Malária - 2º Congresso de Medicina Tropical - Lisboa 20

AL4‐ Malária‐ Henrique Silveira & ?????? A1 Ana Custódio, Isa Pires, Henrique Silveira - Caracterização das transglutaminases de Anopheles
gambiae
Elsa Paula da Silva Kaingona Daniel, Natalia K Almeida de Oliveira, Beatriz Moraes, Bianca
Ervatti Gama, Henrique Chipenda, Filomeno Fortes, Claudio Tadeu Daniel-Ribeiro, Maria
de Fatima Ferreira-da-Cruz - Caracterização dos genes pfdhfr e pfdhps associados a
quimiorresistência a sulfadoxina/pirimetamina em isolados de Plasmodium falciparum de
Lubango, Angola
Giselle FMC Lima, S Wendel, JE Levi, MCA Sanchez, AD Hristov, J Inoue, MJ CostaNascimento, SM Di Santi - PCR em tempo real para diagnóstico de malária em amostras de
banco de sangue agrupadas em pools
Isa Pires, Sara Santos, Lara Borges, João Cardoso, Henrique Silveira - Potenciais funções dos
membros da família 2 GPCR no ciclo de vida, metabolismo e infeção no mosquito
Anopheles gambiae
Juliana Inoue, D Lopes, V Rosário, AD Hristov, GFM Lima, MJ Costa-Nascimento, M Boulos,
SM Di Santi - Mutação K76T no gene pfcrt de Plasmodium falciparum em amostras
brasileiras ao longo de 27 anos
Maria Luísa Simões, Henrique Silveira - Hemozoína reduz a infecção por Plasmodium berghei
através da activação do sistema imunitário de Anopheles gambiae
Renato Fernandes Pinheiro da Silva, Virgílio do Rosário, José de La Fuente, Ana Domingos Identificação de genes em glândulas salivares de Anopheles gambiae diferenciadamente
expressos em resposta à infeção por Plasmodium berghei por sequenciação de RNA
Rita Medina, Fátima Nogueira, Rui Vitorino, Karina Pires de Sousa, Marcelo Sousa Silva Pesquisa e caracterização de potenciais antigénios para a detecção de anticorpos antiPlasmodium falciparum em pacientes com malária importada
Caracterização das transglutaminases de Anopheles gambiae Ana Custódio, Isa Pires, Henrique Silveira
Centro de Malária e Outras Doenças Tropicais, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de
Lisboa
Unidade de Parasitologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa
Endereço eletrónico: [email protected] (Ana Custódio)
Palavras-chave: transglutaminases; Anopheles; malária
INTRODUÇÃO
As transglutaminases são enzimas responsáveis pelo cross-linking de proteínas e estão
envolvidas na coagulação (Mehta, 2005). O mosquito Anopheles gambiae, principal vector da
malária, tem três transglutaminases AgTGM98, AgTGM99 e AgTGM100 (Rogers et al.,
2009), ao contrário de outros insectos que apresentam apenas uma ou duas transglutaminases
(Rogers et al., 2009) Os estudos realizados sobre a regulação de genes durante a infecção
pelo plasmódio e trabalho realizado no nosso laboratório, revelaram diferenças ao nível da
expressão dos genes responsáveis pela produção destas proteínas em Anopheles (Vlachou et
al., 2005, Silveira et al., 2012). Assim, levantam-se algumas questões relativas à função que
1 estas proteínas podem desempenhar no mosquito. Embora
recentemente caracterizada (Le et al., 2013), a caracterização
transglutaminases do mosquito ainda não foi feita. Neste
caracterização parcial das transglutaminases de Anopheles
AgTGM100.
