HEMOGLOBINA A1C HEMOGLOBIN A1C-TURBI (HbA1C

HEMOGLOBIN A1C-TURBI
(HbA1C-TURBI)
COD 13044 1 x 50 mL
CONSERVAR A 2-8ºC
HEMOGLOBINA A1C
Reagentes para medir a concentração de Hemoglobina A1C
Unicamente para utilização in vitro em laboratório clínico
TURBIDIMETRÍA
FUNDAMENTO DO MÉTODO
Depois de preparar um hemolizado utilizando como detergente Brometo de
tetradeciltrimetilamónio (TTAB), a concentração da hemoglobina A1c (HbA1c) é quantificada
mediante um procedimento imunoturbidimétrico de inibição. Em primeiro lugar, mediante a
adição da amostra a um reagente formado por anticorpos dirigidos contra um lugar especifico da
HbA1c, formam-se complexos solúveis formados pela união de ambas as moléculas. Após a
adição à mistura de reacção de um segundo reagente, composto por poli-haptenos, os
anticorpos anti-HbA1c excedentes formam complexos insolúveis, anticorpo-poli-hapteno, que são
medidos turbidimetricamente. A estimativa do percentagem da HbA1c é realizada por medição da
concentração da hemoglobina total por espectrometría1.
COMPOSIÇÃO
A. Reagente: 2 x 95 mL. TTAB 9 g/L.
B. Reagente: 1 x 40 mL. Tampão fosfatos 20 mmol/L, pH 7,4.
C. Reagente: 1 x 40 mL. Tampão MES 25 mmol/L, Tampão TRIS 15 mmol/L, anticorpos de
cabra anti-HbA1C, pH 6,2.
D. Reagente: 1 x 10 mL. Tampão MES 25 mmol/L, Tampão TRIS 15 mmol/L, poli-hapteno HbA1C
≥ 8 µg/mL, pH 6,2.
Utilizar unicamente reagentes B, C e D com o mesmo número de lote.
REAGENTES AUXILIARES
S. Padrão de HbA1c (BioSystems Cod. 13045): Sangue humano e sangue ovino, TTAB 80 g/L. A
concentração de HbA1c e de hemoglobina está indicada no rótulo do frasco.
O sangue humano utilizado na preparação do padrão foi negativo para o antigénio HBs e para
os anticorpos anti-HCV e anti-HIV. No entanto, os padrões devem ser manuseados com
precaução como potencialmente infecciosos.
Irritante (Xi): R36/38: Irrita os olhos e a pele. S24/25: Evitar o contacto com os olhos e a pele.
− Curva de calibração: Representar graficamente os valores de absorvância de cada calibrador
face à respectiva concentração de HbA1c. Utilizar o Branco como calibrador de concentração 0.
A concentração de HbA1c na amostra é calculada por interpolação da sua absorvância na
curva de calibração.
O valor de concentração de HbA1C é rastreável ao método de referência normalizado pela
International Federation of Clinical Chemistry (IFCC)4.
Recomenda-se calibrar, pelo menos, a cada 2 meses, depois de uma mudança do lote de
reagente ou quando os procedimentos de controlo de qualidade assim o exigirem.
PROCEDIMENTO
Preparação do hemolizado
Os calibradores não requerem tratamento prévio.
1. Deixar o reagente A até atingir a temperatura ambiente.
2. Pipetar num tubo de ensaio:
Sangue
PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
O hemolizado é estável 4 horas a 15-25ºC, 24 horas a 2-8°C e 6 meses a –20ºC. Congelar só
uma vez.
Parámetros del ensayo (Nota 1)
Reagent 1: Reactivo B.
A25
GERAL
Técnica
Hb Total
Modo de análise Ponto final mono.
Tipo de amostra
sangue total
Unidades
mmol/L
Tipo de reação
crescente
Técnica de turbidimetria
não
Decimais
3
Nº de Replicatas
1
Nome da técnica no relatório
do doente
PROCEDIMENTO
Volumes
Os Reagentes (A), (B), (C) e (D) estão prontos a utilizar.
