Livro de resumos Mostra Científica de Farmácia

Transcrição

ORGANIZAÇÃO
Coordenação Geral da XI Jornada Acadêmica e Mostra Científica do Curso de Farmácia –
UEPG
Profa. Dra. Patrícia Mathias Döll Boscardin
Profa. Msc. Ana Paula Weber
Coordenação da Mostra Científica
Profa. Dra. Jane Manfron Budel
COMISSÃO GERAL
Professores: Ana Paula Veber, Patricia Mathias Döll Boscardin
Acadêmico: Valter Paes de Almeida
COMISSÃO ESTRUTURAL
Prof: Edmar Miyoshi
Acadêmicos: Guilherme dos Anjos Camargo, Alexandre Alves de Oliveira, Evelyn Assis de
Andrade, Leonardo da Rosa Oliveira, Tatiane Schamne, Paula Olsen Sorgatto, Naiara de
Oliveira Pazian, Kamila Agda Becher Lins, Elizabete Munhoz
COMISSÃO DE DIVULGAÇÃO
Profa: Stella de Bortoli
Acadêmicos: Lohanne Elis Cordeiro Paz, Anatchelyn Juliana Peron Barbosa, Bruna
Roberta Kruger
COMISSÃO CIENTÍFICA
Profa: Jane Manfron Budel
Acadêmicos: Laís Costa Ayub, Luiza Stolz Cruz, Maryana Albino Clavero
COMISSÃO DE PATROCÍNIO
Profs: Mariane Ferreira de Faria, Bruno Ribeiro Cruz
Acadêmicos: Daiandra Fátima da Rosa Colarites, Mariana Vettorazzi, Letícia Martins,
Lislaine Maria Klider
COMISSÃO DE CONFRATERNIZAÇÃO
Acadêmicos: Pamella Cristina Oliveira Françóia, Fernanda Cristine Carneiro, Jessica
Bianca de Souza
SECRETARIA
Prof: Júlio César Miné
Acadêmicos: Millena Bayer, Jéssica Schemin, Milena de Oliveira, Larissa Seniv, Bruna
Ribeiro da Costa, Andressa Ivoglo Van Mierlo, Ana Paula Mikota Tavela
TESOURARIA
Profa: Fernanda Malaquias Barboza
Acadêmicos: Claudia Daiane Stefanczak, Lorena Miná Rodrigues
APRESENTAÇÃO
É com grande satisfação que comunicamos a realização da XI Jornada Acadêmica e
Mostra Científica de Farmácia – UEPG no período de 29 de setembro a 01 de outubro de 2015. A
Jornada é uma realização do Centro Acadêmico de Farmácia Jayme Gusmann em parceria com o
Colegiado do Curso de Farmácia e com os Departamentos de Farmácia e de Análises Clínicas e
Toxicológicas da Universidade Estadual de Ponta Grossa.
Este evento é de grande valor para o aprimoramento e atualização dos conhecimentos dos
acadêmicos e pós-graduandos do curso de Farmácia, além de proporcionar a troca de saberes e
oportunizar o contato com pesquisadores de outras universidades, institutos de pesquisa e
indústrias.
Este ano a XI Jornada Acadêmica e Mostra Científica de Farmácia abordará temas
relacionados principalmente às novas possibilidades de atuação do profissional farmacêutico.
Profa. Dra. Patrícia Mathias Döll Boscardin
Profa. Msc. Ana Paula Weber
PROGRAMA
APRESENTAÇÕES EM POSTERS
TRABALHO 1
Redução enantiosseletiva da acetofenona e p-nitroacetofenona
utilizando micro-organismos como biocatalisadores
Raphael Vieira Lopes (IC) E-mail: [email protected]
Tatiane Schamne (G) E-mail: [email protected]
Luciana de Boer Pinheiro de Souza (PQ) E-mail: [email protected]
Sônia Alvim Veiga Pileggi (PQ) E-mail: [email protected]
Adriana Knob (PQ) E-mail: [email protected]
Eduardo Sidinei Chaves (PQ) E-mail: [email protected]
Luciano Fernandes (PQ) E-mail: [email protected]
Luciano Moro Tozetto (PG) E-mail: [email protected]
G – aluno de graduação;
PG – aluno de Pós-Graduação;
IC – aluno de iniciação científica regularmente registrado na Instituição de Ensino;
PQ – professor responsável pela orientação.
Resumo: A obtenção de compostos enantiomericamente puros é alvo das indústrias farmacêuticas, já que
as mudanças conformacionais entre enântiomeros acarretam alterações na atividade biológica de
fármacos. Um método conhecido para obtenção desses compostos é o uso de enzimas nas reações de
síntese, biocatalisadores específicos que apresentam enantiosseletividade e alta eficiência de catálise. A
utilização de micro-organismos como fonte de enzimas para reações de redução assimétrica de cetonas
pró-quirais, é uma técnica bem estabelecida na área da biocatálise. Nesse contexto, este trabalho visou
estudar através das reações de redução da acetofenona e da p-nitroacetofenona, o potencial biorredutor
de sete cepas fúngicas isoladas do solo e da Mata Atlântica do Paraná. As reações de biocatálise foram
acompanhadas por cromatografia gasosa com coluna capilar quiral e comparadas ao padrão do álcool
quiral e da cetona de partida. Através dos cromatogramas calculou-se as porcentagens de conversão e o
excesso enantiomérico do produto das reações. Das cepas testadas, cinco converteram a pnitroacetofenona no respectivo álcool, sendo que três apresentaram cerca de 90% de conversão, variando
em seus valores de excesso enantiomérico. No que diz respeito à redução da acetofenona, três cepas
realizaram a conversão no álcool correspondente, apresentando valores significativamente baixos nos dois
aspectos analisados. Concluiu-se que de todas as reações as que tiveram como substrato a pnitroacetofenona apresentaram os melhores resultados, destacando-se a cepa fúngica denominada BU, a
qual teve excelentes valores de conversão e excesso enantiomérico.
Palavras-chave: biocatálise, redução, enantiosseletividade.
1. Introdução
Segundo Solomons (2007), uma molécula quiral é definida como aquela que não é idêntica a sua
imagem especular, não sendo sobreponíveis uma a outra. Esse atributo geométrico é
característico de substâncias que possuem um ou mais centros quirais, que são átomos que em
todas as suas ligações possuem substituintes diferentes. Uma molécula quiral e sua imagem no
espelho são chamadas de enantiômeros, os quais possuem as mesmas propriedades físicas,
diferenciando-se apenas em sua conformação espacial. A maioria das substâncias que compõe
os seres vivos são quirais, como por exemplo, enzimas, DNA, anticorpos e hormônios.
Atualmente sabe-se que substâncias farmacológicas usadas como princípio ativo de
medicamentos, não devem ser empregadas na forma de racematos, já que a diferença entre as
formas espaciais de um par de enantiômeros produz alterações em suas propriedades biológicas,
influenciando na atividade do fármaco (PILLI, 2001; RODRIGUES, 2001). A obtenção destes
compostos em sua forma enantiomericamente pura é, sem dúvida, uma das mais promissoras
aplicações da biocatálise.
Um método conhecido para obtenção de compostos enantiomericamente puros é o uso de
enzimas, que comumente vêm sendo empregadas na transformação de moléculas bioativas
(FABER, 2007). As enzimas são proteínas de alto peso molecular, que atuam como
biocatalisadores específicos e eficientes, devido à composição e conformação de seu sítio ativo.
São classificadas segundo a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular em seis
grupos principais, conforme as reações por elas catalisadas: oxidoredutases, transferases,
hidrolases, isomerases, liases e ligases. A aplicação de enzimas como catalisadores em reações
orgânicas tem sido objeto de muitos estudos devido às vantagens que apresentam quando
comparados aos catalisadores convencionais. As principais são a alta estereosseletividade dos
produtos obtidos, o uso de condições reacionais brandas, e serem ambientalmente aceitáveis,
pois são totalmente degradáveis.
A utilização de microrganismos como fonte de enzimas para a redução assimétrica de cetonas
pró-quirais é uma técnica bem estabelecida na área de biocatálise (PEDRINI, 2009). Embora
alguns biocatalisadores sejam extraídos de tecidos animais e vegetais, as enzimas industriais são
geralmente obtidas de microrganismos (bactérias, e fungos). Os microrganismos são capazes de
produzir milhares de enzimas distintas, já que necessitam delas para suas reações metabólicas.
As espécies fúngicas ainda permitem que seu meio de cultivo seja usado como meio reacional,
sem que se faça necessário a lise de suas células, pois parte de sua digestão é feita de forma
extracelular, onde o organismo secreta enzimas para este meio. O uso dessas enzimas como
catalisadores em reações orgânicas, nos permite obter produtos quirais, como álcoois, muitas
vezes com grandes proporções de excesso enantiomérico, devido sua enantio, regio e
quimiosseletividade.
Embora não sejam muito conhecidos por suas atividades farmacológicas, os álcoois quirais são
importantes compostos, que podem servir como intermediários ou como blocos de construção quirais
(“chiral building blocks”) na síntese de diversos compostos de importância biológica (Figura 1) (TEMBA,
2003). Entre vários exemplos, o (S)-(-)-3-hidróxi-butanoato de etila (1), oticamente ativo, é um dos álcoois
quirais mais utilizados como precursor em síntese orgânica; o (S)-(+)-sulcatol (2), é importante insumo
para a síntese de outros produtos naturais; o (R)-lavandulol (3), atua como importante aditivo na indústria
de perfumes; o (S)-mentol, é um terpeno quiral que possui grande aplicação como aromatizante (4).
OH
OH
CO2Et
(S)-(-) hidróxi-butanoato de etila
(S)-(+)-sulcatol
(2)
(1)
OH
OH
OH
(R)-lavandulol
(S)-mentol
(3)
(4)
Figura 1 – Exemplos de álcoois quirais usados nas sínteses orgânicas
O uso de sistemas com células de microrganismos e vegetais, tem conduzido a preparação de álcoois
quirais com alta seletividade e rendimento, e na maioria dos casos a formação de compostos com
configuração S é observada (CORDELL, 2007). Portanto, é vantajosa a utilização de microrganismos como
biocatalisadores alternativos.
Na busca pelo biocatalisador ideal, inúmeros estudos de triagem de microrganismos, potenciais produtores
de redutases, vêm sendo realizados. A utilização de biocatalisadores em reações de redução de
compostos carbonílicos surge como a melhor estratégia para a obtenção de álcoois com alta
enantiosseletividade, considerando que as enzimas possuem sítios catalíticos com reconhecimento quiral.
2. Objetivos
a) Cultivar cepas fúngicas visando induzir a produção de enzimas desidrogenases;
b) Preparar padrões dos alcoóis racêmicos p-nitrofeniletanol e 1-feniletanol via reações de redução com
borohidreto de sódio;
c) Utilizar as cepas fúngicas cultivadas em meio líquido como biocatalisadores nas reações de redução da
acetofenona e da p-nitroacetofenona, avaliando sua capacidade biorredutora na formação dos seus
respectivos alcoóis enantiomericamente puros;
d) Propor novas metodologias sintéticas para redução de cetonas a álcoois quirais, utilizando
microorganismos como biocatalisadores.
3. Materiais e Métodos
3.1 Meios de cultivo, reagentes, solventes, e biocatalisadores
Para os meios de cultivo sólido usou-se batata dextrose Agar (BDA) (Himedia), e para os meios de cultivo
líquidos batata comum (adquirida no comércio local), dextrose (Vetec) e água destilada. Como substrato
para as reações de redução utilizou-se a p-nitroacetofenona (Aldrich) e a acetofenona (Aldrich)
solubilizadas em dimetilsulfóxido (DMSO) (F. Maia).
Os padrões racêmicos do (R,S) p-nitrofeniletanol e (R,S) 1-feniletanol foram preparados por redução da pnitroacetofenona e acetofenona com NaBH4 (Sigma Aldrich) em metanol grau HPLC.
Como biocatalisadores para as reações de redução foram utilizadas sete cepas fúngicas, das quais 5
pertencem à coleção da professora Dra. Adriana Knob do departamento de Biologia Geral da
UNICENTRO, e outras duas pertencentes à coleção da professora Dra. Sônia Alvim Veiga Pileggi do
departamento de Biologia Estrutural e Genética da UEPG, denominadas em: Alt, BU, D6, J3, J38, Mim01
e Tricho.
O método de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) foi utilizado para acompanhar as reações
químicas e biocatalíticas das cetonas. Para isso, utilizou-se cromatofolhas de alumínio em sílica gel
(MERCK), como eluente foram utilizados o hexano P.A (Dinâmica) e acetato de etila (Dinâmica) (8:2).
Para as extrações líquido-líquido das alíquotas, utilizou-se diclorometano grau HPLC e Sulfato de Sódio
Anidro (Sigma Aldrich).
Como solvente para análise no cromatógrafo gasoso, foi usado acetato de etila grau HPLC.
3.2 Equipamentos
Tanto para a fase de cultivo das cepas fúngicas como para as reações de biorredução foi utilizada
incubadora tipo shaker, cedido pela pós-graduação em Biologia Evolutiva da UEPG.
As amostras (alíquotas das reações após a extração líquido-líquido) foram analisadas em cromatógrafo de
fase gasosa da marca Yang Lin, modelo YL6100, equipado com detector de Ionização de chama – FID,
cedido pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná, campus de Ponta Grossa, utilizando coluna
quiral Cyclosil-B (30m x 0.25mm x 0.25µm de filme) da Agilent J&W CG Colunums.
Outros equipamentos utilizados foram: micropipeta, balança analítica, câmara reveladora com lâmpada de
UV (254 nm), câmara de fluxo laminar, autoclave, evaporador rotativo e bomba a vácuo.
3.3 Procedimentos
3.3.1 Condições de cultivo das cepas fúngicas
Os fungos selecionados foram cultivados em batelada utilizando-se como meio de cultura sólido
batata dextrose Agar (BDA). Os meios foram autoclavados a 121ºC durante 20 minutos, e então
vertidos em placa de petri estéril. Após resfriamento das placas, foi retirado um fragmento de 5x5
mm de uma cultura já crescida do micro-organismo, e tranferida para uma placa resfriada.
Terminado o cultivo de todas as cepas, as placas inoculadas foram levadas à estufa para
incubação, e lá permaneceram de 7 a 15 dias, sob temperatura de 28°C.
3.3.2 Procedimento geral para a preparação dos padrões de álcoois quirais.
Para obtenção dos alcoóis racêmicos os substratos, p-nitroacetofenona e acetofenona, foram
reduzidos com NaBH4 (agente redutor), obtendo-se como produto o (R,S) p-nitrofeniletanol e
(R,S) 1-feniletanol .
Em um balão de fundo redondo, adicionou-se 2 g (1 equivalente) do substrato cetônico dissolvido
em aproximadamente 50 mL de metanol e 5 equivalentes do agente redutor, controlando-se a
temperatura do meio reacional (20-25ºC) em banho de gelo. As reações foram acompanhadas
por cromatografia em camada delgada (CCD), e após o consumo do material de partida, realizouse três extrações em funil de separação, com 30mL de diclorometano cada. O resíduo foi
submetido à desidratação com NaSO4 anidro, sendo posteriormente rotaevaporado. Os resíduos
restantes correspondentes aos alcoóis racêmicos, foram solubilizadados em acetato de etila grau
HPLC, e analisados em cromatógrafo em fase gasosa.
3.3.3 Procedimento geral para as reações de biorredução das cetonas
Das cepas fúgicas cultivadas em meio sólido tranferiu-se três discos (3,3mm) para erlenmeyers
contendo 100 mL de meio líquido, os quais foram levados à agitador orbital tipo shaker a 100 rpm
a 28 °C. Após 4 dias do crescimento micelial, adicionou-se 100 mg da p-nitroacetofenona ou 70
µL de acetofenona solubilizadas em 1 mL de DMSO e mantidos sob incubação por mais três
dias. Alíquotas foram retiradas dos sistemas reacionais a cada 24 horas, durante três dias, as
quais foram submetidas a processo de extração líquido-líquido com acetato de etila grau HPLC. O
resíduo gerado foi injetado no cromatógrafo de fase gasosa com coluna quiral, a fim de verificar a
formação dos produtos e determinar a eficiência da reação através da porcentagem de conversão
(%c) e do excesso enantiomérico (ee). Para cada cepa fúngica foi realizado o procedimento
reacional em triplicata.
3.3.4 Análise cromatográfica
As análises foram realizadas pela injeção de 1 µL da amostra solubilizada em acetato de etila
grau HPLC no cromatógrafo a gás com coluna quiral utilizando métodos diferentes para cada
substrato, como demonstra a Tabela 1.
Tabela 1 – Parâmetros para análise em cromatografia de fase gasosa
Parâmetro
Acetofenona P-nitroacetofenona
Temperatura do injetor
220°C
220°C
Temperatura do detector
220°C
220°C
Temperatura inicial
110°C
150°C
Taxa de aquecimento
1,5ºC/min
1,5ºC/min
Temperatura final
131°C/min
180°C
Tempo final
3 min
5 min
Fonte: do autor
Os compostos foram identificados através da comparação entre os picos dos cromatogramas das
amostras e os picos dos cromatogramas dos padrões, verificando os seus respectivos tempos de
retenção.
4. Resultados e Discussão
Na Tabela 2 apresentam-se as porcentagens de conversão em produto (%c) e as porcentagens de
excesso enantiomérico (%ee) para as reações de redução da p-nitroacetofenona biocatalisadas por cepas
fúngicas (Figura 2).
O
OH
OH
Cepas fúngicas
28ºC, 100 RPM
NO2
p-nitroacetofenona
+
NO2
(S)-1-(4-nitrofenil)etanol
NO2
(R)-1-(4-nitrofenil)etanol
Figura 2 – Reação de biorredução da p-nitroacetofenona.
Tabela 2 – Porcentagens de Conversão (%c) e excesso enantiomérico (%ee) obtidas nas reações de biorredução da
p-nitroacetofenona
Fungo
Tempo (h)
%c
% ee
24
90,3
70,7
BU
72
92,6
72,1
24
90,1
6,1
Alt
72
92,0
8,8
24
Tricho
72
94,5
43,9
24
65,3
42,2
Mim01
72
65,4
48,1
24
58,4
63,2
D6
72
54,4
64,3
24
J38
72
24
J3
72
Fonte: do autor.
Analisando os dados da tabela 2 observa-se que somente na presença das cepas J3 e J38 não obteve-se
formação de produtos. As cepas BU, Alt, Tricho, D6 e Mim01 converteram a p-nitroacetofenona no
respectivo álcool quiral, destacando-se as porcentagens de conversão das três primeiras, a qual girou em
torno de 90%. Pode-se observar ainda, que já nas primeiras 24 horas de reação as duas primeiras cepas
exerceram quase sua capacidade máxima de catálise.
No que diz respeito ao excesso enantiomérico, evidentemente a cepa fúngica que teve melhor
desempenho foi a BU, com cerca de 71%, seguida das D6, Mim01 e Tricho, que apresentaram cerca de
60%, 48% e 44% respectivamente. Embora tenha uma boa porcentagem de conversão a cepa Alt,
apresentou baixos níveis de excesso enantiomérico.
As reações foram analisadas por cromatografia gasosa com coluna quiral a fim de verificar a formação
dos produtos e determinar a porcentagem de conversão (%c) e o excesso enantiomérico (%ee). Os
compostos foram identificados através da comparação com os picos dos padrões nos cromatogramas,
verificando os seus respectivos tempos de retenção. As %c e %ee foram determinadas pela área dos
picos (Figura 3).
a
b
c
Figura 3 - Cromatogramas das reações da p-nitroacetofenona. a) Padrão químico p-nitroacetofenona; b) Padrão
químico (R,S) p-nitrofeniletanol; c) Reação biocatalítica da p-nitroacetofenona com a cepa BU em 72h.
Para as reações de redução da acetofenona (Figura 4), biocatalisadas pelas mesmas cepas fúngicas, as
porcentagens de conversão em produto (%c) e as porcentagens de excesso enantiomérico (%ee) estão
apresentadas na Tabela 3.
O
OH
OH
Cepas fúngicas
+
28ºC, 100 RPM
acetofenona
(S)-1-feniletanol
(R)-1-feniletanol
Figura 4 – Reação de biorredução da acetofenona.
Tabela 3 – Porcentagens de Conversão (%c) e excesso enantiomérico (%ee) obtidas nas reações de biorredução da
acetofenona
Fungo
Tempo (h)
%c
% ee
24
BU
72
25,3
63,4
24
18,7
33,3
Alt
72
22,7
76,4
24
23,1
30,5
Tricho
72
37,3
30,4
24
Mim01
72
7,70
100,0
24
D6
72
24
J38
72
24
J3
72
Fonte: do autor
Analisando os dados da Tabela 3 observa-se que somente as cepas Alt, BU, Tricho e Mim01 converteram
parte da acetofenona no respectivo álcool, apresentando valores de conversão significativamente baixos.
A melhor porcentagem de conversão foi observada para a cepa Tricho, seguida da BU, Alt e Mim01,
respectivamente.
No que diz respeito ao excesso enantiomérico, a cepa que teve melhor resultado foi a Mim01,
apresentando 100% de conversão em somente um isômero, embora a conversão em produto tenha sito
extremamente baixa.
5. Conclusão
Após a análise de todos os dados recolhidos, pode-se concluir que a cepa BU é a mais promissora para a
redução dos dois substratos em questão, sendo uma metodologia eficiente na redução de cetonas para
formação de álcoois quirais. No que diz respeito a p-nitroacetofenona esta cepa apresentou um dos
melhores valores de porcentagens de conversão (92,6%), destacando-se em seu excesso enantiomérico
(72,1%). As cepas Tricho e Alt também se mostraram promissoras no que diz respeito as porcentagens de
conversão, ficando acima de 90%, embora tenham apresentado baixos excessos enantioméricos.
Já em relação à acetofenona, embora o valor de conversão tenha sido pouco expressivo, a cepa BU
manteve-se entre as melhores porcentagens de conversão (25,3%), e com um bom excesso
enantiomérico (63,4%).
Há de se destacar a grande diferença de porcentagens de conversão entre as duas
cetonas testadas, fato esse que já era esperado devido à diferença estrutural existente
entre elas. A p-nitroacetofenona, apresenta em sua estrutura um grupamento nitro (NO2),
que possui como característica a retirada de elétrons do anel aromático, tornando a
molécula mais reativa.
Referências
CORDELL, G.A.; LEMOS, T.L.G.; MONTE, F.J.Q.; MATTOS, M.C. Vegetables as Chemical Reagents. Journal
Natural Products. v.70, p.478-492, 2007.
FABER, K. Biotransformations in Organic Chemistry. 5 ed. Berlin: Springer-Verlag. p. 402, 2007.
PEDRINI, P.; GIOVANNI, P. P.; MANTOVANIA, M.; ANDREOTTI, E.; COLALONGO, C. Reduction screening with
endophytic fungi: Synthesis of homochiral secundary alcohols. J. Mol. Cat. B: Enz, v. 60, p. 145-150, 2009.
PILLI, R. A. Catálise assimétrica e o prêmio Nobel de química de 2001. Novos paradigmas e aplicações práticas.
Quím. Nova na Escola, v. 14, p. 16-24,2001.
RODRIGUES, J. A. R.; MORAN, P. J. S. Reduções enantiosseletivas de cetonas utilizando-se fermento de pão.
Quím. Nova, v. 24, n. 6, p. 893-897, 2001.
SOLOMONS, T. W. G. Química Orgânica, 6. ed. Rio de Janeiro: LTC, v. 1, p.158, 2007.
TEMBA, E. S. C.; OLIVEIRA, I. M. F.; DONNICI, C.L. Álcoois quirais: métodos químicos e catalíticos de obtenção por
redução assimétrica. Química Nova, v. 26, n. 1, p. 112-122, 2003.
TRABALHO 2
Obtenção de Nanocápsulas contendo óleo essencial de Melaleuca
alternifolia e Micropartículas de Polilisina
Rosana Leticia da Rosa (IC) E-mail: [email protected]
Luana Serbai (G) E-mail: [email protected]
Daiane Cristine Mirante (PG) [email protected]
Patricia Mathias Doll Boscardin (PQ) E mail: [email protected]
Josiane de Fatima Padilha (PQ) E-mail: [email protected]
Resumo: O desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos tem sido alvo de muitas
pesquisas devido à resistência constante adaptação dos micro-organismos ao fármaco e
consequente resistência bacteriana, além dos efeitos colaterais causados por eles. Algumas
alternativas como a nanoencapsulação e microencapsulação de ativos antimicrobianos, que
permitem maior tempo do ativo na circulação, menor toxicidade e vetorização do fármaco, têm
sido estudadas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de nanocápsulas
poliméricas contendo óleo essencial de Melaleuca alternifolia e micropartículas de ε-poli-L-lisina
(ε-PLL). As nanocápsulas revestidas com ε-PLL apresentaram diâmetro médio nanométrico
(173,9 nm), potencial zeta positivo e índice de polidispersão de 0,17. As micropartículas foram
obtidas pela técnica de secagem por aspersão e apresentaram diâmetro médio de 1099 nm,
potencial zeta positivo e índice de polidispersão de 1,00.
Palavras-chave: Nanocápsulas; óleo essencial de Melaleuca alternifolia; micropartículas; ε-poli-L-lisina.
1. Introdução
Novas alternativas estão sendo pesquisadas como terapia antimicrobiana, pois muitas vezes as já
existentes podem provocar efeitos adversos e danos irreparáveis à saúde. Outro fator importante
em destaque é a resistência microbiana frente aos diversos agentes antimicrobianos (ANTUNES
et al., 2006).
Algumas alternativas estão sendo estudadas para que o fármaco seja levado o mais próximo do
alvo de ação ou até mesmo intracelularmente, aumentando, assim, a sua ação e diminuindo seus
efeitos adversos. Neste sentido, destacam-se as nanocápsulas poliméricas carregadas com
antimicrobianos, que promovem a diminuição da toxicidade e, se comparada com formas
farmacêuticas convencionais, não resulta em uma perda da eficácia do mesmo (MOHAMMADI et
al., 2011).
As micropartículas geralmente estão associadas a um polímero, essas apresentam tamanhos que
variam de 1 a 1000 micrômetros e podem ser classificadas em microcápsulas ou microesferas
conforme sua organização. As microcápsulas formam um sistema do tipo reservatório, onde o
núcleo está envolvido por um polímero. Nas microesferas o material a ser microencapsulado pode
estar adsorvido, incorporado ou ligado covalentemente a rede tridimensional formada pelo
polímero (JAFARI et al., 2008).
Segundo kawashima (1993) os sistemas multiparticulas possuem vantagens em relação a
sistemas unitários, como redução dos danos locais, uma pequena variação da biodisponibilidade
e redução dos riscos de toxicidade, isso se deve a distribuição uniforme e rápida no trato
gastrintestinal.
Os polimeros e seus derivados estão sendo muito usados para o desenvolvimento de nano e
microparticulas encapsuladas de liberação controlada (JAIN, 2000). A ε-poli-L-lisina (ε-PLL) é um
homopolimero, esse tem sido muito usado em alimentos devido sua grande atividade
antimicrobiana e termoestabilidade. A ε-PLL também está sendo usada em medicamentos, devido
sua eficacia em remover seletivamente endotoxinas, reduzindo a toxicidade celular, melhorando a
adesão das células, inibindo a atividade da lipase pancreática, e também inibe a produção da
toxina bacteriana bucal (BO, 2014). Segundo Shima a ε-PLL possui uma atividade antimicrobiana
contra bactérias gram positivas, negativas e leveduras.
A Poli (ε-caprolactona) (PCL) é um poliéster biodegradável, usado na produção de nanoparticulas
(KHOEE AND YAGHOOBIAN, 2008). Segundo M. Hakkarainen (2002) a PCL está sendo aplicada
em várias formulações de liberação controlada devido sua boa biodegradabilidade e
biocompatibilidade com fármacos. Isso garante uma distribuição uniforme do fármaco na matriz e
a desejada liberação controlada, podendo levar meses.
A nanotecnologia está sendo associada a antimicrobianos, como o óleo da árvore-do-chá (tea
tree oil - TTO), também conhecido como óleo essencial de Melaleuca alternifolia (MARKHAM, et
al., 2000). Sabe-se que o TTO é obtido através da destilação a vapor das folhas da Melaleuca
alternifolia chell (CARSON et al., 2006), dessa forma o óleo essencial de Melaleuca alternifolia
chell (MYRTACEAE) tem se mostrado como agente antimicrobiano (Garozzo et al., 2011),
antiinflamatório (Brand et al., 2001) e anticancerígeno (Bozzuto et al., 2011).
Há poucas evidencias que indicam o TTO com um potencial citotóxico significativo. Existem
alguns estudos que avaliam o efeito tóxico do TTO em linhagens de células in vitro, incluindo
células epiteliais e fibroblastos (NIELSEN, 2008). Em doses elevadas esse pode se tornar tóxico,
ou seja, a toxicidade é dose dependente (HAMMER et.al., 2006). Os queratinócitos são linhagens
apropriadas para testes de compatibilidade cutânea (WIEGAND et al., 2009).
2. Objetivo
Esse trabalho tem como objetivo desenvolver nanocápsulas contendo óleo de Melaleuca
alternifolia chell revestidas com ε-Poli-lisina (ε-PLL) assim como micropartículas de ε-PLL.
3.1 Obtenção da solução de nanocápsulas poliméricas
Foram preparadas duas soluções de nanocápsulas, a primeira contendo Poli(ε- caprolactona)
(PCL) como parede polimérica. A segunda suspensão foi obtida revestindo a parede polimérica
de PCL com ε-Poli-lisina (ε-PLL). As duas suspensões foram obtidas pela técnica de deposição
interfacial de um polímero pré-formado, desenvolvida por Fessi et al. (1989).
Na preparação das suspensões de nanocápsulas a fase orgânica foi obtida a partir do PCL, onde
esse foi solubilizado em acetona a uma temperatura de 40 °C sob agitação magnética constante
e seguida da adição de Span 80® e óleo essencial de Melaleuca alternifólia. Essa solução foi
gotejada, usando uma bureta (1cm de diâmetro interno) com uma taxa de gotejamento de 1 mL
min-1, na fase aquosa constituída por Tween 80®, previamente preparado sob agitação magnética
e temperatura de 40°C. Após o termino do gotejamento a agitação foi mantida por mais 10
minutos. O excesso do solvente da suspensão foi evaporado a pressão reduzida em
rotaevaporador (Fisatom), a uma temperatura de 40°C, até o volume final de 10 mL, ajustando
assim a concentração do óleo essencial de Melaleuca alternifólia em 50 mg mL-1.
As suspensões foram mantidas em frasco âmbar sob refrigeração. Para o revestimento catiônico
foi preparada uma suspensão de ε-PLL a qual foi mantida sob agitação juntamente com a
suspensão de nanocápsulas, preparada previamente, por 30 minutos.
3.2 Caracterização físico-química das nanocápsulas poliméricas
3.2.1 Determinação do potencial Zeta e diâmetro médio
O potencial zeta e o tamanho das nanocápsulas de PLL foram determinados em espectrômetro
de auto-correlação a laser (MALVERN INSTRUMENTS, modelo Zetasizer Nanoseries ZS90). A
solução foi diluída (1:100 v/v) em água Mili-Q. O diâmetro e o índice de polidispersão foram
realizados no mesmo equipamento com a mesma proporção de diluição.
3.2.2 Determinação do pH
O pH foi determinado em potenciômetro digital (Hanna Instruments), previamente calibrado com
tampão 4,0 e 7,0.
3.3 Análise por microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo (FEG)
A avaliação morfológica e de superfície das nanocápsulas foi realizado no microscópio eletrônico
de varredura com emissão de campo (TESCAN, modelo Mira3). Foi adicionado 10 µL nas placas
de suporte do equipamento e secas a 40 °C na estufa microbiológica (QUIMIS, modelo Q316M4),
por 24 horas. As imagens foram obtidas após analise das amostras e os registros ocorreram por
meio de software específico.
3.4 Obtenção de micropartículas de ε-poli-L-lisina (ε-PLL)
Foi preparada um solução de ε-PLL com concentração de 10 mg mL-1, em seguida essa foi
atomizada em um mini Spray -Dryer MSD 0.5 (Labmaq), levando em conta os parâmetros
previamente estudados, sendo: fluxo de alimentação 0,15 mL min-1, fluxo de ar 35 L min-1,
pressão de ar comprimido de 4 bar, temperatura de entrada do ar de secagem de 60 °C ± 5°C e
temperatura de saída do ar de secagem de 90 °C ± 5 °C.
3.5 Análises físico-químicas das micropartículas de ε-PCL
O pH foi determinado em potenciômetro digital (Hanna Instruments) previamente calibrado com
soluções tampão pH 4,0 e 7,0, diretamente na solução das micropartículas com concentração de
4 mg mL-1.
3.5.2 Potencial Zeta
O potencial Zeta foi determinado com solução de micropartículas (1:500 v/v) em água MiliQ no
equipamento Zetasizer Nanoseries ZS90 (MALVERN INSTRUMENTS).
4. Resultados e discussão
4.1 Preparação e caracterização das suspensões de nanocápsulas com óleo essencial
Melaleuca alternifolia revestidas e não com ε-PLL
A obtenção das nanocápsulas de óleo de Melaleuca alternifolia se deu por meio da metodologia
proposta. Em seguida essas passaram pelo processo de revestimento com a solução de ε-PLL. A
eficiência do revestimento foi avaliado através do potencial zeta (PZ), diâmetro médio (DM) e
índice de polidispersão (IPD) das nanocápsulas. Os resultados obtidos estão demonstrados na
tabela 1, assim como o das nanocápsulas não revestidas.
Tabela 1. Características físico-químicas das nanocápsulas não revestidas e revestidas
Nanocápsulas
não revestidas
Nanocápsulas
revestidas com
ε-PLL
Fonte: a autora
PZ
DM
IPD
- 33 mV
252,2 nm
0,21
+ 11,6 mV
173,9 nm
0,17
A figura 1 está demonstrando o PZ das nanocápsulas não revestidas e a figura 2 a mesma
analise para nanocápsulas revestidas com ε-PLL. Segundo Avadi et al. (2010) os valores de IPD
podem variar entre 0 e 1, onde os próximos a 0 indicam uma dispersão homogênea e os acima
de 0,5 heterogêneos. Assim todas as dispersões foram consideradas homogêneas. Em relação
ao PZ, Neves et al. (2013) relata que valores absolutos próximos a |30| mV são considerados
estáveis, sendo que o fenômeno de floculação ocorre mais facilmente com valores próximos a 0 e
5 mV. O valor positivo +11,6 mV obtido nas nacocápsulas revestidas indica que houve adsorção
da ε-PLL na superfície das partículas. De acordo com Calvo et. al. (1997) esse valor refere-se aos
grupos aminos da ε-PLL.
Figura 1- Potencial Zeta das nanocápsulas não revestidas
Zeta Potential Distribution
500000
Total Counts
400000
300000
200000
100000
0
-100
0
100
200
Zeta Potential (mV)
Record 8: nano 4 1
Figura 2- Potencial zeta das nanocápsulas revestidas com ε-PLL
As nanocápsulas apresentaram pH ácido de 5,07, formato esférico
esférico e superfície irregular,
conforme as figuras abaixo, essas foram caracterizados por FEG.
Figuras 3 e 4 - Nanocápsula de óleo de Melaleuca alternifólia revestida com ε--PLL.
Figuras 5 e 6 - Nanocápsulas de óleo de Melaleuca alternifolia não revestidas.
4.3 Preparação e caracterização das micropartículas de ε-PLL
As micropartículas de ε-PLL
PLL foram preparadas conforme descrito anteriormente. A avaliação se
deu pelo meio do potencial zeta, diâmetro médio, índice de polidispersão e pH, os valores estão
apresentados na tabela 2.
Tabela 2. Avaliação das micropartículas de ε-PLL
Microparticulas
de ε-PCL
Fonte: a autora
PZ
DM
IPD
pH
14,8 mV
1099 nm
1,00
5,07
Os valores obtidos de PZ e pH das micropartículas eram esperados devido aos grupos aminos
protonados. A figura 7 está demonstrando o PZ das micropartículas de ε-PLL.
Figura 7- Potencial zeta de micropartículas de ε-PLL.
5. Conclusão
A obtenção das nanocápsulas de PCL com óleo essencial de Melaleuca alternifolia a partir da
deposição interfacial foi adequada, pois obteve-se potencial zeta negativo e diâmetro médio de
252,2 nm. Após a adsorção da ε-PLL o esse tornou-se positivo, indicando eficácia do método. Em
relação ao índice de polidispersão pode-se considerar a dispersão de nanocápsulas
homogêneas.
As micropartículas poliméricas obtidas através do processo de secagem por aspersão
apesentaram potencial zeta de +14,8 mV e diâmetro médio de 1099 nm.
Referências
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TRABALHO 3
Contribuição ao estudo farmacognóstico de Tropaeolum majus L.
Camila Dias Machado (G) E mail: [email protected]
Jane Manfron Budel (PQ) E mail: [email protected]
G – aluna do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa;
PQ – professora do departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa, responsável pela orientação do
trabalho.
Resumo: Tropaeolum majus L. caracteriza-se por apresentar propriedades medicinais. É conhecida como
capuchinha, capucine, etc. É utilizada popularmente como antiescorbútica, antimicrobiana, anti-inflamatória, antihipertensiva, antidepressiva e cicatrizante. Este trabalho teve como objetivo determinar os parâmetros
farmacobotânicos presentes nesta planta, a fim de fornecer subsídios anatômicos para serem utilizados na indústria
de fitoterápicos. O material foi coletado no horto medicinal da Universidade Estadual de Ponta Grossa e submetido as
pesquisas microquímica, microscópica (luz e eletrônica de varredura) e análise do pó. A análise anatômica da lâmina
foliar, evidenciou epiderme uniestratificada, sendo as células da face adaxial maiores que as da face abaxial. A
cutícula evidenciou-se delgada e lisa. A folha apresenta estômatos do tipo anomocíticos e anisocíticos. Foram
observados inúmeros tricomas tectores pluricelulares unisseriados cônicos. Drusas de oxalato de cálcio foram
observadas na epiderme foliar e na epiderme da nervura, além disso, cristais prismáticos foram encontrados na
epiderme da nervura. O mesofilo é dorsiventral. No caule foram observadas 2 camadas de córtex e 3 camadas de
células lignificadas, que reagiram positivamente frente ao reativo floroglucina clorídrica, sendo uma característica
jamais visto na literatura. O sistema vascular é constituído por feixes vasculares colaterais livres. A análise do pó
atende a todas as exigências estabelecidas para a espécie. As características farmacobotânicas fornecem subsídios
para o controle da qualidade na indústria de fitoterápicos.
Palavras-chave: Anatomia, controle da qualidade, Tropaeolaceae.
1. Introdução
Tropaeolum majus L. (Tropaeolaceae) é uma planta medicinal que apresenta ação antimicrobiana, sendo
matéria-prima na indústria de fitoterápicos (ZANETTI et al., 2003; LOURENÇO et al., 2011). É conhecida
popularmente como capuchinha, capuchinho, capucine, cinco chagas, nastúrcio, chaguinha, mastruço-doperu, flor-de-sangue, agrião-do-méxico e papagaios (ALONSO; DESMARCHELIER, 2006; LORENZI;
MATOS, 2008; BARBOSA et al., 2012). É considerada uma planta herbácea, perene, cujas folhas são
grandes, simples e alternas, com aspecto circular. As flores são membranáceas e lisas, podendo ser de
amarelo-alaranjada a vermelho-escuro (RIBEIRO; BARBOSA; COSTA, 2012).
A capuchinha é atualmente cultivada em todo mundo, especialmente na Colômbia, Brasil e Perú. É
utilizada na medicina tradicional como antiescorbútica, antimicrobiana, anti-inflamatória, anti-hipertensiva,
antidepressiva e cicatrizante (ZANETTI, et al., 2003; ALONSO; DESMARCHELIER, 2006; LOURENÇO et
al., 2011). Quimicamente contém isotiocianato de benzila e este componente está relacionado à atividade
antimicrobiana, antiviral e antitumoral. Além disto, apresenta ácido erúcico, que demonstrou atividade
antimicrobiana (ZANETTI et al., 2003, 2004; LOURENÇO et al., 2011).
2. Objetivos
Considerando que a primeira análise no controle da qualidade da droga vegetal é a
análise anatômica, objetivou-se determinar os parâmetros farmacobotânicos presentes em
Tropaeolum majus L., a fim de fornecer subsídios farmacognósticos para serem utilizados
na indústria de fitoterápicos. Essa pesquisa faz parte do projeto de extensão intitulado
“Horto medicinal do curso de Farmácia: um espaço para o aprendizado farmacognóstico”,
no qual estão sendo identificadas e descritas botanicamente todas as espécies cultivadas.
Amostras de Tropaeolum majus L. foram coletadas em setembro de 2014, no horto medicinal do
curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa, campus Uvaranas, Ponta Grossa
(30º 10´ S e 51º 20´ W, 27m). Foi realizada a confecção da exsicata, e um representante da
espécie se encontra depositado no Herbário da Universidade de Ponta Grossa sob o número
HUPG 6782.
O material botânico foi fixado em solução de FAA 70 e armazenados em álcool etílico a 70%
(JOHANSEN, 1940; BERLYN; MIKSCHE, 1976). Lâminas semipermanentes foram preparadas
com o material seccionado nos sentidos transversal
transversal e longitudinal, à mão livre, e submetido à
coloração de azul de astra e fucsina básica (ROESER, 1972).
Para a pesquisa microquímica foram utilizados os seguintes reativos: solução de floroglucina
clorídrica para verificação de lignina, Sudan III para compostos lipofílicos, cloreto férrico para
compostos fenólicos, lugol para amido e ácido sulfúrico para verificação da natureza química dos
cristais (JOHANSEN, 1940; FOSTER, 1949; SASS, 1951; BERLYN; MIKSCHE, 1976; OLIVEIRA;
AKISUE, 1991).
copia eletrônica de varredura da superfície foliar e caulinar foi realizada em alto vácuo e
A microscopia
para tal procedimento, as amostras foram desidratadas em série etanólica crescente e pelo ponto
crítico e, após montagem em suporte, submetidas à metalização com ou
ouro e paládio no
microscópio eletrônico VEGA3 TESCAN no Laboratório Multiusuários C-LABMU/PROPESP,
C LABMU/PROPESP, da
Universidade Estadual de Ponta Grossa.
Para análise do pó, folhas e caules foram secos a 40ºC e moídos em moinho analítico. O material
foi padronizado em tamanhos iguais, cerca de 300mm/µm e analisado em microscopia de luz no
laboratório de Farmacognosia da UEPG (BARRETO et al., 2015).
4.1 Análise anatômica da folha
Figura 1 - Tropaeolum majus L. no hábito.
A análise anatômica da lâmina foliar, em secção transversal, evidenciou epiderme
uniestratificada, sendo as células da face adaxial maiores que as da face abaxial. Em vista frontal,
o revestimento epidérmico apresentou formato sinuoso com paredes anticlinais relativamente
delgadas,
lgadas, em ambas as faces. Células volumosas da base dos tricomas podem ser observadas.
