica. Esse dado corresponde à ligação de hidrogênio aumentada, resultando em um pico em 3400 cm–1 mais largo. Para a quitosana, uma banda próxima a 1651 cm–1 pode ser atribuída ao estiramento da ligação C=O de amina I (AOUADA, 2009; CHAVES et al. 2009), uma vez que a estrutura polimérica sempre apresentará quantidades de quitina ainda associadas justificando a presença dos grupos carbonilas verificadas no espectro. O pico próximo a 1594 cm–1 refere-se às deformações relacionadas às ligações dos grupos NH2 e C–N, características do grupo amino (CHAVES et al. 2009). Logo, observou-se que as bandas em 1651 cm –1 e1594 cm –1 modificadas respectivamente para 1634,53 cm–1 e 1538,20 de quitosana foram cm–1 em NP-FITC (Figura 14D). Pode-se observar através da análise da Figura 14D, que houve reticulação com o TPP pelo aparecimento de um pico em 1154 cm -1 característico da deformação do éster fosfato (PAVIA et al. 2001; SILVERSTEIN et al. 2007) desta forma, há formação de nanopartículas de quitosana reticuladas com TPP. 55 Visualiza-se ainda na Figura 14D que o espectro 1634 cm-1 de amina das nanopartículas é diminuído quando comparado com a quitosana pura em 1651 cm-1, resultado próximo ao encontrado por Campos e colaboradores (2004). Significa que a reação entre o grupo ácido da fluoresceína e grupamento amino quitosana resultou na formação de nanopartículas fluorescentes com um menor número de grupos amino livres. 1 Tabela 3 - Principais bandas de Infravermelho (cm- ) da quitosana e nanopartículas fluorescentes Possíveis atribuições Quitosana Pura -1 ( cm ) NP-FITC -1 ( cm ) Estiramento ligação O-H e NH2 3434 3400 Estiramento CH2 2880 2920 Estiramento C=O de Amina I 1651 1634 Deformações NH2 e C-N 1594 1538 Estiramento C-O 1076 1383 Vibrações de Anéis Piranosídicos 662 - - 1154 Deformação P=O Figura 14 - Espectros de FT-IR das Quitosana (A); TPP(B); FITC (C); NP-FITC (D) 56 5.3 Análises Térmicas Técnicas termoanalíticas são amplamente empregadas para caracterização e controle de qualidade de formulações farmacêuticas (NETO, 2005; RAO, 2008, ARORA et al. 2011). Assim este estudo fez uso das técnicas termoanalíticas de TG, DTG e DTA para verificar a estabilidade térmica e comportamento de pirólise da QTS, TPP, FITC NP-FITC em diferentes razões de aquecimento de 5, 10 e 15°C/min. 5.3.1 QUITOSANA As Figuras 15 e 16 ilustram os eventos de termodecomposição da quitosana. A tabela 4 registra o efeito do calor em função das razões de aquecimento testadas. Foi observado que as formas das curvas de degradação térmica foram bastante semelhantes, mudando apenas quando o polímero foi submetido na razão de aquecimento de 10°C/min, Isto é devido ao atraso de transferência de calor com o aumento da taxa de aquecimento (ARORA et al. 2011). Nas duas primeiras razões de aquecimento houve dois eventos de perda de massa. Na razão de 5° C/min, o primeiro evento de perda de massa ocorreu no intervalo de 39°C a 87ºC, com perda de aproximadamente 12% e o segundo evento entre as temperaturas de 279°C a 336°C, perda de massa de 53%. Na razão de aquecimento de 10°C/min, foi possível observar dois eventos térmicos, o primeiro evento ocorre entre 45°C e 89°C com perda de massa de 14% e o segundo no intervalo de 28°C e 339°C, com perda de 55%. Em contrapartida, para a razão de aquecimento de 15°C/min, três eventos termoanalíticos foram observados. O primeiro entre as temperaturas de 35ºC e 95°C e perda de massa de 14%, o segundo no intervalo de 279°C e 329°C e perda de massa de 51% e o terceiro evento térmico entre 509°C e 592°C com perda de 33%. 