a AgTGM99 tenha sido
funcional das outras duas
trabalho, apresentamos a
gambiae, AgTGM98 e
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise das sequências de aminoácidos deduzidas para cada uma das proteínas AgTGM98 e
AgTGM100, revelou uma estrutura contendo os três domínios característicos das
transglutaminases, N-terminal, catalítico e C- terminal, assim como os motivos de ligação ao
cálcio, necessário ao funcionamento destas enzimas e, numa delas, AgTGM100, um motivo
de adesão celular. Os pesos moleculares deduzidos foram confirmados, sendo de ~86.5kDa
para AgTGM98 e ~83kDa para AgTGM100. A localização celular de ambas as proteínas, a
nível do intestino médio, também se revelou distinta: sendo a AgTGM98 membranar e a
AgTGM100 intracelular. Os perfis de expressão relativa dos genes AGAP009098 e
AGAP009100 são distintos, sendo o primeiro expresso ao longo de todo o ciclo de vida do
mosquito, em níveis gradualmente crescentes enquanto o último é expresso apenas em pupas
e adultos Em mosquitos alimentados com sangue infectado com Plasmodium berghei,
verificaram-se alterações da expressão da AgTGM98, o que poderá implicá-la directamente
na infecção pelo parasita.
CONCLUSÕES
Este trabalho permitiu identificar diferenças a nível molecular e bioquímico entre as duas
transglutaminases estudadas, que podem estar associadas a diferentes funções desempenhadas
por estas enzimas no mosquito.
BIBLIOGRAFIA
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2 Caracterização dos genes pfdhfr e pfdhps associados a quimiorresistência a
sulfadoxina/pirimetamina em isolados de Plasmodium falciparum de Lubango, Angola
Elsa Paula da Silva Kaingona Daniel 1,2, Natalia K Almeida de Oliveira 1, Beatriz Moraes 1, Bianca Ervatti
Gama 1, Henrique Chipenda 2, Filomeno Fortes 3, Claudio Tadeu Daniel-Ribeiro 1, Maria de Fatima Ferreira-daCruz 1
1
Laboratório de Pesquisas em Malária, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, RJ, Brasil
Hospital Central Dr. António Agostinho Neto do Lubango, Angola
3
Programa Nacional de Malária, Angola
2
Endereço eletrónico: [email protected] (Maria Ferreira-da-Cruz)
Palavras-chave: malária; quimiorresistência; TIP; pfdhfr; pfdhps; P. falciparum
INTRODUÇÃO
A malária é uma das principais doenças parasitárias do mundo, acometendo importante
contingente de pessoas, sendo o P. falciparum a espécie com maior morbimortalidade e
notória capacidade de apresentar quimiorresistencia.
Considerando que a quimiorresistência se caracteriza como um possível obstáculo à
eficiência do tratamento intermitente preventivo (TIP) com sulfadoxina/pirimetanina (SP) em
mulheres grávidas, e que em Angola essa intervenção é aplicada desde 2006, se faz
necessário o conhecimento da sensibilidade do P. falciparum à combinação SP para auxiliar
na avaliação da eficiência do TIP sobre a morbimortalidade da malária em grávidas, assim
como na pertinência de introdução do TIP em crianças menores de 5 anos. Como a análise da
quimiorresistência in vivo e in vitro não é tão evidente em áreas endêmicas, faz-se plausível a
utilização de ferramentas de biologia molecular para a caracterização gênica da
quimiorresistência de isolados de P. falciparum.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nesse contexto, das 110 amostras de sangue coletadas de pacientes com malária em Lubango,
Angola, e submetidas a PCR para o gene pfdhfr, 107 (97%) foram amplificadas. Dentre os
isolados que foram sequenciadas com sucesso observou-se o seguinte: 46% deles com
haplótipos duplo mutantes ACNRNVI nos códons 59 e 108; 27% com dupla mutação nos
códons 51 e 108 apresentando o haplótipo ACICNVI; 17% triplo mutantes nos códons 51, 59
e 108 com haplótipos ACIRNVI; 2% triplo mutantes nos códons 50, 51, 108 e 59, 108, 164
com haplótiplos ARICNVI e ACNRNVL; 6% com uma única mutação no códon 108, com o
haplótipo ACNCNVI e; uma amostra selvagem ACNCSVI (2%). A mutação 108N (mudança
de serina para asparagina – S108N) do gene pfdhfr, descrita como a mutação precursora para
o surgimento de todas as linhagens resistentes foi a mais prevalente (98%) seguida das
mutações 59R (65%) e 51I (47%).