Figura 2 - Vista frontal da epiderme abaxial.
A cutícula evidenciou-se
se delgada e lisa. A folha apresenta estômatos do tipo anomocíticos e
anisocíticos em ambas as faces,
aces, e estes se localizam no mesmo nível das demais células
epidérmicas.
Inúmeros tricomas tectores pluricelulares unisseriados cônicos, formados por cerca de 5 células,
de ápice agudo e de base bastante alargada podem ser observados na face abaxial. Drus
Drusas de
oxalato de cálcio foram observadas na epiderme foliar.
Figura 3 - Tricoma tector de base alargada
O mesofilo é dorsiventral, sendo constituído por uma camada de parênquima paliçádico típico e
por 4 estratos de parênquima esponjoso. Na região mediana
media
do mesofilo, feixes vasculares
colaterais de pequeno porte são envoltos por bainha parenquimática.
Figura 3 - Mesofilo foliar.
Em secção transversal, a nervura central mostra formato praticamente plano
plano-convexo. A
epiderme uniestratificada é revestida
revestida por cutícula delgada e lisa e, subjacentemente, o
clorênquima se interrompe e são encontradas 1 camada de colênquima angular e face adaxial e
2-3
3 na face abaxial. O sistema vascular é formado por um único feixe vascular colateral na região
mediana do parênquima
rênquima fundamental. Cristais prismáticos e drusas de oxalato de cálcio são
observados na epiderme da nervura.
Figura 4 - Nervura central em secção transversal.
O caule apresenta a epiderme uniestratificada com cutícula delgada e estriada. Em secção
transversal, este, mostra-se
se circular e adjacentemente à epiderme, 2 camadas de colênquima
angular são observadas. Na sequência, são observadas 2 camadas de córtex e 3 camadas de
células lignificadas, que reagiram positivamente frente ao reativo floroglucina
floroglucina clorídrica. Essa
característica não foi observada nessa espécie em estudo de Zanetti et al., (2004).
Figura 5 - Caule em secção transversal.
O sistema vascular é representado por feixes vasculares colaterais livres (cerca de 9). O floema
apresenta forma de U. A medula ocupa o maior volume do caule é formada por células
isodiamétricas e de parede delgada. Grãos de amido podem ser encontrados na medula.
Figura 6 - Detalhe do feixe vascular.
O pó atende a todas as exigências estabelecidas para a espécie.
espécie. São características: fragmentos
de tricoma tector, fragmentos de mesofilo contendo parênquima paliçádico e/ou parênquima
esponjoso, fragmentos de esclerênquima, células epidérmicas com paredes anticlinais sinuosas,
estômatos anomocíticos.
5. Conclusão
As características farmacobotânicas evidenciadas nesse estudo contribuem para a diagnose da
droga vegetal e fornecem subsídios para o controle da qualidade na indústria de fitoterápicos.
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p.173
jul./dez., 2004.
TRABALHO 4
A importancia da adequação da amostra na citopatologia cervicovaginal
Autor 1 (G) Bruna Ribeiro da Costa E-mail: [email protected]
Autor 2 (G) Flávia Ferrari Zlzebiela E-mail: [email protected]
Autor 3 (G) Caroline Wosniack E-mail: [email protected]
Autor 4 (PQ) Ednéia Peres Machado E-mail: [email protected]
Resumo: O câncer do colo uterino deve ser detectado na fase inicial. O Ministério da Saúde preconiza
que o exame seja realizado em mulheres entre 25 a 64 anos, ou sexualmente ativas. Após dois exames
consecutivos negativos, um exame a cada três anos. O exame de Papanicolaou é o método de escolha
para esse trabalho preventivo. Porém, erros de coleta, preparação do esfregaço, presença de sangue,
infiltrado leucocitário, sobreposição de células e artefatos de fixação podem influenciar na sensibilidade e
especificidade do teste podendo resultar em exame falso-negativo. Tendo ciência desses fatores que
afetam a qualidade do exame o objetivo deste trabalho foi averiguar a adequabilidade dos esfregaços
cervicovaginais coletados nas Unidades Básicas de Saúde Antero de Mello, Cezar Milleo e Antônio
Saliba, no município de Ponta Grossa. As análises foram realizadas pelo projeto “Prevenção e educação
na atenção à saúde da mulher: coleta de exame Papanicolaou”, no período de 2014. Foram analisadas
116 amostras, das quais apenas 21 foram consideradas satisfatórias por apresentaram células
endocervicais no preparado citológico. O presente trabalho demonstra a importância do projeto de
extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde mulher: coleta de Papanicolaou”, na educação em
saúde, no tocante ao preenchimento de lacunas na formação de profissionais, quanto à coleta de material
cervicovaginal.
Palavras-chave: esfregaço vaginal, neoplasias do colo do útero, junções intercelulares.
1. Informações Gerais - Introdução
O colo do útero é revestido por várias camadas de células epiteliais pavimentosas, que podem
sofrer alterações e evoluir para uma lesão cancerosa em um período de 10 a 20 anos. O câncer
em sua maioria tem evolução lenta passando por fases pré-clínicas que, se identificadas, podem
ser tratadas e curadas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). O câncer do colo uterino é o terceiro
mais incidente na população feminina brasileira, com uma estimativa para 2014 de 15.590 casos
novos. É caracterizado pela replicação desordenada das células do epitélio que reveste o órgão,
podendo se estender a órgãos próximos. Existem dois tipos de câncer do colo do útero:
carcinoma epidermoide (80% dos casos) e adenocarcinoma (20% dos casos), sendo o último
mais raro e mais grave. Em sua fase inicial normalmente não ocorrem sintomas podendo evoluir
para sangramento vaginal, secreção anormal e dor abdominal (INCA 2014).
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do câncer do colo do útero são: idade
precoce na primeira relação sexual, múltiplos parceiros, histórico de infecções sexualmente
transmissíveis, HPV, tabagismo, alimentação pobre em alguns nutrientes e uso de
anticoncepcional. O pico de incidência desse câncer está entre os 40 e 60 anos de idade
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).
A detecção do câncer é muito importante principalmente em sua fase inicial, para que a
intervenção possa ser feita e o tratamento iniciado. O Ministério da Saúde preconiza que o exame
seja realizado anualmente em mulheres entre 25 a 64 anos (BRASIL, 2014), ou sexualmente
ativas e, após dois exames consecutivos negativos, um exame a cada três anos (AMARAL et al.,
2008).
O exame de Papanicolaou é o teste preconizado no Brasil para o rastreamento do câncer do colo
uterino. É realizado por raspagem de amostra da ectocérvice com espátula de Ayre e da
endocérvice com o auxílio da escovinha cervical.
O material é colocado em lâmina, em esfregaço unidirecional, e logo em seguida fixado com
álcool 95% ou polietilenoglicol, para manter a integridade das células. Os fixadores reagem com
os componentes celulares, sendo que o álcool fixa e o polietilenoglicol protege as amostras
através da formação de uma película impedindo a desidratação (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002;
MANRIQUE et al., 2009).
Erros de coleta e preparação da lâmina podem influenciar na sensibilidade e especificidade do
teste. Fatores como a presença de sangue, infiltrado leucocitário e artefatos de fixação podem
comprometer a análise citopatológica. O esfregaço deve ser uniforme sobre a lâmina para evitar
a sobreposição de células, e não deve ser hipocelular, podendo resultar em exame falso-negativo
(MANRIQUE, et al., 2009).
Deve-se atentar para indicadores de qualidade dos esfregaços como: a espessura,
obscurecimento por sangue e/ou infiltrado leucocitário e dessecamento (GILL, 2005).
Apesar do exame citopatológico ser considerado uma estratégia segura e eficiente na detecção
precoce do câncer do colo uterino, a alta taxa de resultados falsos-negativos (2% a 62%) causa
questionamentos sobre a validade deste serviço na prevenção e detecção precoce da doença.
As principais causas dos resultados falsos-negativos estão relacionadas a erros na coleta de
material (62%), no escrutínio do esfregaço (16%) e na interpretação dos diagnósticos
citopatológicos (22%).
O câncer do colo do útero tem incidência elevada quando comparada a países desenvolvidos
com programas de detecção precoces bem estruturados. Com base nesses dados, o Brasil criou
o Sistema de Informação do Controle do Câncer do Colo do Útero (SISCOLO) o qual registrou um
aumento do número de municípios que realizaram a coleta do exame citopatológico de 89,5%
(2004/2005) para 95% (2007/2008). É o reflexo da política de expansão da estratégia de saúde
da família, com um aumento considerável na demanda de exames realizados pelo Sistema Único
de Saúde (SUS) (BRASIL, 2011; INCA, 2010).
Porém o programa gerou sobrecarga do número de exames preventivos do câncer do colo do
útero que acarretou em dois problemas graves detectados em todo o país: um foi a delonga no
repasse dos resultados dos exames, e o outro a colheita de material mal realizada, demonstrada
estatisticamente pela crescente quantidade de amostras insatisfatórias para uma análise
citopatológica, principalmente no tocante à representatividade e celularidade dos esfregaços
cervicovaginais, diminuindo consideravelmente a sensibilidade e especificidade do teste, tornando
necessárias repetições de exames, tardando ainda mais o processo de diagnóstico e tratamento
em casos de neoplasias (INCA, 2014).
Um levantamento realizado pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA) aponta que no Paraná entre
os anos de 2010 até 2013 houve um constante crescimento no número de amostras
insatisfatórias fundamentadas em hipocelularidade, de 42,19% em 2010 para 46,33% em 2013.
Baseando-se nesses dados, é de fundamental relevância que se busque um progresso no que
cerne à qualidade das amostras, tanto quanto à sua celularidade como representatividade celular,
assegurando a obtenção de elementos celulares do local onde se situa quase que a totalidade
dos cânceres do colo do útero. Dessa maneira é possível expandir a amplitude de detecção de
anormalidades já que a extensão de células analisadas é aumentada, trazendo como benefício a
identificação precoce da ocorrência de células cancerosas e maior agilidade no tratamento da
paciente (BRASIL, 2013).
Torna-se explícita a necessidade de busca por excelência na qualidade das análises, a fim de
que o Brasil alcance patamares mais próximos aos países desenvolvidos, já que é possível
reduzir a ocorrência de novos casos de óbito com o diagnóstico e tratamento adequado das
lesões iniciais (BRASIL, 2013; TEIXEIRA et. al., 2012).
Segundo Bethesda, uma amostra satisfatória deve conter de 8 a 12 mil células escamosas e no
mínimo 10 células endocervicais e/ou metaplásicas, e não apresentarem sobreposição celular e
obscurecimento hemácias ou leucócitos (SOLOMON & NAYAR, 2005).
Pela importância da adequabilidade da amostra no resultado final do exame preventivo do câncer
do colo uterino, o projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde da mulher:
coleta de Papanicolaou” expandiu suas ações às Unidades Básicas de Saúde de Ponta Grossa,
inserindo no seu trabalho a capacitação do quadro de enfermeiros dessas unidades que atuam na
coleta de material cérvico vaginal, na prevenção do câncer do colo do útero.
2. Objetivo
Averiguar a adequabilidade dos esfregaços cervicovaginais realizados em três
Básicas de Saúde em Ponta Grossa.
Unidades
No período de 2014 foram analisadas 116 amostras cervicovaginais colhidas nas Unidades
Básicas de Saúde (UBS) de Ponta Grossa: Antônio Saliba, Antero de Mello e Cezar Milleo.
As pacientes passaram pela anamnese e consulta de enfermagem. Após isso, o material
cérvicovaginal foi coletado da junção escamocolunar por raspagem com espátula de Ayre e o
material do canal endocervical com o uso da escovinha endocervical. O material foi coletado em
duplicata, sendo um dos materiais encaminhado normalmente ao SUS e outro para o projeto.
O exame citopatológico foi realizado no Laboratório Universitário de Análises Clínicas da UEPG,
onde foi corado pelo método de Papanicolaou e a montagem entre lâmina e lamínula foi realizada
com Entellan.
Para a análise da celularidade e representatividade, tomou-se por base os critérios de Bethesda,
que considera uma amostra adequada quanto à celularidade aquela que apresenta uma
estimativa de cerca de 8.000 a 12.000 células escamosas bem preservadas e visualizadas no
esfregaço. Quanto à representatividade, os critérios de qualidade obedeceram à regra que
determina a obrigatoriedade na amostra em análise de no mínimo 10 células endocervicais bem
preservadas e/ou metaplásicas na amostra. Também foram analisadas a sobreposição celular
e/ou obscurecimento por hemácias e leucócitos.
Foram analisadas 116 amostras cérvicovaginais em 2014. Ao inserir os dados obtidos num
gráfico de colunas (Figura 1), observou-se que em números absolutos, quanto à celularidade, 93
amostras apresentaram esfregaços que continham de 8.000 a 12.000 células escamosas na
preparação. Ao se considerar a celularidade juntamente com a representatividade (satisfatório),
ou seja, a observação de células escamosas e endocervicais, esses números caíram para 21,
representando uma queda em 77% na qualidade das amostras. Duas amostras foram
consideradas insatisfatórias por apresentarem hipocelularidade com sobreposição de leucócitos e
hemácias.
140
120
100
80
60
40
20
0
CÉLULAS
ESCAMOSAS
SATISFATÓRIO
INSATISFATÓRIO
Figura 1 – Adequabilidade das Amostras
TOTAL
Ao se analisar isoladamente cada Unidade Básica de Saúde (UBS), a Unidade Básica de Saúde
Antonio Saliba apresentou 62 exames com celularidade ótima, 13 satisfatórios e um insatisafório.
A Unidade de Saúde Cezar Milleo apresentou 23 esfregaços com celularidade ótima, 4
satisfatórios e um insatisfatório. A Unidade de Saúde Antero de Mello apresentou 8 esfregaços
com boa celularidade, 4 satisfatórios e nenhum insatisfatório.
Comparando as Unidades Básicas de Saúde (Tabela 1), observou-se que as amostras
satisfatórias apresentaram um percentual de 17% das amostras colhidas na Unidade Básica
Atonio Saliba, 14% da Unidade Básica Cezar Milleo e 33% da Unidade Básica Antero de Mello.
Levando-se em conta que para a detecção de adenocarcinomas cervicovaginais faz-se
necessário a presença de células edocerviais, observou um alto percentual de possibilidade de
falha na detecção desse tumor em 83% na Unidade Antonio Saliba, 85% na Unidade Cezar Milleo
e 67% na Unidade Antero de Mello.
Tabela 1 – Comparação da adequabilidade da amostra por UBS estudadas
Adequabilidade
Células escamosas
Satisfatório
Insatisfatório
Percentual de
satisfatórios
Percentual de falhas
para pesquisa de
adenocarcinomas
Unidades Básicas
UB. Antonio Saliba UB. Cezar Milleo UB. Antero de Mello
62
23
8
13
4
4
1
1
0
17%
14%
33%
83%
85%
67%
5. Conclusão
O presente trabalho demonstra a importância do projeto de extensão “Prevenção e
educação na atenção da saúde da mulher: coleta de Papanicolaou” na educação em
saúde, no tocante ao preenchimento de lacunas na formação de profissionais que atuam
na coleta de material cervicovaginal.
A qualidade na coleta de material para exame preventivo do câncer do colo uterino são
cruciais para que se obtenha uma boa sensibilidade e especificidade no exame
citopatológico.
Referências
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detecção das lesões precursoras do câncer cervical. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., Rio de Janeiro, v. 30, 2008.
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BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção Básica.
Controle dos
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Atenção Básica. – 2. ed., Brasília : Editora do Ministério da Saúde, 2013.
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ed. Brasília - DF, 2013.
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<http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/sintese-de-resultados-comentarios.asp> Acesso em: 05 de junho de 2014.
SOLOMON, D.; NAYAR, R. Sistema Bethesda para citopatologia cervicovaginal: definições, critérios e notas
explicativas. 2. ed., Rio de Janeiro: Revinter, 2005.
TRABALHO 5
Determinação de marcadores anatômicos para a folha e caule de
Rubus idaeus L., visando o controle da qualidade
1
Matheus Saukoski Pauzer (IC) E-mail: [email protected]
1
Valter Paes de Almeida (IC) E-mail: [email protected]
2
Vanessa Barbosa Bobek (PG) E-mail: [email protected]
3
Rosi Zanoni da Silva (PQ) E-mail: [email protected]
4
Inês Janete Matozzo Takeda (PQ) E-mail: [email protected]
5
Jane Manfron Budel (PQ) E-mail: [email protected]
1
Aluno de iniciação científica do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa;
Doutoranda em Ciências Farmacêuticas da UFPR;
Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa;
4
Pós-doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa;
5
Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela orientação do trabalho.
2
3
Resumo: O gênero Rubus compreende cerca de 700 espécies nativas do norte da Ásia, Europa e
América do Norte, predominando em áreas de clima temperado. Rubus deriva do latim ruber, que significa
vermelho, em alusão à cor da fruta. O nome da espécie idaeus, refere-se ao Monte Ida, localizado no que
hoje é noroeste da Turquia. A família Rosaceae inclui cerca de 100 gêneros e 3000 espécies, sendo uma
das maiores famílias de Angiospermas. Rubus idaeus L. denominada popularmente de framboesa,
framboesa europeia e raspberry é usada na medicina popular em muitos países para o tratamento de
feridas, cólicas e algumas outras doenças, tais como diarréia, doença renal, aumentando a micção. Possui
atividades antioxidante e anticancerígena. As folhas são adstringentes (antidiarreicas e cicatrizantes),
antiinflamatórias e diuréticas. Esse trabalho faz parte do projeto de extensão: “Horto medicinal do curso de
Farmácia: um espaço para o aprendizado farmacognóstico”, onde todas as espécies vegetais presentes
estão sendo identificadas e descritas botanicamente. Desta forma, o objetivo do trabalho foi analisar a
arquitetura foliar e caulinar de Rubus idaeus L., a fim de fornecer descrições botânicas mais detalhadas da
folha e descrever o caule, que ainda não foi estudado anatomicamente. As características botânicas
determinadas nesse estudo para folha e caule de Rubus idaeus L., auxiliam na identificação da espécie e
fornecem subsídios para o controle da qualidade de drogas vegetais, uma vez que diferenciam essa
espécie dos adulterantes Rubus fruticosus L. e Rubus ulmifolius Schott.
Palavras-chave: anatomia, farmacobotânica, morfologia, Rosaceae.
1. Introdução
Rosaceae inclui cerca de 100 gêneros e 3000 espécies, sendo uma das maiores famílias de
Angiospermas. No Brasil ocorrem 8 gêneros e cerca de 25 espécies. Em geral são plantas com
acúleos ou espinhos frequentes, folhas alternas, simples ou compostas com margem inteira ou
serreada (SÁNCHEZ RODRÍGUEZ. et al., 2008); (SOUZA; LORENZI., 2008).
Rubus compreende cerca de 700 espécies nativas do norte da Ásia, Europa e América do Norte,
predominando em áreas de clima temperado. O termo rubus deriva do latim ruber, que significa
vermelho, em alusão à cor da fruta. O nome da espécie idaeus, refere-se ao Monte Ida, localizado
no que hoje é o noroeste da Turquia (GESTEIRA. et al., 2008).
Rubus idaeus L., denominada popularmente de framboesa, framboesa europeia e raspberry é
adulterada no comércio por Rubus fruticosus L. e Rubus ulmifolius Schott. É usada na medicina
popular em muitos países para o tratamento de feridas, cólicas e algumas outras doenças, tais
como diarreia e doença renal. É utilizada também topicamente em ulcerações na pele, bucais ou
na córnea (GESTEIRA. et al., 2008); (ZHANG. et al., 2011).
Estudos químicos revelaram a presença de taninos (10%), ácidos orgânicos, flavonóides e
pectinas nas folhas. Os frutos contêm vitaminas, ácidos orgânicos (1,5-2%): ácido málico, oxálico
e tartárico (GESTEIRA. et al., 2008). O teor flavonoídico total é de 0,46 a 1,05% e até 5% e são
derivados de canferol e quercetina. Polifenois como galotaninos e elagitaninos (2,06 a 6,89% e
até 10%). Outros constituintes presentes como compostos voláteis (E-2-hexenal e Z-3-hexenol),
glicosídeos de C13-norisoprenoides e vitamina C. As bagas contêm antocianinas, taninos
hidrolisáveis, um elagitanino dimérico, triterpenoides, estigmasterol, campesterol, cicloartenol,
colesterol e frambinona (BARNES, JOANNE. et al., 2012).
Possui atividades antioxidante e anticancerígena (WARGOVICH, 2006); (SALGADO, 2003). As
folhas são adstringentes (antidiarreicas e cicatrizantes), anti-inflamatórias e diuréticas
(GESTEIRA. et al., 2008). Apresenta atividade anti-proliferativa contra células de carcinoma de
cólon e antibacteriana (ZHANG. et al., 2011). Rubus idaeus tem um efeito profilático potente
sobre a formação de cálculos renais de oxalato de cálcio, confirmando o folclore sobre a sua
atividade anti-litíase (GHALAYINI. et al., 2011).
2. Objetivos
Esse trabalho faz parte do projeto de extensão: “Horto medicinal do curso de Farmácia: um
espaço para o aprendizado farmacognóstico”, onde todas as espécies vegetais presentes estão
sendo identificadas e descritas botanicamente. Nesse sentido, objetivou-se analisar a arquitetura
foliar e caulinar de Rubus idaeus L., a fim de fornecer subsídios farmacobotânicos para a espécie
medicinal, além de fornecer descrições botânicas mais detalhadas da folha e descrever o caule,
que ainda não foi estudado anatomicamente.
A coleta de partes aéreas do material vegetal ocorreu no Horto Medicinal do Curso de Farmácia,
na Universidade Estadual de Ponta Grossa (PR), Campus Uvaranas, Av. General Carlos
Cavalcanti, 4748 (25°5'23"S 50°6'23"W). Os exemplares de Rubus idaeus L. foram submetidos à
confecção de exsicatas, identificadas por taxonomista e os representantes se encontram
registrados no Herbário do Museu Botânico de Curitiba sob o número 306073.
3.1 Análises Anatômicas
Foram coletadas amostras a partir de 5 cm do ápice da planta. Folhas e caules de Rubus idaeus
L. foram fixados em solução de FAA 70 (formol 5%, ácido acético 5% e etanol 70ºGL 90% v/v)
(Johansen, 1940), durante uma semana e armazenados em álcool etílico a 70% (BERLYN &
MIKSCHE, 1976).
O material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, efetuado à mão livre, foi submetido
à coloração de azul de astra e fucsina básica (Roeser, 1972) e de azul de toluidina (O'Brien et al.,
1964) em lâminas semi-permanentes preparadas para tal fim. A montagem das lâminas foi
realizada com glicerina diluída a 50% (v/v) (BERLYN, MIKSCHE, 1976) e para a lutagem foi
utilizado esmalte incolor.
Fotomicrografias foram capturadas por microscópio de luz Olympus CX31 equipado por uma
unidade de controle C7070. As lâminas semi-permanentes foram analisadas no Laboratório de
Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa.
3.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
O material foi desidratado em uma série etanólica crescente e pelo ponto crítico no aparelho
Balzers CPD-030. A microscopia eletrônica de varredura da superfície foliar e caulinar de Rubus
idaeus L. foi realizada em alto vácuo, utilizando-se a metodologia de Souza (1998). As
eletromicrografias foram realizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3 TESCAN no
C-LABMU/PROPESP, na Universidade Estadual de Ponta Grossa.
A análise anatômica da lâmina foliar de R. idaeus, em vista frontal, mostra células epidérmicas
com parede anticlinal de contorno levemente ondeadas e a ornamentação cuticular é ligeiramente
estriada em ambas as faces. Os estômatos são do tipo anomocítico e restritos à face abaxial,
caracterizando a folha como hipoestomática.
Em secção transversal, a epiderme apresenta-se uniestratificada e coberta por cutícula delgada.
As células da epiderme adaxial são comparativamente maiores que as da face abaxial.
Característica também relatada por Gesteira et al. (2008). Os estômatos estão localizados no
mesmo nível das demais células epidérmicas. Na face abaxial são encontrados tricomas tectores
flageliformes bicelulares, formados por uma pequena célula basal e uma célula apical alongada e
afilada. Na face adaxial esses tricomas são raros. Tricomas tectores estrelados
estrelados foram descritos
para R. ulmifolius Schott., espécie utilizada como adulterante de R. idaeus (GESTEIRA. et al.,
2008).
O mesofilo é dorsiventral, formado por duas camadas de parênquima paliçádico e 2-3
2 de
parênquima esponjoso. No parênquima paliçádico são observados grandes idioblastos contendo
drusas de oxalato de cálcio. Os feixes vasculares colaterais são circundados por uma bainha e
estão mergulhados na região mediana do mesofilo.
A nervura central tem formato côncavo
côncavo-convexo. A epiderme tem as mesmas
mas características
mencionadas para o limbo foliar, entretanto, na face adaxial, são observados raros tricomas
glandulares capitados, formados por pedicelo e cabeça multicelular. Esses tricomas não foram
observados no gênero Rubus no trabalho de Gesteira et al. (2008). Adjacente à epiderme,
observa-se 2-3
3 camadas de colênquima angular na face adaxial e 1-2
1 2 na face abaxial. O sistema
vascular está representado por feixe vascular colateral único. Inúmeros idioblastos contendo
drusas de oxalato de cálcio são observados.
O caule tem formato irregular e a epiderme evidencia cutícula levemente espessada e levemente
estriada. Poucos tricomas tectores com as mesmas características descritas para a folha são
observados. Subjacentemente à epiderme, ocorrem 2-3 camadas
s contínuas de colênquima
lamelar. Abaixo do colênquima são observadas cerca de 3 camadas de células corticais maiores
que as do colênquima.
Os feixes vasculares colaterais são organizados circundando toda a medula e uma calota de
fibras perivasculares bem
m desenvolvidas
desenvolvida é evidenciada aposta ao floema em todos os feixes. A
medula ocupa a maior parte do caule e é formada por células isodiamétricas de parede delgada.
Idioblastos contendo drusas de oxalato de cálcio são encontrados região cortical e medular.
Figura 1 - Rubus idaeus L. no hábito em Horto Medicinal do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa
5. Conclusão
As características farmacobotânicas descritas para folha e caule de Rubus idaeus L., auxiliam na
identificação da espécie e fornecem subsídios para o controle da qualidade de drogas vegetais, uma vez
que diferenciam essa espécie dos adulterantes Rubus fruticosus L. e Rubus ulmifolius Schott.
Referências
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TRABALHO 6
Arquitetura foliar e caulinar de Mikania sessilifolia DC., visando o
controle da qualidade da matéria-prima
1
Paola Aparecida Raeski (IC) E-mail: [email protected]
2
Inês Janete Mattozo Takeda (PQ) E-mail: [email protected]
3
Jane Manfron Budel (PQ) E-mail: [email protected]
1
Aluna de Iniciação Científica, Curso de Ciências Farmacêuticas - UEPG
Aluna de Pós-doutorado, Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas – UEPG
3
Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas, orientadora do trabalho.
2
Resumo: Mikania sessilifolia, popularmente conhecida como orelha-de-onça ou guiné, é uma
planta pertencente a família Asteraceae muito utilizada na medicina popular como antifebril,
tônica, no combate a tosses e resfriados. Devido ao uso medicinal amplamente difundido de
espécies de Mikania, suas diferenças morfológicas pouco expressivas e a ausência de estudos
farmacobotânicos sobre M. sessilifolia justificam a importância de se realizar um estudo sobre a
morfologia e anatomia desta planta. O presente trabalho teve por objetivo analisar a arquitetura
foliar e caulinar de Mikania sessilifolia e pesquisa microquímica. O material coletado foi fixado e
seccionado transversalmente. Os cortes foram submetidos à coloração com fucsina básica e azul
de astra para o estudo anatômico. O material vegetal foi também submetido à técnica de
microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo microquímico foram realizadas secções
transversais do caule e da folha e avaliadas frente aos reativos: floroglucina clorídrica, Sudam III,
cloreto férrico e lugol. Por meio das características morfológicas e anatômicas evidenciadas no
presente estudo, pode-se fornecer caracteres para identificação da espécie, bem como
diferencia-lá de outras espécies do gênero Mikania.
Palavras-chave: Anatomia, Asteraceae, microquímica, morfologia.
1. Introdução
Asteraceae compreende cerca de 1.100 gêneros e aproximadamente 25.000 espécies
distribuídas em regiões tropicais, subtropicais e temperadas. Constitui-se em uma das famílias
mais evoluídas do reino vegetal, bem como uma das maiores, desenvolvendo-se bem em
diferentes habitats. No Brasil há aproximadamente 180 gêneros de Asteraceae, as quais estão
representadas por espécies herbáceas anuais ou perenes, substratos ou arbustos e, em casos
mais raros, algumas espécies arbóreas (SILVA, 2000).
Mikania é muito comum no Brasil, onde cerca de 150 a 300 espécies ocorrem na forma de ervas
perenes ou arbustos, geralmente volúveis, raramente eretos. As folhas são geralmente opostas e
pecioladas e suas corolas brancas ou arrouxeadas. As espécies do gênero são popularmente
conhecidas como “guaco”, sendo empregadas na medicina popular para o tratamento de tosses,
febres, reumatismos, resfriados e afecções respiratórias. Caracterizam-se pela produção de
várias classes de metabólitos secundários, entre os quais se destacam a ocorrência de
triterpenos, diterpenos, em especial de esqueleto caurano e de sesquiterpenos (PRADOet al.,
2011).
Mikania sessilifolia DC. é popularmente conhecida como orelha-de-onça e utilizada na medicina
tradicional como tônica, antifebril e no combate a tosses e resfriados. (RIBEIRO, 2010).
2. Objetivos
A diagnose de espécies medicinais baseia-se primeiramente na análise morfoanatômica dos
órgãos vegetativos e reprodutivos, mostrando-se relevante na identificação de drogas
pulverizadas ou rasuradas, contribuindo para o controle da qualidade de drogas vegetais
(DONATO & MORRETES, 2005). Desta forma, objetivou-se analisar a morfologia externa, a
anatomia e a microquímica da folha e do caule de Mikania sessilifolia DC., a fim de fornecer
características farmacobotânicas para identificação da espécie medicinal, bem como diferenciá-la
de outras espécies do gênero Mikania.
A coleta do material vegetal ocorreu na região dos Campos Gerais do Estado do Paraná (24º 18’
S e 49º 37’ W). O material vegetal foi submetido à confecção de exsicata, identificado por
taxonomista sob o número de registro 10208 no herbário da UEPG.
3.1 Estudo anatômico
As pesquisas referentes aos caracteres morfoanatômicos foram efetuadas com o material vegetal
coletado a partir de 10 cm do ápice da planta. Folhas e caules de M. sessilifolia foram fixados em
solução de FAA 70 (JOHANSEN, 1940) e armazenados em álcool etílico a 70% (BERLYN &
MIKSCHE, 1976). Foram preparadas lâminas semipermanentes com o material seccionado nos
sentidos transversal e longitudinal à mão livre. As secções foram submetidas à coloração de azul
de astra e fucsina básica (ROESER, 1972). As lâminas foram montadas com glicerina diluída a
50% (v/v) (BERLYN, MIKSCHE, 1976) e para a lutagem foi utilizado esmalte incolor.
3.2 Testes microquímicos
Foram realizadas secções transversais à mão livre de folhas e caules de Mikania sessilifolia
paraverificação de lignina, utilizando-se floroglucina clorídrica (FOSTER, 1949), Sudam III para
substâncias lipofílicas (SASS, 1951), cloreto férrico para compostos fenólicos (JOHANSEN, 1940)
e lugol para amido (BERLYN & MIKSCHE, 1976).
3.3 Microscopia eletrônica de varredura – MEV
A microscopia eletrônica de varredura da superficie foliar e caulinar de Mikania sessilifolia foi
realizada em alto vácuo, sendo as amostras submetidas ao processo de desidratação em série
etanólica crescente e pelo ponto crítico de plasma e, após montagem em suporte, foram
submetidas à metalização com ouro e paládio (SOUZA, 1998). As eletromicrografias foram
visualizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3 TESCAN. Para realização do ponto
crítico e microscopia eletrônica de varredura, o material foi analisado no C-LABMU/PROPESP, na
Morfologicamente, Mikania sessilifolia encontra-se como um subarbusto de 0,4 a 1,5m de altura,
com ramos cilíndricos, costados, tomentosos. As folhas são simples, opostas, sésseis, o limbo
tem cerca de 10 a 35 x 6 a 27mm, orbicular a cordado, o ápice é de obtuso a arredondado, as
margens são desde inteiras a onduladas, base truncada a cordada. A face adaxial é estrigosa,
glanulosa, enquanto a face abaxial é hirsutotomentosa, glandulosa. Capítulos discóides,
pedunculados, em panículas. O invólucro é obcônico, variando de 2,5 a 3mm de comprimento e
1,5 a 2mm de diâmetro, brácteas involucrais unisseriadas, 2,5 a 3 x 0,7 a 1mm, oblongas,
tomentosas, glandulosa, o ápice é arredondado e as margens são inteiras. As flores são creme,
monóclinas, com corola tubulosa, tubo 2mm de comprimento, 0,8mm de diâmetro, glanduloso,
inteiramente glabro, fauce campanulada, lobos de 0,5 x 0,4mm, glandulosos. As anteras se
encontram com apêndice apical obtuso e base obtusa. Os ramos do estilete são lineares,
papilosos e agudos. A cipsela é obcônica com 1,2mm de comprimento e 0,3mm de diâmetro e
glandulosa. O papilho é cerdoso, unisseriado, 2,3mm. (HATTORI, 2008)
Anatomicamente, M. sessilifolia apresenta lâmina foliar com epiderme uniestratificada, onde as
células possuem paredes anticlinais ligeiramente onduladas em vista frontal em ambas as faces.
Uma cutícula delgada e levemente estriada é observada recobrindo o sistema de revestimento. A
sua folha é anfiestomática, com a presença de estômatos anisocítico e anomocítico, que tem
localidade no mesmo nível das demais células epidérmicas.
Os tricomas glandulares observados se inserem em depressão naepiderme e mostram-se
capitados e unisseriados, com pedicelo formado por 3-4 células e cabeça globoide. Tricomas
tectores pluricelulares, com aproximadamente 5-8 células, do tipo cônicos, unisseriados, de base
alargada e célula terminal afilada são circundados por células epidérmicas dispostas em roseta.
Sendo a cutícula deste tricoma estriada.Tricomas glandulares e tectores descritos neste estudo
foram relatados em outras espécies de Mikania (BUDEL et al., 2009; AMORIN et al., 2014;
ARAÚJO et al., 2015).
O mesofilo tende à dorsiventral, constituído por parênquima paliçádico, com células dispostas em
cerca de 2 camadas junto à epiderme adaxial; o parênquima esponjoso é formado por cerca de 6
camadas. Feixes vasculares colaterais de pequeno porte, distribuídos na região mediana do
mesofilo, são envoltos por bainha parenquimática. Dutos secretores podem ser observados
próximos aos feixes vasculares. O gênero Mikania é produtor de óleo essencial e várias espécies
apresentam dutos secretores e tricomas glandulares (BUDEL et al., 2009; AMORIN et al., 2014;
ARAÚJO et al., 2015).
A nervura central, em secção transversal, possui formato praticamente plano
plano-convexo. A
epiderme é uniestratificada e, subjacentemente,
centemente, o clorênquima se interrompe e são encontradas
aproximadamente 3 camadas de colênquima do tipo angular em ambas as faces. Um feixe
vascular único do tipo colateral encontra
encontra-se
se mergulhado no parênquima fundamental. Uma calota
de fibras esclerenquimáticas
imáticas aparece junto ao floema e ao xilema.
O caule, apresenta contorno hexagonal, com 6 costelas conspícuas, em secção transversal.
Mikania laevigata evidenciou caule circular (BUDEL et al., 2009), enquanto M. micrantha
apresentou caule hexagonal (ARAÚJO
(ARAÚJ et al., 2015) em secção transversal.
Figura 1. Corte transversal do caule, podendo observar o seu contorno hexagonal.
A epiderme e os tricomas mostram as mesmas características citadas para a folha. Na região das
costelas, em posição adjacente à epiderme,
epid
encontram-se
se faixas de colênquima do tipo angular e
células esclerenquimáticas. Limitando internamente o córtex, observa-se
observa se a endoderme sem
estrias de Caspary evidentes. O cilindro vascular é típico e em aposição ao sistema floemático
notam-se calotas
s de fibras perivasculares. No xilema, os elementos traqueais distribuem-se
distribuem
em
fileiras separadas por células parenquimáticas. A região medular ocupa um pequeno volume do
caule e possui parênquima com células relativamente grandes e com paredes delgadas.
Figura 2. Tricoma glandular de M. sessilifolia visualizado em face abaxial.
Figura 3. Tricoma tector em face abaxial da folha de M. sessilifolia.
5. Conclusão
Dentre os vários caracteres anatômicos observados em M. sessilifolia, podem ser destacados:
tricomas tectores cônicos pluricelulares unisseriados revestidos por cutícula estriada, tricomas
glandulares capitados unisseriados, tricomas glandulares não capitados unisseriados, estômatos
predominantemente anomocíticos, nervura central praticamente plano-convexa, caule hexagonal
evidenciando 6 costelas conspícuas em secção transversal, que analisados em conjunto
fornecem dados complementares para a caracterização da droga vegetal com aplicação na
indústria de fitoterápicos.
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SOUZA W. Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicadas às Ciências Biológicas.Sociedade Brasileira de
Microscopia Eletrônica, Rio de Janeiro, p. 1-4, 1998.
TRABALHO 7
Análise comparativa dos tricomas presentes em folhas de espécies de
Calea spp.
Evelyn Assis de Andrade (IC) Email: [email protected]
Inês Janete Matozzo Takeda (PQ) Email: [email protected]
Paulo Vitor Farago (PQ) Email: [email protected]
Márcia do Rocio Duarte (PQ) Email: [email protected]
Jane Manfron Budel (PQ) Email: [email protected]
Resumo: O gênero Calea pertence à família Asteraceae e apresenta 316 espécies de plantas.
Calea serrata Less., Calea uniflora Less., Calea longifolia Gardn. e Calea triantha (Vell.) Pruski
são espécies analisadas neste estudo. Calea serrata Less., é usada popularmente para tratar
úlceras e problemas hepáticos e apresenta atividade acaricida e inibidora de acetilcolinesterase.
Calea uniflora Less. possui atividade antifúngica e tripanosomicida. Calea longifolia Gardn. é
empregadas na medicina popular como cicatrizante e adstringente. Calea triantha (Vell.) Pruski é
uma espécie pouco estudada e com potencial terapêutico. Objetivou-se investigar o sistema de
revestimento, a fim de identificar e diferenciar as espécies vegetais para aplicação no controle da
qualidade de drogas vegetais. As espécies vegetais foram coletadas, submetidas à confecção de
exsicata e identificadas por taxonomista. Os estudos foram realizados em folhas adultas das
quatro espécies, através de secções paradérmicas e diafanização, posteriormente coradas com
azul de Astra e safranina. A caracterização foi complementada com microscopia eletrônica de
varredura. A análise do sistema de revestimento das espécies de Calea permite concluir que as 4
espécies apresentam 3 tipos de tricomas cada uma. Os tricomas dos tipos III e V são os mais
comuns. O tipo dos tricomas, quando avaliados em conjunto, diferenciam as 4 espécies
analisadas.
Palavras-chave: Asteraceae, Calea serrata, Calea uniflora, Calea longifolia, Calea triantha.
1. Introdução
Asteraceae apresenta 1.535 gêneros, incluindo aproximadamente 25.000 espécies,
representando cerca de 10% da flora mundial (BREMER, 1996). Nakajima et al. (2015)
reconhecem 278 gêneros e 2.065 espécies aceitas na Flora do Brasil. No reconhecimento prático
de Asteraceae, utiliza-se como referencial a presença de inflorescência em capítulo, anteras
sinânteras e cipsela geralmente com um pápus (ROQUE & BAUTISTA, 2008).
Calea apresenta 316 espécies de plantas, sendo 152 espécies aceitas, de acordo com
http://theplantlist.org (2015), das quais, 82 são aceitas na Lista de Espécies da Flora do Brasil
(MONDIN et al., 2015). Espécies desse gênero apresentam compostos ativos que despertam
interesse por suas diversas ações, sendo conhecidas pelas atividades farmacológicas de extratos
e substâncias isoladas, tais como atividades antimicrobiana (DO NASCIMENTO et al., 2004), antihipertensiva e vasodilatadora (GUERRERO et al., 2002), anti-inflamatória (GÓMEZ et al., 2011),
entre outras. A presença de flores do raio pistiladas e pápus composto de páleas livres são
caracteres diagnósticos do gênero (ROQUE & CARVALHO, 2011).
Dentre as espécies analisadas neste estudo estão: Calea serrata Less., Calea uniflora Less.,
Calea longifolia Gardn. e Calea triantha (Vell.) Pruski. Calea serrata Less., conhecida
popularmente como erva-de-cobra, chá-amargo e quebra-tudo, é encontrada no sul do Brasil,
sendo usada na medicina tradicional para tratar úlceras e problemas hepáticos. Apresenta
estudos farmacológicos que demonstram atividade acaricida (RIBEIRO et al., 2008; RIBEIRO et
al., 2011) e inibidora de acetilcolinesterase (RIBEIRO et al., 2012). Estudos realizados por
Nascimento et. al (2002; 2004) demonstram a atividade antifúngica e tripanosomicida de Calea
uniflora Less.
Calea longifolia Gardn. é subarbustiva, cujas folhas são empregadas na medicina popular como
cicatrizante e adstringente (TAKEDA, I.J.M. & FARAGO, P.V., 2001). Calea triantha (Vell.) Pruski
é uma espécie nativa com distribuição nas regiões Sul e Sudeste do Brasil (MONDIN et al., 2015),
pouco estudada e com potencial terapêutico, tendo em vista as propriedades farmacológicas das
demais espécies do gênero.
A descrição do sistema de revestimento auxilia na identificação e diferenciação de espécies
vegetais. A presença e os tipos dos tricomas muito podem contribuir na diagnose vegetal rápida e
fidedigna.
2. Objetivos
Investigar o sistema de revestimento de espécies pertencentes ao gênero Calea spp., consistindo
em subsídio farmacognóstico de identificação botânica, a fim de caracterizar e diferenciar as
espécies do gênero Calea, para aplicação no controle da qualidade de drogas vegetais.
A coleta de Calea uniflora e Calea serrata foi realizada na Fazenda São Maximiano, situada na
região da Serra do Sudoeste, em Guaíba, Rio Grande do Sul, em outubro e dezembro de 2003.
As exsicatas foram identificadas por taxonomista e encontram-se depositada no Herbário do
Instituto de Ciências Naturais da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sendo Calea
uniflora sob o número ICN 49024 e Calea serrata sob o número ICN 51057.
A espécie Calea longifolia foi coletada nas proximidades do Parque Estadual de Vila Velha, em
Ponta Grossa, Paraná, em janeiro de 2004. A exsicata foi identificada por taxonomista e encontrase depositada no Herbário da Universidade Estadual de Ponta Grossa sob o número 10209.
