Resumo expandido IC/UFPI

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AÇÃO DO ANTIOXIDANTE SINTÉTICO HIDRÓXIDO BUTIL TOLUENO
(BHT) NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQUINO.
Sávio Ruan Sampaio de Sousa(Bolsista PIBIC/CNPq), José Adalmir Torres de
Souza(Orientador, Departamento DCCV/CCA/UFPI)
Introdução
A criopreservação de sêmen eqüino representa uma importante biotécnica aplicada ao
manejo reprodutivo desta espécie. Entretanto, os processos de refrigeração e congelação são
eventos que promovem estresse sobre as células ao estimular a produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS), o que determina a redução da integridade estrutural e funcional da célula
espermática. Desta forma, a nossa pesquisa teve como objetivo avaliar e comparar diferentes
concentrações (0,5 µM; 1,0 µM; 2,0 µM) do antioxidante Hidróxido Butil Tolueno (BHT), associado ao
diluidor botu-crio ®, na qualidade do sêmen equino pós-descongelamento.
Metodologia
Foram utilizados quatro equinos machos, da raça Quarto de Milha com idades variando de 3
a 9 anos, pertencentes a um haras localizados no município de José de Freitas, Piauí, sendo colhidos
16 ejaculados por animal. As colheitas foram feitas por meio de vagina artificial aquecida com água a
0
40 C, em copo coletor graduado e com uma gaze estéril para filtragem do sêmen e descarte da
fração gel; tendo como manequim uma égua em estro. Após a coleta foi analisado visualmente o
volume, aspecto e cor, e sob a microscopia convencional, a motilidade total, a motilidade individual
progressiva e o vigor, segundo recomendação do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA
2013).
Em seguida, os ejaculados com motilidade mínima de 60% foram diluídos no meio de
centrifugação botu-sêmen® (Botupharma Biotecnologia Animal, Botucatu-SP, Brasil) na proporção de
1:1, sêmen:diluidor. As amostras foram centrifugadas (600 x g) por 10 minutos, o sobrenadante
desprezado e os “pellets” ressuspendidos com o meio de congelação botu-crio® (Botupharma,
Biotecnologia Animal, Botucatu-SP, Brasil). Em seguida, foram submetidas aos seguintes
tratamentos: Tratamento 1- botu-crio® (Controle); Tratamento 2 – botu-crio® + 0,5µM de BHT;
Tratamento 3 – botu-crio® + 1,0 µM de BHT; Tratamento 4 - botu-crio® + 2,0 µM de BHT.
O sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 mL, previamente identificadas, na concentração de
6
100 x 10 espermatozóides por palheta e congelada em rampa de congelamento (CBRA, 2013). Duas
semanas após a congelação, uma palheta de cada ejaculado foi descongelada em Banho-Maria a
37ºC por 30 segundos.
De cada amostra descongelada, foi retirada uma alíquota de 10µL destinada à realização do
teste hiposmótico (HOST) para avaliação da integridade funcional da membrana plasmática e análise,
de cinética em sistema computadorizado (CASA; Sperm Class Analyzer, Microptics, S.L version 3.2.0
Barcelona, Spain) das características seminais.
A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa estatístico SAS 2000 na versão
9.0, obedecendo a um delineamento em blocos ao acaso, utilizando-se o teste SNK para comparação
das médias a 5% de probabilidade de erro.
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Resultados e Discussão
O volume, motilidade espermática, vigor espermático e teste hiposmótico variaram entre os
animais, porém não houve diferença entre os mesmos (P>0,05) (Tabela 1)
Os valores para a motilidade e vigor do sêmen fresco observados no presente estudo
apresentam-se dentro dos padrões estabelecidos pelo CBRA (2013), motilidade ≥50% e vigor ≥ 3,
para sêmen fresco. Entretanto, o volume dos ejaculados estavam abaixo do preconizado pelo CBRA
(2013). O volume menor que o preconizado pode estar relacionado ao fato de os garanhões estarem
em atividade reprodutiva e em regime de treinamento para competições esportivas (COSTA et al..
2014) e devido as freqüências das coletas, resultando em menor tempo para estocagem na cauda do
epidídimo. (CASTILHO et al.. 2009).
Tabela 1. Médias e desvios-padrão das características do sêmen fresco de garanhões da Raça Quarto de Milha.
Garanhão
Volume (ml)
Motilidade (%)
Vigor (0-5)
Host (%)
1
23 ± 3,20
81,35 ± 6,29
3,75 ± 0,5
40,12 ± 3,17
2
25 ±2,44
77,5 ± 5
3,25 ±0,5
39 ±4,43
3
30 ± 2,21
75 ± 4,08
3±0
38,5 ±2,73
4
17 ± 3,36
61,25 ± 2,5
3±0
39 ± 2,94
Não houve diferença significativa (P>0,05)
Na análise pós-descongelamento, não houve diferença significativa (P>0,05) quanto ao
percentual de espermatozóides reativos ao teste hipósmótico entre as três concentrações testadas
(0.5 mM, 1 mM e 2 mM) e quando comparadas ao controle. Diferindo de resultados encontrados por
IJAZ et al (2009), que ao congelar sêmen de touros com diluidor suplementado com BHT nas
concentrações de 0.5 mM, 1.0 mM, 2.0 mM e 3 mM, verificou que os maiores percentuais de
membrana íntegra avaliados pelo teste hiposmótico, ocorreram na concentração de 2.0 mM e a
concentração de 3.0 mM apresentou os piores resultados.