57 A decomposição da quitosana ocorreu em passo único, como confirmado pelas curvas DTG (Figura 16). A decomposição principal da quitosana ocorreu em torno de 300°C. O primeiro processo de decomposição de quitosana ocorreu em média de 39°C, e é confirmado por eventos endotérmicos (Figura 17). A literatura relata que isso corresponde à evaporação da água, ou seja, a eliminação da água fisicamente adsorvida e/ou fracamente ligada às moléculas de quitosana. O segundo evento que iniciou em media de 279°C correspondeu à reação de despolimerização do polímero através da decomposição dos anéis de piranose (processo de desidratação e desaminação) (ARORA et al. 2011; AOUADA, 2009; DAMIAN, 2005). Na razão de 10°C/min, evidenciou-se o terceiro evento térmico, marcado por efeito exotérmico em 565°C que foi atribuído a cisão da junção C-O-C do polímero e separação dos grupos acetila. A pirólise do polissacarídeo inicia-se pela perda de ligações glicosídicas que leva a decomposição e formação de ácido acético butírico e outros ácidos de cadeias C2, C3 e C6 (HASSAN et al. 2011; NETO, 2005). Dessa forma a análise termogravimétrica permitiu concluir que a quitosana estudada é termicamente estável até 279ºC em atmosfera de nitrogênio. Figura 15 - Curvas TG de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min 58 Figura 16 - Curvas DTG de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min Figura 17 - Curvas DTA de QTS obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min 59 Tabela 4 - O efeito do calor, durante a degradação térmica de quitosana nas razões de 5, 10 e 15ºC/min Razão de aquecimento (°C/min) 1° estágio (°C)/Perda de massa (%) Pico Temp. (°C)/Efeito térmico 2° estágio (°C)/Perda de massa (%) 5 39-87 (12) 63 (endo) 279-336 (53) 10 15 45-89 (14) 35-95 (14) 69 (endo) 147 (exo) 268 (endo) 72 (endo) 280-339 (55) 279-329 (51) Pico Temp. (°C)/ Efeito térmico 3° estágio (°C)/Perda de massa(%) Pico Temp. (°C)/Efeito térmico 307 (exo) 403(exo) - - - - 509-592 (33) 565 (exo) 307 (exo) 350 (exo) 456 (exo) 556(endo) 571 (exo) 247(endo) 315 (exo) 380 (exo) 60 5.3.2 TRIPOLIFOSFATO DE SÓDIO E ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA As Figuras 18 e 19 ilustram os eventos de termodecomposição do TPP e FITC, respectivamente, para a razão de aquecimento de 10°C/min. Observou-se que o TPP apresentou cinco eventos térmicos (Figura 18). O primeiro evento ocorre entre 38°C e 56°C com perda de massa de 0,478%; segundo no intervalo de 77°C e 94°C, com perda de 0,542%; o terceiro entre as temperaturas de 172°C e 138°C com perda de massa de 0,797%; o quarto evento entre 176°C e 201°C com perda de 0,462% e o quinto evento foi entre 220°C e 369°C com perda de massa de 1,212%. Dessa forma, a primeira etapa de degradação correspondeu a uma perda aproximadamente 0,5 mols de água por mol de Na4HP3OI.H20. As perdas posteriores e reduzidas de massa foram devido à superfície de área reduzida do sal (MARIJUAN et al. 2013). O FITC também apresentou cinco eventos térmicos (Figura 19). O primeiro evento ocorreu entre 27°C e 51°C com perda de massa de 2,38%; o segundo no intervalo de 79°C e 116°C, com perda de 2,52%; o terceiro entre as temperaturas de 173°C e 195°C com perda de massa de 0,3%; o quarto evento entre 244°C e 197°C com perda de 0,44% e o quinto evento foi entre 438°C e 528°C com perda de massa de 1,67%, com estágios de perda de massa marcados pela perda e água do material. Figura 18 - Curvas TG-DTG e DTA do TPP obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) na razão de aquecimento de 10°C/min. 61 Figura 19 - Curvas TG –DTG e DTA de FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) na razão de aquecimento de 10°C/min 5.3.3 NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES As NP-FITC também