Amanda Corral

Transcrição

Amanda Corral

UNIVERSIDADE NILTON LINS – UNILTON LINS
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
USO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Piper aduncum NA RAÇÃO PARA
O CONTROLE DE NEMATÓIDES DE PIRARUCU (Arapaima gigas,
SCHINZ, 1822)
AMANDA CURIEL TRENTIN CORRAL
Manaus – Amazonas
Março, 2014
AMANDA CURIEL TRENTIN CORRAL
USO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Piper aduncum NA RAÇÃO PARA
O CONTROLE DE NEMATÓIDES DE PIRARUCU (Arapaima gigas,
SCHINZ, 1822)
ORIENTADORA: DRA. ELIZABETH GUSMÃO AFFONSO
Dissertação
apresentada
Uninversidade
Nilton
Lins
a
em
ampla associação com o Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia
como parte dos requisitos para
obtenção do Título de Mestre em
Aquicultura.
Manaus – Amazonas
Março, 2014
Corral, Amanda Curiel Trentin
Uso do óleo essencial de Piper aduncum na ração para o controle de
nematóides de pirarucu (Arapaima gigas, Schinz, 1822).
Dissertação (mestrado) – UniNilton Lins/INPA, Manaus, 2014.
Orientador: Gusmão Affonso, Elizabeth
Área de concentração: Aquicultura
1.
Arapaima gigas. 2. Sanidade. 3. Fitorerápico.
Sinopse:
Avaliou-se a eficácia do óleo essencial de Piper aduncum, administrado na ração, no controle de
nematódes de pirarucu (Arapaima gigas) e seus efeitos nas respostas fisiológicas dos peixes.
Palavras-chave:
Fitoterápico, nematoide, palatabilidade, perfil fisiológico, pirarucu.
Dedico esta conquista a minha família, que
sempre me apoiou e me deu forças para
lutar.
AGRADECIMENTOS
A FAPEAM pela bolsa de estudos concedida pelo POSGRAD N° 028/2012
durante o período de realização do mestrado.
A Universidade Nilton Lins e ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
pela oportunidade de cursar a Pós-graduação em Aquicultura, pela estrutura e pelos
professores.
A Dra. Elizabeth Gusmão Affonso pela orientação e pela oportunidade de
desenvolvimento deste trabalho.
A Embrapa Ocidental em nome do Dr. Célio pelo auxilio e orientação na coleta
e secagem, e pela disponibilização da estrutura e do material vegetal.
A Estação Experimental de Silvicultura Tropical, em nome do Dr. Antenor, por
disponibilizar a usina para a realização das extrações do óleo.
Ao laboratório de fitoquímica do INPA, em nome da Dra. Ana Cristina Pinto e
Karla Lagos, pela auxilio nas análises do óleo.
A Coordenação de Tecnologia e Inovação (COTI) e ao Laboratório de Fisiologia
Aplicada à Piscicultura (LAFAP) do INPA.
A Ione Castro, secretária do PPG-AQUI, pela dedicação e auxilio prestado.
Aos membros da banca da aula de qualificação Dra. Edisandra Chagas
(EMBRAPA-AM), Dr. José Celso (INPA), Dra Cleusa Suzana (UNINILTON LINS) e
plano de dissertação, Dr. Marcos Tavares (EMBRAPA-PA), Dr. Mauricio Laterça
(UFSC) e Dr. Gilberto Pavanelli (UEM) pelo auxilio e sugestões.
As minhas “co-orientadoras informais” Sanny Maria de Andrade Porto e Marieta
do Nascimento Queiroz pelas orientações.
Aos colegas César Oishi, Elenice Martins Brasil, Renata Silva, Jaqueline Inês
Alves de Andrade, Marieta do Nascimento Queiroz, Tamara Morais, Andressa Marinho,
Bento Monteiro Siqueira, Sanny Maria, Jeffson Nobre, Andreza Batista Lopes, Paula
Corrêa, Jandiara Kelly, Carlos Eduardo de Freitas e Francisco da Chagas Figueira de
Brito Filho pela colaboração durante as análises.
A Luciana Curiel Trentin Corral, Luiz Henrique Suarez Lopez e Gabriel
Henrique de Oliveira Suarez pela ajuda durante o experimento.
Aos colegas da turma PPG-AQUI 2012, pelo companheirismo, e pelos
momentos de alegria e descontração, Andreza Batista Lopes, Jeffson Nobre Pereira,
Tomás Igo Muñoz Sanches, Daniel Bernardes da Silva, Elen Carla dos Santos, Jean
Felipe de Abreu, Diogo Campos e Paulo César de Sena Costa.
A Maria Inês Pereira, Suzana Kawashima, Ana Socorro, Marcos Makiyama,
Dona Fatinha, Sr Joaquim, Atílio Storti-Filho, Sr. Fininho, Sr. Roberto, Gabriel,
Valdelira Lia Fernandes e Daniel pela prontidão em ajudar em todos os momentos.
A minha família que acreditou e confiou em mim, sempre me apoiando e
encorajando para que eu pudesse passar por mais esta etapa.
RESUMO
Este estudo avaliou a eficácia do óleo essencial de Piper aduncum no controle de
nematóides de juvenis de pirarucus. Para isso, foram realizados testes de palatabilidade
e de eficácia da planta administrada na ração comercial com 45% de proteína bruta. No
teste de palatabilidade foi avaliada a capacidade palatável das concentrações de óleo na
ração: 0, 32, 48, 64 e 80 ml/kg, durante 7 e 15 dias de alimentação, sendo estas
administradas pela manhã, e a ração sem medicamento à tarde. Foram utilizados 60
peixes (25,4±3,5 g), em uma densidade de estocagem de 4 peixes/cone, com fluxo
contínuo de água. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre os tratamentos com
32, 48 e 64 ml/kg e o controle (sem medicamento) em 7 e 15 dias. Entretanto, em 80
ml/kg, apresentou a menor taxa de ingestão da ração, 65% e 61% em 7 e 15 dias
respectivamente, e uma diferença significativa (p<0,05) em relação ao controle. A
mortalidade foi maior nos peixes do controle (16,7%), seguidas por 32 e 80 ml/kg com
8,3% e 25% em 7 e 15 dias respectivamente. Para a ração sem medicamento,
administrada à tarde, não houve diferença significativa (p>0,05) entre os peixes dos
tratamentos e o controle. Com estes resultados, foram definidas as concentrações do
óleo essencial de P. aduncum para o teste de eficácia (0, 32, 48, 56, 64 ml/kg), em 7 e
15 dias, sendo avaliados os parâmetros sanguíneos e os índices parasitários dos juvenis
de pirarucus, após os tratamentos. Foram utilizados 135 animais (52±3,2g), em uma
densidade de 9 peixes/tanque, em sistema de fluxo contínuo de água. Dos parâmetros
sanguíneos analisadas, somente os valores de hematócrito (Ht), volume cospuscular
médio (VCM) e hemoglobina corpuscular média (HCM) apresentaram diferenças
significativas (p<0,05) em 7 dias de tratamento, e, em 15 dias, os valores de proteínas
totais apresentaram diferenças significativas (p<0,05) entre os tratamentos e o controle.
Os índices parasitários mostraram prevalência de 100% de nematóides em todas as
concentrações e períodos testados. Em 7 e 15 dias, a intensidade média, a abundância
média e a intensidade de parasitos apresentaram diminuição de acordo com a
concentração do óleo, e, em 15 dias, estes índices foram significativamente menores
(p<0,05) entre os tratamentos e o controle, sendo 64 ml/kg a concentração de óleo que
apresentou maior redução da carga parasitária. Nos testes de eficácia, em 7 e 15 dias de
tratamento, não foram observadas mortalidades de peixes. Em 7 dias não houve
diferença significativa (p>0.05) entre os tratamentos (32, 48, 56, 64 ml/kg) e o controle,
sendo observada uma baixa eficácia da P. aduncum contra os nematóides. Entretanto,
em 15 dias, embora sem diferenças entre os tratamentos com óleo, estes foram
significativamente diferentes (p<0,05) em relação ao controle, no qual 64 ml/kg
promoveu 76,21% de eficácia. Assim, os resultados indicam que o óleo essencial de P.
aduncum apresenta potencial anti-helmíntico, de acordo com a concentração e o tempo
de exposição, contra nematóides de pirarucu, sem prejuízo à homeostase dos peixes.
ABSTRACT
This study evaluated the efficacy of Piper aduncum essential oil in control of nematodes
parasitising juvenile pirarucus. For this, palatability and efficacy tests were performed
with plant given on the commercial ration with 45 % crude protein. In the palatability
test was evaluated palatable capacity of the oil concentrations: 0, 32, 48, 64 and 80
ml/kg for 7 and 15 days of feeding, which was administered in the morning, and in the
afternoon feed without drug. 60 fish (25.4 ± 3.5 g) were used at a stocking density of 4
fish/cone, with a continuous flow of water. There was no significant difference (p >
0.05) between treatments with 32, 48 and 64 ml/kg and the control (no drug) at 7 and 15
days. However, at 80 ml/kg, had the lowest rate of feed intake, 65% and 61% at 7 and
15 days respectively, and a significant difference (p < 0.05) compared to control.
Mortality was higher in the control fish ( 16.7% ) , followed by 32 and 80 ml/kg with
8.3% and 25% at 7 and 15 days respectively. To diet without medication, administered
in the afternoon, there was no significant difference (p > 0.05) between treatments and
control. With these results, the concentrations of P. aduncum essential oil to efficacy
test were defined (0, 32, 48, 56, 64 ml/kg), 7 and 15 days, being evaluated blood
parameters and parasitic indices of juvenile pirarucus after treatments. 135 animals (52
± 3.2 g) were used at a density of 9 fish/tank for continuous water flow system. In blood
parameters analyzed, only the values of hematocrit ( Ht ) , mean cospuscular volume
(MCV ) and mean corpuscular hemoglobin (MCH ) showed significant differences (p <
0.05) after 7 days of treatment, and in 15 days, values of total proteins showed
significant differences ( p < 0.05 ) between treatments and control.The parasite indexes
showed 100 % prevalence of nematodes in all concentrations and times tested. In 7 and
15 days, the mean intensity, mean abundance and intensity of parasites showed
decreased according to the concentration of oil, and, in 15 days, these ratios were
significantly lower (p < 0.05) between control and treatment, 64 ml/kg averaged
concentration of oil, which exhibited a greater reduction in parasite load. In efficacy
trials, at 7 and 15 days of treatment were not observed fish mortalities. In 7 days, no
significant difference (p > 0.05), between treatments (32, 48, 56, 64 ml/kg) and the
control and low efficacy of P. aduncum against nematodes was observed. However, at
15 days, although no differences among treatments with oil, these were significantly
different (p < 0.05) compared to the control, where 64 ml/kg promoted 76.21%
efficiency. Thus, the results indicate that the P. aduncum essential oil has potential
anthelmintic, according to the concentration and exposure time, against pirarucu
nematodes, without prejudice to the homeostasis of the fish.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Folhas de Piper aduncum. (Queiroz, 2012) .....................................................8
Figura 2. Variação da taxa de ingestão da ração medicada (%) com diferentes
concentrações de óleo de Piper aduncum para Arapaima gigas, durante 15 dias de teste
de palatabilidade..............................................................................................................24
Figura 3: Taxa de mortalidade, em porcentagem, de Arapaima gigas tratados com
ração medicada em diferentes concentrações de óleo de Piper aduncum, durante os 7 e
15 dias de teste de palatabilidade....................................................................................25
Figura 4. Visão geral da superfície externa do intestino de pirarucu com grande número
de larvas de nematóides...................................................................................................30
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição química do óleo essencial de Piper aduncum..............................9
Tabela 2. Estudos sobre a Piper aduncum......................................................................10
Tabela 3. Variáveis físicas e químicas da água das unidades experimentais com
Arapaima gigas, antes dos experimentos (aclimatação) e após alimentação com e sem
ração medicada com: 0 (controle); 32; 48; 56 e 80 ml/kg do óleo essencial de Piper
aduncum, por 7 e 15 dias, no teste de palatabilidade. Condutividade Elétrica (CE); gás
carbônico (CO2); alcalinidade (AL); dureza (D) e amônia total (AT). Média ± desvio
padrão..............................................................................................................................21
Tabela 4: Variáveis físicas e químicas da água das unidades experimentais com
Arapaima gigas alimentados com e sem ração medicada contendo: 0 (controle); 32; 48;
56 e 64 ml/kg d óleo de P. aduncum por 7 e 15 dias no teste de eficácia. Condutividade
Elétrica (CE); gás carbônico (CO2); alcalinidade (mg/L CaCo3); dureza (mg/L CaCo3) e
amônia total (AT). Média ± desvio padrão......................................................................22
Tabela 5: Taxa de ingestão da ração nas unidades experimentais com Arapaima gigas
alimentado com ração medicada com diferentes concentrações de óleo essencial de
Piper aduncum (32; 48; 64 e 80 ml/kg) e o controle (sem medicamento), em 7 e 15 dias.
Porcentagem da ingestão de ração medicada, ofertada de manhã - 9:00 h (manhã) e sem
medicamento, ofertada de tarde – 16:00 h (tarde).
Média ± desvio
padrão..............................................................................................................................24
Tabela 6: Parâmetros sanguíneos de peixes nativos de cultivo expostos a diferentes produtos.
[Hb] = Concentração de hemoglobina (g/dl); Ht =hematócrito (%); VCM= Volume corpuscular
médio (fL); HCM= Hemoglobina corpuscular média (pg); CHCM =Concentração de
hemoglobina corpuscular média (g/dL); GL = Glicose plasmática (mg/dl); PT =Proteínas
plasmáticas totais (g/dL); COL = Colesterol plasmático total (mg/L); Eficácia (%).................27
Tabela 7. Parâmetros sanguíneos de Arapaima gigas, alimentados por 7 e 15 dias com
ração medicada contendo diferentes concentrações do óleo de Piper aduncum.
