Avances biotecnologicos reproduccion

Transcrição

SEMINARIO INTERNACIONAL Y TALLER DE BÚFALO DE AGUA EM EL
TRÓPICO
AVANCES BIOTECNOLÓGICOS EN REPRODUCCIÓN DE BÚFALOS
Prof. Dr. WILLIAM G. VALE
Universidade Federal do Oeste do Pará – UFOPA
Santarém, Pará, BRASIL
1. REPRODUCCIÓN EN EL MACHO: TECNOLOGÍA DEL SEMEN E
REPRODUCCIÓN ASISTIDA
2.
REPRODUCCIÓN
EN
LA
HEMBRA
BUFALINA:
INSEMINACIÓN
ARTIFICIAL E REPRODUCCIÓN ASISTIDA
3. ZICARELLI, L. Reproductive seasonality in buffalo. Bubalus bubalis, v.4, p.29-52,
1997b. Supplement.
ZICARELLI, L.; DE FILIPPO, C. FRANCILLO, M.; PACELLI, C.; VILLA, E.
Influence of insemination technique and ovulation time on fertility percentage in
synchronised buffaloes. Proc. 5th World Buffalo Congress, Caserta, p.732-7, 1997
Dinâmica folicular durante o tratamento superovulatório
Apesar do grande esforço de alguns grupos de pesquisa que trabalham com bubalinos,
os resultados obtidos até o momento demonstraram baixa eficiência desta biotecnologia
na espécie bubalina. A baixa taxa de recuperação de estruturas embrionárias vem
comprometendo a viabilidade econômica da técnica de transferência de embriões nesta
espécie. Assim, iniciamos pesquisas objetivando avaliar, pela ultra-sonografia a
resposta superovulatória de fêmeas bubalinas a diferentes protocolos hormonais. Nestes
trabalhos (7), os exames ultra-sonográficos dos ovários mostraram que as fêmeas
bubalinas apresentam resposta folicular ao tratamento superovulatório. Os animais
apresentaram desenvolvimento de um “pool” de folículos que atingiam diâmetro ≥ 8mm
no estro da superovulação, demonstrando que a baixa eficiência da transferência de
embriões nesta espécie parece não estar associada à resposta folicular durante o
tratamento superovulatório. Observamos que os bubalinos apresentaram, em média,
taxa de ovulação de 62,8%, a qual foi semelhante à observada por alguns autores em
bovinos (55). O número médio de ovulações foi de 7,0 ± 3,0, o que foi altamente
correlacionado (r=0,86; P<0,01) ao número de corpos lúteos no dia da colheita de
embriões. Este resultado demonstra que a ovulação foi seguida da formação de corpos
lúteos na espécie bubalina. No entanto, apesar da resposta folicular dos bubalinos à
superovulação, observou-se baixa taxa de recuperação de estruturas embrionárias nas
búfalas superovuladas. As taxas de recuperação de estruturas embrionárias em relação
às ovulações (27,4%) e aos corpos lúteos (32,1%), foram baixas nas búfalas
superovuladas.
Devido a baixa taxa de recuperação embrionária, recentemente realizamos trabalho (12)
no qual 12 búfalas foram avaliadas durante o tratamento superovulatório por ultrasonografia (in vivo) e observação visual dos ovários após o abate. Neste experimento,
foi correlacionando o número de ovulações com o número de estruturas embrionárias
colhidas após o abate e a lavagem do tracto genital (ovidutos e cornos uterinos). Os
resultados confirmaram nossos estudos anteriores, demonstrando que o número de
estruturas embrionárias encontradas no tracto genital de fêmeas bubalinas após a
lavagem dos ovidutos e dos cornos uterinos, correspondem a apenas 35% do número de
ovulações. De 9,2 ± 3,8 corpos lúteos encontrados, apenas 3,2 ± 2,5 estruturas
embrionárias foram colhidas. No entanto, permanece desconhecida a causa desta baixa
taxa de recuperação embrionária.
Com o objetivo de estudar mais detalhadamente o comportamento reprodutivo e a
dinâmica folicular de búfalas superovuladas, realizamos trabalho (13) empregando a
radiotelemetria para detecção do estro e associamos os resultados com o
desenvolvimento folicular avaliado pela ultra-sonografia. Verificamos que o intervalo
entre a aplicação de PGF2α e início do estro foi de 35,4 ± 7,3h. A duração média do
estro foi de 15,9 ± 4,2h, e o intervalo final do estro/ovulação de 17,7 ± 6,7h. O intervalo
PGF2α/ovulação foi de 69,0 ± 7,5h. Notou-se que das 95 ovulações (média de 7,9 ± 2,4
ovulações/búfala), 11 (11,6%) ocorreram às 60h, 73 (76,8%) às 72h, 6 (6,3%) às 84h, 3
(3,2%) às 96h e 2 (2,1%) às 108h após a administração da PGF2α. O intervalo entre a
primeira e última ovulações foi 10,0 ± 10,0h. Observou-se que a concentração média de
E2 foi de 1,49 ± 0,55pg/ml no início da superovulação (D9), de 27,02 ± 23,2pg/ml no
dia precedente ao estro (D13) e de 3,07 ± 1,19pg/ml no dia do estro. As búfalas
apresentaram grande variação das concentrações plasmáticas de E2 durante a fase estral
(3,9 a 80,6pg/ml). A concentração plasmática de P4 foi de 3,7 ± 0,95ng/ml no D9, de
0,24 ± 0,19ng/ml no dia do estro (100% apresentou luteólise) e de 4,6 ± 0,64ng/ml no
quarto dia após o estro. Estes dados colaboram para maior compreensão da resposta
superovulatória na espécie bubalina.
Na tentativa de melhorar a eficiência da transferência de embriões em bubalinos,
iniciamos outra linha de pesquisa utilizando implantes contendo agonista de GnRH
(deslorelina), que provocam bloqueio hipofisário, associados a superestimulação
ovariana (27). No entanto os resultados de taxa de recuperação embrionária
permaneceram baixos (24). Tentamos também boquear a produção de estrógenos no
momento da ovulação para diminuir a contração do sistema genital e aumentar a taxa de
recuperação embrionária (14). Entretanto, não se verificou aumento na taxa de
recuperação embrionária.
Recentemente, nosso grupo utilizou Somatotropina Recombinante Bovina (rBST) no
início do tratamento superovulatório em fêmeas bubalinas (n=16; dados ainda não
publicados). Verificou-se aumento no números de folículos pequenos no início do
tratamento superovulatório (12,4 ± 3,6 vs. 15,6 ± 3,7; P=0,09), de folículos ≥ 8mm no
dia da aplicação de LH (12,7 ± 7,0 vs. 18,6 ± 8,4; P=0,15), de corpos lúteos (4,9 ± 3,2
vs. 10,2 ± 9,4; P=0,15) e de estruturas embrionárias recuperadas (1,6 ± 1,7 vs. 5,1 ± 6,8;
P=0,18), bem como nas taxas de ovulação (38,2% vs. 55,0%; P=0,006) e de recuperação
de estruturas embrionárias/corpo lúteo (33,3% vs. 50,0%; P=0,06) para o grupo tratado
com rBST. A rBST aumenta a população de pequenos folículos antrais e melhora a
qualidade dos oócitos por efeito direto e/ou indireto do fator-I de crescimento
semelhante à insulina (IGF-I; 38). O tratamento com rBST estimula a expansão das
células do cumulus (34), o que pode contribuir para a adesão dos oócitos à fímbria e às
células ciliadas da endosalpinge e pode aumentar a taxa de recuperação embrionária nas
búfalas superovuladas.
Mesmo apresentando problemas de baixa eficiência na colheita de estruturas
embrionárias, existe o registro do nascimento de bubalinos pela técnica de transferência
de embriões no Brasil (5). Informamos, também, o nascimento de bezerros oriundos de
embrião congelado (7), demonstrando a viabilidade da técnica, desde que se aumente a
taxa de recuperação de emPRODUCCIÓN E TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
EN LOS BUFALINOS: REPRODUCCIÓN ASISTIDA
4.
TANSFERENCIA
NUCLEAR
DE
CELULAS
SOMATICAS-CLONE:
1. REPRODUCCIÓN EN EL MACHO: TECNOLOGÍA DEL SEMEN E
Introducción
A criopreservação do sêmen para a inseminação artificial (IA) tem servido como
instrumento de ampla difusão do potencial genético dos animais de alta produção, sendo
porém necessário que o material fecundante dos machos seja submetido à tecnologias
eficientes (Vale, 1994). Apesar disso, no Brasil este melhoramento genético através da
inseminação artificial em bubalinos tem sido inexpressivo, em relação ao contingente
populacional do
rebanho existente. Para alguns autores a relação entre a baixa
resistência do espermatozóides do bubalino, seria um fator intrinsíco ligado a espécie,
face a sua diferença de composição quando comparado aos bovinos. Singh et al.(1970)
reportaram a existência de uma menor quantidade de ácido cítrico, Na+, K+ e Mg++ e
maiores quantidades de Ca+ e bicarbonato, e níveis iguais de frutose, Pi e substâncias
redutoras totais no sêmen de búfalo quando comparado ao bovino. Para outros autores,
os níveis de fosfatase ácida tem um efeito positivo sobre os espermatozóides dessa
espécie, enquanto a fosfatase alcalina, teria um efeito deletério, enquanto que altos
níveis de fosfatase inibiriam a respiração e a viabilidade das células espermáticas face a
um acúmulo de íonos de fosfato-inorgânicos (Chaudhary et al. 1977; Abdou et al.
1978).
Embora em algumas regiões do mundo, os bubalinos sejam considerados sazonais, o
macho dessa espécie parece ser menos susceptível as essas variações, entretanto um
aspecto importante ligado a qualidade do sêmen é o estresse térmico. Altas
temperaturas, manejo deficiente e alimentação desbalanceada levam a qualidade do
ejaculado a se deteriorar e perder a qualidade para a congelação (Vale, 1994;1997). O
inicio da técnica da IA em bubalinos foi sem dúvida muito desistimulante face aos
baixos índices de fertilidade obtidos. Os resultados obtidos foram muito baixos pelo fato
dos diluidores utilizados para a criopreservação do sêmen serem os mesmos dos
bovinos. Após o seminário sobre Reprodução e Inseminação Artificial, promovido pela
FAO e o governo Suéco, em Karnal, Índia, 1979, vários progressos foram obtidos em
diferentes laboratórios do mundo, culminando com a existência de índices de fertilidade
superiores a 65% de nascimento (Sengupta & Sukhija 1988).
Vários problemas ligados aos diluentes foram contornados, principalmente através da
utilização do TRIS (Hydroxi - methyl - amino - methan), TES (Hydroxi - methyl amino - ethan), Skim milk, LAICIPHOS 478, leite - citrato - lactose, lactose, citrato,
ácido cítrico - soro (Roy & Bhat 1973; Bhosrekar & Ganguli 1974; Guenzel et al. 1979;
Avenell 1982; Vale et al., 1984; Tayel et al. 1988; Stoyanova 1991; Vale et a. 1991;
Vale 1994).
No Brasil, e particularmente na Amazônia, a prática da IA, tanto em bovinos quanto em
bubalinos, já é uma realidade, embora ainda necessite de constante estudos, em especial
sobre a utilização de novos diluidores (Vale et al 1991a; 1991b)
Da mesma forma, novos diluentes continuam a serem pesquisados, especialmente pelo
fato, de muitas das substâncias utilizadas, serem importadas e de alto preço, o que de
certa forma.
Enquanto alguns procedimentos para a conservação dos espermatozóides são
relativamente simples, outros como é o caso da criopreservação, tornam-se mais
complexos e requerem conhecimento da fisiologia do trato genital masculino e da
produção dos espermatozóides, bem como a utilização de diferentes compostos
químicos, que possam servir de substratos, crioprotetores e agentes antimicrobianos,
nutrindo e protegendo os espermatozóides durante as diferentes fases do processo, de
modo a se obter células viáveis na fase de pós-congelação.
Morfologia do sistema genital
O trato genital do macho bubalino é semelhante ao do bovino, entetanto as estruturas
que os compõem são menores, (Bhatacharya, 1974). Vale et al., (1981) encontraram
para búfalos jovens pesando entre 400 a 600 Kg os testículos apresentando as seguintes
mensurações para peso, comprimento e largura para o testículo direito e esquerdo
110,15 g, 8,83 cm, 4,64, 107, 33 g, 8,77 cm e 4,58 cm, respectivamente. No tocante as
glândulas vesiculosas, os referidos autores encontraram para a direita e esquerda um
comprimento e largura de 5,33 cm, 1,96 cm, 4,97 cm, 1,87, respectivamente; o
comprimento das ampolas dos dutos deferentes, direita e esquerda, mediram 9,36 cm,
0,38 cm e 9,27 cm e 0,64 cm, respectivamente. Essas mensurações mostraram-se
bastantes inferiores quando comparados aos tamanhos encontrados tanto para Bos
taurus, como para Bos indicus, porém superiores a dados descritos para búfalos em
outros países. O pênis também apresenta um comprimento e espessura menor que o
bovino, tendo em média 80,15 cm e 1,95 cm, respectivamente, com a glande também se
apresentando menos desenvolvida que no bovino, assim como a bainha prepucial é
menos longa e aderida a parede abdominal, com raros pelos e ou mesmo ausência de
pelos no óstio prepucial. Da mesma forma, a bolsa escrotal do bubalino é menos
volumosa e apresenta na região inguinal uma inserção mais retilínea em relação ao
funículo espermático quando comparado aos bovinos, que apresentam uma tendência de
formar um leve estreitamento nesta mesma região, da mesma forma a ausência de pelos
na bolsa escrotal é evidente (Joshi et a., 1967; Maurya et al., 1968; Osman; Fahmy,
1968; Fahmy; Osman, 1972; Bongso et al., 1984; Bhosrekar, 1993).
Um parâmetro importante para a avaliação andrológica no búfalo e com pouca citação
na literatura é o relacionado com a circunferência escrotal (CE). Vale et al., (2004)
trabalhando com animais da raça Murrah, submetidos a manejo adequado observaram
que as medidas da CE é inferior a reportada para bovinos e zebuínos, Tabela 1. Para
Bhosrekar (1993) a CE para búfalos adultos indianos varia entre 30 a 34 cm.
Assim como nos bovinos, também nos bubalinos existe uma alta correlação entre o
peso corporal e a circunferência escrotal (R2=0.92), bem como uma correlação positiva
entre a idade e o peso corporal R2=0.86) para animais de elite da raça Murrah criados no
Brasil, Figura 1, (Vale et al., 2004). O peso corporal e a circunferência escrotal são dois
importantes parâmetros utilizados na avaliação da capacidade reprodutiva de machos
bovinos e bubalinos (Coulter et al, 1975; Carter et al., 1980; Ahmad et al. 1984; Ohashi,
1993).