A espécie Calea triantha foi coletada na Universidade Estadual de Ponta Grossa, no campus
Uvaranas, em Ponta Grossa, Paraná, em agosto de 2015. Foi identificada por taxonomista e
encontra-se depositada no Herbário da Universidade Estadual de Ponta Grossa sob o número de
registro ICN 19062.
Os estudos morfoanatômicos foram realizados em folhas adultas das quatro espécies. O material
foi fixado com solução de formol, ácido acético e álcool (FAA 70) segundo Johansen (1940), e
após uma semana, estocado em uma solução de etanol a 70% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE,
1976). A nomenclatura para descrever os caracteres está baseada em Radford (1974).
Secções paradérmicas foram realizadas à mão livre, com auxílio de lâmina comum de tricotomia.
A diafanização foliar seguiu a técnica de Fuchs (1963) e a descrição do padrão de venação
adotou critérios de Hickey (1973). As lâminas semi-permanentes foram coradas com safranina e
azul de Astra (GERLACH, 1969), montadas com glicerina a 50% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE,
1976) e lutadas em esmalte incolor (BEÇAK & PAULETE, 1976).
A caracterização morfológica da superfície foliar foi complementada com microscopia eletrônica
de varredura, segundo Souza (1998), no Complexo de Laboratórios Multiusuários. As lâminas
foram examinadas e as fotomicrografias foram registradas no microscópio fotônico Olympus CX
31 acoplado à câmera digital Olympus, modelo C-7070, no Laboratório de Farmacognosia da
Metcalfe e Chalk (1988) afirmam que os tricomas podem ser utilizados com finalidades
taxonômicas e estão presentes na família Asteraceae. A análise anatômica do sistema de
revestimento de Calea spp. evidenciou as seguintes características: Calea longifolia apresenta
dois tipos de tricomas glandulares localizados em criptas (face abaxial) (Figura 1) ou em
pequenas depressões na epiderme (face adaxial). O primeiro é um tricoma glandular capitado,
formado por cerca de 6 células no pedicelo e cabeça claviforme (Tipo I), enquanto que o outro
tricoma, também capitado, é formado por pedicelo contendo cerca de 4 células e com cabeça
globoide (Tipo II). Também ocorre um tipo de tricoma tector pluricelular (5 a 8 células),
unisseriados, de base alargada e célula terminal afilada (Tipo III).
Figura 1. Tricomas na folha de Calea longifolia Gardn., evidenciando os tricomas do tipo I (à esquerda) e tipo II (à direita).
Em Calea serrata são evidenciados 3 tipos de tricomas (Figura 2), sendo um glandular e dois
tectores. O glandular é classificado como capitado séssil (Tipo IV). O primeiro tector é igual ao
tipo III, citado para C. longifolia.. O outro tipo de tricoma
tricoma tector é cônico, pluricelular e unisseriado
formado por 6-8 células (Tipo V).
Figura 2. Tricomas na epiderme abaxial de Calea serrata Less.
A espécie Calea triantha (Vell.) Pruski apresenta 3 tipos de tricomas (Figura 3), o primeiro é
glandular capitado
apitado bisseriado (Tipo VI), o segundo é tector cônico (Tipo V) e o outro é tector do
tipo III, também encontrado em C. serrata.
serrata
Figura 3. Calea triantha (Vell.) Pruski, evidenciando tricomas em vista frontal da face abaxial epidérmica.
Em Calea uniflora, os tricomas glandulares estão inseridos em pequena depressão na
epiderme e podem ser do tipo VI (Figura 4B), também encontrado em C. triantha ou
capitados com pedicelo unicelular e cabeça alongada (Tipo VII) (Figura 4A). Tricomas
tectores pluricelulares
es (5 a 8 células), unisseriados, de base alargada e célula terminal
afilada (Figura 4C) são circundados por células epidérmicas dispostas em roseta e
correspondem ao tipo V encontrado em C. serrata e C. triantha.
A
B
C
Figura 4 - Calea uniflora Less.. A. Tricoma glandular do tipo VII . B. Tricoma glandular do tipo VI. C. Tricoma tector do tipo V.
A distribuição dos tricomas presentes nas espécies de Calea está sumarizada no quadro
1.
Quadro 1. Presença e tipo de tricomas encontrados em Calea spp.
Espécies de Calea
Tipos de Tricomas
C. longifolia
C. serrata
C. triantha
C. uniflora
I
Presente
Ausente
Ausente
Ausente
II
Presente
Ausente
Ausente
Ausente
III
Presente
Presente
Presente
Ausente
IV
Ausente
Presente
Ausente
Ausente
V
Ausente
Presente
Presente
Presente
VI
Ausente
Ausente
Presente
Presente
VII
Ausente
Ausente
Ausente
Presente
5. Conclusão
Considerando a análise do sistema de revestimento das espécies de Calea,
Calea conclui-se
que as 4 espécies apresentam 3 tipos de tricomas cada uma. Os tricomas
tricomas dos tipos III e V
são os mais comuns. O tipo dos tricomas, quando avaliados em conjunto, diferencia as
espécies analisadas.
Referências
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TAKEDA, I.J.M. & FARAGO, P.V. Vegetação do Parque Estadual de Vila Velha - Guia de
Campo. Gráfica Plastipel, Curitiba, 2001.
TRABALHO 8
Operação Rondon-UEPG: Um relato Multiprofissional em Ibaiti-PR
Guilherme dos Anjos Camargo (G) DEFAR-UEPG E-mail: [email protected]
Janice Caroline Hardt (G) DEQUIM-UNIOESTE E-mail: [email protected]
Camila Thomaz dos Santos (PG) HURCG-UEPG E-mail: [email protected]
Silvio Luiz Rutz da Silva (PQ) DEFIS-UEPG E-mail: [email protected]
Luciana de Boer Pinheiro de Souza (PQ) DEQUIM-UEPG E-mail: [email protected]
Resumo: A Operação Rondon UEPG é um projeto de integração social envolvendo participação de
universitários voluntários em busca de soluções para o desenvolvimento sustentável em comunidades
paranaenses. A Operação ocorreu em seis municípios do Paraná, no período de 19 a 29 de julho de 2015.
Este é um relato de experiência de três estudantes dos cursos de Química Licenciatura (UNIOESTE),
Farmácia (UEPG) e Residência Multiprofissional em Saúde do Idoso – Cirurgiã Dentista (HURCG - UEPG),
participantes da Operação Rondon UEPG no município de Ibaiti – PR. O relato trata da realização da
oficina intitulada “Mostra de Ciências”, com o intuito de aproximar os alunos dos processos relacionados
as ciências, por meio de atividades experimentais voltadas à área da química, criando problemas reais que
permitiram a contextualização e o estímulo de questionamentos de investigação. A oficina foi realizada em
três colégios de Ibaiti: Colégio Estadual Aldo Dallago, Colégio Estadual Martins de Mello e Centro Estadual
de Educação Profissional; atingindo cerca de 260 alunos do Ensino Fundamental ao Médio. Observou-se
que a experimentação motivou os participantes, que perceberam que atividades simples do cotidiano
estão relacionadas com a ciência. Para os rondonistas, a experiência da oficina foi de suma importância
visto que estes conseguiram compartilhar e construir conhecimentos de forma multiprofissional,
relacionando as áreas da Química, Farmácia e Odontologia, e reconhecendo que sem a participação na
Operação Rondon, esta experiência não existiria.
Palavras-chave: Multiprofissionalidade, Interdisciplinaridade, Projeto de Extensão, Operação Rondon.
1. Introdução
A atuação multiprofissional consiste em uma modalidade de trabalho onde o coletivo é a principal
característica, ou seja, baseia-se na reciprocidade e na interação dos profissionais, buscando intervenções
múltiplas individuais ou coletivas. A comunicação verbal é o centro para ocorrer o trabalho
multiprofissional, onde se compartilham conhecimentos com interação mútua no momento de planejar e
colocar em prática as ações multiprofissionais de promoção à saúde e de prevenção contra doenças e
agravos (PEDUZZI, 2001).
A interdisciplinaridade vem sido discutida há algum tempo, mas segundo relatos não é possível obter um
conceito específico para tal. A ciência está subdivida em três grandes áreas: humanas, sociais e exatas,
caracterizando a disciplinaridade. Há a possibilidade de um diálogo interdisciplinar que aproxime os
saberes específicos, vindos das diversas áreas do conhecimento, de modo que seja compreensível a
todos os envolvidos (JAPIASSU, 1976; LANGOSKI et al., 2015).
O trabalho interdisciplinar em saúde é essencial como uma prática dentro do enfoque filosófico
multiprofissional, pois a ciência não é exclusiva para uma área em específico. O paciente, os
conhecimentos compartilhados e o impacto das ações também devem ser considerados assuntos
relevantes à equipe multiprofissional. Este grupo de profissionais diferenciados terão diferentes pontos de
vista, favorecendo a prática científica.
A construção dessa prática acontece quando pensamos juntos, agimos em equipe, colaboramos para que
todas as ideias e experiências sejam expostas e associadas às vivências de cada profissional. Não se
limita à metodologia de ser somente uma ciência. Há a busca de diversos fragmentos que se concentram
em um único conhecimento, pelo compartilhamento de saberes e vivências (ALVES, E. D., 2010;
JAPIASSU, 1976).
Durante a Operação Rondon UEPG os conceitos de acidez e basicidade de produtos do
nosso cotidiano foi trabalhado de forma interdisciplinar. A Operação Rondon UEPG é um
projeto de integração social, que envolve universitários voluntários com o objetivo de
buscar soluções para o desenvolvimento sustentável em comunidades do estado do
Paraná. A Operação ocorreu em seis municípios paranaenses, no período de 19 a 29 de
julho de 2015.
Os conceitos de acidez e basicidade podem ser trabalhados por diversas áreas do conhecimento, não
apenas pela Química, tratada neste trabalho também pela Farmácia e Odontologia. Algumas observações
que são feitas pela maioria das pessoas por meio do senso comum já foram utilizadas pelos químicos para
classificar as substâncias como ácidos e bases, conforme Bruice (2006):
Inicialmente os químicos chamavam qualquer substância de que tinha gosto azedo de ácido
(do latim acidus, azedo). Alguns ácidos eram familiares, como ácido cítrico (encontrado no
limão e em outras frutas cítricas), ácido acético (encontrado no vinagre) e ácido hidroclórico
(presente no estômago ácido – o gosto azedo associado ao vômito). Substâncias que
neutralizam ácidos, como cinza de madeira e outras cinzas de plantas, eram chamadas de
bases, ou substâncias alcalinas (cinzas, em árabe, é al kalai). Limpadores de vidros e
soluções designadas a desentupir esgotos são soluções alcalinas (BRUICE, 2006, p. 39).
Este é um relato de experiência de estudantes dos cursos de Química Licenciatura
(UNIOESTE), Farmácia (UEPG) e Residência Multiprofissional em Saúde do Idoso –
Cirurgiã Dentista (HURCG - UEPG), participantes da Operação Rondon UEPG no
município de Ibaiti – PR, da oficina intitulada “Mostra de Ciências”.
2. Objetivos
A oficina “Mostra de Ciências” teve por objetivo aproximar os alunos dos processos
relacionados as ciências, com atividades experimentais voltadas à área da química
utilizando materiais que a maioria dos alunos tem em casa e assim criar problemas reais
que permitam a contextualização e o estímulo de questionamentos de investigação.
A Oficina foi realizada em três colégios de Ibaiti: Colégio Estadual Aldo Dallago, Colégio Estadual
Martins de Mello e Centro Estadual de Educação Profissional. Houve a participação total de cerca
de 260 alunos do Ensino Fundamental ao Médio.
A Mostra de Ciências teve como foco principal relacionar os conceitos de acidez e basicidade
com o cotidiano dos alunos e orientá-los sobre os perigos de utilizar essas substâncias sem
cuidados prévios. Para isso, verificou-se os conhecimentos dos estudantes em relação a esses
conceitos de ácido e base, a partir de alguns produtos utilizados de forma rotineira (Figura 1 –
vinagre, suco de limão, água sanitária, solução de bicarbonato de sódio e sabão em pó) e em
seguida, questionamentos foram realizados sobre as propriedades destes produtos:
“Qual desses produtos é ácido e qual é básico?”
“Vocês sabem nos dizer a diferença entre ácido e base?”
“Qual o gosto de uma substância ácida? E de uma substância básica?”
Figura 1 – Produtos utilizados para a Mostra de Ciências
Na sequência, testou-se a acidez e basicidade destes produtos utilizando um indicador ácido-base caseiro
de beterraba (Figura 2) e discutiu-se os conceitos químicos envolvidos.
Figura 2 – Indicador caseiro (confeccionado com extrato de beterraba)
Após a experimentação, os participantes foram novamente questionados em relação a outras substâncias
de seu cotididiano.
“Conhecem alguém próximo a vocês que faz sabão em casa?”
“O que eles utilizam para realizar o sabão?”
“É uma substância ácida ou básica?”
“Quem ajuda a mãe a lavar o banheiro?”
“O que ela utiliza de produtos para limpeza?”
“Ela fecha a porta no momento da limpeza do banheiro?”
Depois de todas as orientações realizadas ao final das perguntas, passou-se para o último experimento:
bexiga na garrafa (Figura 3). Neste experimento, ocorre uma reação ácido-base, por existir uma
quantidade de vinagre (ácido acético) dentro da garrafa e bicarbonato de sódio (base) no interior da
bexiga, que ao entrarem em contato, reagem e tem como um de seus produtos um gás, o dióxido de
carbono (CO2), o qual irá encher a bexiga. A equação química (01) que representa esta reação esta
apresentada a seguir:
(01)
NaHCO3(s) + CH3COOH(aq) → CH3COONa(aq) + H2O(l) + CO2(g)
Assim, pode-se explicar de forma mais simples as perguntas anteriormente realizadas.
Figura 3 – Experimento da Bexiga na Garrafa (reação ácido-base: pelo contato entre o vinagre e
o bicarbonato de sódio, formando um gás)
Para finalizar os experimentos na Mostra de Ciências, realizaram-se outros questionamentos.
“Quais outras substâncias que vocês conhecem que são ácidas ou básicas?”
“E o refrigerante?”
Após as devidas respostas, foi realizada orientação sobre a ingestão em excesso de refrigerante, partindo
dos princípios da existência de ácido fosfórico elevado e pH baixo, finalizando com as consequências que
essas substâncias podem causar ao organismo.
Após o questionamento sobre quais seriam as substâncias ácidas e básicas, sem uma orientação prévia
sobre os conceitos, percebeu-se que a maioria dos participantes sabiam responder quais eram as
substâncias ácidas – limão e vinagre –, porém havia certa dificuldade de entenderem o que seria uma
substância considerada básica. Considerando essa constatação esclareceu-se as diferenças entre as
duas características, com o auxílio de uma tabela de orientação de pH que uma substância ácida possui
pH menor que 7,0 e uma básica pH maior que 7,0. Em seguida, utilizou-se o indicador caseiro em todas os
produtos. Nas substâncias ácidas, a coloração violeta da beterraba ficava mais intensa, e nas substâncias
básicas – sabão, água sanitária e bicarbonato de sódio – permanecia incolor ou não alterava a intensidade
da coloração.
Em relação ao questionamento do sabão, a maioria dos participantes relataram que conheciam algum
familiar que produzia sabão caseiro a base de soda cáustica (NaOH). Ao serem indagados, todos os
alunos responderam que NaOH (hidróxido de sódio) era um ácido, pois é uma substância perigosa e que
provoca queimaduras na pele. Explicou-se, então, que não são somente os ácidos são perigosos e
responsáveis por causarem queimaduras na pele, mas que as substâncias básicas, como o NaOH,
também podem ser extremamente prejudiciais ao organismo.
Quanto a limpeza do banheiro, a maioria dos participantes relataram que eles ou seus familiares, na
maioria dos casos as mães, misturam diferentes produtos de limpeza e fecham a porta do banheiro para
lavar o mesmo. Orientou-se, então, quanto aos perigos de se misturar os produtos de limpeza e de manter
o ambiente fechado durante a limpeza. Pode-se exemplificar os perigos com o mesmo princípio do
experimento da bexiga na garrafa, pois vários dos componentes misturados podem reagir e liberar gases
tóxicos para aqueles que os aspirarem, mesmo que o gás que foi produzido na bexiga não era tóxico.
Ainda mais porque quando misturam as substâncias, a maioria dos alunos e seus familiares não
conseguem saber se há formação de produtos tóxicos. Cinco crianças (das diferentes escolas) relataram
que a intoxicação já aconteceu com algum familiar e que precisou de atendimento médico hospitalar.
Em relação a ingestão de produtos ácidos, orientou-se sobre a ingestão de refrigerante, sendo que cada
Rondonista relatou experiências químicas realizadas em laboratório para comprovar as possibilidades de
risco a saude das substâncias que compõem os refrigerantes. A rondonista acadêmica de Química
explicou sobre a quantidade de ácido fosfórico isolada de um refrigerante e esclareceu sobre o risco que
altas quantidades do mesmo podem causar, como por exemplo a descalcificação óssea. O rondonista
acadêmico de Farmácia relatou sobre o experimento da determinação do pH do mesmo refrigerante (pH
2,3) e explicou que pacientes com quadro clínico de gastrite e úlcera gástrica devem evitar o consumo já
que estão debilitados e, portanto, a ingestão da substância pode agravar o problema. Por sua vez a
rondonista da Odontologia esclareceu ainda que o pH baixo da substância, acidifica o pH da saliva e com
isso a pessoa que ingere o refrigerante (ou outro alimento qualquer) fica mais suscetível a formação de
doenças bucais, como a cárie, demonstrando a importância da higiene bucal (responsável por manter o pH
da saliva dentro da neutralidade). Portanto, durante a realização da Mostra de Ciências foi possível
relacionar a Química com as áreas da saúde como Farmácia e Odontologia, favorecendo o trabalho
multiprofissional.
5. Conclusão
Observou-se que a experimentação proporcionou o interesse dos alunos, que puderam perceber que
atividades simples do cotidiano estão relacionadas com a ciência. Para os Rondonistas, a experiência da
oficina foi de suma importância visto que estes conseguiram compartilhar e construir conhecimentos,
relacionando as áreas da Química, Farmácia e Odontologia. A Operação Rondon UEPG foi um projeto de
extensão essencial para a formação profissional destes estudantes que puderam aprender sobre o
conceito de trabalho multiprofissional e sua aplicabilidade.
Referências
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Kakihara, C.T. (orgs.) São Paulo: Martinari, ISBN 978.85.89788.62-5 2010, 544p.
BRUICE, P. Y. Química Orgânica. 4. ed. v. 1. São Paulo: Pearson Prentice Hall, 2006.
JAPIASSU, H. Interdisciplinaridade e patologia do saber. Rio de Janeiro: Imago, p.01-220, 1976.
LANGOSKI, J.L., SANTOS, C.T., RODRIGUES, A.L. Atividades lúdico interativas a um grupo de idosos: relato de
experiência de residentes multiprofissionais. Anais VI CONGRESSO IBERO-AMERICANO DE PROGRAMAS
UNIVERSITÁRIOS PARA ADULTOS MAIORES – Eixo: Saúde, Nutrição e Qualidade de Vida – Comunicação Oral.
Ponta Grossa: RIPUAM, v.1, p. 1-19, 2015.
PEDUZZI, M. Atualização - Equipe multiprofissional de saúde: conceito e tipologia. Rev Saúde Pública, v.35, n.1,
p.103-109, 2001.
TRABALHO 9
Análise farmacobotânica comparativa de Mikania cordifolia (L.f.) Willd. e
M. microptera DC.
Valter Paes de Almeida1 (IC) E-mail: [email protected]
2
Inês Janete Matozzo Takeda (PQ) E-mail:[email protected]
3
Jane ManfronBudel (PQ) E-mail: [email protected]
1
Aluno de iniciação científica do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa;
Pós-doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa;
Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela orientação do trabalho.
2
3
Resumo: Mikania Willd. pertence à família Asteraceae e apresenta várias atividades
farmacológicas. Mikania cordifolia e M. microptera, popularmente conhecidas como “guaco",
ocorrem no Sul do Brasil, a morfologia externa é muito semelhante. O objetivo deste estudo foi
investigar as características farmacobotânicas de folha e caule de M. cordifoliae M. microptera a
fim de fornecer suporte adicional para diferenciar esses taxa. As folhas e caules foram
investigados por microscopia eletrônica de varredura e de microscopia de luz. Estas espécies
apresentam diferenciação morfoanatômica na forma da folha e da base foliar; na presença de
estômatos; na forma da nervura central, pecíolo e caule em secção transversal; no padrão
vascular do pecíolo, na presença do anel esclerenquimático e na presença dos dutos secretores e
cristais na medula.
Palavras-chave: Asteraceae, droga vegetal, controle de qualidade.
1. Introdução
MikaniaWilld. pertence à família Asteraceae e à tribo Eupatorieae. É composto por 198 espécies,
no Brasil habitam de Norte a Sul do país, sendo encontradas principalmente em São Paulo, Rio
de Janeiro, Minas Gerais e Rio Grande do Sul. Mikania spp. apresenta uma vasta gama de
atividades farmacológicas promissoras principalmente como expectorante, anti-inflamatório,
broncodilatador, anti-hemorrágico, antiasmático, analgésico, antimutagênico antimicrobiano
antifúngico, relaxante muscular e anti-reumático.
O uso inadequado de nomes populares é, definitivamente, uma causa de graves erros na
identificação de drogas vegetais. Uma mesma espécie muitas vezes têm vários nomes comuns e,
assim como um nome popular pode designar várias outras espécies. Mikania cordifolia e M.
microptera, conhecidas popularmente como "guaco", ocorrem no Sul do Brasil e sua morfologia
externa é semelhante, podendo ocasionar equívocos durante o uso da planta medicinal.
Os dados anteriores revelaram que M. cordifolia tem ação anti-inflamatória, insecticida,
tripanocida, genotóxica e anti-proliferativa. Mikania microptera é semelhante à M. cordifolia na sua
morfologia externa. No entanto, nenhuma caracterização farmacológica ou química está foi
determinada para M. microptera.
2. Objetivos
Considerando a morfologia externa semelhante de M. cordifolia e M. microptera, o objetivo deste
trabalho foi estudar as características farmacobotânicas de folhas e caules de M. cordifolia e M.
microptera a fim de fornecer suporte adicional para diferenciar esses taxa, contribuindo para o
controle da qualidade de drogas vegetais e fitoterápicos.
3.1 Materiais botânicos
As partes aéreas de pelo menos cinco espécimes de M. cordifolia e M. microptera foram
coletadas na Fazenda São Maximiano, que está localizado na região da Serra do Sudoeste, na
cidade de Guaíba, Estado do Rio Grande do Sul, Brasil (coordenadas 30 ° 10 'S e 51 ° 20' W e 27
m de altura).
Mikania cordifolia foi coletada em setembro de 2012 e M. microptera em dezembro de 2003. Os
materiais botânicos foram identificados e registrados na Universidade Federal do Rio Grande do
Sulsob os números ICN 116,543 e 129,447, para M. cordifolia e M. microptera, respectivamente.
3.2 Análises anatômicas
As folhas e caules de M. coridifolia e M. microptera foram seccionadas em cerca de cinco
centímetros a partir do ápice. Em seguida, foram colocados em recipientes contendo solução de
FAA 70 (JOHANSEN, 1940), e armazenados em etanol a 70% (BERLYN et al., 1976). As plantas
foram seccionadas à mão livre. Algumas seções foram coradas utilizando azul de astra e/ou
fucsina básica (ROESER, 1972). Algumas fotomicrografias foram capturadas por microscópio de
luz Olympus CX31 equipado por uma unidade de controle C7070. As lâminas semi-permanentes,
foram analisadas no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa
para permitir uma descrição detalhada dos tecidos da folha e do caule.
3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
O material foi desidratado em uma série etanólica crescente e pelo ponto crítico no aparelho
Balzers CPD-030. Após a desidratação, o material foi revestido com ouro, utilizando-se o
aparelho Balzers-Sputtering SCD-030. O microscópio de varredura Jeol JSM-6360LV foi utilizado
para capturar micrografias eletrônicas (SOUZA, 1998). Os resultados foram realizados no Centro
de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do Paraná.
Várias espécies de Mikaniamostram morfologia semelhante, a exemplo de M. Glomerata Spreng.
e M. laevigata Sch. Bip. ex Baker, M. lanuginosa DC. e M. hirsutissima DC., M. confertissima Sch.
Bip. ex Baker, M. hatschbachii G.M. Barroso e M. glomerata, Mikania hirsutissima e M.
microlepsis Baker.
Tal como no caso dos outras, a morfologia de M. cordifolia e M. microptera é semelhante. Mikania
cordifolia possui folhas que tem 4,5-7 cm de comprimento e 3,5-6,5 cm de largura. As folhas são
simples, pecioladas com 5 veias visíveis e opostas. A forma do limbo é deltoide, o ápice
acuminado, a base hastado-cordada e a margem é paucidenteada. As folhas de M. microptera
têm 6,5-13 cm de comprimento e 5,5-13 cm de largura, pecioladas com 5 veias visíveis e opostas.
São simples, de forma triangular e têm um ápice acuminado, a base hastada e margem
paucidentada.
Anatomicamente, em vista frontal da lâmina foliar, as paredes celulares da epiderme são
anticlinais e finas, sinuosas na face abaxial e ligeiramente onduladas na face adaxial em ambas
as espécies. Além disso, a epiderme é coberta por uma cutícula lisa, mas está ligeiramente
estriada perto dos estômatos.
Mikania cordifolia só exibe estômatos anomocíticos no lado abaxial e M. microptera mostra o
mesmo padrão em ambos os lados. Estômatos anomocíticos são comuns em Mikania. No
entanto, anisocíticos (BUDEL et al., 2009) e actinocíticos (NEVES & SÁ, 1991) foram descritos
para espécies de Mikania.
No que diz respeito à ocorrência de estômatos, M. cordifolia mostra folhas hipoestomáticas e M.
microptera tem folhas anfiestomáticas. Folhas hipoestomáticas são comuns em Mikania, como M.
glomerata, M. laevigata, M. confertissima, M. hatschbachii DC., M. hookeriana, M. microlepsis e
M. smilacina DC. No entanto, folhas anfiestomáticas foram encontradas na M. congesta DC.
(OLIVEIRA et al., 1994), M. lanuginosa (AMORIM et al., 2014) e M. micrantha Kunth (ARAÚJO et
al., 2015).
A lâmina foliar, em corte transversal, tem uma epiderme unisseriada coberta por cutícula delgada
e os estômatos estão localizados no mesmo nível que as outras células da epiderme, em ambas
as espécies.
No que diz respeito aos tricomas glandulares, o primeiro é bisseriado capitado e estão localizados
em depressão na epiderme. Neste estudo, tricomas semelhantes são mais abundantes em M.
microptera. Outro tipo de tricoma glandular é o unisseriado multicelular, que pode se apresentar
curvado.
O tricoma tector é cônico e pode ser longo ou curto. Os três tipos relatados foram encontrados em
espécies de Mikania (OLIVEIRA et al., 1994; RODRIGUES et al., 1996; OLIVEIRA et al., 1999;
OLIVEIRA et al., 2000; OLIVEIRA & AKISUE, 2005; AMORIM et al., 2014; ARAÚJO et al., 2015).
O mesofilo das folhas de M. cordifolia e M. microptera é do tipo dorsiventral. O parênquima
paliçádico é composto por uma camada e o parênquima esponjoso exibe várias camadas e tem
alguns pequenos espaços intercelulares.
A forma da nervura central de ambas as espécies, em secção transversal, é biconvexa em ambos
os lados. No entanto, M. cordifolia tem uma forma redonda e M. microptera tem proeminências
obtusas. A epiderme é unisseriada, coberta por uma cutícula lisa em ambas as espécies. Existem
4 camadas de colênquima angular no lado adaxial e 1-2 camadas no lado abaxial para ambas as
espécies. Há 5-6 feixes vasculares colaterais em arco aberto.
Dutos secretores ocorrem entre os feixes vasculares e são compostas de 4-12 células com um
epitélio unisseriadas em ambas as espécies. O colênquima angular e o tipo e distribuição do feixe
vascular colateral são características comuns de Mikania (NEVES & SÁ, 1991; RODRIGUES et
al., 1996; BUDEL et al., 2009; GASPARETTO et al., 2010; AMORIN et al., 2014; ARAÚJO et al.,
2015).
Neste estudo, as características do pecíolo podem ajudar a diferenciar estes taxa. Mikania
cordifolia tem uma forma côncava-convexa em secção transversal e M. microptera tem uma forma
plana-convexa. Adicionalmente, existe uma forma arredondada no lado abaxial em M. cordifolia,
duas nervuras na face adaxial e 3 nervuras no lado abaxial em M. microptera.
A epiderme tem as mesmas características anteriormente descritas para a lâmina foliar. Na face
abaxial, há 3-4 camadas contínuas de colênquima angular em M. cordifolia e 1-2 em M.
microptera. O sistema vascular tem feixes colaterais vasculares, com 8-9 feixes vasculares em
arco aberto em M. cordifolia e 10-12 feixes vasculares em forma de U em M. microptera.
O caule em secção transversal tem formato hexagonal em ambas às espécies, embora tenha alas
em M. microptera. A forma do caule cilíndrico parece ser o padrão em Mikania (RITTER, MIOTO,
2005), embora M. malacolepsis e M. micrantha tenham forma hexagonal (RODRIGUES et al.,
1996). A epiderme do caule é muito semelhante ao da epiderme da folha para essas espécies,
uma vez que possui estômatos, cutícula lisa, e ambos os tricomas glandulares e tector. No
entanto, os estômatos estão localizados acima das outras células epidérmicas em M. cordifolia.
Oliveira et al. (2000), descreveram este complexo estomático como parecendo uma torre.
Abaixo da epiderme, há 2-3 camadas contínuas de colênquima angular em M. cordifolia e um em
M. microptera, exceto nas costelas, onde existem várias camadas de colênquima. Mikania
cordifolia tem um anel esclerenquimático no córtex, onde as células têm paredes de espessura
reduzida e um lúmen. No entanto, Mikania microptera não têm quaisquer sinais deste achado.
A endoderme liga o córtex internamente e contêm grãos de amido em ambas as espécies.
Calotas de fibras perivasculares podem ser observadas ao lado do floema. A zona cambial é
evidente e forma mais xilema do que floema. Em ambas as espécies, a medula é bem
desenvolvida e compreende células parenquimáticas de paredes finas e isodiamétricas. Ductos
secretores podem ser encontrados no córtex e perto do floema em ambas as espécies, no
entanto, eles só aparecem na região perimedular em M. cordifolia.
A presença ou ausência de cristais e seu tipo pode ser caracterizada como uma característica
taxonômica (LERSTEN & HORNER, 2000; MERIC, 2009) e cristais não têm sido citados no
gênero Mikania (OLIVEIRAet al., 1994; RODRIGUES et al., 1996; OLIVEIRA et al., 1999;
OLIVEIRA et al., 2000; OLIVEIRA & AKISUE, 2005; BUDEL et al., 2009; AMORIM et al., 2014;
ARAÚJO et al., 2015). Em contraste com esta informação, cristais prismáticos só foram
observados na região perimedular de M. cordifolia. A ocorrência de cristais é comum em plantas,
embora o seu tamanho e número sofram alterações da concentração de cálcio no ambiente
(NAKATA, 2003).
5. Conclusão
Embora as espécies estudadas apresentem características morfoanatômicas semelhantes,
algumas características podem ser consideradas como diagnóstico. Como, a forma do limbo que
na M. cordifolia é deltoide e na M. microptera é triangular, a forma da base do limbo é hastatocordada em M. cordifoliae hastada em M. microptera. Quanto à presença de estômatos, a folha
de M. cordifolia é classificada como hipoestomática e da M. microptera é anfiestomática.
Mikaniacordifolia, em secção transversal, possui proeminências arredondadas na nervura central
e em M. microptera, essas proeminências são obtusas. A forma do pecíolo em secção transversal
é côncava-convexa, com uma forma arredondada na face abaxial em M. cordifolia é planoconvexa, com duas costelas na face adaxial e três na abaxial em M. microptera. O arranjo do
feixe vascular do pecíolo em M. cordifolia é em arco aberto e em M. microptera em forma de U. A
forma do caule em secção transversal nas duas espécies estudadas é hexagonal, masM.
micropterapossui alas. Quanto ao anel esclerenquimático, ductos secretores e cristais na medula,
M. cordifolia é presente, mas em M. microptera é ausente. Essas características morfoanatômicas
descritas para folha e caule das espécies analisadas, auxiliam na diferenciação e identificação,
fornecendo subsídios farmacobotânicos para o controle de qualidade de drogas vegetais e
fitoterápicos.
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TRABALHO 10
Caracterização de tumor primário e lesões metastáticas em modelos
xenográficos de cancer de mama HER2+ e triplo negativo por PET-FDG
1
Laís Costa Ayub (IC) E-mail: [email protected]
2
Raquel de Souza (PQ) E-mail: [email protected]
Christine Allen3 (PQ) E-mail: [email protected]
1 Acadêmica de Farmácia na Universidade Estadual de Ponta Grossa.
2 Pesquisadora da Universidade de Toronto
3 Professora da Universidade de Toronto
Resumo: O câncer de mama hoje é o mais diagnosticado entre os demias tipos de câncer, e representou
a maior porcentagem de mortes por câncer no Canada, em 2014. Os métodos de diagnóstico por imagem,
são populares e frequentemente usados por não serem invasivos. O uso de fluorodeoxygluse (FDG) como
marcador é bastante descrito na literatura, e apesar de não ser específico (podendo ser metabolisado em
órgãos saudáveis) ele é o mais utilizado na clínica. O presente trabalho teve por objetivo identificar o tumor
e as lesões metastáticas e quantificar o metabolismo dos mesmos, nos diferentes modelos utilizados. Para
isso as linhagens celulares dos modelos triplo-negativo e HER2+(LM2-4 e H2N respectivamente) foram
cultivadas em meio de cultura até atingirem a confluência adequada para a inoculação em fêmeas
imunocomprometidas. As análises foram realizadas em dois pontos por FDG-PET/CT.A metodologia
atingiu o objetivo de identificar e quantificar o metabolismo dos tumores primários e das lesões
metastáticas.Houve uma correlação moderada (r2=0,7) entre o tamanho dos tumores primários e a
quantidade de FDG acumulada, em ambos os modelos. Já as lesões metastáticas não apresentaram esta
correlação entre lesões de um mesmo animal, nem entre lesões do mesmo modelo. A caracterização de
modelos clínicos como este é importante para acelerar e facilitar a pesquisa realizada com os mesmos.
Palavras-chave: Câncer de mama, caracterização, PET-FDG.
1. Introdução
O câncer de mama, atualmente, é o o tipo de câncer mais diagnosticado, e tem a maior
porcentagem de mortes por câncer, de 14% das mulheres Canadenses dignosticadas em 2014
(PUBLIC HEALTH AGENCY OF CANADA, 2014). Este tipo de câncer é dividido em quatro
grupos: luminal, HER2-positivo (HER2+), normal, e o basal (SORLIE et al., 2001). O presente
trabalho é focado nos grupos basal e HER2+.
O grupo basal é assim denominado por não apresentar expressão dos receptores de estrogênio
(ER), de progesterona (PR) e de fator de crescimento epidermal (HER2), porém expressa genes
comumente encontrados em células basais e mioepiteliais da mama. Devido ao status dos
receptores de hormônios, o grupo basal também é conhecido como triplo-negativo (TAN et al.,
2008).O grupo HER2+ é caracterizado por ter a expressão do oncogene ERBB2 aumentada
(REVILLION et al., 1998).
As técnicas de mutimodalidade de imagem são de grande relevância para a pesquisa e a clínica,
promovendo o diagnóstico, avaliação da terapia e monitoramento da doença. A terapia de
emissão de positrões (PET) foi desenvolvida para captar a radiação proveniente do ojeto de
estudo. A radiação provém do marcador que é fornecido ao objeto (ALAZRAKI et al., 1995). A
PET fornece informações sobre o metabolismo da área de estudo, podendo ter a concentração do
marcador, acumulado em um órgão ou tecido, calculada via software que converte o pixel da
imagem em concentração de radiação (MBq). O marcador mais popular para essa área de estudo
é o 2-[18F]fluoro-2-deoxy-d-glucose (FDG), um análogo da glucose capaz de entrar nas células
por meio dos transportadores de glucose (GLUT) e ser parcialmente metabolizado pela via
glicolítica. O composto formado que é incapaz de sair da célula é o FDG-6-fosfato (HESS et al.,
2014, MACHEDA et al., 2005, VALLABHAJOSLUA, 2007).
A tomografia computadorizada (CT) é caracterizada por prover informação tridimensional com alta
resolução espacial sobre o objeto de estudo. A radiação provém do equipamento que envia raiosX sobre o objeto, os quais são absorvidos pelos receptores e transformado em imagem
(GOLDMAN et al., 2008). Quando as duas modalidades são usadas em conjunto (PET/CT), as
informações adquiridas com cada equipamente se complementam, e o que se obtém é uma
imagem coregistrada, com informação sobre a função metabólica de órgãos e tecidos e sua
localização espacial dentro do objeto (PURANDARE et al., 2010, SCHODER et al., 2008, HESS
et al., 2014).
O presente trabalho é parte de um trabalho mais amplo que tem por objetivo caracterizar os
modelos triplo-negativo e HER2+ por meio de multiplas modalidades de imagem. As modalidades
utilizadas foram: bioluminescência, CT de alto contraste, ressonância magnética, fluorescência,
microscopia ótica.
2. Objetivos
Este trabalho possui dois objetivos principais: (1) identificar os tumores primários e as lesões
metastáticas e (2) caracterizar o metabolismo dos tumores primários e das lesões.
3.1 Cultura de células
As linhagens LM2-4 e H2N foram doadas pelo Dr Robert Kerbel, do Instituto de Pesquisa
Sunnybrook, Toronto. Elas foram cultivadas em monocamadas em meio de Dulbecco, com 10%
de soro fetal bovino. Foram mantidas em estufa à 37oC, com 5% de CO2, até que a confluência
de 70-80% fosse atingida. Então as células foram colhidas usando tripsina (0,25% EDTA-tripsina)
e suspendidas em novo meio.A quantificação de células viáveis foi feita usando o BIO-RAD
TC10TM.
3.2 Modelo animal
Foram utilizadas doze fêmeas imunocomprometidas (SCID), de 6-7 semanas de idade. Os
animais foram comprados do Instituto de Câncer de Ontario, Toronto, e aleatóriamente divididas
em dois grupos com seis animais cada. Uma suspensão de 4x106 células foi inoculada na
glândula mamária inguinal direita, para cada animal.
3.3 FDG-PET/CT
Duas sessões de imagem foram realizadas, a primeira 15 a dias após a inoculação das células,
quando os tumores primários atingiram 150-250 mm3. Esta primeira sessão é descrita adiante
como semana 1. Após a sessão os tumores primários foram cirurgicamente retirados, para que as
lesões metastáticas pudessem ser formadas sem que o animal sofresse por causa do tamanho
do tumor primário. Então, no 35o dia após a inoculação a segunda sessão foi realizada, a fim de
avaliar o aparecimento das lesões metastáticas.
3.4 Processamento e análise das imagens
Todas as imagens foram reconstruídas usando um algorítimo de projeção, e foram analisadas e
co-registradas usando o software Inveon Research Workplace (IRW). As imagens do PET e do
CT foram sobrepostas usando o software, para que as imagens do PET pudessem ser analisadas
em contexto anatômico. Contornos dos tumores primários e lesões metastáticas foram feitas
usando uma ferramenta de contorno do IRW, para criar as regiões de interesse (RDI). Com o
RDI, obtem-se o volume e a radioatividade emitida. A dose injetada (%DI/g) foi calculada,
corrigindo a concentração da dose em relação ao seu tempo de meia-vida. O músculo da perna
esquerda foi considerado o tecido base para o consumo de FDG. Assim sendo, os RDIs foram
normalizados, antes de serem analisados para a discussão.
3.5 Análise estatística
Para os tumores primários, utilizou-se a regressão linear para avaliar a correlação entre volume e
consumo de FDG.Com relação as lesões metastáticas realizou-se ANOVA (p<0,05).
4.1 Tumores primários
Um animal do grupo LM2-4 morreu antes da segunda sessão, devido a uma complicação após a
cirurgia, e por isso não foi incluído na análise estatística.
Todos os animais produziram tumores primários, dentro dos primeiros 7 dias após a inoculação
das células. Na figura 1 é possível identificar o perímetro
perímetro do tumor, sugerindo que não houve
invasão da cavidade peritoneal.
Figura 1. Cópia de como as imagens são vistas no software IRW. Na imagem PET/CT pode-se
pode se perceber o contorno
do tumor, e a esquerda o contorno com o RDI.
No modelo LM2-4, os animais tiveram volumes de tumores primários de 215.9 ± 44.0 mm3 (174.9259.4 mm3) e consumo de FDG entre 4.51
4.51-22.33.
22.33. Enquanto isso, os animais do modelo H2N
tiveram volume médio de tumor primário de 161.6 ± 48.5 mm3 (94.1-201.4
201.4 mm3) e consumo de
FDG entre 3.41-14.70.
se que os tumores em geral tenham o consumo aumentado em comparação
Em teoria, espera-se
com os tecidos-base,
base, pois como descrito na literatura células tumorais contém uma maior
concentração de hexokinase, favorecendo maior concentração de glucose e FDG no meio
intracelular (MACHEDA et al., 2005, VALLABHAJOSULA et al., 2007). Porém, o microambiente
dos tumores é muito heterogênio e a necrose, assim como a hipóxia pode interferir com o
consumo e distribuição de FDG dentro do tumor, afetando o resultado (CLAUSEN
(CLAUSEN et al., 2013,
SHA et al., 2013).
O gráfico abaixo mostra a correlação entre volume (mm3) e consumo de FDG no interior dos
tumores primários, e ambos tiveram valores de r2 de aproximadamente 0,72. O que sugere que
quanto mais o tumor cresce, menor é o consumo do FDG.
Tumour-to-muscle Ratio
Correlation between tumour volume
and tumour-to-muscle
tumour
ratioy = -0,129x
0,129x + 42,22
R² = 0,726
25
20
15
10
5
0
LM2
LM2-4
H2N
0
50
100
150
200
250
300
Linear
(LM2
(LM2-4)
y = -0,086x
0,086x + 22,41
R² = 0,725
Tumour Volume (mm3)
Figura 2. Gráfico de correlação entre consumo de FDG e volume dos tumores primários de ambos os modelos.
O declínio no consumo de FDG pode estar relacionado com a presença de hypóxia. Com o crescimento da
massa tumoral, a vascularização do núcleo é prejudicada. O tumor perde a capacidade de prover
nutrientes para esta região. Para tentar reverter o quadro, sinais para angiogênese são liberados, porém
os vasos produzidos são porosos e de estrutura muito frágil.Com sistema linfático também inadequado no
microambiente, os fluídos se acumulam, e aumentam a pressão do núcleo o que favorece a hipóxia
(BARONZIO et al., 2000, POUYSSEGUR et al., 2006).