Já MORILLO-RODRIGUEZ et al. (2011), estudando o efeito do BHT na concentração 1.0 mM
acrescido ao diluidor para sêmen eqüino, não encontrou diferença significativa nos percentuais de
membrana íntegra entre as populações de espermatozóides desta concentração em comparação ao
grupo controle (não suplementado), corroborando com os nossos dados.
Dois mecanismos de proteção podem explicar a ação do BHT como antioxidante no sêmen: o
mesmo pode incorporar-se à membrana plasmática do espermatozóide promovendo o aumento da
sua fluidez e,desta forma, protegendo-a ou impedindo a atividade danosa dos radicais peroxil dos
lipídeos convertendo-os em hidroperoxidos (MORRELI et al.. 2013)
Para a análise das patologias espermáticas, também não houve diferença estatística
significativa (P>0,05) entre os valores referentes aos defeitos maiores, menores e totais entre as três
concentrações estudadas e o controle. Os percentuais de morfologia espermática então dentro da
normalidade para a espécie. Segundo o CBRA (2013), o sêmen resfriado e congelado de eqüinos
deve apresentar um percentual máximo de 40% de patologias pós-descongelação.
A análise da cinética dos espermatozóides revelou que os parâmetros cinéticos MOT, VCL,
VSL, VAP, LIN, STR, WOB, ALH e BCF não diferiram estatisticamente (P>0,05) entre o grupo
controle e os grupos suplementados com BHT (Tabela 2). Entretanto, a análise cinética apresentou
valores absolutos superiores na maioria dos parâmetros das amostras acrescidas de antioxidantes na
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concentração de 0.5 mM, a exceção do WOB que apresentou maior valor na concentração de 1.0
mM. MORILLO-RODRIGUEZ et al. (2011) obtiveram melhoria nos parâmetros cinéticos VCL, VSL e
VAP em amostras de sêmen eqüino acrescidos de BHT a concentração de 1.0 mM, resultado que
não corrobora com nossos dados.
Tabela 3. Cinética de espermatozóide eqüino, diluído em Botu-crio suplementado com BHT em concentrações
distintas, submetidos à congelação.
Grupo
Parâmetros
MOT
VCL
VSL
VAP
LIN
STR
WOB
ALH
BCF
CONTROLE
58,18±20,03
41,12±6,74
22,21±2,04
25,83±3,71
53,73±3,45
77,50±2,54
66,48±5,94
2,37±0,2
9,85±1,03
BHT 0.5
53,50±18,23
38,72±2,73
18,51±1,77
26,43±4,59
49,79±6,31
75,06±4,94
63,63±5,13
2,38±0,3
10,15±2,45
BHT 1.0
58,63±10,95
34,87±4,16
16,23±3,03
23,50±5,20
45,92±8,46
71,24±7,45
65,98±6,32
2,35±0,4
9,61±1,97
BHT 2.0
54,72±16,60
37,79±4,85
16,92±4,11
24,40±5,68
55,41±8,71
70,02±6,36
62,96±3,30
2,35±0,3
9,59±2,2
Não houve diferença significativa (P>0,05)
Os resultados obtidos nesse experimento mostram, um efeito protetor da suplementação com
o antioxidante BHT em espermatozoides criopreservados, ao garantir que todos os parâmetros
avaliados pós-descongelamento asseguraram a vibilidade do sêmen. No entando, a interação entre
os componentes de diluição e o antioxidante é um fator a ser considerado, com o intuito de melhorar
a ação dos antioxidantes durante a criopreservação.
Conclusões
Não houve diferença quanto a ação do BHT adicionado nas concentrações de 0.5 mM, 1.0 mM e
2.0 mM, sobre preservação de sêmen eqüino criopreservado, muito embora este antioxidante tenha
evitado maiores danos à célula espermática.
Apoio: CNPq, Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal-LBR, UFPI
Referências
CASTILHO, E.F. Uso de extrato líquido de melancia (Citrullus lanatus) na criopreservação de
touros da raça nelore. 2012. 40f. Tese. Doutorado em Medicina Veterinária – Curso de PósGraduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal de Minas Gerais.
Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen
animal. 3° Ed. Belo Horizonte: CBRA, 2013.
COSTA, D.N.M. et al. Eficiência dos diluidores tris e botu-crio® sobre os parâmetros seminais de
garanhões das raças Quarto de Milha e Mangalarga Marchador. Ciência Animal Brasileira, v.15.
n.3. p.322-329. 2014.
IJAZ A, HUSSAIN A, ALEEM M, YOUSAF MS, REHMAN H. Butylated hydroxytoluene inclusion in
semen extender improves the post-thawed semen quality of Nili-Ravi buffalo (Bubalus bubalis).
Theriogenology, v.71, p. 1326-1329, 2009.
MORRELI, J.M. et al. Reactive oxygen species in stallion semen can be affected by season and
colloid centrifugation. Animal Reproduction Science. v.10. p.62-69. 2013.
MORILLO-RODRÍGUEZ A, MACÍAS-GARCÍA B, TAPIA JA, ORTEGA-FERRUSOLA C, PEÑA FJ.
Consequences of butylated hydroxytoluene in the freezing extender on post-thaw characteristics of
stallion spermatozoa in vitro. Andrologia 2012; 44: 688-695
Palavras – chave: eqüino. sêmen. criopreservação. antioxidante.