Volume 6 Número 2

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Volume 6 Número 2

Volume 6 - Número 2 - Ano 2010
ISSN 1808-9909
Volume 6, Número 2, 2010
PLANT CELL CULTURE
&
MICROPROPAGATION
Cultura de Células
&
Micropropagação de Plantas
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 6, n. 2, p. 57-104, 2010
A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”, editada semestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos
de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600
exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE
TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.
Para se associar à ABCTP consulte o site: <www.abctp.ufla.br>
PERMUTA
A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation” deseja fazer permuta com revistas de áreas afins.
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Universidade Federal de Lavras – Departamento de Biologia
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FICHA CATALOGRÁFICA
Diretoria
Antônio Paulino da Costa Netto – UFG – Presidente
José Antônio Petters – UFPel – Vice-Presidente
Manuel Gabino Crispin Churata Masca – UFG – Primeiro Secretário
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Fabiano Guimarães Silva – IF Goiano – Primeiro Tesoureiro
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Conselho Fiscal
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José Raniere Ferreira de Santana – UEFS – Titular
Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa UFRN – Titular
Eugênia Jacira Bolacel Braga –UFPel – Suplente
Osmar Alves Lameira – EMBRAPA – Suplente
Adriano Bortolotti da Silva – UNIFENAS – Suplente
Comissão Editorial
Editor Chefe
Renato Paiva – UFLA
Conselho Editorial
Antônio Paulino da Costa Netto – UFG
Antônio Carlos Torres
Secretaria
Diogo Pedrosa Corrêa da Silva – UFLA
Nomenclatura Científica
Manuel Losada Gavilanes– UFLA
Revisão de Português
Rose Mary Chalfoun Bertolucci
Revisão de Inglês
Revisão de Referências Bibliográficas
Diogo Pedrosa Corrêa da Silva – UFLA
Editoração e Diagramação
Patrícia Carvalho de Morais – Editora UFLA
Consultoria Científica (v.6, n.2, 2010)
Antônio Carlos Torres
Antônio Paulino da Costa Netto –UFG
José Eduardo Brasil Pereira Pinto – UFLA
Suzan Kelly Vilela Bertolucci – UFLA
Virginia Silva Carvalho – UENF
João Maurício Cavalcante Alves – UFLA
Vanessa Cristina Stein – UFG
Fernanda Pereira Soares – MAPA
Fernanda Carlota Nery – UFSJ
José Raniere Ferreira de Santana - UEFS
Rodrigo Kelson Silva Rezende – UFGD
Suzana Stefanello – UFPR
Therezinha Rangel Câmara – UFRPE
Milene Alves de Figueiredo Carvalho – EMBRAPA
ISSN 1808-9909
Plant Cell Culture & Micropropagation
CONTEÚDO
PHYTOCHEMICAL SCREENING OF FIELD-GROWN PLANTS AND in vitro TISSUE
CULTURE OF Hovenia dulcis THUNB.
Perfil fitoquímico de Hovenia dulcis Thunb. cultivada in vivo e in vitro.
Ivan Gonçalves Ribeiro, Tatiana Carvalho de Castro, Carlos Roberto Machado Gayer, Marsen Garcia
Pinto Coelho , Norma Albarello.............................................................................................................................
57
SHOOT REGENERATION FROM ROOT EXPLANTS OF Adenocalymma nodosum (SILVA
MANSO) L.G.LOHMANN
Regeneração de brotações a partir de explantes radiculares de Adenocalymma nodosum (Silva
Manso) L.G.Lohmann
Janaína Fernanda de Oliveira, Vespasiano Borges de Paiva Neto, Mônica Cristina Rezende Zuffo, Maria
Rita Marques, Josimara Nolasco Rondon, Sebastião Ferreira Lima.............................................................
65
SACAROSE E GA3 NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES E NO DESENVOLVIMENTO in vitro
DE PLÂNTULAS DE GOIABEIRA ‘PEDRO SATO’
Sucrose and GA3 on germination and on in vitro development of guava ‘Pedro Sato’ plantlets
Thatiane Padilha de Menezes, Filipe Almendagna Rodrigues, Simone Abreu Asmar, Moacir
Pasqual..........................................................................................................................................................
70
6-BENZILADENINE (BA) AND GIBERELIC ACID (GA3) EFFECTS ON in vitro
DEVELOPMENT OF Selenicereus grandiflorus (L.) BRITTON & ROSE (CACTACEAE)
efeitos de 6-benziladenina (BA) e ácido giberelico (GA3) no desenvolvimento in vitro de
Selenicereus grandiflorus (L.) Britton & Rose (cactaceae)
Patrícia Fontes Esteves; Alice Sato; Maria Apparecida Esquibel.................................................................
77
LUZ NATURAL E SISTEMAS DE VEDAÇÃO NA PROPAGAÇÃO in vitro DE CRISÂNTEMO
CV. RAGE: ALTERAÇÕES ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS
natural light and seal systems on in vitro propagation of chrysanthemum cv. Rage: anatomical and
physiological alterations
Francyane Tavares Braga, Moacir Pasqual, Evaristo Mauro De Castro, Samantha Léa Dignart, Gabriel
Coimbra Rafael, Claudinéia Ferreira Nunes..................................................................................................
82
BAP E AIB NO CULTIVO in vitro DE Epidendrum ibaguense KUNTH
BAP and AIB on in vitro culture of Epidendrum ibaguense Kunth
Maurício Reginaldo Alves dos Santos; Maria das Graças Rodrigues Ferreira; Maguiana Gonçalves
Marques.........................................................................................................................................................
90
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
GERMINAÇÃO in vitro E ACLIMATIZAÇÃO DE MUDAS DE Aechmea blanchetiana (BAKER)
L. B. SMITH EM DIFERENTES RESÍDUOS DA AGROINDÚSTRIA
In vitro germination and seedling acclimatization of Aechmea blanchetiana (Baker) L. B. SMITH
in different agroindustry residues
Tarcisio Rangel do Couto; Janie Mendes Jasmim; Virginia Silva Carvalho, Guilherme Eugênio Machado
Lopes.............................................................................................................................................................
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.2, p. 57-104, 2010
99
PHYTOCHEMICAL
SCREENING
OF FIELD-GROWN
PLANTS
Phytochemical
screening of field-grown
plants...
AND in vitro TISSUE CULTURE OF Hovenia dulcis THUNB
57
PERFIL FITOQUÍMICO DE Hovenia dulcis THUNB. CULTIVADA in vivo E in vitro
IVAN GONÇALVES RIBEIRO1, TATIANA CARVALHO DE CASTRO2,
CARLOS ROBERTO MACHADO GAYER3, MARSEN GARCIA PINTO COELHO4, NORMAALBARELLO5
1
Doutorando - Laboratório de Biotecnologia de Plantas (Labplan) - Departamento de Biologia Vegetal - Universidade Estadual do Rio
de Janeiro - Rua São Francisco Xavier, 524. PHLC, sala 509, Maracanã - 20.550-013 - Rio de Janeiro, RJ - [email protected]
2
Técnica em Biotecnologia – Farmacêutica - Laboratório de Biotecnologia de Plantas (Labplan) - Departamento de Biologia Vegetal Universidade Estadual do Rio de Janeiro - Rua São Francisco Xavier, 524. PHLC, sala 509, Maracanã - 20.550-013 - Rio de Janeiro,
RJ - [email protected]
4
Biólogo - Laboratório de Imunologia Aplicada e Bioquímica de Proteínas e Produtos Naturais (LIA-BPPN) - Departamento de
Bioquímica - Universidade Estadual do Rio de Janeiro - Rua Manoel de Abreu, 444. PAPC, 4º andar. Maracanã - 20550-170 - Rio de
Janeiro, RJ [email protected]
5
Professora Adjunta - Laboratório de Imunologia Aplicada e Bioquímica de Proteínas e Produtos Naturais (LIA-BPPN) - Departamento
de Bioquímica - Universidade Estadual do Rio de Janeiro - Rua Manoel de Abreu, 444. PAPC, 4º andar. Maracanã - 20550-170 - Rio
de Janeiro, RJ [email protected]
5
Professora Adjunta - - Laboratório de Biotecnologia de Plantas (Labplan) - Departamento de Biologia Vegetal - Universidade
Estadual do Rio de Janeiro - Rua São Francisco Xavier, 524. PHLC, sala 509, Maracanã - 20.550-013 - Rio de Janeiro, RJ [email protected]
Hovenia dulcis Thunberg is a tree which belongs
to the family Rhamnaceae and is known in Brazil as “uvado-japão”. Many species of Rhamnaceae have been
investigated for medicinal properties and important
pharmacological activities were reported, such as those
related to malaria treatment and the prevention of Chagas
Disease. Among the several medicinal studies from the
Rhamnaceae species, antioxidant, hepatoprotective,
antimicrobial, antineoplasic and antigiardic activities were
reported. Th e aim of this study was to carry out
phytochemical screening of leaves from a wild growing
plant an d compare to material produced from
biotechnological methods based on tissue culture. The
HPLC analysis revealed that plants grown under field
conditions presenting more diverse chromatographic profile
and indicating the presence of a large quantity of
compounds. Gas chromatography showed that these
extracts presented higher amounts of volatile compounds.
Moreover, the absence of peaks in samples from calli and
in vitro propagated plan ts suggests that volatile
compounds are not present in these samples. Due to the
differences observed in the phytochemical profiles,
according to their origin, the data reinforce the use of in
vitro technologies for compounds production, being able
to produce secondary metabolites not found in the field
plant, or allowing in vitro manipulation of these
compounds.
RESUMO
Hovenia dulcis Thunberg é originária da Ásia Oriental,
sendo encontrada mais frequentemente na China e no Japão. No
Brasil, é conhecida popularmente como uva-do-Japão. Diversas
espécies da família Rhamnaceae vêm sendo estudadas quanto ao
seu potencial medicinal, tendo sido relatadas importantes
atividades farmacológicas, com destaque no tratamento da malária
e na prevenção da Doença de Chagas, apresentando ainda atividades
antioxidante, hepatoprotetora, antimicrobiana, antineoplásica, e
antigiárdica. Extratos alcoólicos foram preparados a partir de
calos compactos com dois meses de cultivo, de folhas de um
exemplar arbóreo e da parte aérea de plantas propagadas in vitro,
sendo submetidos a análises cromatográficas. A análise por CLAE
revelou um perfil cromatográfico mais diversificado nos extratos
de planta de campo, indicando a presença de maior quantidade de
substâncias. Porém, foram constatados picos de substâncias
produzidas nas condições in vitro, não observados nos extratos
da planta de campo. A cromatografia gasosa demonstrou que os
extratos de planta de campo possuem maior quantidade de
substâncias voláteis, enquanto a ausência de picos nas amostras
de calos e de plantas propagadas in vitro sugere que substâncias
voláteis não estão presentes. Dessa forma, ficou constatado que
os extratos apresentam perfis fitoquímicos diferentes em função
da sua origem. Esses resultados consolidam a proposta do uso da
cultura de células e tecidos vegetais como estratégia para a
produção de metabólitos, onde podem ser obtidas substâncias
não encontradas na planta de campo, oferecendo ainda a
possibilidade de manipulação dessa produção in vitro.
Index terms: Rhamnaceae, medicinal plant, callus culture, in
vitro propagation
Termos para indexação: Rhamnaceae, planta medicinal, cultura
de calos, propagação in vitro.
ABSTRACT
(Recebido em 29 de outubro de 2009 e aprovado em 29 de junho de 2010)
58
RIBEIRO, I. G. et al.
INTRODUCTION
Natural products have been obtained through plant
tissue culture techniques, such as callus and cell suspension
culture. These methods of producing compounds with
medicinal interest are of great value, since they allow
controlled cultivation , providin g continuous and
homogeneous synthesis of raw material, regardless of
environmental and seasonal factors. These compounds are
not essential to plant metabolism and are known as
secondary metabolites (SANTOS, 2004), belonging to
different chemical classes with medicinal interest.
Hovenia dulcis Thunberg, traditionally known as
“uva-do-japão”, is a tree native from East Asia, mainly China
“uva-do-japão”.
and Japan, and is cultivated in Brazil especially in subtropical
mountainous areas, ideal for its adaptation (COSTA, 1934;
JOHNSTON & FREITAS SOARES, 1972; BASTOS, 1990).
In Chinese folk medicine, pseudofruits are used as
diuretic, febrifuge and against diarrhea (KENNEDY et al., 1988,
HUSSAIN et al., 1990), while in Brazil it has been employed as
antiasmatic (COSTA, 1934; CORRÊA, 1984; BASTOS, 1990).
Recent studies report the antineoplasic potential by inhibition
of growth of tumor cells cultures and tripanocid activity
(CASTRO et al., 2002), besides antigiardic activity (GADELHA
et al., 2005). The antioxidant activity was proposed in several
extracts and related to different mechanisms. Antioxidant
activity of pseudofruit extracts was associated with the
control of diabetes (LEE et al., 2005). The hepatoprotective
activity was reported in several studies and seems to be the
most studied. Besides being used as a medicine against liver
diseases in traditional Chinese and Korean medicine, extracts
of H. dulcis act as detoxicant in alcohol poisoning and protect
the liver against hepatotoxic substances (KIM, 2001; JI et al.,
2001; HWANG et al., 2005).
The present work has been designed to evaluate
the phytochemical profile of calli and in vitro propagated
plants, establishing a comparison with the material
collected under field conditions.
MATERIALAND METHOD
specimen (HRJ1426) is kept at the Herbarium of Rio de
Janeiro State University (UERJ).
Plant material
The extracts were prepared from compact calli
derived from two months old in vitro germinated seedlings,
grown on MS medium with 13.43 mM NAA + 5.54 mM
BAP; aerial parts of two months old in vitro propagated
plants obtained from stem segments and cultivated on MS
medium with 2.22 mM BAP + 2.32 mM of KIN (CASTRO,
2001) and expanded leaves of a tree grown under field
condition located at Teresópolis city (RJ) (RIBEIRO, 2009).
The material was dried at 45oC for 24 hours. The samples
were immersed in ethyl alcohol PA (Merck) for two weeks
at 25+2o C under agitation. After filtration on Whatman
paper (no.1), the extracts were concentrated in rotary
evaporator under reduced pressure and 40º C, dried under
vacuum until constant weight and kept in the dark, at 10o C
(SIMÕES et al., 2006).
High pressure liquid chromatography (HPLC) analysis
The extracts were subjected to HPLC to evaluate
and compare the chromatographic profiles. The samples
were diluted in 77% aqueous acetonitrile to a concentration
of 10 mg mL-1 and injected in a C18 column (BONDAPAK
27,324, particles 10 microns, 300 x 3.9 mm) with UV-VIS
detector set at 210 nm (Castro, 2001). The elution flow was
0.7 mL/min for 15 minutes in linear gradient of 0-77%. The
mobile phase consisted of 77% aqueous acetonitrile. 20
mL of each sample were injected in duplicate. The signs of
absorption were identified according to the retention time
(rt) of compounds.
Gas chromatography (GC) analysis
Gas chromatography was performed on a CP-SIL
31CB column (W-Cotinga, 25 mx 0.32 mm x 0.2 mm) with an
injection temperature of 250 °C and detector at 300 ºC. The
temperature was progressively increased at a rate of 10 ºC
Branches of Hovenia dulcis Thunb. were collected
per minute. Nitrogen was used as the carrier gas. Samples
were diluted in 77% acetonitrile to a concentration of 10
at Teresópolis city, Rio de Janeiro (RJ), Brazil. A voucher
mg L-1 and 20 mL of each sample were injected in duplicate.
Phytochemical screening of field-grown plants...
RESULTS AND DISCUSSION
High pressure liquid chromatography (HPLC) analysis
The extracts subjected to HPLC analysis are
represented in Figure 1. At 210 nm wavelength it was
59
in other species (YOSHIKAWA & FURUYA, 1985; ZHAO
et al., 2001).
Several studies, in wich HPLC analysis was
conducted, have reported that calli extracts presented a
possible to notice that the three types of extracts tested
presented different profiles. The higher number of peaks
smaller number of compounds in comparison with in vitro
showed that extracts obtained from plants grown under
field conditions revealed that these plants presented a more
under in vivo conditions (OLIVEIRA et al., 2001; ITAYA et
diverse chromatographic profile indicating the presence
of a larger amount of compounds. Furthermore, the different
supposed to produce less secondary metabolites mainly
retention times observed in extracts of in vitro propagated
plants compared to extracts of plants grown under field
This way, the higher amount of compounds found on in
conditions, suggests that these two extracts presenting
different compounds. Besides that, it was observed the
propagated plants, especially in relation to plants grown
al., 2005; ROOSTIKA et al., 2007). Callus cultures are
because of its undifferentiated and non-specialized cells.
vivo grown plants is somehow expected, once the
extracts from these plants are composed by substances
produced on several cell types with different functions
presence of a high intensity peak with retention time around
3 minutes in all the three extracts, indicating the production
and consequently with different metabolisms (PASQUA
of similar compounds occurring on the samples.
Callus cultures are very useful systems for the
natural con ditions play an important role in the
et al., 2003; GADZOVSKA et al., 2007). Besides that
synthesis of metabolites that would take effect in the
biosynthesis of natural products, but in some cases, the
production of certain secondary metabolites depends on
al., 2008). Nevertheless, it is possible to manipulate the
the differentiation of some tissues from callus, as observed
callus cultures for producing desired metabolites.
protection against environmental stresses (EDREVA et
FIGURE 1 _ Chromatograms of different extracts of H. dulcis submitted to HPLC analysis. A - In vitro propagated
plants; B - Callus culture; C – Field grown plant.