4.2 Lesões metastáticas
Dois animais, um de cada grupo, não produziram lesões metastáticas e foram retirados da análise
estatística.
Dos animais restantes, todos desenvolveram de 3 à 4 lesões detectáveis, independentemente do modelo
de câncer. As lesões do modelo LM2-4 que tiveram volumes superiores a 50 mm3, tiveram um baixo
consumo de FDG (<10). No modelo H2N volumes, de lesões, superiores a 80mm3, também tiveram
consumo reduzido. Os gráficos de correlação das lesões de cada animal foram plotados, porém não houve
correlação entre volume e consumo de FDG entre lesões de um mesmo animal, ou entre lesões do
mesmo grupo. Sugere-se que a avaliação da presença de necrose ou hipóxia seja feita, para avaliar
melhor o microambiente.
Notou-se que algumas regiões onde as lesões se desenvolveram, era frequente para os animais de ambos
os grupos (Figura 3).
Figura 3. Localizações das lesões metastáticas mais frequentes observadas entre os modelos estudados.
Levando essas localizações em consideração, notou-se que somento o modelo H2N teve consumo de
FDG maior que 20, em relação ao modelo LM2-4 (Figura 4).
Figura 4. Gráfico de consumo pela localização das lesões metastáticas. A linha pontilhada representa uma divisão
para a melhor visualização da diferença entre os modelos estudados.
O resultado do ANOVA mostraram que não há diferença estatística entre os modelos. Mas ao investigar o
grupo H2N, apenas 3 animais (de 5) tiveram as lesões com o consumo maior do que 20. Na verdade,
todas as lesões destes animais foram acima de 20 (Figura 5). Examinando o perfil destess animais, foi
constatado que eles não tiveram nenhuma diferença física (como peso (g))em relação aos animais do
mesmo grupo, e nem com os animais do grupo LM2-4.A quantidade de célula inoculada foi a mesma para
todos os animais. Ambos os modelos são conhecidos por serem altamente metastáticos, sendo a única
diferença a expressão dos receptores para o fator de crescimento epidermal.
Figura 5. Gráfico de correlaçã de consumo de FDG por localização de lesão de cada animal de ambos os modelos
estudados.
Na literatura já foi declarado que as células, para poderem sobreviver à viagem pelo corpo,
precisam se adaptar ao novo microambiente. A mudança é necessária, pois o novo ambiente não
necessariamente produz a mesma matriz extracelular que o local do tumor primário (WOOD et al.,
2014).
As células são dependentes da receptividade do estroma, e são comumente encontradas nos
primeiros órgãos/tecidos nos quais seus capilares que possam aparecer em seu caminho durante
a circulação (KUMAR et al. 2013). Com isso, os resultados sugerem que as lesões são atraídas
para os locais ricamente vascularizados, os quais terão condições de nutri-las.
5. Conclusão
A metodologia utilizada atingiu o objetivo de identificar os tumores primários e as lesões
metastáticas, bem como quantificar o consumo de FDG específico de cada RDI criada.
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TRABALHO 11
Caracteres macro e microscópicos de caule e folha de
Mikania hastato-cordata Malme, visando o controle da qualidade
Beatriz Eloise Mika (IC) E-mail [email protected]
Jane ManfronBudel(PQ) E-mail [email protected]
Resumo: Dentre os gêneros de Asteraceae destaca-se Mikania, que compreende cerca de 450 espécies
distribuídas em regiões tropicais e subtropicais. São popularmente conhecidas como “guaco” e muito
utilizadas na medicina popular no tratamento de tosses e resfriados por apresentarem atividades
expectorante, broncodilatadora, e antissépticas das vias respiratórias. Objetivou-se analisar a morfologia
externa e a anatomia do caule e da folha de Mikania hastato-cordata, a fim de fornecer características
farmacognósticas para identificação e diferenciação de outras espécies do gênero Mikania, visando o
controle de qualidade da matériaprima. O material vegetal foi submetido as técnicas usuais de microscopia
de luz e eletrônica de varredura, além de testes microquímicos. Em relação aos caracteres anatômicos, a
lâmina foliar apresenta, em vista frontal, células de contorno levemente ondeadas, de paredes anticlinais
delgadas. A folha apresenta estômatos do tipo anomocítico somente na face abaxial, caracterizando a
folha como hipoestomática e estes se localizam no mesmo nível das demais células epidérmicas.
Evidencia-se tricomas glandulares pluricelulares unisseriados, formados por cerca de 5 células, além de
tricoma glandularcapitado. O mesofilo é do tipo dorsiventral, sendo constituído por uma camada de
parênquima paliçádico e aproximadamente 6 estratos de parênquima esponjoso. A nervura central, em
secção transversal, apresenta-se plano-convexa e o sistema vascular está representado por 3 feixes
vasculares livres em arco aberto. O pecíolo tem formato cônvavo-convexo, enquanto que o caule tem
formato circular, em secção transversal. As características morfoanatômicas descritas para a folha e para
o caule de Mikania hastato-cordata auxiliam na identificação da espécie vegetal, além de fornecer dados
farmacobotânicos para o controle da qualidade da droga vegetal e de fitoterápicos.
Palavras-chave: Anatomia, Asteraceae, farmacobotânica, morfologia.
1. Introdução
Dentre os principais gêneros de Asteraceae está Mikania Willd., que pertence à tribo Eupatorie e
apresenta cerca de 430 espécies, distribuídas em regiões tropicais quentes e subtropicais dos
continentes Americano e Asiático. Aproximadamente 198 espécies ocorrem no Brasil, de Norte a
Sul, especialmente nos estados do São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais (Ritter& Mioto,
2005; The PlantList, 2014).
Várias espécies de Mikania são muito semelhantes morfologicamente e conhecidas pela
designação popular de guaco e cipó-cabeludo e amplamente utilizadas pela população para o
tratamento de tosses e resfriados. Nesse sentido, vários estudos morfoanatômicos de espécies
de Mikania têm sido conduzidos a fim de auxiliar no controle da qualidade da droga vegetal e de
fitoterápicos (Budel et al., 2009; Amorin et al., 2014; Araújo et al., 2015).
Mikania hastato-cordata Malme, conhecida tradicionalmente como guaco, é uma espécie
trepadeira volúvel que apresenta os ramos cilíndricos, estriados, podendo apresentar poucos
tricomas ou não. No Brasil, pode ser encontrada nas regiões Sudeste e Sul, em bordas de matas
e crescendo sobre vegetação arbustiva, em restinga (Ritter & Mioto, 2005).
Na medicina popular, espécies de Mikania são amplamente utilizadas devido aos seus efeitos
terapêuticos, a exemplo de expectorante, anti-inflamatório, broncodilatador, antiasmático,
antisséptico das vias respiratórias, analgésico, anticarcinogênico, antimutagênico, antimicrobiano,
antifúngico, antiulcerogênica, relaxante da musculatura lisa, sudorífero e antireumático (MuellasSerrano, 2000; Paul et al., 2000; Budel et al., 2009; Gasparetto et al., 2010).
As semelhanças morfológicas e a ausência de informações acerca da caracterização
morfoanatômica de espécies vegetais pode acarretar em coletas equivocadas, utilizações
incorretas e malefícios à saúde, principalmente devido a intoxicações ou ingestão de subdoses,
muitas vezes decorrentes de confusão entre as diferentes espécies pertencentes a um mesmo
gênero.
Considerando que não existem dados farmacobotânicos de Mikaniahastato-cordata, objetivou-se
analisar a morfologia e a anatomia da espécie vegetal a fim de auxiliar na identificação, além de
fornecer dados para o controle da qualidade da droga vegetal e de fitoterápicos
2.1. Material vegetal
A coleta do material vegetal foi realizada na Fazenda São Maximiano, Guaíba, Rio Grande do
Sul. O material vegetal foi submetido à confecção de exsicata, identificado por taxonomista e o
representante foi depositado em Herbário da UEPG.
2.2. Análises anatômicas
O material vegetal foi coletado a partir de 5 cm do ápice da planta. Folhas e caules de M. hastatocordata foram fixados em solução de FAA 70 (Johansen, 1940) e armazenados em álcool etílico a
70% (Berlyn&Miksche, 1976). O material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal,
efetuado à mão livre, foi submetido à coloração de azul de astra e fucsina básica (Roeser, 1972)
em lâminas semi-permanentes preparadas para tal fim. Algumas fotomicrografias foram
capturadas por um microscópio Olympus CX 31 equipado com uma unidade de controle C 7070.
As lâminas semi-permanentes, em seguida, foram analisadas no Laboratório de Farmacognosia
da Universidade Estadual de Ponta Grossa para permitir uma descrição detalhada dos tecidos da
folha e do caule.
2.3.Testes microquímicos
Para a realização dos testes microquímicos foram feitas secções transversais à mão livre do
material e os reativos empregados foram: solução de floroglucina clorídrica para verificação de
lignina (Foster, 1949), Sudam III para substâncias lipofílicas (Sass, 1951), cloreto férrico para
compostos fenólicos (Johansen, 1940) e lugol para amido (Berlyn; Miksche, 1976).
2.4. Microscopia Eletrônica de Varredura
A análise ultra-estrutural de superfície (microscopia eletrônica de varredura - MEV)(Souza, 1998)
foi realizada em lâmina foliar e caule e, para tal procedimento, as amostras foram fixadas em FAA
70, desidratadas em série etanólica crescente e pelo ponto crítico no equipamento Balzers CPD010 e, após montagem em suporte, submetidas à metalização com ouro no aparelho
BalzersSputtering SCD-030. As eletromicrografias foram realizadas no microscópio eletrônico de
varredura Jeol JSM 6360 LV.
Mikania hastato-cordata é um sub-arbusto trepador que apresenta caule cilíndrico e lenhoso. A
região dos nós é, frequentemente, acompanhada por folhas de disposição opostas, estas se
caracterizam por serem deltoides a triangulares em forma, de ápice acuminado e base hastato a
cordada, de margem inteira e pecioladas. As folhas apresentam de 2 a 6 cm de comprimento e de
2 a 4,5 cm de largura em média.
Em relação aos caracteres anatômicos, a lâmina foliar apresenta, em vista frontal, células de
paredes anticlinais levemente ondeadas e delgadas, cobertas por cutícula lisa, que reagiu com
Sudam III. A folha apresenta estômatos do tipo anomocítico somente na face abaxial,
caracterizando a folha como hipoestomática e, em secção transversal, estes se localizam no
mesmo nível das demais células epidérmicas. Sobre o sistema de revestimento, ocorre presença
de cutícula delgada e cera epicuticular esparsa e em forma de rosetas.
Mikania hastato-cordata evidencia tricomas glandulares pluricelulares unisseriados, curvos ou
não, formados por cerca de 5 células, além de tricoma glandular capitado. Esses anexos
epidérmicos aparecem em depressão na epiderme. Esses anexos epidérmicos são comuns em
espécies de Mikania (Budel et al., 2009; Amorin et al., 2014; Araújo et al., 2015). Não foram
observados tricomas
as tectores unisseriados cônicos,
cô
comuns em Mikania spp. (Amorin et al., 2014;
Araújo et al., 2015).
O mesofilo é do tipo dorsiventral, sendo constituído por uma camada de parênquima
parênquima paliçádico e
aproximadamente seis estratos de parênquima esponjoso, que evidencia pequenos espaços
intercelulares. Feixes vasculares colaterais estão mergulhados na região mediana do mesofilo e
aparecem envoltos por uma bainha parenquimática e frequentemente
frequentemente estão associados adutos
secretores, estes são formados por cerca de seis células, podendo apresentar estrato único ou
duplo.
A nervura central, em secção transversal, apresenta
apresenta-se plano-convexa.
convexa. A epiderme é
uniestratificada, recoberta por cutícula
cula delgada e levemente estriada. O colênquima é do tipo
angular e é representado por cerca de dois estratos em ambas as faces. O sistema vascular está
representado por três feixes vasculares do tipo colateral, dispostos em arco aberto, sendo o
central de maior porte. Dutos secretores são observados nas proximidades dos feixes vasculares
e apresentam características semelhantes às anteriormente descritas. O xilema é constituído por
elementos traqueais dispostos em fileira.
O pecíolo, quando seccionado transversalmente
transversalmente na região mediana, tem formato côncavo
côncavoconvexo, e evidencia epiderme uniestratificada coberta por cutícula estriada. Subjacentemente à
epiderme, observa-se
se uma camada de colênquima angular. Cerca de nove feixes vasculares
livres, do tipo colateral,
teral, em arco aberto, estão mergulhados no parênquima fundamental.
O caule, em secção transversal, apresenta formato circular. A epiderme é uniestratificada e
revestida por cutícula estriada e apresenta os mesmos tricomas mencionados para o limbo foliar.
Adjacentemente à epiderme, cerca de seis camadas de colênquima angular são observados.
Limitando internamente o córtex, observa
observa-se
se um estrato de células parenquimáticas contendo
amiloplastos, constituindo a bainha amilífera. Os grãos de amido reagiram pos
positivamente na
pesquisa com lugol. Nas proximidades da bainha, em direção aos feixes vasculares, dutos
secretores de estrato único, formados por cerca de oito células podem ser encontrados. O cilindro
vascular é constituído por floema em direção centrífuga e xilema formado centripetamente,
estabelecendo uma região medular. Calotas de fibras perivasculares são encontradas na região
próxima ao sistema floemático e reagiram à pesquisa de lignina. O parênquima medular compõecompõe
se de células de diversos tamanhos e de parede delgada.
O contorno do caule, em secção transversal, auxilia na diagnose do fármaco. Nesse sentido,
contorno circular também foi observado em M. lanuginosa (Amorinet al., 2014), M. glomerata
(Neves and Sá, 1991) and M. Laevigata (Budel et al., 2009).
009). Entretanto, M.
malacolepsis(Rodrigues
(Rodrigues et al., 1996) e M. cordifolia (Oliveira et al., 2000) mostraram contorno
hexagonal. A espécie em estudo não apresentou dutos secretores na medula, como ocorre em M.
glomerata (Neves and Sá, 1991) e M. laevigata (Budelet al., 2009). A presença de tricomas
glandulares e dutos secretores incentivam estudos microbiológicos com o óleo essencial presente
nessas estruturas.
Figura1 – Vista frontal da face adaxial,
l, evidenciando
tricoma glandular unisseriado.
Figura 2. Secção
o transversal da nervura central e limbo foliar.
Figura 3– Secção transversal do peciolo.
Figura 4 - Secção transversal do caule.
4. Conclusão
As características morfoanatômicas descritas para a folha e para o caule de Mikania hastato-cordata
hastato
auxiliam na identificação da espécie e na dif
diferenciação das demais Mikania e dão suporte ao controle da
qualidade da matéria prima vegetal.
Referências
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TRABALHO 12
Citotoxicidade de nanopartículas de ácido hialurônico e lisina/polilisina
em fibroblastos 3T3
Angélica Maria Duda (IC) Email:[email protected]
Rosana Letícia da Rosa (G) Email: [email protected]
Luana Serbai (IC) Email: [email protected]
Jaqueline Carneiro (PG) Email: [email protected]
Josiane Padilha de Paula (PQ) Email: [email protected]
Patrícia Mathias Döll Boscardin (PQ) Email: [email protected]
Resumo: Os complexos iônicos de ácido-hialurônico/lisina e ácido-hialurônico/polilisina possuem potencial
para serem utilizados como preenchedores cutâneos de aplicação tópica. Dessa forma, faz-se necessário
investigar a citotoxicidade das nanopartículas de ácido-hialurônico e lisina/polilisina por meio do ensaio de
viabilidade celular, sendo utilizado o método de redução do MTT em células 3T3. As nanopartículas foram
obtidas pelo método de gotejamento sob agitação. A análise dos resultados de avaliação da citotoxicidade
demonstrou que as nanopartículas de ácido hialurônico e lisina (AH-LIS) não reduziram a viabilidade
celular dos fibroblastos testados enquanto que as nanopartículas de ácido hialurônico e polilisina (AHPLIS) foram citotóxicas nas concentrações de 2,5 e 1,25 mg/mL.
Palavras- chave: citotoxicidade, nanopartículas, ácido hialurônico, lisina, polilisina.
1. Introdução
Segundo Sakata (2007) a nanotecnologia é a área das ciências farmacêuticas que tem como
finalidade o desenvolvimento de partículas terapêuticas nas escalas nanométricas ou
micrométricas.
As nanopartículas poliméricas são aquelas que apresentam tamanho inferior a 1 µm. Podem estar
organizadas na forma de nanocápsulas, onde o fármaco encontra-se em um núcleo oleoso
rodeado por um invólucro polimérico; ou na forma de nanoesferas, onde o fármaco apresenta-se
disperso numa matriz polimérica (SCHAFFAZICK et al., 2003).
Figura 1 – Representação de nanocápsulas e nanoesferas poliméricas
Fonte: Schaffazick et al. (2003)
As nanopartículas poliméricas são capazes de alterar as propriedades físico-químicas de
formulações melhorando a liberação e a permanência de ativos na pele, dependendo da
composição, encapsulação, entre outros (GUTERREZ; ALVEZ; POHLMANN, 2007). Os
complexos iônicos de ácido-hialurônico/lisina e ácido-hialurônico/polilisina apresentam-se na
forma de pó branco, possuindo potencial para serem utilizadas como preenchedor cutâneo de
aplicação tópica.
O ácido hialurônico (AH) é um glicosaminoglicano e um polímero de ocorrência natural composto
por ligações alternadas entre resíduos de ácido D-glicurônico e N-acetilglicosamina (NELSON;
COX, 2011). É altamente hidrofílico e por apresentar grande capacidade de se ligar a água,
possui alto poder de hidratação e manutenção da viscoelasticidade da matriz da derme. É
encontrado na pele, sendo as fontes mais comuns: crista de galo, cordão umbilical, tendões, pele
e culturas bacterianas (BRANDT; CAZZANIGA, 2007; BORN ,2006).
A lisina (LIS) é um aminoácido essencial, ou seja, não é sintetizado pelo organismo sendo preciso
obtê-lo por meio da alimentação, possuindo características hidrofílicas. Polilisina (PLIS) é o
polipeptídeo formado quando várias moléculas de lisina se unem formando ligações peptídicas
(NELSON; COX, 2011). A polilisina é aplicada para liberação de fármacos, remoção de
endotoxinas e formação de hidrogéis (SHIH; SHEN; VAN, 2006).
2. Objetivos
Investigar a citotoxicidade de nanopartículas de ácido-hialurônico/lisina e nanopartículas de ácidohialurônico/polilisina por meio do ensaio de viabilidade celular pelo método de redução do MTT
em fibroblastos de camundongos (3T3).
3. Material e métodos
3.1. Síntese das nanopartículas
As nanopartículas de ácido hialurônico–polilisina (AH-PLIS) e ácido hialurônico–lisina (AH-LIS)
foram preparadas de acordo com o método proposto por Oyarzun-Ampuero (2011), com
modificações. A relação molar foi calculada utilizando os valores médios de massa molar para o
AH e para a PLIS, sendo para o AH, 20000 g.mol-1, para a PLIS, 9500 g.mol-1, e para a LIS,
146,18 g.mol-1.
Tabela 1 – Concentrações utilizadas para as composições AH-PLIS e AH-LIS
____________________________________________
Complexo iônico
AH (mol) PLIS (mol)
LIS (mol)
AH-PLIS
1
2,5
AH-LIS
1
16400
As soluções de AH e PLIS, ou LIS, foram colocadas em béqueres distintos. A PLIS, ou LIS, foi
gotejada utilizando bureta, sobre o AH sob agitação (1700 rpm), com uma taxa de gotejamento de
2,5 mL/minuto. A solução, então, foi seca em estufa a 40º C. O procedimento foi realizado em
triplicata.
Figura 2 - Esquema da preparação dos compostos AH-PLIS e AH-LIS
3.1.1 Diâmetro médio de partícula
O diâmetro médio de partícula foi determinado no ZetaSizer Nano ZS90 (Malvern) a 25oC, na
concentração de 1 mg.ml-1, em triplicata. As amostras foram levadas para análise de tamanho de
partícula em suspensões aquosas (água Milli-Q), e utilizou-se uma cubeta Glass cell 12mm
(PCS1115 Malvern).
3.1.2 Análises morfológicas e de superfície
A avaliação morfológica e de superfície foi realizada por microscopia eletrônica de varredura
(MEV), em microscópio SSX-550 (Shimadzu Co.). As amostras secas foram levadas para a estufa
a vácuo TE 395 (Tecnal), fixadas em suporte metálico e, então, submetidas à metalização com
ouro no equipamento IC–50 Ion Coater (Shimadzu Co.). As micrografias foram obtidas em
diferentes magnificações, de acordo com cada amostra, empregando voltagens de aceleração de
10 ou 15 kV.
3.2. Ensaio de viabilidade celular pelo método de redução do MTT
A linhagem celular de fibroblastos de camundongos 3T3 foram cultivadas rotineiramente em
garrafas de 25 ou 75 cm2 com meio Dulbecco Mem (DMEM), suplementado com 10% de soro
fetal bovino (SFB), 24 mmol.L-1 de bicarbonato de sódio e antibiótico (penicilina 10000 UI e
estreptomicina 10 mg.mL-1 ). As garrafas foram mantidas a 37º C em estufa com atmosfera
úmida e 5 % de CO2.
O método de redução do MTT foi empregado para a avaliação da citotoxicidade do ácido
hialurônico, lisina/polilisina em fibroblastos 3T3. O método determina a capacidade das células
reduzirem o sal solúvel brometo 3-(4,5)dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2il-tetrazólico formando cristais
insolúveis de coloração violeta.
As células 3T3, em meio Dulbecco Mem (DMEM) contendo 10% de SFB, foram semeadas em
placas de 96 poços (2,5 x 105 células/poço) e mantidas sob condições de cultura (37 ºC em estufa
com atmosfera úmida e 5 % de CO2) por 24 horas. Posteriormente, foram adicionadas diferentes
concentrações de nanopartículas de ácido-hialurônico/lisina e ácido-hialurônico/polilisina (2,5
mg.mL-1, 1,25 mg.mL-1, 0,625 mg.mL-1 e 0,3125 mg.mL-1). Essas concentrações foram obtidas a
partir da diluição das amostras em meio de cultivo DMEM suplementado com 10% de SFB. As
células foram incubadas por 24 horas consecutivas a 37º C em estufa com atmosfera úmida e 5
% de CO2. Após o período de incubação, o sobrenadante foi desprezado e às células foi
adicionado uma solução de MTT a 0,5 mg.mL-1. Em seguida, as culturas foram incubadas a 37 ºC
durante 60 minutos e ao abrigo da luz. Para a solubilização dos cristais de formazan, produto da
redução do MTT, o dimetilssulfóxido (DMSO) foi adicionado e a leitura espectrofotométrica da
absorbância, em comprimento de onda de 550 nm, foi realizada em leitor de placas (Biotek,
µQuant). Meio DMEM suplementado com 10% de SFB foi empregado como controle negativo. A
viabilidade celular foi determinada pela comparação dos valores de absorbância obtidos para
células tratadas e não tratadas.
4. Resultados e discussão
Os complexos iônicos formados apresentaram-se na forma de pó branco. O tamanho
nanométrico das partículas, visto pelas imagens de MEV, condizem com os dados de tamanho
médio de partícula obtidos pelo Zetasizer, de 117,5 nm e 134,1 nm, para as partículas AH-PLIS e
AH-LIS, respectivamente.
Figura 3 – Aspecto morfológico das nanopartículas (a)
AH-PLIS (b) AH-LIS por microscopia eletrônica de varredura
O efeito das nanopartículas de ácido hialurônico e lisina (AH-LIS) e das nanopartículas de ácido
hialurônico e polilisina (AH-PLIS) sobre a viabilidade das células 3T3 foi avaliado por meio do
ensaio do MTT durante 24 horas. As concentrações utilizadas foram: 2,5 mg.mL-1, 1,25 mg.mL-1,
0,625 mg.mL-1 e 0,3125 mg.mL-1. O controle negativo foi feito empregando meio de cultivo sobre
as células aderidas. Os resultados da citotoxicidade estão apresentados nas Figuras 4 e 5.
As nanopartículas de ácido hialurônico e polilisina (AH-PLIS) apresentaram toxicidade para as
células, pois houve diminuição significativa na porcentagem de células viáveis nas concentrações
de 2,5 mg.mL-1 e 1,25 mg.mL-1. As nanopartículas de ácido hialurônico e lisina (AH-LIS) não
reduziram a viabilidade celular dos fibroblastos testados, sendo que estas nanopartículas
promoveram inclusive um aumento significativo na viabilidade celular na concentração de 2,5
mg.mL-1.
Viabilidade celular (%)
150
100
***
*
50
le
co
nt
ro
0,
31
25
0,
62
5
1,
25
2,
5
0
Figura 4 – Efeito das nanopartículas de AH-PLIS sobre a viabilidade de fibroblastos 3T3, após 24 horas, pelo ensaio
de redução do MTT. As concentrações testadas estão em mg/mL. Os resultados estão expressos como média ± EPM
(erro padrão da média) (n=8). Os testes estatísticos utilizados foram Anova, seguida pelo teste post-hoc de Tukey. *
P<0,05 e *** P<0,001 quando comparados ao grupo controle.
Viabilidade celular (%)
150
*
100
50
co
nt
ro
le
0,
31
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0,
62
5
1,
25
2,
5
0
Figura 5 – Efeito das nanopartículas de AH-LIS sobre a viabilidade de fibroblastos 3T3, após 24 horas, pelo ensaio de
redução do MTT. As concentrações testadas estão em mg/mL. Os resultados estão expressos como média ± EPM
(erro padrão da média) (n=8). Os testes estatísticos utilizados foram Anova, seguida pelo teste post-hoc de Tukey. *
P<0,05 quando comparado ao grupo controle.
5. Conclusão
Nanopartículas de AH-PLIS, nas concentrações mais elevadas, reduziram a viabilidade celular e
precisam ser reavaliadas quanto ao seu possível efeito citotóxico. Nanopartículas de AH-LIS não
apresentaram potencial citotóxico para os fibroblastos 3T3 e ainda foram capazes de estimular a
proliferação celular.
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TRABALHO 13
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO CLAE PARA
DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE EFAVIRENZ
EM MICROPARTÍCULAS POLIMÉRICAS
Amanda Martinez Lyra (PG) E-mail [email protected]
1
Traudi Klein (PQ ) E mail [email protected]
Paulo Vitor Farago (PQ) E mail [email protected]
PG – aluna de Pós-Graduação;
PQ1 – responsável pela co-orientação.
Resumo: Um método simples de CLAE/UV foi desenvolvido e validado para a quantificação de
efavirenz (EFV) em micropartículas poliméricas. Condições cromatográficas: coluna C-18
acoplada à pré-coluna, fase móvel metanol:água (87:13, v/v) em modo isocrático, fluxo de 1,0
mL.min-1, detecção UV a 252 nm. Foram avaliados os seguintes parâmetros: especificidade,
linearidade, limites de detecção e de quantificação, precisão, exatidão e robustez. O método foi
específico, linear (r = 0,9983) numa faixa de 8,0 a 50,0 µg.mL-1, com limites de detecção e
quantificação de 0,099 e 0,30 µg.mL-1, respectivamente. A precisão foi demonstrada por um
desvio padrão relativo médio inferior 1 %. Foi obtida % exatidão de 100,08 ± 0,62. O método
demonstrou ser simples, rápido, robusto e adequado para quantificação de EFV em
micropartículas poliméricas.
Palavras-chave: CLAE, Validação analítica, Eudragit® L100, Eudragit® S100
1. Introdução
Efavirenz (EFV) é um dos antirretrovirais de primeira escolha para o tratamento da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS) (DE CLERQ, 2011). É um inibidor da transcriptase
reversa não análogo de nucleotídeo, frequentemente utilizado em combinação com outros
antirretrovirais como parte da terapia antirretroviral altamente ativa e é a primeira escolha para o
tratamento de crianças acima de 3 anos (ALVES et al., 2010; BOYD, 2011; HOFFMAN, et al.,
2014).
O fármaco pertence ao grupo II do Sistema de Classificação Biofarmacêutico, com baixa
solubilidade em água, o que gera uma baixa e errática biodisponibilidade oral (40 – 45 %). A dose
terapêutica para adultos é de 600 mg, que são tomados antes de dormir devido aos efeitos
colaterais, como tontura, dor de cabeça, sonolência, amnésia, agitação, depressão e estado
mental alterado. Também são reportados casos de alterações laboratoriais (BRUNTON;
CHABNER; KNOLLMANN, 2012; STORPIRTIS et al., 2011). Com o objetivo de minimizar os
efeitos colaterais da terapia, a nanomedicina tem desenvolvido estratégias que podem aumentar
a solubilidade e biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em água, como por exemplo, os
sistemas microparticulados de liberação de medicamentos. Micropartículas de polímeros
biocompatíveis e biodegradáveis tem um ótimo potencial devido à capacidade dos polímeros
encapsularem fármacos hidrofóbicos, aumentando a taxa de dissolução nos fluidos biológicos
(CHIAPPETTA et al., 2010; TSHWEU et al., 2014).
A literatura mostra vários métodos analíticos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE),
a maioria voltada à quantificação de EFV associado a outros antirretrovirais ou seus metabólitos
em fluidos biológicos (SARASA-NACENTA et al., 2001; MATTHEWS et al., 2002); VOLOSOV et
al., 2002). Um método desenvolvido para analisar EFV matéria prima e cápsulas, usando coluna
de ciano e fase móvel gradiente, com diferentes proporções de metanol, água e ácido
trifluoracético, resultou em uma corrida de 40 min (MONTGOMERY et al., 2001). Outros métodos
isocráticos para quantificação de EFV foram publicados: para EFV matéria prima e comprimidos,
usando acetonitrila:água:H3PO4 (70:30:0,1, v/v) como fase móvel e temperatura a 30 °C (VIANA
et al., 2011) e para quantificação em nanopartículas usando acetonitrila:água (70:30, v/v) como
fase móvel (SEREMETA; CHIAPPETTA; SOSNIK, 2013). Entretanto, não há trabalhos na
literatura sobre quantificação de EFV matéria prima e em micropartículas, usando metanol em
modo isocrático.
2. Objetivo
O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento e validação de um método de
CLAE/UV simples, rápido e de baixo custo para quantificação de Efavirenz, matéria prima e
micropartículas poliméricas, com o intuito de facilitar a rotina do controle de qualidade da indústria
farmacêutica.
3. Material e Métodos
Efavirenz foi gentilmente doado pelo Laboratório Farmacêutico Federal Farmanguinhos –
FIOCRUZ (Rio de Janeiro, Brasil). Eudragit® L 100 e Eudragit® S 100 (poli(ácido metacrílico cometacrilato de metila)) foi gentilmente doado pela Evonik Industries (Darmstadt, Alemanha).
Etanol PA foi adquirido da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil), metanol grau HPLC foi adquirido da
Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Estados Unidos). Para análises em cromatógrafo líquido foi utilizada
água purificada em sistema de purificação Milli-Q Plus, Millipore (Bedford, MA, Estados Unidos).
Para o desenvolvimento dos sistemas microparticulados foi utilizada água destilada em
equipamento Fanem LTDA (modelo 724/2-A, São Paulo, Brasil).
3.1 Desenvolvimento e Validação do Método Analítico por CLAE
3.1.1 Equipamentos e condições cromatográficas
As análises cromatográficas foram realizadas em cromatógrafo Merck-Hitachi (Lachrom D-7000),
equipado com detector UV L-7400, bomba L-7100, degaseificador e injetor manual Rheodyne
(volume de 20 µL), software Chromquest. As amostras foram injetadas com seringa de 100 µL
(Hamilton, Microliter, 710).
Foi utilizada coluna de fase reversa GL Sciences Inertsil® ODS3 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm),
acoplada a pré coluna GL Sciences Inertsil® ODS3 (10 mm x 4 mm, 5 µm). A eluição foi realizada
à temperatura ambiente, em modo isocrático, com fase móvel constituída de metanol:água
(87:13, v/v), com vazão de 1,0 mL.min-1. O tempo de análise foi de 5 minutos e detecção em 252
nm.
3.1.2 Preparo das soluções padrão
A solução padrão estoque de EFV foi preparada em metanol:água (87:13, v/v) 500 µg.mL-1.
Diluições foram realizadas com objetivo de obter soluções com concentração entre 8 e
50 µg.mL-1, onde a concentração de 20 µg.mL-1 foi definida como 100 %. Antes de serem
injetadas no cromatógrafo, as soluções foram filtradas em filtro de politetrafluoretileno (PTFE,
Cromafil® Xtra, 0,45 µm x 22 mm, Macherey-Nagel GNBH & Co. KG, Düren, Alemanha).
3.1.3 Obtenção dos Sistemas Poliméricos Contendo Efavirenz
Após a solubilização do fármaco puro em etanol, o polímero foi acrescentando e a solução foi
mantida sob agitação magnética por 15 minutos. Em seguida, foi adicionada água e manteve-se a
agitação por mais 15 minutos. A preparação foi então conduzida à secagem por aspersão,
utilizando o Spray Dryer Labmaq, modelo MSD 1.0, sob as seguintes condições: pressão 2,0 bar,
fluxo 0,2 mL.min-1, 60 °C. A composição das formulações está descrita na Tabela 1. Foram
também preparadas formulações sem o fármaco, para controle negativo. Todas as formulações
foram obtidas em triplicata.
Tabela 1 – Composição das micropartículas contendo efavirenz
Formulação
M1
M2
M3
M4
Fármaco
10 %
20 %
10 %
20 %
Polímero
Eudragit® L100
Eudragit® L100
Eudragit® S100
Eudragit® S100
3.1.4 Desenvolvimento e Validação do Método para Quantificação do Efavirenz
Encapsulado às Micropartículas
Para avaliar a melhor condição para a corrida cromatográfica, foi realizado um experimento em
gradiente exploratório, variando a concentração de metanol de 5 a 100 % em 60 minutos. Após
isso, as condições cromatográficas foram otimizadas para se obter uma melhor resolução do pico
para EFV. Um controle negativo foi injetado antes das análises para todas as amostras.
A validação do método analítico por CLAE foi realizada segundo os critérios propostos pelo
International Conferenceon Harmonization of Technical Requirements for the Registration of
Pharmaceuticals for Human Use (ICH, 2005) e pela Resolução 899 de 29 de maio de 2003
(ANVISA, 2003). Foram avaliados os seguintes parâmetros: especificidade, linearidade, limites de
detecção e de quantificação, precisão, exatidão e robustez.
A especificidade foi determinada por análise dos cromatogramas das micropartículas com
fármaco em comparação àqueles obtidos das formulações sem fármaco, com o objetivo de
confirmar que nenhum componente da formulação interfere na quantificação do EFZ.
A linearidade do método foi avaliada por regressão linear usando o método dos mínimos
quadrados através da média dos pontos de três curvas de calibração autênticas, nas
concentrações de: 8, 14, 20, 26, 32 e 50 µg.mL-1. A inclinação e outros parâmetros das curvas de
calibração foram calculadas por regressão linear e análise de variância (ANOVA). Avaliação de
cada ponto foi realizada em triplicata.
Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram calculados com base no desvio padrão
(DP) e inclinação (S) das curvas de calibração, por meio das Equações 1 e 2.
3xDP
10 xDP
LD =
LQ =
(1)
(2)
S
S
A precisão do método foi determinada seguindo o guia do ICH (ICH, 2005). A precisão foi
avaliada em dois níveis: repetibilidade e precisão intermediária.
Para repetibilidade, três concentrações (17, 23 e 29 µg.mL-1) foram avaliadas em triplicata. A
precisão intermediaria foi avaliada por desvio padrão (DP) e desvio padrão relativo (DPR) de seis
injeções a 17 µg.mL-1, analisadas intra-dia, inter-dia e com diferentes analistas.
A exatidão foi determinada por análises de recuperação, adicionando-se a quantidade de 3 mg de
EFV à solução padrão de EFV (500 µg.mL-1). Alíquota de 60 µL da solução padrão EFV (500
µg.mL-1 ou 800 µg.mL-1) foi diluída para 1,5 mL com fase móvel, em triplicata, resultando em
amostras à 20 µg.mL-1 ou 32 µg.mL-1, respectivamente. A % de exatidão do método foi calculada,
em triplicata, segundo a Equação 3.
C 32 − C 20
% Exatidão =
x100
(3),
32 − 20
onde, C32 e C20 correspondem ao valor da concentração experimental
A robustez foi avaliada nas amostras a 20 µg.mL-1, por variações na taxa de fluxo para 0,995 e
1,005 mL.min-1, e a concentração da fase móvel metanol:água para 86:14 (v/v) e 88:12 (v/v).
Teste Tukey de ANOVA foi realizado para avaliar se as variações alteram o resultado das
análises cromatográficas. Os resultados foram analisados utilizando o DPR comparando com os
valores obtidos para a condição padrão (taxa de fluxo de 1,000 mL.min-1 e fase móvel
metanol:água 87:13 (v/v).
3.1.5 Avaliação da Eficiência de Encapsulação
Para a determinação da eficiência de encapsulação, as micropartículas foram pesadas
(quantidade equivalente a 20 mg de EFV), colocadas em balões volumétricos com 8 mL de
metanol:água (87:13, v/v) e mantidas sob agitação magnética por 24 horas. Após, as amostras
foram submetidas a banho de ultrassom por 30 minutos, os volumes foram completados para 10
mL, filtrados em PTFE (0,45 µm) e diluídas para 20 µg.mL-1.
4.1 Desenvolvimento e Validação do Método para Quantificação do Efavirenz Encapsulado
às Micropartículas
O melhor resultado da corrida em gradiente exploratório foi obtido com a fase móvel metanol:água 87:13
(v/v) e fluxo de 1,000 mL.min-1, sendo estas consideradas condições padrão para o restante das análises.
O tempo de análise e o tempo de retenção foram 5,0 e 3,5 minutos, respectivamente, o que é adequado
para análises de rotina.
A especificidade foi demonstrada por comparação dos cromatogramas das micropartículas com e sem
fármaco (Figura 1). Os resultados mostram que não há interferência na quantificação e no tempo de
retenção do EFV. Sendo assim, é possível confirmar a especificidade do método proposto.
A
B
C
B
C
F
G
D
E
D
E
H
I
Figura 1 – Cromatogramas do padrão efavirenz e das micropartículas
Onde: A) padrão efavirenz 20 µg.mL-1; B) M1; C) M1 sem fármaco; D) M2; E) M2 sem fármaco; F) M3; G) M3 sem
fármaco; H) M4; I) M4 sem fármaco
A linearidade do método foi avaliada por meio de seis níveis de concentração. Os resultados estão
apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 – Resumo dos parâmetros da curva de calibração
Efavirenz
Faixa linear
8,0 – 50,0
Limite de Detecção
0,099
Limite de Quantificação
0,30
Dados de regressão
N
3
61130
Inclinação (α)
Desvio Padrão da Inclinação
1828,027
Desvio Padrão Relativo da
Inclinação (%)
2,99
-134350
Intercepto (b)
Coeficiente de correlação (r)
0,9983
*y = ax + b, onde x é a concentração do
composto e y é a área do pico
Foi observada relação linear entre a área do pico e a concentração de EFV em uma faixa de
concentração de 8,0 a 50,0 µg.mL-1. A equação linear obtida foi y = 61130x – 134350, r = 0,9983.
O DPR da inclinação foi de 3 %, estando de acordo com o limite proposto pelo ICH e pela
ANVISA de até 5 %. O valor negativo de b foi com intervalo de confiança de 95% da curva de
calibração, pelo teste ANOVA. Estes resultados (DPR e valor negativo de b) indicam que a
linearidade do método e a pureza do composto estão dentro dos limites aceitáveis (KLEIN;
LONGHINI; DE MELLO, 2012).
De acordo com o Analytical, Methods Committee (AMC), um valor de coeficiente de correlação
próximo a 1 não é necessariamente o resultado de relação linear, e por isso, deve ser aplicado o
teste de falta de ajuste (lack of it). Este teste avalia a variação dos valores residuais (HADAD;
EMARA; MAHMOUD, 2009). O teste ANOVA para a linearidade está apresentado na Tabela 3.
Para a falta de ajuste, o valor de F foi menor que o valor de F tabelado, para o intervalo de 95 %
de confiança (α = 0,05), portanto, a regressão linear não apresentou falta de ajuste (KLEIN;
LONGHINI; DE MELLO, 2012).
Tabela 3 – Resultados de ANOVA para linearidade do método
Efavirenz
SS
DF
Modelo
1,2443 x 1013
1
10
Resíduo
4.1916 x 10
16
9
4
Falta de ajuste
7,3023 x 10
10
12
Erro puro
3.4614 x 10
Onde: SS: soma dos quadrados; DF: graus
do teste; Ftab: valor do F tabelado
MS
Ftab
F
1,2443 x 1013
28,3250
4,494
9
2,6198 x 10
Linear
10
1,8255 x 10
0,6328
3,259
2,8845 x 109
Não há falta de ajuste
de liberdade; MS: soma dos quadrados, F: valor F
A menor concentração onde o EFV pode ser detectado (LD) e quantificado (LQ) com aceitável
precisão e exatidão foi 0,099 e 0,30 µg.mL-1, respectivamente.
Repetibilidade expressa a precisão sob as mesmas condições de operação durante um curto
intervalo de tempo. Foi avaliada a precisão intermediária, expressa como variação inter-dia e com
diferentes analistas. O teste Tukey avalia a existência de qualquer diferença entre os diferentes
níveis de um fator. Até 5 % não há diferença significante na área do pico e no tempo de retenção
do EFV. O DPR para repetibilidade nas concentrações 17, 23 e 29 µg.mL-1 foram de 0,33 %, 0, 47
% e 0,17 %, respectivamente. Quanto a precisão intermediária, os valores de DPR foram de 0,62
%, 0,73 % e 1,05 % para intra-dia, inter-dia e segundo analista, respectivamente. Os resultados
são apresentados na Tabela 4, confirmando a precisão do método desenvolvido.
Tabela 4 – Dados da repetibilidade e precisão intermediária
Concentração
-1
Teórica (µg.mL )
Concentração Experimental
-1
(µg.mL , Média ± DP*)
DPR**
(%)
17
23
29
16,95 ± 0,06
23,05 ± 0,11
29,11 ± 0,05
0,33
0,47
0,17
17,12 ± 0,11
17,22 ± 0,13
16,99 ± 0,18
17,11 ± 016
0,62
0,73
1,05
0,92
Repetibilidade (n = 9)
Precisão intermediária
Intra-dia (n = 3)
17
Inter-dia (n = 3)
17
Diferentes analistas (n = 3)
17
Média ± DP* (n = 9)
17
*DP: desvio padrão; ** DPR: desvio padrão relativo
A exatidão do método por ensaios de recuperação foi determinado pela preparação de uma
amostra com quantidade conhecida de EFV. A % média de recuperação ± DP e DPR foram
100,08 ± 0,62 e 0,62 %, respectivamente. Portanto, estes resultados indicam que o método
proposto é considerado exato.