Hematócrito (Ht), Número de eritrócitos (RBC), Hemoglobina (Hb), Volume
corpuscular média (VCM), Hemoglobina corpuscular média (HCM), Concentração de
hemoglobina corpuscular (CHCM), glicose (Gl), proteína total (PT) e colesterol (Col).
Média ± desvio padrão, N=9...........................................................................................28
Tabela 8. Prevalência (P%), Intensidade média (IM) ± desvio padrão, Abundância
média (AM) ± desvio padrão e Intensidade (I) de parasitos em Arapaima gigas do grupo
controle e após 7 e 15 dias de tratamento com diferentes concentrações do óleo
essencial de P. aduncum..................................................................................................31
Tabela 9. Eficácia (%) do tratamento com óleo de P. aduncum administrado na nação e
o controle (sem o óleo) de nematóides de Arapaima gigas.............................................34
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................1
1.1. Sanidade na Aquicultura........................................................................................1
1.2. O pirarucu, Arapaima gigas...................................................................................2
1.3. Parasitismo por nematóides....................................................................................4
1.4. Uso da fitoterapia na aquicultura...........................................................................5
1.5. Piper aduncum, no controle de parasitos...............................................................8
1.6. Avaliação dos efeitos tóxicos de fármacos e seus indicadores.............................12
1.7. Administrando o fármaco.....................................................................................13
2. OBJETIVO...................................................................................................................14
2.1. Geral.....................................................................................................................14
2.2. Específicos............................................................................................................14
3. MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................15
3.1. Obtenção, condicionamento alimentar e aclimatação dos peixes........................15
3.2. Coleta e extração do óleo de P. aduncum.............................................................15
3.3. Preparo e adiminstração da ração medicada.........................................................16
3.4.Teste de palatabilidade...........................................................................................17
3.5. Teste de eficácia....................................................................................................17
3.6. Coleta de sangue e determinação dos parâmetros sanguíneos..............................18
3.7. Análises parasitológicas e de eficácia do tratamento............................................18
3.8. Monitoramento da qualidade da água...................................................................19
3.9. Análises estatísticas..............................................................................................19
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................19
4.1. Qualidade de água.................................................................................................19
4.2. Palatabilidade das rações medicadas....................................................................22
4.3. Efeitos do óleo P. aduncum na fisiologia de pirarucus.........................................25
4.4. Eficácia do óleo essencial de P. aduncum............................................................30
5. CONCLUSÃO..............................................................................................................36
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................37
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Sanidade na Aquicultura Brasileira
Nos últimos anos, a aquicultura brasileira vem se destacando no cenário
internacional, ocupando o 12º lugar na produção mundial (FAO, 2013). Apesar disso, o
Brasil ainda não está preparado para enfrentar os problemas sanitários que, cada vez
mais, são frequentes nas pisciculturas de todas as regiões do país. Com raras exceções,
não existem laboratórios certificados para realizar um diagnóstico rápido e
recomendações para o controle das enfermidades, principalmente nas regiões mais
distantes do país (Campos, 2011).
Há mais de 20 anos já eram descritas infestações por nematóides em criações de
Pseudoplatystoma carruscans (Spix &. Agassiz, 1829) e hiperparasitose por cestoides
em pimelodídeos de diferentes regiões do Brasil (Rego et al. 1989). Um surto
epizoótico que abalou criadores de camarão no sul e sudeste do Brasil, em 2004, e no
nordeste, em 2005, foi o Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV, white spot
syndrome virus), colocando em alerta o setor produtivo da carcinicultura nacional
(Buchelli, 2005; Filho, 2005; Gesteira, 2006). Esse vírus, que ataca o sistema imune,
dizimou as criações de camarões, gerando prejuízos econômicos, sociais e ambientais
(Seiffert e Costa, 2005; Costa, 2008). Após seis anos do aparecimento desta doença no
estado de Santa Catarina, verificou-se a diminuição do número de fazendas produtoras
de camarão, em consequência de falhas na aplicação de medidas sanitárias e, ainda hoje,
a doença da mancha branca continua impactando a carcinicultura nesse estado (Costa,
2012).
Infecções por Aeromonas hydrophila (Schubert, 1974) são comuns em fazendas
de peixes nativos, assim como infestações causadas pelo parasito Ichthyophthirius
multifiliis (Fouquet, 1876) em fazendas especializadas em recria e engorda de tambaqui
(Colossoma macropomum Cuvier, 1818). Em 2009, foi identificado, em cultivos de
Pseudoplatystoma fasciatum (Linnaeus, 1766) x Rhamdia sebae (Cuvier, 1829), o
primeiro surto causado pela bactéria Streptococcus agalactiae (Lehmann & Neumann
1896) (Figueiredo et al. 2010). Em exemplares de pirarucu, Arapaima gigas (Schinz,
1822), obtidos no estado do Mato Grosso, foram identificados Trichodina sp. e
monogenóides em raspados da pele (Araújo et al. 2006); nematóides na vesícula gasosa
e no estômago, e acantocéfalos no intestino (Santos et al. 2008).
Na região Norte, tem sido cada vez mais comum à presença de diferentes
espécies de parasitas em peixes de cultivo. Durante a necropsia de juvenis de pirarucu,
2
criados no município de Manacapuru, AM, foram identificados nematóides intestinais,
Camallanus tridentatus (Drasche, 1884) (Araujo et al. 2009). Alta infestação por
Acanthocephala Neoechinorhynchus buttnerae Golvan, 1956 causou a morte de 100%
dos tambaquis criados numa represa no município de Rio Preto da Eva, AM,
provavelmente em consequência da falta de avaliação prévia das condições sanitárias
dos peixes e da quarentena, além de problemas nas barragens (Malta et al. 2001). Em
juvenis de tambaqui, criados em sistema de tanques redes no lago Paru, em
Manacapuru, AM, foram identificadas quatro espécies de monogenóideos, do maior
para menor índice parasitológico, Anacanthorus spathulatus Kritsky, Thatcher &
Kayton, 1979, encontrada na pele e brânquias, Notozothecium janauachensis BelmontJégu, Domingues & Martins 2004, nas fossas nasais e brânquias; Mymarothecium
boegeri Cohen & Kohn 2005, em filamentos branquiais, e Linguadactyloides
brinkmanni Thatcher & Kritsky, 1983 nas brânquias dos peixes (Morais et al. 2009).
Problemas sanitários relacionados à criação de pirarucu, principalmente nos
primeiros estágios de vida, ocasionando grandes perdas de alevinos, têm sido também,
um dos grandes desafios da pesquisa que visa o desenvolvimento de novas tecnologias
para a criação desta espécie em cativeiro (Ono, 2011). Andrade et al. (2009)
encontraram 100% de prevalência de Dawestrema cycloancistrium Price & Nowlin,
1967 nos raspados de pele e brânquias. Araújo et al. (2009a) observaram a presença de
Dawestrema cycloancistrioides Kritsky, Boeger & Thatcher, 1985, D. cycloancistrium,
Trichodina sp., Ichthyobodo sp. (Protozoa), Camallanus tridentatus, Terranova serrata
(Drasche, 1884), Goezia spinulosa (Diesing, 1939) (Nematoda), sendo as três primeiras
com maior intensidade parasitária e 96% de prevalência.
Andrade-Porto et al. (2011) registraram pela primeira vez larvas do nematoda
Hysterothylacium sp. em juvenis de pirarucu de cultivo, esse parasita pertence a familia
Anisakidae e possui potencial zoonótico. Os nematodas apresentaram uma prevalencia
de 98% e encontravam-se fixados e livres no lúmen intestinal e cecos pilórios.
1.2. O piracucu, Arapaima gigas
O pirarucu (Osteoglossiforme, Arapaimidae), é uma espécie endêmica da região
amazônica, com distribuição, no Brasil, nas bacias Amazônica e Araguaia-Tocantins,
Equador, Peru, Bolívia, Venezuela, Colômbia e Guianas. É considerado o maior peixe
3
de escamas de água doce do mundo, podendo medir até 3 m de comprimento e pesar
200 kg (Santos et al. 2008).
Uma característica evolutiva interessante desta espécie é sua respiração aérea
obrigatória, por meio da bexiga natatória altamente vascularizada como órgão acessório.
Possui comportamento gregário e não realiza migrações reprodutivas, sendo uma
espécie considerada monogâmica, que constrói ninhos e protege a prole. (Bard e Imbira,
1986; Santos et al. 2008; Monteiro et al. 2010). Possui hábito carnívoro, porém, sua
preferência alimentar muda de acordo com seus estágios de desenvolvimento,
alimentando-se de crustáceos e moluscos na fase inicial e, a partir do primeiro ano de
vida, os peixes passam a fazer parte da sua dieta, sendo este o item mais importante da
sua alimentação (Oliveira et al. 2005).
Devido ao grande potencial para criação em cativeiro, tais como: rápido
crescimento, tolerância ao adensamento, carne branca de alta qualidade e sem espinhas
intramusculares, rendimento de filé superior a 45% e alto valor no mercado, o pirarucu
tem sido a espécie cujos investimentos têm se intensificado nos últimos anos. Exemplos
como o Projeto Estruturante do Pirarucu da Amazônia I e II (SEBRAE), o plano Safra,
entre vários outros financiados com recursos do Ministério da Pesca e Aquicultura,
Embrapa e FAPs.
Algumas barreiras ainda impedem a expansão na criação do pirarucu, que teve
uma produção de 1.137,1 t no ano de 2011 (MPA, 2013). Entre elas, a limitada oferta de
alevinos, que ainda são provenientes de desovas naturais, cuja falta de conhecimento
sobre o manejo da prole resulta na baixa sobrevivência (10 a 20%) (Ono, 2011).
Segundo Castillo (2012), outro desafio para aumentar produtividade dessa espécie está
relacionado à nutrição, pois ainda são poucas as informações sobre suas exigências
nutricionais, o que encarece a criação, já que a alimentação representa 50 a 80% dos
custos da produção.
O manejo alimentar do pirarucu, na fase inicial do seu desenvolvimento, é
fundamental para sua sobrevivência, além de ser responsável pelo alto índice da fauna
parasitária observada. Nessa fase, os peixes são alimentados com plânctons, hospedeiros
intermediários de alguns parasitos, que podem causar elevadas taxas de mortalidade dos
animais, causadas, principalmente, por monogenóideos, tricodinas, acantocéfalos, e
nematóides (Olmos, 2003; Gomes et al. 2007), sendo este último objeto do presente
estudo. Segundo Olmos (2003) e Gomes et al. (2007), o hábito alimentar é decisivo para
a composição da fauna parasitária, principalmente para os endoparasitos.
4
1.3. Parasitismo por nematóides
Os nematóides são metazoários, triploblásticos, pseudocelomados com sistema
digestivo com boca e ânus. São dióicos, e, em alguns, há nítido dimorfismo sexual; não
possuem sangue, sistema circulatório nem sistema respiratório (Hickman et al. 2004).
A fertilização dos nematóides é interna e, assim como os artrópodes, realizam
mudas periodicamente. Há quatro estágios larvais, antes da fase adulta, no caso de
nematóides de peixes a primeira fase larval pode ser temporariamente livre na água.
Microcrustáceos (geralmente um copépoda) são necessários como hospedeiro
intermediário, pois os copépodas ingerem o primeiro estágio larval, natante, que se
desenvolve para a terceira ou quarta etapa no crustáceo. Os peixes se infectam quando
ingerem estes copepodes contendo o terceiro ou quarto estágio larval. Algumas espécies
de nematóides, como o Terranova serrata parasito de pirarucu, requerem dois
hospedeiros intermediários para completar o ciclo. O primeiro deles é um
microcrustáceo e o segundo um pequeno peixe. Em tais casos, as larvas não
amadurecem no primeiro peixe, mas podem penetrar seus tecidos, onde eles esperam
para se desenvolver no peixe que predar seu hospedeiro (Thatcher, 2006). Peixe da
Amazônia, geralmente, têm numerosas larvas de nematóides encistadas em seus tecidos
(especialmente no mesentério) (Pananelli et al. 2013). Algumas delas representam
espécies de Contracaecum, Multicaecum, Terranova, Dujardinascaris e Eustrongylides
que também podem utilizar aves e crocodilianos como hospedeiro intermediário
(Thatcher, 2006).
As primeiras descrições de nematóides parasitando peixes de água doce no
Brasil datam de 1839 e incluíam G. spinulosa e Gnathostoma gracile (Diesing, 1838)
coletados em pirarucu. Na literatura são descritas as seguintes espécies de nematóides
de pirarucu: G. spinulosa (Diesing, 1939); Philometra senticosa (Baylis, 1927);
Terranova serrata (Drasche, 1884); Camallanus tridentatus (Drasche, 1884);
Gnathostoma
gracile
(Diesing,
1838);
Rumai
rumai
Travassos,
1960;
Capillostrongyloides arapaimae Santos, Moravec, Venturieri, 2008; Hysterothylacium
sp. Ward & Magath, 1917 (Santos, Moravec, Venturieri, 2008); Eutrongyides sp.
Jãgerskiold, 1909 (Luque et al. 2011).
A importância dos nematóides como patógenos de peixes tem aumentado com o
crescimento da piscicultura, podendo causar perdas econômicas significativas. Eles
podem afetar a fisiologia e o comportamento dos peixes, retardar o crescimento e a
5
maturação sexual e também tornar os animais mais susceptíveis a poluentes, já que
alteram seu sistema imunológico (Pavanelli et al. 2013).
Espécies como Camallanus sp. podem causar obstrução intestinal em animais de
pequeno porte e afetar sua taxa de crescimento, ocasionando reação inflamatória local e
anemia pela perda de sangue. Os nematóides com espinhos cuticulares invadem a
mucosa intestinal, e alguns colocam toda ou a maior parte do corpo dentro da parede do
intestino do hospedeiro, causando graves inflamações, como G. spinulosa, um
ascarioide (Thatcher, 2006).