foram identificadas através das análises térmicas como mostra as Figuras 20, 21 e 22. A tabela 5 registra o efeito do calor em função das razões de aquecimento testadas. Durante os estudos de termodegradação (Figuras 20 e 21) as duas primeiras razões de aquecimento testadas apresentaram quatro eventos de perda de massa. A razão de aquecimento de 5°C/min apresentou quatro eventos de perda de massa: o primeiro evento ocorreu no intervalo de 41°C a 61ºC, com perda de aproximadamente 29%; segundo evento entre as temperaturas de 115°C a 162°C, com perda de massa de 6,71%; o terceiro no intervalo de 223°C a 276°C com perda de 12% e o quarto evento entre as temperaturas de 317°C e 369°C com perda de massa de 14%. Na razão de aquecimento de 10°C/min o primeiro evento ocorreu entre 52 °C a 70°C com perda de massa de 29%; o segundo no intervalo de 121°C e 164°C, com perda de 6%; o terceiro no intervalo de 237°C a 285°C com perda de 12% e o quarto evento de perda de massa entre 345°C a 409°C, com perda de massa de 13%. Em contrapartida, são visualizados na razão de aquecimento de 15°C/min, três eventos termoanalíticos de perda de massa. O primeiro entre as temperaturas 62 de 35ºC a 71°C com perda de massa de 30%, o segundo no intervalo de 126°C a 172°C e perda de massa de 6% e o terceiro evento térmico entre 239°C a 383°C com perda de 28%. Foram obtidos os termogramas das nanopartículas de quitosana por análise térmica diferencial os quais estão ilustrados na Figura 22. A razão de 5°C/min mostrou dois efeitos endotérmicos, o primeiro em 56°C e o segundo em 296°C, seguido por um pico exotérmico em 324°C. Na razão de 10°C/min foi possível identificar oito efeitos térmicos. Um endotérmico em 62°C, seguido por sete exotérmicos: o primeiro em 103°C, seguidos em 322°C, 327°C, 565°C, 576°C, 583°C e 590°C. Para a razão de 15°C/ min, foram obtidos três efeitos térmicos, os dois primeiros foram endotérmicos com picos em 60°C e 300°C, seguido por um exotérmico em 344°C. O maior número de eventos térmicos de perda de massa foi verificado nas NP-FITC. Isso se atribui a presença de compostos higroscópicos como o TPP e o FITC, mantendo-se dessa forma maior quantidade de nível de água no material, comprometendo a estabilidade do sistema. Outra explicação para a menor estabilidade das NP-FITC deve-se ser fundamentada na neutralização dos grupos amino da quitosana pelos grupos aniônicos do FITC e TPP. Conforme estudo de Sinha et al (2004), na qual utilizaram micropartículas de quitosana preparadas em meio acido e reticuladas com sulfato de sódio, a instabilidade da formulação deveuse a neutralização de grupos aminos carregados positivamente da quitosana pelo sulfato de sódio. 63 Figura 20 - Curvas TG de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min Figura 21 - Curvas DTG de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min 64 Figura 22 - Curvas DTA de NP-FITC obtidas em atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL/min) com as razões de aquecimento de 5°C,10°C e 15°C/min 65 Tabela 5 - O efeito do calor, durante a degradação térmica de NP-FITC nas razões de 5, 10 e 15ºC/min Razão de aquecimento (°C/min) 1° estágio (°C)/ Perda de massa (%) Pico Temp. (°C)/ Efeito térmico 2° estágio (°C) /Perda de massa (%) Pico Temp. (°C)/ Efeito térmico 3° estágio (°C)/ Perda de massa(%) 5 41-61 (29) 56 (endo) 115-162 (6) 296 (endo) 223-276 (12) 10 52-70 (29) - 237-285 (12) 15 35-71 (30) 62 (endo) 103 (exo) 60 (endo) 121-164 (6) 126-172 (6) - 239-383(28) Pico Temp. (°C)/ Efeito térmico 322 (exo) 327 (exo) 300 (endo) 344 (exo) 4° estágio (°C)/ Perda de massa(%) Pico Temp. (°C)/ Efeito térmico 317-369 (14) 324 (exo) 345-409 (13) 565 (exo) 576 (exo) 590 (exo) - - 66 5.