60
Stafford (1991) suggests that an adjustment of growth
Gas chromatography (GC) analysis
regulators added to culture medium is, in most cases,
By the amount of peaks observed in the
the most important parameter to be considered, and
chromatograms (Figure 2), it was noticed that extracts of
therefore of highest priority. However, other factors such
plant grown under field conditions presented higher amounts
as nitrogen and phosphorus sources, temperature,
of volatile compounds. Moreover, the absence of peaks in
presence or absence of light, addition of amino acids,
samples from calli and in vitro propagated plants suggests
metabolic engineering, genetic engineering and elicitors
that volatile compounds are not present in these samples.
may be considered too (PANDA et al., 1992; CHOI et al.,
Gas chromatography has been widely used in the study of
1994; FETT-NETO et al., 1994; VEERPORTE et al., 1999;
plant volatiles. Analysis by GC has shown that many volatile
compounds produced by plants grown under field
BOURGAUD et al., 2001). Temperature, for example, has
proven to be an i mportan t factor affecti ng th e
biosynthetic activity of cells in several species (AKSU
& EREN, 2005). The production of beta carotene was
observed in callus cultures of Capparis spinosa L.
maintained on media supplemented with PIC or 2,4-D,
specially at 36±2 °C (ALBARELLO et al., 2007). The next
step of this study is the identification of metabolites of
interest in H. dulcis callus cultures. Thus, some of these
parameters, specially temperature and light, will be
evaluated in order to explore metabolite production.
conditions may not be present in in vitro cultures (Hamada
et al., 1991). Differences in phytochemical profiles obtained
by GC have been reported for several species (GULLUCE et
al., 2003; NIKOLAKAKI & CHRISTODOULAKIS, 2004;
ZAYED et al., 2006; PACIFICO et al., 2008).
The low amount of volatile substances found in in
vitro cultures of H. dulcis does not imply that this kind of
compounds cannot be produced in these conditions. For
example, the analysis of wheat calli identified over 200
volatile compounds (LOZOVAYA et al., 2006).
FIGURE 2 _ Chromatograms of different extracts of H. dulcis submitted to GC. A - In vitro propagated plants ; B Callus; C - Field grown plants.
Through the manipulation of culture medium, it is
possible to stimulate or in hibit the synth esis of
substances already present in in vivo plants, besides
ind ucing th e pr oducti on of new substan ces
(FIGUEIREDO et al., 1999; SIMÕES et al., 2009). SchmedaHirschmann et al. (2004) compared different types of in
vitro cultures of Fabiana imbricata Ruiz & Pavón with
plan ts collected in field during different mon ths
throughout the year analyzing the contents of oleanolic
acid, rutin, chlorogenic acid and scopoletin. The authors
found a high variation of these metabolites in plants under
in vivo conditions, and in some cases showed that the
callus cultures were more efficient in the production of
these metabolites. Simões et al. (2009) observed
similarities on the chromatographic profiles from calli and
stems of field-grown plant extracts of Cleome rosea Vahl
ex DC. and the presence of the anthocyanin peonidin
was observed from callus culture, but not from field-grown
plants. The use of elicitation methods may also be applied
on the production of these compounds (DE ALWIS et al.,
2009). This way some modifications may be applied on H.
dulcis callus culture medium allowing the synthesis of
volatile compounds such as terpenes.
Preliminary studies of H. dulcis by HPLC
analysis sh owed th at differen t compounds were
detected mainly in extracts of leave and stem from in
vitro plants. Tissue culture techniques were efficient
to increase the production of some compounds in
extracts from in vitro plants, when compared with
extracts from seedlings and adult plant (CASTRO et
al., 2001) In the present study, considering that different
compounds were detected depen din g on culture
conditions (in vivo and in vitro), new procedures
should be adopted regarding the modification of culture
medium, in order to increase in vitro production of
desirable metabolites from H. dulcis.
CONCLUSIONS
It was possible to conclude that the synthesis of
metabolites might vary according to the origin of plant
material and culture conditions. These data reinforce the
61
use of in vitro technologies for compounds production,
being able to produce compounds not found in the field
plant, or allowing in vitro manipulation of these compounds.
AKNOWLEDGEMENTS
This study was carried out as a part of the project
“Produção e avaliação de plantas e metabólitos de interesse
medicinal obtidos in vivo e in vitro’’, coordinated by Dr Norma
Albarello. The authors are grateful to FAPERJ and CNPq for
financial support, to Maria Francisca Santoro de Assunção
(Núcleo de Biotecnologia Vegetal - IBRAG/UERJ) for technical
assistance and also to Mrs. Maria Dolores Formosinho de Sá
for consenting the access to the site where the species were
collected under field conditions.
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64
SHOOT REGENERATION
FROM
ROOT EXPLANTS OF
OLIVEIRA,
J. de F. et al.
Adenocalymma nodosum (SILVA MANSO) L.G.LOHMANN
REGENERAÇÃO DE BROTAÇÕES A PARTIR DE EXPLANTES RADICULARES DE
Adenocalymma nodosum (SILVA MANSO) L.G.LOHMANN
JANAÍNA FERNANDA DE OLIVEIRA1, VESPASIANO BORGES DE PAIVA NETO2, MÔNICA CRISTINA REZENDE
ZUFFO3, MARIA RITA MARQUES4, JOSIMARA NOLASCO RONDON4, SEBASTIÃO FERREIRA LIMA2
1
Graduanda em Agronomia - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campus de Chapadão do Sul - Cx. P. 112 - 79560-000
Chapadão do Sul, MS - [email protected]
2
Doutor em Agronomia - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campus de Chapadão do Sul - Cx. P. 112 - 79560-000
Chapadão do Sul, MS - [email protected], [email protected]
3
Bacharel em Agronomia - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campus de Chapadão do Sul - Cx. P. 112 - 79560-000
Chapadão do Sul, MS - [email protected]
4
Doutora - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Departamento de Morfofisiologia - Cidade Universitária, Cx. P. 549
79070-900 - Campo Grande, MS. - [email protected], [email protected]
-
ABSTRACT
A reproductible in vitro shoot regeneration system in
Adenocalymma nodosum (Silva Manso) L.G.Lohmann using root
explants was obtained in this investigation. Shoots were induced
in vitro directly from root explants of 50-d-old seedlings on
Murashige and Skoog (MS) medium through adventitious shoot
bud regeneration. The ability of root explants to produce shoot
buds occur without plant growth regulators addition. Shoot buds
elongated into healthy shoots in the same induction medium.
Results reforce hyphotesis that this species probably have an
increased endogenous cytokinins biosynthesis.
Savanna, locally known as Cerrado biome, with up to 1.70
m high, large and yellow flowers, and compound leaves
Index terms: cytokinin, brazilian savanna, direct organogenesis,
in vitro
2005; TRESVENZOL et al., 2009; TRESVENZOL et al., 2010).
Siqueira (1988) describes the popular use of the stem and
RESUMO
Um sistema de regeneração in vitro de fácil
reprodutibilidade para Adenocalymma nodosum (Silva Manso)
L.G.Lohmann, utilizando explantes de raiz, é apresentado na
presente pesquisa. Brotações adventícias foram originadas
diretamente de explantes radiculares obtidos de plântulas com 50
dias de idade e cultivados em meio MS. A capacidade dos explantes
para produzir gemas ocorreu sem adição de reguladores de
crescimento vegetal. As brotações alongaram e geraram ramos
saudáveis no mesmo meio de indução. Os resultados obtidos
reforçam a hipótese de que esta espécie tem, provavelmente,
uma elevada capacidade para biossíntese de citocininas.
leaf infusions in the treatment of external wounds and
ulcers. Silva (1998) reports the use of root tea for intestinal
Termos para indexação: citocininas, cerrado, organogênese
direta, in vitro
INTRODUCTION
Adenocalymma nodosum (Silva Manso) L.G.
Lohmann (Bignoniaceae) popularly named “carobinha do
campo” is a perennial shrub mainly found in the the Brazilian
(SILVA, 1998). Until recently this species was botanically
known as Memora nodosa (Manso) Miers. However,
Alcantara & Lohmann (2010) reclassified and renamed it
to Adenocalymma nodosum. In recent years, researches
have been carried out with A. nodosum in respect to
essential oil composition and action (TRESVENZOL et al.,
pain. Guarim Neto & Morais (2003) listed A. nodosum as a
medicinal plant and pharmacognostical studies conducted
by Tresvenzol et al. (2005) demonstrated the presence of
essential oil, flavonoids, carbohydrates and traces of
heterosides saponins in leaves of A. nodosum. However,
personal observations showed a special regeneration
capacity of this species from root fragments, meanly after
a drastic pruning. This characteristic makes it an agressive
plant in pasture areas with mechanical weed control.
According to George (1993) and Taiz & Zeiger (2004)
roots are the more important organs of cytokinins
biosynthesis in plants. So, we hypothesized that it has
probably an increased genetic capacity to cytokinins
(Recebido em 17 de dezembro de 2009 e aprovado em 12 de julho de 2010)
Shoot regeneration from root explants of Adenocalymma nodosum...
65
biosynthesis that allows enhanced regeneration ability from
underground tissues. Additionally, a very similar plant of
(250 mL) containing 40 mL of MS-medium with total or half
strenght salts, and supplemented as germination medium
the same genus called Adenocalymma peregrinum (Miers)
L.G.Lohmann (cited as Memora peregrina) has the same
except to activated charcoal. Culture glass flasks were
maintaned in growth room as described before. After forty
agressive behavior in field and its strategy is focused in
nitrogen metabolism (MARCHETTI, 2006; DUTRA, 2007).
days in culture, of the number of shoots per explant and
number of elongated shoots (> 0,3 mm) data were collected.
So, initially we have two interests to obtain a protocol to
in vitro cultivation of A. nodosum: first, to check the
The regeneration experiment was performed with fourteen
flasks with at least four root segments each, using a
capacity of this species to produce endogenous
cytokinins; and second, to investigate aspects of the in
completely randomized design. Data were submitted to
analysis of variance (ANOVA) and statistical averages
vitro nitrogen metabolism.
comparations were made through Tukey’s test at 5%
significance level using the statistical program Sisvar
MATERIAL AND METHODS
(FERREIRA, 2002).
Th e work was carried out at the LabTec
(Biotechnology Laboratory) at Universidade Federal de
Mato Grosso do Sul, Campus de Chapadão do sul, located
in Chapadão do Sul, Mato Grosso do Sul state, Brazil.
Seed germination initiated 20 days after embryo
innoculation, and fungi contamination rate was 10% (data
Winged seeds of A. nodosum were collected from
not shown). Fifty days after innoculation, seedlings have
adult field-grown plants in a cerrado area at Chapadão do
large root height and almost complete shoot absence
Sul, Mato Grosso do Sul State, Brazil. They were manually
(Figure 1A). This could be an interesting characteristic of
selected, taking healthy seeds. To facilitate germination
adapted species to cerrado conditions, once that water
process and to reduce contamination, seeds were pre-
disponibility in this biome soils could be a critical factor.
sterilized by immersion in hypochlorite solution (3 % active
chlorine) for five min followed by manual coat removal.
So seedlings invest in root system trying to ensure their
After that, embryos were dipped into an ethanol solution
“inverted forest” (RODIN, 2004; ABDALA et al., 1998), in
70 % (v/v) for 1 min, and afterwards in a sodium
which the underground biomass (root system) is greater
survival. The cerrado biome is often characterized as an
hypochlorite solution (1 % active chlorine) for 5 min, and
than the air biomass. This development pattern can be
rinsed 5 fold with sterile distilled water. Following surface-
observed in other savannas plants around the world, and
sterilization process, embryos were germinated in glass
the uptake of water and nutrients are the main explanation
flasks (250 mL) containing 30 mL of medium with MS-based
(CAIRNS et al., 1997).
salts (MURASHIGE & SKOOG, 1962), supplemented with
-1
A highly reproducible in vitro shoot regeneration
MS vitamins, 58.4 mM sucrose, 100 mg L myo-inositol, 5
system in A. nodosum using root explants was developed
g L-1 activated charcoal pH 5.6 ± 0.1, and solidified with 2.8
in this investigation (Figures 1B and 1C). Shoots were
g L-1 agar. Cultures were maintained under a 16 h
induced in vitro directly from root explants through
-2 -1
photoperiod, irradiance of 36 mmol m s provided by two
adventitious shoot bud regeneration, despite having only
fluorescent tubes (Luz do Dia Especial, 20 W, Osram, Brazil),
1.1 shoots per explant (Table 1), representing a low
o
and temperature of 27 ± 2 C in a growth room. After fifty
days in germination culture medium, root seedlings were
cut (15 mm approximately) and used to perform regeneration
experiment. Root explants were placed in culture flasks
number of regenerated shoots. Root explants have been
proven to be regenerative for in vitro propagation of a
limited number of species, so use of root as explants
source is not an usual practice. According to Son & Hall
66
OLIVEIRA, J. de F. et al.
(1990), the root explant source offers obvious advantages
(easy of manipulation, availability, less oxidation after
al., 2010). Use of plant growth regulators to obtained shoot
regeneration from root explants are reported by above
excision etc.) in comparison with other organ cultures.
However it has been used with success in a small number
cited authors and by Kapoor et al. (2008) that obtained
shoot regeneration in lily hybrids root explants only in
of plant species, for example, Populus alba L. × Populus
grandidentata Michx. (SON & HALL, 1990), Albizia
NAA and BA supplemented medium and by Franklin et
al. (2004) that obtained indirect shoot induction in
jublibrissin Durazzo (SANKHOLA et al., 1995), Populus
tremula L. (VINOCUR et al., 2000), Solanum melongena
Eggplant (Solanum melongena L.) in the medium
containing 0.45 µ M thidiazuron and 13.3 µ M 6-
L. (FLANKLIN et al., 2004), Aralia elata (Miq.) Seem.
(KARIM et al., 2007); Lilium (KAPOOR et al., 2008;
benzyladenine. These authors are supported by Karim et
al. (2007) that demonstrated the ability of Aralia elata
KUMAR et al., 2008), Rosa hybrida (KIM et al., 2009) and
Allium schoenoprasum L. (ZDRAVKOVIÆ-KORAÆ et
root explants to produce shoot buds depended on the
supplementation of plant growth regulators.
FIGURE 1 – Regeneration process of Adenocalymma nodosum in vitro from root explants. A – Germination process
showing large root height. B, C – Direct organogenesis in root explants. Bars = 1 cm.
TABLE 1 – Morphogenic response of the Adenocalymma nodosum root explants.
MS salts
Shoot regeneration (%)
Elongated shoots/explant
Average lenght of elongated shoots (cm)
Total strength
75 a
1.3 a
3.2 a
Half strength
89 a
1.1 a
3.6 a
Means in a column with different letters are significantly different (P � 0.05, Tukey’s test)
Shoot regeneration from root explants of Adenocalymma nodosum...
CONCLUSIONS
Initial and easy protocol for in vitro propagation of
Adenocalymma nodosum (Silva Manso) L.G.Lohmann from
in vitro root explants in a free-growth-regulator-medium
was shown.
The obtained sucessful supports our hypothesis
that this species produces a large quantity of cytokinins.
So, here we saw a repeating of this species pattern response
found in the field natural conditions when it’s under
wounding conditions.
ACKNOWLEDGEMENTS
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul and
Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino,
Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul
(FUNDECT) are thanked for financial assistance, and
Professor Wagner Campos Oton i for Scientific
contributions.
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SACAROSE
E eGA
GERMINAÇÃO
DE SEMENTES
E
Sacarose
GA33naNA
germinação
de sementes e no desenvolvimento
...
NO DESENVOLVIMENTO in vitro DE PLÂNTULAS DE
GOIABEIRA ‘PEDRO SATO’
69
SUCROSE AND GA3 ON GERMINATION AND ON in vitro
DEVELOPMENT OF GUAVA ‘PEDRO SATO’ PLANTLETS
THATIANE PADILHA DE MENEZES1, FILIPE ALMENDAGNA RODRIGUES2,
SIMONE ABREU ASMAR3, MOACIR PASQUAL4
1
Engenheira Agrônoma - Mestranda em Agronomia/Fitotecnia - Universidade Federal de Lavras - Departamento de Agricultura - Caixa
Postal 3037 - 37200-000 - Lavras, MG - [email protected]
2
Engenheiro Agrônomo - Doutorando em Agronomia/Fitotecnia - Universidade Federal de Lavras - Departamento de Agricultura Caixa Postal 3037 - 37200-000 - Lavras, MG - [email protected]
3
Engenheira Agrônoma - Doutoranda em Agronomia/Fitotecnia - Universidade Federal de Lavras - Departamento de Agricultura Caixa Postal 3037 - 37200-000 - Lavras, MG - [email protected]
4
Professor Titular - Universidade Federal de Lavras - Departamento de Agricultura - Caixa Postal 3037 - 37200-000 - Lavras, MG [email protected]
RESUMO
Objetivou-se, neste trabalho, estudar a influência da
sacarose e do GA3 na germinação e no desenvolvimento in vitro
de plântulas de goiabeira (Psidium guajava L.) ‘Pedro Sato’.