Segundo Freitas e Lent (1946), a mortalidade de larvas e juvenis de Astronottus
ocellatus Agassiz, 1831 e A. gigas infectados por G. spinulosa, numa estação de
piscicultura no estado do Ceará, foi a responsável pelo fracasso da criação. Além disso,
as perdas econômicas também foram causadas pela presença de larvas de nematóides
que podem ser vistas a olho nu, tornando a produção não comercializável. Essa mesma
espécie foi observada parasitando pirarucus adultos que, embora não tenham sido
verificados sinais clínicos do parasitismo, apresentaram várias lesões ulcerativas no
estômago, com a presença de grande número de nematóides adultos (Pavanelli et al.
2013).
Vários produtos para o controle de parasitas de peixes em sistemas de cultivo
têm sido citados na literatura, tais como formalina, cloreto de sódio, verde malaquita,
eritromicina, flumequina, oxitetraciclina, florfenicol, cloranfenicol, ácido acético, iodo,
permanganato de potássio, sulfato de cobre, praziquantel, paration, levamisol,
febendazole, sulfato de cobre, entre outros (Parra et al. 1997; Affonso et al. 2002;
Tavares-Dias et al. 2002; Araújo et al. 2004; Andrade et al. 2005; Gieseker et al. 2006;
Sanches et al. 2007; Silva, 2007; Cruz et al. 2008; Pavanelli et al. 2008; Maciel, 2009;
Carraschi et al. 2011; Chagas et al. 2012). Entretanto, a maioria desses produtos pode
ser tóxico para o animal ou para o ser humano, bem como causar sérios riscos ao
ambiente. Assim, produtos a partir de plantas medicinais têm sido uma alternativa
prática, econômica e eficaz que, cada vez mais, vêm ganhando destaque na aquicultura
mundial.
1.4. Uso da fitoterapia na aquicultura
No final da década de 70, a Organização Mundial da Saúde (OMS) criou o
“Programa de Medicina Tradicional” para promover a saúde mundial, incentivando a
6
cultura popular e os conhecimentos sobre plantas medicinais. Em 2006, no Brasil, foi
criado o “Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápico”, promovendo o uso
sustentável da biodiversidade para o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria
nacional (MMA, 2006), já que a ocorrência de fármacos residuais no meio ambiente
pode apresentar efeitos adversos em organismos aquáticos e terrestres.
Diversos produtos fitoterápicos vêm sendo testados para o controle e prevenção
de doenças na aquicultura. Segundo a ANVISA (2014), são considerados medicamentos
fitoterápicos aqueles obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas
vegetais. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que inclui, na sua
composição, substâncias ativas isoladas, sintéticas ou naturais, nem as associações
dessas com extratos vegetais.
Sendo o Brasil detentor da maior floresta tropical do mundo, com a maior
biodiversidade de plantas do planeta, aproveitar esse potencial para produzir
fitoterápicos, capazes de controlar as doenças, tem sido estimulado nos diferentes
setores da produção animal. Vale et al. (2006) utilizaram o extrato bruto de Jatropha
gossypiifolia Linnaeus, 1753, na cicatrização de hemorragias gástricas em ratos.
Segundo Acergo (2005), para tratamento de doenças do gado leiteiro, vem sendo usada
Araucaria augustifolia Kuntze, 1898, no controle do carrapato e do berne; como
bactericidas na desinfecção da sala de ordenha Baccharis trimera e Casearia sylvestris;
como cicatrizantes e anti-inflamatórias Plantago major, Symphytunn officinale, Arctium
lappa, Leonorus Sibiricus e Calendula officinaIis. Henrique et al. (2010) testaram
Matricaria camomila na ração para codornas, e verificaram que, durante a fase de
postura, não houve diferença nos parâmetros de desempenho, comportamento e
fisiologia dos animais. A bananeira (Musa spp. Linnaeus, 1753) usada para caprinos,
bovinos, camundongos como anti-helmíntico (Escosteguy, 2000; Braga et al. 2001;
Amorim, 1987) e para cães como remédio para sarna (Lans e Browm, 1998).
Diversos estudos na literatura têm demonstrado a eficácia dos fitoterápicos no
controle das enfermidades em peixes. O extrato aquoso da amendoeira, Terminalia
catappa Linnaeus, 1753, na concentração de 200 ppm, reduziu a infecção por fungos
nos ovos de tilápias do nilo (Oreochromis niloticus Linnaeus, 1758) e, em 800 ppm,
eliminou Trichodina sp. em juvenis desta espécie, após dois dias de tratamento
(Chitmanat et al. 2005). O alho (Allium sativum Linnaeus,1756) é outra planta que vem
sendo utilizada no tratamento de peixes contra bactérias, fungos, protozoários e vírus,
além de ser de fácil obtenção. Essas propriedades do alho se devem a alicina, que
7
também
é
responsável
pelo
odor
característico
da
planta,
sendo
usada,
preferencialmente, crua, pois altas temperaturas desnaturam esta substância (Tavechio
et al. 2009).
O aumento da resistência à infecção bacteriana por Pseudomonas fluorenscens
(Migula, 1895), em 91,3%, foi verificado quando adicionado 3% de alho/kg de ração,
durante três meses em tilápias do nilo (Diab et al. 2008). Martins et al. (2002)
verificaram a redução de 95% da infecção por monogenóides (Anacanthorus
penilabiatus Boeger, Husak & Martins, 1995) em pacu (Piaractus mesopotamicus
Holmberg, 1887), usando 2,0 g/kg de alho na ração, por 45 dias.
O efeito do extrato metanólico de sementes de Piper guineense Schumach,1827,
sobre parasitas monogenóides de Carassius auratus Linnaeus, 1758, foi testado por
Ekanem et al. (2004). Cruz, (2005), utilizando extrato aquoso de nim (Azadirachta
indica), obteve o controle de 89% de Anacanthorus penilabiatus em pacu. Segundo
Tavechio et al. (2009), outras plantas que vêm sendo utilizadas, experimentalmente,
como fitoterápicas na piscicultura são: goiaba (Psidium guajava Linnaeus, 1758), viscobranco (Viscum álbum) e urtiga (Urtica dioica Linnaeus, 1758). Liu et al. (2010)
descreveram o uso do extrato de sementes da Semen pharbitidis contra Dactylogyrus
intermedius Weger, 1910, em C. auratus e Wu et al. (2010) testaram o potencial antihelmíntico de Radix Bupleuri chinensis contra Dactylogyrus intermedius em C. auratus.
O goji (Lycium sp.) é utilizado como imunoestimulante e confere resistência à
Edwardsiella tarda Ewing, 1965 em tilápias do nilo. O ginseng (Eleutherococcus
senticosus) também aumenta a resistência à E. tarda e Vibrio anguillarum Pacini, 1854
em linguados. O alecrim (Rosmarinus officinalis), no tratamento de tilápias, serve como
imunoestimulante e bacteriostático. O capim bermuda (Cynodon dactylon Linnaeus,
1753) tem atividade viricida usado no tratamento do vírus da mancha branca, em
camarões (Penaeus monodon Fabricius, 1798) (Figueiredo et al. 2011).
Considerando o potencial das espécies medicinais brasileiras, os estudos
fitoterápicos ainda são incipientes e, portanto, são um campo vasto para pesquisas sobre
o uso destes no controle de doenças nas pisciculturas de todo o país. Com este objetivo,
grupos de pesquisas do INPA e da Universidade Nilton Lins vêm desenvolvendo
estudos relacionados à fitoterapia em peixes. Dentre eles, o uso de cipó-alho
(Adenocalymna alliacea) na ração e o extrato aquoso de mastruz (Chenopodium
Ambrosioides Linnaeus, 1753) para o controle de monogenóides de tambaqui (Viana,
8
2012; Monteiro, 2012), o extrato de Piper aduncum no controle de monogenóides de
pirarucu (Queiroz, 2012) e de A. hydrophila em tambaqui (Brasil, 2013)
1.5. Piper aduncum no controle de parasitos
Piper aduncum, que pertence à família Piperaceae, é originária do Peru, com
ampla distribuição nos trópicos americanos, se estendendo por toda América do Sul, sul
do México, Caribe e Polinésia. É popularmente conhecida como pimenta-de-macaco,
matico, erva de soldado, pimenta-longa, pimenta-de-fruto-ganchoso, aperta-ruão, tapaburaco, e jaguarandi (Yuhncker, 1975; Maia et al. 2001).
Esta piperácea é um arbusto, considerada “erva daninha” por ocupar,
rapidamente, áreas desflorestadas, medindo entre 1 e 8 metros (Figura 1). Possui caule
delgado e ereto, de coloração amarelada com protuberâncias e nós no caule, de onde
saem os galhos. As folhas são pecioladas, simples e alternadas, medindo de 12 a 22 cm,
apresentando uma textura áspera com nervuras. A inflorescência é uma espiga floral que
nasce de forma oposta às folhas e medem de 6 a 16 cm de comprimento (Ribeiro e
Bendo, 1999).
Figura 1. Folhas de Piper aduncum. (Queiroz, 2012)
Diversos trabalhos já foram realizados para avaliar o rendimento do óleo essencial
da P. aduncum que, de acordo com os resultados obtidos, podem variar de 0,25 a 4%
(Maia et al. 2000; Martínez et al. 2003; Rali et al. 2007; Gaia et al. 2010; Brazão, 2012;
9
Potzernheim et al. 2012; Silva et al. 2013). Estas variações nas extrações de óleo da P.
aduncum indicam que este depende do local de coleta, da idade da planta e do período
de colheita (Pimentel et al. 1998; Silva e Oliveira 2000; Bergo et al. 2005).
Vários metabólitos secundários já foram identificados na sua composição (Tabela
1), porém, o óleo essencial fenilpropanóide dilapiol é o composto majoritário da planta,
podendo variar de 58 a 88,4%, (Smith e Kassim, 1979; Gottied et al. 1981; Fazolin et
al. 2005). As concentrações dos metabólitos secundários das plantas sofrem variações
qualitativas e quantitativas decorrentes de fatores bióticos e abióticos, tais como,
temperatura, sazonalidade, ciclo circadiano, disponibilidade de água, qualidade do solo,
poluição atmosférica, lesões, ataques por insetos, entre outros (Gobbo-Neto e Lopes,
2007). Em geral, boa parte das propriedades farmacêuticas descritas para plantas
medicinais são creditadas aos óleos essenciais, os quais podem ser extraídos de
diferentes formas, tais como hidrodestilação, destilação a vapor, CO2 supercrítico, ou
com a utilização de solventes orgânicos ou gorduras. Além da sua importância como
medicamento, os óleos essenciais são amplamente difundidos na fabricação de
cosméticos e perfumes.
Tabela 1. Composição química do óleo essencial de Piper aduncum.
COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Dilapiol, monoterpenos e sesquiterpenos
Dilapiol, ácido p-hidroxibenzóico prenilado,
miristicina e sesquiterpenos
Dihochalconas
Monoterpenos, sesquiterpenos, cromenos, ácido
benzoico, flavonoides e diidrochaclona
Ácido 2.2 – dimetil-2H-leromeno-6-carboxílico e 3(3’.7’-dimetil-2’.6’-octadienil)-4-metoxibenzóico
2’.6’- Dihidroxi-4’-metoxichalcona
Dilapiol
Derivado de ácido benzoico
Dilapiol e o derivado do ácido benzoico prenilado
metil 4-hidroxi-3-(3’-metil-2’-butenil) benzoato
Dilapiol, safrol e sarisan
REFERÊNCIA
Gottlieb et al. 1981
Orjala et al. 1993a
Orjala et al. 1993a
Burke e Nair, 1986; Orjala et
al. 1993a;
Baldoqui et al. 1999
Torres-Santos et al.1999a
Maia et al. 2001; Pino et al.
2004
Lago et al.2004
Oliveira et al. 2005
Estrela et al.2006
Na literatura são descritos inúmeros estudos sobre a ação dos diferentes
compostos de P. aduncum realizados no Brasil e em outros lugares do mundo (Tabela
2). O óleo essencial tem grande eficácia no controle de pragas e microrganismo, sendo
10
importante para a agricultura, devido suas características inseticidas, fungicidas,
bactericida, acaricida, moluscicida e parasiticida (Fazolin 2005; Estrela 2006; Rapado
2007; Silva 2008). Em humanos, esse óleo tem sido utilizado no tratamento de úlceras
crônicas, diurético, antiblenorrágico, carminativo, excitante digestivo, males do fígado,
combate a erisipela, controle da atividade antibacteriana de Streptococcus mutans e
Streptococcus sanguis causadoras de cáries dentárias e de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzy (Lorenzi e Matos 2002; Passerini 2008; Souza et al. 2008;
Magalhães 2010).
Na medicina veterinária, Silva (2008) verificou que o extrato hexânico de folhas
de P. aduncum induziu mais de 50% de mortalidade de larvas de Rhipicephalus
microplius em 10, 15 e 20 mg/ml do extrato por 24 h, com 75% de eficácia na maior
concentração. Segundo Queiroz (2012), 80 ml/L do extrato aquoso de P. aduncum foi
80% eficaz no tratamento de monogenóideos de A. gigas, durante banhos longos (24 h),
sem comprometer sua homeostase fisiológica. Brasil (2013) verificou que o extrato
hidroalcoólico dessa planta, a partir de 5 µg/mL, é bacteriostático para A. hydrophila, e
as concentrações abaixo de 80 µg/mL apresentam baixa toxicidade e não
comprometeram o equilíbrio homeostático do tambaqui.
Tabela 2. Estudos sobre a Piper aduncum.