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) As nanopartículas em suspensão após a síntese de preparação por gelatinização ionotrópica foram analisadas pelas imagens de MET e apresentaram formato esférico com discretos pontos de agregação e distribuição de tamanho de partículas de 107 nm como apresentado na Figura 23. Conforme Schaffazick & Guterres et al (2003), nanopartículas podem ser geradas com diâmetros médio de 1 a 300 nm, este resultado vai depender sobretudo da escolha do material polimérico e do método de obtenção a ser empregado. Figura 23- Micrografia de MET de nanopartículas fluorescentes de quitosana; aumento 35.000x 67 5.5 Análise doTamanho e Polidispersividade das NP-FITC A análise do tamanho e da polidispersividade das NP-FITC realizada no aparelho Zeta Size Nano mediu o raio hidrodinâmico do material nanoparticulado em suspensão na água do rio Amazonas e revelou diâmetro da partícula em suspensão de 211,1 nm (Figura 24). Segundo Costa (2012), esta técnica baseia-se no movimento aleatório das partículas sob o impacto das moléculas do solvente sobre a sua superfície. Desta forma, pode-se inferir que a medida de tamanho das NP-FITC ressuspendidas na água do rio Amazonas mostrou-se alterada daquela visualizada na imagem da MET (Figura 23) passando de 107 nm para 211,1 nm. Este fato é justificado pela formação de pequenos pontos de agregação oriundos da ressuspensão das partículas na água do rio e pela sua discreta polidispersão (PDI = 0,34), classificada na faixa de polidispersão média (Tabela 2). Tamanho de partícula (nm) Figura 24 - Distribuição do tamanho médio de nanopartículas fluorescentes em função dos percentuais acumulativo e da intensidade. Fonte: Aparelho Zeta size nano (Malven Instruments) 68 5.6 Análise da Carga Superficial das Nanopartículas As NP-FITC, apresentaram potencial zeta positivo de + 32,51 mV ± 0,8 mV em pH 6,6 da água do rio. Dessa forma, ressalta-se que apesar da formulação ter apresentado polidispersividade média (PDI =0,34), o potencial zeta maior que 30 mV confere estabilidade a formulação e menor tendência a agregação das partículas (TRIERWEILER, 2009). Os autores Schaffazick & Guterres (2003), afirmam que uma boa estabilidade físico–química de suspensões coloidais é alcançada com valores de potencial zeta relativamente altos, devido às forças repulsivas que tendem evitar a agregação em função das colisões ocasionais de nanopartículas adjacentes, dessa forma, a repulsão eletrostática gerada evita a aglomeração e agregação. Além disso, o potencial zeta é medido para determinar a propriedade mucoadesiva das partículas (HE et al. 1998).Nanopartículas com cargas positivas na sua superfície são capazes de se aderir à mucosa e abrir de forma transitória as junções apertadas entre as células epiteliais adjacentes, de modo a favorecer a absorção do principio ativo (FANGUEIRO, 2012). O muco é formado em sua grande maioria por glicoproteínas (mucina), lipídios, eletrólitos e água (BRAVO-OSUNA et al. 2007; HE et al. 1998). Ressalta-se que para esse estudo a propriedade mucoadesiva destas nanopartículas, é uma característica que favorece a interação com os grupos aniônicos da mucina, logo, há formação de uma dupla camada de carga elétrica na interface polímero-mucina (WATTANAKORN et al. 2010) que foi frequentemente encontrada nos tecidos dos peixes analisados. 