Em touros jovens (um ano para Bos taurus e dois anos para Bos indicus), a
circunferência escrotal relacionada ao peso corporal e a qualidade do sêmen, tem sido
apresentado por vários autores como de grande importância para a seleção de animais
com maior potencial para reprodutores, tanto do ponto de vista de
produção
Circunferência escrotal (cm) (cm)
Figura 1. Apresentação sumarizada da regressão entre a relação da
circunferência escrotal em (cm) e a idade em (meses) em machos da
raça Murrah.
45
y = 0.3367x + 18.74
R2 = 0.92
40
35
30
25
20
15
10
20
30
40
Idade em meses
Fonte: Vale et al., (2004).
50
60
70
quantitativa e qualitativa de sêmen de da fertilidade como um todo (Vale Filho et al.,
1993).
No tocante ao macho bubalino é possível que o desenvolvimento corporal e do trato
genital nesta espécie pode atingir o seu desenvolvimento pleno de forma semelhante
aos bovinos e zebuínos, dependendo da pressão de seleção, manejo adequado dos
animais desde o nascimento, passando pelo desmame e continuando pelas diferentes
fases. É importante salientar que dentro do manejo deve-se levar em conta a profilaxia
das enfermidades parasitárias, prevenção de enfermidades infecciosa e uma alimentação
balanceada.
Tamaño del testículo, pubertad, maturidad sexual y efecto de la edad sobre la
reproducción
Mientras diferentes autores lo reportaran que el macho bufalino presenta una baja
precocidad no que se refiere a la reproducción, en la actualidad sabemos que ese aspecto
está directamente ligado a las deficiencias del manejo y de la alimentación (Yassen &
Mahmaoud, 1972; Ohashi et al. 1988; Vale et al. 2001; Vale et al. 2004).
Al nacimiento, el testículo contiene mucho pocas células de Leydig funcionales,
mientras que en el lúmen de los tubuelos seminíferos si encontrón células sustentación o
las células
de Sertoli, con la presencia de los gonocitos que dan el origen a las
espermatogonias. Aunque esa fase, el animal entra en la fase infantil, hasta la edad del
destete, entre 6 a 8 meses, cuando si empieza gradativamente a secreción de
gonadotropinas por la pituitaria (FSH e LH), comenzando desta forma a la secreción de
hormonas sexuales masculinos, principalmente la testosterona por las células Leydig,
iniciando-se no final desa fase el proceso de la espermatogenese, cuando entonces entre
el 10 y 14 mes el animal atinge a la pubertad.
Si embargo, la pubertad en el bufalino macho pode ser considerada como el tiempo en
que el animal empieza la producción de espermatozoos. O início da espermatogênese
coincide com a luminación y el aumento del diametro tanto de los tubuelos seminiferos
como de su lúmen. En esta fase ocurre también um rápido crescimento de todo o
sistema genital, cuando el animal manifesta interesse por la hembra, sendo entonces
capaz de fecundar una o más hembras en celo. Após esse período, segue-se a fase da
maturidade sexual, quando o sistema genital atinge a sua produción plena de las
hormonas e espermatozoos, idade essa que é atingida entre o 22° e 24° mês de idade.
Nesse período a produción de espermatózoides atinge os níveis normais, com a
produción plena de um ejaculado com características desejáveis para a copngelación.
Em esta fase el animal atinge su maturidade sexual. Es important salientar si embargo,
que existe una marcante diferencia entre a morfologia e o tamanho do sistema genital do
bufalino e das espécies Bos taurus e Bos indicus. La bolsa escrotal del bufalino es
menos volumosa y presenta una inserción mas retilinea en relación a el funiculo
espermatico y a sua fijación em la región inguinal, enquanto que nos bovinos, existe una
tendência de formar um leve estreitamento nesta mesma región. De la misma forma la
ausencia de pelos na bolsa escrotal é evidente, o tamanho dos testículos, que si
presentan menor quando comparado aos bovinos y gado zebu.
A circunferência escrotal dos touros ideal entre 30-36 meses de idade na raça Murrah
esta em torno de 30 ± 3,6 cm (24,4-31,0 cm), habendo um crescemiento linear e
correlacionados com a circunferência escrotal, peso corporal e da idade do animal (com
manobrista, 2001, Vale et al., 2004), Figura 1 e Tabela 1.
Tabla 1. Clasificacion de la circunferencia escrotal en semental bufalino de
la raza Murrah
Edad
Media (cm)
(meses)
Muy
bueno Bueno (cm)
Questionable (cm)
(cm)
12 - 17
21±3.3
>23
23
>19
18 - 23
25±3.2
>26
25
>21
24 – 29
27±2.8
>29
28
>23
30 - 35
29±3.5
>30
29
>25
36 - 41
32±3.1
>33
32
>28
42 - 47
34±2.9
>34
33
>30
48 - 53
36±3.5
>36
34
>31
54 – 60
38±3.6
>39
36
>32
Fuente: Vale et al. (2004).
c, acompanhado pela parada no crescimento ou mesmo um decréscimo no tamanho dos
testículos, não havendo entretanto alteração no quadro espermático. Os mesmo autores
consideraram que os testículos encontravam-se maduros com una idade de 2,77±0,09
anos, com um peso corporal de 275,6±8,5 e una circunferência escrotal entre 20-21 cm.
Outros autores também encontraram una correlação positiva entre a idade,
circunferência escrotal, volume testicular e peso corporal em diferentes raças bubalinas
(Bongso et al. 1984; Ohashi, 1993).
Ohashi (1993) estudando bufalinos leiteiros da raça Mediterrânea, reportou que
puberdade é atingida entre 10-14 meses de idade, com una circunferência escrotal de
21,7±1,9 cm e na maturidade sexual 31,1±2,9 cm com 24 meses de idade O mesmo
autor chamou a atenção que a puberdade não deve ser confundida com maturidade
sexual. A puberdade deve ser definida como o tempo de primeiro potencial de
procriação, enquanto maturidade sexual é o tempo em que o animal atinge o seu
potencial máximo de procriação.
Selecção e exame clinico andrológico de sementais doadores de sêmen
Para que um macho bubalino torne-se um doador de sêmen é de grande importância o
conhecimento de sua progênie. Assim, o primeiro aspecto a ser levando em conta na
indicação de um bufalino com produtor de sêmen, é o seu valor zootécnico baseado em
um teste de progênie ou de performance. Na América Latina, cujo produto principal
hoje procurado é o leite para a fabricação de muzzarella ou outros tipos de queijos
finos, o conhecimento da produção leiteira dos ancestrais desse futuro doador de sêmen
é de fundamental importância.
Além do mais, os animais selecionados como doadores de sêmen, devem ter tido desde
o período pré-puberal um tratamento especial no que concerne ao seu aleitamento,
alimentação, calendário profilático contra enfermidades parasitárias e infectocontagiosas de que grassam na região de onde se origina, além de um manejo adequado.
Una vez satisfeitas essas exigências iniciais, aos 16-18 meses, o futuro reprodutor já
pode ser enviado a um Centro Especializado para a congelacão do sêmen. Porém, antes
de ir para esse Centro, una série de exames clínico-andrológico e higiênico-sanitário
devem ser realizados, constando que o mesmo encontra-se livre de distúrbios
reprodutivos de fundo hereditário ou morfo-funcionais ligados ao aparelho reprodutor
tais como hipoplasia testicular, degeneração testicular, disfunção epididimária, ausência
ou baixa libido assim como de enfermidades infecto-contagiosas, tais como:
Brucelose
Campilobacteriose (vibriose)
BVD
IBR/IPV
Tricomoniase
Leucose
Leptospirose
Tuberculose
Esses exames devem ser realizados por Médico Veterinário, que da mesma forma deve
expedir certificado de vacinação contra as diferentes enfermidades infecto-contagiosas
que existem na región, como no caso a febre aftosa, carbúnculo sintomático, raiva etc.
En el Centro Especializado, el animal debe si quedar en uno período normal de la
quarentena, recebendo um manejo que consistirá de banhos diários nas horas mais
quentes, alimentação controlada do ponto de visto protéico, e recebimento de alimento
volumoso de boa qualidade, além de suplemento mineral ad libitum ao cocho. O ideal é
que o animal jovem fique isolado em una baia individual, porém diariamente, seja
agrupado com dois ou mais animais, em una mesma baia, onde possa ser observado a
atividade homossexual dos mesmos, da mesma forma que
deve-se determinar a
hierarquia e a dominância entre os mesmos.
Treinamiento de sementales jóvenes para colhita del semen por el método de la
vagina artificial
O bufalino é talvez a mais fácil espécie doméstica a se adaptar e ser treinado para servir
na vagina artificial. Para isso é importante observar o comportamento dos machos
jovens mesmo antes dos mesmos atingirem a puberdade, pela existência de intensa
atividade homossexual entre os machos jovens, inclusive com a dominância de um
macho sobre um determinado grupo (Anand, 1979; Vale, 1994;1997).
Uma vez identificado a preferência de um determinado animal pelo outro, devemos
escolher o dominado e colocá-lo em um tronco de monta e deixar o dominador saltar em
montas falsas, tendo-se o cuidado de desviar o pênis sem tocá-lo e ainda a presença da
vagina artificial. Una vez treinado, o macho geralmente ejaculará na vagina artificial já
na primeira tentativa.
É importante salientar que o comportamento sexual dos bubalinos quando comparado
com os bovinos europeus é mais fraco, assemelhando-se aos zebuínos. O bufalino
jovem pode ser condicionado para saltar em um macho ou em una fêmea, embora o
tempo de reação sexual e a libido sejam bem mais fracos, embora outros atributos
seminais como volume, concentração, atividade de massa e vigor tenham pouca
variação quando comparado aos bovinos e zebuínos (Vale, 1994;1997).
Comportamento sexual
O macho da espécie bubalina apresenta um comportamento sexual semelhante ao do
Bos taurus e do Bos indicus, porém a libido sexual é menos intensa. A habilidade
sexual segue una cadeia de atitudes, tais como cortejo, ereção, protusão do pênis, monta,
procura com arremetidas pélvicas rítmicas, introdução do pênis na vagina, ejaculação
percebida pela estocada final, desmonta e período de calma ou tranqüilização.
Dentro dessa cadeia, o cortejo é talvez a fase mais longa, variando entre 10-15 ou mais,
havendo necessidade de muita paciência para o animal acostumar-se com o manequim,
que deve ser de preferência um outro macho, nos casos de animais jovens, ou una vaca
em cio para machos adultos.
Regogida, processamiento y congelacción del semen para uso em la inseminación
artificial
La utilización del semen congelado como herramienta para la mejora mejoramiento
genético de los bufalinos fue iniciada por Bhattacharya & Srivastava (1955) en la Índia,
cuando la inseminación artificial (I.A.) fue pela primera vez realizada con relativo
suceso, utilizando semen congelado en pelletas y hampuelas. Enseguida, varios trabajos
tuvieran continuidad, no solo en este primero país, más en otros, Roy et al. (1956),
Basirov (1964), Sahani & Roy (1972) y Heuer (1980). Si embargo, el desconocimiento
de una tecnología adecuada para la especie bufalina, en que concerní a los diluyentes,
porcentual de glicerol, tiempo del equilibrio, métodos de congelación e falta de
padronização, levaban a resultados pobres e variables. Hoy si sabe que esas fallas,
ocurrirán pelo facto de sí tentar utilizar en el procesamiento tecnológico del semen
bufalino, la misma metodología utilizada para el semen de bovinos. Por esta última
razón, la utilización de la metodología para la congelación del semen bovino aplicada a
de los bufalinos, lleva a fracasos, se debiendo desa forma procurar utilizar la tecnología
propia para la especie, que sen embargo llevará a resultados excelentes.
Para algunos autores la relación entre la baja resistencia de los espermatozoos del
macho bufalino, seria uno factor intrínsico ligado a especie, debido a su diferencia en la
composición cuando comparado a de los bovinos.
Después de la realización del seminario sobre Reproducción e Inseminación Artificial,
promovido por la FAO y el gobierno Sueco, en Karnal, India, 1979, varios progresos
fueran obtenidos en diferentes laboratorios del mundo, culminando con la obtención de
tajas de fertilidad superiores a 65% de nacimiento (Sengupta & Sukhija 1988).
Varios problemas ligados a los diluyentes fueran contornados, principalmente después
de la utilización del TRIS (Hydroxi - methyl - amino - methan), TES (Hydroxi - methyl
- amino - ethan), skim milk, Laiciphos 478, leche - citrato - lactosa, lactosa, citrato,
ácido cítrico - suero de leche de bufalino (Roy et al. 1956; Pavithran et al. 1972;
Bhosrekar & Ganguli 1974; Guenzel et al. 1979; Heuer, 1980; Vale et al., 1984; Tayel
et al. 1988; Stoyañova 1991; Vale et a. 1991; Vale 1994).
A pesar de que en algunas regiones del mundo, los bufalinos sejam considerados
sasonales, el macho dessa especie parece ser menos suceptivel as las variciones,
mientras uno aspecto importante ligado a la qualidad del semen es el estresse termico.
Altas temperaturas, manejo deficiente y alimentación desbalanceada llevan a una
qualidad del eyaculado a si deteriorar y perder la qualidad para a congelación (Shafie,
1994 Vale, 1994;1997).
No Brasil, y particularmente na Amazônia, a prática da IA, tanto em bovinos quanto em
bubalinos, já é una realidade, embora ainda necessite de constantes estudos, em especial
sobre a utilização de novos diluidores (Vale et al 1991a; 1991b).
Da mesma forma, novos diluentes continuam a serem pesquisados, especialmente pelo
fato, de muitas das substâncias utilizadas no processamento tecnológico do sêmen
bubalino, serem importadas e de alto preço, o que de certa forma onera os custos do
processo.
La criopreservación del semen para la IA en bufalinos, hay servido como instrumento
de larga difusión del potencial genetico de los animales de alta produción, sendo
necesario que el material fecundante dos machos seja submetido a uno processamiento
tecnologico eficiente, como garantia del sucesso del proceso (Vale, 1994). Apesar disso,
no Brasil este melhoramento genético através da inseminação artificial tem sido
inexpressivo, em relação ao enorme plantel existente.
A pesar de certos procedimentos para o estudo da morfologia dos espermatozóides são
relativamente simples, como em outros para a criopreservação, tornam-se mais
complexos e requerem conhecimento da fisiologia dos espermatozoos, bem como a
utilização de diferentes compostos químicos, que possam servir de substratos,
crioprotetores e agentes antimicrobianos, nutrindo e protegendo os gametas masculinos
durante as diferentes fases do processo, de modo a se obter células viáveis na fase de
pós- congelacão.