ÁREA DE
ESTUDO
Adstringente,
Hemostática e
Antimicrobiana
Antimicrobiana,
moluscicida
Antimicrobiana,
citotóxica e
fitoquímico
Antimicrobiana e
citotóxica
Antimicrobiana,
citotóxica e
fitoquímico
Antimicrobiana e
citotóxica
Inseticida
COMPOSTO
Óleo essencial
LOCAL
ND
REFERÊNCIA
Costa, 1935
Preniladas derivadas de ácido Papua Nova Guiné
benzoico
Aduncamida
Papua Nova Guiné
Orjala et al.
1993a
Orjala et al.
1993b
Cromonas preniladas
Papua Nova Guiné
Extrato de éter de petróleo
Papua Nova Guiné
Orjala et al.
1993c
Orjala et al.
1993d
Dihydrochalcones
Papua Nova Guiné
Orjala et al. 1994
Extrato etanólico e dilapiol
Costa Rica
Antimicrobiana
Extrato alcoólico
Guatemala
Antimicrobiana
Extrato
Honduras
Bernard et al.
1995
Caceres et al.
1995
Lentz et al. 1998
11
2',6'-dihydroxy-4'Methoxychalcone
2',6'-dihydroxy-4'Methoxychalcone
Extrato metanólico
RJ – Brasil
Óleo essencial
Indonésia
Óleo essencial
Flavonóides
Cuba
SP – Brasil
Extrato metanólico
Malasia
Fitoquímico
Antimicrobiano,
análise circadiana
Fitoquímico
Óleo essencial
Cromonas preniladas
Panamá e Bolívia
SP – Brasil
Óleo essencial
MG – Brasil
Antimicrobiana
Extrato etanólico
Perú
Antimicrobiana
Antimicrobiana
Inseticida
Extrato metanólico
Óleo essencial
Óleo essencial
MG – Brasil
SP – Brasil
AC – Brasil
Moluscicida
Alelopatia
Extrato
Extrato aquoso
AM – Brasil
DF – Brasil
Antiprotozoária
Óleo essencial
Cuba
Inseticida
Acaricida
Óleo essencial
Extratos hexânico, etanólico,
etil acetato e óleo essencial
Extrato etanólico
Malásia
AM – Brasil
Ácido benzoico
Extrato hexânico
Óleo essencial
Óleo essencial
Bolívia
SP – Brasil
CE – Brasil
RS – Brasil
Extrato aquoso
Extrato hidroalcoólico
Óleo essencial
Planta
AM – Brasil
AM- Brasil
ND
Cuba
Extrato hidroalcoólico
Hidrolato
Extrato etanólico
Peru
AM – Brasil
Perú
Antiprotozoária
Antiprotozoária
Antiviral e
Citotóxica
Antimicrobiana e
fitoquímico
Fitoquímico
Antimicrobiana e
fitoquímico
Inseticida
Antiprotozoária:
Antimalarial
Antiparasitária
Antimicrobiana
Inseticida
Acaricida e
fitoquímico
Antiparasitário
Antimicrobiano
Inseticida
Farmacobotânica
Farmacologia
Antiparasitário
Farmacologia
RJ – Brasil
Indonésia
Perú
Torres-Santos et
al. 1999a
Torres-Santos et
al. 1999b
Devehat et al.
2002
Jamal e Praptiwi,
2003
Pino et al. 2004
Lago et al. 2004
Hidayatulfathi et
al.2004
Vila et al. 2005
Morandim et al.
2005
Mesquita et al.
2005
Kloucek et
al.2005
Braga et al. 2007
Duarte et al. 2007
Fazolin et al.
2007
Rapado, 2007
Lustosa et al.
2007
Sariego et
al.2008
Misni et al. 2009
Silva et al.2009
Valadeau et
al.2009
Flores et al, 2009
Lago et al.2009
Costa et al.2010
Ferraz et al.2010
Queiroz, 2012
Brasil, 2013
Araujo et al.2012
Orlando et
al.2012
Zaa et al.2012
Corral, 2013
Arroyo et al.2013
ND – não descrito
Em geral, o uso de medicamentos fitoterápicos no controle de doenças exige
precaução, pois, devido à presença de vários compostos na planta, o efeito de mais de
um princípio ativo, agindo sinergicamente, potencializa suas ações terapêuticas ou
12
reações adversas. Portanto, os fitoterápicos devem ser avaliados, não somente sob o
ponto de vista de sua eficácia no tratamento de uma doença, mas sob os seus efeitos
adversos que podem causar sérios danos no organismo ou até a sua morte. No trabalho
de Queiroz (2012), a morte por asfixia, de exemplares de pirarucu, foi observada na
maior concentração do extrato de P. aduncum (100 ml/L), o que foi justificada pela
presença de alcalóides, cujo efeito anestésico, provavelmente, impediu os peixes de
subirem à superfície para respirar.
1.6. Avaliação dos efeitos tóxicos de fármacos e seus indicadores
A avaliação da toxicidade de um fármaco em organismos não-alvo, como o
peixe, é tão importante quanto a sua eficácia no controle de patógenos, o qual pode ser
estimada e monitorada por testes conduzidos em laboratório (USEPA 2002; Grisolia
2005). Em geral, durante esses testes, são avaliadas a sobrevivência ou a mortalidade
dos organismos, além das alterações comportamentais, hematológicas, histológicas,
parasitológicas ou genotóxicas (Chagas et al. 2006, Pavanelli et al. 2008; Affonso et al.
2009; Andrade et al. 2009; Maciel, 2009; Silva et al. 2009; Schalch, et al. 2009; França
et al. 2011; Tavares-Dias et al. 2011; Queiroz, 2012; Brasil, 2013).
Os parâmetros sanguíneos têm fornecido uma importante contribuição para
avaliar o bem-estar do animal durante os bioensaios laboratoriais (Schreck, 2000;
Urbinati e Carneiro, 2004; Maciel, 2009; Figueiredo, 2011; Santos et al. 2011, Queiroz,
2012; Viana, 2012). Esses parâmetros podem indicar efeitos adversos na homeostase
fisiológica do animal como uma resposta ao estresse, contribuindo para uma melhor
interpretação dos resultados.
Em situação de estresse, o organismo pode apresentar três respostas: primária
(sistema endócrino), secundária (alteração tecidual) e terciária (efeitos duradouros)
(Wedmayer, 1996). Nas respostas primárias ocorre a liberação de hormônios de
estresse, catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e cortisol na corrente sanguínea.
Estes vão desencadear as respostas secundárias, onde ocorrem mudanças fisiológicas,
bioquímicas e estruturais. Sob estresse crônico, as respostas terciárias comprometem o
crescimento, as taxas de fecundidade, o comportamento e a resistência imunológica,
podendo causar até a morte do animal (Wedemeyer, 1996; Barton, 2002).
O estresse por infecções parasitárias, como a doença renal causada pela bactéria
Renibacterium salmoninarum, aumentou os níveis de cortisol plasmático e de lactato e
reduziu os níveis de glicose plasmática no salmão (Schreck, 2000). Araújo et al.
13
(2009a) verificaram que o parasitismo causou aumento nas concentrações de glicose,
hemoglobina, concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), número de
leucócitos e linfócitos, e redução nos níveis plasmáticos de proteínas totais e cloreto.
Sitja-Bobadilla e Pellitero-Alvarez (2009), testando métodos de transmissão de
Sparicotyle chrysophrii Van Beneden et Hesse, 1863 em Sparus aurata Linnaeus, 1758,
observaram variações nos níveis de anemia, de acordo com o grau da infestação. Maciel
(2009) observou um aumento significativo nas concentrações de glicose de tambaquis
expostos a diferentes concentrações de praziquantel.
Estudos relacionados à toxicidade do peróxido de hidrogênio (H2O2), aplicado
na forma de banhos, demonstraram aumento significativo na concentração de glicose
plasmática de tambaqui, em todas as concentrações do fármaco, em relação aos valores
basais (antes do experimento), retornando a estes após 24 h de recuperação (Affonso et
al. 2009). O teste de toxicidade aguda do extrato de P. aduncum, na forma de banho por
24 h, para pirarucus infectados com monogenóideos, não demonstrou alteração nos
valores dos parâmetros sanguíneos, comparados ao grupo controle, indicando que as
concentrações testadas foram de baixa toxicidade (Queiroz, 2012).
1.7. Administração do fármaco
O método mais comum para administrar um fármaco em peixes é na forma de
banho. Este tem a vantagem da simplicidade e indicado para medicamentos que devem
possuir características hidrossolúveis, nos quais não é possível a utilização de óleos
essenciais. Sua aplicação é recomendada quando o número de animais a ser tratado é
pequeno e a captura é simples (ex. aquariofilia, quarentena). Entretanto, nos viveiros
onde os peixes são criados, esta forma de aplicação não é possível, pois gera muito
efluente que pode causar impacto ambiental, grande desperdício do fármaco, o que
eleva o custo da aplicação, entre outros (Treves-Brown, 2000).
Uma alternativa para administrar os fármacos em peixes é o tratamento oral, que
pode ser utilizado pela adição das bases farmacológicas à ração. A via oral causa menos
desperdício que os banhos, e, por isso, é sempre adotada nas pisciculturas A
desvantagem desse método refere-se às doenças que causam inapetência ou anorexia
nos peixes, levando a menor ingestão ou mesmo a não ingestão da ração medicada.
Além disso, a ingestão do alimento pode ser prejudicada, caso o fármaco altere o
sabor da ração, sendo esta evitada pelo animal. Assim, para assegurar a eficácia de um
novo fármaco testado, é importante avaliar sua aceitação pelo animal. Isso é possível
14
por meio de testes de palatabilidade, no qual são avaliados a concentração e o período
de aceitação dos animais ao fármaco (Lima,.2004; Shalaby et al.2006; Yamamoto et al.
2011; Ishimaru et al. 2013)
Diversos fármacos vêm sendo incorporados à ração para o tratamento de
doenças em peixes. Martins et al. (2002), utilizaram 2 g/kg de Allium sativum, por 45
dias em P. mesopotamicus, e obtiveram 95% de eficácia. John et al. (2007), misturando
alho e cominho preto a 3% na ração de tilápias, por 90 dias, observaram aumento na
resistência dos peixes à infecção bacteriana por Pseudomonas spp. Diab et al. (2008),
usando 3% de alho na ração, por 3 meses, observaram o aumento da resistência da
tilápia à bactéria Pseudomonas fluorenscens em 91,3%. Willians (2009), testando antiparasitários para Seriola lalandi Valenciennes, 1833, obteve 82,9% de eficácia com
0,05 g/kg de febendazol, por 6 dias, e 70,8% com 0,075 g/kg, em 3 dias e, com 0,1 g/kg,
alcançou 92,3% de eficácia. Este mesmo autor, testando oxfendazol, obteve eficácia de
87,4% com 0,05 g/kg, em 6 dias, e 78,9% com 0,075 g/kg, e a eficácia de 77,2% com
concentrações de 0,1 g/kg e 0,15 g/kg, em 3 dias. Boijink et al. (2011), testando 45 g/kg
de Adenocalymna aliacea para tratamento em tambaquis, por 45 dias, observaram
eficácia de 63%. Viana (2012), testando cipó-alho no tratamento de tambaquis, obteve
eficácia de 78,2% em 50 g/kg, por 30 dias.
Desenvolver novas tecnologias, que possam evitar problemas sanitários nos
peixes cultivados, ou prevenir a presença de patógenos, tem sido um dos objetivos das
pesquisas nesta área. Assim, com este trabalho, pretende-se contribuir com os estudos
sobre a saúde dos peixes de cultivo, fortalecendo os conhecimentos sobre o uso de
fitoterápicos, como o óleo essencial de P. aduncum, na aquicultura, particularmente
para espécies nativas como o pirarucu.
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar o efeito do óleo essencial de Piper aduncum na ração para o tratamento de
endoparasitos nematóides de pirarucu, Arapaima gigas.
2.2. Específicos
1. Avaliar a palatabilidade das rações com óleo essencial;
2. Determinar o efeito das diferentes concentrações do óleo nas respostas
fisiológicas dos pirarucus infectados com nematoides: e
15
3. Avaliar a eficácia do tratamento, via oral, para o controle dos nematóides.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Obtenção, condicionamento alimentar e aclimata ção dos peixes.
Os juvenis de pirarucu (5,8±0,7g) foram obtidos de uma piscicultura local e
transportados para a Estação Experimental de Piscicultura da Coordenação de
Tecnologia e Inovação (COTI) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA)
em Manaus, AM, onde foram mantidos em tanques de 2000 L, com renovação
constante de água de poço artesiano. Foi realizada uma avaliação nos exemplares de
pirarucu adquiridos para detectar a presença de nematoides.
O condicionamento alimentar dos alevinos foi realizado durante 15 dias. Nos
sete primeiros dias, foram alimentados com 2000 ml de plâncton, misturados com ração
comercial com 45% de proteína bruta (PB), em pó, em intervalos de duas horas. Após
isso, o plâncton foi substituído por 200 ml de água e acrescentado mais ração na
alimentação. Após 15 dias, os peixes passaram a se alimentar apenas com a ração em pó
e, gradativamente, o tamanho dos grânulos foi aumentado, até a ingestão da ração com 4
mm.
Durante o período de aclimatação, os peixes foram alimentados ad libitum, duas
vezes ao dia, com ração extrusada comercial para peixes carnívoros (45% PB) de 4 mm,
até atingirem 25,4 ± 3,5 g e 14,2 ± 0,7 cm. Como prevenção contra fungos e bactérias, a
cada dois dias, eram aplicados 8 g/L de sal agropecuário na água dos tanques. Vinte e
quatro horas antes do início dos experimentos, os peixes passaram por privação
alimentar para o esvaziamento gastrointestinal e os banhos terapêuticos foram
interrompidos.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Uso Animal
(CEUA) do INPA, protocolo 023/2013.