Em relação ao gene pfdhps, das 75 amostras amplificadas na PCR, observou-se uma total
prevalência da mutação no códon 437G, com exceção de 1 amostra (4%) que apresentou
haplótipo selvagem SAKAA. Dessas 24 amostras mutantes, 21 tinham uma única mutação
3 (single mutante) apresentando o haplótipo SGKAA, 2 amostras apresentaram duplo mutantes
nos códons 437 e 540 originando o haplótipo SGEAA e 1 amostra também duplo mutante nos
códons 436 e 437, com haplótipo AGKAA.
Os haplótipos mais prevalentes nesse estudo foram ACNRNV (46%), ACICNVI (27%) e
ACIRNVI (17%) para o gene pfdhfr (códons 51, 59 e 108), e SGKAA (82%), SGEAA (9%),
AGKAA (4,5%) para o gene pfdhps (códons 436, 437 e 540).
CONCLUSÕES
Em função do expressivo percentual de populações de P. falciparum circulando em Lubango
com um perfil de resistência associado a pirimetamina assim como uma tendência de
tolerância a sulfadoxina, concluimos que o TIP poderá não ser mais eficiente em áreas
endêmicas angolanas.
PCR em tempo real para diagnóstico de malária em amostras de banco de sangue
agrupadas em pools
Giselle FMC Lima 1, S Wendel 2, JE Levi 3, MCA Sanchez 3, AD Hristov 1, J Inoue 1, MJ Costa-Nascimento 4,
SM Di Santi 1,4
1
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil
Banco de Sangue do Hospital Sírio Libanês, São Paulo, Brasil
3
Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil
4
Superintendência de Controle de Endemias, Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, São Paulo, Brasil
2
Endereço eletrónico: [email protected] (Giselle Lima)
Palavras-chave: diagnóstico; malária; Plasmodium; PCR em tempo real
INTRODUÇÃO
A malária transmitida por transfusão sanguínea permanece como uma das mais relevantes
infecções induzidas em áreas endêmicas e não endêmicas devido ao aumento no número de
indivíduos que se deslocam globalmente. Embora a incidência de malária transfusional não
seja conhecida no Brasil, este evento pode contribuir para a disseminação da doença em áreas
com transmissão ativa, onde a triagem clínico-epidemiológica não esteja sendo efetuada de
maneira rigorosa (SÁEZ-ALQUÉZAR et al, 1998). Apesar dos avanços na busca de segurança
transfusional, não existe transfusão isenta de riscos (CARRAZZONE et al, 2004). A transmissão
de patógenos através de hemocomponentes ocorre quando o doador infectado não é detectado
pelos métodos de triagem, transferindo o agente etiológico a um hospedeiro susceptível
(COVAS, 2001). Embora os dados sobre malária transfusional no Brasil sejam escassos,
relatos de acidentes desta natureza mostram a necessidade de estudos que possam determinar
a prevalência de marcadores específicos para malária em candidatos à doação de
hemocomponentes (SCURACCHIO et al, 2011). Infecções assintomáticas com baixas
parasitemias são difíceis de detectar pela hemoscopia e apresentam um desafio para as
4 estratégias de controle. Portanto, é essencial aplicar ferramentas mais sensíveis para uma
triagem mais segura de candidatos a doadores de sangue (KITCHEN e CHIODINI, 2006,
SCURACCHIO et al, 2011).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As 290 amostras de doadores de sangue de diferentes serviços hemoterápicos do Brasil,
foram agrupadas em pools de 10 amostras/pool. O local de origem dessas amostras
permanece desconhecido para esta fase do estudo. O DNA foi extraído com Qiagen®
QIAamp DNA Blood Mini Kit para a realização de qPCR para amplificação gêneroespecífica usando com o alvo o gene 18S ssrRNA de Plasmodium. O protocolo de Gama et al
(2007) foi modificado quanto ao número de ciclos e volume de reagentes a fim de obter
maior sensibilidade e menor custo. Dos 29 pools de amostras de doadores de sangue testados
pela qPCR (EcoIllumina) utilizando corante intercalante EvaGreen (Biotium), 13
apresentaram amplificação até o cut-off de 37,28 estabelecido em estudo anterior. Os
controles positivos de amostras de cultura de P. falciparum diluídos seriadamente em razão
10, amplificaram satisfatoriamente com intervalos de 3 log. O ensaio apresentou Slope de 3,21; R2: 0,99 e Efficiency %: 104,49. Os pools positivos foram amplificados utilizando-se
outro protocolo, já padronizado em estudo anterior (LIMA et al, 2011) para confirmar
sensibilidade, e apresentaram amplificação nas mesmas amostras apresentadas neste estudo
empregando o mesmo cut-off. Considerando que os resultados deste estudo, usando amostras
agrupadas em pools são comparáveis às análises individuais num estudo anterior (LIMA et al,
2011), o diagnóstico utilizando amostras agrupadas pode ser aplicado em especial em
serviços hemoterápicos reduzindo custo e tempo de processamento, além de oferecer uma
alternativa segura à triagem de malária em candidatos a doação de sangue.