Características del ejaculado a ser congelado
O sêmen do semental bufalino pode apresentar problemas associados com os fatores
climáticos ou sazonais, face una grande sensibilidade do epitélio seminífero a um
aumento da temperatura ambiental. No caso de temperatura tropical como na região
Amazônica e do Brasil Central há necessidade de se implementar um manejo especial,
com o acesso a açudes ou banhos diários nas horas mais quentes, aspecto esse de
fundamental importância na atenuação dos efeitos deletérios do calor). Por serem mais
sensíveis ao calor, atenção especial deve ser dada a animais submetidos a colheita
durante a estação quente do ano. A melhor maneira para superar o problema que leva a
una deterioração de qualidade de sêmen, é proporcionar aos animais banhos com água
durante as horas mais quente do dia ou permitir os animais terem acesso a lagunas. É
muito importante a proteção dos animais contra o estresse térmico, proporcionando o
acesso livre do animal ao banho e a sombra, posto que o bufalino tem dificuldades de
dissipar o calor corporal, por possuir menos glândulas sudoríparas e portanto um
sistema termo-regulador menos eficiente quando comparado aos bovinos e zebuínos
(Shafie, 1994; Vale, 1994;1997).
Assim, o melhor horário para a colheita do semen bubalino é no início do dia (ainda
escuro) ou no final do entardecer, posto que essa espécie apresenta um comportamento
sexual noturno. No momento da colheita do semen, há necessidade de que o ambiente
seja tranqüilo, sem barulho ou outras formar de atitudes que possam causar una perda de
concentração do reprodutores que vão doar semen.
A higiene do local de colheita do semen, assim como de todo material utilizado no
processamento tecnológico do semen é de fundamental importância para o sucesso do
processo. Todo o material utilizado, vaginas artificiais, vidraria, equipamentos de
processamento etc., devem ser esterilizados ou submetidos a processos prévios de
descontaminação adequada, inclusive os diluidores, que devem ser processados com a
antecedência mínima de 24 horas.
Da mesma forma para una melhor qualidade do ejaculado a ser colhido, deve-se usar
vagina artificial não lubrificada, com una temperatura entre 44-45oC. Cada colheita
consistirá de dois ejaculados - primeira e segundo, colhidos dentro de um intervalo de
mínimo 30 minutos. A utilização de montas falsas com desvio do pênis,
são
recomendadas para aumentar a qualidade da ejaculado.
Logo depois da colheita, o ejaculado deve ser avaliado para os parâmetros seguidos e
então colocado em um banho maria com a água a una temperatura de 37 o C (Vale,
1994;1997).
Cor ou Densidade
Está na dependência da concentração ou seja do número de celulas espermáticas no
ejaculado. Assim, a cor e a densidade refletem concentração do ejaculado. Em geral a
cor normal do semen bubalino varia entre branco-leitoso para branca ou cremosa, e una
vez colocados contra a luz artificial, apresenta estrias com cor azul escura (Vale,
1994;1997).
Volume
As variações em volume pode ser observada tanto no caso de touros jovens e como
adultos. Temos observado que animais jovem na puberdade ou no início da maturidade
sexual o volume de semen pode variar entre 1,0 a 3ml, porém esse volume pode
alcançar volumes entre 4 a 8 ml após atingirem a maturidade sexual. A atenção deve
ser dada nos casos de degeneração testicular, em geral causado por estresse térmico
produzido pelo calor ambiental, quando não só o volume como outras características
físicas e morfológicas do sêmen tendem a sofrer alteração.
Para Vale (1994 e 1997) o ejaculado bubalinos apresenta as seguintes características
físicas e morfológicas, conforme esta explicitado na Tabela 2.
Tabla 2. Características del eyaculado del semental bufalino obtenido através de la
vagina artificial.
Característica
Padrón normal
Color
Blanco, blanco-lechoso, con estrías escurasazules
Volumen
3 ml ( 2 al 8 )
Turbidez
>3
Motilidad (%)
>70
Vigor (motilidad individual)
>3
Concentración
6 x 105 al 12 x 105
Celulas espermáticas vivas(%)
>70
Patología espermática (%)
<30
pH
6.7 al 7.5
Fuente: Vale (1994;1997)
Movimiento de onda o turbión
O movimento de onda ou turbuiao se traduz certificadadiretamente pela concentração e
mobilidade dos espermatozóides presentes no ejaculado. Todo esse movimento, se faz
após a colocação de uma gota de ejaculdo em uma lâmina de microscópio e a sua
observação em microscópio com aumento de (10x), possa ser feita una avaliação desse
fenômeno dentro de una escala de 0 a 5, conforme encontra-se sunarizado na Tabla 3.
Eyaculados com una escala numérica de 3 a 5 son apropriados para la congelación.
Tabla 3. Escala para la evaluación microscópica de la turbidez do semen bufalino
Parâmetro
Escala numérica
Característica microscópica do semen
Ausência
Muy pobre
0
1
ondas,
com
os
espermatozoos imóveis
Ausência
Pobre
de
de
ondas,
com
poucos
eserpmatozóides móveis
Raras ondas são observadas, com alguns
Médio
2
espermatozoos móveis
Presença de ondas, movimento de
Bueno
3
espermatozoos moderado
Presença de ondas rápidas e distintas,
Muy bueno
4
com escurecimento do campo
Presença de múltiplas ondas em todas
Excelente
5
direções, com intenso escurecimento do
campo
Fonte: Vale (1994;1997)
Concentración
A concentração dos espermatozoos do semental bufalino normal presenta uma variação
entre 0,6 x 106 a 1,2 x 106 mm3. Este parâmetro está diretamente correlacionado com
os aspectos genéticos, sazonais, nutricionais e do manejo.
A concentração dos
espermatozoos de um ejaculado é estimada pelo número de células por mm3 do volume
do semen. Asim, como nas outras espécies domésticas, existem diferentes métodos
utilizados para a determinacion de la concentracion espermática, , os mais utilizados
rotineiramente sao a câmara hematimétrica o da fotocolorimetría.
O primeiro método, é muito simples, pois utiliza una pipeta de Sahli ou una pipeta de
Eppendorf automática, com graduação para 20 µl, que
será diluído em um frasco
contendo 4 ml de una solução de formol-salino tamponada a 1% ou de citrato de sódio
tamponado o que dará una diluição final de 1:200; após esse procedimento, com o
semen sendo imediatamente analisado ou colocado em refrigerador a una temperatura
de 4º C até ser analisado. Após una leve e rápida homogeneização do sêmen diluído,
una gota é levada a una câmara de Neubauer que é cheia e mesmo procedimento
utilizado para a contagem de células sangüíneas. Um total de cinco quadrados são
contados, com o resultado sendo multiplicado por 10.000 para a obtenção da
concentração total de espermatozoos do ejaculado (Vale, 1994;1997).
Motilidade
A motilidade espermática é um parâmetro fundamental para una conclusão da qualidade
de um ejaculado. Deve ser realizada imediatamente após a avaliação do
turbilhonamento. Una gota pequena de sêmen é colocada entre una portaobjetos e
lamínula a 40° C, e examinado ao microscópio em um aumento de (40 ou 100x), Tabela
4.
Tabla 4. Escala para a avaliação microscópica da motilidade do sêmen bubalino
Motilidade (%)
Descrição do percentual
Valor numérico
80 – 100
Muito boa
5
60 – 80
Boa
4
40 – 60
Média
3
20 – 40
Pobre
2
0 – 20
Ruim
1
Fonte: Vale (1994;1997)
Vigor
O vigor ou motilidade individual é a avaliação do tipo e intensidade do movimento
individual de um espermatozóide individual no campo, realizado entre portaobjetos e
lamínula a 40° C, utilizando-se um aumento de (40 a 100x) em microscópio.
Tabla 5. Escala para la avaluación microscópica del vigor del semen bufalino
Vigor
Descripción
5
Todos o casi todos los espermatozoos con enérgicos movimientos progresivos
4
La mayoría de los espermatozoos con rápidos movimientos progresivos
3
Espermatozoos con movimientos progresivos de intensidad regular y
movimientos oscilatorios
2
Algunos espermatozoos con movimiento progresivo vagaroso y mucho
movimiento oscilatorio
1
Solamente espermatozoos con movimiento oscilatorio
0
Todos los espermatozoos sí encontrón inmóvil
Fuente: Vale (1994;1997)
Vivos y muertos
Através da determinação do número de espermatozoos vivos e mortos, é possível se
predizer a qualidade de um ejaculado. Um ejaculado que apresenta mais de 30%
dos espermatozoos mortos, dificilmente servirá para ser processado e congelado. O
procedimento para a coloração para vivos e mortos é a seguinte:
Colocar una pequena gota de sêmen fresco, retirado do ejaculado logo após a colheita
sobre una portaobjetos limpa e aquecida a 37°C;
Colocar duas gotas do corante (Eosina a 2%), misturando ambos os líquidos com um
bastão de vidro;
Deixar a mistura repousar por 30 segundos, procedendo-se a feitura do frotis em una
segunda portaobjetos;
Secar a portaobjetos sobre una fonte de calor ou ar aquecido;
Examinar ao microscópio
Os espermatozoos vivos apresentaram coloração clara – não se deixaram corar,
enquanto que os mortos terão coloração rosa-cinza, devendo-se considerar os
espermatozoos parcialmente corados, também como mortos.
pH
O sêmen de bufalino normal colhido através da vagina artificial, apresenta um pH que
varia entre 6.5 a 7.2. O pH deve ser determinado imediatamente após a colheita,
utilizando-se papel indicador. É importante salientar que o sêmen bubalino tem una
tendência muito grande a se acidificar, muito embora tenha una concentração mais
baixa de açúcares, após ser colhido, ocorre una rápida metabolização desses açucares
que são transformados em ácido láctico, com una diminuição do pH de sêmen, levando
a alterações irreversíveis nos espermatozoos.
Características bioquímicas do sêmen
Os aspecto relacionados com a composição bioquímica do sêmen bubalino integral e do
plasma seminal é importante para o perfeito conhecimento da aplicação de técnicas de
congelacão nessa espécie.
Singh et al.(1970) reportaram a existência de una menor quantidade de ácido cítrico,
Na+, K+ e Mg++ e maiores quantidades de Ca+ e bicarbonato, e níveis iguais de frutose,
Pi e substâncias redutoras totais no semen de bufalino quando comparado ao bovino.
Para outros autores, os níveis de fosfatase ácida tem um efeito positivo sobre os
espermatozoos dessa espécie, ao passo que a fosfatase alcalina, teria um efeito deletério,
enquanto que altos níveis de fosfatase inibiriam a respiração e a viabilidade das celulas
espermáticas face a um acúmulo de ínos de fosfato-inorgânicos (Chaudhary et al. 1977;
Abdou et al. 1978).
Tabela 6. Algumas características físicas e bioquímicas do sêmen bubalino integral e do
plasma seminal
Característica
Semen total
Plasma seminal
Osmolaridade (mosM/kg
293.33±3.39
283.75±2.31
Proteína total (g/100 ml)
3.10±0.10
2.86±0.14
Lipídeos totais (mg/100 ml)
321.15±18.41
260.86±12.52
Frutose (mg/100ml)
547.08±61.24
684.60±81.14
Ácido cítrico (mg/100 ml)
368.73±14.82
466.33±31.66
Sódio (mg/100 ml)
260.63±8.81
258.58±13.65
Potássio (mg/100 ml)
153.50±2.68
154.83±3.27
Cálcio (mg/100 ml)
32.04±2.77
32.42±3.10
Magnésio (mg/100 ml)
6.17±0.41
6.46±0.39
Cloretos (mg/100 ml)
196.57±2.45
224.06±2.60
Fosfatos inorgânicos (mg/100 ml)
17.02±1.67
12.75±1.09
Fosfatase ácida (U/100 ml)
225.00±2.99
331.20±2.60
Fosfatase alcalina (U/100 ml)
326.05±2.16
331.20±2.60
Zn (mol/célula e µmol/l)
14.3
86.88
Fonte: Ibrahim et al. (1985)
Exame de la morfologia dos espermatozoos
A porcentagem de espermatozoos normais no ejaculado colhido de um bufalino, é um
ponto importante que deve ser observado quando o objetivo for a congelacão do sêmen.
É importante associar os outros parâmetros já avaliados no ejaculado, tais como
turbilhonamento, motilidade e vigor, que estão diretamente correlacionados com o
número total de espermatozoos normais e añormais. O estudo morfológico das celulas
espermáticas é realizada através de preparações feitas em portaobjetoss coradas e em
montagem úmidas. Nas portaobjetoss coradas vários métodos podem ser utilizados,
dentre eles destacam-se a coloração de Williams (carbo-fucsina-eosina) ou ainda o
método Cerovsky (vermelho Congo), quando 200 celulas serão contadas em imersão
com um aumento de 1.000 a 2000 vezes em microscópio convencional de luz brilhante.
No caso da preparação úmida, consiste em se retirar de um frasco contendo solução de
formol-salino com duas gotas de semen já diluído logo após a colheita, tendo-se
cuidado de proceder una leve homogeneização do frasco, e colocar una gota em una
portaobjetos aquecida a 40°C e cobrir a gota com una lamínula, e examinando-se a
preparação em microscópio de contraste de fase ou interferência. Em ambos os métodos
cerca de 200 celulas serão contadas.
Os vários tipos de añormalidades estruturais associadas com alterações morfológicas da
cabeça, acrossomo, peça intermediária, cauda, gotas citoplasmáticas, além de outras
estruturas estranhas ao semen normal, tais como celulas da linhagem espermatogênica,
prepuciais, sangüíneas, inflamatórias, devem ser observadas e contadas, cujos
percentuais irão juntamente com os outros parâmetros já mencionados, compor o
Espermiograma.
As alterações por acaso encontradas devem seguir a classificação proposta por Blom
(1972) para bovinos, divididas em defeitos maiores e menores.
Defeitos maiores
Defeitos menores
Sub-desenvolvido
Cabeça delgada
Cabeça isolada patológica
Pequeno normal
Estreito na base
Gigantes, curtos e largos
Piriforme
Cauda dobrada e enrolada
Contorno añormal
Abaxial, retroaxial
Pequeno añormal
Gota citoplasmática próximal e distal
Os limites para defeitos maiores individual e total devem ser de:
Individual - 5%
Total
- 20%
Os limites totais para defeitos maiores e menores aceitáveis para o sêmen bubalino com
una concentração de 40 milhões por dose é de 30% de patologia total (Vale,
1994;1997).