3.2. Coleta e extração do óleo essencial de P. aduncum
As folhas de P. aduncum foram coletadas na Embrapa Ocidental, Rodovia AM
010 Km 29, onde permaneceram por sete dias sobre uma lona para secagem e, em
seguida, transportadas ao INPA. Para a retirada da umidade, estas permaneceram em
estufas de circulação contínua de ar, a 45°C, por 48 h, e, quando secas, foram
16
armazenadas em sacos de ráfia e mantidas em sala climatizada (20°C) até a extração do
óleo essencial.
Para a extração do óleo essencial, foi utilizado o método padrão de arraste por
vapor d’água. Para isso, as folhas foram trituradas em um triturador (modelo DPM-4
marca Nogueira) na Estação Experimental de Silvicultura Tropical (EEST) do INPA,
localizada na BR 174 Km 43. A hidrodestilação do material foi realizada em usina de
escala semi-industrial com capacidade para 20 kg, abastecida por um gerador de vapor
modelo MGV 70 (70 kg/h) da Maritec, a uma pressão de 4 kgf/cm², e o vapor de água
injetado numa pressão de 0,5 kgf/cm². Nesse sistema, o óleo das folhas foi arrastado e o
vapor passou por um condensador. O hidrolato (material com a maior parte da água) foi
desviado para um recipiente coletor e o óleo foi armazenado no separador. A cada 60
minutos, retirou-se o óleo do condensador para verificar a eficiência da extração. Foram
realizadas três usinagens, com duração de cinco horas cada, sendo extraídos, de cada 8,0
kg de matéria seca, cerca de 250 ml de óleo, resultando em um alto rendimento de
extração do óleo de 3,12%.
O óleo coletado foi filtrado em algodão hidrófilo e armazenado sob-refrigeração.
A retirada total da água foi feita com sulfato de sódio anidro (2 g/50 ml de óleo),
utilizando funil de separação e posterior filtragem com papel filtro para separar o sal do
óleo essencial. Foram calculados a umidade do material e o rendimento de óleo de
acordo com o peso total de matéria seca/total de óleo coletado.
Para garantir a qualidade das três extrações isoladas, foi feito um teste de
cromatografia de camada delgada para verificar a composição dos óleos obtidos, de
acordo com Collins e Braga (1997). Após isso, as amostras de óleo foram armazenadas
em uma garrafa de vidro âmbar sob-refrigeração.
3.3. Preparo e administração da ração medicada
Cada concentração de óleo testada (32, 48, 64 e 80 ml/kg) foi calculada a partir
da biomassa total dos peixes. O óleo essencial foi diluído em álcool de cereais 1:7,5
(óleo:álcool) e pulverizado, uniformemente, sobre os pellets de ração comercial
extrusada para peixes carnívoros (45% PB), utilizando frascos pulverizadores de
gatilho. Seguindo a metodologia sugerida por Williams (2009), as rações foram
preparadas no dia anterior e secas no período da noite. Para a ração controle, realizou-se
o mesmo procedimento, mas sem adição do óleo essencial.
17
As rações medicadas (com diferentes concentrações de óleo essencial) e o
controle (sem o óleo essencial) foram administrados por 7 e 15 dias. Os peixes
receberam a ração medicada uma vez ao dia, pela manhã (9:00 h), sendo ofertada a
ração sem medicamento no período da tarde (16:00 h). A quantidade de ração ofertada,
em cada unidade experimental, foi definida com relação à biomassa presente,
determinada com base nos valores da biometria inicial.
Dos 5% de seu peso vivo (PV), consumidos diariamente de ração pelo pirarucu,
foram preparados 2% do PV em ração medicada. Este preparo, em menor quantidade de
ração medicada, garantiu que todos os peixes, durante o arraçoamento matinal,
pudessem consumir essa ração.
3.4. Teste de palatabilidade
Para o teste de palatabilidade, foram utilizados 60 peixes (25,4±3,5 g),
distribuídos em cones de 60 L, na densidade de estocagem de 4 peixes/cone, com fluxo
de água contínuo, segundo Viana (2012), durante 7 e 15 dias. O delineamento
experimental foi constituído por quatro concentrações do óleo essencial: 32, 48, 64 e 80
ml/kg de ração, seguindo a metodologia de Queiroz (2012) e o controle (sem o óleo),
em triplicatas.
Durante a alimentação, foi observada a palatabilidade por meio da
aceitação/ingestão da ração em todas as concentrações e registrada a quantidade de
ração ofertada por unidade experimental. A taxa de ingestão (porcentagem de ração
ingerida) foi calculada segundo Barros et al. (1998): Taxa de ingestão (%) = ração
ingerida x 100 / ração administrada.
3.5. Teste de eficácia
Foram utilizados 135 juvenis de pirarucu, pesando 52±3,2g, os quais foram
distribuídos em tanques de polietileno (unidades experimentais) de 310 L cada, em uma
densidade de 9 peixes/unidade experimental, em um sistema de fluxo contínuo de água
(taxa de renovação de 175 ml/min). O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, constituído por quatro tratamentos com ração medicada com óleo essencial,
a partir dos resultados de palatabilidade: 32, 48, 56 e 64 ml/kg de ração e o controle
(sem óleo essencial), em triplicatas. Os peixes foram alimentados com as rações
medicadas, exceto o grupo controle, por um período de 7 e 15 dias.
18
Ao final de cada período, três peixes de cada unidade experimental, foram
amostrados para determinação dos parâmetros sanguíneos (item 3.7), e posterior análise
parasitológica (item 3.7)
Durante todo o período experimental, foram realizados os procedimentos de
manejo de rotina, como: limpeza dos tanques e monitoramento da qualidade da água
(item 3.8).
3.6. Coleta de sangue e determinação dos parâmetros sanguíneos
O sangue foi coletado por punção da veia caudal, utilizando seringas de 3 ml
rinsadas com EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) 10%, e as amostras armazenadas
em tubos de eppendorf de 2 ml, sob refrigeração a 4°C.
A partir do sangue total, foram analisados: hematócrito (Ht%), pelo método de
microhematócrito; contagem de eritrócitos (RBC-eritrócitos/µL), utilizando a câmara de
Neubauer® em solução de Natt e Herrick (1952), concentração de hemoglobina ([Hb]g/dl) pelo método da cianometahemoglobina. Os índices hematimétricos: volume
corpuscular médio (VCM fL), concentração de hemoglobina corpuscular média
(CHCM%) e hemoglobina corpuscular média (HCM pg) foram calculados a partir dos
valores de Ht, RBC e [Hb], segundo Wintrobe, (1934).
Posteriormente, as amostras de sangue foram centrifugadas para separar o
plasma, que foi utilizado para as análises de glicose (mg/dL) pelo método enzimáticocolorimétrico da glicose oxidase, colesterol, pelo método colorimétrico e proteínas
totais (PPT – g/dL), pelo método de biureto. Essas análises foram realizadas em
espectrofotômetro UV/Visível (BIOPLUS 2000).
3.7. Análises parasitológicas e de eficácia do tratamento
As análises parasitológicas foram realizadas antes e após os tratamentos. Em
cada unidade experimental, três peixes, randomicamente selecionados, foram
eutanásiados por concussão cerebral, seguido de perfuração craniana para retirada de
material biológico. Os órgãos internos (intestino e estômago) foram removidos,
colocados em coletores universais e fixados com formalina 10% (Moravec, 1998;
Jerônimo et al. 2012). Após a fixação, foi feita a contagem total dos parasitos para
estimar a carga parasitária, utilizando estereomicroscópio (Zeiss®).
19
Os índices parasitários foram calculados de acordo com Bush et al. (1997): a)
Prevalência = N° de hospedeiros infectados / N° total de peixes x 100; b) Intensidade =
valor mínimo e máximo de parasitos encontrados; c) Intensidade média = N° de
parasitos / N° de hospedeiros infectados e; d) Abundância média = N° de parasitos / N°
total de hospedeiros infectados ou não.
Segundo Martins et al. (2001) e Onaka et al. (2003) foram calculadas para os
tratamentos a eficácia = N° de parasitos do grupo controle - N° de parasitos após o
tratamento / n° de parasitos do grupo controle x 100.
3.8. Monitoramento da qualidade da água
Foram monitoradas as variáveis físicas e químicas da água dos tanques durante
todo o período experimental. Diariamente, às 8:00 horas, foram determinados: oxigênio
dissolvido (OD – mg/L), temperatura (T - ºC) e condutividade elétrica (CE - µ.S/cm)
por meio de um oxímetro digital da marca YSI modelo 85 e o potencial hidrogeniônico
(pH), utilizando um pHmetro digital da marca YSI modelo 60.
No início e no final dos experimentos, foram coletadas amostras de água em
garrafas de 1 L e armazenadas sob refrigeração para as análises colorimétricas:
concentração de amônia total (NH3 + NH4+) determinada segundo Verdouw et al.
(1978), nitrito (NO2 - mg/L), gás carbônico (CO2 - mg/L), dureza (mg de CaCO3/L) e
alcalinidade (mg de CaCO3/L) segundo Boyd e Tucker (1992).
3.9. Análises estatísticas
O teste de palatabilidade, os parâmetros sanguíneos dos juvenis de pirarucu, os
índices parasitológicos, assim como as análises das variáveis físicas e químicas da água
foram comparados mediante análise de variância (ANOVA) de dois fatores (tempo de
exposição e concentrações), seguido pelo teste de Tukey, quando as diferenças foram
significativas a 5% de probabilidade, utilizando o programa Statsoft Statistica 6.0®.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Qualidade de água
20
O acompanhamento das variáveis físicas e químicas da água das unidades
experimentais é realizado para assegurar a qualidade dos bioensaios, frente a fatores
exógenos que podem interferir nos resultados dos experimentos (Atta-ur-Rahman et al.
2001)
Os resultados obtidos nas variáveis físicas e químicas da água das unidades
experimentais, no teste de palatabilidade e de eficácia, estão representados nas Tabelas
3 e 4. Não foram verificadas diferenças significativas (p>0,05) em nenhuma das
variáveis analisadas nos experimentos, sejam elas comparadas entre as concentrações,
no mesmo período, ou entre os períodos (aclimatação = 0, 7 e 15 dias). A alta taxa de
renovação (175 ml/min) do fluxo contínuo de água e a limpeza de manutenção, nas
unidades experimentais, foram responsáveis pela estabilidade dos valores nas variáveis
analisadas em todos os tratamentos.
Comparando com os valores de qualidade da água descritos para peixes tropicais
(Kubitza 2003), alguns valores, como, por exemplo, pH, estão abaixo dos considerados
adequados. Classificadas como águas pretas (ex. Rio Negro), brancas (ex. rio Solimões)
e claras (ex. rio Tapajós), o pH destes rios variam de 3,8-4,9; 6,2 -7,2 e 4,5 – 7,8
respectivamente (Sioli 1992). Portanto, estão dentro das variações naturais que a espécie
tolera no seu ambiente natural (Ono 2011).
Por ser um peixe de respiração aérea obrigatória, o pirarucu não depende dos
níveis de oxigênio da água, entretanto, quando estes diminuem, podem afetar outras
variáveis químicas da água como, por exemplo, o CO2, cujos valores, neste estudo,
estiveram sempre constantes e sem prejuízo ao animal. Os índices mínimos e máximos
de alcalinidade e dureza foram respectivamente 1,83 e 2,84 CaCO3/L e 1,00 e 1,91
CaCO3/L, corroborando os valores de pH que variaram entre 4,01 e 4,44.
Nas análises colorimétricas, foram detectados baixos níveis de nitrito e de
amônia total, provavelmente em função da renovação contínua da água e da limpeza
diária dos tanques. Os valores médios de temperatura (26,62 e 28,3oC), determinados
em todos os experimentos, estão dentro da zona de conforto para o cultivo das espécies
tropicais, que oscilam entre 26 e 30 oC.
21
Tabela 3. Variáveis físicas e químicas da água das unidades experimentais com Arapaima gigas, antes dos experimentos (aclimatação) e após
alimentação com e sem ração medicada com: 0 (controle); 32; 48; 56 e 80 ml/kg do óleo essencial de Piper aduncum, por 7 e 15 dias, no teste de
palatabilidade. Condutividade Elétrica (CE); gás carbônico (CO2); alcalinidade (AL); dureza (D) e amônia total (AT). Média ± desvio padrão.