Sementes foram inoculadas em tubos de ensaio, contendo 15 mL
do meio de cultura JADS, acrescidos de GA3 (0,0; 0,25; 0,5; 0,75
e 1,0 mg L-1) e sacarose (0; 15 e 30 g L-1). Posteriormente, os
tubos foram transferidos para a sala de crescimento a 25 ± 2 ºC,
irradiância média de 42 W m-2 e fotoperíodo de 16 horas. Após 45
dias de incubação, foram avaliados o índice de velocidade de
germinação, porcentagem de germinação, número de folhas,
comprimento da parte aérea e raiz. Melhores resultados foram
obtidos em meio JADS, em ausência de sacarose e GA3 para a
germinação da goiabeira ‘Pedro Sato’. Maior número de folhas
(7,9) foi observado em ausência de sacarose e 0,25 mg L-1 de
GA3, maior comprimento de parte aérea (4,8 cm) e de raiz (5,7
cm) em 30 g L-1 de sacarose e 0,25 mg L-1 GA3..
Termos para indexação: JADS, cultura de tecidos, Psidium
guajava L.
ABSTRACT
The objective was to study the influence of sucrose and
GA3 on germination and on the in vitro development of plantlets
of guava (Psidium guajava L.) ‘Pedro Sato’. Seeds were inoculated
in test tubes containing 15 mL of culture medium JADS
supplemented with GA3 (0.0, 0.25, 0.5, 0.75 and 1.0 mg L-1) and
sucrose (0, 15 and 30 g L-1). Subsequently, the tubes were
transferred to a growth room at 25 ± 2º C temperature, average of
42 W m -2 and a photoperiod of 16 hours. After 45 days of
incubation, germination velocity, germination percentage, number
of leaves and shoot and root length were evaluated. Better results
were obtained in medium JADS, in the absence of sucrose and
GA3 for germination of guava ‘Pedro Sato’. Increased number of
leaves (7.9) was observed in the absence of sucrose and 0.25 mg
L-1 GA3, higher length of shoot (4.8 cm) and root (5.7 cm) in 30
g L-1 sucrose and 0.25 mg L-1 GA3.
Index terms: JADS, tissue culture, Psidium guajava
INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de
goiaba juntamente com a Índia, Paquistão, México, Egito e
Venezuela e, de acordo com Azzolini et al. (2005), a ‘Pedro
Sato’ é a preferida no mercado nacional. A goiaba constituise um dos frutos de maior importância nas regiões
subtropicais e tropicais brasileiras, não só em razão do seu
elevado valor nutritivo, mas pela excelente aceitação do
consumo in natura, pela grande aplicação industrial e pela
capacidade de desenvolvimento da planta em condições
adversas de clima (MENEZES et al., 2009).
A goiabeira (Psidium guajava L.) pertence à família
Myrtaceae, que contém cerca de 102 gêneros e 3024
espécies cultivadas, presente em países de clima tropical e
subtropical. Seus frutos destinam-se ao consumo in natura
ou à indústria (MANICA, 2000).
A propagação da goiabeira ocorre tanto via sexuada,
por meio de sementes, quanto pela via assexuada, por
partes vegetativas. A propagação por meio de sementes é
usada para formação de porta-enxerto, e em trabalhos de
melhoramento genético (MANICA, 2000). A propagação
(Recebido em 11 de maio de 20010 e aprovado em 31 de agosto de 2010)
70
MENEZES, T. P. de et al.
por partes vegetativas é feita pelos métodos de alporquia,
estaquia, enxertia e por cultura de tecidos. No entanto, o
induzem o alongamento dos internódios e o crescimento
de meristemas ou gemas cultivadas in vitro.
enraizamento de estacas de goiabeira é afetado pelo
genótipo, condições fisiológicas da estaca, fatores
Diante desse contexto e dada à importância
comercial da goiabeira, objetivou-se avaliar a influência da
ambientais e grau de lignificação (ZIETEMANN &
ROBERTO, 2007).
sacarose e do GA3 (ácido giberélico) na germinação e no
desenvolvimento in vitro de plântulas de goiabeira ‘Pedro
Plantas desuniformes, oriundas de sementes e as
dificuldades encontradas no enraizamento são fatores que
Sato’.
dificultam a propagação da espécie. Assim, em razão da
escassez de trabalhos publicados envolvendo o cultivo in
vitro da goiabeira, estudos de aditivos aos meios de cultura
são fundamentais para maximizar a taxa de germinação da
espécie e obter plântulas homogêneas e sadias.
Os carboidratos estão dentre os compostos de
reserva com maior proporção nas sementes (CORTE et al.,
2006), sendo fonte de energia e de carbono para suprir o
desenvolvimento inicial da plântula (MARCOS FILHO,
2005).
A sacarose é o carboidrato mais utilizado em
trabalhos de micropropagação (FERREIRA et al., 2002),
sendo empregada para muitas espécies em concentrações
que variam de 20 a 40 g L-1 (NAGAO et al., 1994; REZENDE
et al., 2009). A exemplo do meio de cultura MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962), a concentração utilizada
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de
Cultura de Tecidos Vegetais, do Departamento de
Agricultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA),
Lavras-MG.
Para a execução do experimento foram utilizadas
sementes de frutos de goiabeira ‘Pedro Sato’ colhidos no
pomar da UFLA, previamente selecionados e maduros.
Após a coleta, as sementes foram lavadas em água corrente
para retirada da mucilagem e, em seguida, desinfestadas
em álcool 70% por 1 minuto seguido de hipoclorito de
sódio 50% (1% de cloro ativo). Posteriormente, foram
lavadas por três vezes em água destilada e autoclavada.
As sementes foram inoculadas em tubos de ensaio
contendo 15 mL de meio de cultura JADS (CORREIA, 1993)
adicionando-se ao meio 5,5 g L-1 de ágar, acrescidos de
é de 30 g L-1, e modificações nesse valor podem beneficiar
o cultivo in vitro (REZENDE et al., 2009). Entretanto, sua
GA3 (0,0; 0,25; 0,5; 0,75 e 1,0 mg L-1) e sacarose (0; 15 e 30
ausência provoca em pouco tempo a morte do explante,
pois a sacarose é a fonte de carboidrato para a planta
autoclavagem a 121 ºC e 1,0 atm por 20 minutos. Após a
(COUCEIRO et al., 2001).
O uso de reguladores de crescimento é fundamental
sala de crescimento a 25 ± 2ºC, irradiância média de 42 W
para o sucesso da multiplicação in vitro (SCHWENGBER
et al., 1999). As giberelinas têm papel chave na germinação
de sementes, estando envolvidas na superação da
dormência e no controle de hidrólise das reservas, pela
g L-1). O pH do meio foi ajustado para 5,8 antes da
inoculação, as sementes foram mantidas por 45 dias em
m-2 e fotoperíodo de 16 horas. O delineamento experimental
utilizado foi o inteiramente casualizado, em um fatorial 5x3,
com quatro repetições de três tubos cada.
Foram realizadas avaliações da porcentagem de
germinação, considerando-se germinada a semente que
indução da síntese de á-amilase, enzima responsável pela
hidrólise do amido (LEVITT, 1974).
apresentava radícula protundida, e do índice de velocidade
O equilíbrio entre hormônios, promotores e
inibidores exerce papel fundamental na germinação e no
dias, após a primeira semente germinada. As velocidades
crescimento inicial de plântulas (TAIZ & ZEIGER, 2004).
De acordo com Jacques (1985) e Pires (1998), as giberelinas
velocidade de germinação (IVG), adaptado da fórmula de
de germinação (IVG). A germinação foi avaliada a cada três
de germinação foram determinadas segundo o índice de
Maguire (1962), sendo: IVG = (G1 / N1)+ (G2 / N2) +...+ (Gn /
Sacarose e GA3 na germinação de sementes e no desenvolvimento...
Nn), onde: G1 = número de sementes germinadas na primeira
contagem; N1 = número de dias decorridos até a primeira
contagem; G2 = número de sementes germinadas na
segunda contagem; N2 = número de dias decorridos até a
segunda contagem; n = última contagem.
Avaliaram-se também o número de folhas (por
contagem direta) e comprimento da parte aérea e da raiz
(por meio de régua milimetrada). Os dados obtidos foram
submetidos à análise de variância utilizando-se análise de
regressão com o uso do programa estatístico SISVAR
(FERREIRA, 2000).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As sementes de goiabeira ‘Pedro Sato’ iniciaram a
germinação após 14 dias da inoculação in vitro e, aos 21 dias,
obteve-se a maior porcentagem de germinação (100%), na
ausência de sacarose (Figura 1). Contrapondo os resultados
obtidos por Pereira et al. (2006) com maiores porcentagens de
germinação na presença de 15 g L-1 de sacarose em murmuru
(Astrocaryum ulei Burret). Já Soares et al. (2009), trabalhando
com mangabeira (Hancornia speciosa Gomes), verificaram a
menor porcentagem de sementes germinadas na ausência de
sacarose e GA3 no meio de cultura.
As diferentes concentrações de GA3 não exerceram
influência na germinação das sementes de goiabeira. Santos
et al. (2007), trabalhando com sementes de Cattleya bicolor
Lindl. também não verificaram efeito de GA3 no processo
germinativo. Já Stein et al. (2007), verificaram que não é
necessária a adição de GA3 para a germinação in vitro de
ingazeiro (Inga vera Willd.). No entanto, Pinheiro et al.
(2001) observaram resultado positivo na germinação de
sementes de mangabeira (Hancornia speciosa Gomez)
tratada com ácido giberélico.
O maior IVG (3,71) foi obtido na interação de 30 g L-1
de sacarose e 0,25 mg L-1 de GA3 (Figura 2). O IVG é uma
variável utilizada como indicador do vigor das sementes,
ou seja, a sua habilidade em germinar em condições
adversas (POPINIGIS, 1977). De acordo com Silva et al.
(2009), a velocidade em que o processo de germinação
ocorre é fun damental para a sobrevivência e o
desenvolvimento da espécie, pois diminui o tempo de
exposição da semente às condições adversas e às
intempéries, e a primeira contagem de germinação é um
indicador da velocidade de germinação.
O maior número de folhas (7,9) foi obtido na ausência
de sacarose e na presença de 0,25 mg L-1 de GA3 (Figura 3).
A partir dessa concentração de GA3, ocorreu redução no
número de folhas. Esses resultados são contrários aos
obtidos por Ribeiro et al. (2009) que, trabalhando com copode-leite (Zantedeschia aethiopica L. Spreng), observaram
Porcentagem de germinaçã o
100
75
50
25
0
14
71
21
Dias a pós a inocula çã o in vitro de sementes de goiabeira 'Pedro Sato'
FIGURA 1 – Germinação in vitro de goiabeira ‘Pedro Sato’.
72
maior número de folhas na presença de 37,3 g L-1 de
sacarose e na ausência de GA3.
das plântulas. Resultados semelhantes também foram
observados por Rezende et al. (2009), que verificaram
Maiores comprimentos de parte aérea (4,8 cm) e
de raiz (5,7 cm) foram verificados com 30 g L-1 de sacarose
que o cultivo in vitro de plântulas de Cattleya loddigesii
sp. pode ser realizado com concentração de 30 g L-1 de
e 0,25 mg L-1 de GA3, havendo um decréscimo em
concentrações de GA3 superiores a 0,25 mg L-1 (Figuras 4
sacarose ou com a metade dessa concentração. No
entanto, esse mesmo autor obteve maior comprimento de
e 5, respectivamente). Esses resultados estão de acordo
com Pereira et al. (2006) que, trabalhando com embriões
raiz na ausência de sacarose e GA3. Já, Ribeiro et al. (2009)
rel atam que a sacar ose é fun damen tal par a o
de murmuru (Astrocaryum ulei), constataram que a adição
de 30 g L-1 de sacarose ao meio proporcionou maior altura
desenvolvimento das raízes in vitro, o que também foi
observado neste trabalho.
4
3,5
3
IVG
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
15
30
Concentrações de saca rose (g L-¹) e 0,25 mg L-¹ de GA3
Número de folhas
FIGURA 2 – Índice de velocidade de germinação de goiabeira ‘Pedro Sato’ em diferentes concentrações de sacarose (g
L-1) e 0,25 mg L-1 de GA3.
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
y = -3,3367x2 + 4,4207x + 6,5235 R² = 0,499
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Concentra ções de GA3 (mg L-¹) e a usência de sacarose
FIGURA 3 – Número de folhas em plântulas de goiabeira ‘Pedro Sato’ em diferentes concentrações de GA3 e ausência
de sacarose.
73
Comprimento de parte aérea (cm)
6
5
4
3
2
y = -0,802x + 4,9052 R² = 0,5463
1
0
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Concentrações de GA3 (mg L-¹) e 30 g L-¹ de sacarose
FIGURA 4 – Comprimento de parte aérea (cm) de plântulas de goiabeira ‘Pedro Sato’ em diferentes concentrações de
GA3 e 30 g L-1 de sacarose.
7
Comprimento de raiz (cm)
6
5
4
3
2
y = -2,8084x + 6,0604 R² = 0,7007
1
0
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Concentrações de GA3 (mg L-¹) e 30 g L-¹ de saca rose
FIGURA 5 – Comprimento de raiz (cm) de plântulas de goiabeira ‘Pedro Sato’ em diferentes concentrações de GA3 e 30
g L-1 de sacarose.
CONCLUSÕES
• Maior porcentagem de germinação de sementes
de goiabeira ‘Pedro Sato’ é verificada na ausência de
sacarose.
• Agerminação de goiabeira (Psidium guajava L.) ‘Pedro
Sato’ ocorre em meio JADS, na ausência de sacarose e GA3.
• A interação de 30 g L-1 de sacarose e 0,25 mg L-1
de GA3 promove maior velocidade de germinação em
goiabeira ‘Pedro Sato’.
• O meio JADS contendo 0-30 g L-1 de sacarose e
0,25 mg L-1 de GA3 possibilita maior desenvolvimento in
vitro de plântulas de goiabeira ‘Pedro Sato’.
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766-BENZILADENINE
(BA) AND
GIBERELIC
ACID (GA3) EFFECTS
ESTEVES,
P. F. et al.
ON in vitro DEVELOPMENT OF Selenicereus grandiflorus (L.)
BRITTON & ROSE (CACTACEAE)
EFEITOS DE 6-BENZILADENINA (BA) E ÁCIDO GIBERELICO (GA3) NO
DESENVOLVIMENTO in vitro DE Selenicereus grandiflorus (L.) BRITTON &
ROSE (CACTACEAE)
PATRÍCIA FONTES ESTEVES1; ALICE SATO2; MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3
1
Mestre em Biotecnologia Vegetal - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) - Centro de Ciências e da Saúde – Avenida Carlos
Chagas Filho, s/nº, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Bloco G - 2º andar - Sala G2 050, Cidade Universitária, Ilha do Fundão
- 21941-590 - Rio de Janeiro, RJ - [email protected]
2
Doutora em Biotecnologia Vegetal - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO) – Avenida Pasteur, nº 458 – 4º
andar – Sala 415, Urca - 22290-240 - Rio de Janeiro, RJ - [email protected]
3
Pós-Doutora em Bioeletrogênese - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) - Centro de Ciências e da Saúde – Avenida Carlos
Chagas Filho, s/nº, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Bloco G - 2º andar - Sala G2 050, Cidade Universitária, Ilha do Fundão
- 21941-590 - Rio de Janeiro, RJ - [email protected]
ABSTRACT
Stem segments of Selenicereus grandiflorus (L.) Britton
& Rose were cultured on MS medium supplemented with
different concentrations of 6-benziladenine (BA) and gibberelic
acid (GA3) with the objective to investigate the effects on plant
organogenesis and rhizogenesis. Cultures treated with BA in
concentrations of 0.22 or 0.88 mM, induced mean production of
9 and 10 shoots/explant in 29.0 and 32.3% of explants,
respectively in 30 days of culture; while in 75 days of culture,
58.1 and 48.4% of explants developmented 28 and 21 shoots/
explant. Regenerated shoots rooted within 30 days of culture in
100% of explants. The treatment with GA3 at 0.29 or 0.88 mM,
induced mean production of 9 and 5 shoots/explant with shoots
percentage of 19.6 and 9.5, respectively, in 30 days of culture.
However in 75 days of culture, the addition of GA3 did not
produce effect on shoots production. The application of GA3
did not induce significant effect on roots development, besides
inhibited its elongation.
Index terms: Cacti, Tissue culture, Growth regulators.
RESUMO
Segmentos caulinares de Selenicereus grandiflorus (L.)
Britton & Rose foram cultivados em meio MS, suplementados
com diferentes concentrações de 6-benziladenina (BA) e ácido
giberélico (GA3), a fim de verificar seus efeitos na organogênese
de brotos e raízes. As culturas tratadas com BA nas concentrações
de 0,22 ou 0,88 mM, em 30 dias de cultura, induziram produção
média de 9 e 10 brotos/explante em 29,0 e 32,3% dos explantes,
respectivamente, enquanto em 75 dias de cultura, 58,1% e 48,4%
dos explantes desenvolveram 28 e 21 brotos/explante. A rizogênese
foi de 100% em 30 dias de cultura. O tratamento com GA3, 0,29
ou 0,88 mM promoveu, em 30 dias de cultura, produção média
de 9 e 5 brotos/explante, com porcentagem de brotamento de
19,6 e 9,5%, respectivamente. Entretanto, em 75 dias de cultura,
a adição de GA3 não produziu efeito na produção de brotos. O
ácido giberélico não promoveu desenvolvimento significativo das
raízes, além de inibir o alongamento destas.