CONCLUSÕES
Nossos resultados mostram que este protocolo de qPCR que utiliza corante intercalante, é
eficaz na detecção de DNA de Plasmodium mesmo em amostras agrupadas em pools. Nosso
estudo anterior mostra que a sensibilidade das amostras processadas individualmente foi
similar às das amostras agrupadas em pools, demonstrando que a técnica é indicada para
processamento de amostras em larga escala. Os pools com amostras positivas serão ensaiados
individualmente usando nested PCR para determinar a espécie de Plasmodium.
BIBLIOGRAFIA
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Potenciais funções dos membros da família 2 GPCR no ciclo de vida, metabolismo e
infeção no mosquito Anopheles gambiae
Isa Pires, Sara Santos, Lara Borges, João Cardoso, Henrique Silveira
CMDT, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa
Unidade de Parasitologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa
Endereço eletrónico: [email protected]
Palavras-chave: GPCR; Anopheles; malária
INTRODUÇÃO
Os receptores G-protein-coupled receptors (GPCRs) constituem uma grande e diversa família
de proteínas caracterizadas por sete regiões transmembranares cuja função primária é a
transdução de estímulos extracelulares em sinais intracelulares. Membros desta família
emergiram relativamente cedo no processo evolutivo e estão envolvidos em múltiplas
funções fisiológicas devido à multiplicidade de estímulos a que reagem, bem como pela
variedade de vias de sinalização intracelular que activam (Kroeze et al, 2003). Em
vertebrados, os membros da família 2 constituí um pequeno grupo de receptores GPCRs
unicamente activados por famílias de péptidos que circulam no sangue tendo funções
importantes no crescimento, desenvolvimento, metabolismo, resposta imunitária, entre outros
(Civelli et al, 2006). Genes homologos desta família foram recentemente identificados em
genomas de invertebrados, no entanto os péptidos que activam os receptores homólogos em
vertebrados são ausentes levantando questão sobre a sua manutenção e função em genomas
de invertebrados (Cardoso et al, 2007). Estudos preliminares que caracterizam a sua função
na mosca da fruta e em nemátodes sugerem a existência de respostas fisiológicas semelhantes
aos homólogos vertebrados (Johnson et al, 2004; Johnson et al, 2005; Janssen et al, 2008)
mas muitos receptores permanecem órfãos e os seus ligantes por descobrir. Recentemente foi
demonstrado que potenciais receptores da família 2 em C.elegans são ativados por péptidos
humanos que activam os seus homólogos em vertebrados (Cardoso et al, 2009) sugerindo a
possibilidade de interacções moleculares entre péptidos e receptores de organismos
6 filogeneticamente distantes e de novas respostas fisiológicas que permanecem por explorar.