Para a avaliação da robustez, o fluxo de 1,000 mL.min-1 e a fase móvel metanol:água 87:13 (v/v)
foram consideradas condições padrão. O teste Tukey a nível de 5 % mostrou que não houve
diferença significativa na área do pico e o tempo de retenção do EFV quando a taxa de fluxo
variou de 1,000 mL.min-1 para 0,995 mL.min-1 (DPR = 0.96 %) e para 1.005 mL.min-1 (DPR = 1.36
%), e quando a concentração da fase móvel variou de 87:13 (v/v) para 86:14 (v/v) (DPR = 1.88 %)
e para 88:12 (v/v) (DPR = 0.78 %). Portanto, o método provou ser robusto para o fármaco
analisado, sob as condições avaliadas.
4.2 Avaliação da Eficiência de Encapsulação
Todas as formulações apresentaram EE maior que 80% com baixos valores de desvio padrão e
desvio padrão relativo para as análises em triplicata (Tabela 5). Sendo assim, o método validado
foi aplicado com sucesso para a determinação da eficiência de encapsulação em micropartículas
carregadas com EFV.
Tabela 5 – Eficiência de Encapsulação das Micropartículas
Eficiência de
Micropartículas
DPR**
Encapsulação (% ± DP*)
M1
104,25 ± 1,81
1,74
M2
90,34 ± 3,27
3,62
M3
99,65 ± 1,04
1,04
M4
94,01 ± 4,41
4,69
*DP: desvio padrão; ** DPR: desvio padrão relativo
5. Conclusão
O método de CLAE foi desenvolvido e validado de acordo com os critérios do ICH e RE 899/2003 da
ANVISA e provou ser um ensaio alternativo para quantificação de EFV matéria prima e em
micropartículas. Além disso, o método envolve o uso de uma fase móvel simples, sem uso de solução
tampão e com mínimo preparo de amostra. Neste estudo, o método provou ser simples, específico, linear,
preciso, exato e robusto, com picos bem definidos e boa resolução. O método desenvolvido oferece
vantagens sobre outros métodos descritos na literatura e representa uma alternativa para rotina
laboratorial de uma indústria farmacêutica, particularmente aquelas de desenvolvimento e produção de
formas farmacêuticas antirretrovirais.
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TRABALHO 14
A importância do exame citopatológico pelo método de Papanicolaou na
detecção de alterações inflamatórias cervicovaginais
Autor 1 (G) Caroline Orejana Ghizzi Bentos E-mail: [email protected]
Autor 2 (G) Maria Carolina Catapan de Assis E-mail: [email protected]
Autor 3 (G) Camila Vida Selski E-mail: [email protected]
Autor 4 (PQ) Ednéia Peres Machado E-mail: [email protected]
Resumo: O câncer do colo uterino é uma das principais causas de morte em mulheres economicamente
ativas. Foram criados protocolos de rastreamento dessa neoplasia, baseado no método de Papanicolaou,
padronizado pelo Ministério da Saúde. Esta metodologia também se mostra útil no rastreamento de
inflamações e infecções do trato reprodutivo feminino, muitas vezes identificando agentes causadores de
infecções, viabilizando o norteamento terapêutico. Baseado nisto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a
relação entre o exame clínico e o citológico de Papanicolaou. Mediante o exposto, esse trabalho teve
como objetivo determinar a prevalência de inflamações no exame citopatológico pelo método de
Papanicolaou. Foram avaliadas 501 amostras, sendo constatados 351 (70%) casos inflamatórios, um
(0,1%) adenocarcinoma endocervical “in situ”, um (0,1%) ASC-H e 144 (29%) normais. A porcentagem de
alterações inflamatórias detectadas no exame citopatológico cervicovaginal é alta, demonstrando a
importância do exame Papanicolaou na informação dessas alterações como ferramenta no diagnóstico
laboratorial de vaginites.
Palavras-chave: Teste de Papanicolaou, inflamação, vaginite.
1. Informações Gerais - Introdução
O câncer do colo uterino é uma das principais causas de morte por neoplasia em pacientes do
sexo feminino, atingindo grande número de mulheres em idade social e economicamente ativa.
Na teoria todas as neoplasias cervicais são curáveis em sua fase pré-invasiva, pois o
desenvolvimento do carcinoma escamoso invasor é lento, aproximadamente 10 a 12 anos. Com
isso foram criados protocolos de rastreamento baseados na analise das células obtidas do colo
do útero conforme o que foi proposto por Papanicolaou em 1940. O estudo citológico do
esfregaço cervical permite a identificação de um conjunto de alterações classificadas de acordo
com a presença e o grau das atipias celulares (PEDROSA et al., 2003).
A primeira proposta da avaliação citológica das células obtidas do colo uterino e da vagina por
Papanicolaou foi: classe I - ausência de células atípicas ou anormais; classe II - citologia atípica,
porém sem evidência de malignidade; classe III - citologia sugestiva, mas não conclusiva para
malignidade; classe IV - citologia fortemente sugestiva de malignidade; classe V - citologia
conclusiva para malignidade. Um dos problemas dessa classificação é a utilização não
homogênea por diferentes laboratórios de citopatologia e a não existência de correspondência
com os achados histológicos de biópsias cervicais (PEDROSA et al., 2003).
No decorrer dos anos, outros sistemas surgiram, estabelecendo o conceito de neoplasia
intraepitelial cervical (NIC), subdivididas em três graus (NIC I, NIC II e NIC III), contudo também
apresentavam problemas relacionados ao grande número de definições e à impossibilidade de
alcançar consenso entre os especialistas sobre os critérios morfológicos necessários para os
diagnósticos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003).
Diante da necessidade de uma nova classificação em 1988, uma oficina de trabalho promovida
pelo Instituto Nacional de Câncer (EDA) em Bethesda, criou o sistema Bethesda (TBS), com o
objetivo de desenvolver uma descrição dos esfregaços de Papanicolaou que representasse a
interpretação citológica de um modo claro (ENGLER, 2012).
Com o TBS foram introduzidos os termos lesões intraepiteliais escamosas de baixo (LSIL), que
compreende alterações celulares associadas ao HPV e a NIC I e lesões intraepiteliais escamosas
de alto grau (HSIL) o qual inclui a NIC II e a NIC III. Também foi criado o termo atipia escamosa
de significado indeterminado (ASCUS), para os casos que não se enquadram na morfologia de
processo reativo e não se pode afirmar alteração celular neoplásica, a qual foi dividida em duas
subcategorias em 2011: ASC-US para células escamosas atípicas e (ASC-H) nas quais não se
pode excluir lesão de alto grau (AGUIAR et al., 2011).
A avaliação da adequabilidade da amostra também foi introduzida e é um processo de garantia
de qualidade. Uma amostra satisfatória para avaliação deve conter pelo menos 5.000 células
pavimentosas bem conservadas em amostras de citologia líquida e de 8.000 a 12.000 células
pavimentosas bem preservadas em amostras de citologia convencional. Qualquer amostra com
células anormais deve ser considerada satisfatória para avaliação, independentemente do
número de células pavimentosas presentes. A amostra é considerada insatisfatória quando
possui um número insuficiente de células e/ou tem obscurecimento (em mais de 75% das células)
por sangue / artefatos de secagem (ao ar) / excesso de citólise / lubrificante / muco / excesso de
células inflamatórias. O sistema Bethesda de 2001 incluiu alterações que se baseiam no acúmulo
de dados e nos avanços na compreensão da biologia do câncer cervical (NCI BETHESDA
SYSTEM, 2011).
Um diagnóstico final da paciente e seu plano terapêutico integram não somente o resultado da
citologia cervical, mas também a história, os achados clínicos e outros resultados laboratoriais
como as interpretações da biopsia.
O método de Papanicolaou foi padronizado pelo Ministério da Saúde, no Brasil, para
rastreamento de lesões e neoplasias cervicais, porém também se mostra como uma importante
ferramenta no rastreamento de inflamações e infecções do trato reprodutivo feminino, além de
contribuir na avaliação da microbiota vaginal normal ou patogênica (ALVES et al, 1991). Permite
muitas vezes identificar agentes causadores de infecções, viabilizando o norteamento terapêutico
mesmo na ausência de sintomas característicos de inflamação e/ou infecção, proporcionando a
diminuição da proliferação do agente microbiano contribuindo indiretamente para a diminuição da
cadeia de transmissão humana do HPV (SILVA, 2004).
O próprio Papanicolaou apontou, no seu trabalho original, a observação de certas formas
bacterianas com limitado valor diagnóstico para câncer, classificando como Classe II em 1954
(KLINE, 1997).
O Sistema Bethesda introduziu novos termos como Alterações Celulares Benignas que
caracterizam largo espectro de processos não neoplásicos e reativos que ocorrem na cérvice
raramente associados displasias ou carcinoma cervical . No relatório do Exame de Citopatologia
Vaginal do SUS, dois tópicos constituem as Alterações Celulares Benignas: infecções e
alterações reativas, que não devem ser substituídas apenas pela indicação "Negativo para lesão
intra-epitelial ou malignidade", proposta pelo TBS 2001 (ABREU & LIMA, 2001)
A detecção de inflamações e agentes causais é importante, levando-se em conta que a taxa de
mulheres infectadas por algum tipo de microrganismo é frequentemente elevada. Os
microrganismos mais comumente encontrados em exames citopatológicos são Gardnerella
vaginalis, Trichomonas vaginalis, Candida sp. (MUSIAL, 2009).
A importância da identificação de microrganismos causadores de inflamação e/ou lesão é pelo
fato destes agentes comumente acometerem o colo uterino vindo a atuar na chamada zona de
transformação, estimulando a substituição do tecido glandular em mucosa recoberta por epitélio
escamoso, processo conhecido por metaplasia escamosa. Sugere-se que neste processo de
diferenciação ocorra maior propensão à gênese do carcinoma do colo uterino, pois essas células
são mais permissivas a infecção por HPV. Maximizar a eficiência morfológica é fundamental para
atender às expectativas do diagnóstico citológico das infecções cérvico-vaginais, como vaginites
e vaginoses (ANJOS, 2010).
Pelas análises microbiológicas apresentarem maior especificidade e sensibilidade diagnóstica, o
teste de Papanicolaou não as substitui, porém é um método relevante no estudo da microbiologia
vaginal, por ser amplamente usado em saúde pública (BIBBO, 1976)
Os microbiologistas reconhecem que o diagnóstico de inflamação através do exame de
Papanicolaou é seguro (ECKERT et al.,1995 ). A avaliação de alterações oriundas de processo
inflamatório de intensidade leve, moderada ou acentuada pode ser aferida através da análise de
alterações citoplasmáticas ou nucleares e podem ser seguramente identificados microrganismos
tais como Lactobacillus sp., Gardnerella vaginalis, Leptotrix vaginalis, Actinomyces sp.,
Trichomonas vaginalis e Candida sp., além das alterações citopáticas pelo papiloma vírus
humano, o HPV e herpes simplex, o HSV. (AMSEL et al, 1983 )
Por considerar relevante a contribuição do exame Papanicolaou no diagnóstico laboratorial de
alterações inflamatórias, o projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde da
mulher: coleta de Papanicolaou”, elabora laudos citopatológicos descritivos, relatando tanto as
alterações reativas celulares oriundas de processo inflamatória como descreve detalhadamente
as alterações da microbiota vaginal.
2. Objetivo
Determinar a prevalência de inflamações do epitélio cervicovaginal no exame citopatológico pelo
método de Papanicolaou.
Foram coletados resultados do banco de dados do projeto de extensão “Prevenção e educação
na atenção à saúde da mulher: coleta de exame Papanicolaou”, no período de 2011 a 2014.
Neste período foram atendidas 501 mulheres nos seguintes locais: Ambulatório da UEPG,
Hospital Universitário Regional dos Campos Gerais e Unidades de Saúde Antônio Saliba, Antero
de Mello e Cesar Milleo, no município de Ponta Grossa.
As pacientes passaram pela anamnese e consulta de enfermagem. O material cervicovaginal foi
coletado da junção escamocolunar por raspagem com espátula de Ayre e o material do canal
endocervical com o uso da escovinha. O esfregaço em lâmina foi realizado unidirecionalmente e
fixado com propilenoglicol. O material foi coletado em duplicata, sendo um dos materiais
encaminhado normalmente ao SUS e outro para o projeto.
O exame citopatológico foi realizado no Laboratório Universitário de Análises Clínicas da UEPG,
onde foi corado pelo método de Papanicolaou e a montagem entre lâmina e lamínula foi realizada
com Entellan.
Das 501 amostras analisadas no período de 2011 a 2014 pelo projeto de extensão “Prevenção e
educação na atenção à saúde mulher: coleta de exame Papanicolaou, 144 (29%) foram
reportados como normal, 351 (70%) como inflamatório, 4 (0,8%) insatisfatório e 1 (0,1%) caso de
adenocarcinoma endocervical “in situ” 1 (0,1%) caso de ASC-H (Figura 1).
Optou-se por utilizar a classificação de Bethesda, onde ASC-H significa a presença de células
escamosas atípicas, com características mistas, que podem ser suspeitas de uma lesão maligna.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Figura 1 – Resultado em percentual dos exames citopatológicos no período de 2011 a 2014
Das 351 (70%) amostras analisadas classificadas como inflamatórias, foram subdivididas em
alterações inflamatórias leve, moderada e acentuada. Segundo critérios de Bethesda, pode-se
fazer esta separação partindo-se da quantidade de infiltração leucocitária e também da análise
das alterações celulares reativas oriundas de inflamação, as quais podem gerar agressões às
células, podendo ou não serem fatores de risco para câncer do colo do útero. Das amostras com
alterações inflamatórias, foram relatadas como leve 191 (54%), moderada 144 (41%) e acentuada
16 (5%) (Figura 2).
5
41
moderado
leve
acentuado
54
Figura 2 – Percentual de resultado inflamatório classificado quanto ao grau da lesão
5. Conclusão
Diante do quadro exposto, na qual 70% das análises realizadas pelo projeto de extensão
“Prevenção e educação na atenção à saúde da mulher: coleta de exame Papanicolaou
presentaram alterações inflamatórias, fica explicita a importância do laudo citopatológico
relatar essas informações a fim de contribuir na resolução de vaginites, vindo a evitar
complicações futuras, em prol da manutenção da integridade dos órgãos do trato genital
feminino.
Referências
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grandes acertos e pontos polêmicos. Jornal da Sociedade Brasileira de Cancerologia. Ano IX,nº 39, nov / dez,
2001.
AGUIAR., et al. Avaliação crítica das nomenclaturas diagnósticas dos exames citopatológicos cervicais utilizadas no
Sistema Único de Saúde (SUS). Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia. Vol. 33, n.3 Rio de Janeiro, 2011.
AMSEL, R., TOTTEN, P. A., SPIEGEL,C. A., CHEN, K. C. S., ESCHENBACH, D., HOLMES, K. K. Nonespecific
vaginitis: diagnostic criteria and epidemiologic associations. Am. J. Med , n.74, p.14-22,1983.
ANJOS, S. J. S. B. et al. Fatores de risco para câncer do colo do útero segundo resultados de IVA, citologia e
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ALVES, V. A. F., LIMA, M. A. N.,UTAGAWA, M. L., MAEDA, M. Y. S. Programa de controle de qualidade em
citologia ginecológica do Instituto Adolpho Lutz: estratégias e análise critica dos resultados de sua implantaçãopiloto. Rev.Ass.Med.Bras. v.1, n.37, p.36-42,1991.
BIBBO, M., HARRIS, M. J., WIED, G. L. Microbiology and inflamation of the female genital
tract in Compendium
on diagnostic Cytology. 4 ed. Tutorials of Cytology, Chicago, Illinois,1976.
ECKERT, L. O., KOUTSKY, L. A., KIVIAT, N. B., KRONE, M. R., STEVENS, C. E., ESCHENBACH, D. A. The
inflammatory Papanicolaou smear: what does it means? Obstet. Gynecol. v. 3, n.86, p360-366,1995.
ENGLER, M, S, S. Análise crítica entre as classificações de Papanicolaou, Richart e Sistema de Bethesda e
aplicações no sistema de saúde brasileiro. São Paulo, 2012.
KLINE,T. S. The Papanicolaou smear: a brief historical perspective and where we are today. Arch. Pathol.Lab
Med., n. 121, p. 205-209,1997.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto Nacional de Câncer. Nomenclatura brasileira para
laudos citopatológicos cervicais e condutas clínicas preconizadas. Rio de Janeiro: INCA; 2003. Disponível em:
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/ Nomenclatura_Internet.pdf. Acesso:> 07/06/2015.
MUSIAL, D. C. et al. Frequência De Leveduras Em Exames Colpocitológicos Oferecidos Pelo Sus Em Duas cidades
Do Norte Paranaense. Rev. Saúde e Biol., Campo Mourão, Vol. 4, n.2, p.1-5, jul./dez. 2009.
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atendidas pelo programa de controle do câncer de colo uterino no município do Rio de Janeiro. Fundação Oswaldo
Cruz Escola Nacional de Saúde Pública Departamento de Epidemiologia. Rio de Janeiro, p. 1-83, 2003.
SILVA, M. P. S. Alcances e limites do exame citopatológico com a coloração de Papanicolaou no diagnóstico das
cérvico-vaginites: um estudo citológico e um microbiológico de 2.169 casos de um total de 10.064 exames
citopatológicos. 2004. 189 f. Dissertação (Mestrado em Anatomia Patológica) - Universidade Federal de Pernambuco,
Pernambuco, 2004.
TRABALHO 15
Caracterização Morfológica e Espectroscópica de Nanocápsulas
Poliméricas contendo Cilostazol
Mona Lisa Simionatto Gomes (PG): [email protected]
Débora Maria Borsato (PQ): [email protected]
Paulo Vitor Farago (PQ): [email protected]
Resumo
O cilostazol (CIL) é um inibidor da agregação plaquetária com propriedades vasodilatadoras e
amplamente empregado no tratamento do sintoma da claudicação intermitente por doença arterial
obstrutiva periférica. O fármaco encontra-se na classe II do sistema de classificação
biofarmacêutica, apresentando pouca solubilidade em água, HCl 0,1N e NaOH 0,1N e alta
permeabilidade no trato gastrointestinal, porém lenta e incompleta. Apresenta como efeitos
adversos mais comuns cefaleia, taquicardia, palpitações, fezes amolecidas e diarreia. O objetivo
deste trabalho foi caracterizar suspensões de nanocápsulas poliméricas contendo cilostazol
obtidas a partir dos polímeros poli(ε-caprolactona) (PCL), poli(D,L-ácido láctico-co-ácido glicólico)
(PLGA) e de blendas com polietilenoglicol (PEG), PCL-PEG e PLGA-PEG, contendo
concentrações de 0 a 3 mg/mL de CIL por meio de análisesmorfológicas e espectroscópicas. As
fotomicrografias,obtidas por microscopia eletrônica de varredura, comprovaram as dimensões
nanométricas nas suspensões de nanocápsulas poliméricas. As análises de difração de raios X
para o CIL demonstraram picos característicos, indicadores de cristalinidade, assim como para os
polímeros PCL e PEG. Os resultados obtidos para PLGA demonstram que ele é um polímero de
caráter amorfo.As análises obtidas por espectroscopia vibracional de absorção na região do
infravermelho confirmaram os principais grupos químicos dos compostos nas formulações como
verificaram a integridade do CIL após sua encapsulação. O uso de nanopartículas pode ser uma
estratégia interessante na promoção do aumento da solubilização aparente do cilostazol
melhorando seu perfil de dissolução e, consequentemente, sua ação farmacológica.
Palavras-chave:Nanotecnologia farmacêutica, microscopia eletrônica de varredura, análise por
difração de raios X, espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier.
1.Introdução
O cilostazol, 6-[4-(1-ciclohexil-1H-tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-diidro-2(1H)-quinolinona, é um inibidor
da atividade da fosfodiesterase III, com efeitos antitrombóticos e vasodilatadores, sendo usado no
tratamento de doenças vasculares periféricas (PRATT, 2001).
Foi lançado no Japão e em outros países asiáticos em 1988 e aprovado nos Estados Unidos da
América, em 1999, para o tratamento clínico da claudicação Intermitente (CI) por doença arterial
obstrutiva periférica (DAOP), causada pela aterosclerose de membros inferiores. Tornou-se o
medicamento de primeira escolha para esse fim, de acordo com as diretrizes atuais (BORGES,
2009). A dose recomendada de cilostazol para tratar os sintomas de CI é de 100 mg, duas vezes
ao dia e os efeitos adversos mais frequentes incluem cefaleia, taquicardia, palpitações, fezes
amolecidas e diarreia (ROSA et al., 2006).
Considerando o esquema posológico e os efeitos colaterais indesejáveis associados ao uso de
diversos fármacos, em que se inclui o cilostazol, o uso de nanocarreadores pode oferecer
numerosas vantagens, quando comparado às formas farmacêuticas convencionais. Tais sistemas
são úteis por proteger os fármacos frente à degradação no meio biológico, por carrear fármacos
hidrofóbicos e por reduzir os efeitos colaterais indesejáveis, visando otimizar a ação
farmacológica.
2. Objetivos
O objetivo desse trabalho foi desenvolver e caracterizar, por meio de análises morfológicas e
espectroscópicas, nanocápsulas poliméricas contendo cilostazol para uso potencial no tratamento
farmacológico da claudicação intermitente.
3.1 Caracterização das suspensões de nanopartículas poliméricas
3.1.1Análises morfológicas e de superfície por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A avaliação morfológica e de superfície das nanocápsulas foi realizada em microscópico
eletrônico de varredura SSX–550 Superscan (SHIMADZU). As amostras foram fixadas em
suporte metálico e levadas à estufa a vácuo (TECNAL, modelo TE 395). Após, foram submetidas
à metalização com ouro no equipamento IC–50 IonCoater (SHIMADZU). As fotomicrografias
foram obtidas empregando voltagens de aceleração de 10 ou 15 kV e registradas por meio da
utilização desoftware específico.
3.1.2 Análise por difração de raios X (DRX)
As suspensões de nanocápsulas poliméricas foram depositadas sobre lamínula de vidro e secas
em temperatura ambiente. O CIL, os polímeros puros e as misturas físicas não receberam
tratamento prévio à análise. Na sequência, as amostras foram examinadas em difratômetro de
raios X (RIGAKU, modelo Ultima IV), scan de 2º.min–1 e 2θde 5º a 80º, radiação Kα de cobre
(λ=1.5418Å), corrente de 40 mA e voltagem 30 kV, para a observação de possíveis picos
indicativos de cristalinidade.
3.1.3 Avaliação por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (IVTF)
As suspensões de nanocápsulas poliméricas contendo CIL, após serem liofilizadas, foram
analisadas por espectroscopia na região do infravermelho, em pastilha com KBr, empregando 4
mg de cada amostra e 196 mg de KBr grau espectroscópico (2% m/m),noequipamentoIRPrestige21(SHIMADZU),
32
scans.min–1,
resolução
de
4 cm–1. Os espectros obtidos por infravermelho com transformada de Fourier das amostras
preparadas foram avaliados frente aos espectros do fármaco puro, dos polímeros de partida e das
respectivas misturas físicas.
4.1 Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Por meio das análises das fotomicrografias foram comprovadas as dimensões nanométricas nas
suspensões de nanocápsulas poliméricas. Foi observado que mesmo alterando a concentração
do fármaco nas formulações e o revestimento com os diferentes polímeros de partida, as
estruturas apresentaram-se morfologicamente similares, como demonstrado nas figuras 1 e 2.
Foram visualizados aglomerados polidispersos de superfície lisa e tamanhos similares aos
resultados encontrados no método de espectroscopia de correlação de fótons para o tamanho de
partícula e índice de polidispersão.
Figura 1: (A) Fotomicrografia da suspensão de nanocápsulas NC3-PLGA
em aumento de15000 x e (B) NC3-PLGA/PEG em aumento de 30000 x
Figura 2: (C)Fotomicrografias obtidas por MEV da suspensão de
nanocápsulas NC2-PCL
PCL (C) e (D) NC2-PCL/PEG
NC2
em aumento de 15000 x
4.2 Análise por difração de raios X (DRX)
A difração de raios X demonstra a característica do fármaco quanto à cristalinidade ou amorfismo, o que é
de extrema importância quanto ao potencial de solubilidade e a velocidade de dissolução do fármaco.
Substâncias cristalinas possuem picos
icos bem definidos em relação às substâncias amorfas, entretanto,
sólidos amorfos são mais solúveis devido à disposição aleatória de suas moléculas, precisando de pouca
energia para separá-los
los (RIEKES et. al., 2011).
A Figura 3 apresenta os difratogramas para
para o fármaco puro (A) e os polímeros PCL (B), PLGA (C) e PEG
(D) utilizados na obtenção das suspensões de nanocápsulas.
A
2000
2500
800
2000
1500
1000
500
400
0
0
700
30
40
10
50
20
30
40
50
2θ
2θ
C
600
D
3500
3000
500
23.33
20
19.39
10
2500
400
Intensidade
Intensidade
B
23.76
Intensidade
17.84
18.61
1200
22.08
15.51
1600
23.44
3000
21.34
3500
2400
12.61
Intensidade
2800
300
2000
1500
200
1000
100
500
0
10
20
30
40
50
10
20
30
40
50
2θ
2θ (B), PLGA (C)
Figura 3: Difratogramas do cilostazol (A) e dos polímeros PCL
e PEG (D)
As análises de difração
ção de raios X para o CIL demonstraram picos bem característicos em
aproximadamente 2θ = 12,61°, 15,51°, 17,84°, 18,61°, 22,08°, 23,44°, além de outros de menores
intensidades. Esses resultados são compatíveis com os estudos de SHIMIZU et al. (1985) e
PATEL; RAJUD (2009). Para os polímeros PCL e PEG, foram obtidos alguns indicativos de
cristalinidade.
stalinidade. Os resultados obtidos para PLGA demonstram que ele é um polímero de caráter
amorfo (REZENDE et al., 2005; KURTI et al., 2011).As figuras 4, 5, 6 e 7 apresentam os
difratogramas comparativos entre o fármaco puro (CIL), os polímeros de partida (PCL,
(
PLGA,
PEG), a mistura física (MF) e as suspensões de nanocápsulas preparadas em diferentes
concentrações (NC0, NC1, NC2 e NC3).
NC3-PCL/PEG
NC2-PCL
NC2-PCL/PEG
NC1-PCL
NC1-PCL/PEG
Intensidade (u.a)
Intensidade (u.a.)
NC3-PCL
NC0-PCL
MF
NC0-PCL/PEG
MF
PEG
PCL
PCL
CIL
10
20
30
40
CIL
10
50
20
30
40
50
2θ
2θ
NC3-PLGA/PEG
NC3-PLGA
NC2-PLGA/PEG
NC2-PLGA
NC0-PLGA
MF
PLGA
Intensidade (u.a)
Intensidade (u.a.)
NC1-PLGA/PEG
NC1-PLGA
NC0-PLGA/PEG
MF
PEG
PLGA
CIL
10
20
30
2θ
40
50
CIL
10
20
30
40
50
2θ
A análise por difração de raios X detecta picos indicativos de cristalinidade correlacionados às estruturas
cristalinas de sólidos, portanto a presença de halos amorfos em baixas intensidades confirma a ausência
de cristalinidade e é condizente com a estrutura de nanocápsulas.
Para todas as formulações preparadas, os perfis obtidos são similares entre si e apresentam grande
redução da cristalinidade dos seus componentes em decorrência do processo de nanoencapsulação.
Esses resultados sugerem a dispersão molecular entre o CIL e os polímeros, resultando em
nanopartículas de caráter amorfo, para as quais se espera melhores características de solubilidade em
relação ao fármaco puro.Conclusões semelhantes foram obtidas por Patel e Rajput (2009), os quais
obtiveram um aumento na taxa de dissolução do CIL por meio de complexos de inclusão em
ciclodextrinas.
4.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IVTF)
As análises obtidas por espectroscopia vibracional de absorção na região do infravermelho permitem a
identificação e elucidação estrutural de substâncias orgânicas em função da detecção de suas ligações e
grupos funcionais. Também apontam possíveis interações moleculares entre o fármaco encapsulado e o
polímero, pela comparação de deslocamentos, variações de intensidade, alargamento ou aparecimento de
novas bandas com espectro característico ao da amostra (LOPES; FASCIO, 2004). Para tanto, os
espectros obtidos visaram confirmar os principais grupos químicos dos compostos nas formulações como
verificar a integridade do CIL após sua encapsulação.
4000
3500
3000
2500
2000
1044
1171
1660
1725
1239
1500
2944
2860
Transmitância (%)
1034
2864
2933
Transmitância (%)
3185
3054
O espectro IVTF obtido a partir da análise do CIL, representado na Figura 8, demonstrou bandas em 3185
cm-1, referente à vibração de estiramento N – H de amida secundária e em 3054 cm-1 correspondente à
vibração de estiramento da ligação C – H do anel aromático. As vibrações simétrica e assimétrica de CH2
foram demonstradas em 2933 e 2864 cm-1, respectivamente. O estiramento C = O de amida levou a uma
forte absorção em 1660 cm-1, enquanto o estiramento da ligação C = C do anel aromático foi detectado em
1500 cm-1. Por fim, as vibrações de C – O, do arilalquil éter, são visualizadas em 1239 e 1034 cm-1. Esses
resultados são consistentes com os apresentados por Shimizu et al. (1985) e Patel e Rajput (2009),
indicando que as ligações químicas encontradas são compatíveis com a estrutura química do CIL.Para o
poliéster PCL, o espectro (Figura 9) exibiu uma banda intensa em 1725 cm–1, correspondente à vibração
de deformação axial do grupamento C = O de ésteres alifáticos simples. As bandas em 2944 e 2860 cm–1
correspondem às vibrações simétricas e assimétricas do grupamento – CH2, respectivamente. Bandas
observadas em 1171 e 1044 cm-1 são referentes ao estiramento C – O (HOIDY et al., 2010; PAVIA et al.,
2010).
1500
1000
4000
500
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Número de onda (cm )
-1
Figura 8: Espectro IVTF do cilostazol
Figura 9: Espectro IVTF do polímero PCL
2890
Transmitância (%)
4000
3500
3000
2500
2000
1108
1760
1090
1454
2999
2947
Transmitância (%)
3524
O polímero PLGA, representado na Figura 10 apresentou uma banda em 1758 cm-1 atribuída à
frequência de estiramento de grupos carbonilas C = O de ésteres. O estiramento dos grupos
metila CH3 são apresentados nas bandas em 2999 e 2947 cm-1, enquanto as bandas em 1460 e
1090 cm-1 representam o estiramento das ligações C – O presentes na molécula (YANG et al.,
2007; SILVA et al., 2014).O espectro do polímero PEG (Figura 11), demonstrou absorções
características em 3524 cm-1 referente aos grupos hidroxilas terminais –OH associados por
ligações de hidrogênio. O grupamento C – H da cadeia alifática exibe uma banda em 2890 cm-1e
a vibração do estiramento
assimétrico C – O – C de éteres dialquílicos está
representadaem1108cm-1(BISWALet al., 2008; PAIVA et al., 2012).
1500
1000
-1
Figura 10: Espectro IVTF do polímero PLGA
500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
-1
Figura 11: Espectro IVTF do polímero PEG
500
Os espectros comparativos de IVTF para o fármaco puro, os polímeros e blendas poliméricas, as misturas
físicas e as suspensões de nanocápsulas (em diferentes concentrações) estão demonstrados nas Figuras
12 e 13.As análises espectrais das amostras demonstraram que não houve alteração dos grupos
funcionais específicos dos componentes das formulações, sugerindo que não ocorreram interações
químicas entre eles. Para as misturas físicas, suas bandas correspondem à soma das bandas encontradas
para os compostos individuais (LOPES; FASCIO, 2004).
NC3-PLGA/PEG
NC3-PCL/PEG
NC2-PLGA/PEG
NC2-PCL/PEG
NC1-PLGA/PEG
NC0-PCL/PEG
MF
CIL
Transmitância (u.a.)
Transmitância (u.a.)
NC1-PCL/PEG
NC0-PLGA/PEG
MF
CIL
PEG
PEG
PLGA
PCL
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
4000
3500
3000
2500
-1
2000
1500
1000
500
-1
5. Conclusão
As imagens fornecidas por microscopia eletrônica de varredura demonstraram-se
concordantes entre si, apresentando nanocápsulas de formas esféricas, com superfícies lisas e
homogeneidade na distribuição de tamanho. Os resultados de difração de raios X revelaram a
ausência de cristalinidade das nanocápsulas, evidenciando que o processo de nanoencapsulação
conduziu a uma amorfização do fármaco. Os espectros revelados por espectroscopia na região
do infravermelho demonstraram que não ocorreram interações químicas entre o CIL e os
polímeros durante o processo de nanoencapsulação.
Agradecimentos
À CAPES, Fundação Araucária e CNPq, pelo auxílio financeiro.
Referências
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TRABALHO 16
Caracteres microscópicos de folha, caule e raiz de
Philodendron appendiculatum Nadruz & Mayo
Juliane Nadal Dias Swiech 1(PG) E-mail: [email protected]
Vanessa Barbosa Bobek 2(PG) E-mail [email protected]
Daniela Gaspardo Folquitto 3(PG) E mail [email protected]
Rosi Zanoni da Silva 4(PQ) E-mail: [email protected]
Jane Manfron Budel 5(PQ) E-mail: [email protected]
Paulo Vitor Farago 6(PQ) E-mail: [email protected]
Marilis Dallarmi Miguel 7(PQ) E-mail: [email protected]
Obdulio Gomes Miguel 8(PQ) E-mail: [email protected]
1 - Aluno de Pós-Graduação de Doutorado pela Universidade Federal do Paraná;
4- Professora Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável
pela co-orientação do trabalho;
5- Professora Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável
pela co-orientação do trabalho;
6 - Professor Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela
co-orientação do trabalho;
7 - Professora Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná responsável pela coorientação do trabalho;
8- Professor Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná responsável pela
orientação do trabalho;
Resumo:
Philodendron é o segundo maior da família Araceae, e por sua beleza apresenta amplo uso ornamental. O
presente estudo apresenta as características anatômicas e o resultado de testes microquímicos realizados
em raiz, caule e folhas da espécie Philodendron appendiculatum, a fim de identificar e diferenciar das
demais Philodendron. Para tanto, foram preparadas lâminas semipermanentes com o material seccionado
nos sentidos transversal e longitudinal, à mão livre e realizou-se o uso de reativos específicos, conforme
literatura. Os caracteres anatômicos evidenciados neste estudo caracterizam a espécie Philodendron
appendiculatum. As evidências botânicas, como idioblastos cristalíferos contendo drusas ou ráfides de
oxalato de cálcio que reagiram à pesquisa com solução de ácido sulfúrico, a presença de dutos resiníferos
e células de conteúdo fenólico incentivam estudos químicos e farmacológicos com a espécie em questão.
Palavras-chave: anatomia, Liliopsida, Philodendron
1. Introdução
O nome Philodendron vem do grego philos (amigo) e dendron (árvore). Philodendron constitui plantas
hemi-epífitas ou hepífitas e poucas são heliófitas, raramente arborescentes. Caracteriza-se pelo caule
composto de unidades simpodiais de uma única folha, e da inflorescência na qual a zona estéril, entre a
zona estaminada e pistilada, é mais curta que a zona estaminada (COELHO e MAYO, 1998).
As folhas com lâmina foliar elíptica a lanceolada, oblanceolada, ovada ou cordada, inteira ou pinatifida, em
geral coriácea. Espata persistente na frutificação, com tubo basal e lâmina apical. Sementes uma a muitas
em cada fruto (DISLICH e MANTOVANI, 1998).
Philodendron, pertence à família Araceae, com cerca de 500 espécies distribuídas em três
subgêneros: Philodendron, Meconostigma e Pteromischum (SAKURAGUI, 2001). Pela beleza de
suas grandes folhas, apresentam um amplo uso ornamental, mas estudos vêem sendo realizados
em busca de suas atividades terapêuticas (MISHRA, KOVACHICH, 1984; MUELAS SERRANO et
al., 1999; MENEZES et al., 2004).
No Brasil, Philodendron apresenta dois centros de diversidade genética: um centrado no sudeste
do país, na região da mata atlântica e outro na Amazônia. Estes dois centros refletem um padrão
geográfico ligado a aspectos morfológicos do grupo: o grupo da Amazônia apresenta lóculos do
ovário uniovulados com placentação basal, enquanto o grupo do Sudeste Brasileiro apresenta
lóculos do ovário pluriovulados com placentação sub-basal (SAKURAQUI, 2001).
Este gênero possui distintos padrões de morfologia, anatomia e distribuição (MAYO, 1988) sendo
que neste trabalho apresentamos as características anatômicas e o resultado de testes
microquímicos realizados em raiz, caule e folhas da espécie Philodendron appendiculatum.
2. Objetivos
Considerando que não existem estudos anatômicos de Philodendron appendiculatum e que as
evidências microquímicas indicam que a espécie vegetal possa ter potencial terapêutico, o
presente trabalho objetivou analisar anatomicamente as partes vegetativas aéreas desse táxon
com finalidade de identificação e diferenciação das demais Philodendron.
Foram coletadas pelo menos 5 exemplares de Philodendron appendiculatum, na Rua Estados
Unidos, número 150, no município de Piçarras – Santa Catarina (Latitude -26.7334963/ Longitude
-48.682338). Os exemplares foram submetidos à confecção de exsicatas, identificadas por
especialista e os representantes equivalentes estão registrados no Herbário do Museu Botânico
de Curitiba sob o número 390354. O material coletado foi devidamente processado para a
realização do estudo anatômico.
As pesquisas referentes aos caracteres anatômicos foram efetuadas com folhas, caules e raízes
de Philodendron appendiculatum , a partir de 5cm do ápice da planta. O material vegetal foi fixado
em FAA 70 (formol 5%, ácido acético 5% e etanol 70ºGL 90% v/v) (JOHANSEN, 1940), e
estocados em solução de etanol a 70% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Foram preparadas
lâminas semipermanentes com o material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, à
mão livre, submetido à coloração de azul de astra e fucsina básica (ROESER, 1972). As lâminas
foram montadas com glicerina diluída a 50% (v/v) (BERLYN, MIKSCHE, 1976) e para a lutagem
foi utilizado esmalte incolor.
Foram realizadas secções transversais à mão livre de folhas e caules de Philodendron
appendiculatum e os reativos empregados foram solução de floroglucina clorídrica para
verificação de lignina (FOSTER, 1949), Sudam III para substâncias lipofílicas (SASS, 1951),
cloreto férrico para compostos fenólicos (JOHANSEN, 1940), ácido sulfúrico para a verificação da
natureza dos cristais (OLIVEIRA, 2005) e lugol para amido (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Os
resultados dos testes microquímicos e da análise anatômica foram registrados por meio de
fotomicrografias em microscópio fotônico Olympus CX31, acoplado à câmera digital Olympus
model C-7070, no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa.
A caracterização morfológica das superfícies foliares, caulinares e radiculares de Philodendron
appendiculatum foi realizada com análise ao microscópio eletrônico de varredura. Para tal
procedimento, as amostras foram fixadas em FAA 70 e desidratadas em série etanólica
crescente. As eletromicrografias foram realizadas em alto vácuo e visualizadas no microscópio
eletrônico de varredura VEGA3 TESCAN (SOUZA, 1998). Para realização do ponto crítico e
microscopia eletrônica de varredura, o material foi analisado no C-LABMU/PROPESP, na
4.1 Caracteres foliares
A análise anatômica da lâmina foliar de Philodendron appendiculatum, em vista frontal, mostra
células epidérmicas com parede anticlinal de formato poligonal e delgadas em ambas as faces. A
cutícula ocorre em faixas sobre a epiderme, acompanhando as paredes anticlinais das células,
em ambas as faces.
Essa característica também foi encontrada em Philodendron
melanochrysum Linden & André (KLIMKO et al., 2014). Nesse estudo, a cutícula reagiu
positivamente à pesquisa de compostos lipofílicos.
Os estômatos são do tipo paracítico aparecendo somente na superfície abaxial, caracterizando a
folha como hipoestomática. Estômatos tetracíticos foram encontrados em Philodendron
bipinnatifidum Schott ex Endl. Em secção transversal, a epiderme apresenta-se uniestratificada e
coberta por cutícula espessa. Os estômatos estão localizados no mesmo nível das demais células
epidérmicas. Folhas hipo e anfiestomáticas foram encontradas em espécies de Philodendron
(KLIMKO et al., 2014).
O mesofilo é dorsiventral, sendo constituído por duas camadas de parênquima paliçádico de
células curtas, e pelo parênquima esponjoso formado por cerca de 8-10 camadas de células,
formando várias cavidades aeríferas. Dispersos por todo o mesofilo são observados idioblastos
cristalíferos contendo drusas ou ráfides de oxalato de cálcio que reagiram à pesquisa com
solução de ácido sulfúrico. Também são observadas células com conteúdo fenólico e que
reagiram positivamente à pesquisa com cloreto férrico. Feixes vasculares de pequeno porte, do
tipo colateral, estão distribuídos na região mediana do mesofilo e podem estar associados a
células com conteúdo fenólico. Calotas de fibras perivasculares podem ocorrer apostas ao floema
e ao xilema.
A nervura principal, em secção transversal, possui formato plano-convexo. A epiderme
uniestratificada é revestida por cutícula levemente estriada. Vários feixes vasculares estão
dispersos pelo parênquima fundamental. Este apresenta espaços intercelulares de tamanhos
variáveis constituindo cavidades aeríferas que caracterizam o aerênquima. As grandes cavidades
aparecem separadas por porções unisseriadas de parênquima fundamental. Dispersos pelo
aerênquima são encontrados idioblastos cristalíferos contendo drusas ou ráfides e células com
conteúdo fenólico. Também foram encontrados dutos resiníferos e grãos de amido. Idioblastos
cristalíferos foram amplamante citados em espécies de Philodendron (KLIMKO et al., 2014).
O pecíolo, em secção transversal, tem formato arredondado. A epiderme é uniestratificada com
as mesmas características da folha e, subjacentemente, são encontradas 2 camadas de
parênquima fundamental e logo abaixo, cordões isolados, formados por cerca de 6 camadas de
colênquima angular. O parênquima fundamental é formado por células que delimitam câmaras de
tamanhos variáveis e que na região mediana, formam o aerênquima. Vários feixes vasculares do
tipo colateral estão dispersos no parênquima fundamental, sendo o floema orientado para o
perímetro externo. Também são observados idioblastos cristalíferos contendo drusas ou ráfides
de oxalato de cálcio e células com conteúdo fenólico. Células de conteúdo fenólico, contendo
antocianidina, foram encontradas em outras Philodendron spp. (SAITO, LIMA, 2009).
4.2 Caracteres caulinares
O caule, seccionado transversalmente, apresenta formato circular. A epiderme caulinar
apresenta-se uniestratificada e pode aparecer lignificada. O felogênio instala-se internamente à
epiderme e forma em direção à periferia, células alongadas anticlinalmente. Epiderme lignificada
também foi observada em P. oblongum (Vell.) Kunth e P. propinquum Schott (TENORIO et al.,
2012). Pode ocorrer hipoderme lignificada, como observado nas espécies P. cordatum Kunth ex
Schott, P. appendiculatum Nadruz & Mayo e P. ornatum Schott.