Termos para indexação: Cactus, Cultura de tecidos, Reguladores
de crescimento.
INTRODUCTION
Selenicereus grandiflorus (L.) Britton & Rose
(Cactaceae), native of Mexico and West Indies, is a
creeping and fleshy plant. In Brazil, it is known by the
name of night-blooming cereus because its flowers expand
at night and exhale a vanilla-like odor. The cladodes are
therapeutically used in asthenia, bronchitis, chronic
asthma, hemorrhoids cases and possess diuretic action,
besides they have been utilized in cardiac diseases
treatment (CORRÊA et al., 1998).
In general, succulent plants present slow growth
and it can impose limitation in their reproductive capacity.
The tissue culture is an efficient method for propagation
of them, because it allows a fast and continuous production
of new plants.
Cacti are commonly propagated by seeds or
cuttings, but these methods show many disadvantages.
Seeds present low germination rates and are difficult to be
obtained due to self -incompatibility (BOYLE, 2003). The
tissue culture allows fast multiplication from little plant
(Recebido em 17 de dezembro de 2008 e aprovado em 21 de outubro de 2010)
6-Benziladenine (Ba) and Giberelic Acid (Ga3) Effects...
material and provokes low impact on wild populations,
and it is also a potential method for ex situ conservation of
genetic diversity (GIUSTI et al., 2002).
This method has been showed adequate for several
members of Cactaceae family (MAUSETH, 1979; ESCOBAR
et al., 1986; HUBSTENBERGER et al., 1992; DEOLIVEIRA
et al., 1995; MALDA et al., 1999; ESTRADA-LUNA et al.,
2002; PELAH et al., 2002) using different explant sources:
apex of plantlets (AULT & BAGAMON, 1985; SMITH et
al., 1991; PELAH et al., 2002), pith excised from stem tissue
of plants growing in nature (JOHNSON & EMINO, 1979),
shoot tips of mature plants (CLAYTON et al., 1990), roots
(BHAU, 1999) and explants with areoles (RAMIREZMALAGON et al., 2007).
Particularly for cactus, it has been observed that in
vitro plants show fast growth and produce significant
number of new shoots. Rodriguez & Rubluo (1993) showed
that Aztekium ritterii Boed., a cactus of slow growth,
produced 5-7 new shoots after 11 months of culture, while
ex vitro specimens did not produce new shoots.
Mammillaria woodsii Craig obtained from seeds needed
at least one year to reach the same size than regenerated
plants, which needed of few months of culture (VIZKOT
& JARA, 1984). Comparable observations were showed
for Neomammillaria prolifera (Mill.) Britton & Rose
(MINOCHA & MEHRA, 1974) and Cephalocereus senilis
(Haw.) Pfeiff (BONNES et al, 1993).
Many different media and hormones have been
tested for cactus propagation, especially the interaction
of auxins and cytokinins, but the response is different for
each cactus species (GIUSTI et al., 2002). It has been
suggested that each species might require a specific
hormone combination (JOHNSON & EMINO, 1979; GIUSTI
et al., 2002; RUBLUO et al., 2002). However, studies point
out that an exogenous cytokinin is required to obtain in
vitro proliferation, while auxins are not strictly necessary
(RUBLUO et al., 2002). In this study we analyzed the
morphogenetic responses in relation to the growth
regulators influence on organogenesis and rhizogenesis
of in vitro stem segments of S. grandiflorus.
77
MATERIALAND METHODS
In vitro culture establishment.
Stem segments of S. grandiflorus were washed with
water containing a few drops of 2% neutral commercial
detergent (15 min), rinsed in sterile distilled water, followed
by immersion in 50% commercial bleach (3% sodium
hypochlorite, 15 min), rinsed in sterile distilled water,
washed in 70% ethanol (10min) and finally washed three
times (2min each) in sterile distilled water. This process
was realized at flow chamber.
After sterilization process, the stem segments were
isolated and transferred to solid medium (20 mL), consisting
of full-strength MS salts and vitamins (MURASHIGE &
SKOOG, 1962), 30 gL-1 sucrose, without growth regulators.
This medium was named MS0 (control medium).The pH
was adjusted for 5.8, solidified with 8 gL-1 of agar and
sterilized in autoclave at 120°C for 15min.
The cultures were incubated in a growth room at
25+2°C with a 16-h photoperiod under irradiance of 23.0
mmoles of photon m-2 s-1 for 90 days.
Growth regulators treatments
After three months of culture, stem segments (1cm)
from MS0 were transferred to MS medium (50 mL)
supplemented with 6-benziladenine (BA: 0.22, 0.44 or 0.88
M) and gibberelic acid (GA3: 0.29 or 0.88 mM). Each
treatment was replicated five times and 40 explants were
used.
Statistical analysis
Growth regulators effects were determined
according to shoots number, the higher length of shoot
and root, shoots production and rhizogenesis percentage.
Each fifteen days were measured the shoot and root
production, during 75 days. The obtained results were
analyzed by ANOVA and the means were compared by
Tukey test at the 0.05 level of significance. The difference
between percentage test (p1 and p2) was applied in the
comparative study of shoots production and rhizogenesis
percentage, at the 0.05 level of significance, using Statistic
for Windows TM, version 5.0.
78
ESTEVES, P. F. et al.
The sterilization protocol utilized was efficient and
mean of 1.3 shoots/explant only in E. minima. Kinetin
(KIN) at high concentration (23.23 mM) with low
none contamination was observed after 30 days of culture
(Figure 1A).
concentration of NAA (0.05 mM) induced mean of 10.2
shoots/explant in P. aselliformis; low concentrations of
Due to the culture multiplication capacity in
different concentrations of BA, the shoots number
KIN induced less or none axillary shoots formation (GIUSTI
et al., 2002). In disagreement with these studies, Bhau (1999)
developed in 30, 45, 60 and 75 days of culture was
determined. After 30 days of culture, the explants cultivated
sh owed th at KIN an d BA alon e did n ot induce
morphogenetic response in culture of Coryphantha
in 0.22 and 0.88 mM of BA showed significantly higher
shoots production (9 and 10 shoots/explant, respectively)
elephantidens (Lem.) Lem.. The maximum shoots
production (1.6 shoots/explant) was obtained on medium
when compared to MS0 (3 shoots/explant) (Table 1). After
75 days of culture, the media supplemented with BA (0.22;
with 2.2mM 2.4-D and 4.6 mM KIN. Nikam (1997) also
demonstrated that high concentrations of KIN reduce the
0.44 and 0.88 mM) induced production of 28, 19 and 21
shoots/explant, respectively, but these results did not show
number of shoots/explant, and BA was also inefficient on
Agave sisalana Per. shoots production. These results were
statistic difference in relation to MS0.
Similar results were obtained by Ruvalcaba et al.
similar for A. cantala Roxb. and A. fourcroydes Lem. (BINH
et al., 1990).
(1999), studying Agave parrasana Berger cultures. When
BA was not added to the medium, shoots production was
In the Cactaceae family, interaction of auxins and
cytokinins for in vitro regeneration is well documented
imperceptible (0.1 shoot/explant), however when BA (13.3
to 53.2 mM) was added to the medium, the shoots
(HUBSTENBERGER et al., 1992) however the authors
showed that an exogenous cytokinin is necessary to obtain
production increased (25 shoots/explant).
The efficiency of cytokinins on shoots proliferation
shoot proliferation moreover auxins are not required. On
the other hand, Rubluo et al. (2002) demonstrated a linear
was also observed in Escobaria minima (Baird) D. Hunt,
Mammillaria pectinifera (Ruempler) F.A.C.Weber and
positive correlation between auxin concentration and
shoots proliferation. The same results were obtained for
Pelecyphora aselliformis Ehrenberg cultures. The higher
BA concentration (22.2 mM) induced mean of 3 shoots /
Echinocereous spp. and Opuntia polycantha Haw.
(MAUSETH & HALPERIN 1975; HUTABARAT, 1986),
explant, while the lower concentration (0.44 mM) induced
which demonstrate that morphogenetic responses are
FIGURE 1 – Micropropagation of S. grandiflorus from stem segments. (A) Axillary shoots development on MS0
medium (arrow). (B) Proliferation of shoots obtained with 0.22�M BA (bar = 1 cm).
singular for each cactus specie (JOHNSON & EMINO, 1979;
CLAYTON et al., 1990).
In relation to shoots production percentage, after
30 days of culture, the media containing BA (0.22 and 0.88
mM) induced greater shoots production percentage (29.0%
and 32.3%, respectively) while MS0 showed 5.7% of shoots
production percentage (Figure 1B). However, after 75 days
of culture, BA addition (58.1; 42.9 and 48.4%) did not induce
better results than MS0 (38.5%) (Table 1).
The positive effect of BA on shoots production
confirms the BA efficiency on multiplication of many
species and it may be the perfect cytokinin for aerial parts
79
explants did not showed respon se for in vitro
multiplication (MACHADO & PRIOLI, 1996).
In 30 days of culture, the addition of GA3 induced mean
production of 9 and 5 shoots/explant, while MS0 induced 3
shoots/explant (Table1). However after 75 days of culture, MS0
induced higher shoots production than the media with GA3
and it can also be observed on shoots production percentage,
where the medium supplemented with 0.29 and 0.88 mM
GA3 showed 20.0 % and 14.6 %, respectively (Table 1).
Shoot elongation
In regeneration of Cereus peruvianus (L.) Mill. from
callus culture, lateral explant in medium with auxins (IAA
The shoots elongation was significantly greater (0.8
and 0.9 cm, respectively) in the media supplemented with
0.22 and 0.88 mM BA than MS+0.44 mM BA (0.3 cm), after
30 days of culture. In 75 days of culture, plants cultivated
in MS0 did not show difference to plants submitted to BA
(Table 2). Exogenous GA3 did not promote effects on shoots
elongation (Table 2) but rather inhibited it. Although
gibberellins have been reported to promoted growth of
shoot and root, cell division and cell elongation were not
distinguished (SPONSEL &HEDDEN, 2004). This
suggested that the stem segments contains enough
gibberellins to support elongation growth and that
and NAA) and cytokinins (BA and Kinetin) showed
positive results on shoots regeneration, while apical
exogenous addition of GA3 results in a supra–optimal
concentration of this growth regulator in the segment.
multiplication and axillary shoots induction. It is important
to jut out the influence of concentration on success in
vitro multiplication (TORRES & CALDAS, 1990).
Other authors also observed positive effect of BA
(0.44 – 44 mM) in Opuntia polyacantha Haw., O. amyclaea
Ten. and Mammillaria spp. cultures (MAUSETH &
HALPERIN, 1975; MAUSETH, 1979; ESCOBAR et al.,
1986).
TABLE 1 – Effect of 6-benziladenine (BA) and giberelic acid (GA3) on the morphogenetic response of stem segments
from Selenicereus grandiflorus for 30 and 75 days of culture. The values represent mean + standard deviation and
percentage (n=40/treatment).
Growth
regulators
Concentration
(�M)
Shoots production
(%)
30 days
b
75 days
30 days
30 days
75 days
28 + 0.96
100
b
100 b
19 + 0.90
100 b
100 b
21 + 0.70
100
b
100 b
0.22
29.0
BA
0.44
11.4 a
42.9 a
BA
0.88
32.3
b
a
GA3
0.29
19.6 a
20.0 b
9 + 0.39 *
9 + 0.42
84.8 b
88.9 b
GA3
0.88
9.5 a
14.6 b
5 + 0.40 *
6 + 0.52
64.3 a
82.9 b
5.7 a
38.5 a
3 + 0.47
24 + 0.79 **
40.4 a
66.7 a
48.4
9 + 0.23
75 days
*
Roots formation (%)
BA
Control
58.1
a
Shoots/explant
Mean ± standard deviation
4 + 0.46
10 + 0.32
**
* P < 0.05. ** P < 0.01 (Tukey‘s test). Values with different letters are significantly different from each other at a 5% level
by difference between percentage tests.
80
TABLE 2 – Effect of 6-benziladenine (BA) and giberelic acid (GA3) on shoots and roots length of S. grandiflorus in 30
and 75 days of culture. The values represent mean + standard deviation. (n=40/treatment).
Growth
regulators
Concentration
(�M)
Shoot length (cm)
Roots length (cm)
30 days
75 days
30 days
75 days
BA
0.22
0.8+0.2*
1.6+0.94
3.1+1.24**
7.6+0.97**
BA
0.44
0.3+ 0.11
1.7+0.81
1.3+0.65
4.7+0.86
BA
0.88
0.9+0.3*
2.4+0.97
4.0+1.22 **
11.5+1.02**
0.5+0.15
2.1+ 0.72
1.6+0.79
1.5+0.15
1.7+0.30
3.7+0.81
Control
GA3
0.29
0.1+0.04
GA3
0.88
0.1+0.04
1.0+0.11
1.5+0.30
1.7+0.19
Control
0.1+0.04
* P < 0.05. ** P < 0.01 (Tukey’s test).
1.6+ 0.13
3.1+1.1**
4.8+0.95**
Like the results of our study, KIN was responsible for
the fast growth of Mammillaria pectinifera F.A.C. Weber and
Pelecyphora aselliformis Ehrenberg; shoots reached height
of 1.8 to 2.5 cm (GIUSTI et al., 2002). Nikam (1997) showed the
same result in Agave sisalana culture, where shoots cultivated
with 0.93 to 6.98 mM KIN attained height of 1 cm in 35 days of
culture. Differently, Bhau (1999) showed that shoots in medium
supplemented with 2.2 µM 2.4-D and 4.6 mM KIN attained
height of 3.4 cm in 28 days of culture; the shoots production
was not observed in medium supplemented with kinetin or BA
alone. To reach this production, the balance between cytokinins
and auxins was necessary.
2.2+0.21
culture the medium MS+ 0.88 M BA induced roots with higher
length reaching an average of 11.5 cm after 75 days (Table 2).
The medium supplemented with 0.29 mM GA3,
induced the greater rooting in 30 and 75 (84.8 and 88.9 %,
respectively) days of culture (Table 1). Meanwhile, addition
of GA3 inhibited the roots length (Table 2).
For rooting stage it is also commonly used a
dilutions of salt concentrations of culture medium.
Therefore Cereus jamacaru presented higher root number
and root elongation on MS 25% additioned of 2.0 mg.L-1
IBA (OLIVEIRA et al., 2008).
CONCLUSION
Rooting
To promote rooting in cactus, MS without growth
regulators has usually been used (NIKAM, 1997;
RUVALCABA et al., 1999; GIUSTI et al., 2002; RUBLUO et al.,
2002). However, to S. grandiflorus stem explants exogenous
BA concentrations utilized were more efficient on rooting
induction when compared to control medium. They induced
rooting on 100% of explants in 30 days, while the plants
cultivated in MS0 attained the greater rooting perceptual (66.7)
only after 75 days of culture (Table 1). Since the beginning of
The BA addition on culture medium showed significant
effect on roots development as well as on shoots production
and elongation of shoots and roots in 30 days of culture.
Media supplemented with GA3 stimulated shoots
production but did not induce significative elongation.
BA was also efficient on roots development, and medium
enriched with 0.88mM BA induced greater elongation while
GA3 inhibited roots elongation.
The present results suggest that cytokinins may
be involved in in vitro morphogenetic response of cactus
and confirm that each cactus species show specific
response to different growth regulators.
ACKNOWLEDGEMENTS
81
ESTRADA-LUNA, A. A.; LÓPEZ-PERALTA, C.;
CÁRDENAS-SORIANO, E. In vitro micrografting and the
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prickly pear cactus (Opuntia spp). Scientia Horticulturae,
Amsterdan, v. 92, p. 317-327, 2002.
The authors wish to acknowledge CNPq/PIBIC/
UNIRIO and FAPERJ for financial support.
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LUZ NATURAL
E SISTEMAS
DE VEDAÇÃO
NA
Luz natural e sistemas
de vedação na propagação
in vitro...
PROPAGAÇÃO in vitro DE CRISÂNTEMO CV. RAGE:
ALTERAÇÕES ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS
83
NATURAL LIGHT AND SEAL SYSTEMS ON in vitro PROPAGATION OF
CHRYSANTHEMUM CV. RAGE: ANATOMICAL AND PHYSIOLOGICAL ALTERATIONS
FRANCYANE TAVARES BRAGA1, MOACIR PASQUAL2, EVARISTO MAURO DE CASTRO3,
SAMANTHA LÉA DIGNART4, GABRIEL COIMBRA RAFAEL5, CLAUDINÉIA FERREIRA NUNES6
1
Doutora em Agronomia/Fitotecnia - Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais EPAMIG - Núcleo Tecnológico Uva e
Vinho - 37780-000, Caldas, MG - [email protected]
2
Professor - Departamento de Agricultura - Universidade Federal de Lavras - Caixa Postal 3037 - 37200-000 - Lavras, MG [email protected]
3
Professor - Universidade Federal de Lavras - Caixa Postal 3037 - 37200-000 - Lavras, MG - [email protected]
4
Mestre em Agronomia/Fisiologia Vegetal - Instituto Educacional Matogrosense - UNIVAG - 78118-900, Várzea Grande, MT [email protected]
5
Graduando em Engenharia Florestal - Universidade Federal de Lavras - Caixa Postal 3037 - 37200-000 - Lavras, MG [email protected]
6
Doutora em Agronomia/Fitotecnia - Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais/EPAMIG - Núcleo Tecnológico Uva e
Vinho - 37780-000 - Caldas, MG - [email protected].