69 5.7 Ensaio de NP-FITC em tecido de tambaquis 5.7.1 ANÁLISE DA QUALIDADE DE ÁGUA DO TANQUE DOS TAMBAQUIS Os parâmetros limnológicos que determinam a qualidade da água como: pH, temperatura da água, condutividade elétrica, oxigênio dissolvido e transparência de água estão descritos na Tabela 6. Tabela 6 - Valores médios e desvio padrão dos parâmetros de qualidade da água do tanque de tambaquis Parâmetro observado Variação pH 6,65 ± 0,049 Temperatura (°C) 30°C 2 Condutividade elétrica (µS/cm ) 29,86 ± 0,60 Oxigênio Dissolvido (mg/L) 6,35 ± 0,049 Transparência em disco de Secchi 2m e 20 cm A avaliação de qualidade da água é um item muito importante para a criação dos animais em qualquer fase do crescimento (TAVARES-DIAS, 2009). Todas as variáveis analisadas no experimento apresentaram-se relacionadas com o nível hidrológico em faixas consideradas toleráveis às populações ícticas. Os valores de qualidade de água encontrados nos tanques conferem com a maioria dos trabalhos encontrados para padrão de qualidade da água necessário à criação de tambaquis (BRASIL, 2000; TAVARES-DIAS, 2009). 70 5.7.2 AVALIAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO DA FLUORESCÊNCIA EM TECIDOS DE TAMBAQUIS As análises da quantificação de fluorescência foram realizadas através das micrografias das seguintes secções de: brânquias (Figuras 25A, 25B, 25C e 25D), pele (26A, 26B, 26C e 26D), estômago (Figuras 27A , 27B, 27C e 27D) e segmentos iniciais de intestino delgado (Figuras. 28A, 28B, 28C e 28D). As setas nas respectivas figuras sinalizam os pontos de fluorescência ao longo dos tecidos analisados. Figura 25A- Seção longitudinal de filamento branquial de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X Figura 25C - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NPFITC; objetiva 10X. Figura 25B - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10X. Figura 25D - Seção transversal de brânquias de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10X. 71 Figura 26A- Seção longitudinal de pele de tambaquis, grupo controle; objetiva 10 X. Figura 26C- Seção Transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X. Figura 26B - Seção transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X. Figura 26D - Seção Transversal de pele de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X. 72 Figura 27A- Seção longitudinal de estômago de tambaquis, grupo controle; objetiva 10X Figura 27C- Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X. Figura 27B- Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10X. Figura 27D - Seção transversal de estômago de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X. 73 Figura 28A - Seção longitudinal de intestino de tambaquis, grupo controle; objetiva 10X. Figura 28B- Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 30 minutos de NP-FITC; objetiva 10 X Em todos os tecidos avaliados fo Figura 28C- Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 60 minutos de NP-FITC; objetiva 10X. Figura 28D- Seção transversal de intestino de tambaquis submetido a banho de 90 minutos de NP-FITC; objetiva 10X 74 Em todos os tecidos avaliados foi identificada a presença de nanopartículas com grande intensidade de fluorescência, mesmo após três horas e meia, relativa manutenção dos peixes em água livre de NP-FITC (p<0,05). As médias da quantificação das áreas de fluorescência dos tecidos analisados e seus respectivos erros padrão estão demonstrados na tabela 7. A diferença de comportamento de fluorecência entre brânquias e demais tecidos pode ser atribuída ao fato da camada de muco na brânquia ser mais delgada quando comparada aos demais tecidos (DICKERSON, 2006). Por sua vez, a tendência redução da fluorescencia no tempo 90' do tecido estomacal é coincidente com o aumento de fluorescencia na porção inicial do intestino, que pode estar associado ao esvaziamento do estômago e uma baixa retenção de nanopartículas nesse tecido, devido a diminuição da carga