A cutícula do caule é delgada, levemente estriada e reagiu positivamente à pesquisa de
compostos lipofílicos. Adjacente à epiderme, em secção transversal, encontra-se de 6 camadas
de colênquima angular. Dispersos no parênquima, são encontrados idioblastos cristalíferos
contendo drusas ou rafídeos, dutos resiníferos e células contendo substâncias fenólicas.
Os traços foliares e os feixes vasculares são colaterais e estão dispersos por todo o cilindro
central, sendo o floema voltado para a periferia. Aposto ao floema ocorre uma calota de fibras
perivasculares bem desenvolvida. Essa característica foi encontrada no caule de
Philodendron hederaceum (Jacq.) Schott. Todavia, pode não ser verificada em Philodendron
(TENORIO et al., 2012).
4.3 Caracteres radiculares
A raiz, em secção transversal, tem formato circular, evidenciando algumas depressões na
epiderme. A epiderme é uniestratificada com cutícula moderadamente espessa. Ocorre
hipoderme lignificada. O felogênio instala-se internamente à hipoderme e forma em direção à
periferia, células alongadas anticlinalmente.
O córtex é formado por várias células isodiamétricas, onde são observados tubos resiníferos
circundados por células lignificadas, células com conteúdo fenólico e cavidades aeríferas.
Delimitando internamente o córtex, surge a endoderme sem estrias de Cáspary visíveis. O cilindro
vascular é tipico de liliopsida e a medula é formada por células isodiamétricas de paredes
delgadas, que centralmente, pode evidenciar células lignificadas.
5. Conclusão
Os caracteres anatômicos evidenciados neste estudo caracterizam a espécie Philodendron
appendiculatum e fornecem dados botânicos para diferenciação das demais Philodendron. As
evidências botânicas, como a presença de dutos resiníferos e células de conteúdo fenólico
incentivam estudos químicos e farmacológicos com a espécie em questão.
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http://www.revistas.usp.br/bolbot/article/viewFile/57986/pdf_3>.
Acesso
em:
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Fev.
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TRABALHO 17
DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA
PERMEAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS
CONTENDO ÁCIDO FERÚLICO
Jessica Mendes Nadal (PG) E-mail: [email protected]
André Rabelo Peixoto Bertocco (G) E-mail [email protected]
Sandra Maria Warumby Zanin (PQ) E mail [email protected]
Paulo Vitor Farago (PQ) E mail [email protected]
Resumo: O ácido ferúlico (AF) é um composto químico que apresenta umaatividade terapêutica diversificada,
inclusive fotoprotetora, quando aplicado sobre a pele. No entanto, o AF apresenta características desfavoráveis,
como sua baixa solubilidade aquosa, fácil oxidação e fotossensibilidade. Levando-se em conta que a exposição
prolongada e demasiada ao sol pode trazer sérios problemas à saúde, este trabalho teve como objetivo desenvolver
e caracterizar uma suspensão de nanocápsulas obtida a partir do polímero poli-(ε-caprolactona) (PCL) contendo AF,
preparada pelo procedimento de deposição interfacial do polímero pré-formado. A determinação do AF incorporado
às nanocápsulas apresentou eficiência de encapsulação superior a 80%. Os valores de pHmantiveram-se estáveis
após 100 dias. As nanocápsulas apresentaram médias de diâmetro e potencial zeta de 208,57 nm e -32,8 mV,
respectivamente.A avalição da espectroscopia por infravermelho evidenciou que tanto a formulação Nano_AF como a
–1
Nano_0 apresentaram uma banda característica na região de 1643 cm , referente ao óleo usado na formulação. As
nanocápsulas de PCL contendo AF apresentaram resultados satisfatórios com relação à permeação in vitro,
realizada em célula de Franz, que mostraram a grande eficiência das nanocápsulas em carrear o ativo através das
camadas epidérmicas. Os resultados obtidos sugerem que as nanocápsulas poliméricas elaboradas a partir da PCL
contendo AF têm viabilidade como um sistema de liberação percutânea.
Palavras-chave: antioxidante,ácido ferúlico,fotoprotetor, poli-(ε-caprolactona)
1. Introdução
O ácido ferúlico (AF) ou ácido 4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico é um composto químico extremamente
abundante no reino vegetal, que tem baixa toxicidade e é sintetizado pela via do chiquimato, a
partir da fenilalanina ou da L-tirosina (WANG et al., 2011; ITAGAKI et al., 2009).
Estudos anteriores demonstram que o AF tem atividade terapêutica diversificada, incluindo efeitos
anti-inflamatório, antioxidante, antitrombótico, anticancerígeno, neuroprotetor e cardioprotetor.
Quando aplicado sobre a pele pode apresentar um efeito fotoprotetor (MERLIN et al., 2012;
STANIFORTH et al., 2012; WANG et al., 2011).
A capacidade antioxidante, ligada à capacidade fotoprotetora, se deve a dois motivos estruturais
distintos: presença de grupamentos doadores de pares de elétrons no anel benzênico e a
insaturação na cadeia lateral (ITAGAKI et al., 2009). Estudos in vitro como o de Luceroet al
(2012) comprovam sua capacidade fotoprotetora, ao promover a fotoestabilização de extrato de
camomila dobrando sua meia-vida de dissipação.
No entanto, o AF apresenta características desfavoráveis, como sua baixa solubilidade aquosa e
sua fácil oxidação e fotossensibilidade, características responsáveis pela conversão parcial do
isômero trans para o isômero cis, muito menos ativo. Portanto, torna-se desejável a sua
estabilização, pretendendo-se com este estudo, o desenvolvimento e caracterização de
nanocápsulas de poli-ε-caprolactona (PCL) contendo AF, com o objetivo de se alcançar a
fotoestabilidade do fármaco e quantificar o potencial de fotoproteção das nanocápsulas de ácido
ferúlico (Nano_AF) veiculadas em uma formulação cosmética.
2. Objetivos
Desenvolver e caracterizar uma suspensão de nanocápsulas obtida a partir do polímero poli-εcaprolactona (PCL) contendo ácido ferúlico, preparado pelo procedimento de deposição interfacial
do polímero pré-formado (nanoprecipitação) e proceder à avaliação da permeação cutânea in
vitro.
3.1 Obtenção das nanopartículas poliméricas contendo ácido ferúlico
Suspensões de nanocápsulas obtidas a partir do polímero poli(ε-caprolactona) (PCL)contendo
ácido ferúlico foram preparadas pelo procedimento de deposição interfacial do polímero préformado descrito porQuintanar-Guerreroet al. (1988). Resumidamente, 100 mg do polímero (PCL)
foram solubilizados em 27 mL de acetona com auxílio de agitação magnética, juntamente com 75
mg de ácido ferúlico, 77 mg de Span 80® e 300 mg de triglicerídeos de ácido cáprico/caprílico. A
solução orgânica resultante foi gotejada em 54 mL de uma solução aquosa contendo 77 mg de
Tween 80®, previamente preparada e mantida sob constante agitação magnética e temperatura
controlada de 40 ºC. A acetona foi, então, eliminada da nanossuspensão sob pressão reduzida
em rotaevaporador até o volume final de 10 mL, para obter a formulação Nano_AF. O
experimento foi realizado em quintuplicata além do desenvolvimento de uma nanossuspensão de
controle negativo (Nano_0), com a ausência do fármaco.
3.1.1 Mistura física
A mistura física entre o polímero utilizado e o AF foi preparada para a caracterização comparativa
da nanossuspensão em estudo na proporção, em massa, de 1:1 (AF:PCL) (50%).
3.1.2 Determinação do ácido ferúlico incorporado às nanocápsulas de PCL e eficiência de
encapsulação
A concentração de fármaco incorporado na nanosuspensão (mg.g–1) e a eficiência de
encapsulação (%) foi determinada pelo método indireto, o qual determina a concentração de
fármaco não associado ao sistema carreador no ultrafiltrado das nanosuspensões, após o
procedimento de ultrafiltração/centrifugação (Hitachi, Himac CR21GII), a 2200Хg durante 30
minutos, em dispositivo Amicon® (10.000, Millipore). As amostras foram analisadas por
espectrometria na região do ultravioleta (UV), em espectrofotômetro Genesys 10 UV Scanning
(Thermo Fisher Scientific). A eficiência de encapsulação (EE%) foi calculada a partir da Equação
1:
EE % =
AF inicial
− AF livre
AF inicial
x 100
(Equação 1)
Onde, AF inicial corresponde à concentração do fármaco adicionada inicialmente à
formulação e, AFlivre, à concentração de ácido ferúlico não incorporado às nanocápsulas,
quantificado por UV-Vis. Os valores de EE% foram expressos como média ± DP.
A determinação do pH foi realizada em potenciômetro digital, previamente calibrado com soluções
tampão pH 4,0 e 7,0, diretamente nas suspensões coloidais, após a preparação. Os resultados
representam a média de três amostras diferentes.
3.2.2. Determinação do diâmetro médio e do potencial zeta
O tamanho médio de partícula e o índice de polidispersão (distribuição de tamanho) foram
medidos (n=3) por espectroscopia de correlação de fótons após a diluição de uma alíquota de
suspensão de nanocápsulas em água purificada (1:500) (Zetasizer Nanoseries, Malvern
Instruments, Reino Unido).
3.2.3 Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão por efeito de campo (MEVFEG)
A caracterização morfológica das nanossuspensões contendo AF foi realizada usando
microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão por efeito de campo, com aumentos de
20 a 200 kx (MEV-FEG – TESCAN, modelo MIRA 3, Brno, República Checa). As amostras foram
depositadas sobre o stub polido e posteriormente recobertas com ouro usando o equipamento de
recobrimento (Quorum Technologies Ltda, modelo SC7620, East Sussex, BN8 6BN, Reino
Unido), durante 1 minuto e 10 mA.
3.2.4 Avaliação por espectroscopia na região do infravermelho
Na avalição na região do infravermelho, as amostras foram gotejadas sem diluição em pastilha de
KBr, empregando 4 mg de cada amostra e 196 mg de KBr grau espectroscópico (2% em massa).
A leitura feita no modo de transmitância (T) com 32 scans.min–1 e resolução de 4 cm–1, no
espectrômetro infravermelho com transformada de Fourier (Shimadzu, modelo IR Prestige-21,
Quioto, Japão). Os espectros foram analisados frente à comparação com o os espectros obtidos
do fármaco, do polímero e da mistura física.
3.3 Estudo de permeação in vitro
A célula de difusão in vitro consistiu de um compartimento receptor de 7 mL, uma área disponível
para a difusão de 1,77 cm2, acoplados a um sistema de agitação magnética. O sistema de difusão
encontrava-se acoplado a um banho-maria, termostatizado com circulação externa para a
manutenção da temperatura em 37 °C.
No estudo foi empregada membrana natural (pele dissecada da orelha de porco, sem pêlo e sem
o tecido subcutâneo e gorduroso presente abaixo da derme). Uma solução tampão fosfato pH 7,4
foi colocada no compartimento receptor. Sobre a extremidade das células foram esticadas as
membranas, com a derme voltada para a solução receptora, garantindo a condição “sink”.
Espalharam-se uniformemente sobre toda a área da membrana 1,0 g de gel de hidroxietilcelulose
a 0,5% contendo as amostras a serem testadas (fármaco livre, e as nanosuspensões Nano_AF e
Nano_0) em concentrações equivalentes a 0,5% de AF.
O sistema de agitação foi acionado e alíquotas de 1,0 mL da fase receptora foram coletadas nos
tempos de 1, 2, 6, 8 e 12h. Para manter o volume constante, a cada coleta foi reposto ao sistema
o mesmo volume retirado da solução receptora. O experimento foi realizado em triplicata e como
controle negativo, foi utilizada a formulação de nanosuspensão que não continha o AF (Nano_0).
A quantidade de AF permeado foi determinada por espectrofotometria no ultravioleta,
comprimento de onda de 320 nm a partir de uma curva padrão de AF (0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 5,0; 7,0
µg.mL–1) em tampão fosfato pH 7,4. Para esta análise, as alíquotas das soluções receptoras,
removidas das células de difusão foram diluídas (1:10) com tampão fosfato pH 7,4.
O método de deposição interfacial de polímero (nanoprecipitação) aplicado se mostrou satisfatório no
preparo das nanocápsulas. Imediatamente após adicionar a fase orgânica sobre a fase aquosa, todas as
formulações se tornaram opacas como leite, sendo uma característica originada no efeito Tyndall que
resulta da reflexão de luz pela formação das nanopartículas (SCHAFFAZICK et al., 2003).
4.1 Determinação do AF incorporado às nanocápsulas de PCL e eficiência de encapsulação
A concentração de fármaco incorporado na nanocápsula (mg.g-1) e a eficiência de encapsulação
(%) para as nanocápsulas desenvollvidas são resumidos na Tabela 1.
A formulação desenvolvida apresentou valores adequados de EE, superior a 80%. Este valor
pode ser justificado, principalmente, devido à baixa solubilidade aquosa (6,63 mg.dL–1 em pH 7,2)
(SAIJA, 2000) do AF, que acarretou um aumento da concentração de fármaco no interior da
nanopartícula.
Tabela 1- Características físico-químicas das suspensões de nanocápsulas
Teor
–1
(mg.g )
AF
incorporado
(mg.g–1)*
EE (%)*
pH
(100 dias)
Nano_0
0
—
—
4,39 ± 0,30
381,52 ±2,27
0,12 ± 0,018
-51,1 ± 3,45
Nano_AF
75
61,6 ± 1,77
82,13 ± 0,56
3,46 ± 0,37
208,10±1,65
0,27 ± 0,52
-32,8 ± 2,23
Formulação
Tamanho de
partícula
(nm)
Índice de
polidispersão
Potencial
Zeta (mV)
*Média± desviopadrão (n=5)
4.2.1 Determinação depH
A avaliação do pH das nanossuspensões preparadas foi realizada no dia daobtenção da
formulação e 100 dias após o preparo a fim de avaliar o comportamento e estabilidade.
Os valores de potenciais hidrogeniônicos determinados podem ser visualizados na Tabela 1,
constatando-se que o AF deixa a formulação levemente mais ácida (3,52), devido a sua
característica de doador de prótons.
Também se pode observar o que polímero (PCL) não é capaz de acidificar o microambiente, pois
o pH da formulação se mantém praticamente inalterado durante os 100 dias de armazenamento.
4.2.2 Determinação de tamanho médio e potencial zeta
Os resultados de diâmetro médio e índice de polidispersão (IP) das nanocápsulas de PCL
contendo ácido ferúlico e da formulação controle encontram-se na Tabela 1. Foram obtidas, em
maior parte, populações monodispersas de nanopartículas, produzindo formulações que
apresentaram baixos valores de IP (> 0,3). As nanopatículas Nano_AF apresentaram diâmetro
médio de 208,10 nm e a Nano_0 de 381,52nm.Estes resultados estão em conformidade com
trabalhos prévios descritos aplicando a técnica de nanoprecipitação que apresentam valores
menores que 300 nm (FESSI et al.,1989; SANTOS et al., 2011).
Os valores medidos na avaliação do potencial zeta das amostras ficaram entre -32,8 e -51,1 mV e
podem ser observado na Tabela 1.
Em geral, as partículas podem ser consideradas estáveis quando o valor absoluto do potencial
zeta for superior a +30 mV ou inferior a –30 mV, enquanto que potenciais próximos a 0 e 5 mV
podem produzir o fenômeno de floculação mais facilmente (NEVES et al., 2013).
4.2.3 Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão por efeito de campo (MEVFEG)
A Figura 1,A mostra as Nano_0, aglomeradas e isoladamente, em especial na imagem da
nanopartícula isolada, pode-se comprovar suas dimensões nanoméricas, apresentando
aproximadamente 200 nm, o que condiz com os resultados obtidos pelo equipamento Zeta-sizer
Nano Series (Malvern Instruments, NANO ZS 90, Malvern, Reino Unido).
Da mesma forma, a Figura 1,B mostra as Nano_AF, e ao analisar suas dimensões pode-se
perceber que também possuem dimensões nanoméricas, variando entre 300 e 500 nm. Em
ambas as micrografias, a escala foi tão pequena, que não foi possível obter imagens nítidas.
As fotomicrografias obtidas não demonstraram a formação de cristais. Cristais podem ocorrer
quando o composto a ser nanoencapsulado está presente em excesso no meio de dispersão ou
devido a uma grande polidispersão no tamanho das nanopartículas obtidas.
b
Figura 1 - Fotomicrografias das nanopartículas obtidas por MEV
MEV-FEG:
FEG: Nano_0, aumento de 140 kx (A) e Nano_AF,
aumento de 50 kx (b).
4.2.4 Espectroscopia na região do infravermelho
A Figura 2 representa os espectros obtidos para o polímero (PCL), o fármaco puro (AF), a mistura física
(MF) e as nanosuspensões na região do infravermelho entre 400 a 4000 cm–1.
O espectro IVTF do ácido ferúlico puro indicou uma banda típica referente à vibração de deformação axial
do grupamento OH em 3437 cm-1. A ocorrência de uma banda em 3016 cm-1 no espectro é atribuída ao
estiramento assimétrico
ssimétrico do grupamento C-H.
C H. O evento de uma banda em 1713 cm-1 se deve ao
estiramento do grupamento carbonila conjugado ao anel aromático e três bandas intensas e
características em 1618, 1598 e 1518 cm-1, correspondentes às vibrações de deformação axial do anel
aromático. Absorção em 1464 cm-1 é indicativo da deformação axial do grupamento C
C-H
H do anel aromático.
A banda em 1272 cm-1 é atribuída à deformação axial do grupamento C-O-C.
C C. Ainda, as bandas nítidas em
804 e 832 cm-1 são devidas a dois átomos de
de hidrogênio adjacentes no anel fenil (WANGet
(WANG al., 2011).
A PCL apresentou uma banda forte em 1727 cm–1, correspondente à vibração de deformação axial do
grupamento C=O e duas bandas em 2943 e 2864 cm–1, devido as vibrações simétricas e assimétricas do
grupamento –CH2, respectivamente.
A mistura física na proporção 1:1 apresentou espectro condizente com as bandas encontradas tanto na
avaliação da PCL quanto do AF puro.
Tanto a formulação Nano_AF como a Nano_0 apresentaram uma banda característica na região de 1639
cm–1, provavelmente característica do óleo utilizado na formulação, o triglicérides de ácido
cáprico/caprílico, que está em maior quantidade na composição, (aproximadamente 80%) e que forma o
núcleo oleoso onde o fármaco encontra-se
encontra
disperso, evidenciando
enciando a formação de uma estrutura de
nanocápsula.
-1
Espectro IVTF (4 cm , 32 scans, pastilha com KBr)
Nano_AF
Transmitância (%)
Nano_0
MF
AF
PCL
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Numero de onda (cm )
Figura 2 - Espectros de IVTF da poli-(ε-caprolactona)
poli caprolactona) (PCL), ácido ferúlico (AF), mistura física (MF), e
nanossuspensões (Nano_0 e Nano_AF)
4.3 Permeação cutânea in vitro
A Figura 3 mostra o perfil de permeação do AF puro e da formulação desenvolvida Nano_AF, em tampão
fosfato 7,4 utilizando uma membrana natural (pele dissecada da orelha de porco) em condições não
oclusivas, utilizando-se células de Franz. Esses estudos foram realizados com o objetivo de se avaliar a
influência deste nanocarreador sobre a penetração cutânea do AF.
Para a determinação da quantidade de AF permeada foi utilizada uma curva padrão em tampão fosfato pH
7,4, obtida em comprimento de onda de 320 nm, onde obteve-se o r = 0,9999 e equação da reta y =
0,1652 x + 0,021.
A permeação do fármaco puro, que encontrava-se apenas disperso no gel de hidroxietilcelulose pode ser
considerada insignificante durante o período de tempo analisado, sendo o valor permeado de apenas
aproximadamente 0,50% no final de 12 horas. A formulação Nano_AF apresentou um total de 34,10% de
permeação cutânea que aumentou ao decorrer do tempo do teste, o que comprova a capacidade das
nanopartículas poliméricas de atravessar as barreiras cutânaeas, demonstrando que estas podem ser
consideradas excelentes carreadoras provavelmente devido ao fato de que o processo de
nanoencapsulação promoveu uma melhora na solubilidade do AF.
Os carreadores coloidais apresentam vantagens para aplicação tópica, uma vez que a liberação
sustentada é importante para suprir a pele com o fármaco por um período prolongado. O mecanismo de
ação das nanopartículas pode ser atribuído à associação com a superfície da pele. O pequeno tamanho
da partícula e a elevada área de superfície asseguram um maior contato com o estrato córneo. O agente
encapsulado penetrando na pele viável facilita o transporte do fármaco por alterar o coeficiente de partição
veículo/estrato córneo. A habilidade do fármaco em uma formulação tópica de permear a pele e exercer
seu efeito depende de dois eventos consecutivos: o fármaco deve primeiro difundir do veículo para a
superfície da pele e então deve permear essa barreira. A função dessas nanopartículas é liberar um
ingrediente ativo nas camadas superiores da pele e, em aplicações ótimas, prolongar o tempo no qual este
fármaco permanece sobre a pele (ALVES et al., 2007).
Permeação do ácido ferúlico (%)
40
35
30
25
20
15
AF puro
10
Nano_AF
5
0
0
5
10
15
Tempo (h)
Figura 3 - Representação gráfica do percentual de permeação cutânea in vitrodo AF puro e nanoencapsulado nos
tempos pré-determinados (horas)
5. Conclusão
Os resultados deste trabalho demonstram que nanocápsulas poliméricas contendo ácido ferúlico
podem ser preparadas utilizando o polímero pré-formado PCL pela técnica de deposição
interfacial, um método simples e rápido para obter nanocápsulas adequadas à liberação tópica,
sendo possível sugerir que as nanopartículas poliméricas elaboradas com o polímero PCL
proporcionam a vetorização do ácido ferúlico em nanocápsulas, o que poderia controlar a
liberação percutânea do fármaco, garantindo eficácia em tempo prolongado além de minimizar a
degradação pela luz, ar e calor.
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TRABALHO 18
Avaliação da qualidade de vida das funcionárias de uma instituição de
ensino na cidade de Ponta Grossa, PR.
FRANÇÓIA, P. C. O. (G) E-mail: [email protected]
GRIMM, R. C. (PG) E-mail:[email protected]
MACIEL, M. A. S. (PQ) E mail:[email protected]
SIMIONATTO, M. (PQ) E mail: [email protected]
G – acadêmica de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa - UEPG;
PG – aluno de pós-graduação em Administração Pública do Centro Universitário CESUMAR - UNICESUMAR;
PQ – docente do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa – UEPG e professora orientadora;
PQ – docente do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa – UEPG e professora orientadora.
Resumo: A qualidade de vida abrange conceitos de ordem econômica, social, cultural e política e
não apenas a ausência de doença ou enfermidade. O objetivo do presente estudo foi levantar as
condições sócio-econômica-cultural e avaliar a qualidade de vida no trabalho (QVT) de
funcionárias de uma instituição de ensino, na cidade de Ponta Grossa. Os dados foram obtidos
em evento realizado por um projeto extensionista da Universidade Estadual de Ponta Grossa.A
amostra foi composta por 12 mulheres com idades entre 31 e 59 anos. Foram empregados dois
questionários abordando aspectos sócio-econômico-cultural e QVT (Questionário SF-36). Os
resultados do questionário sócio-econômico-cultural foram bem variados, por envolver questões
pessoais, funções diferenciadas e variações na idade e tempo de serviço. As perguntas
relacionadas a patologias de caráter crônico como anemia, parasitose, diabetes, hipertensão
arterial e problemas cardíacos mostraram certo grau de incerteza nas respostas, mas possibilitou
a detecção destas bem como fatores hereditários evidentes. Pelo cálculo de índices de massa
corporal, apenas 25% das mulheres apresentaram peso saudável, as demais, evidenciaram
sobrepeso ou obesidade. O questionário SF-36 demonstrou valores adequados (≥ 50) para7 dos
8 domínios analisados variando de 58,3 a 85,7. Somente o domínio de dor no corpo foi
considerado inadequado como dor importante e limitante (valor de 41,7). De forma geral, a QVT
para estas mulheres é boa, refletindo em boa convivência familiar, social e com os menores da
instituição. Ações educativas a respeito de enfermidades e hábitos saudáveis e auxílio
profissional são necessários para a manutenção da QVT dessas funcionárias.
Palavras-chave: Qualidade de vida, questionário SF-36, funcionárias, realidade social, extensão.
1. Introdução
Qualidade de vida é um conceito muito amplo e gera entendimentos de forma diferenciada pelos
indivíduos na sociedade. A partir da literatura sobre o tema, é possível perceber que embora cada
época venha a apresentar um enfoque diferente para conceituar qualidade de vida no trabalho,
algo que parece comum a todos é o fato de que os interesses dos indivíduos e das organizações
seguem o mesmo caminho, isto é,quando melhora a satisfação do trabalhador há melhora na
produtividade da empresa (FERNANDES, 1997).
A qualidade de vida é uma discussão de natureza econômica, social, cultural e política,
constituindo o seu discurso uma linha de pensamento em conflito com o discurso tradicional.
Chiavenato (1999) menciona que, embora qualidade de vida seja considerada por diversos
autores como conceito abstrato, difícil de operacionalizar, ela equivale a "bem-estar" no domínio
social; a "status de saúde", no domínio da medicina; a nível de satisfação, no domínio psicológico.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) define a qualidade de vida como um estado de completo
bem-estar físico, mental e social, não consistindo apenas na ausência de doença ou enfermidade.
A qualidade de vida relacionada à saúde (QVRS) é mencionada como a noção que o indivíduo
tem em relação a possíveis doenças que possam acometê-lo e seus efeitos na própria vida e
compreende a satisfação pessoal, bem estar físico, funcional, emocional e social (LANA et al.,
2007).
O termo qualidade de vida vem sendo empregado no ambiente de trabalho devido ao fato das
pessoas dedicarem o maior tempo de sua vida nesses lugares. Portanto, a qualidade de vida no
trabalho (QVT) refere-se à renda capaz de satisfazer as necessidades pessoais e sociais
motivando o sentimento de orgulho pelo trabalho realizado; satisfazendo a vida emocional;
promovendo a auto-estima e a imagem positiva da empresa/instituição junto à opinião pública; de
modo a obter o equilíbrio entre trabalho e lazer; aos horários e condições adequadas de trabalho;
a ter possibilidade de oportunidades e perspectivas de carreira; bem como, possibilidade de
demonstração de uso do potencial; respeito aos direitos adquiridos; e recompensas justas pelo
trabalho realizado(SUCESSO, 2002). Em contrapartida, se faz necessário salientar que QVT
assimila duas posições antagônicas: de um lado, a reivindicação dos empregados quanto ao
bem-estar e satisfação no trabalho; e, de outro, o interesse das organizações quanto aos seus
efeitos potenciais sobre a produtividade e a qualidade (CHIAVENATO, 1999).
Cavassiniet al. (2006) ressalta que é relevante cuidar do bem-estar e segurança dos indivíduos
resultando em uma maior produtividade e qualidade no trabalho e ainda, contentamento na vida
familiar e pessoal.
Especificamente abordando um dos temas relacionados à QVT, neste caso a saúde, e com o
intuito de mensurar a qualidade de vida de trabalhadores, faz-se necessário a utilização de
instrumentos que possam quantificar a percepção do individuo sobre seu estado de saúde. O
questionário Medical OutcomesStudy 36-Item short-Form Health Survey (SF-36) é um meio pelo
qual, avalia-se a qualidade de vida de forma ampla e completa. Esse instrumento avalia tanto
aspectos positivos como bem-estar, quanto aspectos negativos como doença (FERNANDES et.
al., 2009).
O SF-36 é composto por 36 itens de auto-resposta de modo a ser dividido em oito dimensões
para avaliação dos conceitos de saúde que representam valores humanos básicos significativos
ao desempenho funcional e ao bem-estar individual (ABRUNHEIRO, 2005).
Além dos aspectos de qualidade de vida, esse tipo de instrumento pode ser complementado com
outras questões, como os dados demográficos do indivíduo, tais como sexo, idade, estado civil,
grau de instrução, tipo de empresa/instituição em que trabalha e tempo de trabalho na
empresa/instituição.
Para atingir os objetivos de estudos com o uso de entrevista em profundidade e questionários
adota-se uma abordagem qualitativa por meio de estudo de caso que segundo Fachin (2003), é
um tipo de pesquisa que lida com interpretações da realidade social.
2. Objetivos
O presente estudo tem por objetivo levantar as condições sócio-econômica-cultural e avaliar a
qualidade de vida de funcionárias de uma instituição de ensino, na cidade de Ponta Grossa, por
meio de abordagem individual e aplicação de questionários.
O estudo foi realizado no Instituto João XXIII de Ponta Grossa, entidade de acolhimento que
faz parte da Vara da Infância e do Adolescente local e exerce atividades de ensino e
profissionalizantes para crianças, adolescentes e jovens internos e/ou de contra-turno, com
idades entre 6 e 18 anos. Para tanto, 29 adultos fazem parte do quadro funcional sendo
destes, 15 mulheres e 14 homens.
Participaram do estudo funcionárias vinculadas por regime de contrato de trabalhodo Instituto
João XXIII em evento realizado em julho de 2015 pelo projeto de extensão “Avaliação e
acompanhamento do estado de saúde dos alunos do Instituto João XXIII, na cidade de
Ponta Grossa, Paraná” que conta com a participação de acadêmicos do curso de Farmácia e
de professoras supervisoras do Laboratório Universitário de Análise Clínicas (LUAC).
A amostra foi composta por 12 mulheres com faixa etária compreendendo entre 31 e 59 anos.
Com base no método proposto, foram elaborados e realizados dois questionários aplicados,
sendo um sócio-econômico-cultural com perguntas relacionadas às questões como: estado civil,
escolaridade, renda familiar, moradia, saneamento básico, hábitos higiênicos e ainda, dados
antropométricos, de saúde e funcionais; e outro sobre qualidade de vida no trabalho, conforme a
versão brasileira do Questionário SF-36 proposto por Ware&Sherboune (1992), onde são
levantadas 11 questões que abordam saúde, esforço físico, problemas emocionais, dor, energia e
vigor e atividades sociais, e que são avaliadas em 8 grupos de domínios (WARE, et al.,1997).
Sendo eles: funcionamento físico (limitações em atividades físicas), limitações de desempenho
consequentes a problemas físicos, dor no corpo, percepção geral de saúde, vitalidade,
funcionamento social (limitações em atividades sociais), limitações de desempenho decorrentes
de problemas emocionais, e ainda, saúde mental.
A interpretação dos domínios da versão brasileira do questionário por Martinez, Paraguay e
Latorre (2004) atualmente ocorre por uma escala de 0 (zero) a 100 (cem), onde zero é pior
domínio e cem, o melhor. Aplica-se uma fórmula para o cálculo de cada domínio e para o mesmo
existe um limite inferior e variação pré-determinados, conforme descrito na figura 1.
í =
Valorobtidonasquestõescorrespondentes − Limiteinferior
x100
Variação
Onde: ● Valor obtido nas questões correspondente é a razão da soma de todos os escores das
questões referentes a esse domínio pela população/amostragem;
● Limite inferior e variação (Score Range) são valores constantes.
Figura 1 – Fórmula para obtenção dos domínios da versão brasileira do questionário SF- 36
Considerou-se significado baixo ou ruim de desempenho de domínio, valores até 49,9 e em
contrapartida, significado alto ou bom com valores iguais ou maiores a 50.
No inquérito original, a interpretação é realizada por meio de uma tabela de informação com o
significado dos valores altos e baixos de escores e/ou desempenho de domínio que são obtidos
pela pontuação das questões transformadas em porcentagem (%) também calculadas por
fórmula.
Para o cálculo do Índice de Massa Corporal (IMC) utilizou-se a fórmula preconizada pela OMS,
aonde o IMC do indivíduo é a razão do seu peso em kg pela sua altura em metros ao quadrado
(WHO, 2004).
As atividades funcionais realizadas pelas mulheres desta instituição estão intimamente
relacionadas ao cuidado dos menores atendidos pelo abrigo, tais como, cuidadora, educadora,
cozinheira, lavadeira, auxiliar de limpeza e de leiteria e técnica administrativa. Sendo assim, sabese que o desempenho profissional está intimamente relacionado ao seu bem-estar físico e social
e que refletirá diretamente no atendimento adequado às crianças, adolescentes e jovens da
comunidade.
As respostas referentes ao questionário sócio-econômico-cultural foram bem variadas, por
envolver questões pessoais e pelo fato das trabalhadoras exercerem funções diferentes dentro da
instituição, bem como, idade e tempo de serviço.
Em relação ao estado civil, 2 (16,67%) eram solteiras, 6 (50%) casadas formalmente, 2 (16,67%)
casadas porém de modo não formal, 2 (16,67%) divorciadas ou separadas e nenhuma em viuvez.
Quanto à escolaridade, 1 (8,33%) era alfabetizada, 6 (50%) tinham o ensino fundamental
incompleto, 1 (8,33%) com o ensino fundamental completo, 1 (8,33%) com o ensino médio
incompleto, 2 (16,67%) com o ensino médio completo, 1 (8,33%) com o ensino superior completo
e nenhuma analfabeta ou com ensino superior incompleto.
Os resultados sobre a renda familiar foram mais homogêneos, sendo que 10 (83,33%) delas
apresentam de 1 a 2 salários mínimos, 1 ( 8,33% ) entre 3 a 5 salários mínimos e 1 (8,33%) com
renda superior a 5 salários mínimos.
Em relação à ocupação, 8 (66,67%) delas tinham moradia própria, 2 (16,67%) moravam em local
alugado e 2 (16,67%) em moradia cedida. Apenas 2 (16,67%) mulheres responderam que se
tratava de zona urbana e 1 (8,33%) possuía horta em casa. Todas (100%) mencionaram que
havia coleta de lixo, água e esgoto tratados. Apenas 1 (8,33%) relatou ter poço na moradia e
nenhuma com fossa.
Os resultados quanto aos hábitos higiênicos,que se referiam à lavagem das mãos antes das
refeições, após ir ao banheiro e andar descalço e obteve-se respectivamente, 12 (100%), 11
(91,67%) e zero.
Como dados funcionais, foram avaliados o tempo de serviço e o turno das funcionárias na
instituição apenas 11 funcionáriasresponderam essa questão,conforme a tabela 1. Duas
funcionárias haviam iniciado as atividades há 2 e 6 meses e todas as outras com mais de 2 anos
de trabalho (91,67%). Percebeu-se uma média de tempo de serviço de cinco anos e meio e
períodos de trabalho de até 17 anos, demonstrando estabilidade empregatícia. Todas (100%)
trabalham pela manhã e a tarde.
Tabela 1. Valores referentes ao tempo de serviço (em anos) das funcionárias da instituição
TEMPO DE SERVIÇO (em anos)
menor que 1 ano
1a3
4a6
10 ou mais
TOTAL
Fonte: Dados da pesquisa.
FREQUÊNCIA
2
3
3
3
11
%
16,67
25,0
25,0
25,0
91,67
Com os dados antropométricos como peso e altura, foram calculados os índices de massa
corporal – IMC, e que resultou em 3 (25%) das mulheres apresentando peso saudável, 5
(41,67%) em estado de sobrepeso, 3 (25%) com obesidade de grau I e 1 (8,33%) com obesidade
de grau II, dados elucidados na tabela 2.
Tabela 2. Índice de massa corporal das funcionárias da instituição
CATEGORIA
FREQUÊNCIA
(n)
%
Subnutrição
0
0
IMC: abaixo de 18,5
Peso saudável
3
25,0
IMC: 18,5 – 24,9
Sobrepeso
5
41,7
IMC: 25,0 – 29,9
Obesidade grau I
3
25,0
IMC: 30,0 – 34,9
Obesidade grau II
1
8,3
IMC: 35,0 – 39,9
Obesidade grau III
0
0
IMC: 40,0 e acima
TOTAL
12
100
Fonte: IMC adaptado do WHO, 1995, WHO, 2000 e WHO, 2004e dados da pesquisa.
Os resultados encontrados para o sobrepeso, obesidade grau I e grau II (75%) alertam para as
condições de hábitos alimentares inadequadas e que acarretam em diminuição da qualidade de
vida e consequentes problemas de saúde.
Para as perguntas sobre os dados de saúde, as respostas não foram completas, o que
demonstrou desconhecimento ou incerteza. As perguntas estavam relacionadas a patologias
como anemia, parasitose, diabetes, hipertensão arterial e problemas cardíacos, com
complemento de tratamento quando da sua existência e conhecimento de casos na família nas
três últimas propostas.
Quanto aos casos de anemia, 7 (58,33%) que responderam a questão não relataram a
anormalidade e das 3 (25%) que apresentaram o quadro de anemia, somente 2 (16,67%)
realizaram o tratamento. De todas as mulheres, 9 (75%) mencionaram nunca ter apresentado
parasitose. Mesmo que 4 (33,33%) delas apresentavam casos de diabetes familiar, apenas 1
(8,33%) apresentou tal alteração no metabolismo dos carboidratos. Em relação à hipertensão
arterial, 4 (33,33%) disseram-se hipertensas, mas somente 3 (25%) relataram que estão em
tratamento. Entretanto, 5 (41,66%) apresentaram casos de familiares com hipertensão. Já em
relação a problemas cardíacos, somente 1 (8,33%) delas sabia da sua patologia e se tratava,
porém 7 (58,33%) mencionou o problema em familiares.
Os resultados indicam que, de modo geral, trabalhos educativos com as mulheres e
acompanhamento clínico parecem necessários.
Os resultados da versão brasileira do questionário SF-36 para a qualidade de vida das
funcionárias do Instituto João XXIII estão representados na tabela 3.
Numa escala de 0 (zero) a 100 (cem), demonstraram valores de 68,3 para o domínio de
funcionamento físico, 83,3 para limitações de desempenho consequentes a problemas físicos,
41,7 para o domínio de dor no corpo, 63,3 para a percepção de saúde em geral, 58,3 para o
domínio de vitalidade, 64,5 funcionamento social, 85,7 de limitações de desempenho
consequentes a problemas emocionais, e 72,9 de saúde mental.
Com base nos resultados obtidos para os todos os domínios, de modo geral, as mulheres se
encontram sem limitações ou problemas físicos, sociais e mentais que impedem a realização das
suas atividades diárias. Apresentam-se saudáveis e com vitalidade, porém em contrapartida, o
domínio da dor demonstrou valores abaixo do escore desejável, demonstrando que a dor corporal
pode limitar suas atividades normais.
Tabela 3. Avaliação dos resultados dos escores do Questionário SF-36 para as funcionárias da instituição
DOMÍNIO
FREQUÊNCIA DE
DESEMPENHO
Funcionamento
físico (limitações
em atividades
físicas)
68,3
Limitações de
desempenho
consequentes a
problemas físicos
83,3
Dor no corpo
41,7
Percepção de
saúde em geral
63,3
Domínio de
vitalidade
58,3
SIGNIFICADO DOS ESCORES
BAIXO (<49,9)
Grande limitação ao
desempenhar as
atividades físicas,
incluindo tomar banho
ou vestir-se, devido à
saúde
Problemas com o
trabalho ou outras
atividades diárias como
resultado da saúde
física
Dor importante e muito
limitante
Avalia a sua saúde
como ruim e acredita
que vai piorar
Sente-se cansado e
esgotado todo o tempo
ALTO (≥50,0)
Sem limitação de
saúde para realizar
todas as atividades
físicas, incluindo as
mais rigorosas
Sem problemas no
trabalho ou em outras
atividades diárias
Sem dor ou limitações
decorrentes de dor
Avalia a sua saúde
como excelente
Sente-se animado e
com energia todo o
tempo
Atividades sociais
normais sem
interferência de
problemas físicos e
emocionais
Interferência extrema e
frequente em atividades
Funcionamento
64,5
sociais normais devido a
social
problemas físicos e
emocionais
Problemas no trabalho
Limitações de
desempenho
ou em outras atividades Sem problemas no
85,7
diárias como
consequentes a
trabalho ou em outras
consequencia de
problemas
atividades diárias
emocionais
problemas emocionais
Sentimentos de paz,
Sentimento de
Saúde mental
72,9
nervosismo e depressão calma, felicidade todo
o tempo
todo o tempo
Fonte: Dados da pesquisa segundo o questionário de Ware et al., 1997. Adaptado para a versão brasileira
demonstrada por Martinez, Paraguay e Latorre, 2004.
Vários estudos são realizados utilizando o questionário SF-36 porque é de fácil compreensão, do
tipo auto administrado e visa a percepção pelo próprio paciente/entrevistado do seu estado atual
de saúde.Como por exemplo, o estudo de Fernandes et al. (2009) avaliou a qualidade de vida da
gerência de assistência nutricional da Santa Casa de Misericórdia do Pará e obteve resultados
muito similares aos encontrados neste trabalho e concluiu que seus funcionários apresentavam
uma boa qualidade de vida.
A evolução clínica de pacientes também pode ser acompanhada por este método, assim como o
efeito da terapia empregada e analisar a influência de co-morbidades na QVRS (AYDEMIR et al.,
2005).
5. Conclusão
A análise de qualidade de vida das funcionárias do Instituto João XXIII, realizada por meio de
projeto de extensão, proposta neste estudo demonstrou pelo levantamento sócio-econômicocultural diferenças expressivas em relação às respostas, principalmente, as que dizem respeito à
idade, escolaridade, atividade funcional e tempo de serviço na instituição. As mulheres
apresentaram dificuldades para responder aos dados de saúde, parecendo alheias aos
apontamentos, porém os resultados do cálculo do IMC alertaram categorias de sobrepeso e
obesidades grau I e II. Portanto, demonstra a necessidade de ações educativas a respeito de
enfermidades e hábitos saudáveis, bem como, auxílio profissional.
Quanto ao questionário de qualidade de vida SF-36 adaptado à realidade brasileira, para todos os
domínios avaliados apenas o que se referia à dor resultou em níveis preocupantes com grande
potencial de interferir nas atividades diárias comuns, mas de forma geral, a QVT para estas
mulheres é boa e as mesmas encontram-se em adequado estado de saúde física, emocional e
mental sem comprometimento de suas atividades funcionais e sociais refletindo na convivência
dos seus familiares e dos menores atendidos na instituição.
Referências
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Acessoem 01 de setembro de 2015.