No modelo malária, o efeito modelador da interacção entre moléculas humanas, do parasita e
do mosquito já foi descrita (Luckart et al, 2003), contudo a existência e a relevância de
interações moleculares entre hospedeiro e vector continua pouco explorada. O sangue de
mamíferos provoca alterações na transcrição dos genes do mosquito, resultando em maior
intensidade de infecção por Plasmodium e mudanças na oogénese do mosquito (Abrantes et
al, 2005; Shiao et al, 2006; Lopes et al, 2007; Abrantes et al, 2008). Este estudo pretende
investigar a existência de potenciais interacções moleculares associados à família 2 GPCRs
receptores-ligandos no modelo malária e caracterizar o papel funcional de receptores órfãos
na fisiologia do mosquito, ciclo de vida e presença do parasita. Cinco membros desta família
que partilham aproximadamente 30% de similaridade com os homólogos de vertebrados
foram identificados e isolados no genoma do mosquito e a sua caracterização funcional está
de momento a ser investigada. Neste trabalho o papel destes receptores no ciclo de vida,
infecção e na alimentação do mosquito Anopheles gambiae encontra-se descrita recorrendo à
técnica de amplificação quantitativa.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Analisou-se a expressão de cinco genes diferentes da família 2 GPCR (Agap003654,
Agap005464, Agap005465, Agap001175 e Agap009770). Os resultados obtidos por PCR em
tempo real mostraram que os genes Agap005464 e o AGAP009770 parecem estar regulados
negativamente nas fases larvares, quando grandes alterações metabólicas e morfológicas
ocorrem.
Analisou-se também a expressão destes receptores em resposta à refeição sanguínea no
intestino médio e no corpo gordo de mosquitos fêmea. Todos os genes analisados encontramse regulados positivamente no intestino médio (excepto o gene Agap005465 que não foi
testado). A mesma tendência pode ser observada no corpo gordo.
Foram também verificados os níveis de expressão dos referidos genes em fêmeas que
efectuaram refeição sanguínea infectada e posteriormente comparados com a refeição
sanguínea não infectada. Observa-se um aumento da expressão de Agap005465, Agap001175
e Agap003654 no corpo gordo, mantendo-se a expressão no intestino médio. Os genes
Agap005464 e Agap009770 apresentam uma expressão regulada negativamente em ambos os
tecidos.
CONCLUSÕES
De modo geral, estes resultados preliminares parecem indicar que a família 2 GPCR podem
estar envolvidos no desenvolvimento do mosquito e ciclo de vida. Alterações na expressão do
receptor, na presença de uma refeição de sangue e, em resposta à infecção pelo parasita
indicam um papel potencial no metabolismo e na resposta imune do mosquito.
BIBLIOGRAFIA
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Mutação K76T no gene pfcrt de Plasmodium falciparum em amostras brasileiras ao
longo de 27 anos
Juliana Inoue 1, D Lopes 2, V Rosário 2, AD Hristov 1, GFM Lima 1, MJ Costa-Nascimento 3, M Boulos 1, SM
Di Santi 1,3
1
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Brasil
Instituto de Higiene e Medicina Tropical/Universidade Nova de Lisboa
3
Núcleo de Estudos em Malária/Superintendência de Controle de Endemias/ Secretaria de Estado da Saúde de
São Paulo, Brasil
2
Endereço eletrónico: [email protected] (Juliana Inoue)
Palavras-chave: Plasmodium falciparum; cloroquina; pfcrt; resistência
8 INTRODUÇÃO
A resistência do Plasmodium falciparum aos antimaláricos permanece um desafio para o
controle da doença. Esta espécie possui um genoma complexo, que lhe confere capacidade de
adaptação a qualquer droga. O surgimento da resistência à cloroquina em praticamente todas
as áreas endêmicas levou a mudanças nas políticas de tratamento. No Brasil, a resistência à
cloroquina foi detectada em 1960, em Rondônia (Rodrigues da Silva, 1961). Atualmente este
antimalárico é utilizado apenas para o tratamento da malária causada por outras espécies de
Plasmodium, que não o P. falciparum (Brasil, 2010). A resistência à cloroquina está
relacionada ao gene pfcrt (P. falciparum chloroquine resistant transporter). Dentre as vinte
mutações pontuais detectadas no pfcrt, a substituição de lisina por treonina na posição 76
(K76T) é encontrada nos parasitos resistentes (Fidock et al, 2000; Djimde et al, 2001). No
presente estudo, são analisadas amostras de P. falciparum coletadas no período de 1984 a
2011, a maioria proveniente do Brasil, com o objetivo de verificar a ocorrência da mutação
K76T e sua relação com a resposta de P. falciparum à cloroquina. Foram realizados PCRRFLP para análise do códon 76 do gene pfcrt e testes in vitro para análise da resposta do P.