Variáveis
pH
O2 (mg/L)
CE (µS/cm)
Temperatura (°C)
CO2 (mg/L)
AL (mg/ L CaCo3)
DT (mg/ L CaCo3)
AT (mg/L)
Nitrito (mg/L)
pH
O2 (mg/L)
CE (µS/cm)
Temperatura (°C)
CO2 (mg/L)
AL (mg/ L CaCo3)
DT (mg/ L CaCo3)
AT (mg/L)
Nitrito (mg/L)
Aclimatação
4,47 ± 0,07
5,47 ± 0,22
28,9 ± 0,81
27,63 ± 0,57
5,0 ± 0,0
0,55 ± 0
2,5 ± 0
0,35 ± 0,01
0,008 ± 0,004
Controle
4,42 ± 0,11
5,48 ± 0,16
28,85 ± 0,51
28, 04 ± 0,31
8,33 ± 2,89
0,64 ± 0,16
2,17 ± 0,29
0,42 ± 0,02
0,003 ± 0,004
4,42 ± 0,02
5,35 ± 0,05
28,61 ± 0,23
27,91± 0,02
10 ± 0,0
1,28 ± 0,42
2,17 ± 0,38
0,40 ± 0,07
0,006 ± 0,003
Ração com óleo de Piper aduncum (7 dias)
32 (ml/kg)
48 (ml/kg)
64 (ml/kg)
80 (ml/kg)
4,41 ± 0,09
4,41 ± 0,10
4,39 ± 0,10
4,46 ± 0,27
5,38 ± 0,28
5,33 ± 0,30
5,44 ± 0,17
5,44 ± 0,20
29,11 ± 0,63
29,08 ± 0,46 29,02 ± 0,38 29,01 ± 0,53
28,05 ± 0,30
28,04 ± 0,31 28,05 ± 0,33 28,01 ± 0,28
8,33 ± 2,89
10 ± 0,0
8,33 ± 2,89
8,33 ± 2,89
0,83 ± 0,28
0,92 ± 0,32
0,73 ± 0,16
0,92 ±0,32
2,09 ± 0,52
2,17 ± 0,29
2,25 ± 0,25
2,09 ± 0,52
0,39 ± 0,03
0,39 ± 0,05
0,40 ± 0,01
0,39 ± 0,05
0,002 ± 0,001 0,001 ± 0,001 0,001 ± 0,001
0,001 ± 0,0
4,41 ± 0,02
4,40 ± 0,02
4,41 ± 0,04
4,44 ± 0,05
5,35 ± 0,10
5,31 ± 0,05
5,30 ± 0,06
5,33 ± 0,05
28,78 ± 0,09 28,73 ± 0,23 28,66 ± 0,15
28,63 ± 0,27
27,92 ± 0,07 27,90 ± 0,02 27,92 ± 0,05
27,88 ± 0,05
10 ± 0,0
10 ± 0,0
10 ± 0,0
10 ± 0,0
0,92 ± 0,32
0,92 ± 0,42
1,01 ± 0,57
1,01 ± 0,16
1,84 ± 0,52
2,00 ± 0,25
2,00 ± 0,0
1,75 ± 0,25
0,41 ± 0,07
0,35 ± 0,02
0,37 ± 0,01
0,40 ± 0,05
0,004 ± 0,0
0,004 ± 0,0
0,004 ± 0,0
0,004 ± 0, 001
22
Tabela 4: Variáveis físicas e químicas da água das unidades experimentais com
Arapaima gigas alimentados com e sem ração medicada contendo: 0 (controle); 32; 48;
56 e 64 ml/kg d óleo de P. aduncum por 7 e 15 dias no teste de eficácia. Condutividade
Elétrica (CE); gás carbônico (CO2); alcalinidade (mg/L CaCo3); dureza (mg/L CaCo3) e
amônia total (AT). Média ± desvio padrão.
Variáveis
Controle
4,44 ± 0,14
pH
6,53 ± 0,44
O2 (mg/L)
25,45 ± 0,8
CE (µS/cm)
27,5 ± 0,85
T (°C)
10± 0,0
CO2 (mg/L)
Alcalinidade 2,84 ± 0,42
1,25 ± 0
Dureza
0,03 ± 0,0
AT (mg/L)
Nitrito (mg/L) 0,00 ± 0,00
pH
O2 (mg/L)
CE (µS/cm)
T (°C)
CO2 (mg/L)
Alcalinidade
Dureza
AT (mg/L)
Nitrito (mg/L)
4,43 ± 0,13
6,49 ± 0,49
25,3 ± 0,81
27,6 ± 0,86
10± 0,0
2,10 ± 0,79
1,7 ± 0,43
0,04 ± 0,00
0,00 ± 0,00
32 (ml/kg) 48 (ml/kg) 58 (ml/kg) 64 (ml/kg)
4,01 ±0,81 4,44 ± 0,13 4,35 ± 4,8
4,43 ± 0,11
6,51 ± 0,64 6,43 ± 0,48 6,50 ± 0,76
6,49 ± 0,45
26,01 ± 0,03 25,8 ± 0,64 25,7 ± 0,79
25,9 ± 0,97
26,62 ± 2,96 27,7 ± 0,92 27,4 ± 1,09
27,4 ± 0,86
10± 0,0
10± 0,0
10± 0,0
10± 0,0
2,65 ± 0,15
2,75 ± 0
2,56 ± 0,15
2,47 ± 0,27
1,00 ± 0,25
1,03 ± 0,2
1,16 ± 0,5
1,08 ± 0,1
0,04 ± 0,0
0,02 ± 0,0 0,06 ± 0,01
0,05 ± 0,02
0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
4,44 ± 0,55 4,4 ± 0,13 4,39 ± 0,45
4,44 ± 0,13
6,55 ± 0,49 6,52 ± 0,43 6,44 ± 0,55
6,40 ± 0,47
24,83 ± 1,42 25,97 ± 0,8 25,8 ± 0,93 25,87 ± 1,06
27,50 ± 1,29 27,7 ± 0,84 27,6 ± 0,98
27,7 ± 0,98
10± 0,0
10± 0,0
10± 0,0
10± 0,0
2,29 ± 0,31 2,29 ± 0,15 1,83 ± 0,42
1,74 ± 0,15
1,8 ± 0,14
1,5 ± 0,25 1,91 ± 0,14
1,50 ± 0,25
0,04 ±0,00 0,04 ± 0,00 0,04 ± 0,00 0,057 ± 0,01
0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
4.2. Palatabilidade das rações medicadas
Em estudos de bioensaios com rações medicadas, é comum avaliar apenas a
palatabilidade aparente, sem a preocupação de verificar se esta continua atrato-palatável
e por quanto tempo pode ser administrada sem alterar a ingestão dos peixes (Willians
2009; Boijink et al. 2011; Viana 2012).
No presente estudo, os valores da taxa de ingestão da ração medicada estão
representados na Tabela 5 e na Figura 2. Não foram verificadas diferenças significativas
(p>0,05) na ingestão da ração no período da tarde (ração sem medicamento), analisadas
em 7 e 15 dias de experimento. Entretanto, na ingestão da ração administrada durante a
manhã (ração com medicamento), diferenças significativas (p<0,05) foram observadas
na maior concentração (80 ml/kg), em 7 e 15 dias de experimento.
23
Tabela 5: Taxa de ingestão do Arapaima gigas alimentados com ração medicada com
diferentes concentrações de óleo essencial de Piper aduncum (32; 48; 64 e 80 ml/kg) e o
controle (sem medicamento), em 7 e 15 dias. Porcentagem da ingestão de ração
medicada, ofertada de manhã - 9:00 h (manhã) e sem medicamento, ofertada de tarde –
16:00 h (tarde). Média ± desvio padrão.
Ingestão (%) das rações com óleo de Piper aduncum (7 dias)
Controle
32 (ml/kg)
48 (ml/kg)
64 (ml/kg)
80 (ml/kg)
95,95 ± 2,83a
94,38 ± 7,89a
88,33 ± 5,69a 86,42 ± 9,13a
64,28 ± 6,73b
Manhã
94,28 ± 5,17
92,38 ± 2,21 92,38 ± 3,71
89,52 ± 9,71
Tarde (%) 95,23 ± 1,38
Ingestão (%) das rações com óleo de Piper aduncum (15 dias)
87,67 ± 4,71a
82,11± 5,06a
78, 3 ± 6,4a
60,11 ± 6,22b
Manhã (%) 92,22 ± 2,06a
89,55 ± 2,47
87,89 ± 3,59
87,3± 1,4
85,55 ± 5,94
Tarde (%) 96,44 ± 2,18
Letras diferentes na mesma linha indicam médias significativamente diferentes dentro do
mesmo tempo de exposição (p<0,05).
Período
Figura 2. Variação da taxa de ingestão da ração medicada (%) com diferentes
concentrações de óleo essencial de Piper aduncum para Arapaima gigas, durante 15
dias de teste de palatabilidade.
Na maior concentração (80 ml/kg), a taxa de ingestão da ração medicada foi
inferior a 60% nos dois períodos (7 e 15 dias). Foi possível observar, ainda, nessa
concentração, alterações comportamentais, tais como agitação e rejeição aos pellets
medicados, logo após a oferta da ração. Tal comportamento não foi observado no
período da tarde, quando era ofertada a ração sem medicamento, porém, os animais se
aproximavam mais vagarosamente dos pellets, o que não interferiu na taxa de ingestão
no período da tarde. Esse comportamento não foi verificado nas demais concentrações,
24
portanto, os resultados indicam a baixa palatabilidade das rações com 80 ml/kg de P.
aduncum.
A taxa de mortalidade dos pirarucus, durante o teste de palatabilidade, está
representada na Figura 3. Em 7 dias de teste, os peixes do controle (0 ml/kg)
apresentaram maior mortalidade (16,7%), seguidos por aqueles com 32 e 80 ml/kg,
ambos com 8,3%; sem mortalidade em 48 e 64 ml/kg. Em 15 dias, a taxa de mortalidade
foi 25% para o controle e para 32 e 80 ml/kg, 8,3% em 48 mg/kg e sem mortalidade em
64 ml/kg.
Figura 3: Taxa de mortalidade, em porcentagem, de Arapaima gigas tratados com
ração medicada em diferentes concentrações de óleo essencial de Piper aduncum,
durante os 7 e 15 dias de teste de palatabilidade.
Schreck e Moffitt (1987), realizando tratamento com antibiótico, verificaram que
as rações medicadas com 10 e 12 μg/mg de eritromicina tiveram sua palatabilidade
reduzida para Oncorhynchus tshawytscha Walbaum, 1792. De acordo com os autores,
os peixes levavam mais tempo para ingerir os pelletes, aumentando a taxa de ejeção
com o aumento das concentrações do antibiótico, e a taxa de ingestão diminuiu quanto
maior a concentração.
Hustvedt et al. (1991) observaram redução de 17% na ingestão da ração
medicada com ácido oxolínico, e 61% na ração medicada com oxitetraciclina
comparados ao grupo controle. Segundo Prak et al. (1994), a adição de sarafloxacinHCl também causou uma diminuição da palatabilidade das rações medicadas para
Penaeus vannamei Boone, 1931. De acordo com Mohney et al. (1997), houve uma
25
sensível redução no consumo de dieta medicada por camarões Litopenaeus. Lima
(2004), usando dietas formuladas com diferentes doses de oxitetraciclina (4, 8, 12, 16,
20 μg.g-1), aplicadas no tratamento, verificou que houve redução da palatabilidade nas
dosagens testadas, contudo, foi observada uma sensível relação inversa entre o consumo
e a dosagem de oxitetraciclina no alimento, concluindo que a adição de antibiótico à
ração influenciou a palatabilidade.
Assim, os resultados obtidos no presente estudo confirmam a importância dos testes
prévios de palatabilidade da ração medicada com a espécie-alvo. Para os testes de
eficácia, as rações medicadas com óleo essencial de P. aduncum podem ser aplicadas
com até 64 ml/kg, uma vez que não difere significativamente (p>0,05) destas com a
taxa de ingestão dos peixes do controle (sem medicação) e obteve 100% de
sobrevivências dos peixes em 7 e 15 dias de experimento.
4.3. Efeitos do óleo essencial de P. aduncum na fisiologia de pirarucus
Os parâmetros fisiológicos vêm se tornando cada vez mais frequente nos estudos
sobre os efeitos tóxicos de medicamentos em organismos aquáticos, principalmente em
peixes de interesse para a aquicultura (Tabela 6) (Tavares-Dias et al. 2002b; Araújo et
al. 2004; Farah et al. 2006; Chagas et al. 2006; Winkaler et al. 2007; Affonso et al.
2009; Maciel, 2009; Bicudo 2010; Kavitha et al. 2011; Figueiredo 2011; Tavares-Dias
et al. 2011; Monteiro 2012; Queiroz 2012; Viana 2012; Brasil 2013). Isso porque, sob
condições de estresse, o animal pode sofrer adaptações fisiológicas para manter o seu
equilíbrio homeostático (Bardon 2002).
No presente estudo, os resultados destes parâmetros, obtidos para os peixes
alimentados com e sem inclusão de óleo essencial de P. aduncum na ração, por 7 e 15
dias, estão representados na tabela 7. Foram observadas alterações nos valores de Ht,
VCM, HCM com 7 dias e, alteração nos valores de proteínas totais dos pirarucus após
15 dias de tratamento.
26
Tabela 6. Parâmetros sanguíneos de peixes nativos de cultivo expostos a diferentes produtos. [Hb] = Concentração de hemoglobina (g/dl); Ht =hematócrito
(%); VCM= Volume corpuscular médio (fL); HCM= Hemoglobina corpuscular média (pg); CHCM =Concentração de hemoglobina corpuscular média
(g/dL); GL = Glicose plasmática (mg/dl); PT =Proteínas plasmáticas totais (g/dL); COL = Colesterol plasmático total (mg/L); Eficácia (%).
Espécie
Produto
Concentração
Tempo
[Hb]
1 dia
7,4
27,7
146,6
-
26,7
96,5
--
-
78,76
0,001g/L
1 dia
8,1
31,0
153,0
-
26,2
107,8
-
-
58,21
0,001g/L
8 dias
8,4
30,4
156,2
-
27,6
142,0
-
-
-
0,001g/L
15 dias
6,5
25,5
124,2
-
25,7
92,7
-
-
-
0,0005g/L
Piaractus mesopotamicus
Sulfato de cobre
(CuSO4)
Ht
VCM
HCM
CHCM
GL
PT
COL
Eficácia Referências
Tavares-Dias et al., 2002b
Colossoma macropomum
Formalina
0,2g/L
30 min
-
-
-
-
-
89,57
-
-
-
Araújo et al., 2004
Mebendazol
0,3g/L
120 min
11,01
33,1
154,85
45,12
29,66
73,13
-
-
-
Chagas et al., 2006
Praziquantel
0,0125g/L
24 h
8,9
27
198,0
63,0
34,0
63,0
2,8
-
61,8
Sado e bicudo, 2010
Piaractus mesopotamicus
Levamisol
0,1g/kg
30 dias
8,93
-
-
-
26,8
84,1
-
-
-
Sulfato de
cobre
(CuSO4)
0,004g/L
48h
6,7
20,1
351,3
-
34,2
37,2
1,4
255,8
100
0,008g/L
48h
7,2
23,8
351,2
-
30,9
38,1
1,8
-
100
8,0
22,67
149,47
52,33
35,25
43,25
2,22
57,12
38,7
9,44
24,78
149,44
57,03
37,86
54,42
2,4
76,35
66,4
8,72
24,56
145,43
57,69
35,31
39,56
2,38
66,81
78,2
9,9
33,0
181,8
54,6
30,2
86,9
1,59
-
58,4
10,1
33,8
208,3
61,4
30,6
88,7
1,72
-
100
60 min
6,88
24,2
144,3
40,8
28,6
59,5
2,17
67,5
46,8
24 h
8,21
28,2
149,2
43,2
29,7
94,2
2,76
29,8
54,4
30 g/kg
Cipó-alho
(A. alliacea)
Arapaima gigas
Pimenta de
macaco
Piper aduncum
Mastruz
(Chenopodium
40 g/kg
30 dias
50g/kg
ambrosioides)
60 ml/L
80 ml/L
3,9 ml/L
24 horas
Bicudo, 2010
Tavares-Dias et al., 2011
Viana, 2012
Queiroz, 2012
Monteiro, 2012
27
Tabela 7. Parâmetros sanguíneos de Arapaima gigas, alimentados por 7 e 15 dias com ração medicada contendo diferentes concentrações de
óleo essencial de Piper aduncum. Hematócrito (Ht), Número de eritrócitos (RBC), Hemoglobina (Hb), Volume corpuscular média (VCM),
Hemoglobina corpuscular média (HCM), Concentração de hemoglobina corpuscular (CHCM), glicose (Gl), proteína total (PT) e colesterol (Col).