Padrão de HbA1c (S): Reconstituir o liofilizado com 2,0 mL de água destilada. Estável durante 8
horas a 15-25ºC, 2 dias a 2-8ºC e 3 meses a -20 ºC. Congelar somente uma vez.
Curva de Calibração: Preparar diluições do padrão utilizando uma solução salina 9 g/L como
diluente. Multiplicar a concentração do padrão de HbA1c pelo factor correspondente indicado no
quadro para obter a concentração de HbA1c das diluições.
Filtros
Tempos
DILUIÇÃO
1
2
3
4
5
240
Padrão de HbA1c (µL)
30
60
120
180
Sol. salina (µL)
210
180
120
60

0,125
0,25
0,5
0,75
1,0
Factor
CALIBRAÇÃO
AMOSTRAS
Sangue capilar ou venoso colhido mediante procedimentos padrão e com heparina ou EDTA
como anticoagulante.
HbA1C no sangue é estável 3 dias a 15-25ºC, 7 dias a 2-8°C e 6 meses a –20ºC. Congelar só
uma vez.
OPÇÕES
VALORES DE REFERÊNCIA
Os seguintes valores discriminantes foram estabelecidos pelo Diabetes Control and
Complications Trial Research Group (DCCT) e foram aceites em vários países para a população
não diabética e para a avaliação do grau de controlo da glicose no sangue em pacientes
diabéticos2,3.
NGSP-DCCT
%
IFCC
(mmol/mol)
Valores de referência
/ Grau de controlo
4,0 - 6,5
6,0 - 7,0
7,0 - 8,0
> 8,0
20 - 48
42 - 53
53 - 64
> 64
Não diabético
Objectivo
Bom controlo
Actuação precisa
A15
Hb Total
Ponto final mono.
sangue total
mmol/L
crescente
não
3
1
-
Leitura
Amostra
Reagente 1
Reagente 2
Lavagem
Fator de pré-diluição
Fator de pós-diluição
Principal
Referência
Leitura 1
Leitura 2
Reagente 2
bicromática
30
170
1,2
1,2
560
670
300 s
-
bicromática
30
170
1,2
1,2
560
670
312 s
-
Tipo de calibração
Nº de calibradores
Replicatas do calibrador
Replicatas do branco
Curva de calibração
específico
1
3
3
-
específico
1
3
3
-
sim
-
sim
-
-
-
Branco com solução salina
Limite de absorção do
branco
Limite do branco cinético
Limite de linearidade
Reagent 1: Reactivo C; Reagent 2: Reactivo D.
GERAL
Técnica
Modo de análise
Tipo de amostra
Unidades
Tipo de reação
Técnica de turbidimetria
Decimais
Nº de Replicatas
Nome da técnica no relatório
do doente
CALIBRAÇÃO
Hemoglobina:
− Branco: Realizar o branco do reagente com uma solução salina 9 g/L.
− Calibrador: Diluição 5 do Padrão de HbA1c. O valor de concentração de hemoglobina é
rastreável ao método de referência normalizado pela International Federation of Clinical
Chemistry (IFCC).
HbA1C:
− Branco: Realizar o branco do reagente com solução salina 9 g/L.
1000 µL
3. Agitar levemente. Evitar a formação de espuma. O hemolizado está pronto para o seu uso
quando a cor passar do vermelho para o castanho-esverdeado (aproximadamente 3 minutos).
CONSERVAÇÃO
Conservar a 2-8 ºC.
Os Reagentes e o padrão são estáveis até à data de validade indicada no rótulo, desde que
sejam mantidos bem fechados e a contaminação seja evitada durante a sua utilização.
Sinais de degradação:
− Reagente A: Presença de partículas, turbidez.
− Reagente B: Absorvância do branco de Hb Total superior a 0,010 a 560 nm.
− Reagente C e D: Absorvância do branco HbA1c inferior a 0,850 a 340 nm.
− Padrão de HbA1c S: Presença de humidade.
