beads

Troubleshootings
Resolução de problemas no BD FACSCalibur
André Cardoso
Especialista de Aplicações em Campo
Fontes comuns de problemas
1. Conexão do citômetro e estabilização dos lasers
2. Pressurização do equipamento
3. Preparo dos reagentes de calibração (BD CaliBRITE™)
4. Presença de interferentes (bolhas e coágulos) nas linhas de amostras
5. Manutenção (limpezas periódicas)
1. Conexão e estabilização dos lasers
•
Caso o citômetro não esteja conectando ao computador, reinicie o
computador. Lembre-se sempre de ligar o citômetro antes de ligar o
computador.
•
Antes da calibração do equipamento deve ser respeitado um intervalo de
15 minutos com o citometro ligado. Este tempo é necessário para a
estabilização do laser e garantir assim leituras consistentes e reprodutíveis.
2. Pressurização do equipamento
•
O BD FACSCalibur trabalha com um sistema de pressão positiva para
promover a injeção da amostra no equipamento. Para tanto, é imperativo
que o sistema esteja absolutamente fechado e que não haja escape de ar.
RUN não fica verde
2. Pressurização do equipamento
•
Problemas comuns de pressurização incluem:
– Encaixe inadequado da tampa de pressurização do tanque de salina;
– Válvula de pressão do tanque de salina desativada;
– Tubo rachado;
– Bal-seal.
Gaveta de Fluídos
Válvula de pressão
Troca do Bal-seal
3. Calibração - BD CaliBRITE™
•
A calibração do equipamento é um processo de controle de qualidade e
deve ser PREPARADO e PASSADO DIARIAMENTE.
•
O preparo inadequado dos reagentes e o uso do BD CaliBRITE™ fora das
especificações geram ajustes equivocados e prejudicam o desempenho do
equipamento.
BD CaliBRITE™
Cuidados no preparo do BD CaliBRITE™
•
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•
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•
Usar tubos novos (nunca reutilizar);
Usar salina filtrada pelo citômetro (a salina não filtrada pode conter cristais que interferem na
calibração e prejudicam o equipamento);
Agitar os frascos de CaliBRITE vigorosamente antes de pingar as gotas nos tubos A e B;
As gotas devem ser “gordas” e turvas;
Ler os tubos A e B imediatamente após o preparo. Caso não seja possível, guardá-los a 4º C
(geladeira) ao abrigo da luz por apenas 1 hora;
Preencher o tubo A com 1mL de salina filtrada e nele pingar 1 gota das beads unlabeled (não
marcadas) e 1 gota das beads APC;
Preencher o tubo B com 3mL de salina filtrada, 1 gota das beads unlabeled (não marcadas), 1
gota das beads FITC, 1 gota das beads PE, 1 gota das beads PerCP e 1 gota das beads APC;
Preencher corretamente os números de lotes do CaliBRTIE (localizados nas etiquetas laranja e
verde-água) no FACSComp, lembrando que devem ser usados os números da coluna
“FACSFlow Sheath” (nunca os da coluna “bead dilution buffer”) e que o último caracter é sempre
uma letra;
Na tela de Set Up do FACSComp, selecionar sempre a opção “Lyse/No-Wash” no campo
“Assay”;
Agitar vigorosamente os tubos A e B;
Ler os tubos A e B em modo RUN/HI.
BD CaliBRITE™
Preparo do BD CaliBRITE™
A
B
1 gota das beads não marcadas
(unlabeled)
1 gota das beads APC
1 mL da solução isotônica
filtrada
AGITAR!!!
citômetro
1 gota de cada uma das beads:
FITC, PE, PerCP, APC
1 gota das beads não marcadas
(unlabeled)
3mL da
filtrada
solução
AGITAR!!!
citômetro
CLICAR NO SET UP DEPOIS DE CALIBRAR: SALVA E JÁ IMPRIME
isotônica
Ajustar os parâmetros (SETTINGS)
Passo-a-Passo
Passos da calibração
Tubo
1.
Ajuste das voltagens dos
A (beads não marcadas e beads
PMTs
APC)
2.
Calibração do Time Delay
3.
Ajuste das compensações
4.