Média ± desvio padrão, N=9.
Parâmetros
Ht (%)
RBC (erit./uL)
Hb (g/dl)
VCM (fL)
HCM (pg)
CHCM (g/dL)
Gl (mg/dl)
PT (g/dL)
Col (mg/L)
Controle
24,33 ± 6,24b
1,46 ± 0,31
9,98 ± 1,83
170,6 ± 47,8ab
69,9 ± 15,4ab
42,33 ± 9,07
37,61 ± 3,03
1,45 ± 0,53
52,17 ± 17,91
Ht (%)
RBC (erit./uL)
Hb (g/dl)
VCM (fL)
HCM (pg)
CHCM (g/dL)
Gl (mg/dl)
PT (g/dL)
Col (mg/L)
31,22 ± 5,23
1,91 ± 0,25
12,15 ± 1,52
164,4 ± 31,47
63,83 ± 7,52
39,30 ± 3,12
37,22 ± 5,77
1,60 ± 0,30 a
56,55 ± 11,81
32 (ml/kg)
48 (ml/kg)
56 (ml/kg)
64 (ml/kg)
26,83 ± 6.22ab
25,61 ± 5,94ab
30,89 ± 3,12a
28,88 ± 1,31a
1,33 ± 0,29
1,63 ± 0,13
1,52 ± 0,25
1,50 ± 0,15
11,60 ± 2,16
9,96 ± 3,22
11,63 ± 2,85
12,58 ± 1,66
208,42 ± 65,7a
159,18 ± 43,6b
206,7 ± 31,6a
193,9 ± 14,4ab
89,85 ± 22,62b
62,55 ± 22,87a
77,8 ± 22,3ab
85,49 ± 20,5ab
43,91 ± 4,56
38,82 ± 8,29
37,35 ± 7,39
43,83 ± 7,88
36,28 ± 6,38
39,11 ± 2,86
38,78 ± 6,92
38,63 ± 2,26
1,60 ± 0,44
1,31 ± 0,50
1,37 ± 0,43
1,49 ± 0,24
60,42 ± 14,84
52,45 ± 17,93
55,04 ± 12,8
51,33 ± 5,45
29,63 ± 4,21
25,02 ± 4,75
27,35 ± 5,93
28,00 ± 9,08
1,61 ± 0,15
1,45 ± 0,13
1,59 ± 0,20
1,80 ± 0,16
11,44 ± 0,93
10,24 ± 1,93
11,26 ± 1,92
11,59 ± 2,45
185,8 ± 40,05
180,35 ± 18,6
171,7 ± 32,
163,4 ± 33,4
71,29 ± 9,68
70,82 ± 12,06
70,88 ± 10,47
64,57 ± 12,80
39,18 ± 5,83
44,55 ± 4,39
41,80 ± 3,54
43,22 ± 7,84
41,50 ± 3,03
37,78 ± 3,53
41,08 ± 6,16
37,35 ± 6,51
1,58 ± 0,09 ab
1,53 ± 0,28 ab
1,30 ± 0,30 a
1,18 ± 0,37 b
49,11 ± 14,66
57,01 ± 10,76
59,90 ± 13,77
52,26 ± 12,38
Letras diferentes, na mesma linha, indicam médias significativamente diferentes (p< 0,05) entre o controle e os tratamentos, dentro do mesmo tempo de
exposição.
28
Segundo Fujimoto et al. (2009), a presença de parasitas nos peixes pode causar
alterações nos valores hematológicos. Tavares-Dias et al. (2002) compararam
espécimes de tilápias parasitadas e não parasitadas e observaram que a [Hb], o Ht e a
CHCM dos peixes infectados foram significativamente (p<0,01) menores que os
observados no grupo controle, sugerindo que o parasitismo provocou anemia nos peixes
parasitados. De acordo com Tavares-Dias e Moraes (2004), a exposição aos agentes
patogênicos pode gerar respostas fisiológicas semelhantes àquelas que ocorrem na
presença de outros agentes estressores e assim deprimir respostas de defesa nos
hospedeiros. Azevedo et al. (2006) observaram que o baixo nível de parasitismo não é
capaz de causar alterações hematológicas.
No presente estudo, as alterações nos valores de hematócrito nas maiores
concentrações de P. aduncum, após 15 dias em relação ao controle, podem ter ocorrido
devido, provavelmente, à entrada de água nos eritrócitos, causando hemodiluição dos
eritrócitos, como verificada pelos valores de VCM (Tavares-Dias et al. 2002b).
Segundo Queiroz (2012), as diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum,
em juvenis de pirarucus, induziram a diminuição nos valores de Ht em relação ao
controle, causadas pela diminuição do número e não no tamanho dos eritrócitos.
Para o número de eritrócitos de pirarucus infectados por nematóides, nos
diferentes tempos (7 e 15 dias) e concentrações (0, 32, 48, 56, 64 mg/kg) de óleo
essencial de P. aduncum, sugere-se que: 1) o efeito da ração medicada é de baixa
toxicidade e 2) esta não alterou a capacidade de transporte do sangue. Esses são
corroborados com os resultados obtidos nas concentrações de hemoglobina e de HCM.
Na literatura, outro importante parâmetro indicador de estresse é a glicose, que
demonstra diferentes respostas em decorrência do tipo de estímulo, do tempo de
administração, da idade e da espécie de peixe estudada (Hori et al. 2008; Maciel, 2009;
Winkaler et al. 2007; Kavitha et al. 2011; Rosa et al. 2012). Em geral, sob condições de
estresse, é comum ocorrer hiperglicemia nos peixes, visto que estes necessitam de mais
energia para manter sua homeostase fisiológica. Estudos realizados sob efeito da
formalina (Araujo et al. 2004), do praziquantel (Maciel, 2009) e do mebendazol
(Chagas et al. 2006) em tambaquis, e levamisol para pacu (Sado e Bicudo, 2010),
demonstraram níveis elevados de glicose no plasma. Para Rosas et al. (2010), os valores
de glicose não foram diferentes significativamente em pirarucus tratados com óleo de
alfavaca, óleo de cipó-alho e óleo de alho, mostrando que esta espécie é tolerante a
rações suplementadas com estes óleos essenciais. Nesse estudo, os níveis de glicose não
29
foram alterados entre os diferentes tratamentos com P. aduncum, o tempo (7 e 15 dias)
de alimentação com o medicamento (7 e 15 dias) e nem com a infecção pelo parasita.
Esses resultados corroboram aqueles obtidos por Queiroz (2012) para pirarucus
infectados por monogenóideos e expostos ao banho de P. aduncum, onde não houve
alterações nos valores de glicose.
Outro parâmetro que contribui com a avaliação do estado de saúde dos peixes
são as proteínas totais plasmáticas (Zhou et al. 2009). Essas estão relacionadas às
inúmeras proteínas no sangue, entretanto, cerca de 40 a 60% é constiuida de albumina.
Muitas delas podem ser afetadas por processos patológicos, por isso são importantes
indicadores para várias doenças.
Em geral, os valores de proteínas totais, neste estudo, estão abaixo daqueles
descritos para esta mesma espécie por Souza (2007), Castillo (2012) e Silva, (2013),
mas corroboram com Queiroz (2012), cujos exemplares de pirarucus também estavam
parasitados. Essa diminuição pode se uma conseqüência do grande número de parasitos
presentes na cavidade externa do estômago e do intestino (item 4.4), que, segundo a
literatura, causa alterações teciduais na região, disponibilizando, na corrente sanguínea,
fragmentos do tecido, devido ao aumento da permeabilidade dos capilares.
Além da ação infecciosa causada pelo parasito, as diferentes concentrações de
óleo essencial de P. aduncum acentuaram a diminuição nos níveis de proteínas totais
plasmáticas de pirarucus neste estudo (Tabela 7). A hipoproteinemia tem sido observada
em estudos sob efeito de quiomio e fitoteráficos em peixes (Inoue et al. 2005; Sudová et
al. 2008).
O colesterol tem sido determinado em estudos sob o efeito de diferentes agentes
estressores em peixes. Esse faz parte da composição nas membranas celulares, além de
ser precursor de hormônios esteróides e dos ácidos biliares. A alteração no colesterol
está relacionada com o metabolismo do fígado (Sifa et al. 2000). Para os valores de
colesterol plasmático no presente estudo, não foram observadas diferenças significativas
(p>0.05) entre os tratamentos e o controle, porém, estes estão abaixo daqueles descritos
para esta espécie por Souza (2007), Castillo (2012) e Silva (2013).
Além da ação contra patógenos, P. aduncum tem sido citada na literatura por seu
efeito anestésico, devido à presença de alcalóides que atuam no sistema nervoso central
dos animais (Lorenzi e Matos 2002). Queiroz (2012), testando o efeito de P. aduncum
em juvenis de pirarucu, observou a diminuição nos movimentos dos peixes, e, em
alguns exemplares, impediu a subida à superfície para respirar, o que resultou na morte
30
por asfixia. Para Honczark e Inoue (2009) o uso de anestésicos em pirarucus, que
utilizam, obrigatoriamente, a respiração aérea, pode causar a morte dos animais por
asfixia. Diferente dos resultados descritos por Queiroz (2012), no presente estudo, o
tratamento oral com o óleo essencial de P. aduncum não causou letargia nos peixes,
entretanto, foi observada, durante o arraçoamento com ração medicada, agitação dos
animais, o que pode ser explicado pelo efeito termogênico da piperina presente nas
piperáceas (Estrela et al. 2006; Dewick, 2009). Pelo exposto, pode-se sugerir que, tanto
a forma de administrar, como usar partes da planta, podem atuar no comportamento
e/ou na fisiologia do animal teste, sendo esta uma informação importante para a
aplicação farmacológica desta planta em espécies com adaptações morfológicas para
respirar, como o pirarucu.
4.4. Eficácia do óleo essencial de P. aduncum
A análise parasitológica realizada antes do experimento revelou uma prevalência
de 100% de larvas de nematóides no trato digetório e uma intensidade de 2 a 615.
Após o tratamento com P. aduncum, foi registrada a presença de larvas de
nematóides em todos os peixes analisados, prevalência de 100%, nos dois períodos
experimentais (7 e 15 dias). As larvas foram registradas na cavidade externa do
estômago e no intestino dos peixes (figuras 4). A intensidade parasitária por peixe,
avaliada em 7 e 15 dias, variou de 5 a 949 e 9 a 1221 respectivamente. Os índices
parasitários durante os dois períodos experimentais estão descritos na tabela 8.
Figura 4. Visão geral da superfície externa do intestino de pirarucu com grande número
de larvas de nematóides.
31
A prevalência parasitária nas cinco concentrações (0, 32, 48, 56 e 64 ml/kg), nos
dois períodos de tratamento (7 e 15 dias), foi de 100%. Os resultados da atividade
antiparasitária do óleo essencial de P. aduncum, em 7 e 15 dias, estão representados na
tabela 8. Durante os testes de eficácia (7 e 15 dias), não foram observadas mortalidade
de peixes. Os índices de intensidade média, abundância média e intensidade de parasitos
não apresentaram diferenças significativas (p>0,05) entre os tratamentos (32, 48, 56, 64
ml/kg) durante os 7 dias, porém, todos apresentaram diferença significativa (p<0,05) em
relação ao controle. Em 15 dias, esses índices apresentaram diferenças significativas
(p<0,05) entre as diferentes concentrações de P. aduncum e o controle. Diferença
significativa (p<0,05) também foi observada entre os tratamentos com 32, 48, 56 ml/kg
e o tratamento com 64 ml/kg.
Tabela 8. Prevalência (P%), Intensidade média (IM) ± desvio padrão, Abundância
média (AM) ± desvio padrão e Intensidade (I) de parasitos em Arapaima gigas do grupo
controle e após 7 e 15 dias de tratamento com diferentes concentrações de óleo essencial
de P. aduncum.
Concentrações
(ml/kg)
0
32
48
56
64
P(%)
100
100
100
100
100
0
32
48
56
64
100
100
100
100
100
7 Dias
IM
AM
a
536,22±19,66 536,22±19,66a
519,67±26,65b 519,67±26,65b
498,44±23,4b 498,44±23,46b
456,44±22,79b 456,44±22,79b
450,67±23,55b 450,67±23,55b
15 Dias
a
567±36,05
567±36,05a
401,67±20,63b 401,67±20,63b
338,67±18,10b 338,67±18,10b
260,11±18,00b 260,11±18,00b
134,89±10,43c 134,89±10,43c
I
20-702a
5-949b
112-856b
100-760b
11-798b
9-1221a
20-600b
124-708b
9-603b
9-288c
Letras diferentes, na mesma coluna, indicam médias significativamente diferentes (p<0,05)
entre o controle e os tratamentos dentro do mesmo tempo de exposição.