falciparum à cloroquina, através da determinação da concentração mínima inibitória (CMI).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram genotipadas 117 amostras: 104 (88,88%) apresentaram o genótipo K76T, associado à
resistência à cloroquina; cinco amostras apresentaram o genótipo misto K76 e K76T,
indicando duas populações no mesmo isolado; oito amostras apresentaram o genótipo
selvagem K76, sensível à cloroquina. Todas as amostras que continham a mutação são
provenientes do Brasil. As amostras com genótipo misto ou selvagem são provenientes do
Haiti e de países africanos, e foram utilizadas como um grupo de comparação. Visto que
nestes países há predominância de P. falciparum, a substituição do tratamento com
cloroquina por outro antimalárico interrompe a pressão seletiva da droga, indicando a
possibilidade de reversão da resistência. Este fenômeno foi descrito no Malawi (KUBLIN et al,
2003; LAUFER et al, 2010). Com relação ao genótipo mutante encontrado em todos os
isolados brasileiros, resultados similares foram reportados em outros estudos, em que todas as
amostras provenientes da região Amazônica continham a mutação K76T (VIEIRA et al, 2004;
VIANA et al, 2006). Para comparação do padrão genotípico com a resposta in vitro foram
utilizadas 23 amostras de isolados brasileiros. Vinte e duas amostras apresentaram CMI ≥ 32
pmoles/poço e uma amostra apresentou CMI = 8 pmoles/poço, indicando que todas
apresentaram o fenótipo de resistência in vitro para cloroquina. Assim, observou-se
concordância de 100% entre a resposta in vitro de resistência e a presença da mutação K76T.
Estes resultados confirmam a adequação desta mutação como marcador de resistência à
cloroquina. Os testes in vitro foram imprescindíveis para a comparação entre o padrão
genotípico e fenotípico da resposta à cloroquina, visto que seria impossível a comparação
com o desfecho clínico in vivo, pois esta droga não é utilizada para o tratamento de P.
falciparum desde a metade da década de 80.
CONCLUSÕES
9 Os resultados deste estudo indicam que a mutação K76T no gene pfcrt, marcador molecular
de resistência à cloroquina, continua presente na população de P. falciparum no Brasil.
Embora esta 4-aminoquinoleína tenha sido substituída por outros esquemas terapêuticos para
P. falciparum na segunda metade da década de 80, ainda é preconizada para tratamento de P.
vivax no Brasil, que responde por 87% dos casos. Este fato pode ter contribuído para que esta
mutação tenha se fixado no genoma parasitário pela pressão exercida com a continuidade do
uso deste antimalárico para P. vivax.
BIBLIOGRAFIA
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Hemozoína reduz a infecção por Plasmodium berghei através da activação do sistema
imunitário de Anopheles gambiae
Maria Luísa Simões, Henrique Silveira
Unidade de Parasitologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Endereço eletrónico: [email protected] (Maria Simões)
10 Palavras-chave: hemozoína; Anopheles gambiae; Plasmodium berghei; imunidade inata
Identificação de genes em glândulas salivares de Anopheles gambiae diferenciadamente
expressos em resposta à infeção por Plasmodium berghei por sequenciação de RNA
Renato Fernandes Pinheiro da Silva 1, Virgílio do Rosário 1, José de La Fuente 2, Ana Domingos 1
1
2
Unidade de Parasitologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa.
Lisboa, Portugal.
Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos, Universidad de Castilla–La Mancha. Ciudad Real,
Espanha.
Endereço eletrónico: [email protected] (Renato Silva)
INTRODUÇÃO
Os mosquitos Anopheles gambiae são considerados um dos vectores mais importantes da
malária e a sua eficiência na transmissão de Plasmodium sp. depende de vários factores como
a sua preferência por humanos como hospedeiros para a refeição sanguínea, a sua elevada
susceptibilidade à infecção pelo parasita e a sua longevidade (Catterruccia, 2007). As
medidas de controlo da malária com maior eficiência têm sido e continuam a ser os processos
de controlo do mosquito-vector. Com este objectivo têm sido utilizadas ferramentas a nível
genómico e proteómico que têm possibilitado alargar o conhecimento da biologia do
mosquito-vector (Das et al., 2010).