TRABALHO 19
Estudo farmacobotânico comparativo de duas espécies de Baccharis L.
da Região dos Campos Gerais
Vanessa Barbosa Bobek1 (PG) E-mail: [email protected]
Valter Paes de Almeida 2(IC) E mail [email protected]
3
Tomoe Nakashima (PQ) E mail [email protected]
4
Jane ManfronBudel (PQ) E-mail [email protected]
1 Mestranda do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná;
2 Aluno de iniciação científica do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa;
3 Professora Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná
responsável pela co-orientação do trabalho;
4 Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável
pela orientação do trabalho
Resumo: Baccharis compreende muitas espécies medicinais. Baccharis caprariifolia DC. e
Baccharis erioclada DC., popularmente conhecidas como “vassouras”, ocorrem no Sul do Brasil e
sua morfologia externa é muito semelhante. Objetivou-se neste trabalho investigar as
características farmacobotânicas de folhas e caules destas espécies. Foram feitos cortes
transversais à mão livre de folhas e caules das duas espécies. Utilizou-se a dupla coloração azul
de astra e fucsina básica. Os resultados foram registrados através de fotomicrografias em
microscópio de luz. As duas espécies estudadas apresentam características morfológicas muito
semelhantes. Algumas características anatômicas podem ser consideradas como elementos
diferenciais de diagnóstico: a ocorrência de estômatos nas folhas e o tipo detricomanão-glandular.
Palavras-chave: Asteraceae, Baccharis, morfoanatomia.
1. Introdução
Entre as diversas famílias botânicas com destaque para uso medicinal encontra-se Asteraceae
Dumort que apresenta aproximadamente 1.600 gêneros e 25.000 espécies. Dentre os gêneros de
Asteraceae, destaca-se Baccharis L., que inclui mais de 400 espécies, sendo 178 encontradas no
Brasil. São frequentemente utilizadas na medicina popular para controle e tratamento de diversas
enfermidades (CORRÊA, 1984; HEIDEN et al., 2010).
Numerosas espécies de Baccharis são produtoras de óleo essencial. Estudos químicos relataram
a composição dos seus óleos voláteis e vários componentes do óleo essencial têm demonstrado
atividade biológica, tais como β-pineno, limoneno, β-cariofileno, espatulenole (E) – nerolidol
(FLORÃO et al., 2012; BUDEL et al., 2012).
Baccharis caprariifolia DC. e Baccharis erioclada DC., popularmente conhecidas como
"vassoura", ocorrem no Sul do Brasil e sua morfologia externa é muito semelhante. Estudos
anteriores revelaram que β-cariofileno e (E)-nerolidol são os componentes principais do essencial
óleo das partes aéreas de Baccharis caprariifoliaDC. Enquanto que β-pineno e limoneno são os
compostos majoritários do óleo essencial de B. erioclada DC. (FERRACINI et al., 1995).
2. Objetivos
Objetivo deste trabalho foi estudar os caracteres farmacobotânicos de folhas e caules de B.
caprariifolia e B. eriocladapara fornecer suporte adicional para diferenciar estas espécies
vegetais.
Partes aéreas de B. caprariifolia e B. erioclada foram coletadas na região dos Campos Gerais,
Ponta Grossa, Paraná, Brasil (coordenadas 25 ° 08 'S e 50 ° 27 'W) durante o verão de 2013. Os
materiais botânicos foram identificados e os comprovantes foram depositados no Herbário de
Universidade Estadual de Ponta Grossa e Universidade Federal do Rio Grande do Sul sob os
números ICN 59353 e ICN 20412, respectivamente para B. caprariifolia e B. erioclada.
O material vegetal foi fixado em FAA 70 (JOHANSEN, 1940) e estocado em etanol a 70% (v/v)
(BERLYN & MIKSCHE, 1976). As lâminas semipermanentes foram obtidas através de secções
transversais à mão livre (OLIVEIRA & AKISUE, 1997). Para a montagem das lâminas foi utilizada
glicerina a 50% (BERLYN & MIKSCHE, 1976) e a lutagem feita com esmalte incolor (BEÇAK &
PAULETTE, 1976).
Para os testes microquímicos foram feitas secções transversais à mão livre do material fixado. A
verificação de lignina foi feita com floroglucina clorídrica (FOSTER, 1949). Para compostos
lipofílicos foi empregado o reativo de Sudam III (SASS, 1951). Compostos fenólicos foram
detectados com cloreto férrico e lugol para amido (JOHANSEN, 1940; BERLYN & MIKSCHE,
1976). Os resultados foram registrados através de fotomicrografias em microscópio óptico.
A análise ultraestrutural de superfície foi realizada por microscopia eletrônica de varredura em
alto vácuo. As eletromicrografias foram realizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3
TESCAN, no C-LABMU/PROPESP da UEPG.
As folhas de B. caprariifolia medem 1,5- 3 cm de comprimento e 0,5 cm de largura, possuem
ápice obtuso, base atenuada e margem foliar denteada no terço superior. Baccharis erioclada
apresenta folhas com 1-2 cm de comprimento e 0,3-0,5 cm de largura, ápice agudo, base
atenuada e margem foliar denteada no terço superior. Ambas as espécies evidenciaram folhas
sésseis e com formato oblongo.
Baccharis geralmente apresenta folhas com filotaxia do tipo alternada, como observado em B.
caprariifolia e B. erioclada. De acordo com a literatura (BARROSO & BUENO, 2002), um pequeno
número de Baccharis pode exibir umadisposição oposta das folhas, conforme relatado para
B. lymannii G.M. Barroso e B. spicata (Lam.) Baill.
Quanto à margem foliar, comumente em Baccharis ocorrem folhas com a porção média superior
provida de dentes triangulares como se encontra nasespécies em estudo, bem como em
B. spicata (BARROSO & BUENO,2002; OLIVEIRA et al., 2011). No entanto, em B. singularis
(Vell.) G.M. Barroso (SOUZA et al., 2011) e B. uncinella DC. (BUDEL & DUARTE, 2008a), a
margem foliar é desprovida de dentes.
Na análise anatômica da lâmina foliar, em vista frontal, as células epidérmicas apresentam
parede anticlinal com formato ondulado na face abaxial e reto na face adaxial, em
B. caprariifolia assim como em B. megapotamica (BUDEL, 2009). Enquanto que em B. erioclada o
formato das células apresentou-se ligeiramente ondulado na face adaxial e ondulado na face
abaxial.
É comum em Baccharis as células epidérmicas apresentarem-se com formato poligonal em vista
frontal (FREIRE et al., 2007; BUDEL & DUARTE, 2007; PEREIRA et al., 2014). No entanto, os
formatos ondulado (OLIVEIRA et al., 2011; BUDEL et al., 2013) e sinuoso (BUDEL & DUARTE,
2008b) também podem ser encontrados. Medri & Lleras (1980) sugeriram que o formato
sinuosodas células da parede celular, pode ser atribuído às características de adaptação da
planta com objetivo de diminuir a perda excessiva de água. Em secção transversal, a epiderme
apresentou-se uniestratificada com células isodiamétricas para as duas espécies.
Baccharis caprariifolia revelou-se anfiestomática e os estômatos presentes em ambas asfaces
são classificados como anomocíticos e anisocíticos. No entanto B. erioclada apresentou-se
hipoestomática com estômatos anomocíticos e anisocíticos presentes apenas na face abaxial.
Segundo Metcalfe e Chalk (1950), o aspecto do estômato, em vista frontal, tem valor diagnóstico
para a família Asteraceae, e dois tipos podem ser encontrados: anomocítico e anisocítico, sendo
o primeiro mais comum. Outros tipos de estômatos também foram descritos para o gênero
Baccharis tais como, ciclocítico(FREIRE et al., 2007; BUDEL et al., 2013), estaurocíticos,
tetracíticos (FREIRE et al., 2007) e actinocítico (PEREIRA et al., 2014).
O tipo do tricoma é uma característica relevante para o controle da qualidade de drogas vegetais,
visto que elas são comercializadas na forma rasurada ou pulverizada. Vários autores relataram
que o tipo de tricoma pode ser utilizado como um parâmetro de diagnóstico para Asteraceae
(FREIRE et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2011). Neste estudo foram encontrados tricomas
glandulares capitados e bisseriados com 8-12 células de base para ambas espécies. A ocorrência
desses tricomasfoi amplamente descrito em Baccharis (SOUZA et al., 2011; BUDEL, et al., 2013;
PEREIRA et al., 2014).
Foram observados tricomas tectores em B. caprariifoliae B. erioclada. Esses tricomas são
classificados como flageliformes simples em B. caprariifolia os quais possuem 3-4 células de base
e em tricomasflageliformes ramificados os quais foram encontrados em B. erioclada com 2 células
de base.
Tricomasflageliformes foram observadas em B. anômala (BUDEL & DUARTE, 2008b), B. cognata
(BUDEL et al., 2013), B coridifolia (BUDEL & DUARTE, 2007), B. singularis (SOUZA et al., 2011),
B. spicata (OLIVEIRA et al., 2011), e B. rufescens var. tenuifolia (SOUZA et al., 2013).Tricomas
flageliformes ramificados foram encontradas em B. coridifolia (BUDEL & DUARTE, 2007), B.
dracunculifolia (BUDEL et al., 2004) e B. uncinella (BUDEL & DUARTE, 2008a).
As folhas de B. caprariifolia e B. erioclada mostraram mesofilo isobilateral, evidenciando
parênquima paliçádico composto por 2-3 camadas de células e parênquima esponjoso formado
por 2-3 camadas de células. Mesofilo isobilateral foi relatado em diversas espécies de Baccharis
(BUDEL & DUARTE, 2010; BUDEL et al., 2013; SOUZA et al., 2013).
A nervura central em secção transversal evidenciou formato plano na face adaxial e ligeiramente
convexo na face abaxial em B. caprariifolia e formato ligeiramente côncavo na face adaxial e
convexo na face abaxial em B. erioclada. A epiderme é unisseriada e coberta por uma cutícula
delgada e ligeiramente estriada. Há duas camadas de colênquima angular em ambas as faces
para as duas espécies e um único feixe vascular do tipo colateral. Foram observadas calotas de
fibras esclerenquimáticas, as quais reagiram com floroglucina clorídrica nos testes microquímicos.
No xilema, os elementos traqueais estão dispostos em fileiras. Dutos secretores com epitélio
unisseriado compostos de 4-12 células ocorrem próximo ao floema em ambas as espécies.
O caule apresenta formato praticamente circular evidenciando 3-4 costelas. A epiderme caulinar é
uniestratificada. Uma a cinco camadas de colênquima angular podem ser encontradas subjacente
à epidermede ambas as espécies, principalmente nas costelas. O córtex possui uma camada de
colênquima angular contínuo subjacente à epiderme. Colênquima alternando com clorênquima
nas demais camadas. Essa característica foi observada em B. anomala, B. megapotamica, B.
microcephala, B. ochracea, B. spicata e B. uncinella (BUDEL, 2009). A endoderme limita o córtex
internamente com estrias de Caspary visíveis.
Dutos secretores e calotas de fibras perivasculares são observados junto ao floemaconforme
amplamente divulgado para várias espécies de Baccharis (BUDEL et al., 2004; RODRIGUEZ et
al., 2008; SOUZA et al., 2011). Os elementos traqueais do xilema estão dispostos em fileiras, de
forma organizada e são separados por células do parênquima e fibras.
Várias espécies do gênero evidenciam a presença de cristais de oxalato de cálcio (BUDEL et al.,
2004; RODRIGUEZ et al., 2008; SOUZA et al., 2011). Nesse estudo, numerosos cristais de
oxalato de cálcio do tipo ráfides, prismáticos e estilóidesforam encontrados na região perimedular
de ambas as espécies.
5. Conclusão
Os estudos morfoanatômicos realizados neste trabalho auxiliam no reconhecimento da flora
nativa brasileira e, quando tomados em conjunto, contribuem na caracterização farmacobotânica
(macro e microscópica) dessas espécies.
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TRABALHO 20
Investigação anatômica e microquímica de caule e folha de
Sambucus australis Cham & Schltdl
1
Thamires Aparecida Dzirba (IC) E-mail: [email protected]
Daniela Gaspardo Folquitto 2 (PG) E-mail: [email protected]
Jane Manfron Budel 3 (PQ) E-mail: [email protected]
1
Aluna de iniciação científica do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa;
Mestranda do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná.
3
Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável
pela orientação do trabalho.
2
Resumo: Sambucus australis Cham & Schltdl pertencente à família Caprifoliaceae e é conhecida
popularmente no Brasil como sabugueiro-do-rio-grande e sabugueiro-do-brasil. É nativa no Brasil,
ocorrendo nas Regiões Nordeste e Sudeste até o Rio Grande do Sul. As flores, cascas e folhas
são utilizadas na medicina tradicional sob a forma de infusão ou decocção para o tratamento de
reumatismos, inflamações e queimaduras. Objetivou-se analisar a anatomia e a microquímica das
partes vegetativas aéreas de Sambucus australis, a fim de fornecer características
farmacobotânicas para a identificação da espécie medicinal, bem como para a diferenciação de
outras espécies do gênero. O material botânico foi submetido às microtécnicas fotônicas e
eletrônicas de varredura usuais. Dentre as características observadas, destacam-se: tricoma
tector cônico unicelular, tricoma glandular capitado com cabeça multicelular, estômato
anomocítico, folha hipoestomática, mesofilo dorsiventral, forma ovalada da nervura central com
feixe vascular colateral único, pecíolo bicôncavo-convexo com 5 feixes vasculares dispostos em U
e caule circular com costelas, que analisadas em conjunto auxiliam na identificação da espécie
medicinal e diferenciação das demais Sambucus.
Palavras-chave: Anatomia, Caprifoliaceae, controle da qualidade, microquímica, sabugueiro.
1. Introdução
Caprifoliaceae compreende 18 gêneros e 450 espécies distribuídas principalmente nas regiões
temperadas do Hemisfério Norte e com uma menor distribuição no Hemisfério Sul (HEYWOOD,
1993).
Entre os importantes gêneros dessa família, encontra-se Sambucus, que apresenta 25 espécies,
destacando-se Sambucus canadenses L., Sambucus ebulus L., Sambucus nigra L. e Sambucus
australis Cham. & Schltdl. (REITZ, 1985; TÔRRES et al., 2005; AGRA et al., 2007). O único
gênero com espécies nativas na América do Sul é Sambucus, com duas espécies: Sambucus
peruviana Kunth e S. australis (BACIGALUPO, 1974; DIMITRI, 1980; REITZ, 1985).
Autores recentes sugerem que o gênero Sambucus seja realocado para a família Sambucaceae
(TAKHTAJAN, 1997), ou para Adoxaceae (JUDD et al., 1999), enquanto outros ampliam a
circunscrição de Caprifoliaceae (APG II, 2003).
Sambucus australis, conhecida popularmente no Brasil como sabugueiro-do-rio-grande e
sabugueiro-do-brasil, é uma espécie medicinal que consta apenas da primeira edição da
Farmacopeia Brasileira (SILVA, 1929).
É nativa no Brasil, ocorrendo nas Regiões Nordeste e Sudeste até o Rio Grande do Sul (TORRES
et al., 2005; AGRA et al., 2007). Sendo uma planta medicinal que consta apenas da primeira
edição da Farmacopéia Brasileira (SILVA, 1929; BRANDÃO et al., 2006). As flores, as cascas e
as folhas são utilizadas na medicina tradicional sob a forma de infusão ou decocção para o
tratamento de reumatismos, inflamações e queimaduras.
Atividades farmacológicas de extratos ou de substâncias isoladas têm sido investigadas, sendo
relatadas as atividades diurética, antipirética, anti-inflamatória e laxativa (REITZ, 1985; LORENZI
& MATOS, 2002).
2. Objetivos
Considerando que somente a Farmacopeia brasileira I apresenta a monografia da flor de S.
australis, objetivou-se investigar anatomicamente e microquimicamente a folha e o caule dessa
espécie, a fim de fornecer características farmacobotânicas para identificação da espécie
medicinal, bem como diferenciá-la de outras espécies de Sambucus.
Foram coletadas partes aéreas floridas de 5 exemplares de Sambucus australis Cham & Schltdl.,
no Horto Medicinal de Plantas Medicinais do Curso de Farmácia da UEPG (Campus Uvaranas,
Av. General Carlos Cavalcanti, 4748; CEP 84030-900; GPS: 25°5'23"S 50°6'23"W). Os
exemplares foram submetidos à confecção de exsicatas, identificadas por especialista e os
representantes equivalentes estão registrados no Herbário do Museu Botânico de Curitiba sob o
número 21145. O material coletado foi devidamente processado para a realização do estudo
anatômico.
As pesquisas referentes aos caracteres farmacobotânicos foram efetuadas com folhas e caules
de Sambucus australis, a partir de 10 cm do ápice da planta. O material vegetal foi fixado em FAA
70 (formol 5%, ácido acético 5% e etanol 70ºGL 90% v/v) (JOHANSEN, 1940), e estocados em
solução de etanol a 70% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Foram preparadas lâminas
semipermanentes com o material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, à mão livre,
submetido à coloração de azul de astra e fucsina básica (ROESER, 1972) ou de azul de toluidina
(O'BRIEN, FEDER, MCCULLY, 1964). As lâminas foram montadas com glicerina diluída a 50%
(v/v) (BERLYN, MIKSCHE, 1976) e para a lutagem foi utilizado esmalte incolor.
Foram realizadas secções transversais à mão livre de folhas e caules de Sambucus australis e os
reativos empregados foram solução de floroglucina clorídrica para verificação de lignina
(FOSTER, 1949), Sudam III para substâncias lipofílicas (SASS, 1951), cloreto férrico para
compostos fenólicos (JOHANSEN, 1940), ácido sulfúrico para a verificação da natureza dos
cristais (OLIVEIRA, AKISUE, 1997) e lugol para amido (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Os
resultados dos testes microquímicos e da análise anatômica foram registrados por meio de
fotomicrografias em microscópio fotônico Olympus CX31, acoplado à câmera digital Olympus
model C-7070, no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa.
A caracterização morfológica das superfícies caulinares e foliares de Sambucus australis foi
realizada com análise ao microscópio eletrônico de varredura. Para tal procedimento, as amostras
foram fixadas em FAA 70 e desidratadas em série etanólica crescente. As eletromicrografias
foram realizadas em alto vácuo e visualizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3
TESCAN (SOUZA, 1998). Para realização do ponto crítico e microscopia eletrônica de varredura,
o material foi analisado no C-LABMU/PROPESP, na Universidade Estadual de Ponta Grossa.
Anatomicamente, o folíolo de S. australis em vista frontal mostra as paredes anticlinais das
células epidérmicas levemente ondeadas na face adaxial e sinuosas na face abaxial. Estômatos
anomocíticos são encontrados somente na face abaxial, caracterizando a folha como
hipoestomática. Em secção transversal, a epiderme é uniestratificada coberta por cutícula
ligeiramente espessa e estriada e os estômatos estão situados no mesmo nível das demais
células epidérmicas. As células da camada epidérmica adaxial são maiores que as células da
camada abaxial. Essas características também forma relatadas por Jorge et al. (1999) para a
lâmina foliar de S. australis.
São observados dois tipos de tricomas, um tricoma tector cônico unicelular de parede espessada
e um tricoma glandular capitado com pedicelo formado por cerca de 4 células e cabeça
multicelular.
icelular. Esses tricomas são frequentes na nervura central e na face adaxial do pecíolo.
Divergindo dessa constatação, Jorge et al. (1999) descreveu o tricoma glandular dessa espécie
como tendo cabeça septada.
A organização dos parênquimas fotossintetizantes
fotossintetizantes é dorsiventral, ocorrendo uma camada de
parênquima paliçádico e cerca de 7 camadas de parênquima esponjoso. Feixes vasculares de
pequeno porte, envoltos por bainha parenquimática, são observados na região mediana do
mesofilo. A nervura central tem formato
formato ovalado e adjacente à epiderme são observados
aproximadamente 3 camadas de colênquima angular. O sistema vascular é representado por um
único feixe vascular do tipo colateral. No parênquima fundamental são observadas células
contendo compostos fenólicos,
s, areia cristalina e grãos de amido.
O pecíolo, em secção transversal, tem formato bicôncavo-convexo.
bicôncavo convexo. Adjacente à epiderme são
encontradas cerca de 3 camadas de colênquima angular. O sistema vascular é representado por
5 feixes colaterais livres organizados
os em U, sendo o central mais desenvolvido. No parênquima
fundamental, próximas aos feixes, são frequentes células contendo compostos fenólicos, células
com areia cristalina e células contendo grãos de amido.
O caule, seccionado transversalmente, apresenta formato circular, evidenciando várias arestas e
valéculas. Subjacentemente ao sistema de revestimento são observadas várias camadas de
colênquima angular e de parênquima cortical. Limitando internamente o córtex, uma endoderme
amilífera está presente. O sistema
istema vascular é típico e, aposto ao floema, podem ser observadas
calotas de fibras esclerenquimáticas. A medula apresenta células isodiamétricas e de paredes
finas, sendo também encontradas células com conteúdo fenólico.
A caracterização farmacobotânica de plantas medicinais é fundamental para a identificação de
espécies medicinais e está entre as análises mais acessíveis. Os dados anatômicos e
microquímicos obtidos podem ser utilizados para detectar adulterações e contaminações
acidentais ou intencionais,
s, contribuindo para o controle da qualidade da matéria
matéria-prima vegetal.
Fig. 1 Secção transversal do caule.
Fig. 4. Secção transversal do pecíolo.
Fig. 2. Grãos de amido presentes no córtex.
Fig. 5. Secção transversal da nervura central.
5. Conclusão
As características farmacobotânicas observadas, a exemplo de tricoma tector cônico unicelular,
tricoma glandular capitado com cabeça multicelular, estômato anomocítico, folha hipoestomática,
mesofilo dorsiventral, forma ovalada da nervura central com feixe vascular colateral único, pecíolo
bicôncavo-convexo com 5 feixes vasculares colaterais dispostos em U e caule circular; e as
microquímicas, como presença de compostos fenólicos, de areia cristalina, de amido na nervura
central, pecíolo e caule, quando analisadas em conjunto auxiliam na identificação da espécie
medicinal e na diferenciação das demais Sambucus.
Referências
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Northeast of Brazil. Rev Bras Farmacogn 17: p.114-140, 2007.
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orders and families of flowering plants: APG II. Bot J Linn Soc 441: 399-436.
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pt.6, p.50-52, 1974.
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DIMITRI MJ. Enciclopedia Argentina de Agricultura y Jardineria. 3.ed. Buenos Aires: ACME v.2, 1980.
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JUDD WS, CAMPBELL CS, KELLOG EA, STEVENS PF. Plant Systematics: a Phylogenetic Approach.
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O'BRIEN, T.P., FEDER, N., MCCULLY, M.E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.
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OLIVEIRA, F.; AKISUE, G. Fundamentos de farmacobotânica. 2 ed. São Paulo: Atheneu, p.216, 1997.
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ROESER, K.R. Die Nadel der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der Natur. Mikrokosmos, v. 61, p. 33-36,
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SOUZA, W. Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicadas às Ciências Biológicas. Rio de Janeiro: Sociedade
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TAKHTAJAN AL. Diversity and Classification of Flowering Plants. Nova Iorque: Columbia University Press, 1997.
TÔRRES AR, OLIVEIRA RAG, DINIZ MFFM, ARAÚJO EC. Estudo sobre o uso de plantas medicinais em crianças
hospitalizadas da cidade de João Pessoa: riscos e benefícios. Rev. Bras Farmacogn 15: p. 373-380, 2005.
TRABALHO 21
Pesquisa Fitoquímica de Neolignanas da Espécie Medicinal Piper
solmsianum C.DC. var. solmsianum (PIPERACEAE) e Mortalidade de
larvas de Plutella xylostella
Talita Correa (G) E-mail [email protected]
Marina Delgobo (G) E-mail: [email protected]
Vanessa Lima Gonçalves Torres (PQ) E mail [email protected]
Adalci Torres (PQ) E mal: [email protected]
Rosi Zanoni da Silva (PQ) E mail:[email protected]
Resumo: Brassica oleracea var. acephala cultivar Manteiga é um dos alimentos importantes na nutrição
humana, sendo rica em minerais e vitaminas. Sua cultura é danificada por diversas pragas em especial
pela traça-das crucíferas (Plutella xylostella). O controle desta praga é feito geralmente com inseticidas. A
aplicação de extratos de plantas no controle de pragas é uma alternativa atrativa por apresentar
diminuicao na contaminacao residual. Este trabalho teve como objetivo a pesquisa fitoquimica de
neolignanas e a avaliação biológica do extrato etanólico e frações das folhas de Piper solmsianum C.DC.
variedade solmsianum conhecida popularmente como Pariparoba.O extrato bruto assim como as frações
foram analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD) usando padrão de neolignanas. O extrato
etanólico obtido por maceração e as frações hexânica, diclorometano, acetato de etila a 5% foram
utilizadas para avaliação na mortalidade de larvas de Plutella xylostella. Discos foliares de couve foram
pulverizados com as soluções até preenchimento total das folhas e oferecidos sem chance de escolha a
larvas de 1º. Instar de P. xylostella. As CCDs do extrato bruto e da fração hexânica quando reveladas com
anisaldeído revelaram manchas características de neolignanas. As CCDs das frações diclorometano,
acetato de etila e etanol reveladas com KOH a 5% em metanol e irradiação com luz UV apresentaram
fluorescências características de cumarina. A placa da fração etanólica revelada com cloreto férrico a 3%
apresentou mancha sugestiva de flavonoides. Na avaliação da mortalidade o extrato bruto, a fração
hexânica e fração diclorometano apreentaram 100% de mortalidade das larvas de P. xylostella. A espécie
Piper solmsianum C.DC. variedade solmsianum apresenta potencial como controle da praga em estudo.
Palavras-chave: Pariparoba, Plutella xylostella, mortalidade, neolignanas.
1. Introdução
As florestas tropicais são consideradas frequentemente como o mais promissor habitat para a
descoberta de novos medicamentos devido à alta biodiversidade e o endemismo. Estima-se que
existam cerca de 250 mil espécies de plantas superiores no globo terrestre e que mais da metade
destas está concentrada nestas florestas (BRESSOLIN & CECHINEL FILHO, 2003; DAVID &
NASCIMENTO & DAVID, 2004).
Diante desta realidade, nos deparamos com o interesse cada vez maior da indústria farmacêutica
mundial pelo potencial medicamentoso das florestas tropicais brasileiras. Visto sermos detentores
de uma exuberante flora, riquíssima em espécies vegetais, as quais são constituídas por
moléculas bioativas (PINTO, 2002).
Neste contexto, produtos naturais de origem vegetal constituem uma estratégia para a inovação
farmacêutica e competitividade do setor, tendo em vista a singularidade estrutural dessas
substâncias e patenteabilidade (CALIXTO,2000).
Entre a diversidade de espécies medicinais presentes na flora brasileira empregadas pela
população em virtude das suas propriedades terapêuticas, destacamos a Piper solmsianum
C.DC. var. solmsianum conhecida popularmente por pariparoba ou caapeba.
O gênero Piper é constituído por aproximadamente 700 espécies, as quais encontram-se
distribuídas em regiões tropicais e subtropicais, onde a população nativa tem usado algumas
destas plantas como condimento, agentes no controle de pestes e no tratamento de muitas
doenças. Estas espécies vegetais apresentam elevados valores comerciais, econômicos e grande
importância medicinal (SILVA, 2010).
Uma revisão sobre metabólitos secundários de espécies do gênero Piper relatou a presença das
seguintes classes de compostos bioativos: alcalóides, amidas, chalconas, diidrochalconas,
flavonas, flavanonas, terpenos, esteróides, kavapironas, fenilpropanóides, lignanas e neoliganas
(PAMAR, 1997; SILVA, 2010).
MOREIRA et al.(1995) submeteu a investigação fitoquímica os caules e folhas da espécie vegetal
Piper solmsianum C.DC. que foram coletados no município de Teresópolis-RJ. No presente
trabalho, foi possível isolar e identificar no extrato hexânico das folhas, a neolignana
Eupomatenóide-6.
A espécie medicinal Piper solmsianum C. DC., foi novamente estudada no aspecto químico por
MARTINS, et al. (2000) e nesta investigação fitoquímica, isolaram do extrato acetato de etila das
folhas e dos caules coletados no mês de junho na cidade de São Paulo/SP, cinco
fenilpropanóides, bem como, a tetrahidrofurano lignana tetrahidrofurânica denominada de (-)Grandisina
e
(7R,8R,7’S,8’R)-3’,4’-metilenodioxi-3,4,5,5’tetrametoxi-7,7’epoxilignana
(MARTINS, et al.,2000; MARTINS, et al.,2003).
Recentemente, a Piper solmsianum C.DC. variedade solmsianum investigada fotoquimicamente
por SILVA (2006) o qual envolveu processo de extração, isolamento, purificação e identificação
dos constituintes químicos das folhas de outono da Piper solmsianum. Da fração hexânica foram
isoladas três neolignanas benzofurânicas denominadas de euponatenóide-3, eupomatenóide-5 e
conocarpano. Da fração diclorometano foi isolado o conocarpano. Na fração acetato de etila
foram detectados as flavonas 7-metoxi-apigenina (genkwanina) e a orientina e duas flavanonas
hesperidina e luteolina-7-rutinosídeo. Todos estes compostos foram identificados por análises de
espectroscopia no IV, de RMN 1H, de RMN 13C e por comparação com os dados existentes na
literatura.
As lignanas e neolignanas têm atraído o interesse dos pesquisadores nestes anos devido a sua
larga distribuição na natureza, pois parecem exercer um papel importante na defesa das plantas,
atuando como agentes antimicrobianos, antifúngicos e inseticidas. Esta classe de compostos
também tem despertado grande interesse biológico em virtude de suas propriedades
terapêuticas, como: antitumoral, antiviral, antihipertensiva, sedativa, antibacteriana, inibidora do
crescimento de plantas, antifúngica, antiinflamatória, citotóxica, anti-PAF (fator de agregação
plaquetária) e anti –LTB4 (mediador químico da inflamação, leucotrieno) (OLIVEIRA, 2003).
A traça- das-crucíferas, Plutella xylostella (Linnaeus,1758) (Lepidoptera: Plutellidae) é
considerada a praga mais danosa aos cultivos de brássicas, nas diversas regiões do mundo. No
Brasil foi feito o primeiro registro de ataque desta praga no estado da Bahia, por volta de 1927,
época em que inviabilizou o cultivo de brássicas em algumas regiões do estado (BARROS, 1998).
O seu alto potencial reprodutivo somado ao grande número de espécies hospedeiras resulta em
um elevado número de gerações ao longo do ano, nas regiões produtoras de hortaliças.
Especula-se que a P. xylostella, tenha origem na região do Mediterrâneo, pois muitas espécies de
brássicas possuem origem nessa região. O adulto da P. xylostella é um microlepidóptero que
mede cerca 10 mm de comprimento, apresentando coloração parda. As fêmeas da P. xylostella
ovipositam após a realização da cópula, ovipositam preferenciamente na face dorsal das folhas e
os ovos são de coloração alaranjados; as lagartas de primeiro instar possuem coloração verde
clara, destacando-se pelo hábito minador e nos estágios posteriores, hábito desfolhador,
provocando maiores danos (BARROS, 1998).
Para minimizar os prejuízos causados pela traça-das-crucíferas em brássicas a grande maioria
dos produtores opta apenas pelo uso de inseticidas sintéticos, na tentativa de manter a população
da praga, abaixo do nível de dano econômico. Somado ao grande número de pulverizações e as
práticas manejo incorretas, como plantios sucessivos de uma mesma espécie e a não eliminação
dos restos culturais, tem contribuído para o aumento dos danos causado pela traça-dascrucíferas, além de afetar os inimigos naturais e contribuir para o aparecimento de populações
resistentes (TORRES et al, 2006).
Diante deste cenário, a busca de alternativas, como emprego de produtos naturais extraídos de
diferentes espécies de plantas, poderá contribuir de forma relevante no manejo da P. xylostella. O
uso de planta inseticida no manejo de pragas, como as da família, Rutaceae, Asteraceae e
Meliaceae, tem dado resultados significantes, devido à baixa toxicidade ao ser humano e a
eficiência na redução de população de insetos pragas. Dessa forma, estudos com diferentes
espécies botânicas, que apresentem substancias bioativas danosas a P. xylostella, podem
contribuir para o manejo integrado desta praga (TORRES, 2004).
2. Objetivos
A utilização de plantas em diversas áreas da saúde é muito comum. Deseja-se com este trabalho
isolar compostos bioativos que possam ser utilizados como controle de pragas em substituição a
inseticidas como forma de controle a agressão ao meio ambiente.
a) Coletar e dessecar as folhas de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum;
b) Preparar extratos etanólicos das folhas de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum por
maceração;
c) Fracionar os extratos etanólicos de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum por partição
líquido/líquido com extrações sucessivas utilizando solventes de polaridades crescentes;
d) Caracterizar as moléculas bioativas isoladas nas frações hexânica e diclorometano por
cromatografia em camada delgada (CCD) comparativa utilizando padrões autênticos de
neolignanas
e) Avaliar o potencial do extrato e frações de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum no indice
de mortalidade de larvas de Plutella xylostella.
3.1 Material Vegetal
3.1.1 Coleta, Identificação e Preparação do Extrato Etanólico
As folhas de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum foram coletadas no bairro Vila Estrela,
Ponta Grossa/Paraná, no mês de março de 2015. A identificação ocorreu no Museu botânico do
Rio de Janeiro pela botânica sistemática Drª. Elsie Franklin Guimarães. Uma exsicata está
depositada sob o número RB 368597. O extrato com as folhas secas e fragmentadas foi
preparado por maceração usando etanol como agente extrator e foi mantido fechado ao abrigo de
luz por uma semana. Após este período o extrato foi filtrado e concentrado em rotaevaporador a
pressão reduzida e banho-maria com temperatura controlada a 45 ºC até a completa eliminação
do solvente.
3.1.2 Partição Líquido/líquido
Para a obtenção das frações hexânica, diclorometano e acetato de ertila, o extrato etanólico bruto
das folhas foi submetido a extrações sucessivas com os solventes hexano, diclorometano, acetato
de etila e etanol, em funil de separação.
Na fração hexânica precipitou um sólido em meio a uma impureza de coloração verde escura. A
impureza apresentou-se solúvel em hexano: diclorometano (1:1mL) e o sólido em diclorometano.
Na fração diclorometano houve também presença de precipitado e ambos foram separados por
filtração. Estas frações foram analisadas por CCD em placas DC-Fertigfolien ALUGRAM® SIL G,
MARCHEREY-NAGEL®.
3.2 Métodos Cromatográficos
Marcha sistemática analítica por Cromatografia em camada delgada (CCD) - a fração hexânica,
diclorometano e acetato de etila foram submetidas ao procedimento analítico por CCD
comparativa para se detectar a presença de neolignanas, usando como padrão Conocarpano,
eupomatenoide-3, eupomatenoide -5, por meio revelação em câmara com luz ultravioleta nos
comprimentos de onda 254 e 366 nm e reveladores químicos específicos, como:
a)Lignanas e neolignanas – anisaldeído sulfúrico e aquecimento a 100oC. Observado o
desenvolvimento de manchas azuladas para lignanas e neolignanas;
b)Cumarinas – KOH 5% em metanol - observado o aparecimento de fluorescência em luz UV
(366nm);
c)Polifenóis – Cloreto férrico 3% - observado aparecimento de mancha marron escura.
3.3 Criação dos Insetos
O experimento foi realizado no Laboratório de Entomologia Aplicada da Universidade Estadual de
Ponta Grossa (UEPG) em Ponta Grossa-PR, em sala climatizada sob condições controladas de
temperatura (25 ± 2°C) e umidade 66 ± 10% e foto fase de 14 horas.
Para o estabelecimento da criação, foram coletados insetos em lavouras de brássicas no
município de Ponta Grossa-PR. Lagartas de primeiro instar foram colocadas em recipientes
plásticos retangulares (15 x 10 x 5 cm), sendo alimentados com folhas de couve manteiga da
Geórgia (Brassica oleracea L. var. acephala) adquiridas em plantações com sistema de produção
orgânico no município de Ponta Grossa, previamente sanitizadas.
As folhas de couve foram substituídas diariamente, até que as lagartas atingissem a fase pupal,
em seguida as pupas foram transferidas para células de placas de Elisa, permanecendo fechadas
com filme plástico. Após a emergência, os adultos foram transferidos para gaiolas de plásticos
transparentes, no interior de cada gaiola foram colocados discos de folha de couve, medindo 8
cm de diâmetro sobre papel filtro, umedecidos com água deionizada, para que ocorresse a
postura das fêmeas. No interior da gaiola foi adicionado um pequeno algodão embebido com
solução a 10% de diluição à base de mel para alimentação dos adultos. Os discos de couve
foram trocados a cada 24h, sendo em seguida colocados em placas de Petri, até a eclosão das
lagartas.
3.4 Bioensaio
Para montagem do bioensaio foram preparadas soluções etanólicas na concentracao 5% (p/v) do
extrato bruto seco e das frações hexânica, diclorometano e acetato de etila das folhas de Piper
solmsianum C.DC. var. solmsianum.
Após a obtenção das soluções, foram cortados discos de couve medindo 8 cm de diâmetro e
pulverizados com cada solução até o total preenchimento da folha. Os discos de couve usados
como testemunha foram pulverizados com água deionizada, alcool, hexano, diclorometano e
acetato de etila. Em seguida os discos foram colocados na câmara de fluxo de ar por 20 minutos,
para perda do excesso dos solventes.
Em seguida, foram colocadas em cada placa de Petri, 10 larvas de 1º. instar em esquema
inteiramente casualizado com oito tratamentos e 4 repetições. As placas foram mantidas no
laboratório em condições controlada de temperatura e umidade, sendo as folhas substituídas
diariamente por outras sem tretamento. Nesta troca de folhas foi anotado o numero de larvas
mortas.Tal procedimento foi realizado até que as larvas atingissem o estágio de pupa.
3.5 Análise Estatistica
Os resultados obtidos da deterrência e da mortalidade de larvas foram submetidos a análise de
variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o
programa ESTAT.
O extrato bruto seco, bem como suas frações, foi submetido ao procedimento analítico por CCD
comparativa usando padrões das neolignanas conocarpano, eupomatenóide-3 e eupomatenóide5 e revelação com anisaldeído sulfúrico seguida de aquecimento a 100ºC em estufa revelando
manchas caracteristicas de neolignanas.
As CCDs das frações diclorometano, acetato de etila e etanol reveladas com KOH a 5% em
metanol e irradiação com luz UV (366 nm) apresentaram fluorescências características de
cumarina. A placa da fração etanólica revelada com cloreto férrico a 3% apresentou mancha
sugestiva de flavonoides.
Estes resultados estão de acordo com SILVA (2006), que realizou a identificação e caracterização
das neolignanas de Piper solmsianum C.DC. var.solmsianum.
Em relação a mortalidade larval (Tabela 1), as larvas que se alimentaram de folhas de couve
tratadas com o extrato bruto , fração diclorometano, fração hexano apresentaram alto indice de
mortalidade com poucas larvas atingindo a fase de pupa. O extrato bruto e a fração
diclorometano apresentaram 100 % na mortalidade larval podendo ser associado a presença das
neolignanas.
Tabela 1. Porcentagem média de mortalidade larval de Plutella xylostella em discos de couve tratados com extrato de
folha de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum à concentração de 5% (peso/volume). T (ºC) = 25 ± 2; UR (%) =
66 ± 10; fotofase = 14 horas. Ponta Grossa (PR).
TRATAMENTO
MÉDIA DE MORTALIDADE LARVAL(%)
EXTRATO BRUTO
100,00 a
FRAÇÃO DICLOROMETANO
100,00 a
FRAÇÃO HEXANO
95,00 a
HEXANO
47,50 b
FRAÇÃO ACETATO
35,00 bc
ACETATO
27,50 cd
ALCOOL
22,50 cd
ÁGUA
20,00 cd
DICLOROMETANO
15,00 d
C.V (%)
14,62
5. Conclusão
Pela realização das CCDs comparativas foi possível identificar tanto no extrato da folha como no
do caule. Foi observada influência dos extratos no comportamento de P. xylostella tanto na
ovoposição como na alimentação da praga. Conclui-se que as partes aéreas da T. diversifolia
possuem propriedades fitoquimicas com potencial para emprego no manejo de P. xylostella.
Referências
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parasitóide Oomyzus sokolowskii (Kurdjumov). 2004. Tese (Doutorado)–Faculdade de Ciências Agrárias
eVeterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal,
TRABALHO 22
Pesquisa Fitoquímica da EspécieTithonia diversifolia (HEMSL.) A. GRAY,
ASTERACEAE e EFEITO COMO PROMOTORES DE DETERRÊNCIA NA
OVIPOSIÇÃO E MORTALIDADE DE Plutella xylostella
Marina Delgobo (G) E-mail: [email protected]
Guilherme Lopes Gonçalves (G) E-mail: [email protected]
Juliana Colman Ribeiro (G) E-mail [email protected]
Vanessa Lima Gonçalves Torres (PQ) E mail [email protected]
Adalci Torres (PQ) E mal: [email protected]
Rosi Zanoni da Silva (PQ) E mail:[email protected]
Resumo: A traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Plutellidae) é
considerada a praga mais danosa aos cultivos de brássicas. As fêmeas de P. xylostella ovipositam
preferencialmente na face dorsal das folhas e ao eclodirem as lagartas de primeiro ínstar destacam-se
pelo hábito minador dificultando o controle químico e que nos estágios posteriores, hábito desfolhador,
provocam maiores danos. A busca de alternativas, como emprego de produtos naturais extraídos de
diferentes espécies de plantas, pode contribuir de forma relevante no manejo deP. xylostella. Esta
pesquisa objetivou avaliar o efeito dos extratos etanólicos e frações de partes aéreas deThitonia
diversifolia(girassol mexicano)como promotores de deterrência na oviposição e mortalidade de larvas de P.
xylostella. Os extratos etanólicos da folha e caule da T. diversifolia foram obtidos por maceração e as
frações obtidas por partição líquido/líquido. Discos foliares de couve (Brassica oleracea var. acephala)
cultivar Manteiga foram pulverizados com soluções dos extratos das folhas e caule à concentração de 5%
até preenchimento total das folhas e oferecidos com chance de escolha para oviposição de P. xylostella.
Para o índice de mortalidade, as folhas de couve foram pulverizadas com soluções do extrato da folha e
frações à concentração de 5% até preenchimento total das folhas e colocadas em cada tratamento 10
larvas de 1º.Instar. Na análise fitoquímica os extratos analisados apresentaram presença de terpenos e
esteroides assim como cumarinas, flavonoides, antronas e taninos. O extrato bruto do caule da T.
diversifolia proporcionaram efeito deterrente na oviposição de P. xylostella superiore a 92 %. A fração
diclorometano apresentou 100 % na mortalidade larval podendo ser associado a presença de maior
quantidade de terpenos. A espécie T.diversifolia apresenta potencial para o uso no manejo da praga P.
xylostella.
Palavras-chave: P. xylostella,Thitonia diversifolia, fitoquimica.
1. Introdução
O uso de substâncias bioativas extraídos de plantas, para o controle de pragas, tem mostrado grande
potencial, devido ação que algumas substâncias apresentam. Apesar de ser uma prática milenar, o uso de
plantas com ação inseticida, ainda não é muito utilizada no manejo de pragas, a sua utilização apresenta
inúmeras vantagens em relação ao controle convencional que preconiza o uso de inseticidas sintéticos,
dentre essas vantagens estão a rápida degradação, baixo custo e a baixa toxicidade em mamíferos
(JESUS et al, 2011).