Patología del acrosoma de los espermatozoos pos-descongelación
O processamento tecnológico de sêmen podar causar alterações significativas no
ambiente na osmolaridade do meio diluyente dos espermatozoos e afetar o esperma
acrossômica
em
particular,
tanto
durante
o
processo
de
congelamento
e
descongelamento (singh et al. 1995; vale, 1994). por isso, é recomendável antes da
liberação de una partida de semen congelado, que seja feita una avaliação da integridade
do
acrossomo
dos
espermatozoos
congelados.
essa
técnica
apresenta
dois
procedimentos, ou seja pode ser feita através de frotis corado ou preparação úmida. no
primeiro caso, prepara-se um frotis em portaobjetos limpa e aquecida a 40°c do sêmen
descongelado, secando da mesma forma que é feito para a coloração de vivos e mortos
e, em seguida corar com o corante de giemsa, com a portaobjetos sendo examinada em
microscópio no mesmo procedimento para a técnica de determinação de vivos e mortos.
no caso da preparação úmida, toma-se una amostra de sêmen logo após a
descongelação, quando duas a três gotas são previamente diluídas em una solução de
formol salino a 4%, sofrendo logo em seguida una leve homogeneização. em seguida
retira-se una gota do sêmen diluído entre portaobjetos e lamínula é examinado em
microscópio invertido em contraste de fase, utilizando-se um aumento de 1000x. em
ambas técnicas serão pesquisados os seguintes alterações relacionadas com o
acrossomo: acrossomo desprendido, acrossomo em desprendimento, acrossomo
edemaciado, acrossomo rompido. após esse exame, qualquer partida de sêmen
congelada que apresentar mais de 50% desses defeitos, deve ser descartada, por não
servir para uso em ia (vale et al. 1991a; vale, 1994;1997).
Processamento tecnológico para a congelacão do sêmen
O princípio básico para a congelacão do sêmen bubalino é semelhante ao de qualquer
outra espécie, e encontra-se sumarizado na Figura 2.
Figura 2.
Representação esquemática da rotina utilizada nas diferentes etapas do
processamento tecnológico para a congelação do sêmen bubalino.
EJACULADO
FASE I
DILUIÇÃO
EQUILÍBRIO
FASE II
CONGELACIÓN
DESCONGELACIÓN
TTR*
* Teste de Termoresistência.
FASE III
Diluidores
Atualmente inúmeros diluidores são utilizados na criopreservação do sêmen bubalino,
tais como: citrato-gema, lactose, leite desnatado, soro de leite, TRIS-gema e, mais
recentemente, o diluidor à base de TRIS (Tris-hydroximethyl amino methaño), Quadro
1, e o TES(Tris-hydroxymethyl amino ethaño), Quadro 2,
sendo o glicerol a 7% o
crioprotetor comum a todos os diluidores (Vale, 1994; 1997). Grande parte desses
diluidores são constituídos de substratos orgânicos industrializados, produtos
importados de eficiência comprovada, mas de alto custo e de difícil aquisição e muitas
vezes encarecendo o processo tecnológico.
Assim, outras alternativas surgiram com a utilização da água de coco, utilizada em
bovinos por Chieffi & Masoti (1959) e por Nunes (1998) em diferentes animais
domésticos, inclusive na espécie humana.
Quadro 1. Fórmula do diluidor TRIS
TRIS (Hidroxi-metil-amino-metaño)
Solução-mãe
Tris
38,10g
Ácido cítrico
19,70g
D-frutose
15,50g
Sulfato de estreptomicina
1,00g
Penicilina G potássica
5 x 105 UI
Água bidestilada q.s.p.
1000 ml
Diluição Final
73% Solução-mãe
7% Glicerol
20% Gema de ovo fresco
Quadro 2. Fórmula do diluidor TES
TES (Hidroxi-metil-amino-etaño)
Solução-mãe (parte I)
TES
48,30g
TRIS
11,60g
D-frutose
2,00g
2,00g
1 x 106 UI
Água bidestilada q.s.p.
1000 ml
Solução-mãe (parte II)
Skim milk
11g
Água bidestilada
100 ml
Diluição Final
36,5% solução-mãe (parte I)
36,5 % solução-mãe (parte II)
7% Glicerol
20% Gema de ovo fresco
Vale et al. (1984) congelaram pela primeira vez com sucesso no brasil o semen
bubalino, utilizando diluidores a base de tris (tris-hydroximethyl amino methane) e o
tes(tris-hydroxymethyl amino ethane), com o semen
congelado
apresentando
motilidade pós descongelación superior a 40% e vigor 3 e quando utilizado a nível de
campo em programas pilotos, apresentou fertilidade computada através de percentual de
nascimento superior a 57%.
Novamente Vale et al. (1997;1999) utilizaram como alternativa um diluidor a base de
água de coco, seguindo as recomendações de Nunes (1998), obtendo resultados
satisfatórios tanto em laboratório, como em testes de ia à nível de campo, com índices
de fertilidade semelhantes aos outros diluidores tradicionais que encontra-se descrito no
quadro 3.
Quadro 3. Fórmula do diluidor CEBRAN I a base de água de coco
Solução Stock I
Água de coco
50 ml
Água bi-destilada
25 ml
Citrato de sódio 5%
25 ml
Solução Stock II
Solução stock I
90 ml
Gema de ovo
10 ml
DILUIDOR FINAL
Solução stock II
93.0 ml
Glicerol
7.0 ml
1.000UI/ml
2 g/100 ml
(Ajustar o pH para 6.8 7.0)
A osmolaridade deve ser ajustada em torno
de 290±5mosM
Quadro 4. Fórmula do diluidor CEBRAN II a base de
RINGER-LACTATO
Solução A (500 ml)
D-Frutose
1,08 g
70
mg
ou
1000 UI
700 mg/ 105
UI
Ringer-Lactate
q.s.p
500 ml
Solução B
11% Skim milk diluído em água a 80º C
SOLUÇÃO FINAL
Solução A
36,5 ml
Solução B
36,5 ml
Glicerol
Gema de ovo
7,0 ml
20,0 ml
(Ajustar o pH para 6.8 7.0)
A osmolaridade deve ser ajustada em torno de
290±5mosM
Dilución
Después de recoger el semen esto debe ser rápidamente pré-diluído con el diluyente
mezclado lentamente con el auxilio de una pipeta en uno flasco del tipo mamadeira o
Erlenmeyer con uno volumen entre 20 a 40 ml. Tanto o semen como o diluyente deve
estar a temperatura de 37° C, por isso devem estar imersos em banho maria com a
mesma temperatura. É muito importante que o diluidor seja adicionado gota a gota com
o semen, até atingir o volume para a concentração de 40 x 106 espermatozoos/dose. Al
final de la dilución se debe proceder una avaliacción de la motilidad y del vigor, antes
do envase do semen que pode ser em minitubos ou parrillas francesa de 0,5 ml,
previamente identificadas com número do touro, data e número da partida.
Refrigeración y tiempo de equilibrio
Después del envasamiento del semen en los mini tubos o parrillas deben ser colocados
en uno refrigerador, y submetidas a uno declínio de la temperatura en torno de 0,25°
C/minutos, hasta atingir a la temperatura de 5°C. El tiempo del equilíbrio ideal para el
semen bubalino é de 6 horas, devendo-se valorar o semen após o final do tempo de
equilíbrio, antes de prosseguir para o processo da copngelación.
Congelacción
La congelación del semen debe si hacer inicialmente en vapor de nitrogeno liquido,
mantendo os minitubos ou palhetas por 20 minutos dispostos horizontalmente sobre una
rampa localizada a 4 cm acima do nível do nitrogênio. Após este período o material
deve ser imerso diretamente no nitrogênio líquido, colocado em raques e estocadas em
um recipiente criogênico até a sua utilização.
Avaliação do sêmen após a descongelación
Logo após a congelación e antes mesmo de una partida de sêmen ser armazenado em
conteiner apropriado, se faz necessário a descongelación de una dose de sêmen, que
deve ser avaliada quanto a motilidade e vigor. Essa descongelación deve ser feita em
água a 40°C por 30 segundos. Portanto, para una partida de sêmen congelado ser
liberada para uso em programas de IA, deve apresentar una motilidade mínima de 30%
e vigor 2-3. A avaliação do sêmen deve ser feita da mesma forma quando da avaliação
do semen recém colhido através da vagina artificial.
Tambem é recomendado se realizar avaliação microscópica de amostras de semen, após
a congelación, principalmente para a observação de patologia acrossômica dos
espermatozoos se fazer a diluição do semen em solução de PBS (tampão fosfato salino),
Quadro 4. Este procedimento objetiva facilitar a avaliação da qualidade do semen, pois
o diluidor a base de TES torna difícil a visualização dos espermatozoos, e a diluição
com PBS os torna mais visíveis. La solución puede ser preparada y armazenada a –
20°C, de acuerdo con la fórmula abajo descrita.
Cuadro 5. Fórmula da solução de PBS
Soluçción del PBS
NaCL
8,000g
KCL
0,200g
MgCI26H2O
0,100g
CaCI22H2O
0,100g
Na2HPO4
1,150g
KH2PO4
0,200g
H2O bidestilada q.s.p.
1000 ml
Teste de termoresistência (TTR)
Após ser decorrido um mínimo de 30 dias de estocagem em nitrogênio líquido, cada
partida de semen deverá ter um mínimo três doses escolhidas ao acaso, que serão
descongeladas em banho-maria a 40°C por 30 segundos e abertas. Una amostra deverá
ser separada e incubada durante 3 a 5 minutos e banho maria a 40°C, para ter o semen
submetido a exames imediatos na pós-descopngelación. Para o teste de termoresistência
as doses de semen foram novamente vedadas se permaneceram sob incubação em
banho-maria a 40°C, sofrendo novas avaliações aos 30, 60, 120 e 180 minutos. No TTR
o semen tem que apresentar um mínimo de 20% de motilidade após 180 minutos de
incubação (Ribeiro et al. 1991).
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2. REPRODUCCIÓN EN LA HEMBRA BUFALINA: INSEMINACIÓN
ARTIFICIAL E REPRODUCCIÓN ASISTIDA
Introducción
A utilização do sêmen congelado de bubalinos na Inseminação Artificial (IA) foi pela
primeira vez realizada por Bhattacharya & Srivastava (1955) na Índia. Em seguida, vários
trabalhos foram realizados em diferentes países, Roy et al. (1956), Basirov (1964), Allahverdiev
(1969) e Sahani & Roy (1972),
contudo, a ausência de um processamento tecnológico
adequado do sêmen no que concerne a diluentes, percentual de glicerol e, tempo de
equilíbrio, métodos de congelação e falta de um padrão adequado, levavam a resultados
pobres e variáveis. Todo o processamento tecnológico baseava-se na mesma
metodologia utilizada para bovinos, faltando,
portanto o estabelecimento de um
diluidor específico para bubalinos. Após o Seminário sobre Reprodução e Inseminação
Artificial, promovido pela FAO e o Governo Suéco, em Karnal, Índia, 1979, vários
progressos foram obtidos em diferentes laboratórios do mundo, culminando com a
utilização de diluidores próprios para o sêmen de bubalinos e a obtenção de taxas
índices de nascimento fertilidade superiores a 65% de nascimento (Sengupta & Sukhija
1988).
No Brasil, a prática da IA em bubalinos, iniciou-se na década de 80 do século passado,
quando Vale et al. (1984) utilizando os diluidores TRIS e TES fizeram com sucesso as
primeiras inseminações com sêmen congelado na região Amazônica, obtendo taxas de
prenhez índices acima de 50% de fertilidade. Posteriormente, índices superiores a 70%
de nascimento foram obtidos na pelos mesmos pesquisadores, dando início a utilização
do processo de forma ampla em todo o Brasil e na América Latina. Em outros países da
América Latina, inclusive no Brasil, índices de natalidade acima de 80% têm sido
obtidos, enquanto na China existem dados oficiais que reportam índices de fertilidade
em torno de 90% em búfalas inseminadas em comunas rurais. Portanto, na atualidade a
inseminação artificial nos rebanhos bubalinos atinge índices de fertilidade igual aos dos
bovinos.
Técnicas de inseminación
A técnica da inseminação artificial na fêmea bubalina é igual a da vaca bovina, ou seja é
do tipo cervical profunda, com a deposição do sêmen no corpo do útero. Diferentemente
dos bovinos, a inseminação artificial em novilhas, debe ser evitada, pelo fato delas
apresentarem uma cervice pequena, o que leva a lesões, com sangramentos e baixos
índices de fertilidade.
Detecção do estro
Para que o ato inseminatório tenha pleno sucesso, faz-se necessário que a fêmea esteja
no momento apropriado para a inseminação. A detecção e o reconhecimento da fêmea
no início do cio é fundamental para o sucesso do processo. Em geral deve-se ter um lote
de fêmea aptas para a IA em um número nunca superior a 100 animais, que devem estar
perfeitamente identificados e em perfeitas condições de sanidade e nutrição.
Uma prática muito recomendada e de fundamental importância é o uso do rufião, que
deve ter o auxílio da identificação visual pelo pessoal envolvido nos trabalhos de IA. O
rufião, pode ser colocado livre no lote ou durante períodos em que se queira observar se
há alguma fêmea no cio.
Como nas outras espécies de bovídeos, a búfala apresenta o ciclo estral dividido em
pró-estro, estro, metaestro e diestro, com a duração do ciclo variando entre 18 a 32
dias, com uma média de 23 dias (Vale, 1988).
Entretanto, um dos grandes impecilhos para o sucesso da IA nesta espécie, é a
exteriorização dos sintomas de estro ou cio, que por não ser tão evidentes como na vaca
taurina, pode levar a interpretações equivocadas, e portanto a um baixo índice de
fertilidade. Em rebanhos criados em regime intensivo ou semi-intesivo e submetidos a
um bom manejo, é possível se observar sintomas de estro ou cio que se caracterizam por
edema e descarga de muco pela vulva, hiperemia, micção e berros freqüentes, elevação
e movimentação constante da cauda e se deixar montar pelo macho. Através do exame
retal é possível se observar o aumento significativo do tônus uterino, evidenciando que
o tônus uterino na búfala é muito mais intenso que na vaca taurina e zebuína (Vale,
1983).
Uma característica fundamental de baixa ocorrência, ao contrário da vaca taurina e
zebuína, é o fenômeno do comportamento homossexual durante o estro, ou seja, o
hábito das fêmeas montarem ou se deixarem montar umas nas outras durante a fase de
aceitação. É raro observar essa sintomatologia nos bubalinos (somente 3,44%), o que
indica que, com maior freqüência, o macho realiza a monta no período de cio. Este
comportamento diminui a visualização externa de cio e, durante muito tempo, fez
acreditar que os bubalinos apresentavam cios fracos e silenciosos (Baruselli, 1993).