As glândulas salivares (GS) desempenham um papel fundamental não só na alimentação e
digestão mas também na transmissão de agentes patogénicos (Jarivapan et al., 2007). Foram
já realizados vários estudos que demonstram ser possível bloquear o parasita durante sua
passagem através das GS baseadas em hibridação ou sequenciação como “microarrays”,
análise sequencial de expressão genética (SAGE) e bibliotecas de hibridação subtractiva
(SSH) (Dixit, 2009, Oviedo et al., 2009). Os resultados obtidos na análise do transcriptoma
de GS, quer em relação ao processo de alimentação, quer em relação à infeção por
Plasmodium sp., produziram dados importantes, possibilitando actualizar o catálogo de genes
de Anopheles spp. e identificar alguns genes diferenciadamente expressos (Oviedo et al.,
2009).
Recentemente, o chamado sequenciamento de nova geração (GNS) ou RNA-seq
(sequenciamento de RNA) surge como uma nova e promissora ferramenta no estudo do
transcriptoma (Wilhelm, Landry, 2009).
Este trabalho tem como principal objectivo realizar a análise transcriptómica comparativa de
duas populações, GS de An. gambiae infectadas com P. berghei e GS não infectadas e
identificar genes de interesse que serão posteriormente objecto de estudos de silenciamento.
Dois grupos An. gambiae foram alimentados em murganhos infectados com P. berghei e nãoinfectados. Após 18 dias, foi confirmada a infeção através da visualização, nas GS, de
esporozoítos marcados com GFP em microscopia de fluorescência e realizada a dissecção das
GS para extração de RNA. A biblioteca de genes conseguida foi obtida utilizando a técnica de
sequenciação direta de RNA (RNAseq) em Illumina® GA IIX, utilizando a estratégia seguida
11 para genomas anotados, tendo sido realizadas leituras de 75 pares de bases (reads) permitindo
obter um número elevado de leituras de elevada qualidade. Os reads obtidos foram
subsequentemente alinhados com o genoma de referência (Vector Base-vectorbase.org) e
mapeados utilizando a plataforma Bowtie 2.
A expressão diferencial foi avaliada e realizada uma análise estatística.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O RNA obtido de GS infectados e não infectados foi sequenciado em leituras de 75 reads. Os
resultados obtidos foram analisados, onde observou-se que 2623 genes estavam
diferencialmente expressos (sub e sobrexpressos) em níveis variados. Com a utilização do
programa estatístico R, e usando o teste Z de Kal, sendo o valor de p<0.05 considerado
estatisticamente significativo, foram encontrados 19 genes com os graus de expressão
diferencial elevados. A confirmação da expressão está a ser confirmada por Real-time PCR.
CONCLUSÕES
A análise feita por RNA-seq possibilitou observar uma grande quantidade de genes expressos
diferencialmente nas condições apresentadas; destes, foram inicialmente selecionados 19
genes candidatos. A análise, ainda a decorrer, permitirá verificar a localização das proteínas
expressas por estes genes, através de softwares específicos, assim como avaliar a sua
importância no processo de infeção pelo P. berghei, recorrendo a técnica de RNA de
interferência.
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12 Pesquisa e caracterização de potenciais antigénios para a detecção de anticorpos antiPlasmodium falciparum em pacientes com malária importada
Rita Medina 1, Fátima Nogueira 2,3, Rui Vitorino 4, Karina Pires de Sousa 1, Marcelo Sousa Silva 1
1
Unidade de Ensino e Investigação de Clínica Tropical
Unidade de Parasitologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa
3
Centro de Malária e Outras Doenças Tropicais, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova
de Lisboa
4
Centro de Espectroscopia de Massa - Universidade de Aveiro
2
Endereço eletrónico: [email protected] (Marcelo Silva)
Palavras-chave: malária importada; Plasmodium falciparum; anticorpos anti-Plasmodium; proteínas
imunogénicas
13