Estabelecimento do
FITC, beads PE, beads PerCP,
threshold em FL3
beads APC)
5.
Teste de sensibilidade
B (beads não marcadas, beads
Ajuste dos PMTs
SSC
região-alvo
FSC
FL2
Ajuste dos PMTs
região-alvo
FL1
região-alvo
Os PMTs de SSC, FL1, FL2 e FL3 são ajustados
com as beads BD CaliBRITETM não marcadas
Por que ajustar os PMTs?
Evitar falso-positivo e falso-negativo – células não marcadas como controle
SEM
ajuste
COM
ajuste
Ajuste dos PMTs
Counts
regiãoalvo
FL4
O PMT FL4 é ajustado com as beads BD
CaliBRITETM marcadas com APC
Passo-a-Passo
Passos da calibração
Tubo
1.
Ajuste das voltagens dos
A (beads não marcadas e beads
PMTs
APC)
2.
Calibração do Time Delay
3.
Ajuste das compensações
4.
Estabelecimento do
FITC, beads PE, beads PerCP,
threshold em FL3
beads APC)
5.
Teste de sensibilidade
B (beads não marcadas, beads
SEM a Calibração do Time Delay
sinal de excitação do
laser azul
FL4
laser azul
(488 nm)
FL2
laser vermelho
(635 nm)
FL4
sinal de excitação do
laser vermelho
FL2
TEMPO
COM a Calibração do Time Delay
sinal de excitação do
laser azul
FL4
laser azul
(488 nm)
FL2
laser vermelho
(635 nm)
FL4
sinal de excitação do
laser vermelho
FL2
TEMPO
Passo-a-Passo
Passos da calibração
Tubo
1.
Ajuste das voltagens dos
A (beads não marcadas e beads
PMTs
APC)
2.
Calibração do Time Delay
3.
Ajuste das compensações
4.
Estabelecimento do
FITC, beads PE, beads PerCP,
threshold em FL3
beads APC)
5.
Teste de sensibilidade
B (beads não marcadas, beads
Ajuste das Compensações
Por que ajustar as compensações?
Compensação do FITC
COM
ajuste
SEM
ajuste
PE
585/42
PerCP
670 LP
Relative Intensity
FITC
530/30
Aumente o
valor
0.0
500nm 550nm 600nm 650nm 700nm
Wavelength (nm)
Compensação do PE
COM
ajuste
SEM
ajuste
PerCP
670 LP
PE-Cy7
780/60
Relative Intensity
PE
FITC
530/30 585/42
1.2
0.0
500nm 550nm 600nm 650nm 700nm 750nm 800nm
Wavelength (nm)
Aumente o
valor
Importância da Compensação
beads SEM
compensação
beads COM
compensação
Passo-a-Passo
Passos da calibração
Tubo
1.
Ajuste das voltagens dos
A (beads não marcadas e beads
PMTs
APC)
2.
Calibração do Time Delay
3.
Ajuste das compensações
4.
Estabelecimento do
FITC, beads PE, beads PerCP,
threshold em FL3
beads APC)
5.
Teste de sensibilidade
B (beads não marcadas, beads
threshold
Passo-a-Passo
Passos da calibração
Tubo
1.
Ajuste das voltagens dos
A (beads não marcadas e beads
PMTs
APC)
2.
Calibração do Time Delay
3.
Ajuste das compensações
4.
Estabelecimento do
FITC, beads PE, beads PerCP,
threshold em FL3
beads APC)
5.
Teste de sensibilidade
B (beads não marcadas, beads
Teste de Sensibilidade
Avalia a separação de sinal entre marcado (sinal) e não marcado (ruído) para FL1, FL2 e
FL3
FL2
FL1
unlabeled
FITC
unlabeled
FL3
PE
unlabeled
PerCP
Teste de Sensibilidade
Avalia a separação de sinal entre PerCP (ruído) e APC (sinal) para FL4
FL4
PerCP
APC
Teste de Sensibilidade
Avalia a separação de sinal entre sinal e ruído para FSC e SSC
FSC
ruído
SSC
sinal
ruído
sinal
FACS Comp Report
Teste de
sensibilidade
Corrente e potência
do laser azul
Voltagens dos
detectores
Threshold
Valores de
compensação
Teste de
sensibilidade
Comments:
Time Delay calibration passed.