É importante frisar que, devido a baixa incidência de comportamento homossexual na
espécie bubalina, o rufião é imprescindível para a detecção do cio.
Sintomas e duração do cio
Como já mencionado, a exteriorização dos sintomas de cio na búfala não é tão evidente
como na vaca bovina, muito embora é verificado um sintoma importante, a monta pelo
rufião, encontrado em 100% dos cios observados (Vale et al., 1987).
Assim sendo, a melhor forma de detecção do cio na búfala é a utilizações de rufiões
com buçal marcador e tinta, associada à observação visual intensa (Vale, 1983). A
freqüência do aparecimento de cios em búfalas esta relacionado com à hora do dia,
conforme pode ser observado na Tabela 1.
Tabla 1. Freqüência do aparecimento do cio em búfalas criadas na região
Amazônica.
Cios observados
Número
Percentual (%)
Manhã (7:00-12:00 horas)
16
10.6
Tarde (12:00-17:00 horas)
08
5.3
Noite (17:00-07:00 horas)
126
84.0
TOTAL
150
100.0
Na literatura internacional a maioria dos autores enfatiza que a búfala possui hábitos
sexuais noturnos, com predominância dos sintomas clínicos do cio no período
compreendido entre 17:00 às 20:00 horas e entre 4:00 às 7:00 horas da manhã,
respectivamente (Hafez, 1954; Luktuke & Ahuja, 1961; Gill et al., 1973; Vale
1984;1987). Tal fato parece estar relacionado a radiação solar e a temperatura ambiental
que possuem inibitório sobre a manifestação do cio. É possível que exista também
alguma ação desses fatores sobre a secreção do LH, pois durante o dia, especialmente
nas criações extensivas, estes animais procuram água e a noite pastam (Gangwar, 1980;
Vale, 1983).
Recentemente foi desenvolvido um sistema, que funciona por radiotelemetria,
para o estudo do comportamento reprodutivo e para detecção do estro. Tal sistema
(HEATWATCH® ; DDx, Incorporated, Boulder, Colorado, USA) objetiva substituir a
observação visual diária e determinar a fase estral com eficiência e precisão. O método
preconiza a fixação, no dorso da fêmea, de um sensor que emite ondas de rádio toda vez
que sofre a pressão exercida pela monta. Essas ondas são captadas por uma antena e
enviadas a um sistema informatizado. Assim, o sistema consegue suprir algumas das
necessidades práticas, como a de operar por 24 horas e de aumentar da acurácia de
detecção do estro .
Nossa equipe utilizou este sistema para estudar o comportamento estral em
bubalinos. Os resultados estão dispostos na Tabela 2.
TABLA 2 -
Detecção do estro em fêmeas bubalinas por radiotelemetria. (Porto-Filho,
et al., 1999)
Média
Duração do estro (h)
11,8 ± 5,6 (45)*
Início do estro-ovulação (h)
30,0 ± 4,9 (44)
Con formato: Portugués (Brasil)
Final do estro-ovulação (h)
17,9 ± 4,1 (43)
Número de montas por estro
24,6 ± 18,2 (45)
Duração da monta (seg.)
3,6 ± 0,7 (45)
Duração total das montas(seg.)
94,2 ± 80,7 (45)
*( ) Os números entre parênteses representam o número de estros observados.
O sistema de radiotelemetria detectou 1108 eventos de monta em 50 estros
induzidos com prostaglandina, sendo que o número médio de montas por estro foi de
24,6 ± 18,2. Foi observado número de montas bastante diferenciado, sendo detectados
Con formato: Fuente: Times New
Roman
estros com apenas três montas (n=1), e estros que apresentaram 80 montas (n=1). A
duração de cada monta foi, em média, de 3,6 ± 0,7 segundos, com duração total das
montas por estro de 94,2 ± 80,7 segundos. Foi também observada variação de 8 a 373
segundos para a duração total das montas por estro. A duração individual das montas
variou de 2 a 5,5 segundos.
A distribuição das montas durante as 24 horas do dia não apresentou diferença
significativa (P > 0,05). Foi observado apenas pequeno aumento entre 04:00 e 08:00
horas e entre 22:00 e 02:00 horas (Gráfico 1). Este resultado demonstra que os
bubalinos, criados no centro-sul do Brasil, apresentam distribuição homogênea dos estros
durante as 24 horas. Esse resultado pode ser devido á manisfestação do estro no período
do outono, que na região centro sul do Brasil, apresenta temperaturas amenas,
diferentemente das verificadas na região amazônica.
A duração média do estro nas novilhas avaliadas por radiotelemetria foi de
11,8 ± 5,6h, inferior à verificada em búfalas paridas (14,7h; Baruselli (1994). Foi
observada grande variação com relação à duração dos estros (1h a 25h). A classificação
dos estros quanto à intensidade e à duração demonstrou que a grande maioria deles
apresentou alta intensidade (75,6%) e longa duração (80%), com mais da metade
(57,8%) demonstrando ambas as características. Estes resultados foram superiores
àqueles relatados por Dransfield et al. (1998) os quais, em bovinos de leite, encontraram
porcentagens semelhantes entre estros com alta intensidade e curta duração (34,3%), e
entre estros com baixa intensidade e longa duração (33,2%). Ao contrário do que foi
encontrado em bubalinos, tais autores relatam que estros de longa duração e alta
intensidade ocorreram com pouca freqüência em bovinos de leite (8,4%). No presente
experimento, caso fosse utilizado esquema tradicional de detecção de estro (manhã e
tarde), apenas 8,9% dos estros não seriam detectados, confirmando o resultado obtido
por Baruselli (1992), o qual verificou que apenas 3,5% dos estros não seriam detectados
nestes períodos. Esses resultados confirmam que, apesar das búfalas apresentarem
algumas particularidades na manifestação do estro, a maioria delas apresenta
características evidentes desta fase, demonstrando que é possível detectar estros na
espécie bubalina adotando adequado manejo.
Nesse experimento foi colhodo sangue a cada uma hora para dosagem dos níveis
circulantes de LH. Veiificou-se que o pico de LH ocorreu 45,6 ± 10,8h após a
administração da prostaglandina. O intervalo entre o pico de LH e a ovulação fo de 25,6
± 2,6h (Gráfico 2). O intervalo entre pico de LH e a ovulação encontrada é semelhante
aos achados por Kanai e Shimizu (1986) em bubalinos, que verificaram intervalo de
27,7 ± 0,5h para que ocorresse a ovulação após o pico de LH. O intervalo entre o início
do estro e o pico de LH foi de 3,6 ± 3,4h. Esse intervalo está em conformidade com os
dados da literatura, que utilizaram observação visual para detecção do estro (Kanai e
Shimizu, 1986; Avenell et al., 1995).
Verificou-se, também, que o pico de estradiol foi de 8,9 ± 1,7pg/ml, variando de
7,2pg/ml a 10,9pg/ml. Esse dado está próximo da variação de 9 a 13pg/ml observada
por Seren e Parmeggiani (1997), e próximo ao pico de 12,9 ± 0,6pg/ml relatado por
Avenell et al.(1995). Este resultado demonstra que os bubalinos apresentam baixas
concentrações de estradiol comparados com os bovinos durante a fase estral.
GRÁFICO 1 - Distribuição total das montas/hora detectadas por radiotelemetria
durante as 24 horas em babalinos (n=1180 montas). Porto-Filho (2000).
ESTRO
LH
E2
35
30
LH (ng/ml)
9
8
7
6
25
5
20
4
Ovulação
15
3
10
2
5
1
0
0
25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Horas após PG
Gráfico 2Níveis de LH e estradiol em uma novilha bubalina com estro
comportamental detectado por radiotelemetria. Porto-Filho (2000)
E2 (pg/ml)
40
Tabla 3. Endocrinologia do estro em bubalinos (Porto Filho (2000)
- Intervalo entre a aplicação PGF/pico de LH
45,6 ± 10,8h
- Intervalo entre o início do estro/pico de LH
3,6 ± 3,4h
- Intervalo entre o pico de LH/ovulação
25,6 ± 2,6h
- Pico de LH
45,8 ± 11,9ng/ml
- Pico de Estradiol
8,9 ± 1,7pg/ml
Segundo Pandey (1979), durante o ciclo estral da búfala os níveis máximos de (17-beta
estradiol-E2), coincidem com a descida rápida dos níveis de (P4), sugerindo que o efeito
antagônico desses dois hormônios, levam nas manifestaçõesão psíquicas e clínicas do
cio com subsequente evolução. Enfatiza ainda o mesmo autor que o problema do cio
fraco ou silencioso nesta espécie parece estar relacionada à interferência no sinergismo
entre esses dois hormônios antes do surgimento do pique de LH.
Da mesma forma, na literatura internacional, corroborando achados reportados no Brasil
por Vale et al e Baruselli et al , incidência de cio silencioso e anovulatórios é freqüente
na búfala, especialmente em animais com deficit alimentar ou submetidos a situações de
contínuo “stress” térmico, Kaur & Arora, 1981; Vale et al., 1987).
Durante o ciclo estral é possível a palpação dos folículos e do corpo lúteo, muito
embora seja mais difícil do que na vaca bovina, face ao desenvolvimento dessa estrutura
se fazer mais inteiramente no sentido dea modelar. Em bovinos obeserva-se , ao
contrário da vaca que se faz n, verificando crescimento no sentido da cortical. O corpo
lúteo , sendo que este atinge o crescimento máximo entre o 100 e o 160 dia do ciclo,
chegando muito das vezes a tomar quase 2/3 do tamanho total do ovário, apresentando
um diâmetro médio de 1,5cm (Hafez, 1954; Luktuke & Rao, 1962; Vale et al., 1982; Vale, 1983).
Duplas ovulações são raras, tendo sido até o presente momento observado em material
de matadouro somente um caso no mesmo ovário em uma búfala não gestante (Vale et al.,
1982).
Na Itália, também existem relatos de duplas ovulações durante a fase estrogênica
do cilco estral (Zicarelli, 1997).
Momento da ovulação
A ovulação na fêmea bubalina ocorre após no final do cio, sendo esse aspecto
importante para definir o horário da inseminação artificial. Estudos indicam que as
búfalas, em média, ovulam 17 horas após o final da aceitação de monta (Vale et al.,
1988 e Baruselli 1992). Assim, se recomenda-se a inseminação artificial quando cessarem
todos os sintomas de cio, ou seja, quando a fêmea não aceitar mais ser montada pelo
rufião.
Cio fraco ou silencioso
Na literatura internacional, corroborando achados reportados no Brasil por Vale et al.
(1984) e Baruselli et al. (1999), a incidência de cio silencioso e anovulatório é freqüente
na búfala, especialmente em animais com deficit alimentar ou submetidos a situações de
contínuo “stress” térmico (Kaur & Arora, 1981; Vale et al., 1987), como também Como já
mencionado anteriormente, a freqüência de cio fraco ou silencioso, em geral
anovulatórios é comumente observado na búfala, em especial em rebanhos submetidos a
manejo inadequado, com déficit alimentar ou submetidos a stress térmico.
Pandey (1979)
enfatiza que o problema do cio fraco ou silencioso nesta espécie parece
estar relacionado ao sinergismo entre a proesterona e o estradio antes do surgimento do
pico de LH.
Inseminação artificial com detecção do estro
Pelos dados de duração de cio e momento de ocorrência da ovulação na espécie
bubalina, pode-se propor uma tabela de inseminação artificial. Como existe grande
variação na duração do cio em bubalinos, preconiza-se inseminar o mais próximo
possível do final das maifestações de cio, quando as fêmeas não aceitam mais a monta.
Em levantamento feito durante o Programa de Inseminação em bubalinos do Vale do
Ribeira, observaram-se variáveis durações nas manifestações de cio (de 6 a 108 horas),
no entanto a taxa de gestação manteve-se relativamente constante e não sofreu
interferência da duração do cio (Baruselli, 1998). A duração do cio foi estimada
calculando o intervalo de tempo entre a primeira aceitação de monta e sua rejeição.As
búfalas que apresentam cios de 12 horas (62,2%) são inseminadas conforme proposta
feita por Trimberger para bovinos, na qual as vacas que são observadas em cio pela
manhã devem ser inseminadas na tarde do mesmo dia e vacas observadas em cio à tarde
devem ser inseminadas na manhã do dia seguinte, bem cedo. No entanto, búfalas que
apresentam cios de duração diferente (38,8%), são inseminadas quando não aceitam
mais a monta. Este tipo de manejo visa aproximar o horário de inseminação ao final das
características de estro, quando a possibilidade de concepção é mais elevada. Desta
maneira, tenta-se eliminar a grande variação observada no horário de duração do cio na
espécie bubalina. Recomenda-se fazer uma observação de cio ao meio dia para
aproximar o horário de inseminação ao final do cio e para melhorar a eficiência da
detecção.
Resumindo, podemos esquematizar um sistema para inseminar búfalas.
1. Búfalas que estiverem em cio durante o período de observação (manhã ou tarde) e
que não aceitam mais a monta no período seguinte devem ser inseminadas
imediatamente. Estes animais são inseminados 12 horas após a detecção do cio. Esta
situação é encontrada em aproximadamente 60% das inseminações de búfalas.
2. Búfalas que estiverem em cio durante o período de observação (manhã ou tarde) e
que continuam em cio no período seguinte não devem ser inseminadas e devem ser
observadas em cio no próximo período. Se não aceitarem mais a monta, devem ser
inseminadas. Estes animais são inseminados 24 horas após a detecção do cio. Esta
situação é encontrada em aproximadamente 25% das inseminações de búfalas.
3. No caso de cios de maior duração (mais de 24 horas), inseminar quando as fêmeas
não aceitarem mais a monta. Esta situação é encontrada em aproximadamente 5%
das inseminações de búfalas.
A seguir (Tabelas 4 e 5), estão expostos os resultados do Programa de Inseminação
Artificial em Bubalinos no Vale do Ribeira. Entre 1993 e 1997 participaram 12
propriedades, totalizando 1551 inseminações. A taxa de concepção da primeira
inseminação foi, em média, de 51,8%, a da segunda de 57,9% e a da terceira de 56,8%
(Tabela 4). O número médio de doses utilizadas por concepção foi de 1,86 (Tabela 5).
Tabla 4. Taxa de concepção de búfalas submetidas à inseminação artificial,
segundo propriedades e ordem de inseminação. Vale do Ribeira, SP, 1993 a 1997.
Propie- Nº de
N° de
Taxa de N° de
N°
de Taxa de
Dades IA (1ª ) Prenhes Concep. IA (2ª) Prenhes concep.
(%)
N° de N° de
Taxa de
IA (3ª) Prenhes Concep.