RESUMO
Conduziu-se este trabalho, com o objetivo de avaliar o
efeito de dois ambientes de cultivo: (sala de crescimento e casa de
vegetação com sombrite 50%) e de dois sistemas de vedação de
frascos: (tampa convencional e tampa com ventilação) na
propagação in vitro de crisântemo. Os explantes constituíram-se
de segmentos nodais cultivados in vitro contendo uma gema. Foi
utilizado o meio MS, acrescido de 15 g L-1 de sacarose. Após 60
dias de cultivo, para todas as variáveis fitotécnicas analisadas
(número de folhas, brotos e raízes e comprimento da parte aérea
e comprimento da maior raiz) constatou-se como, o melhor
ambiente de cultivo, a casa de vegetação, associado ao sistema
vedação com ventilação. Quanto aos aspectos anatômicos, para
densidade estomática o melhor resultado foi obtido em casa de
vegetação com a utilização do sistema de vedação. Para diâmetros
polar e equatorial dos estômatos, casa de vegetação e vedação
convencional foram mais eficientes. A espessura do mesofilo
mostrou-se maior em casa de vegetação e vedação convencional.
Termos para indexação: Fotoautotrofia, micropropagação,
anatomia vegetal, Dendranthema grandiflorum
ABSTRACT
The objective of the present work was to evaluate the
effects of two environments (growth room and greenhouse with
50%) and two seal systems (conventional and ventilated seal).
Explants were made of nodal segments of chrysanthemum with
one bud cultivated in vitro. MS medium supplemented with 15 g
L-1 sucrose was used. After 60 days of culture, for all the analyzed
variables such as number of leaves, sprouts and roots, shoot
length and length of the biggest root, the best culture environment
was observed in greenhouse, under ventilated seal system. For
stomatal density, the best result was obtained in greenhouse
using ventilated seal system. For stomatal diameters, greenhouse
and conventional seal revealed to be more efficient. Mesophyl
thickness was higher in greenhouse and conventional seal.
Index terms: photoautotrophy, micropropagation, plant
anatomy, Dendranthema grandiflorum
INTRODUÇÃO
O sistema de propagação in vitro fotoautotrófica
representa um tipo de cultivo caracterizado por fornecer
condições ambientais com aumento na disponibilidade de
CO2 e nos níveis de radiação, bem como redução na
umidade relativa dentro dos frascos, induzindo a
fotossíntese e conferindo capacidade de crescimento e
multiplicação das plantas em meios sem ou com reduzida
suplementação orgânica (GEORGE, 2008).
Por outro lado, o uso da luz natural em substituição
à luz artificial comumente observada em salas de
crescimento, permite expandir o uso da micropropagação
em escala comercial na produção in vitro de crisântemo,
diminuindo o custo das mudas, cujo gasto com energia
elétrica em salas de crescimento é um dos fatores mais
onerosos (DIGNART et al, 2009).
(Recebido em 19 de maio de 2010 e aprovado em 11 de novembro de 2010)
84
BRAGA, F. T. et al.
Uma alternativa viável seria o cultivo in vitro em
ambiente de luz natural. Essa tecnologia não é muito adotada
por não estarem esclarecidos seus efeitos sobre as culturas
que, convencionalmente, são condicionadas em luz artificial,
com intensidades luminosas inferiores e com fotoperíodo e
temperatura controlada (ERIG & SCHUCH, 2005).
Algumas técnicas e metodologias têm sido
desenvolvidas com o objetivo de fornecer condições
ambientais que promovam a capacidade fotossintética do
material micropropagado e favoreçam a aquisição de
fotoautotrofia in vitro. Como exemplo tem-se a utilização
de filtros de membranas com microporos permeáveis a
gases, que promovem aumento na transferência destes
entre o recipiente de cultivo e o ambiente externo, sendo a
atmosfera ao redor do recipiente mantida sob
concentrações normais de CO2 (sistema de ventilação
natural) ou enriquecida com CO2 (sistema de ventilação
forçado), e a utilização de maior densidade de fluxo de
fótons fotossinteticamente ativos (DFFFA) por meio da
iluminação natural (DECCETTI et al., 2008).
Alguns trabalhos têm demonstrado que a
micropropagação fotoautotrófica, ou seja, na ausência
de sacarose e aumento de irradiação, tem apresentado
algumas vantagens, quando comparada aos sistemas
convencionais de micropropagação (ROCHA et al., 2007;
COSTA et al., 2009; BRAGA et al., 2009). Isso porque
promove maior crescimento e desenvolvimento in vitro,
diminuindo o nível de contaminação; simplifica os meios
de cultura, uma vez que permite a retirada de certos
reguladores de crescimento e compostos orgânicos e
promove rápido e vigoroso desenvolvimento das plantas
durante a aclimatização (SILVA et al, 2008).
A eliminação total de uma fonte de carbono do meio
de cultura deve ser questionada em algumas situações,
uma vez que o processo de hiper-hidricidade ou vitrificação
pode ser provocado em função do alto potencial hídrico
do meio de cultura, o que disponibiliza mais facilmente
água para os explantes (HAZARIKA, 2006).
Diante dessas considerações, neste estudo, objetivouse avaliar um sistema de vedação para frascos que permite
troca de gases do recipiente de cultivo com o meio externo,
bem como o uso de luz natural como fonte de irradiação
luminosa na propagação in vitro de crisântemo cv. Rage.
MATERIAL E MÉTODOS
O material vegetal utilizado constituiu-se de
propágulos de crisântemo cv. Rage já estabelecidos in vitro,
dos quais foram retirados segmentos nodais contendo uma
gema e inoculados em meio MS (MURASHIGE & SKOOG,
1962) com adição de 15 g L-1 de sacarose e 5 g L-1 de ágar.
O pH do meio foi ajustado para 5,8, antes da autoclavagem
a 121ºC e 1,2 atm durante 20 minutos.
O experimento foi conduzido em dois ambientes de
luz: 1) casa de vegetação (CV), onde os frascos foram
colocados diretamente sobre as bancadas sob proteção
adicional de sombrite com 50% de retenção da radiação solar
e 2) sala de crescimento convencional (SC), com fotoperíodo
de 16 horas, temperatura de 25 ± 2ºC e DFFA de 45,5 W m-2,
fornecida por lâmpadas brancas fluorescentes.
Os frascos foram vedados com tampas convencionais
de polipropileno e tampas provenientes da Samavidros®,
modelo BioSama. Tais tampas possuem um orifício de borracha
com furo de 1 mm de diâmetro preenchido com algodão
hidrofílico e um filtro millipori com porosidade de 22 µm,
permitindo trocas gasosas dentro dos recipientes.
A radiação dentro da casa de vegetação foi avaliada,
com a utilização de um sensor de radiação (LI-200SA, Li-cor,
Lincoln, Nevasca, USA) acoplado a um sistema de registro
(LI 1400; Li-cor.Neb), a cada meia hora, durante 12 horas
(das 06:00 às 18:00 horas). O valor médio de radiação recebida
no ambiente casa de vegetação foi de 99,43 W m-2.
Após 60 dias de cultivo, foram avaliadas
características fitotécnicas e anatômicas.
Como características fitotécnicas avaliou-se o número
de folhas e raízes por propágulo e comprimento da parte
aérea e de raízes. Para os estudos anatômicos, seguiu-se o
protocolo definido por Kraus & Arduin (1997), avaliando-se
a espessura dos tecidos do limbo foliar. Em relação às
características paradérmicas avaliou-se número de
estômatos/mm2 e diâmetro polar e equatorial dos mesmos,
de acordo com a técnica descrita por Laboriau et al. (1961).
Luz natural e sistemas de vedação na propagação in vitro...
O experimento foi montado em delineamento
inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 2
(ambiente de luz) x 2 (Tampas), totalizando quatro
tratamentos, com 10 repetições. Cada qual composta por
um frasco contendo cinco segmentos nodais.
Os dados foram submetidos ao programa SISVAR
5.0 (FERREIRA, 2000), para a realização das análises de
variância. As médias foram comparadas pelo Teste de Tukey
a 5% de probabilidade.
Os resultados não foram significativos para a
interação dos fatores ambiente de luz e sistema de vedação.
Para ambiente de luz, foram observadas diferenças
significativas para todas as variáveis , exceto número de
brotações, onde o melhor resultado foi apresentado pelo
ambiente casa de vegetação (Tabela 1).
Quanto ao sistema de vedação, houve diferenças
significativas apenas para as variáveis, número de folhas e
comprimento de raízes, sistema de vedação com ventilação
natural proporcionou os maiores resultados (Tabela 1).
Contrariando os resultados obtidos neste trabalho
com o uso de maior irradiância em casa de vegetação,
Kanechi & Ochi (1998) trabalhando com Brassica oleracea
L., avaliaram diferentes condições de cultivo in vitro, a
fotomixotrófica e a fotoautotrófica e observaram que baixas
intensidades de irradiância e sistema de vedação com
ventilação natural promoveram maior área foliar, bem como
maior massa de raízes e brotos nos propágulos.
85
Uma das formas de facilitar o processo de
aclimatização de propágulos cultivados in vitro seria
aumentar a intensidade luminosa, promovendo a
fotossíntese e melhorando as relações hídricas. Ibaraki &
Nozaki (2005) afirmam que se houver necessidade de
desenvolver capacidade fotossintética nos tecidos, um dos
fatores mais importantes que devem ser considerados é o
ambiente de luz, especialmente a intensidade.
O emprego de luz natural é uma forma de aumentar
a irradiância no ambiente de cultivo in vitro. A alta
irradiância altera a divisão celular, a diferenciação do
mesofilo e o desenvolvimento de estômatos na lâmina foliar
(ERIG & SCHUCH, 2005).
O aumento dos níveis de irradiância durante o
crescimento in vitro e a concentração de CO2 no interior
dos frascos, são fatores críticos na promoção de altas taxas
fotossintéticas em plantas cultivadas em condições
fotoautotróficas (SILVA et al., 2008). Por outro lado, a fixação
de carbono pelas folhas desenvolvidas in vitro em meios
sem adição extra de sacarose é insuficiente para que ocorra
um crescimento autotrófico, principalmente após
transferência para aclimatização, sendo necessária uma
adição desse carboidrato ao meio de cultura (GEORGE, 2008).
Observou-se que as folhas de crisântemo cv. Rage
são do tipo hipoestomática, apresentando estômatos do
tipo anomocíticos, com células-guardas de formato elíptico,
e grande quantidade de tricomas tectores multicelulares
não ramificados em toda a extensão da superfície abaxial
(Figura 1).
TABELA 1 – Número de folhas (NF), comprimento de parte aérea (CPA), número de raízes (NR), comprimento da maior
raiz (CR) e número de brotações (NB), de propágulos de crisâtemo cv. Rage, cultivado em diferentes ambientes de luz
e sistemas de vedação.
AMBIENTE DE LUZ
NF
CPA (cm)
NR
CR (cm)
NB
Casa de vegetação
27,85a
7,36a
15,32a
13,57a
2,62a
Sala de crescimento
20,32b
6,21b
11,27b
10,11b
2,27a
SISTEMA DE VEDAÇÃO
NF
CPA (cm)
NR
CR (cm)
NB
Ventilação natural
26,55a
6,92a
13,95a
10,99b
2,57a
Convencional
21,62b
6,61a
12,65a
12,68a
2,32a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
86
BRAGA, F. T. et al.
FIGURA 1 – Fotomicrografias da superfície abaxial de folhas de crisântemo. SC = sala de crescimento; CV = casa de vegetação;
V = sistema de vedação com ventilação e N = sistema de vedação convencional. Barra = 25µm. UFLA, Lavras, MG, 2009.
Ocorreu interação significativa entre os fatores
ambiente de luz e sistema de vedação para as variáveis, número
de estômatos e diâmetro polar. Para diâmetro equatorial, não
foi observada interação entre os fatores (Tabela 2). Maior
número de estômatos foi verificado com a interação de casa
de vegetação com sistema de vedação com ventilação natural.
O aumento no número de estômatos sob maiores
níveis de irradiância e ventilação natural demonstra que
plantas cultivadas in vitro têm tendência semelhante à de
plantas cultivadas em outros ambientes, que é de aumentar a
frequência de estômatos sob maior disponibilidade de luz e
CO2. Maior número de estômatos em plantas cultivadas in
vitro, quando comparadas a plantas cultivadas em ambientes
naturais, tem sido reportado em diversos estudos que têm
associado esse aumento, principalmente, à alta umidade relativa
dentro dos frascos (KHAN et al., 2003; COSTA et al., 2009).
Os estômatos das folhas que se desenvolveram em
casa de vegetação apresentaram formato elíptico e mostraramse maiores em sistema de vedação convencional. Os
desenvolvidos em casa de vegetação com ventilação natural
apresentam-se menores e de formato elíptico (Figura 1).
TABELA 2 – Número de estômatos, diâmetros polar e
equatorial dos estômatos de folhas de propágulos cultivados
sob diferentes ambientes de luz (sala de crescimento-SC e
casa de vegetação-CV) e sistema de vedação com ventilação
natural e convencional.
Número de Estômatos (mm2)
CV
SC
Ventilação
163,54aB*
150,96aA
Convencional
91,74bA
141,34aA
Diâmetro polar (µm)
CV
SC
Ventilação
49,45aB
39,15bA
Convencional
56,81aA
41,54bA
Diâmetro equatorial (µm)
CV
39,09a**
SC
29,13b
Ventilção
Convencional
34,08a
34,14a
* Letras minúsculas correspondem às colunas e letras
maiúsculas às linhas.
**Letras iguais não diferem entre si, pelo teste de Tukey,
a 5% de probabilidade.
87
TABELA 3 – Número de estômatos, diâmetros polar e equatorial dos estômatos de folhas de propágulos cultivados sob
diferentes ambientes de luz (sala de crescimento-SC e casa de vegetação-CV) e sistema de vedação com ventilação natural
e convencional.
CV
SC
EAba (µm)
24,00a
20,40b
EAda (µm)
31,95a
27,50b
PE (µm)
110,70a
89,10b
PP (µm)
55,80a
33,50b
* Letras minúsculas correspondem às colunas e letras maiúsculas às linhas.
**Letras iguais não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Maior diâmetro polar foi verificado em estômatos de
propágulos cultivados em casa de vegetação com vedação
convencional. Quanto ao diâmetro equatorial, não houve
interação significativa entre os fatores estudados, tendo
sido observada diferença apenas para o ambiente de luz. Os
maiores resultados foram observados em casa de vegetação.
Alguns trabalhos demonstraram que a presença de
uma fonte de carboidrato no meio, bem como o acúmulo de
etileno no interior do frasco e, principalmente, a alta umidade
relativa nos recipientes vedados convencionalmente
resultam no desenvolvimento anormal dos estômatos e na
reduzida capacidade de fechamento destes em resposta às
condições severas do ambiente natural, como, por exemplo,
a demanda evaporativa das plantas em ambientes ex vitro
(DECETTI et al., 2008; ROCHA et al., 2007; BRAGA et al.,
2009; COSTA et al., 2009).
A funcionalidade dos estômatos sob diferentes
condições de cultivo, condições estas que se aproximem do
ambiente natural, pode impedir a excessiva dessecação das
plantas micropropagadas após o transplantio, aumentando
as taxas de sobrevivência durante o processo de aclimatização.
Não houve interação entre os fatores estudados para
o espessamento das epidermes abaxial e adaxial, bem como
para os parênquimas paliçádico e esponjoso (Tabela 3 e 4).
Analisando-se os ambientes de cultivo separadamente,
observaram-se diferenças significativas.
Para as epidermes abaxial e adaxial e os parênquimas
paliçádico e esponjoso, a maior espessura foi observada
em folhas de propágulos mantidos em casa de vegetação.
Para o sistema de vedação, foram observadas
diferenças significativas apenas para as variáveis, epiderme
abaxial e parênquima esponjoso. As demais não diferiram
significativamente entre si. Porém, os maiores valores, foram
obtidos em sistema de vedação convencional.
Em todas as condições de cultivo, as epidermes
apresentaram apenas uma camada de células (epiderme
uniestratificada) que não apresentaram um formato definido,
sendo revestidas por uma fina camada de cutícula. O
mesofilo, nos dois ambientes de luz, mostrou-se dorsiventral,
apresentando parênquima paliçádico na face superior
(adaxial) e parênquima esponjoso na face inferior (abaxial).
O parênquima paliçádico apresentou apenas uma camada
de células, com células de formato indefinido e arranjadas
desorganizadamente, o parênquima esponjoso mostrou
células também desuniformes e espaçadas (Figura 2).
O aumento na espessura da folha e células paliçádicas
mais alongadas constituem um padrão clássico de resposta e
de adaptação das plantas à alta intensidade de luz e evidenciam
a plasticidade adaptativa da planta. A capacidade de alterar a
estrutura da folha em resposta ao ambiente, principalmente
ao nível de irradiância, tem sido comumente observada em
diversas espécies cultivadas in vitro (LEE et al., 2000; SILVA
et al., 2008; BRAGA et al., 2009; COSTA et al., 2009).
Os resultados deste trabalho demonstram que
diferentes ambientes de cultivo, principalmente diferentes
níveis de irradiância, podem modificar o desenvolvimento
da folha in vitro, tornando a anatomia desta mais semelhante
à das plantas cultivadas em ambiente in vivo. Dessa maneira,
o aumento na capacidade fotossintética de crisântemo em
estágios do desenvolvimento in vitro, principalmente sob
alta irradiância, pode estar associado ao maior
desenvolvimento das características estruturais relacionadas
ao processo fotossintético, como a maior diferenciação do
mesofilo, principalmente do parênquima paliçádico.