10 µL
Reagente (A)
PROCEDIMENTO
Volumes
Leitura
Amostra
Reagente 1
Reagente 2
Lavagem
Fator de pré-diluição
A25
A15
HbA1C
diferencial
bi-reagente
sangue total
mmol/L
crescente
sim
3
1
-
HbA1C
diferencial
bi-reagente
sangue total
mmol/L
crescente
sim
3
1
-
monocromática
8
200
40
1,2
-
monocromática
8
200
40
1,2
-
Fator de pós-diluição
Principal
Referência
Leitura 1
Leitura 2
Reagente 2
Filtros
Tempos
CALIBRAÇÃO
Tipo de calibração
Nº de calibradores
Replicatas do calibrador
Replicatas do branco
Curva de calibração
OPÇÕES
− Interferências: a lipemia (triglicéridos 6 g/L), o factor reumatóide (<750 IU/mL) e a bilirrubina
(60 mg/dL) não interferem. Outros medicamentos e substâncias podem interferir6.
Para os anticorpos anti-HbA1c utilizados neste equipamento de reagentes não foram
encontradas reacções cruzadas com HbA0, HbA1a, Hb1b hemoglobina acetilada, hemoglobina
carbamilada, albumina glicada, HbA1c lábil nem HbA1d. As variantes de hemoglobina HbS e
HbC não interferem. Concentrações muito elevadas de HbF podem provocar valores de HbA1C
inferiores aos esperados7,8.
2
340
180 s
480 s
195 s
2
340
168 s
480 s
192 s
específico
5
3
3
poligonal
decrescente
específico
5
3
3
poligonal
decrescente
sim
-
sim
-
A Hemoglobina A1c é o produto da condensação irreversível da glicose com o resíduo N-terminal
da cadeia β da hemoglobina A.
-
-
A concentração de HbA1C no sangue é directamente proporcional à concentração média de
glicose durante um período de tempo de 6-8 semanas, equivalente à vida média dos eritrócitos2,
e a glicose média estimada (eAG) pode ser calculada com as fórmulas seguintes9:
Branco com solução salina
Limite de absorção do
branco
Limite do branco cinético
Limite de linearidade
Nos pacientes com anemia hemolítica, anemia por deficiência de ferro ou quando foi praticada
uma transfusão, a idade média dos eritrocitos é alterada. Por este motivo, os resultados de
HbA1C destes pacientes devem ser interpretados com precaução.
CARACTERÍSTICAS DIAGNÓSTICAS
eAG (mg/dL) = 28,7 x HbA1c-NGSP-DCCT (%) – 46,7
CÁLCULO
eAG (mmol/L) = 1,59 x HbA1c-NGSP-DCCT (%) – 2,59
A concentração de HbA1c na amostra é calculada com a seguinte fórmula geral. Os valores
obtidos são rastreáveis ao método de referência descrito pela IFCC:
eAG (mg/dL) = 2,64 x HbA1c-IFCC (mmol/mol) + 15,0
eAG (mmol/L) = 0,146 x HbA1c-IFCC (mmol/mol) + 0,843
HbA1c (mmol/L)
HbA1c – IFCC (mmol/mol) =
x 1000
O ensaio foi concebido para medir a HbA1C em mmol/mol (IFCC) e em % (DCCT/NGSP). Não
deve ser aplicado na medição individual de Hb Total ou HbA1C.
Os níveis de HbA1C são um complemento valioso para as determinações de glicose no sangue
na avaliação do controlo glicémico com vista ao acompanhamento dos pacientes diabéticos,
proporcionando uma informação mais fiável do que a concentração de glicose. Existem vários
estudos que indicam que as complicações relacionadas com a diabetes podem ser reduzidas
através de um controlo rigoroso dos níveis de glicose no sangue. A concentração de HbA1c
também pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da diabetes10.
O diagnóstico clínico não deve ser realizado tendo em conta o resultado de apenas um ensaio,
mas deve integrar os dados clínicos e laboratoriais.
CONTROLO DE QUALIDADE
NOTAS
Recomenda-se o uso dos Controlos de Hemoglobina A1C, Normal (cod. 18001) e elevado (cod.
18002), para verificar a funcionalidade do procedimento de medição.
1. Para evitar possíveis interferências com outro tipo de ensaios é recomendável realizar as
medições de hemoglobina total e de HbA1C em séries independentes do resto das técnicas.