(%)
(%)
A
171
93
54,4
79
47
59,1
19
11
57,9
B
11
5
45,4
4
4
100,0
-
-
-
C
64
32
50,0
18
13
72,2
3
3
100,0
D
28
15
53,6
1
1
100,0
-
-
-
E
290
150
51,7
93
56
60,2
10
9
90,0
F
42
22
52,3
15
11
73,3
-
-
-
G
179
92
51,4
48
30
62,5
1
1
100,0
H
79
44
55,7
31
12
38,7
2
1
50,0
I
76
41
53,9
11
6
54,5
1
0
0,00
J
62
32
51,6
18
12
66,7
-
-
-
L
15
6
40,0
-
-
-
-
-
-
M
108
51
47,2
53
23
43,4
24
9
37,5
Total
1125
583
51,8
371
215
57,9
60
34
56,8
Baruselli
(1998)
Das 1125 búfalas inseminadas, 832 (74,0%) permaneceram gestantes com, no
máximo, 3 interventos. Este índice variou de 53,3 a 82,2% entre as propriedades.
Observa-se que existe uma grande variação dos resultados conforme as
propriedades (de 1,67 a 2,50 doses por concepção, de 60,0 a 40,0 % na taxa de
concepção e de de 53,3 a 82,2% de taxa de prenhez). Estas variações devem-se
principalmente às diferenças no manejo geral das propriedades, a qualidade do sêmen e
à habilidade do inseminador. É importante ressaltar que nessa investigação, mesmo
quando detectados problemas na propriedade, os dados não foram eliminados e constam
nestas Tabelas.
Con formato: Fuente: 12 pto
Tabla 5 - Taxa de concepção (1ª, 2ª e 3ª IA) de búfalas submetidas à inseminação
artificial segundo propriedades. Vale do Ribeira, SP, 1993 a 1997.
Propriedades
Número de
Número
I. A.
Gestantes
A
264
B
de Taxa de
Dose/
Concepção (%)
Concepção
151
57,2
1,75
15
9
60,0
1,67
C
85
48
56,5
1,89
D
29
16
55,2
1,81
E
393
215
54,7
1,83
F
57
33
57,9
1,73
G
228
123
53,9
1,85
H
112
57
50,9
1,96
I
88
47
53,4
1,87
J
80
44
55,0
1,82
L
15
6
40,0
2,50
M
185
83
44,7
2,23
Total
1551
832
53,6
1,86
Baruselli (1998)
Tabla 6 – Fertilidad en uno programa de insemincion artificial en uno rebano
bufalino creado en la region del medio Amazonas, Estado do Pará, com la utilización
de celos naturales y con el semen congelado en el diluidor TES/TRIS entre nlos anos
1986-1995.
Dose
Ano
No.
de No AI relizadas
por
concepcion
Fertilidad
hembras
1.
2.
3.
Total
n.
%
1986-87
42
42
27
10
79
1.88
25
59.0
1987-88
64
64
47
37
148
2.31
29
43.3
1988-89
70
70
21
6
97
1.38
47
67.1
1990-91
95
95
44
15
154
2.44
64
67.3
1991-92
105
105
58
21
184
1.44
73
69.3
1992-93
98
98
24
11
133
1.92
69
70.4
1993-94
94
94
35
07
136
1.97
69
73.4
1994-95
156
156
78
24
258
2.03
127
81.4
Total
724
724
334
131
1189
1.92
503
64.4
Por la analise de la tabla 6, es posible observar que los índices de fertilidad fueran
fueran mas altos en función de las mejoras del manejo reproductivo, en espcial la
alimentación. De nada adianta preencher todos os requisitos anteriormente mencionados
se a qualidade do sêmen utilizado não estiver dentro dos padrões recomendados. Os
doadores devem ser isentos de doenças infecto-contagiosas que possam ser transmitidas
pelo sêmen. A contaminação do sêmen por bactérias causa infecções uterinas e queda na
taxa de concepção. A qualidade do sêmen após o descongelamento é fundamental para a
obtenção de bons resultados. Com a tecnologia existente na atualidade é possível
congelar sêmen de bubalinos com resultados satisfatórios, quanto à fertilidade. Antes de
iniciar um programa de inseminação artificial o sêmem deve ser avaliado e somente as
partidas aprovadas devem ser utilizadas, evitando transtornos futuros.
Inseminação artificial com indução do estro
Regulación artificial del ciclo estral
A inseminação artificial (IA) em bubalinos, se consagrou mundialmente e provou ser
viável técnica e economicamente para acelerar o ganho genético e o retorno econômico
na espécie. Entretanto, para serem obtidos elevados índices reprodutivos com o uso da
IA é necessário compreender as limitações do emprego desta biotecnologia. Em todo o
mundo existem relatos que indicam baixa taxa de serviço, principalmente devido a
comprometimentos na eficiência de detecção de estro, como um dos principais
impedimentos para expansão da IA. Este comprometimento é maior em rebanhos
bubalinos, devido à particularidades do comportamento reprodutivo (baixa incidência de
comportamento homossexual). Desta forma, programas que visam sincronizar o estro e
a ovulação para empregar a inseminação em tempo fixo, sem a necessidade de detecção
de estro, colaboram sobremaneira no aumento do emprego desta biotecnologia. Estes
protocolos preconizam sincronizar oa onda de crescimento folicular, a fase luteínica e
sua regressão e, o momento da ovulação, permitindo o emprego da IA em tempo fixo.
Sincronização do estro com prostaglandinas
A prostaglandina e seus análogos foram amplamente empregados com a
finalidade de sincronizar as manifestações estrais, objetivando o emprego de
biotecnologias. A prostaglandina causa regressão do corpo lúteo durante fase restrita do
ciclo estral (diestro), na qual o CL apresenta responsividade à luteólise, com
conseqüente queda dos níveis de progesterona e manifestações de cio, seguidas de
ovulação após 2 a 5 dias da aplicação (Nebel e Jobst, 1998). A responsividade inicia-se
no 5° dia do ciclo estral, aumenta até o 12° dia e permanece em fase de platô até o 17°
dia, quando se inicia a regressão espontânea causada pela liberação endógena de
prostaglandina (Odde, 1990; Larison e Ball, 1992). No momento em que ocorre a
regressão do corpo lúteo, o folículo dominante presente, que não iniciou a fase de
regressão e de atresia, será o folículo ovulatório (Kastelic et al., 1990). Verificou-se que
quando o tratamento com prostaglandina é realizado no 5° dia do ciclo estral, no
momento em que o folículo dominante da primeira onda ainda está em fase de
crescimento, o intervalo entre a aplicação e a ovulação é de 3 dias. No caso do o
tratamento iniciar-se no 12° dia do ciclo estral, o folículo dominante da segunda onda
encontra-se no início da fase de crescimento e a ovulação ocorre 4,5 dias após a
aplicação. Em bovinos tratados no 8° dia do ciclo estral, ocorre freqüentemente a
ovulação do folículo dominante da primeira onda folicular 4 dias após a aplicação de
prostaglandina; no entanto, ocasionalmente pode ocorrer a ovulação do segundo folículo
dominante 6 dias após o tratamento.
Em bubalinos, também foi detectada variação na duração da manifestação do estro (36 a
96 horas) após a aplicação de prostaglandina (Baruselli, 1994). Com o objetivo de
estudar detalhadamente as variações do estro e da ovulação após a aplicação de
prostaglandina nesta espécie, nossa equipe realizou recentemente experimento com
acompanhamento da dinâmica folicular de animais tratados em diferentes fases do ciclo
estral (Porto Filho et al., 1999). Os animais foram divididos em dois grupos: o Grupo 1
recebeu prostaglandina antes do Dia-10 e o Grupo 2 recebeu prostaglandina após Dia-10
do ciclo estral. As búfalas foram colocadas na presença de duas fêmeas androgenizadas
para auxiliar a detecção de cio, realizada pelo sistema de radiotelemetria (Heatwatch).
As ovulações foram acompanhadas por ultra-sonografia, de 6 em 6 horas após o início
do cio. Os resultados estão expostos na Tabela 7. Verificou-se que a fase do ciclo estral
na qual foi ministrada a prostaglandina interferiu no intervalo entre o tratamento e o
início das manifestações estrais e a ovulação (P < 0,01). As búfalas tratadas antes do dia
10
apresentaram menor intervalo de tempo para as manifestações do estro e da
ovulação, comparadas com animais tratados após o dia 10 do ciclo estral. Os resultados
demonstram que neste grupo ocorreu, provavelmente, a ovulação do folículo dominante
da primeira onda, presente no momento da aplicação da prostaglandina.
Tabla 7. Intervalo entre a aplicação de prostaglandina e o início do cio e a ovulação,
de acordo com a fase do ciclo estral (< D-10 e > D-10) na qual foi realizado o
tratamento. São Paulo, 1999.
Fase do ciclo Número
de PG- início do cio (h)
PG-ovulação (h)
estral
tratamentos
< dia 10
31
40,4 ± 2,1 a
70,0 ± 11,3a
> dia 10
14
56,3 ± 3,2 b
87,2 ± 12,9b
(a ≠ b; P < 0,01)
Porto-Filho et al. (1999)
Estes dados demonstram que o sucesso da aplicação da prostaglandina depende
da presença do corpo lúteo funcional em fase específica do ciclo estral (diestro).
Observa-se, também, que o estro e a ovulação não são precisamente sincronizados
devido à variação da população folicular no momento da regressão do corpo lúteo,
sendo que alguns animais apresentam demora na maturação do folículo dominante
ovulatório. Em função desta variação, faz-se necessária a detecção das sintomatologias
de estro após o tratamento com prostaglandina para identificar o momento apropriado
para a realização da inseminação artificial. Assim, protocolos que procurem utilizar a
inseminação em tempo fixo apenas com a utilização de prostaglandina, não têm
apresentado bons resultados.
Sincronização com GnRH/PGF2αα/GnRH para IA em tempo fixo
Assim, pela avaliação da eficiência do método de sincronização da ovulação para
inseminação artificial em tempo fixo em bubalinos (Baruselli et al., ). Os animais
receberam 10µg de GnRH (Acetato de buserelina) durante o período pós-parto (média
de 60 dias), sendo aplicados 7 dias mais tarde PGF2α. Dois dias após a aplicação da
PGF2α os animais receberam 10µg de GnRH, sendo inseminados 16 horas mais tarde.
A primeira fase do projeto objetivou estudar a dinâmica folicular de 33 búfalas tratadas
com o protocolo “Ovsynch”, para verificar a resposta da espécie a esta seqüência de
tratamentos hormonais. Pela análise dos exames ulta-sonográficos, observou-se que
60,6% dos animais ovularam após a 1a aplicação de GnRH. Notou-se que os animais
que ovularam apresentaram diâmetro superior do maior folículo (0,95 ± 0,17a vs. 0,67 ±
0,24b cm; P<0,01). Observou-se, também, que búfalas com elevadas concentrações de
P4 (>1ng/ml) no dia da aplicação do 1º GnRH apresentaram taxa de ovulação
semelhante aos animais com baixas concentrações de P4 (66,6 vs. 55,5%; P>0,05). O
intervalo entre a 1a aplicação de GnRH e a ovulação foi de 33,0 ± 8,3h (n=20), e o
intervalo entre a 2a aplicação de GnRH e a ovulação foi de 32,0 ± 5,7h. No dia da
aplicação de PGF2α, as búfalas apresentaram folículo com diâmetro médio de 1,03 ±
0,20cm (0,7 a 1,5cm), sugerindo que houve sincronização da onda folicular. As búfalas
que ovularam na 1a aplicação de GnRH (n=20) apresentaram maiores concentrações
plasmáticas de P4 no dia da aplicação da PGF2α (2,56 ± 1,02 vs. 1,26 ± 0, 82 ng/ml;
P<0,05). Observou-se que 100% dos animais apresentaram concentração plasmática de
P4 abaixo de 1ng/ml 48h após a aplicação de PGF2α, demonstrando efetivo efeito
luteolítico. Os animais que não ovularam na 1a aplicação de GnRH (n=13) apresentaram
intervalo mais curto entre a 2a aplicação de GnRH e a ovulação (22,2 ± 10,4 vs. 33,9 ±
4,9 h; P<0,05), provavelmente devido à menor sincronização da onda folicular nos
animais que não ovularam. Os resultados demonstraram que os bubalinos respondem ao
tratamento com GnRH/ PGF2α/GnRH.
Na segunda fase do experimento (10), foram inseminadas artificialmente 1.053
búfalas leiteiras pelo protocolo “Ovsynch”, em seis propriedades rurais do Vale do
Ribeira, no Estgado de São Paulo, Brasil, durante o ano de 1998/1999. Nesta fase,
estudou-se o efeito de fatores ligados à condição corporal no início do tratamento
(escala de 1 a 5), a ordem de partos, o período pós parto em que se iniciou o tratamento,
a ordem de inseminação e o período de inseminação (estação reprodutiva favorável março a agosto - n=967; estação reprodutiva desfavorável – setembro a dezembro n=86) sobre a taxa de concepção. As 967 búfalas tratadas durante a estação reprodutiva
favorável apresentaram taxa de concepção média de 48,8%. Observou-se influência
(P<0,05) da condição corporal na taxa de concepção (≤3,0 = 31,4%a, n=223; 3,5 =
52,9%b, n=546; ≥4,0 = 57,1%b, n=198). Este resultado sugere que as búfalas devem
apresentar condição corporal ≥3,5 para obtenção de boa eficiência ao tratamento. A
ordem de partos também interferiu na eficiência do tratamento (P<0,05). Primíparas
apresentaram menor eficiência do que pluríparas (35,5%; n=138 vs. 51,0%; n=829).
Portanto, deve-se preferencialmente sincronizar pluríparas para melhorar a eficiência
deste tratamento. O período pós-parto em que se iniciou o tratamento e a ordem da
inseminação não interferiram estatisticamente no tratamento (P>0,05). Estes resultados
demonstram que o tratamento pode ser iniciado entre 40 e 60 dias pós parto e os
animais que não se tornaram gestantes à primeira sincronização podem ser tratados
novamente. Desta maneira, pode-se alcançar taxa de prenhez do rebanho trabalhado de
aproximadamente 75%, com duas inseminações sincronizadas em período de serviço
inferior a 100 dias. O grupo de animais inseminados fora da estação reprodutiva
(primavera; 6,9%; n=86) apresentou menor taxa de concepção do que o grupo
inseminado durante a estação reprodutiva favorável (outono/inverno; 48,8%; n=967;
P<0,05). Este dado demonstra que, mesmo com a estimulação hormonal exógena, os
bubalinos continuam apresentando marcada estacionalidade reprodutiva.