88
BRAGA, F. T. et al.
TABELA 4 – Espessura dos tecidos epidérmicos e dos parênquimas paliçádico e esponjoso de folhas crisântemo
desenvolvido durante cultivo in vitro sob ambiente de casa de vegetação (CV) e sala de crescimento (SC).
EAba (µm)
EAda (µm)
PE (µm)
PP (µm)
Ventilação
19,95b
Convencional
24,45a
29,10a
85,85b
44,45a
30,45a
112,95a
44,85a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% probabilidade.
FIGURA 2 – Fotomicrografias de cortes transversais de folhas de crisântemo desenvolvidas durante o cultivo in vitro
sob SC = sala de crescimento; CV = casa de vegetação; V = ventilação natural e N = convencional. Barra = 70µm UFLA,
Lavras, MG, 2009.
CONCLUSÕES
AGRADECIMENTOS
O cultivo em ambiente casa de vegetação proporciona
um aumento no número de folhas, raízes, brotos e comprimento
de parte aérea e raízes, o uso de vedação que permite ventilação
natural não interfere no crescimento dos propágulos.
O uso de casa de vegetação como ambiente de
cultivo in vitro proporciona maior formação de número de
estômatos com formato elíptico.
Maior espessura dos tecidos que compõem o limbo
foliar é obtida quando propágulos de crisântemo são
cultivados in vitro em casa de vegetação.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
Minas Gerais, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico e à Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior pelo apoio financeiro recebido.
BRAGA, F. T.; PASQUAL, M.; CASTRO, E. M.; DIGNART,
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90
BAP E AIB NO CULTIVOSANTOS,
in vitro
DE
Epidendrum
ibaguense KUNTH
M. R.
A. dos
et al.
BAP AND AIB ON in vitro CULTURE OF Epidendrum ibaguense KUNTH
MAURÍCIO REGINALDO ALVES DOS SANTOS1; MARIA DAS GRAÇAS RODRIGUES FERREIRA2;
MAGUIANA GONÇALVES MARQUES3
1
D.Sc. em Agronomia – pesquisador - Embrapa Rondônia, Caixa Postal 127 - 76815-800 - Porto Velho,RO [email protected]
2
D.Sc. em Produção Vegetal - pesquisadora - Embrapa Rondônia, Caixa Postal 127 - 76815-800 - Porto Velho,RO [email protected]
3
Bióloga - Estagiária Embrapa Rondônia, Caixa Postal 127 - 76815-800 - Porto Velho,RO - [email protected]
RESUMO
Neste trabalho objetivou-se avaliar o efeito dos
reguladores de crescimento AIB e BAP no desenvolvimento in
vitro de plântulas de Epidendrum Ibaguense Kunth, visando
ao estabelecimento de um protocolo eficiente de regeneração de
plantas dessa espécie. Utilizaram-se plântulas oriundas de
sementes germinadas in vitro, em meio Knudson, sem
reguladores de crescimento, com aproximadamente 1,0 cm de
comprimento. Foram realizados dois ensaios experimentais. No
primeiro, utilizaram-se diferentes concentrações de BAP (0,0;
0,9; 1,8; 2,7 e 3,6 mg L-1) no meio Knudson e, no segundo, as
plântulas foram subcultivadas em meio com diferentes
concentrações de AIB (0,0; 0,8; 1,6; 2,4 e 3,2 mg L-1). Nos 60
dias subsequentes ao estabelecimento de cada experimento,
avaliou-se o comprimento total das plântulas, o comprimento
da parte aérea e da parte radicular e o número de folhas. Os
dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as
médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5 %. Houve diferença
significativa entre os tratamentos utilizados. Os tratamentos
mais eficientes para o desenvolvimento das plântulas foram:
3,6 mg L-1 de BAP, para o desenvolvimento da parte aérea,
seguido do subcultivo em meio com 1,6 mg L-1 de AIB, visando
ao enraizamento das mesmas.
Termos para indexação: orquídea, reguladores de crescimento,
cultura de tecidos.
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effect of
growth regulators IBA and BAP in the development of in vitro
seedlings of Epidencrum Ibaguensis Kunth, aiming to establish a
protocol for efficient regeneration. It was used seedlings with
approximately 1.0 cm in length from seeds germinated in vitro, in
Knudson medium without growth regulators. Two experimental
trials were conducted. The first using different concentrations of
BAP (0.0, 0.9, 1.8, 2.7 and 3.6 mg L-1) in the medium, and the
second, on different concentrations of IBA (0.0, 0.8, 1.6, 2.4 and
3.2 mg L-1). Seedlings, shoots and roots length and number of
leaves were evaluated 60 days after the establishment of each
experiment. The data were submitted to analysis of variance and
averages compared by Tukey test at 5%. There was difference
between the treatments. The most efficient for plantlets
development were: 3.6 mg L-1 BAP for shoot development,
followed by subculture in 1.6 mg L-1 IBA for plantlet rooting.
Index terms: orchids, growth regulators, tissue culture.
INTRODUÇÃO
As orquídeas são encontradas em estado nativo
em todos os continentes e nos mais variados climas, com
exceção das regiões polares e de desertos extremamente
secos. A família Orchidaceae é uma das maiores dentre as
angiospermas, constituída por cerca de 700 gêneros e
30.000 espécies. Podem ser epífitas (raízes aéreas), vivendo
em árvores, ou rupícolas, vivendo sobre pedras (nas
regiões tropicais) e terrestres (nas zonas temperadas)
(FARIA et al., 2004).
Como resposta à pressão seletiva, as orquídeas
desenvolveram a capacidade de produzir numerosas e
minúsculas sementes (ROBINSON & BURNS-BALOGH,
1982), podendo um só fruto, ou cápsula, conter de 376 a
3,7 milhões de sementes, dependendo da espécie
(WITHNER, 1959). Porém, as sementes não possuem
endosperma funcional, ou seja, não possuem reservas, e
sua germinação em geral depende de associações
micorrízicas. Essa simbiose mostra-se bastante delicada, e
pode não acontecer em razão das condições ambientais
adversas (SANTOS et al., 2007; FRÁGUAS et al., 2003).
Nesse contexto, a micropropagação apresenta-se
como alternativa para a propagação eficiente de espécies
de orquídea, uma vez que propicia o aproveitamento de
praticamente todas as sementes produzidas nas cápsulas
e a regeneração de plantas adultas a partir destas. Em
(Recebido em 29 de outubro de 2009 e aprovado em 10 de janeiro de 2011)
Bape aib no cultivo in vitro de Epidendrum ibaguense...
91
condições naturais, uma cápsula que possui cerca de 3.000
sementes dá origem a relativamente poucas plantas. Com
reguladores de crescimento BAP e AIB, em diferentes
concentrações, no desenvolvimento de plântulas da
os trabalhos de Lewis Knudson, na década de 20,
desenvolveu-se meios de cultivo nos quais se tornou
espécie.
possível a germinação de sementes de diversas espécies
de orquídea e o seu cultivo, promovendo o comércio de
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi realizado no Laboratório de Cultura
plântulas produzidas em laboratório e aliviando a pressão
do extrativismo sobre as espécies nativas (ARAÚJO et al.,
de Tecidos Vegetais da Embrapa Rondônia, em Porto Velho-
2006a; NOGUEIRA et al., 2005).
O crescimento in vitro é regulado pela interação e
de idade, aproximadamente 1,0 cm de altura e apenas uma
pelo balanço entre as substâncias adicionadas ao meio de
cultura e por aquelas produzidas de forma endógena
de Epidendrum ibaguense Kunth cultivada no campo
(CHAPLA et al., 2009). A adição de auxinas e citocininas
ao meio é essencial para regular o crescimento e a
em meio Knudson, sem reguladores de crescimento. Foram
morfogênese nos tecidos vegetais in vitro (VICTÓRIO et
al., 2008). As citocininas são reguladores vegetais que
os explantes foram inoculados individualmente, em tubos
participam ativamente dos processos de divisão e
diferenciação celular. Dentre estas, a 6-benzilaminopurina
RO. Utilizaram-se, como explantes, plântulas com 30 dias
folha, oriundas de sementes procedentes de uma planta
experimental da Embrapa Rondônia, germinadas in vitro,
realizados dois ensaios experimentais. No primeiro ensaio,
de ensaio contendo 10,0 mL de meio Knudson,
suplementado com 0,0; 0,9; 1,8; 2,7 e 3,6 mg L-1 de BAP,
sendo quatro repetições, cada uma composta por cinco
(BAP) é uma das mais utilizadas (LINO et al., 2009), sendo
considerada a mais eficiente na multiplicação de explantes
tubos com um explante cada. No segundo ensaio,
e indução de gemas, além de ser a citocinina de menor
custo no mercado (CAMPOS et al., 2007). No enraizamento,
suplementado com 3,6 mg L-1 de BAP, aproximadamente
ácido indolbutírico (AIB) é frequentemente considerado
como a auxina mais eficiente para a maioria das espécies
para meio Knudson contendo 0,0; 0,8; 1,6; 2,4 e 3,2 mg L-1
vegetais (OLIVEIRA et al., 2008).
Epidendrum é um gênero botânico pertencente à
utilizaram-se plântulas cultivadas durante 60 dias em meio
4,0 cm de altura e três folhas, as quais foram transferidas
de AIB. Os tubos foram mantidos em sala de crescimento,
sob irradiância de 35 mmol m-2 s-1, temperatura de 25 + 2°C
e fotoperíodo de 16 horas, em delineamento experimental
família das orquídeas e inclui mais de 1.100 espécies. A
espécie amazônica Epidendrum ibaguense, descrita em
inteiramente casualizado.
1816, é uma orquídea terrestre que cresce em grandes
touceiras, prostradas e enroscadas. No Brasil, desenvolve-
experimento, avaliou-se o comprimento da parte aérea e da
se em afloramentos rochosos, em altitudes de 200 a 1.000
metros, nos estados do Amazonas, Pará e Roraima
número de folhas e os dados obtidos foram submetidos à
(MENEGUCE et al., 2004). Apresenta grande potencial para
comercialização, visto que produz flores o ano inteiro, com
coloração vermelha e amarela, podendo ser utilizada como
flor de corte, de vaso ou para paisagismo (SANTOS et al.,
Aos 60 dias após o estabelecimento de cada
parte radicular, o comprimento total das plântulas e o
análise de regressão.
Ensaio 1 – Efeito do BAP no desenvolvimento das plântulas
Houve maior desenvolvimento da parte aérea das
Neste trabalho, objetivo-se o estabelecimento de
plântulas de orquídea no tratamento contendo 3,6 mg L-1
de BAP, com média de 3,74 cm de comprimento por plântula,
um protocolo eficiente de produção de mudas in vitro de
Epidendrum Ibaguense Kunth, avaliando os efeitos dos
seguido pelos tratamentos com 2,7 mg L-1 e 1,8 mg L-1, com
comprimentos de 3,29 cm e 3,16 cm, respectivamente. No
2007).
92
SANTOS, M. R. A. dos et al.
controle, observou-se média de 1,81 cm de comprimento
da parte aérea (Figura 1).
Resultados semelhantes foram obtidos por Araújo
et al. (2006b) que, em trabalho com Brassocattleya ‘Pastoral’
x Laeliocattleya ‘Amber Glow’ (Orquidaceae), compararam
o efeito dos meios MS, WPM e Knudson em combinação
com concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1).
Esses autores obtiveram o maior crescimento das plântulas
(comprimento da parte aérea) em meio WPM, suplementado
com 4,0 mg L-1 de BAP; e maior multiplicação (número de
brotos) com meio MS, sem regulador de crescimento.
O desenvolvimento de protocormos de
Cypripedium candidum Muhl. ex Willd (Orquidaceae) foi
avaliado em função da suplementação do meio com as
citocininas BAP, 2iP e cinetina (0,1; 0,2; 0,4; 0,8 e 1,6 mg L-1).
BAP e 2iP promoveram o maior crescimento dos
protocormos, em concentrações inferiores a 1,0 mg L-1.
Cinetina promoveu menor crescimento, mas resultou em
desenvolvimento normal dos tecidos, enquanto que BAP
e 2iP resultaram em brotações múltiplas (PAUW et al., 1995).
O desenvolvimen to de protocormos de E.
Ibaguense foi estudado comparando-se os meios MS,
Phytamax e Knudson C e Mitra, na presença e ausência de
peptona (2,0 mg L-1) e carvão ativado (2,0 mg L-1).
Identificou-se maior desenvolvimento nos meios MS e
Phytamax, ambos com a adição de peptona e carvão ativado
(HOSSAIN, 2008).
Estudando o crescimento in vitro de Carissa
carandas, Rai & Misra (2005) observaram que o maior
comprimento das plântulas foi atingido com a suplementação
do meio de cultivo com 13,32 ìM de BAP, decrescendo na
concentração imediatamente superior, de 17,75 µ M.
O maior comprimento radicular verificado foi de 0,79
cm, observado no tratamento contendo 2,7 mg L-1 de BAP.
A concentração imediatamente superior, 3,6 mg L-1 de BAP,
provocou redução no comprimento radicular, sendo
observado o comprimento médio de 0,69 cm. No controle,
o comprimento radicular verificado foi o de 0,68 cm (Figura 2).
É possível que a concentração mais alta da citocinina tenha
inibido a formação de raízes.
Araújo et al. (2006b), trabalh ando com
Brassocattleya Pastoral x Laeliocattleya Amber Glow,
observaram que a utilização de BAP no meio de cultivo
não promoveu nenhum efeito no número de raízes.
Comprimento da parte aérea (cm)
4
3,5
3
2,5
2
y = -0,112x + 0,891x + 1,8926
2
2
R = 0,9636
1,5
1
0,5
0
0
0,9
1,8
2,7
3,6
Concentrações de BAP (mg.L-1)
FIGURA 1 – Efeito de concentrações de BAP sobre o comprimento da parte aérea de plântulas de E. ibaguense, após
60 dias de cultivo in vitro.
Comparando os meios WPM, MS e Knudson C, os autores
verificaram que o meio WPM resultou em maior número de
raízes, seguido do meio MS, sendo os menores valores
verificados no meio Knudson C.
De acordo com Pierik (1987), em concentrações mais
elevadas, as citocininas podem induzir à formação de gemas
adventícias, quebrando a dominância apical e retardando
a formação de raízes.
O comprimento total das plântulas apresentou-se
maior com o aumento na concentração de BAP. O menor
comprimento foi verificado no tratamento controle, com
média de 2,49 cm. O maior comprimento foi de 4,43 cm, no
meio suplementado com a maior concentração de BAP, 3,6
mg L-1 (Figura 3). Estudando o crescimento de Carissa
carandas L. , Rai & Misra (2005) observaram que o maior
comprimento médio das plântulas foi atingido com a
suplementação do meio de cultivo com 3,0 mg L-1 de BAP
(4,39 cm), decrescendo na concentração imediatamente
superior, de 4,0 mg L-1 (2,38 cm).
Quanto ao efeito do BAP sobre o número de folhas,
esse valor aumentou do tratamento controle para as
concentrações de 0,9 e 1,8 mg L-1 do regulador, com 3,9,
93
4,70 e 4,85 folhas por plântula, respectivamente. Porém, o
n úmero de folh as decresceu em seguida, n as
concentrações de 2,7 e 3,6 mg L-1 de BAP (Figura 4).
O aumento seguido de decréscimo pode indicar
toxicidade por altas concentrações da citocinina,
estabelecendo uma faixa de utilização ótima da mesma para
a variável estudada. Resultados diferentes foram obtidos
por Talukder et al. (2003), que obtiveram maior número de
folhas por plântula (4,25) em Dendrobium utilizando 2,25
mg L-1 de BAP.
Ensaio 2 – Efeito do AIB no desenvolvimento das plântulas
Com relação ao comprimento da parte aérea, a maior
média, 6,76 cm, foi obtida com a concentração de 1,6 mg L1
de AIB. Já, o menor comprimento médio, 4,60 cm, foi
observado no tratamento contendo 3,2 mg L-1 de AIB. No
tratamento controle, o comprimento médio obtido para a
parte aérea foi de 6,12 cm (Figura 5).
O crescimento radicular foi maior no tratamento
contendo 1,6 mg L-1 de AIB, que resultou no comprimento
radicular médio de 1,64 cm. Na ausência de regulador de
crescimento, verificou-se comprimento radicular médio de
Comprimento radicular (cm)
0,8
0,78
0,76
0,74
0,72
2
y = -0,0212x + 0,0851x + 0,6737
0,7
2
R = 0,6322
0,68
0,66
0
0,9
1,8
2,7
3,6
FIGURA 2 – Efeito de concentrações de BAP sobre o comprimento radicular de plântulas de E. ibaguense, após 60
dias de cultivo in vitro.
94
0,92 cm. Nas concentrações superiores, de 2,4 e 3,2 mg L-1
de AIB, os comprimentos decresceram para 1,54 cm e 0,84
(Orchidaceae) em relação a diferentes concentrações de AIB
(0,0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg L-1), observaram maiores número
cm, respectivamente (Figura 6).
De forma similar, Aktar et al. (2007), estudando o
de raízes por plântula, comprimento e peso fresco radicular
na concentração de 1,0 mg L-1, que resultou também no
desenvolvimento radicular em plântulas de Dendrobium
menor tempo para a formação de raízes (10,8 dias).