Cada laboratório deve estabelecer o seu próprio programa de Controlo de Qualidade interno,
assim como procedimentos de correcção no caso de os controlos não cumprirem as tolerâncias
aceitáveis.
BIBLIOGRAFÍA
Hb (mmol/L)
Os valores rastreáveis ao método de referência descrito pelo US National Glycohemoglobin
Standardization Program (NGSP) são obtidos com a seguinte fórmula5:
HbA1C-NGSP-DCCT (%) = 0,0915 x HbA1C-IFCC (mmol/mol) + 2,15
CARACTERÍSTICAS METROLÓGICAS
Os dados seguintes foram obtidos usando um analisador A25. Os resultados são similares aos
do A15. Os detalhes sobre os dados de avaliação estão disponíveis a pedido.
− Limite de detecção:
Hb: 0,48 mmol/L.
HbA1c: 0,06 mmol/L.
− Intervalo de medida:
Hb: 0,48-24,8 mmol/L.
HbA1C: (valor aproximado dependendo da concentração do calibrador mais elevado): 0,06-1,61
mmol/L. Quando forem obtidos valores superiores, diluir a amostra 1/2 com Reagente A e
repetir a medição de Hb e HbA1C. O resultado em percentagem pode ser aplicado sem
conversão.
1. Karl J et al. Development and standarization of a new immunoturbidimetric HbA1C assay. Klin
Lab 1993;39:991-996.
2. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 4th ed. Burtis CA, Ashwood
ER, Bruns DE. WB Saunders Co, 2005.
3. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. The effect of intensive
treatment of diabetes on the development and progression of long term complications in
insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1993; 329: 977-986.
4. Jeppson JO, Kodold U, Finke A, Hoelzel W, Hoshino T, Miedema K, Mosca A, Mauri P, Paroni
R, Thienpont L, Umemoto M, Weykamp C. Approved IFCC reference method for the
measurement of HbA1c in human blood. Clin Chem Lab Med 2002;40:78-89.
5. Hoezel W et al. IFCC reference systems for measurement of hemoglobin A1c in human blood
and the national standarization schemes in the United States, Japan and Sweden: a methodcomparison study. Clin Chem 2004;50:166-174
6. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 5th ed. AACC Press, 2000.
− Repetibilidade (intra-série):
Concentração média de HbA1C-IFCC
CV
n
39 mmol/mol
77 mmol/mol
1,2 %
1,0 %
20
20
Concentração média de HbA1C-NGSP
CV
n
5,7 %
9,2 %
0,8 %
0,8 %
20
20
7. Bry L, Chen P, Sacks D. Effects of hemoglobin variants and chemically modified derivates on
assays for glycohemoglobin. Clin Chem 2001;41:153-163.
8. Roberts WL, De BK, Brown D, Hanbury MC, Hoyer JD, John WG, Lambert TL, Lundell RB,
Rohlfing C, Little RR. Effects of hemoglobin C and S traits on eight glycohemoglobin methods.
Clin Chem 2002;48:383-385.
9. Nathan DM, et al. Translating the A1C assay into estimated average glucose values. Diabetes
Care 2008; 31: 1473-1478.
10. Nathan DM, et al. International Expert Committee report on the role of the HbA1C assay in the
diagnosis of diabetes. Diabetes care 2009: 32: 1327-1334.
− Reprodutibilidade (intersérie):
Concentração média de HbA1C-IFCC
CV
n
39 mmol/mol
77 mmol/mol
3,7 %
2,5 %
25
25
Concentração média de HbA1C-NGSP
CV
n
5,7 %
9,2 %
2,3 %
1,9 %
25
25
− Veracidade: Os resultados obtidos com estes reagentes não mostram diferenças sistemáticas
significativas se comparados com o método de referência descrito pela IFCC e com o método
de referência descrito pelo NGSP. Os detalhes do estudo comparativo estão disponíveis sob
pedido.
M13044p-05
BioSystems S.A. Costa Brava 30, Barcelona (Spain)
Quality System certified according to
EN ISO 13485 and EN ISO 9001 standards
03/2011