Recentemente, Baruselli et al. (10) objetivaram avaliar a eficiência de outro análogo de
GnRH (Lecirelina), lançado recentemente no mercado (Gestran Plus). Os animais
tratados com Lecirelina foram comparados ao grupo controle, composto de animais
sincronizados com Acetato de buserelina (Conceptal). Foram utilizadas 270 búfalas
pertencentes a 2 propriedades rurais localizadas nos Estados de São Paulo e de Mato
Grosso do Sul. As búfalas do G1 (n=132) receberam 20µg de Acetado de buserelina e,
7setedias mais tarde, PGF2α. Dois dias após a PGF2α, os animais receberam 10µg
Acetado de buserelina. No G2 (n=138) foi empregado o mesmo protocolo, diferindo na
1ª (50µg de Lecirelina) e na 3ª (25µg de Lecirelina) doses de GnRH. Procedeu-se à
IATF 16 horas após o 2º GnRH em ambos os grupos. Observou-se que não houve
diferença na taxa de concepção entre os tratamentos (Acetato de buserelina=47,0% vs.
Lecirelina=50%). Com base nestes resultados podemos concluir que é possível utilizar a
Lecirelina para sincronizar a ovulação para inseminação artificial em tempo fixo (IATF)
em bubalinos.
Em outro experimento (15) objetivou avaliar a eficiência de diferentes doses de GnRH
(Acetato buserelina e Lecirelina) na IATF. Foram utilizadas 482 búfalas que receberam
20µg (G1; n=84) e 10µg (G2; n=86) de Acetato de buserelina e, 7 dias mais tarde,
PGF2α. Dois dias após a PGF2α os animais receberam 10µg de Acetato de buserelina.
Nos G3 e G4 foram tratadas seguindo o mesmo protocolo, diferindo apenas o análogo
de GnRH, (G3=50µg e G4=25µg de Lecirelina). Procedeu-se à IATF 16h após o 2º
GnRH. Os animais apresentaram semelhantes taxas de concepção, de 55,9% (47/84),
52,3% (45/86), 49,0% (76/155) e de 48,4% (76/157), respectivamente, para os Grupos
1, 2, 3 e 4 (P>0,05). Os resultados demonstram que é possível utilizar reduzidas doses
de Acetato de buserilina e de Lecirelina no protocolo de IATF em bubalinos.
Com o objetivo de estudar novas alternativas de sincronização da ovulação com
gonadotrofinas, nossa equipe realizou experimento para avaliar o efeito da substituição
do GnRH pelo LH na segunda aplicação hormonal do protocolo “Ovsynch” em
bubalinos (17). O LH age diretamente no folículo, induzindo a ovulação, enquanto o
GnRH estimula a hipófise a liberar LH endógeno, o qual irá provocar a ovulação. Na
ausência de estoque de LH na hipófise, a aplicação de GnRH não induz a liberação de
LH e, consequentemente, não ocorre ovulação. Neste sentido, foi acompanhada a
dinâmica folicular por ultra-sonografia em 30 búfalas (G1, n=15; GnRH/PGF2α/GnRH e
G2, n=15; GnRH/PGF2α/LH). Para avaliar a eficiência a campo, foram sincronizadas e
inseminadas 305 búfalas com estes protocolos (G1, n=154; G2, n=151). Os animais
receberam 20µg de GnRH (Acetato de buserelina, Conceptal) durante o período pósparto, sendo aplicados 7 dias mais tarde, 15mg de PGF2α (Luprostiol, Prosolvin). Dois
dias após a aplicação da PGF2α, os animais receberam 10µg de GnRH (G1) ou 12,5mg
de LH (G2; Lutropin-V). Observou-se taxa de ovulação após a primeira aplicação de
GnRH de 86,6% (26/30). A taxa de ovulação após a 2a dose de GnRH e ao LH foi de
93,3% (14/15) e de 93,3% (14/15) , respectivamente. A ovulação ocorreu 36,4 + 10,4h
após a 1a aplicação de GnRH para ambos os grupos. O G1 (GnRH) apresentou média de
26,5 + 9,6h desde a última aplicação hormonal até a ovulação. Os animais do G2
ovularam 24,4 + 7,9h após a aplicação de LH. O momento da ovulação entre os dois
grupos não diferiu estatisticamente (GnRH vs. LH; P>0,05). Os animais inseminados a
campo com GnRH e LH apresentaram taxas de concepção de 56,49% (n=154) e 64,24%
(n=151), respectivamente (P=0,08). Os resultados demonstraram que houve
sincronização da ovulação e boa eficiência do protocolo a campo nos dois grupos
estudados.
Sincronização com progesterona e ou progestágeno para IA em tempo fixo
Em bubalinos existem poucos relatos científicos sobre a utilização de progestágenos e
ou P4 para sincronizar o estro e a ovulação com o objetivo de realizar a IATF. Na Itália,
Zicarelli et al. (59) estudaram o emprego a campo de CRESTAR e de PRID em
búfalas leiteiras. Os resultados demonstraram baixa eficiência dos tratamentos, com taxa
de concepção variando entre 11,4 e 29,2% para ambos os grupos. Os autores
verificaram que 55,7% das novilhas e 40,6% das vacas não apresentaram ovulação até
96h após a retirada do implante.
Alguns pesquisadores indianos relataram a eficiência de tratamentos com progestágenos
em bubalinos. Rao et al. (46) observaram em 150 búfalas, que 93,3% (140/150)
manifestaram estro em média 78 ± 8h após a retirada do implante contendo P4, e 40,7%
(61/150) dos animais conceberam após duas inseminações, 48 e 72h após a retirada do
PRID. Bodhipaksha et al. (21) conduziram experimento comparando a taxa de
concepção à IA e à cobertura natural em 40 búfalas tratadas com PRID por 12 dias. O
índice de concepção foi de 40% em ambos os grupos. Também, Rajamahendran e
Thamotharam (45) observaram 80% (12/15) de estro em búfalas, as quais retiveram
100% dos PRIDs implantados na vagina. O índice de concepção à IATF (60 a 84h após
a remoção do dispositivo intravaginal) foi de 33% (4/12), considerado baixo.
No Brasil, com o objetivo de avaliar o momento adequado para a IA em tempo fixo em
fêmeas bubalinas, nossa equipe testou dois protocolos hormonais visando sincronizar o
ciclo estral e a ovulação (4). No G1 (n=15) foi utilizado CIDR-B por 9 dias
consecutivos, sendo aplicados 1mg de benzoato de estradiol (BE) no momento da
inserção do implante e PGF2α no momento da remoção do implante. O G2 (n=15)
recebeu CRESTAR por 9 dias consecutivos, sendo aplicado 5mg de valerato de
estradiol (VE) e 3 mg de norgestomet via IM no momento da inserção do implante.
Exames ultra-sonográficos diários foram realizados para estudo da dinâmica folicular e
da ovulação. O estro foi detectado por sistema de radiotelemetria (Heat Watch). O
intervalo entre a inserção do implante e a emergência da onda folicular ovulatória foi de
5,5 ± 0,8 dias (n=15; 100%) para o G1 e de 8,7 ± 0,8 dias (n=12; 80,0%) para o G2
(P<0,01). Em 3 animais do G2 não foi observado crescimento folicular durante os
exames ultra-sonográficos. O intervalo médio entre a retirada do implante e o início das
manifestações de cio foi de 42,2 ± 19,6h (n=14; 93,3%) para o G1 e de 117,4 ± 88,1h
(n=10; 60,0%) para o G2. A duração média do cio no G1 foi de 16,42 ± 19,9h, enquanto
que o G2 apresentou duração média de 8,5 ± 9,0h. O intervalo entre a remoção do
implante e a ovulação foi de 70,22 ± 19,8h (n=10; 66,6%) para o G1, enquanto que no
G2, apenas uma búfala ovulou (6,7%) com intervalo de 64h. Provavelmente a
quantidade e a propriedade química do estradiol aplicado na inserção do implante (5mg
de VE vs. 1mg de BE) tenha contribuído para a supressão do crescimento folicular com
conseqüente baixa eficiência na sincronização da ovulação nos animais do G2. O grupo
tratado com CIDR-B apresentou crescimento folicular e ovulação. No entanto,
somente 66,6% dos animais tratados ovularam e não apresentaram ovulação
sincronizada (variando de 32 a 96h). Pelos resultados obtidos, pode-se concluir que o
uso do protocolo CRESTAR com aplicação de 5mg de VE não apresentou eficiência
na sincronização do estro e da ovulação em bubalinos. Os animais tratados com o
protocolo CIDR-B apresentaram ovulação, entretanto o percentual de animais que
ovularam (66,6%) e a sincronização da ovulação não demonstraram boa eficiência. São
necessárias alterações nestes protocolos para ajustá-los à espécie bubalina.
Em outro experimento, procuramos avaliar a dinâmica folicular de búfalas com
implantes de CIDR-B por 9 dias, tratadas com diferentes doses de BE no momento da
inserção do implante (26). Os animais receberam diferentes doses de BE no momento
da inserção do implante (G1=1,0mg; G2=2,5mg; G3=5,0mg). Exames ulra-sonográficos
diários foram realizados para o estudo da dinâmica folicular e da ovulação. O estro foi
detectado por sistema de radiotelemetria (Heat Watch). O intervalo de tempo entre a
inserção do implante e o início da onda de crescimento folicular foi diferente entre os
grupos. Os animais tratados com 5mg de BE apresentaram maior intervalo de tempo
entre a aplicação hormonal e o início da onda de crescimento folicular quando
comparado aos animais que receberam 2,5 e 1mg (P<0,05). O intervalo entre a remoção
do implante e o início das manifestações de cio foi de 65,6 ± 45,7h (n=5; 62,5%) para o
G1, de 56,6 ± 35,1h (n=4; 50,0%) para o G2 e de 55,8 ± 39,6h (n=5; 62,5%) para o G3
(P>0,05). O intervalo de tempo entre a retirada do implante e a ovulação foi de 72,3 ±
19,8h (n=6; 75,0%) para o G1, de 67,5 ± 21,1h (n=6; 75,0%) para o G2 e de 78,2 ±
39,3h (n=5; 62,5%) para o G3 (P>0,05). Os trabalhos realizados com objetivo de
sincronizar o estro e a ovulação com P4 e ou progestágenos em bubalinos têm
apresentado baixa eficiência, com pequeno percentual de ovulações e com grande
variabilidade no tempo de ovulação após a retirada do implante.
Com o objetivo de melhorar a resposta aos tratamentos com P4 realizamos outro
experimento administrando eCG no momento da remoção do dispositivo intravaginal de
P4 (CIDR-B), na tentativa de dar suporte gonadotrófico ao folículo dominante presente
no final do tratamento e aumentar a taxa de ovulação. Para sincronizar a ovulação
optou-se pela aplicação de hCG, efetuada dois dias após a administração de eCG (16).
Observaram-se satisfatórias taxas de concepção (55%) com o emprego desse protocolo,
para animais sincronizados e inseminados em tempo fixo, mesmo durante a estação
reprodutiva desfavorável.
Factores de explotación que afectan la eficiencia de la inseminación artificial en los
bufalinos
IATF DURANTE A ESTAÇÃO REPRODUTIVA DESFAVORÁVEL
Os búfalos apresentam eficiente resposta a sincronização da ovulação para a
inseminação artificial em tempo fixo (IATF) durante a estação reprodutiva favorável
(outono e inverno; Baruselli et al., 1999, 2000). No entanto, estes animais, quando
sincronizados para IATF na estação reprodutiva desfavorável (primavera e verão)
apresentam taxa de concepção mais baixa (Baruselli et al., 1999).
O desenvolvimento de protocolos para a IATF que apresentem respostas eficientes
durante o ano todo poderá ser mais uma ferramenta para a distribuição dos partos e da
lactação das búfalas leiterias.
Neste sentido, nossa equipe desenvolveu projeto avaliando a eficiência de protocolos de
desestacionalização para IATF em bubalinos (Baruselli et al., 2002; 2003; Porto Filho,
2004; Porto Filho et al., 2004). As búfalas receberam tratamento à base de progesterona,
benzoato de estradiol, PGF2α, eCG e hCG segundo os protocolos demonstrados nos
experimentos à seguir:
Experimento 1
O objetivo deste experimento foi avaliar diferentes protocolos para a sincronização da
ovulação e utilizá-los na IATF durante a estação reprodutiva desfavorável (primavera e
verão).
Para tanto, foram utilizadas 135 búfalas multíparas mantidas em pastagens tropicais no
Estado de São Paulo, durante os meses de Dezembro de 2001 e Janeiro de 2002 . Estas
fêmeas foram divididas em dois grupos de acordo com ECC, idade e presença de
bezerro. No Grupo 1 (G1; n=96), as búfalas receberam um dispositivo intravaginal de
progesterona (1,9 g de P4, CIDR-B, InterAg) mais 2,0 mg de benzoato de estradiol
(Estrogin, Farmavet) em estágio aleatório do ciclo estral (Dia 0, tarde). O CIDR-B foi
removido no dia 9 (D9, tarde) juntamente a aplicação de uma dose de PGF2α (IM, 0,150
mg de d-cloprostenol, Preloban, Hoechst) e 500 UI de eCG (IM, Novormon, Syntex).
Após dois dias (D11, tarde), cada fêmea recebeu 1.500 UI de hCG (IM, Vetecor®,
Calier). As búfalas foram inseminadas 14 horas após a aplicação de hCG (D12, manhã).
No Grupo 2 (G2; n=39), as búfalas foram submetidas ao protocolo tradicional para
IATF (“Ovsynch”; GnRH/PGF2α/GnRH). As fêmeas receberam 25µg de GnRH
(Lecirelina, Gestran-plus®, Arsa) em estágio aleatório do ciclo estral (D0, tarde). Sete
dias mais tarde (D7, tarde), foi efetuada uma aplicação de 0,150 mg de PGF2α (IM, dcloprostenol, Preloban). A segunda dose de 25µg GnRH foi aplicada dois dias mais
tarde (D9, tarde). A IATF foi realizada 16h após a última aplicação hormonal (D10
manhã), com o sêmen do mesmo touro utilizado no G1 (FIG. 1).
Grupo 1: BE+CIDR-B/PGF2αα+eCG/hCG/IA
2,0 mg BE
0,150 mg PGF2α
500 UI eCG
1.500 UI hCG
CIDR-B
IATF
14h
D0
D9
D11
18hs
18hs
D12
18hs
08hs
Grupo 2: “Ovsynch” (GnRH/PGF2αα/GnRH)
25 µg GnRH
25 µg GnRH
0,150 mg PGF2α
IATF
16h
D0
D7
D9
D10
17hs
17hs
17hs
09hs
FIGURA 1 - Protocolos utilizados para sincronização da ovulação e inseminação
artificial em tempo fixo na estação reprodutiva desfavorável. São Paulo - SP, 2002.