5
Comprimento total (cm)
4,5
4
3,5
3
2
y = -0,1332x + 0,976x + 2,5663
2,5
2
R = 0,974
2
1,5
1
0,5
0
0
0,9
1,8
2,7
3,6
FIGURA 3 – Efeito de concentrações de BAP sobre o comprimento total de plântulas de E. ibaguense, após 60 dias
de cultivo in vitro.
6
Número de folhas
5
4
2
y = -0,3175x + 0,9095x + 4,0057
3
2
R = 0,8111
2
1
0
0
0,9
1,8
2,7
3,6
FIGURA 4 – Efeito de concentrações de BAP sobre o número de folhas por plântula de E. ibaguense, após 60 dias de
cultivo in vitro.
95
Ribeiro et al. (2006) testaram o efeito de uma
combinação fatorial de AIB e Ga3 (0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg
melhores resultados com a suplementação do meio com
2,0 mg L-1 de AIB, associados a 1,0 mg L-1 de GA3. Por
L-1) sobre o comprimento e o número de raízes em plântulas
de Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng., obtendo os
outro lado, Rai & Misra (2005), estudando a
micropropagação de Carissa carandas L., observaram que
Comprimento da parte aérea (cm)
8
7
6
5
2
y = -0,4509x + 1,0929x + 5,8709
4
2
R = 0,7741
3
2
1
0
0
0,8
1,6
2,4
3,2
Concentrações de AIB (mg.L-1)
FIGURA 5 – Efeito de concentrações de AIB sobre o comprimento da parte aérea de plântulas de E. ibaguense, após
60 dias de cultivo in vitro.
Comprimento radicular (cm)
1,8
1,6
1,4
1,2
2
y = -0,2768x + 0,9107x + 0,8297
1
2
R = 0,8613
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,8
1,6
2,4
3,2
FIGURA 6 – Efeito de concentrações de AIB sobre o comprimento radicular de plântulas de E. ibaguense, após 60 dias
de cultivo in vitro.
96
o AIB utilizado isoladamente, em diferentes concentrações
plântulas de Carissa carandas L. identificou maiores
testadas, não resultou em enraizamento satisfatório,
valores no meio de cultura sem reguladores de crescimento
formando raízes longas e finas.
(2,01 cm), em comparação com o meio suplementado com
Oliveira et al. (2008) testaram concentrações de AIB
(0,0; 1,0 e 2,0 mg L-1) em combinação com concentrações
AIB nas concentrações de 0,18 mg L-1 (1,76 cm) e 0,46 mg
L-1 (1,52 cm).
dos sais macronutrientes do meio MS (25, 50 e 100%) para
As auxinas, especificamente o AIB, geralmente
o enraizamento de plântulas de Cereus jamacaru P.DC.,
induzem a formação e o desenvolvimento de raízes, o que
observando maior número de raízes com a concentração
se verificou neste experimento. Conforme esperado, esse
de 2,0 mg L-1 de AIB e 50% dos macronutrientes do meio
regulador
MS. Em relação ao comprimento das raízes, os autores não
desenvolvimento da parte aérea. As auxinas são os únicos
observaram diferença entre as concentrações de AIB,
reguladores de crescimento que aumentam a formação de
sendo que a concentração de sais de 100% promoveu o
primórdios radiculares (TAIZ & ZEIGER, 1998), sendo
maior crescimento radicular (OLIVEIRA et al., 2008).
predominantemente obtidas em tecidos jovens (DAVIES,
de
crescimento
não
estimulou
o
O comprimento total médio das plântulas foi maior
1995). De forma inversa, as citocininas são produzidas
na concentração de 1,6 mg L-1 de AIB, 8,40 cm, enquanto
principalmente nas raízes (ITAI & BIRNBAUM, 1996),
obteve-se 7,04 cm de comprimento no controle. Porém, em
estimulando a iniciação de gemas caulinares (PILLARY &
-1
-1
concentrações superiores, de 2,4 mg L e 3,2 mg L de
RAILTON, 1993). Embora as auxinas em geral induzam o
AIB, o comprimento total médio das plântulas diminuiu,
enraizamento, as respostas a elas não são universais, ou
atingindo valores de 7,64 cm e 5,44 cm, respectivamente
seja, algumas espécies enraízam com dificuldade ou não
(Figura 7). Esses resultados diferem bastante dos obtidos
enraízam, mesmo com a utilização dessa classe de regulador
por Rai & Misra (2005), cuja avaliação do comprimento de
de crescimento (HARTMANN et al., 2002).
9
Comprimento total (cm)
8
7
6
2
y = -0,7277x + 2,0036x + 6,7006
5
2
R = 0,7826
4
3
2
1
0
0
0,8
1,6
2,4
3,2
FIGURA 7 – Efeito de concentrações de AIB sobre o comprimento total de plântulas de E. ibaguense, após 60 dias de
cultivo in vitro.
O número de folhas foi maior nas plântulas
cultivadas na ausência de regulador de crescimento,
seguido do tratamento contendo a concentração mais baixa
de AIB, 0,8 mg L-1 (Figura 8). As auxinas não têm ação
recon hecida sobre essa variável, e sim sobre a
organogênese e o desenvolvimento da parte radicular.
CONCLUSÃO
A concentração de 3,6 mg L-1 de BAP proporciona
maior desenvolvimento da parte aérea de plântulas de
Epidendrum ibaguense Kunth. A concentração de 1,6 mg
-1
L de AIB resulta no maior desenvolvimento radicular
dessas plântulas.
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Germinação in vitro e aclimatização
de mudas...
COMUNICAÇÃO
CIENTÍFICA
99
GERMINAÇÃO in vitro E ACLIMATIZAÇÃO DE MUDAS
DE Aechmea blanchetiana (BAKER) L. B. SMITH EM
DIFERENTES RESÍDUOS DA AGROINDÚSTRIA
In vitro GERMINATION AND SEEDLING ACCLIMATIZATION OF Aechmea blanchetiana
(BAKER) L. B. SMITH IN DIFFERENT AGROINDUSTRY RESIDUES
TARCISIO RANGEL DO COUTO1; JANIE MENDES JASMIM2;
VIRGINIA SILVA CARVALHO3, GUILHERME EUGÊNIO MACHADO LOPES4
1
Bolsista PIBIC/CNPq - Laboratório de Fitotecnia, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias - Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) - Av. Alberto Lamego, 2000 - 28013-602 - Campos dos Goytacazes , RJ [email protected]
2
Professora Associada - Laboratório de Fitotecnia, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias - Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) - Av. Alberto Lamego, 2000 - 28013-602 - Campos dos Goytacazes , RJ - [email protected]
3
Bolsista PDR/FAPERJ - Laboratório de Fitotecnia, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias - Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) - Av. Alberto Lamego, 2000 - 28013-602 - Campos dos Goytacazes , RJ – [email protected]
5
Pesquisador - PESAGRO-Rio - Estação Experimental de Itaocara - Antigo Campo de Sementes, s/nº - 28.570-000 – Itaocara, RJ [email protected]
RESUMO
Aechmea blanchetiana L. B. SM. é uma bromeliácea
brasileira que ocorre normalmente em restingas, com
características de crescimento e inflorescências decorativas
adequados para o paisagismo. O cultivo in vitro é uma alternativa
para a produção de bromélias, por permitir a produção de mudas
de qualidade em larga escala, a preços mais acessíveis,
contribuindo para a redução do extrativismo. Para a aclimatização
dessas mudas, a fibra de coco e a casca do fruto da mamoneira
aparecem como alternativas promissoras na composição de
substratos. Assim, testaram-se a germinação de sementes in
vitro e aclimatização das mudas nesses dois subprodutos da
agroindústria. Os meios usados para a germinação foram
constituídos pelos sais minerais do meio MS (1 e ½ força). As
sementes apresentaram alta taxa de germinação,
independentemente do meio utilizado. Após quatro meses de
cultivo in vitro, as mudas foram transferidas para oito
combinações de Plantmax® HT, fibra de coco e casca do fruto da
mamoneira nas granulometrias de 7 e 10 milímetros. Após quatro
meses de aclimatização, avaliou-se a taxa de sobrevivência, o
diâmetro e a altura da roseta, o número de folhas, a área foliar e
a massa seca total das plantas. Houve 100% de sobrevivência,
independentemente do substrato usado. Para as demais variáveis,
foram observadas diferenças significativas, sendo os melhores
resultados obtidos nos tratamentos compostos por casca do
fruto da mamoneira, em ambas granulometrias, pura ou misturada
à fibra de coco. A casca do fruto da mamoneira pura ou misturada
à fibra de coco apresentou potencial como substrato para
aclimatização de bromélias.
Termos para indexação: Bromeliaceae, casca do fruto da
mamoneira, fibra de coco.
ABSTRACT
Aechmea blanchetiana L. B. SM. is a Brazilian bromeliad
that usually occurs on sandy coasts, with growth characteristics
and decorative inflorescences suitable for landscaping. In vitro
growth is an alternative as a bromeliad production, for it allows
the large scale yield of quality plantlets at more accessible prices,
contributing to the reduction of extrativism. Coconut fiber and
castor bean fruit husks appear as promising alternatives to be
used in substrate composition for the acclimatization of plants
produced in vitro. Therefore, in vitro germination of seeds and
the acclimatization of seedlings were tested in both agroindustry
byproducts. The media used for germination were MS mineral
salts (1 and ½ strength). The seeds showed high germination
rates independently of the medium used. After four months of in
vitro growth, the seedlings were transferred to eight combinations
of Plantmax® HT, coconut fiber and castor bean fruit husks of
seven and ten millimeters. After four months of acclimatization,
the survival rate, rosette diameter and height, the number of
leaves, leaf area and total dry mass were evaluated. There was
100% of survival, independently of the substrate used. For the
other variables tested, there were significant differences, with
the best results obtained under the treatments with both sizes of
castor bean fruit husks pure or mixed to coconut fiber. Castor
bean fruit husks, pure or mixed to coconut fiber, showed potential
as a substrate for bromeliad acclimatization.
Index terms: Bromeliaceae, castor bean fruit husks, coconut fiber.
As bromélias são plantas ornamentais que
apresentam diferentes tipos de crescimento e formas, o
que aumenta o interesse econômico por essas plantas com
(Recebido em 29 de outubro de 2009 e aprovado em 19 de outubro de 2010)
100
COUTO, T. R. do et al.
elevado valor comercial (MOREIRA, 2008), que acarreta,
muitas vezes, o aumento do extrativismo para abastecer o
mercado.
A espécie Aechmea blanchetiana L. B. Smith.
pertence à subfamília Bromelioideae e é comum nas
restingas por ser heliófita, formando grandes touceiras com
folhagem amarelada. Essa espécie também coloniza matas,
onde passa a viver, eventualmente, como epífita e perde
sua coloração característica (LEME & MARIGO, 1993). É
uma planta herbácea, epífita, perene, rizomatosa, com
folhagens e inflorescências decorativas, podendo atingir
de 60 a 90 cm de comprimento (LORENZI & MELLO-FILHO,
2001).
Pesquisas visando ao desenvolvimento de
tecnologias de produção de espécies de bromélias,
evitando seu extrativismo e promovendo a conservação
em seus habitats, são fundamentais para evitar riscos de
extinção. A propagação in vitro de bromélias pode ser
utilizada como uma alternativa para a produção de mudas
de qualidade em larga escala, a preços mais acessíveis,
contribuindo para a redução da extração das plantas em
seus habitats (CARNEIRO & MANSUR, 2004). A
germinação de sementes de bromélias in vitro vem sendo
realizada por diversos pesquisadores e com resultados
variados entre as espécies (MOREIRA, 2008; SILVA et al.,
2008; BELLINTANI et al., 2007; ARANDA-PERES &
RODRIGUES, 2006; ARANDA-PERES, 2005).
A etapa de aclimatização é uma fase crítica da
propagação in vitro, por causar um estresse na plântula e
pelo perigo de contaminação por fungos e bactérias
patogênicos nas condições ex vitro (COSTA, 1998). Umas
das limitações no processo de aclimatização é o tipo de
substrato utilizado, em razão de problemas relacionados
aos efeitos sobre a translocação de água, ao sistema soloplanta-atmosfera e no estabelecimento do novo sistema
radicular (SILVA et al., 2006). Plantas epífitas como as
bromélias exigem substratos de baixa densidade, alta
permeabilidade e aeração (KAMPF, 1992).
Resíduos da agroindústria, casca do fruto da
mamoneira decomposta e fibra de coco verde aparecem
como materiais promissores para uso na composição de
substratos, puros ou em misturas (AMARAL et al., 2009;
LOPES, 2009; LIMA et al., 2008; LOPES et al., 2007;
AMARAL, 2007; SANTOS JUNIOR, 2007; JASMIM et al.,
2006). Segundo Lopes et al. (2007), o processo de
compostagem melhora as características físicas e químicas
da casca do fruto da mamoneira, permitindo sua utilização
como substrato, pura ou em misturas, para o cultivo de
plantas em recipientes. Segundo Rosa et al. (2002), a fibra
de coco é um substrato 100% natural, podendo ser utilizado
na germinação de sementes, cultivo de hortaliças e flores,
por apresentar uma boa estrutura física, com alta
porosidade e potencial de absorção de umidade, sendo
também um produto biodegradável. Portanto, esses
resíduos podem ser utilizados como substrato agrícola,
agregando valor ao mercado de floricultura e visando à
sustentabilidade da produção agrícola.
Nesse contexto, testaram-se a germinação de
sementes de Aechmea blanchetiana em meio MS completo
e com metade da concentração de sais e a aclimatização
das mudas, utilizando substratos a base de casca do fruto
da mamoneira e fibra de coco.
Os experimentos in vitro foram conduzidos em
laboratório e, os experimentos de aclimatização, em casa
de vegetação com cobertura de plástico (100µm) e sombrite
50%, na Unidade de Apoio à Pesquisa, do Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, em Campos
dos Goytacazes – RJ. O município situa-se na latitude 21o
45’ S e na longitude 41o 20’ W, altitude média de 11 metros,
com temperatura média anual de 23 °C e umidade relativa
média anual de 51%.
Sementes maduras recém-coletadas de A.
blanchetiana foram obtidas de plantas matrizes do
produtor Pedro Nahoum na BOTÂNICA POP LTDA em
Maricá – RJ em maio de 2008.
O meio de cultura utilizado para germinação foi
constituído pela concentração total dos sais minerais do
meio MS (1 força iônica) ou pela metade da concentração
total (MS/2) e as vitaminas de White (MURASHIGE &
Germinação in vitro e aclimatização de mudas...
SKOOG, 1962), 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mioinositol, solidificado com 8 g L -1 de ágar Vetec ® ,
autoclavado por 20 minutos a 1,5 atm e 121 oC.
Sob condições de câmara de fluxo laminar, as
sementes foram desinfestadas colocando-as em seringas,
de acordo com a seguinte marcha: 30 minutos em hipoclorito
de sódio 0,5 % seguido por três enxaguaduras em água
desionizada estéril nos tempos de 5, 10 e 10 minutos. Após
a desinfestação, vinte e cinco sementes foram colocadas
em cada frasco (5 x 10 cm) contendo 40 mL de meio de cultura.
Os frascos foram vedados com filme PVC.
O experimento foi montado no delineamento
inteiramente casualizado com dois tratamentos
(concentração total dos sais minerais do MS e metade da
concentração total, 1 e ½ força, respectivamente) e cinco
repetições. Cada repetição consistiu de um frasco
contendo 25 sementes.
Após a semeadura, os frascos foram transferidos
para a sala de cultivo e mantidos à temperatura de 27 ± 2
o
C, fotoperíodo de 16:8h (luz:escuro) e irradiância de 25
µ mol m-2 s -1, fornecida por lâmpadas fluorescentes
(OSRAM®, luz do dia) durante toda a condução do
experimento.
Após três meses de cultivo, todas as plântulas
foram transferidas para novo meio de cultura de mesma
composição que o anterior. As plântulas de cada frasco
inicial foram recultivadas para dois novos frascos.
Trinta dias após o recultivo, as plântulas foram
avaliadas quanto à porcentagem de germinação das
sementes e massa fresca produzida.
Após quatro meses e dez dias de cultivo in vitro,
as plântulas de A. blanchetiana com aproximadamente um
centímetro foram aclimatizadas em bandejas de poliestireno
expandido, contendo 128 células com, aproximadamente,
25 cm3 por célula.
O delineamento experimental foi em blocos ao acaso
com quatro repetições, e seis plantas por parcela, em oito
diferentes composições de substratos:
1. Casca do fruto da mamoneira curtida passada em
peneira de malha de 7 mm (M7); 2. Casca do fruto da
101
mamoneira curtida passada em peneira de malha de 10 mm
(M10); 3. Plantmax® HT (PM); 4. Fibra de coco cortada em
pedaços de aproximadamente 1 cm (FC) + M7 (1:1); 5. FC + M10
(1:1); 6. FC + PM (1:1); 7. M7 + PM (1:1); 8. M10 + PM (1:1).
O preparo da fibra de coco foi de acordo com a
metodologia descrita por Jasmim et al. (2006), sendo que a
fibra foi ainda cortada em pedaços de, aproximadamente,
um centímetro antes de ser colocada nas células das
bandejas de cultivo.
A casca do fruto da mamoneira foi obtida a partir da
área de produção de mamona da Estação Experimental da
PESAGRO-Rio, em Itaocara – RJ e preparada como descrito
por Lopes (2009).