Em geral, no ambiente de cultivo a manifestação de uma doença nos peixes pode
estar relacionada às práticas de manejo incorretas, como altas densidades de estocagem,
má nutrição, qualidade da água inadequada, além de fatores genéticos (Pavanelli et al.
2013). Para o pirarucu, tem sido verificado que os fatores que causam doenças estão
relacionados ao manejo inadequado dos alevinos, principalmente quando são retirados
do cuidado parental, o período de transição alimentar (alimento vivo x ração) e a
qualidade da água do ambiente (Araújo et al. 2009a; Araújo et al. 2009b; Ono 2011;
Queiroz 2012).
32
Estes fatores ainda são motivo de vários estudos, entretanto, os resultados das
pesquisas ainda não são conclusivos para que se desenvolvam técnicas que minimizem
os problemas sanitários enfrentados pela espécie nos primeiros estágios de
desenvolvimento. A elevada intensidade de parasitas nesse estudo é um bom exemplo
da atual situação que a maioria dos produtores enfrenta e que levam a grandes perdas
dos animais. Além disso, a variação no número de parasitos (2 – 615) encontrados por
peixe, antes do tratamento, pode estar relacionada a uma característica específica do
organismo animal, já que estes eram da mesma prole e estavam sob as mesmas
condições ambientais.
Os nematóides são parasitos comuns em peixes de água doce, que podem servir
de hospedeiro definitivo ou intermediário (Williams e Jones 1994). Quando adultos, os
nematóides habitam, preferencialmente, o tubo digestivo, entretanto, as formas larvais
podem ser encontradas na musculatura e na cavidade mesentérica, muitas vezes
encistadas (Pavanelli et al. 2013). A capacidade dos nematóides de se instalar na
cavidade mesentérica no corpo do hospedeiro foi observada neste estudo, cujas larvas
estavam localizadas na camada exterior do estômago e do intestino dos pirarucus.
Gomes (2007) verificou a presença de nematóides no intestino, nos cecos pilóricos e nas
brânquias de pirarucus. Andrade-Porto et al. (2011) registraram nematóides de pirarucu
no lumem intestinal e nos cecos pilóricos. Quando em grandes quantidades, os
nematóides se fixam em determinado local do estômago e do intestino do hospedeiro,
causando lesões crônicas e, consequentemente perfurações (Kent et al. 2002). Em
salmonídeos, Philonema spp foram observados, na maioria dos casos, aderidos na
cavidade visceral e mesentérica (Nagasaw, 1985; Garnick e Margolis 1990).
Na literatura são descritos efeitos devastadores de infecções por nematóides.
Molnár et al. (1993) relatou a morte de enguias no lago Balaton, Hungria, devido a A.
crassus. Moravec e Gut (1982) e Moravec et al. (1984) relataram a mortalidade de
peixes ornamentais devido à infecção com Pseudocapillaria brevispicula Linstow, 1873
e Capillaria pterophylli Heinze, 1933. Freitas e Lents (1946) citam a presença de
nematóides em alevinos de apaiarís e pirarucus no Posto de Piscicultura, estado do
Ceará, sugerindo que este parasito seria responsável pelo insucesso na criação destas
espécies.
Segundo Gomes (2007), os parasitos coexistem com os pirarucus tanto no
ambiente natural como no ambiente de cultivo. Esse autor, estudando a comunidade de
parasitos do A. gigas na Reserva de Desenvolvimento Sustentável de Mamirauá – AM,
33
encontrou uma intensidade de 1 a 116 nematóides em peixes com aproximadamente um
metro. Santos et al. (2008), estudando os helmintos parasitos de pirarucu no rio
Araguaia, no estado do Mato Grosso, relataram uma intensidade de 41 a 198 parasitos.
Neste estudo, os valores de intensidade foram elevados (5 a 1121 parasitos/peixe) ao
comparar com aqueles descritos por Araújo et al. (2009a), que encontraram uma
intensidade de 2 a 10 parasitos por peixe infectado e com o mesmo tamanho,
aproximadamente 17 cm, dos exemplares utilizados no presente trabalho.
Outro exemplo de abundância parasitária no pirarucu foi descrito por AndradePorto et al. (2011) quando foram coletadas 590 larvas de Hysterothylacium sp. no
intestino, no estômago e nos cecos pilóricos de pirarucus. A intensidade média foi de
6,02, variando de 1 a 40 larvas por hospedeiro, e a abundância média foi de 5,9 em
peixes com aproximadamente 14,5 cm.
Além da possível ação do fitoterápico sobre os nematóides, a capacidade de
defesa do organismo animal também contribui, em uma menor proporção, para a
eliminação deste parasito. De acordo com a literatura, os nematóides estimulam a
produção de anticorpos específicos nos hospedeiros e a migração das larvas para a
cavidade mesentérica e tecido dos peixes pode causar alterações no sistema imune do
animal e, consequentemente, a eliminação ou a morte do parasito (Molnár et al. 2006).
Em enguias europeias foi observada a produção de anticorpos específicos contra
Anguillicoloides crassus (Buchmann et al., 1991; Höglund e Pilström, 1994; Békési et
al. 1997; Nielsen e Buchmann, 1997; Knopf et al. 2000). Dois tipos principais de
antígenos são, geralmente, reconhecidos nas infecções por nematóides, a excreção e
secreção solúvel (E/S). Os antígenos somáticos estão associados com superfícies no
exterior dos parasitos, geralmente as reações celulares desempenham um papel
importante na proteção do hospedeiro contra nematóides. Segundo Coscia e Oreste,
(1998), teleósteos da Antártida produzem anticorpos específicos contra Contracaecum
osculatum Rudolphi, 1908.
Na tabela 9 estão representados os valores do cálculo de eficácia (%) do óleo
essencial da P. aduncum contra os nematóides, após 7 e 15 dias de tratamento. Foram
calculadas a eficácia de cada tratamento, de acordo com Martins et al. (2001) e Onaka
et al. (2003). Nos dois períodos experimentais, não foi registrada mortalidade dos
peixes. Após 7 dias de experimento, não houve diferença estatística (p>0,05) entre os
tratamentos, exceto na maior concentração (64 ml/kg), e entre estes com o grupo
controle e verificou-se a baixa eficácia da P. aduncum contra os nematóides, inclusive
34
na maior concentração (Figura 7). Em 15 dias, os tratamentos foram significativamente
diferentes (p<0,05) em relação ao grupo controle e houve diferença na maior
concentração (64 ml/L) que promoveu 76,21% de eficácia.
Tabela 9. Porcentagem de Eficácia (%) do óleo essencial de P. aduncum administrado
na ração e o controle (sem o óleo essencial) contra nematóides de Arapaima gigas em 7
e 15 dias de experimento.
Tratamento
(ml/kg)
Controle
32
48
56
64
Eficácia (%)
7 dias
15 dias
0
0
3,08
29,15
7,04
40,27
14,87
54,12
15,95
76,21
Para ser considerado um fármaco anti-helmíntico, uma droga precisa atuar na
cutícula do verme, podendo causar alterações nas atividades neuromusculares do
parasito ou lesar a cutícula. Essa ação pode resultar na digestão parcial do verme ou sua
eliminação através dos mecanismos imunológicos do hospedeiro (Molnár et al. 2006).
Entretanto, nenhum composto antiparasitário é eficaz contra todos os estádios de
desenvolvimento dos parasitas (Atta-ur-Rahman et al. 2005).
Substâncias presentes nas piperáceas interferem no metabolismo energético das
células, no ciclo de Krebs, ocasionando uma diminuição do armazenamento de energia,
do metabolismo de glicose e da respiração celular (Oliveira et al. 1963; Oliveira et al.
2003). Segundo Rafael (2008), o uso de dilapiol em larvas de Aedes aegypti causou
alterações cromossômicas. Bano et al. (1991) descrevem que a piperina, composto
presente na família Piperaceae, promove uma rápida absorção de nutrientes no trato
gastrointestinal, devido seu caráter lipofílico (afinidade com o tecido adiposo), podendo
interagir com os componentes lipídicos da membrana da célula intestinal, facilitando a
permeabilidade e a entrada de nutrientes. O que facilitou a permeabilidade do óleo,
permitando, assim, uma maior absorção do medicamento. Fazendo com que estes
metabólitos secundários encontrados no óleo essencial entressem em contato com a
cutícula dos nematóides.
O potencial de ação de alguns quimioterápicos anti-helmínticos sobre os
parasitos tem sido descrito na literatura: benzimidazóis (mebendazol, tiabendazol e o
albendazol) são agentes de amplo espectro, que interferem na captação de glicose
35
dependente de microtúbulos, impedindo a função microtubular dos helmintos. O
praziquantel atua na homeostasia do cálcio nas células dos helmintos, o que provoca
uma contração muscular, paralisia e morte dos parasitos. A piperazina e a ivermectina
atuam como agentes inibidores de neurotransmissores sobre os canais de cloreto no
músculo do nematóide, que, depois de paralisados, são expelidos ainda vivos dos
hospedeiros. O pirantel e o levamisol atuam na despolarização neuromuscular dos
helmintos, causando espasmos e paralisia. (Rang, 2001; Fuches, 2004; Constanzo, 2004;
Craig e Stitzel, 2005; Gilmam, 2005; Katung, 2006; Golan 2009).
Na literatura são descritos diversos produtos de origem vegetal incorporados na
dieta para tratar patógenos em peixes, entre eles os nematóides (Amorim, 1987;
Escosteguy, 2000; Braga et al., 2001; Chitmanat et al. 2005; Diab et al. 2008; Tavechio
et al. 2009). A P. aduncum, apesar da vasta literatura acerca de seus efeitos
farmacológicos, não tem sido citada para controle de nematóides em peixes. Entretanto,
essa espécie já foi utilizada no controle de Meloidogyne incógnita Kofoid & White,
1919, um fitonematóide de tomateiro (Silva et al., 2006). A concentração de 80 ml/L do
extrato aquoso de P. aduncum foi eficaz no tratamento de D. cycloancistrium e D.
cycloancistrioides, ectoparasitas do pirarucu (Queiroz, 2012).
Em geral, as parasitoses na piscicultura têm sido tratadas com produtos químicos
compostos,
entre
eles, destacam-se:
eritromicina, flumequina,
oxitetraciclina,
florafenicol, cloranfenicol, praziquantel, levamisol, entre outros (Parra et al., 1997;
Pavanelli et al., 2008; Carraschi et al., 2011). Entretanto, pelas vantagens conferidas aos
fitoterápicos, as pesquisas vêm avançando para que estes se tornem acessíveis ao
produtor. Exemplos de resultados satisfatórios com diferentes fitoterápicos no controle
parasitário de peixes são descritos na literatura. Martins et al. (2002) testaram, em
juvenis de tilápias do Nilo, 2 g/kg de alho (A. sativum) na ração, por 45 dias, e
observaram redução em 95% da infestação por monogenóides de pacus. Chitmanat et al.
(2005) realizaram experimentos utilizando o extrato do alho em banhos, por dois dias,
com a concentração de 0,8 g/L, e obtiveram 100% de eficácia no controle de Trichodina
spp. Magalhães (2010) testou cipó-alho na concentração de 40 g/L em banhos de 60
minutos em tambaquis, e obteve média de 4,7 monogenóides vivos e 92,2 mortos.
Boijink et al. (2011) obtiveram 63% de eficácia, adicionando 45 g/kg de cipó-alho na
ração para tambaqui, por 45 dias, no tratamento de monogenóides. Abd El-Galil e
Aboelhadid (2012) verificaram que banhos com 3 ppt. do óleo de alho, durante 1 h, e
300 mg.L-1 de dentes de alho recém esmagados em banhos, por tempo indeterminado,
36
impediram a infecção por tricodinídeos e monogenóideos em O. niloticus. Fujimoto et
al. (2012) testaram sementes de abóbora em Astyanax zonatus e obtiveram 95,26% e
92,48% de eficácia no controle de nematóides no intestino e no estômago dos peixes e,
para aqueles alimentados com sementes de mamão, a eficácia foi de 72% no controle de
monogenóides.
De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA),
Portaria n° 48, de 12/05/1997, através de sua Secretaria da Defesa Agropecuária, o
registro de produtos antiparasitários para mamíferos domésticos só é possível se sua
eficácia estiver acima de 90%. Entretanto, não existe uma legislação que defina a
eficácia de um medicamento para peixes e outros organismos aquáticos. Segundo Onaka
et al. (2003) isso pode gerar um prejuízo na avaliação destes produtos para peixes, pois
o objetivo dos tratamentos é o controle dos parasitos, de maneira significativa, e não,
necessariamente, sua eliminação acima de 90%.
Em geral, estudos sobre eficácia de diferentes produtos vegetais têm mostrado a
relação destes com a espécie testada, o tempo de exposição ao fármaco e sua forma de
administração. Portanto, a eficácia de P. aduncum, aplicado, via oral na alimentação,
pode representar um importante anti-helmíntico dessa e de outras espécies, mas devem
ser observadas as recomendações acima quanto à forma, período, e concentração
aplicada no animal.
5. CONCLUSÃO
Com os resultados obtidos, pode-se concluir que, nas concentrações testadas, o
óleo essencial de P. aduncum, no controle de nematóides, é de baixa toxicidade,
garantindo o bem estar do animal, evidenciado pelo equilíbrio fisiológico dos juvenis de
pirarucus. Foi constatado o potencial anti-helmíntico desse óleo, principalmente na
maior concentração (64 ml/kg) e tempo de exposição (15 dias) testados, cuja
porcentagem foi de 76,21% no controle de nematóides nos peixes. Supõe-se que,
concentrações acima de 64 ml/kg poderiam gerar melhores resultados, o que
recomenda-se futuros estudos com adição de ingredientes que possam tornar a ração
medicada mais palatével.
37
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Amanda Corral

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