Time Delay
4. Presença de interferentes
• Microcristais, coágulos e bolhas são interferentes que podem
influenciar a calibração do equipamento causando falhas em seus
parâmetros.
• É comum a utilização de protocolos que visem a retirada destes
interferentes das linhas de amostra, porporcionando um fluxo mais
estável no sistema fluídico.
4. Presença de interferentes
•
Para a remoção destes interferentes podemos usar diferentes protocolos
que terão em comum a passagem de água no modo RUN/HI por um
período de tempo mais longo, realização de PRIMES convencionais e, por
vezes, sem o tubo e com o braço aberto. Além disso, podemos tentar usar
diferentes pressões de amostra para promover o desentupimento e retirada
de bolhas da célula de fluxo.
5. Manutenção
•
•
•
Limpeza diária
Limpeza mensal
Limpezas não periódicas
Limpeza diária – BD FACSCalibur™
3 ml de
hipoclorito 0,5%
1 min braço aberto
5 min braço fechado
1 min braço aberto
3 ml de
água destilada
5 min braço fechado
Limpeza Mensal – BD FACSCalibur™
1. Ligue o instrumento BD FACSCalibur™.
2. Verifique se a válvula de pressão, localizada entre os reservatórios de
fluidos e lixo, está desligada (sentido contrário da seta).
3. Pressione o clip de metal, retire a válvula de fluido (branco) e mantenha a
válvula de ar (azul) conectada.
4. Desenrosque a tampa do reservatório de fluido e retire o sensor de
detecção.
5. Deslize o protetor de metal que fica sobre o reservatório de fluido para a
frente.
6. Remova o reservatório de fluido.
7. Instale um reservatório sobressalente (usado somente para esta finalidade)
no lugar do reservatório de fluido, contendo 1 a 2 litros de hipoclorito 0,5%.
8. Recoloque o protetor de metal, ajustando-o sobre os pinos e deslizando-o
para trás.
Limpeza Mensal – BD FACSCalibur™
•
•
•
•
•
•
Bypass do filtro de salina
Tanque contendo 1 a 2 litros de hipoclorito 0,5% e tubo de hipoclorito 0,5%
na probe (RUN/HI) – 30 minutos
Tanque contendo 1 a 2 litros de água destilada e tubo de água destilada na
probe (RUN/HI) – 30 minutos
Desfazer o bypass do filtro de salina
Tanque de salina e tubo de água destilada na probe (RUN/HI) – 20 minutos
Fazer 10 PRIMES
Durante a limpeza mensal
1
2
Esta mangueira
está conectada em
1, e passará a estar
conectada em 2.
Esta mangueira ficará desconectada.
Durante a limpeza mensal
1
2
Mangueira saiu de
1, e passa a estar
conectada em 2.
Mangueira desconectada.
Protocolos de limpeza não periódicas
• Entre os protocolos que sugerimos estão:
– Água destilada 20’ RUN/HI, 2’ RUN/LO, 2’ RUN/HI, seguido de 2
PRIMES convencionais.
– 6 PRIMES convencionais.
– 1 PRIME com o braço aberto e sem o tubo e 1 PRIME
convencional.
– Água destilada 10’ RUN/HI.
Comments:
Time Delay Calibration Passed. FL4 mean changed
too much after Time Delay Calibration
NÃO SE PREOCUPAR
MENSAGEM NÃO ASSOCIADA A ERRO DE CALIBRAÇÃO
EQUIPAMENTO
PARADO POR MAIS DE
UMA SEMANA?
Fazer o BYPASS e
substituir o tanque de
salina por um de água
destilada.
Deixar correr 20’ (Run/HI)
e desligar o equipamento.
AO RETORNAR…
Desfazer o BYPASS e
substituir o tanque de água
por salina. Deixar correr 20’
(Run/HI) e trabalhar.
Dúvidas e problemas?
• Em caso de dúvidas no procedimento a ser realizado ou
caso o problema persista, entre em contato conosco.
BD Biosciences
[email protected]