superficial da mucina e de ácido siálico ionizada em pH inferiores 5.5 (HE et al.1998). De acordo estes resultados, nanopartículas de quitosana apresentam grande potencial como nanocarreadores de medicamentos e antígenos vacinais para piscicultura, em especial, porque peixes doentes, parasitados ou sob efeito de estresse aumentam drasticamente a produção de muco, direcionando a retenção de princípios ativos nos peixes doentes. Seu uso na forma de uma dispersão em água, como realizada nesse experimento, configura uma nova abordagem terapêutica na piscicultura uma vez as formas tradicionais de uso de medicamentos são limitadas devido aos custos da mão de obra de aplicação, estresse de tratamento, tempo de exposição ao princípio ativo etamanho dos peixes (BURKA et al. 1997; ESTEBAN, 2012). 75 Tabela 7 - Intensidade de fluorescência de brânquias, pele, estômago e porções iniciais de intestino de alevinos de tambaqui expostos a 0,1 g/L de NFQ nos tempos (0- controle negativo, 30 60 e 90 minutos). Intensidade de Fluorescencia ± EP (pixel/area)* Tecido Brânquias 0' (control) 30' a 5632,8 ± 1375,5 60' 59367.5 ± 11.816.9 b 18806,3 ± 3291,5 90' b 187213,7 ± 39007,6 b Pele a 16019,1 ± 1947,6 61512,4 ± 8141,7 b 99181,2 ± 9353,3 bc 147295,6 ± 18604,9 c Estômago Intestino 2790,6 ± 578,2 11840,9 ± 865,2 a a 51882,1 ± 6472,1 59097,2 ± 4699,5 b b 202290,2 ± 31066,9 91457,5 ± 14637,2 c bc 83123,9 ± 4292,0 b 292691,7 ± 29609,5 c *Letras distintas na mesma linha diferem entre si (p<0,05) pelo método de Dunn. 76 6. CONCLUSÕES Nanopartículas fluorescentes de quitosana reticuladas com tripolifostado de sódio obtidas neste trabalho apresentaram os grupos funcionais referentes à deformação do éster fosfato característico da reticulação da quitosana com o TPP e diminuição do espectro amino para 1154 cm-1. O resultado foi à formação de nanopartículas fluorescentes com um menor número de grupos amino livres. Nas diferentes razões de aquecimento investigadas para quitosana pura as curvas de termodecomposição revelaram perfil térmico semelhante, com decomposição do material em torno de 300°C. As NP-FITC apresentaram-se termicamente menos estáveis, devido à neutralização de grupos aminos positivos com os grupos fosfóricos aniônicos do TPP. Quanto ao tamanho e carga superficial, as NP- FITC revelaram valores de 211,1nm quando ressuspensas na água do rio Amazonas e carga catiônica de + 32,51 mV ± 0,8 mV em pH 6,6. Em todos os tecidos avaliados foi identificada a presença das nanopartículas com grande intensidade de fluorescência, com diferença estatística de fluorescência entre brânquias e demais tecidos, que pode ser atribuída à camada de muco na brânquia por ser mais delgada quando comparada os demais tecidos. Observou-se que a redução da fluorescência no tempo 90' do tecido estomacal coincidiu com o aumento da fluorescência na porção inicial do intestino, associado ao esvaziamento do estômago. Compreende-se que mais pesquisas serão necessárias para plataforma de desenvolvimento de nanopartículas mucoadesivas de quitosana como “drug delivery” de fármacos e antígenos vacinais na piscicultura comercial, que promoverá uma aplicação mais efetiva, racional e sustentável destes sistemas gerando uma maior rentabilidade no agronégocio. 77 REFERENCIAS AJUN, W. et al. Preparation of aspirin and probucol in combination loaded chitosan nanoparticles and in vitro release study. Carbohydrate Polymers, v. 75, n.4, p. 566574, 2009. ALMEIDA, N.M.et al. Alteração post-mortem em tambaqui (Colossoma macropomum), conservados em gelo. Ciência Rural, Santa Maria, v.96, p. 12881293, jul-ago, 2006. ALMEIDA, F. M. N. 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