Baruselli et al., 2002
A taxa de concepção foi maior para as búfalas do G1 do que para as do G2
(P<0,01; TAB. 4).
Tabla 4 - Eficiência de diferentes protocolos utilizados em búfalas para inseminação
artificial em tempo fixo durante a estação reprodutiva desfavorável. São Paulo - SP,
2002.
Tratamentos
No de animais inseminados
Taxa de concepção (%)
Grupo 1
86
53,5 (46/86)b
Grupo 2 (“Ovsynch”)
39
28,2 (11/39)a
ab
diferentes dentro de uma mesma coluna denota diferença estatística (P<0,01)
Baruselli et al., 2002
A baixa taxa de concepção observada nos animais tratados com o protocolo “Ovsynch”
está de acordo com os resultados obtidos por Baruselli et al. (1999).
Na Itália, Zicarelli et al. (1997) em condições de campo, estudaram o uso do
CRESTAR e do PRID em búfalas leiteiras durante a primavera. Os resultados obtidos
demostraram baixa eficiência do tratamento. Os autores verificaram que 55,7% das
novilhas e 40,6% das vacas não ovularam até 96 horas após a retirada dos implantes de
P4. Rajamahendran e Thamotharam (1983) observaram 80% de estro em búfalas
tratadas com progesterona, no entanto, a taxa de prenhez à IATF (60 a 84 horas após a
retirada dos dispositivos de P4) foi 33%, o que é considerado baixo. No Brasil
(Bartolomeu et al., 2001) as búfalas submetidas à IATF após a sincronização da
ovulação com CIDR-B e CRESTAR também apresentaram baixa taxa de prenhez
(21,0 a 27,3 %). Barille et al. (2001), utilizando duas IAs (uma 72 e a outra 96 horas
após a remoção do PRID), administraram eCG no momento de retirada dos
dispositivos de progesterona, e obtiveram um aumento na taxa de concepção (50%). No
presente
experimento,
os
resultados
do
grupo
tratado
com
BE+CIDR-

B /PGF2α+eCG/hCG na estação reprodutiva desfavorável, foram considerados
satisfatórios, uma vez que os animais receberam apenas uma inseminação artificial (62
horas após a retiradas do dispositivo de progesterona). O protocolo proposto no presente
experimento permitiu a utilização de apenas uma inseminação devido a indução e
sincronização desta por hCG. Em resumo, os resultados demonstraram que a utilização
de BE+P4/PGF2α+eCG/hCG resultaram em satifatória taxa de concepção em búfalas
submetidas a IATF durante a estação reprodutiva desfavorável.
Experimentos 2 e 3
Os objetivos dos experimentos 2 e 3 foram de reduzir as doses dos hormônios hGC
(exp. 2) e eCG (exp. 3) nos protocolos para IATF durante a estação reprodutiva
desfavorável (primavera e verão), visando minimizar os custos dos tratamentos sem
prejudicar as taxas de concepção.
Estes experimentos foram realizados em diferentes propriedades dos Estados de São
Paulo e Paraná, no período de novembro de 2002 a fevereiro de 2003 (exp. 2), e entre
novembro de 2003 e fevereiro de 2004 (exp. 3).
Para o experimento 2, foram utilizadas 174 búfalas leiteiras das raças Murrah e
Mediterrâneo, mantidas a pasto e suplementadas com mineral ad libitum. As fêmeas
foram divididas aleatoriamente em dois grupos, de acordo ECC, idade e presença do
bezerro.
As aplicações hormonais foram realizadas por via intramuscular (IM) no período da
tarde (17hs), e as IAs foram efetuadas no período da manhã (09hs), 16 horas após a
aplicação do hCG no D11 (FIG. 2).
A inseminação artificial em tempo fixo (IATF) tem como objetivo a sincronização da
ovulação, permitindo que a inseminação artificial seja programada para um determinado
dia e hora (tempo fixo), sem a necessidade da detecção do estro.
Esta técnica foi desenvolvida em função do fato de que em todo o mundo os programas
de IA apresentam baixa taxa de serviço, principalmente pela dificuldade na detecção do
estro, sendo este um dos principais entraves
para a expansão da IA. Este
comprometimento é ainda maior em rebanhos bubalinos, devido à particularidades do
comportamento reprodutivo, como descrito anteriormente. Desta forma, programas que
visam empregar a inseminação artificial em tempo fixo (IATF), sem a necessidade de
detecção de estro, colaboram sobremaneira para o aumento do emprego desta
biotecnologia.
Estes protocolos preconizam sincronizar a onda de crescimento folicular, a fase
luteínica e sua regressão e, o momento da ovulação, permitindo o emprego da IA em dia
e horário predeterminados. Assim, foram realizados experimentos para avaliar a
eficiência do método de sincronização da ovulação para inseminação artificial em
tempo fixo (Ovsynch) em bubalinos durante o período pós-parto (média de 60 dias),
cuja metodologia básica consiste na aplicação de
10µg de GnRH (Acetato de
buserelina) durante o período pós-parto (média de 60 dias), sendo aplicados 7 dias mais
tarde prostaglandina (PGF2α). Dois dias após a aplicação da PGF2α os animais
receberam 10µg de GnRH, sendo inseminados 16 horas mais tarde (Baruselli et al. 1999
e 2000).
O primeiro estudo objetivou avaliar a dinâmica folicular de 33 búfalas tratadas com esse
protocolo para verificar a resposta da espécie a esta seqüência de tratamentos (Baruselli
et al., 1999). Pela ulta-sonografia, observou-se que 60,6% dos animais ovularam após a
1a aplicação de GnRH. Notou-se que as búfalas que ovularam apresentaram diâmetro
superior do maior folículo no momento do tratamento (0,95 ± 0,17a vs. 0,67 ± 0,24b
cm; P<0,01). O intervalo entre a 1a aplicação de GnRH e a ovulação foi de 33,0 ± 8,3h
(n=20), e o intervalo entre a 2a aplicação de GnRH e a ovulação foi de 32,0 ± 5,7h, com
a grande maioria das ovulações (92%) ocorrendo em um intervalo de apenas 12 horas.
Observou-se que 100% dos animais apresentaram concentração plasmática de P4 abaixo
de 1ng/ml 48h após a aplicação de PGF2α, demonstrando efetivo efeito luteolítico. Os
resultados são indicativos de que os bubalinos respondem satisfatoriamente ao
tratamento com GnRH/ PGF2α/GnRH, apresentando sincronização do crescimento
folicular e da ovulação que permitem o emprego da inseminação artificial em tempo
fixo..
Na segunda fase do estudo (Baruselli et al., 2000), foram inseminadas artificialmente
em tempo fixo 1.053 búfalas leiteiras sincronizadas com o protocolo “Ovsynch”. Nesta
fase, avaliou-se o efeito da condição corporal no início do tratamento (escala de 1 a 5),
da ordem de partos, do período pós-parto em que se iniciou o tratamento, da ordem de
inseminação e do período de inseminação (estação reprodutiva favorável - março a
agosto - n=967; estação reprodutiva desfavorável – setembro a dezembro - n=86) sobre
a taxa de concepção. As 967 búfalas tratadas durante a estação reprodutiva favorável
apresentaram taxa de concepção média de 48,8%. Observou-se influência (P<0,05) da
condição corporal na taxa de concepção (≤3,0 = 31,4%a, n=223; 3,5 = 52,9%b, n=546;
≥4,0 = 57,1%b, n=198).
Este resultado sugere que as búfalas devem apresentar condição corporal ≥3,5 para
obtenção de boa eficiência à inseminação artificial em tempo fixo. A ordem de partos
também interferiu nos resultados (P<0,05). Primíparas apresentaram menor eficiência
do
que
pluríparas
(35,5%;
n=138
vs.
51,0%;
n=829).
Portanto,
deve-se
preferencialmente sincronizar pluríparas para melhorar a eficiência deste tratamento.
O período pós-parto em que se iniciou o tratamento e a ordem da inseminação não
interferiram estatisticamente nos resultados (P>0,05). Estes dados demonstram que a
sincronização pode ser iniciada entre 40 e 60 dias pós parto e os animais que não se
tornaram gestantes à primeira inseminação podem ser tratados novamente. Desta
maneira, pode-se alcançar taxa de prenhez de aproximadamente 75%, com duas
inseminações sincronizadas em período de serviço inferior a 100 dias.
O grupo de animais inseminados fora da estação reprodutiva (primavera) apresentou
menor taxa de concepção (6,9%; n=86) do que o grupo inseminado durante a estação
reprodutiva favorável (outono/inverno; 48,8%; n=967; P<0,05). Este dado demonstra
que o protocolo que emprega GnRH/ PGF2α/GnRH (Ovsynch) para inseminação
artificial em tempo fixo em bubalinos não apresenta resultado satisfatório fora da
estação reprodutiva favorável.
Devido a baixa eficiência do protocolo Ovsynch para IATF fora da estação reprodutiva
e a marcada estacionalidade dos partos que dificulta a produção homogênea de leite
durante o ano foram realizados estudos com finalidade de sincronizar o crescimento
folicular e a ovulação com diferentes protocolos. Para tanto, utilizou-se tratamentos que
associam
dispositivos
intravaginais
ou
auriculares
contento
progesterona
e
progestágenos com PGF2α e estrógenos com finalidade de viabilizar a IATF em
bubalinos durante todo o ano.
Assim, foi estudada a dinâmica folicular durante os tratamentos com dispositivo
intravdinal de progesterona (CIDR) e com implantes auriculares de Norgestomet
(CRESTAR) no período reprodutivo favorável (outono e inverno) e desfavorável
(primavera e verão; Bartolomeu, 2003). Encontrou-se baixa taxa de ovulação de 40%
para as búfalas sincronizadas com CID) e de 20% para as búfalas sincronizadas com
CRESTAR. Nesse mesmo experimento, o intervalo decorrido para o início de uma nova
onda de crescimento folicular foi inferior para búfalas tratadas com CIDR (3,5 ± 0,4
dias) que as tratadas com CRESTAR (6,3 ± 0,2 dias), provavelmente pela maior
permanência na circulação do Valerato de estradiol, empregado juntamente com a
inserção do implante (Dia 0) nos animais sincronizados com CRESTAR. O intervalo
entre a retirada do dispositivo e a ovulação foi de 62,0 ± 5,6 horas para o grupo CIDR e
de 64,0 ± 0,0 horas para o grupo CRESTAR.
Em outra investigação, também na estação reprodutiva desfavorável (Moura, 2003),
verificou-se que búfalas que receberam 1,0mg de BE associado ao momento da inserção
do CIDR não ovularam ao final do tratamento e aquelas que receberam 2,5mg e 5,0mg
de BE apresentaram reduzidas taxas de ovulação (20%). Quando as búfalas foram
inseminadas em tempo fixo após a administração de 0,5 (G1) e 1,0mg (G2) de BE 24
horas após a retirada do CIDR as taxas de prenhez foram de 6,7% (G1; 2/30) e de
10,0% (G2; 3/30). O grupo controle (Ovsynch) também não apresentou resultados
satisfatórios (10,3%; 3/29).
Pelos resultados obtidos, pode-se concluir que o uso desses protocolos não
apresentaram resultados satisfatórios na taxa de ovulação e de concepção em bubalinos
sincronizados e inseminados em tempo fixo durante a estação reprodutiva desfavorável.
Visando melhorar a resposta aos tratamentos com progesterona realizou-se outro
experimento administrando eCG no momento da remoção do dispositivo intravaginal de
progesterona (CIDR), na tentativa de dar suporte gonadotrófico ao folículo dominante
presente no final do tratamento (ação FSH e LH do eCG) e aumentar as taxas de
crescimento folicular e de ovulação. Para sincronizar a ovulação optou-se pela aplicação
de hCG, efetuada dois dias após a administração de eCG (Baruselli et al., 2002), sendo
os animais inseminados 16 horas após. Com esse protocolo, observou-se satisfatórias
taxas de concepção (55%) à IATF mesmo durante a estação reprodutiva desfavorável.
Em outra investigação foi estudada a dinâmica folicular durante os tratamentos com
eCG associado a dispositivos intravaginais de progesterona (Porto Filho, 2004). A taxa
de ovulação foi maior no grupo que recebeu eCG (G2; 70,0%) do que naquele que não
recebeu (G1; 44,4%). Em bovinos, resultados semelhantes quanto à associação ou não
de eCG a dispositivos intravaginais ou implantes subcutâneos de liberação de P4
também são relatados. Cutaia et al. (2003) verificaram diferença significativa com a
utilização do eCG na taxa prenhez de vacas que se encontravam em anestro (30,6%
versus 54,2%). Baruselli et al (2004) verificaram diferença significativa nas taxas de
concepção, ao compararem o uso (51,9%) ou não (38,8%) de eCG em vacas bovinas de
corte, sendo esse efeito mais evidente em vacas em anestro.
Assim, os resultados apresentados sugerem que o tratamento com eCG no momento da
retirada dos dispositivos de P4 aumenta as taxas de ovulação e de prenhez em fêmeas
bubalinas na estação reprodutiva desfavorável. Desta forma, preconiza-se a utilização
do protocolo “Ovsynch” durante a estação reprodutiva favorável (alta taxa de
ciclicidade e reduzidos custos; Figura 1) e o protocolo com dispositivos contendo
progesterona associados ao eCG durante a estação desfavorável (baixa taxa de
ciclicidade; Figura 2).
1o GnRH
PGF2α
2o GnRH
IA
16 h
Dia 0
(16:00h)
Dia 7
(16:00h)
Dia 9
(16:00h)
Dia 10
(8:00h)
Figura 1. Protocolo de inseminação artificial em tempo fixo com sincronização da ovulação em
bubalinos durante a estação reprodutiva favorável.
PGF2α
(150 µg)
BE
(2 mg)
+
eCG
(400 UI)
hCG
(1.000 UI)
IA
14 h
Dispositivo Intravaginal de Progesterona
Dia 0
Dia 9
Dia 11
Dia 12
(18:00h)
(18:00h)
(18:00h)
(8:00h)
Figura 2. Protocolo de inseminação artificial em tempo fixo com sincronização da ovulação em
bubalinos durante a estação reprodutiva desfavorável.
Conclusões
Os conhecimentos existentes sobre o manejo reprodutivo e o emprego de biotécnicas da
reprodução em bubalinos permitem avaliar e indicar, aos técnicos e criadores, quais os
procedimentos que podem ser empregados com sucesso. De posse desses
conhecimentos, o setor produtivo possui ferramentas para incrementar o emprego da
inseminação artificial em tempo fixo durante o ano todo, com vistas à melhoria genética
e produtiva dos rebanhos bubalinos.
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