O experimento foi conduzido em casa de vegetação
nas condições descritas anteriormente. As plantas foram
irrigadas a cada dois dias, até a saturação do substrato,
constatada pelo início de escorrimento de água das células
da bandeja. Um mês após o plantio, as plantas de todos os
tratamentos passaram a ser adubadas quinzenalmente com
solução nutritiva de Hoagland & Arnon (1950) (RESH, 1997).
Cada planta recebeu três mililitros da solução nutritiva após
a rega.
Após quatro meses de aclimatização, avaliou-se:
sobrevivência, número de folhas, área foliar com o aparelho
LICOR 3100, massa seca total, altura e diâmetro da roseta
com um paquímetro.
Todos os dados observados foram submetidos à
análise estatística utilizando o programa GENES® (CRUZ,
2006).
As sementes de A. blanchetiana germinaram a
partir de 10 até 14 dias após a semeadura in vitro. Aos três
meses de cultivo não havia diferença visual entre as
plântulas germinadas em meio MS completo ou com
metade da concentração de sais. Após a transferência de
todas as plântulas para novo meio de cultura, as plântulas
de cada frasco inicial foram distribuídas em dois novos
frascos, para ampliar o espaço disponível e favorecer o
crescimento das mesmas. Após quatro meses de cultivo,
avaliou-se o número de sementes germinadas e massa fresca
das plântulas (Tabela 1).
102
Não houve diferença significativa na germinação
das sementes, nem na massa fresca das plântulas de A.
blanchetiana em meio MS completo ou com metade da
concentração de sais. Bellintani et al. (2007) não
encontraram diferenças na germinação de Orthophytum
mucugense Wand. e Conceição e Neoregelia mucugensis
Leme em meio MS/2 ou em água destilada gelificada e,
após a germinação, as plântulas foram transferidas para
meio MS completo ou com metade da concentração de
sais, suplementado ou não com carvão ativado, não
havendo também diferença entre os tratamentos.
A porcentagem de germinação das sementes foi
alta em ambas as concentrações do meio MS. O mesmo foi
observado por Moreira (2008) trabalhando com várias
espécies de bromélias, obtendo alto percentual de
germinação de Aechmea fasciata Baker (100%), Aechmea
miniata (Beer) hortus ex Baker (100%), Vriesea sp. (76%)
e Aechmea sp. (69%) utilizando meio MS.
Aranda-Peres et al. (2006) verificaram que sementes
de Aechmea germinam facilmente in vitro, corroborando
com os resultados obtidos no presente trabalho, em que
sementes de A. blanchetiana apresentaram boas respostas
de germinação in vitro.
Após quatro meses de aclimatização, foi feita a
avaliação das mudas. As variáveis avaliadas foram:
porcentagem de sobrevivência, número de folhas, área foliar,
massa seca total, altura e diâmetro da roseta (Tabela 2).
As plantas oriundas do cultivo in vitro
apresentaram boa resistência na fase de aclimatização com
taxa de sobrevivência de 100% em todos os tratamentos.
Para todas as demais variáveis testadas houve diferença
entre os tratamentos. Os resultados obtidos com Plantmax®
HT, puro ou misturado à fibra de coco, foram inferiores
àqueles dos demais tratamentos. Os melhores resultados
foram obtidos nos tratamentos compostos por casca do
fruto da mamoneira nas duas granulometrias, puros ou
misturados à fibra de coco, resultando em melhor qualidade
da muda produzida utilizando esses resíduos como
substrato na aclimatização de A. blanchetiana (Figura 1).
TABELA 1 – Germinação das sementes de A. blanchetiana in vitro e massa fresca das plântulas após quatro meses de
cultivo in vitro.
Meio de cultura MS
Germinação sementes (%)
Massa fresca total (g)
Completo
86,4 a
0,212 a
Metade da Concentração de sais (MS/2)
81,6 a
0,196 a
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
TABELA 2 – Diâmetro (DIR) e altura da roseta (ALR), número de folhas (NF), área foliar (AF) e massa seca total (MST)
de mudas de A. blanchetiana oriundas do cultivo in vitro após quatro meses de aclimatização.
Tratamento
DIR (cm)
ALR (cm)
NF
AF (cm2)
MST (g)
M7
13,71 a
9,55 a
15,00 a
92,11 a
0,50 ab
M10
13,83 a
8,41 ab
14,83 ab
78,28 ab
0,40 abc
PM
7,97 bc
6,51 bc
13,75 ab
44,81 b
0,19 bc
FC + M7
10,67 ab
8,33 ab
14,41 ab
80,62 ab
0,46 abc
FC + M10
13,18 a
8,95 ab
14,91 a
109,83 a
0,53 a
FC + PM
6,52 c
5,37 c
11,91 b
39,51 b
0,15 c
PM + M7
10,75 ab
8,40 ab
14,91 a
72,21 ab
0,35 abc
PM + M10
11,06 ab
8,42 ab
15,83 a
77,09 ab
0,42 abc
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
Germinação in vitro e aclimatização de mudas...
103
FIGURA 1 – Plantas de Aechmea blanchetiana após quatro meses de aclimatização. Tratamentos (da esquerda para a
direita): M7; M10; PM; FC + M7; FC + M10; FC + PM; M7 + PM; M10 + PM.
Na aclimatização das mudas é imprescindível o uso
de substrato de qualidade, pois o mesmo deve permitir a
manutenção mecânica do sistema radicular, estabilidade da
planta, suprimento de água, nutrientes e aeração (SANTOS
et al., 2006). A mistura de fibra de coco e Plantmax® HT,
visualmente, apresentaram compactação, dificultando a
drenagem da água de irrigação e, provavelmente,
acarretando menor aeração. Os demais substratos, que não
continham Plantmax ® HT, não apresentavam essa
característica, podendo ser esse o motivo do melhor
crescimento das plantas nesses últimos, pois, segundo
Kampf (1992), plantas epífitas, como as bromélias, exigem
substratos de baixa densidade, alta permeabilidade e aeração.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq, pela bolsa de iniciação científica. À
FAPERJ, pela bolsa de pós-doutorado e financiamento da
pesquisa. À PESAGRO-Rio pelo fornecimento da casca
do fruto da mamoneira. À BOTÂNICA POP LTDA e ao seu
proprietário Pedro Nahoum, pelo fornecimento das
sementes de Aechmea blanchetiana L. B. Smith.
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inseridos no texto após a citação dos mesmos e também
em um arquivo à parte, salvos em extensão “tif” ou “jpg”,
com resolução de 300 dpi. Os gráficos devem vir também
em excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem
negrito, sem caixa de textos e agrupados, em arquivo à
parte.
Símbolos e Fórmulas Químicas: deverão ser feitos em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker, sem perda de suas formas originais.
2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
2.1. O artigo científico deve ser apresentado na seguinte
seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfulas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação – instituição a que o autor
está filiado – endereço da instituição – CEP – cidade, estado
– endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro – Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
INTRODUÇÃO
Deve apresentar uma visão concisa do estado atual
do conhecimento sobre o assunto, que o manuscrito
aborda e enfatizar a relevância do estudo, sem constituirse em extensa revisão e, na parte final, os objetivos da
pesquisa. Deve incluir a revisão de literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta seção pode ser dividida em subtítulos,
indicados em negrito.
Podem ser divididas em subseções, com subtítulos
concisos e descritivos, e conter tabelas e figuras.
CONCLUSÕES
Finalizar com os resultados de acordo com os
objetivos do trabalho
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos
Devem seguir as normas para citação no texto e na
seção própria.
2.2. A comunicação científica deve ser apresentada na
seguinte seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfluas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação – instituição a que o autor
está filiado – endereço da instituição – CEP – cidade, estado
– endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro – Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista “Plant Cell Culture & Micropropagation” para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
Texto: sem subdivisão, porém com introdução, material e
métodos, resultados e discussão (podendo conter tabelas
e gráficos e conclusão subentendidas.
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos.
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção
própria.
3. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS,
ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
3.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi.
3.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi.
As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New
Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e
agrupadas.
3.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos
mesmos, dentro do próprio texto, elaborado
preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman,
tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas
formas originais.
OBS: A formatação correta é parte imprescindível para que
o trabalho seja devidamente protocolado. Caso este não
esteja nas normas, o mesmo será recusado.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências
bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002
da ABNT.
A exatidão das referências constantes da listagem e a
correta citação no texto são de responsabilidade do(s)
autor(es) do artigo.
4.1. Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento
científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não
deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de
publicação (cidade), a ser descrito no lugar adequado para
cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
4.2. Exemplificação (tipos mais comuns):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de
ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas
Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 7480, jan./mar. 2000.
LIVRO:
a) livro no todo:
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and
procedures of statistics. New York: McGraw-Hill Book,
l960. 481 p.
b) Parte de livro com autoria específica:
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos
da automação sobre a organização da produção de trabalho.
In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/
IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em
confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de
corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica
de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha
dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera
controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado
em Ciência dos Alimentos) – Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: “A folha é composta de duas páginas: anverso e
verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são
impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.”
(ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de
madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia
brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6.,
1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/
SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme
normas específicas para cada tipo de documento
(monografia no todo e em parte, trabalho apresentado em
evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.),
acrescidas de informações sobre o endereço eletrônico
apresentado entre braquetes (< >), precedido da expressão
“Disponível em:” e da data de acesso ao documento,
precedida da expressão “Acesso em:”.
Nota: “Não se recomenda referenciar material eletrônico de
curta duração nas redes” (ABNT, NBR6023/2000, p. 4).
Segundo padrões internacionais, a divisão de endereço
eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
a) livro no todo
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//
www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível
em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de
institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de
projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de
institutos de pesquisa tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000.
Disponível em: <http://www.abipti.org.br>. Acesso em:
01 dez. 2000.
d) Tese
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira
de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação (Mestrado
em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua) - Pontifícia
Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997.
Disponível em: <http://www.terra.com.br/virtualbooks/
freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em: 28 nov. 2000.
O INFORMARÁ SOBRE SUA PUBLICAÇÃO. OS
ARTIGOS QUE NECESSITAREM DE MODIFICAÇÕES
SERÃO DEVOLVIDOS AO AUTOR PARA A DEVIDA
REVISÃO.
Artigo de periódico (acesso online):
7. OS ARTIGOS SERÃO PUBLICADOS EM ORDEM
DE APROVAÇÃO.
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um
conceito contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife,
v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em: <http://
www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov.
2000.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTORDATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE,
1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al.,
1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma
obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
5. O EDITOR CHEFE NOTIFICARÁ O AUTOR DO
RECEBIMENTO DO ORIGINAL E, POSTERIORMENTE,
6. OS ARTIGOS NÃO APROVADOS SERÃO
DEVOLVIDOS.
8. O NÃO-CUMPRIMENTO DESSAS NORMAS
IMPLICARÁ NA DEVOLUÇÃO DO ARTIGO AO
AUTOR.
9. OS CASOS OMISSOS SERÃO RESOLVIDOS PELA
COMISSÃO EDITORIAL.
10. O ARTIGO DEVERÁ SER ENVIADO PARA:
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
CEP 37200-000
Lavras – MG
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
“Plant Cell Culture & Micropropagation”, a
semestral journal edited by Editora UFLA of the
Universidade Federal de Lavras, publishes scientific
articles and communications in the area of plant tissue
culture, elaborated by researchers of the national and
international scientific community. One of the authors must
be associated and have paid all charges required by the
ABCTP (Plant Tissue Culture Association) in order to be
tax free for publication in Plant Cell Culture &
Micropropagation. Submission of a manuscript implies that
it is neither under consideration for publication elsewhere
nor has appeared previously in part or in whole. On
acceptance for publication, authors assign to the Editors
full copyright of the manuscript in all languages and
countries. Publications will depend on editorial rules and
on the review of experts and ad hoc commission. Reviewer
and editorial opinions will be anonymously communicated
to authors.
Concepts and affirmations included in articles and
communications are of the entire responsibility of the
authors.
1. SUBMISSION
The manuscript must present a maximum of 14
pages. At the time of submission, a cover letter must be
sent with the manuscript copies to the Editor requesting
publication of the article. This cover letter must be signed
by all authors and also contain the full address,
telephone number and e-mail of the authors. Any
inclusion, exclusion or alteration in the authors order must
be notified and signed by all authors including the one
excluded.
Original: Four copies and CD with text and illustrations.
Only one of the 4 printed copies must contain the full
names of the authors and footnote in the first page.
Format: Word for Windows (version 98, 2000, XP ou 2003)
Spacing of the text: Double. Margin on the left hand side
and 2.0 cm margin on the right hand side, 2.5 cm upper and
lower margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for the
footnote
Paper: A4 format
Source: Times New Roman, size 12
Number of pages: up to 14 pages, including the illustrations
Tables: Tables should be part of the body of the paper and
they must be presented in Word or Excel. The title should
be above and be presented in the language in which the
article was written and in English. The vertical lines
separating the columns should not appear.
Graphs/Figures/Photographs: must be presented in black
and white, clear and with contrast, scanned, inserted in
the text after citation and also in a separate file (on the
same diskette as the article) saved in extension “tif” or
“jpg”, with resolution of 300 dpi. The title should be below
and presented in the language in which the article was
written and in English.
Symbols and Chemical Formula: must be presented using
a word processor that permits a format Page Maker.
2. STRUCTURE AND ORGANIZATION
2.1. The article should be presented in the following
sequence:
TITLE
In English language, containing no more than 15 words in
capital letters and bold.
AUTHORS
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies. :
Footnote: titulation – name of the institution to which the
authors belong – address of institution – ZIP CODE – city,
state – mail address.
ABSTRACT
should be informative and condensed and should
explain the objectives, material and methods, results and
conclusion of the work in a maximum of 250 words all written
in one paragraph.
For articles written in English the abstract should also be
presented in Portuguese.
Key words: minimum of three and maximum of five. They
should not repeat words that are already in the title. These
may include phrases as well as individual words and should
be separate by commas.
For articles written in English the key-words should also
be presented in Portuguese.
INTRODUCTION
Should present a concise vision of the current level of
knowledge that has been achieved within the subject area
that the paper will discuss. It should neither give an
extensive review nor should it include details about the
results and discussion. It should clearly indicate the
objectives of the research that was carried out.
MATERIALAND METHODS
This section can contain subdivisions, with subtitles in
bold print.
This section can have subsection which begins with
concise, descriptive titles in bold print.
CONCLUSIONS
Finishing agree of objectives of work
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
2.2 The Communication should be presented in the
following sequence
TITLE
Sufficiently clear, conspicuous and complete, without
superfluous words. It is recommended to initiate with the
term that represent the most important aspect, with other
terms in decreasing of importance
TITLE IN PORTUGUESE;
FULL NAME(S) OF THE AUTHOR(S)
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies.
Footnote: titulation – name of the institution to which the
authors belong – address of institution – ZIP CODE – city,
state – mail address.
ABSTRACT
Written continuously without paragraph. It must
not exceed 250 words. Index terms must be enclosed after
the abstract using terms different from those used in the
title and separated by comma.
Index terms: (3 to 5) must be described in capital and small
letters, and express the content of the article
ABSTRACT AND INDEX TERMS IN PORTUGUESE
Text: with no division but must include introduction,
material and methods, results and discussion and
conclusion (it may include tables and figures)
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
3. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS
OR FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULD
OBEY THE FOLLOWING RULES:
3.1. Photographs must be presented in black and white,
clear and with contrast, inserted in the text after their citation
and also in a separate file (on the same diskette as the
article) saved in extension “TIFF” or “JPEG” with
resolution of 300 dpi.
3.2. Figures must be presented in black and white, clear
and with contrast, inserted in the text after their citation and
also in a separate file (on the same diskette as the article)
saved in extension “TIFF” or “JPEG” with resolution of
300 dpi. They must be elaborated using Times New Roman
font, size 10, without bold, without text box and arranged.
3.3. Graphs must be inserted in the text after their citation,
elaborated preferentially in Excel, using Times New Roman
font, size 10, without bold.
3.4. Symbols and Chemical Formula must be presented
using a word processor that permits a format for Page Maker
(ex: MathType, Equation) without loss of its original form.
4. REFERENCES: references must be cited according to
NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct
citation in the text are of the entire responsibility of the
author(s).
5. THE BRAZILIAN ASSOCIATION OF PLANT TISSUE
CULTURE (ABCTP) WILL INFORM THE AUTHOR THE
RECEIPT OF THE ORIGINAL MANUSCRIPT AND
EVENTUALLY IT WILLALSO SEND INFORMATION
REGARDING ITS PUBLICATION. MANUSCRIPTS
THAT REQUIRE MODIFICATIONS WILL BE
RETURNED TO THE AUTHOR FOR THE RESPECTIVE
REVISION ANDCORRECTIONS.
6. MANUSCRIPTS NOT APPROVED WON’T BE
RETURNED TO THE AUTHOR.
7. ARTICLES WILL BE PUBLISHED ACCORDING TO
THE ORDER OF RECEIPTAND APPROVAL.
8. IFANY OFTHESE RULES ARE NOTATTENDED THE
MANUSCRIPTWILL BE RETURNED TO THE AUTHOR.
9. THE NEGLECTFUL CASES WILL BE SOLVED BY
THE EDITORIAL COMMITTEE.
10. MANUSCRIPTS SHOULD BE SENT TO THE
FOLLOWINGADDRESS:
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
37200-000 – Lavras – MG – BRAZIL

Volume 6 Número 2

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