As plantas inseticidas são capazes de provocar inibição alimentar nos insetos, redução da
motilidade intestinal, interferência na síntese do ecdisônio, inibição da biossíntese da quitina,
deformações em pupas e adultos, redução da fecundidade, longevidade, esterilização, inibição na
ovoposição e mortalidade de formas imaturas e adultas (BOIÇA JUNIOR et al., 2005;JESUS et
al., 2011).
Muitos resultados indicam os efeitos de extratos vegetais de algumas espécies botânicas, sobre o
desenvolvimento da traça-das-crucíferas. No Brasil existe muitas espécies com elevado potencial
de utilização com planta inseticida, com destaque as pertencentes às famílias das Meliaceae,
Rutaceae, Asteraceae, Annonaceae, Labiateae e Canellaceae (MEDEIROS, 2005).
O girassol mexicano (Tithonia diversifolia) é uma planta herbácea originária da América Central.
Pertence à Divisão: Sphermatophyta, Classe: Dicotiledoneae, Subclasse: Metaclamídeas, Ordem:
Campanuladas, Família Asteraceae, Gênero: Tithoniae Espécie: Tithonia diversifolia (Hemsl.)
Gray (CHAGAS-PAULA,2012).
Várias classes de metabólitos secundários foram isoladas de espécies de Tithonia, incluindo
sesquiterpenos e diterpenos, fitoesteróis como também flavonoides e cumarinas(CHAGASPAULA,2012).
Mais de 150 compostos foram isolados da T. diversifolia, que é a espécie mais estudada do
gênero Tithonia. Esta espécie é rica em lactonas sesquiterpênicas, especialmente tagitininas A, C
e F. As lactonas sesquiterpênicas apresentam uma infinidade de atividades biológicas, e devido
ao seu número de anéis e substituintes, são utilizados como marcadores químicos em vários
estudos quimiossistemáticos com Asteraceae (FERREIRA et al., 2005).
As tagitininas são as lactonas sesquiterpênicas mais estudadas do gênero, principalmente
devido ao seu amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas.Um estudo
recente com uma população de T. diversifolia brasileira, mostrou que as tagitininas A, C e
F são os principais constituintes dos tricomas glandulares encontrados na superfície foliar
desta planta. Entretanto, a tagitinina C foi o composto majoritário (AMBRÓSIO et al.,
2008).
Uma grande variedade de mono e sesquiterpenos foram isolados como compostos voláteis do
óleo essencial das folhas e flores da T. diversifolia. O óleo da folha contém apineno, β-cariofileno,
germacreno D, β-pineno e 1,8-cineol, enquanto que os sesquiterpenos germacreno D, βcariofileno e biciclogermacreno são encontrados no óleo das flores (MORONKOLA et al., 2007).
As atividades biológicas de extratos vegetais brutos ou constituintes isolados de T. diversifolia são
amplamente estudadas apresentando atividades antiinflamatória e analgésica, antiviral,
antidiabética, antimicrobiana, antidiarreica, citotóxica, antiespasmódica, inseticida e repelente.
Uma atenção especial deve ser dada à obtenção do extrato bruto, porque pode apresentar efeitos
biológicos diferentes dependendo do tipo de extração e do solvente utilizado (CHAGASPAULA,2012).
2.Objetivos
a) Coletar e dessecar as folhas e caule de Tithonia diversifolia;
b) Preparar extratos etanólicos das folhas e caules de Tithonia diversifoliapor maceração;
c) Fracionar os extratos etanólicos de Tithonia diversifolia por partição líquido/líquido com extrações
sucessivas utilizando solventes de polaridades crescentes;
d) Avaliar o potencial dos extratos de Tithonia diversifoliana oviposição de Plutella xylostella;
e) Avaliar o potencial do extrato e frações de Tithonia diversifoliano índice de mortalidade de
larvas de Plutella xylostella.
3.1 Material Vegetal
3.1.1 Coleta, Identificação e Preparação do Extrato Metanólico
As folhas e caules de Tithonia diversifolia foram coletadas no Horto Medicinalda Universidade
Estadual de Ponta Grossa no mês de abril de 2015. O extrato com as folhas secas e
fragmentadas e o extrato do caule seco e fragmentado foram preparados por maceração usando
etanol como agente extrator e mantidos fechados ao abrigo de luz por uma semana. Após este
período os extratos foram filtrados e concentrados em rotaevaporador a pressão reduzida e
banho-maria com temperatura controlada a 45 ºC até a completa eliminação do solvente.
3.1.2 Partição Líquido/líquido
Para a obtenção das frações hexânica, diclorometano e acetato de ertila, o extrato etanólico bruto
das folhas e o o extrato etanólico bruto do caule foram submetidos a extrações sucessivas com
os solventes hexano, diclorometano,acetato de etila e etanol, em funil de separação.
3.2 Métodos Cromatográficos
Marcha sistemática analítica por Cromatografia em camada delgada (CCD) - a fração hexânica,
diclorometano e acetato de etila foram submetidas ao procedimento analítico por CCDpor meio
revelação em câmara com luz ultravioleta nos comprimentos de onda 254 e 366 nm e reveladores
químicos específicos, como:
a) esteroides e terpenos: anisaldeído sulfúrico e aquecimento a 100oC. Observado o
desenvolvimento de manchas azuladas ou roxas;
b)Cumarinas – KOH 5% em metanol - observado o aparecimento de fluorescência em luz UV
(366nm);
c)Polifenóis – Cloreto férrico 3% - observado aparecimento de mancha marron escura.
3.3 Ensaio sistemático de análise fitoquímica
O ensaio visa detectar a presença dos principais grupos de metabólitos secundários na espécie
vegetal em estudo, sendo avaliada a sua presença pela formação de precipitados ou coloração
característica para cada reação.
3.3.1 Pesquisa de alcalóides
Para a preparação do extrato, foi colocado em um béquer 1g do material vegetal em estudo, seco
e fragmentado com 40mL de ácido sulfúrico a 1% e levado à fervura por 5 min. Posteriormente,
filtrado em algodão e resfriado. Em seguida, alcalinizado o extrato até pH 10 com hidróxido de
amônia a 40%, usando papel indicador de pH. Depois, foi transferido o extrato alcalinizado para
um funil de separação e extraido os alcaloides com 20mL de éter etílico, agitando
cautelosamente. Foi coletado a camada etérea e filtrado em sulfato de sódio anidro. Transferir o
extrato etéreo para uma cápsula de porcelana e aquecer em banho-maria para concentração até
secura. Posteriormente, dissolver o resíduo em 2mL de ácido sulfúrico a 1% e distribuí-lo para 3
tubos de ensaio pequenos e gotejando os reativos gerais: Dragendorff, Meyer e Bourchardart.
3.3.2 Pesquisa de antraderivados
3.3.2.1Pesquisa de antraderivados por microsublimação
Foi colocadouma lâmina de microscopia sobre tela de amianto em suporte e sobreposto um anel
de vidro na lâmina. Em seguida adicionado 0,1g de material vegetal em estudo seco e moído no
interior do anel então colocado sobre o anel outra lâmina e aquecido. Realizada a trocada lâmina
superior repetidamente até obter várias preparações (resíduo amarelo). Observado ao
microscópio óptico.
3.3.2.2 Pesquisa de antraderivados livres com solventes orgânicos
Em um erlenmeyer com tampa foram colocados 4g do material vegetal em estudo seco e
fragmentado com 30mL de éter etílico, agitado e deixado em repouso por 15 minutos. Em seguida
foi filtrado, transferido para um tubo de ensaio e adicionado 2mL de hidróxido de amônio a 40%.
Os antraderivados livres são aglicônicos, que reagem com bases formando íons fenolatos
resultando em complexos coloridos.
3.3.2.3 Pesquisa de O-heterósidos antraquinônicos
Foram fervidos 4g do material vegetal em estudo seco e fragmentado com 50mL de álcool etílico
a 25% por 5 min. Em seguida, filtrado e acidificado com 30mL de ácido sulfúrico a 10% e fervido
novamente por mais 5 minutos. Resfriado e transferido o extrato para um funil de separação com
20mL de clorofórmio. Foi agitado vagarosamente para a decantação da camada clorofórmica,
filtrado com sulfato de sódio anidro e transferido para um tubo de ensaio sendo adicionado 2mL
de hidróxido de amônio a 40%.
3.3.2.4 Pesquisa de C-heterósidos antraquinônicos
Foram fervidos 4g do material vegetal em estudo seco e fragmentado em 10mL de transferir o
extrato para um funil de separação com 20mL de clorofórmio. Agitado e deixado decantar a
camada clorofórmica Em seguida foi lavado com H2O destilada. Filtrado o extrato com sulfato de
sódio anidro e transferido para tubo de ensaio. Sendo adicionado 2mL de hidróxido de amônio a
40%.
3.3.3 Pesquisa de cumarinas
Foi colocado uma lâmina de microscopia sobre tela de amianto em suporte e sobreposto anel de
vidro na lâmina. Adicionado 0,1g de material vegetal em estudo seco e moído no interior do anel e
coberto por outra lâmina e aquecico. A lâmina superior foi trocada repetidamente até obter várias
preparações (sublimado na forma de gotas incolores ou cristais aciculares). O sublimado obtido
foi diluido com 0,5mL de clorofórmio. Foi colocado 5 gotas do sublimado em duas regiões
distintas de uma fita de papel de filtro. Depois de seco adicionado uma gota de solução etanólica
de hidróxido de potássio a 10%. Observar sob luz UV (365nm).
3.3.4Pesquisa de esteróides e terpenos (Reação de Liebermann Bouchard)
Em cápsula de porcelana, foi dissolvido uma pequena porção da fração hexano e com clorofórmio
e evaporou-se o solvente até secura. Em seguida, foi dissolvido os resíduos com 1mL de anidrido
acético e transferidopara tubo de ensaio onde cuidadosamente, pelas paredes do tubo, foi
adicionado 1mL de ácido sulfúrico concentrado, sem agitar.
3.3.5 Pesquisa de flavonóides
Foram aquecidos em banho-maria por 5 minutos, 3g do material vegetal em estudo, seco e
fragmentado, com 20mL álcool etílico 70%. Posteriormente, filtrado com algodão e transferido
para 3 tubos de ensaios e 2 cápsulas de porcelana para executar as reações de identificação.
3.3.5.1 Reação de Shinoda
Foram adicionados 2mL do extrato hidroalcoólico em um tubo de ensaio e inserido três
fragmentos de magnésio metálico. Adicionado 1mL de ácido clorídrico concentrado pelas paredes
do tubo. Observado o desenvolvimento de coloração vermelha.
3.3.5.2 Reação com cloreto de alumínio (AlCl3)
Foi umedecido duas áreas diferentes de uma tira de papel de filtro com o extrato hidroalcoólico
obtido. Em seguida foi colocado sobre uma das regiões uma gota de solução etanólica de AlCl3
5% e visualizado a fluorescência em câmera fechada com luz ultravioleta a 365nm.
3.3.5.3 Hidróxido alcalino
Foram adicionadosem um tubo de ensaio 3mL do extrato aquoso e adicionado pelas paredes do
tubo 1mL de solução aquosa de NaOH 1N.
3.3.5.4 HCl concentrado
No mesmo tubo de ensaio, após a adição de base, adicionar pelas paredes do tubo 1mL de HCl
concentrado.
3.3.5.5 Pesquisa de Taubouk
Em cápsula de porcelana foram adicionados 3mL do extrato aquoso e aquecido em banhomaria
para a concentração do extrato até secura. Após resfriado, o resíduo foi umedecido com cinco
gotas de acetona e alguns cristais de ácido bórico e ácido oxálico. Evaporado novamente em
banho maria até secura, evitando aquecimento prolongado. O resíduo foi dissolvido em 3mL de
éter etílico e observado sob a luz UV 365nm.
3.3.5.6 Pesquisa de PEW
Em cápsula de porcelana foram adicionados 3mL do extrato aquoso e levado ao banhomaria para
concentração até secura.Em seguida foram adicionados 3mL de metanol e transferido o conteúdo
para tubo de ensaio e adicionado alguns fragmentos de zinco metálico e três gotas de HCl
concentrado.
3.3.5.7 Cloreto férrico
Em tubo de ensaio foram adicionados 2mL do extrato aquoso, 1mL de H2O destilada e três gotas
de solução aquosa FeCl3 1%.
3.3.6 Pesquisa de saponinas
Foram fervidos5g do material vegetal em estudo seco e fragmentado com 10mL de H2O destilada
por 2 min. Em seguida foi filtrado em algodão em um tubo de ensaio e agitado por 15 seg. Foi
marcada a altura da espuma e observado s presistencia daespuma por 15 min.
3.3.7 Pesquisa de taninos
Foram fervidos 2g do material vegetal em estudo, seco e fragmentado com 30mL de H2O
destilada em um béquer por 5 min. Em seguida, filtrado em algodão e resfriado. O extrato aquoso
foi distribuido para nove tubos de ensaio identificados para a realização das provas de
identificação para taninos.
3.3.7.1 Reação com a gelatina
Foram adicionados 0,5mL; 1mL e 2mL do extrato aquoso em três tubos de ensaio e uma gota de
HCl 10%. Em seguida, 2mL de solução de gelatina a 2,5%.
3.3.7.2 Reação com acetato de cobre
Foram adicionados 2mL do extrato aquoso em um tubo de ensaio e dez gotas de solução aquosa
de acetato de cobre a 4%.
3.3.7.3 Reação com acetato de chumbo
Foram adicionado 2mL do extrato aquoso em um tubo de ensaio e dez gotas de solução aquosa
de acetato de chumbo 10%.
3.3.8 Pesquisa de taninos hidrolisáveis
3.3.8.1 Reação com acetato ácido de chumbo
Em um tubo de ensaio foram adicionados 3mL do extrato aquoso e 5mL de ácido acético glacial a
10% e 3mL de solução de acetato de chumbo a 10%.
3.3.8.2 Reação com FeCl3
Em um tubo de ensaio foram adicionados 2mL do extrato aquoso e diluido com 1mL de H2O
destilada. Em seguida adicionado três gotas de solução de FeCl3 1%.
3.3.9 Pesquisa de taninos condensados
3.3.9.1 Água de bromo
Em tubo de ensaio foram adicionados 2mL do extrato aquoso e cinco gotas de água de bromo.
3.4 Criação dos Insetos
O experimento foi realizado no Laboratório de Entomologia Aplicada da Universidade Estadual de
Ponta Grossa (UEPG) em Ponta Grossa-PR, em sala climatizada sob condições controladas de
temperatura (25 ± 2°C) e umidade 66 ± 10% e foto fase de 14 horas.
Para o estabelecimento da criação, foram coletados insetos em lavouras de brássicas no
município de Ponta Grossa-PR. Lagartas de primeiro instar foram colocadas em recipientes
plásticos retangulares (15 x 10 x 5 cm), sendo alimentados com folhas de couve manteiga da
Geórgia (Brassica oleracea L. var. acephala) adquiridas em plantações com sistema de produção
orgânico no município de Ponta Grossa, previamente sanitizadas.
As folhas de couve foram substituídas diariamente, até que as lagartas atingissem a fase pupal,
em seguida as pupas foram transferidas para células de placas de Elisa, permanecendo fechadas
com filme plástico. Após a emergência, os adultos foram transferidos para gaiolas de plásticos
transparentes, no interior de cada gaiola foram colocados discos de folha de couve, medindo 8
cm de diâmetro sobre papel filtro, umedecidos com água deionizada, para que ocorresse a
postura das fêmeas. No interior da gaiola foi adicionado um pequeno algodão embebido com
solução à 10% de diluição à base de mel para alimentação dos adultos. Os discos de couve
foram trocados a cada 24h, sendo em seguida colocados em placas de Petri, até a eclosão das
lagartas.
3.4 Bioensaio
3.4.1Preparação dos discos
Para montagem do bioensaio foram preparadas soluções etanólicas na concentração 5% (p/v) do
extrato bruto seco e das frações hexânica, diclorometano e acetato de etila das folhas e caule de
T.diversifolia.
Após a obtenção das soluções, foram cortados discos de couve medindo 8 cm de diâmetro e
pulverizados com cada solução até o total preenchimento da folha. Os discos de couve usados
como testemunha foram pulverizados com água deionizada, álcool, hexano, diclorometano e
acetato de etila. Em seguida os discos foram colocados na câmara de fluxo de ar por 20 minutos,
para perda do excesso dos solventes.
3.4.2 Efeito na ovoposição de P. xylostella
Os discos foram cortados em quatro partes iguais e remontados,sendo dois triângulos tratados
com os extratos e testemunhas e dois tratados com água deionizada em esquema inteiramente
casualizado com 4 tratamentos (extrato bruto seco das folhas, extrato bruto seco do caule, etanol
e hexano) e 4 repetições
Em cada gaiola, foi introduzido um casal de P. xylostella com 24 horas de idade, oriundos da
criação do laboratório, mantidos por dois dias para oviposição, realizando-se diariamente a
contagem dos ovos.
3.4.2 Efeito na biologia da P. xylostella
Após o preparo dos discos, eles foram colocadas em cada placa de Petri, juntamente com 10
larvas de 1º. instar em esquema inteiramente casualizado com 9 tratamentos (extrato bruto das
folhas, extrato bruto do caule, frações hexano, diclorometano e acetato de etila das folhas) e 4
repetições. As placas foram mantidas no laboratório em condições controlada de temperatura e
umidade, sendo as folhas substituídas diariamente por outras sem tratamento. Nesta troca de
folhas foi anotado o número de larvas mortas.Tal procedimento foi realizado até que as larvas
atingissem o estágio de pupa.
3.5 Análise Estatistica
O efeito deterrente foi avaliado através da fórmula: PD = (NC – NT)/(NC+ NT) x 100, adaptada de
OBENG-OFORI (1995), sendo PD, a porcentagem média de deterrência; NC, onúmero de ovos
no tratamento com água deionizada ; e NT,o número de ovos em cada tratamento. Classificadose da seguinte forma: Deterrente PD> 0 e Neutro: PD < 0. Cada gaiola contendo um casal da
praga correspondia a uma repetição.
Os resultados obtidos da deterrência e da mortalidadede larvas foram submetidos a análise de
variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o
programa ESTAT.
O extrato bruto seco das folhas e caule, bem como suas frações, foram submetidos ao
procedimento analítico por CCD e revelação com anisaldeído sulfúrico seguida de aquecimento a
100ºC em estufa revelando manchas caracteristicas de terpenos (lactonas sesquiterpênicas).
As CCDs das frações diclorometano, acetato de etila e etanol reveladas com KOH a 5% em
metanol e irradiação com luz UV (366 nm) apresentaram fluorescências características de
cumarina. A placa da fração etanólica revelada com cloreto férrico a 3% apresentou mancha
sugestiva de flavonoides e taninos.
O ensaio sistemático de análise fitoquímica, representado na Tabela 1, mostra os principais
componentes encontrados no extrato bruto da folha e extrato bruto do caule. Conforme estudos
de Chagas-Paulaet al (2012), a espécie T. diversifolia apresenta lactonas sesquiterpênicas,
antraderivados, cumarinas, taninos e flavonóides.
Tabela 1 – Ensaio sistemático de análise fitoquimica dos extratos de Folha e caule de T. diversifolia
Grupo
Análise
Folha
Caule
Alcaloides
Draggendorf
Meyer
Bouchardart
Antraderivados
Borntraeger (C- heterósido)
Borntraeger (O-heterósido)
+
+
Antrona
Antrona
Cumarinas
CCD (KOH 10% + Fluorescência 365 nm)
+
+
Esteroides/Terpenos
Liebermann Bouchard
+
+
Flavonoides
Shinoda
AlCl3
+
+
Hidróxido Alcalino
+
+
HCl Concentrado
+
+
Taubouk
+
+
PEW
FeCl3
+
+
Saponinas
Espuma Persistente
Taninos
Acetato de Cobre
+
+
Acetato de Chumbo
+
+
Taninos Hidrolisáveis
Acetato Ácido de Chumbo
FeCl3
+
+
Taninos Condensados
Água de Bromo
Fonte: os autores
Na avaliação do efeito deterrente (Tabela 2) houve uniformidade da postura sobre os discos de
folha de couve imersos em água deionizada, uma vez que a porcentagem de deterrência (PD) foi
igual a 4,47 %, significando que a quantidade de ovos colocados foi similar nos triângulos de
folhas de couve expostos à oviposição da praga, resultando em índice baixo em relação aos
demais tratamentos. O extrato bruto do caulede Tithonia diversifoliapromoveu efeito deterrente de
92,85% na oviposição de P. xylostella, enquanto o extrato bruto das folhas proporcionou baixa
porcentagem de deterrência (38,32 %) quando comparado com o extrato de caule da mesma
planta.Os solventes hexano (27,42 %) e álcool etílico (23,20 %) exerceram influência na
oviposição de P. xylostella uma vez que foram semelhantes ao extrato de folhas de T. diversifolia
e diferiram da testemunha (4,47 %), porém com baixa porcentagem de deterrência.
Tabela 2. Porcentagem média (± IC) de deterrência para oviposição de Plutella xylostella em discos de couve
tratados com extratos de espécies vegetais à concentração de 5% (peso/volume). T (ºC) = 25 ± 2; UR (%) = 66 ± 10;
fotofase = 14 horas. Ponta Grossa (PR).
Tratamento
Porcentagem de deterrência (PD)*
Tithonia diversifolia (Caule)
92,85 ± 2,17 a
Tithonia diversifolia (Folhas)
38,32 ± 0,80 b
Hexano
27,42 ± 3,24 b
Álcool
23,20 ± 2,93 bc
Testemunha (água)
4,47 ± 2,53 c
C.V.(%)
18,62
*
Médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Jesus et al (2011), estudaram o efeito de plantas inseticidas, Azadirachta indica, Sapindus saponária,
Dimorphandra molis e Stryphnodendron adstringens, em teste com chance de escolha e observaram
redução do número de ovos de P. Xylostella. Efeito semelhante foi observado por Torreset al. (2006).
Um efeito antialimentar utilizando o extrato CH2Cl2 das folhas frescas de T. diversifolia, em concentrações
de 1 a 5%, foi observado na larva Chlosyne lacinia (Lepidoptera). As larvas evitaram os discos
umedecidos com o extrato e o efeito deterrente foi atribuído à presença de lactonas sesquiterpênicas
(AMBRÓSIO et al., 2008).
Em relação a mortalidade larval (Tabela 3), as larvas que se alimentaram de folhas de couve tratadas com
o extrato bruto, fração diclorometano, fração hexano, fração acetato de etila apresentaram alto indice de
mortalidade com poucas larvas atingindo a fase de pupa. A fração diclorometano apresentou 100 % na
mortalidade larval podendo ser associado a presença de maior quantidade de terpenos.
Tabela 3. Porcentagem média de mortalidade larvalde Plutella xylostella em discos de couve tratados com extrato da
folha de Tithonia diversifolia à concentração de 5% (peso/volume). T (ºC) = 25 ± 2; UR (%) = 66 ± 10; fotofase = 14
horas. Ponta Grossa (PR).
TRATAMEMTO
MÉDIA DE MORTALIDADE LARVAL(%) *
FRAÇÃO DICLOROMETANO
100,00 a
FRAÇÃO HEXANO
97,50 a
EXTRATO BRUTO
95,00 a
FRAÇÃO ACETATO
92,50 a
HEXANO
47,50 b
ACETATO
27,50 bc
ALCOOL
22,50 c
TESTEMUNHA
20,00 c
DICLOROMETANO
15,00 c
C. V.
14,62%
*
Médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
5. Conclusão
Pela análise fitoquímica foi possível verificar a presença de terpenos, cumarinas, flavonoides, antronas e
taninos tanto no extrato da folha como no do caule. Foi observada influência dos extratos no
comportamento de P. xylostella tanto na ovoposição como na alimentação da praga. Conclui-se que as
partes aéreas da T. diversifoliapossuem propriedades fitoquímicas com potencial para emprego no manejo
de P. xylostella.
Referências
AMBROSIO, S.R. et al.Constituents of glandular trichomes of Tithonia diversifolia: relationships to herbivory and
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desenvolvimento e oviposição de Plutella xylostella. Bragantia. Vol. 65, p.447-457, 2006.
TRABALHO 23
Perfil de ação antioxidante do cetoprofeno, associado ou não ao
flavonóide rutina, frente aos modelos HOCl e Ânion Superóxido.
Anderson Gustavo Santos (G) E-mail: [email protected]
Caroline Belló (PG) E-mail: [email protected]
José Carlos Rebuglio Vellosa (PQ) E-mail: [email protected]
Resumo: Estudos recentes têm demonstrado que citocinas, como o TNF-α e IL-1β, produzidas durante a
resposta inflamatória, promovem aumento na síntese de espécies reativas de oxigênio participantes do
estresse oxidativo. A utilização de anti-inflamatórios, como o cetoprofeno em associação com
antioxidantes naturais, como a rutina, podem ser uma alternativa viável na defesa do organismo contra
estas espécies deletérias.Desta forma, é objetivo deste trabalho a investigação da ação do cetoprofeno
diante de diferentes espécies reativas, e se a associação deste fármaco com a rutina altera este perfil.
Para isso foram empregados os ensaios modelos de espécies reativas de oxigênio: HOCl e Ânion
Superóxido in vitro, em diferentes concentrações. Os resultados são expressos como inibição radicalar
máxima alcançada.Verificou-se atividade antioxidante significativa da rutina nas metodologias utilizadas,
corroborando com pesquisas semelhantes. O cetoprofeno, entretanto, não apresenta atividade
antioxidante significativa. Isso pode ser observado através dos valores de inibição máxima sobre as
espécies reativas, obtendo-se 36,9% (±2,7%) e 31,74% (±0,68%) de inibição máxima pelo cetoprofeno e
61,25% (±2,7%) e 61,64% (±2,5%) pela rutina, nas metodologias HOCl e Ânion Superóxido,
respectivamente. Quando estes compostos são associados, a inibição máxima alcançada frente o HOCl foi
de 92,22% (±0,3%) e no Ânion Superóxido foi de 44,3%(±0,68%). Por meio destes resultados, pode-se
concluir que o cetoprofeno não possui atividade scavenger nos modelos experimentais utilizados. Estes
dados sugerem que o cetoprofeno interfere na capacidade antioxidante da rutina e a associação destes
compostos pode ser uma alternativa viável ao combate do estresse oxidativo.
Palavras-chave: Antioxidantes, Cetoprofeno, Rutina, Estresse oxidativo.
1. Introdução
Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) estão entre os medicamentos mais vendidos no
mundo. Sua comercialização atinge um montante de cerca de 73 milhões de prescrições anuais
em todo o mundo. Diante disto é possível identificar sua ampla aplicabilidade na clínica médica,
principalmente no tratamento da dor, febre e inflamação (LASTRAet al. 2002). O cetoprofeno
exerce os seus efeitos por inibição não seletiva da COX-1 e COX-2, as enzimas-chave que
convertem o ácido araquidônico em prostaglandinas e tromboxanos (LIUet al. 2010). Os AINEs
afetam uma grande variedade de sistemas antioxidantes enzimáticos, incluindo glutationa
peroxidase, glutationa redutase, xantina oxidase, superóxido dismutase e da mieloperoxidase,
resultando no aumento da concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) dentro da
célula, causando danos irreversíveis (LASTRAet al. 2002; CHENGet al. 2013).
Estudos epidemiológicos indicam que os usuários AINEs têm um maior risco de ulceração
gastrointestinal do que os pacientes que não estão tomando AINEs (CHENGet al.2013). A
geração de EROs e apoptose associada foram mostrados por induzir toxicidade gastrointestinal
(KUSUHARAet al. 1999). Assim, o estresse oxidativo no trato gastrintestinal é considerado cada
vez mais ocasionador de úlceras (ASENSIOet al. 2007).
A geração do processo de estresse oxidativo decorre de um desequilíbrio entre os compostos
oxidantes e antioxidantes, resultando no aumento excessivo da produção de radicais livres, ou na
diminuição da velocidade de eliminação destes. Estes processos conduzem a oxidação de
biomoléculas que acabam perdendo sua função biológica levando a um desequilíbrio
homeostático. A produção excessiva e crônica de radicais livres tem papel importante sobre o
processo fisiológico de diversas patologias. (BARBOSA et al. 2010).
A rutina, também conhecida como vitamina P, um derivado natural de flavonas, foi descoberta no
trigo mourisco no século XIX. É um composto polifenólico de baixo peso molecular que é
amplamente distribuído entre os vegetais e frutas. O trigo mourisco é o alimento com maior teor
de rutina. (JIANGet al. 2007). Ela é amplamente utilizada no tratamento de doenças, possuindo
várias atividades farmacológicas incluindo atividade antialérgica, anti-inflamatória, vasoativa,
antitumoral, antiviral, antibacteriana e antiprotozoária (CALABRÒet al.2005).
Estudos em modelos animais também indicaram que ela é utilizada para proteção da mucosa
gástrica, uma vez que previne o estresse oxidativo. (BARNAULOW, MACHINEVA&
KAMISSARENKO, 1983). Todos estes efeitos são resultado da sua alta capacidade de
eliminação de radicais e da sua atividade antioxidante (GUO, WEI, & LIU, 2007).
Estas propriedades são de alta importância na prevenção de doenças e na proteção da
estabilidade do genoma. Alguns estudos também indicam o efeito dose-resposta da rutina sobre a
diminuição da concentração de colesterol LDL em animais. (JIANG et al. 2007). O aumento da
concentração de colesterol HDL também foi observado através de experimentos animais, sendo
este fato explicado pela atividade inibitória da enzima superóxido dismutase. (RODRIGUES et. al.
2003).
Produtos naturais são, em geral, capazes de agir sobre oxidantes e radicais livres e, desta forma,
a associação entre a rutina e o cetoprofeno parece promissora na atenuação de efeitos tóxicos
relacionados ao estresse oxidativo ou ainda na intensificação da ação anti-radicalar por meio de
sinergismo sobre estas espécies reativas.
2. Objetivos
O objetivo deste trabalho foi comparar o perfil da atividade antioxidante da rutina, do cetoprofeno
e da associação entre a rutina e o cetoprofeno.
3.1 Preparo das Soluções de Rutina e Cetoprofeno
Para cada teste foram preparadas soluções com 3 concentrações diferentes para cada
substância. Estas soluções foram preparadas através da diluição da rutina ou do cetoprofeno em
metanol, sendo que tal solvente foi utilizado por Araújo (2012) para a dissolução da rutina, na
realização dos modelos experimentais utilizados em sua pesquisa.
Foram pesados 5mg de cetoprofeno, marca Fragon®, com 100% de pureza, e adicionado a 5 ml
de metanol, resultando numa solução de 1mg/ml de cetoprofeno. Após o preparo desta solução,
se preparou a solução de 0,1mg/ml onde foram retirados 500 microlitros da solução 1mg/ml e
adicionados a 4,5ml de metanol. Seguinte ao preparo desta, foi realizado o preparo da solução de
0,01mg/ml onde se seguiu o mesmo raciocínio da diluição anterior, retirando 500 microlitros da
solução 0,1mg/ml e adicionando a 4,5ml de metanol.
As soluções contendo rutina, marca Sigma-Aldrich®, foram realizadas da mesma maneira, porém
foram pesados 5,3mg uma vez que a pureza desta era de 95%.
3.2 Atividade Scavenger do Ácido Hipocloroso (HOCl)
O ácido hipocloroso é um forte agente oxidante que está presente em células humanas como os
neutrófilos, e que por isso, contribui para a destruição de bactérias. Ele é produzido através das
mieloperoxidases, que catalisam as reações de oxidação dos íons cloro com o H2O2, resultando
na formação do HOCl. (SÁNCHEZ-MORENO, 2002).
O modelo experimental foi realizado segundo Costa et al. (2004), com algumas modificações, o
qual cita que o princípio do teste se baseia no fato de que o composto testado só é um bom
scavenger do HOCl quando ele é capaz de competir com o TMB (ácido 5-tio-2-nitrobenzoico) pela
oxidação causada pelo HOCl.
O experimento foi realizado através da incubação das amostras durante 10 minutos contendo
tampão fosfato de sódio (50mM e pH 7,4), rutina, TMB (2,8mM) e HOCl (30µM). O mesmo foi
realizado para as amostras contendo cetoprofeno e associação de cetoprofeno e rutina.
A avaliação do teste foi realizada através da determinação da absorbância em espectrofotômetro
no comprimento de onda de 652nm.
3.3 Atividade Scavenger do Ânion Superóxido (O2-)
O ânion superóxido é o primeiro produto da redução da molécula de O2. Segundo Robak;
Gryglewski (1988), o O2-, que é produzido pelo NADH e MSF (metossulfato de fenazina), ao
entrar em contato com a solução de NBT (nitro-blue tetrazolium), reduz este composto formando
o cromóforo formazana. E a adição de qualquer composto que reaja com o O2-, inibe a formação
do formazana, reduzindo a formação de coloração.
A metodologia utilizada foi segundo o mesmo autor citado acima na descrição deste teste. Os
testes foram realizados através da incubação das amostras durante 2 minutos contendo tampão
fosfato de sódio (100mM e pH 7,4), MSF, NBT (68,4 µM), rutina e NADH. O mesmo foi realizado
para as amostras contendo cetoprofeno e associação de cetoprofeno e rutina. A incubação não
foi realizada nas amostras “branco”.
A avaliação do teste foi realizada através da determinação da absorbância em espectrofotômetro
no comprimento de onda de 560nm.
Através dos resultados obtidos em absorbância, pode-se calcular os valores de inibição radicalar
máxima utilizando-se o software GraphPrisma.
4.1 Ácido Hipocloroso
Flavonóides como a rutina e a quercetina podem inibir a atividade de mieloperoxidases em
neutrófilos, e consequentemente, previnem a liberação do ácido hipocloroso. (FREI, 2012).
A rutina, frente ao modelo do HOCl, apresentou percentuais de inibição radicalar máxima de
61,25% (±2,7%).
Figura 1. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de rutina
isoladamente, obtidos no teste do Ácido Hipocloroso (HOCl).
O cetoprofeno apresentou valores de inibição radicalar máxima de 36,9% (±2,7%),
coincidindo com os resultados apresentados por Manente et al. 2011, onde esta cita que o
cetoprofeno apresentou 31,2% de inibição máxima numa concentração de 20µg/ml.
Figura 2. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de cetoprofeno
isoladamente, obtidos no teste do Ácido Hipocloroso (HOCl).
A associação entre a rutina e o cetoprofeno se mostrou benéfica, uma vez que aumentou o
percentual de inibição radicalar máxima em relação ao cetoprofeno isoladamente, resultando em
92,22% (±0,3%).
Figura 3. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de associação entre
a rutina e o cetoprofeno, obtidos no teste do Ácido Hipocloroso (HOCl).
4.2 Ânion Superóxido
Estudos recentes têm demonstrado que compostos fenólicos como as catequinas e flavonóides,
como a rutina, são importantes antioxidantes e scavengers do ânion superóxido. (BENAVENTEGARIA et al. 1997)
Através dos valores de absorbância foi obtido os valores de inibição radicalar máxima, aonde a
rutina isoladamente apresentou 61,64% (±2,5%) de inibição. Tal resultado se encontra compatível
com os resultados apresentados por J. Yang et al.(2008), o qual demonstrou uma inibição de
aproximadamente 55% para uma concentração de 0,2mg/ml de rutina.
Figura 4. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de rutina
isoladamente, obtidos no teste do Ânion Superóxido.
O cetoprofeno, por outro lado, apresentou valores de 31,74% (±0,68%)de inibição radicalar
máxima, o que contrasta com o que foi proposto por Manente et al. 2011, que apesar de ter
utilizado concentrações menores, propõe que o cetoprofeno isoladamente não apresenta
atividade antioxidante significativa se comparado com o branco, no modelo do ânion superóxido.
Figura 5. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de
cetoprofeno isoladamente, obtidos no teste do Ânion Superóxido.
Já a associação entre o cetoprofeno e a rutina apresentou um resultado superior ao
demonstrado pelo cetoprofeno isoladamente, obtendo um valor de 44,3% (±0,68%) de inibição
radicalar máxima, o que indica que a associação entre a rutina e o cetoprofeno é mais eficiente
do que o cetoprofeno isolado.
Figura 6. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml da solução de associação entre
a rutina e o cetoprofeno, obtidos no teste do Ânion Superóxido.
5. Conclusão
Através dos resultados obtidos, podemos observar que a rutina apresentou percentual de inibição
radicalar máxima maior do que o cetoprofeno nos dois testes realizados, indicando que esta
apresenta uma maior capacidade scavenger dentro dos modelos propostos.
A associação entre a rutina e o cetoprofeno apresentou-se benéfica no modelo do HOCl,
aumentando a inibição máxima em relação ao cetoprofeno e à rutina isoladamente, o que
contrasta com o resultado obtido no modelo do Ânion Superóxido, que apesar de a associação
obter uma inibição maior que o cetoprofeno isoladamente, esta se comportou de maneira menos
eficaz que a rutina isoladamente, o que pode sugerir que por algum mecanismo não conhecido a
rutina interfere na capacidade de captura desta espécie reativa provocado pelo cetoprofeno.
Referências
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TRABALHO 24
Desenvolvimento de um Método Qualitativo para Detecção de
Adulterantes no Leite
Autor 1 (G) Geisamara Janaina Carneiro E-mail: [email protected]
Autor 2 (PQ) Júlio Miné E-mail: [email protected]
Autor 2 (PQ) Stella Bortoli E-mail: [email protected]
Resumo: O leite é um dos alimentos mais utilizados pela população em todas as faixas etárias, muito
importante para o crescimento e desenvolvimento, principalmente pelo seu alto teor de cálcio, vitaminas e
minerais; além de ser fonte de energia e proteínas com grande poder nutritivo. Por este motivo tanto a
produção de leite quanto o controle da sua qualidade são pontos importantes para a economia.
Recentemente foram reportados casos de adulteração, o que é relevante para a saúde pública. Esses
casos são notificados pelas agências responsáveis pelo controle de qualidade do leite e noticiados à
população pela imprensa. As adulterações configuram fraude e algumas delas representam risco de
intoxicação para o consumidor. Existem diferentes tipos de adulterações, com diversas finalidades, seja
para aumentar a qualidade do produto final ou mascarar alguns aspectos que comprometem a integridade
quando este está próximo da sua validade. O objetivo dessa pesquisa é uma análise prática compilando
as principais adulterações no leite encontradas ultimamente com relevância toxicológica. Neste trabalho
foram analisados a presença de formaldeído, peróxido de hidrogênio, hipocloritos e hidróxido de sódio em
diferentes concentrações por metodologia colorimétirca. O desenvolvimento dos métodos propostos
permitiu a detecção de concentrações mínimas de alguns adulterantes encontrados em fraudes do leite. A
possibilidade de utilização desses métodos em campo é de grande ajuda como indicativo de detecção de
alteração. Assim tornou-se possível a análise da qualidade do leite comercializado, a fim de fornecer uma
metodologia simples, rápida e segura para identificação da fraude no leite.
Palavras-chave: Leite, adulteração, toxicidade, desenvolvimento de metodologia, colorimetria.
1. Introdução
O leite é um alimento natural, com alta concentração de água, com composição química variada
entre as espécies, sendo a composição do leite de bovinos em média: 87% de água; 3,7 % de
gorduras; 4,9 % de lactose; 3,5 % de proteínas variadas, entre elas: caseína, β-lactoglobulina, αlactoalbumina, soroalbumina e imunoglobulina e 0,7 % de minerais. Destinado a produzir um
rápido desenvolvimento dos mamíferos recém-nascidos (PRATA, 2001).
Entende-se por leite, sem outra especificação, o produto oriundo da ordenha completa,
ininterrupta em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas
(BRASIL, 2002).
Sendo o Brasil um grande produtor de leite é de suma importância que haja métodos que
garantam a correta detecção de adulteração do alimento, para melhoria da qualidade de vida do
ser humano. E assim se garantam alimentos saudáveis, com alto valor nutricional, disponíveis e
acessíveis à população. Desde o nascimento do ser humano, o leite apresenta-se quase
indissociável de sua alimentação. Os avanços nas técnicas relacionadas às etapas de produção,
processamento e distribuição do leite têm favorecido ainda mais o seu consumo humano. Essas
etapas, porém, induzem a alterações bioquímicas, físico-químicas, microbiológicas, nutricionais,
sensoriais e reológicas (no comportamento mecânico) que podem comprometer a qualidade do
produto final. A análise do leite tornou-se muito importante para a garantia de qualidade do
produto.
A produção de leite de boa qualidade é um desafio que pode ser alcançado desde que alguns
cuidados sejam tomados na fonte de produção. A qualidade deve ser vista como um somatório de
esforços que inclui melhoramento genético, bom manejo nutricional, controle sanitário, práticas
higiênicas de ordenha, resfriamento do leite em baixa temperatura nas propriedades, transporte
rápido e em condições apropriadas até as indústrias (Cerqueira et al. 2009).
A Rede Brasileira de Qualidade do leite, foi criada pelo Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento - MAPA em 18 de abril de 2002 pela Instrução Normativa nº 37, com a finalidade
de dar suporte analítico aos leites crus refrigerados, visando à ampliação da Instrução Normativa
nº 51, no Brasil (MAPA, 2002).
O Brasil é um grande produtor e consumidor de leite e com esse consumo muitos casos de
adulteração são observados. Esses casos são notificados pelas agências responsáveis pelo
controle de qualidade do leite e alguns são noticiados à população pela imprensa. As
adulterações configuram fraude e consequente risco de intoxicação para o consumidor. Existem
diferentes tipos de adulterações, com diversas finalidades, tais como: aumentar o volume,
mascarar acidez, recompor a aparência; objetivando sempre lucro para empresas e
distribuidores.
Com a regulamentação da produção de leite e definição de parâmetros de qualidade, o
desenvolvimento de métodos analíticos quantitativos e qualitativos foi um dos pilares para o
processo de busca por alimentos seguros, e o incentivo para os pesquisadores.
A adulteração pode ser feita ao produto em diferentes fases da cadeia de produção, por isso uma
preocupação é identificar a adulteração assim que ela é desenvolvida, pelo histórico fica evidente
o perfil reativo, ou seja, a adulteração precisa ocorrer primeiro para que depois os métodos sejam
desenvolvidos para identificá-la.
Vários são os aspectos avaliados nas análises de rotina do leite, entre eles: características
sensoriais (odor, cor, sabor); características físico químicas (densidade, pH, acidez, teor de
gordura e proteínas); controle microbiológico; pesquisa de neutralizantes de acidez e
reconstituintes de densidade, pesquisa da presença de resíduos de antibióticos e outros
medicamentos de uso veterinário, entre outros (MAPA, 2006).
Os principais adulterantes encontrados no leite são a adição de soro, adição de água, alteração
da composição, adição de reconstituintes, adição de neutralizantes, adição de conservantes,
adição de leite em espécies diferentes, adição de gorduras não lácteas.
O uso fraudulento de hidróxido de sódio tem a finalidade de substituir as boas práticas na
produção/processamento do leite, pois a intenção é enquadrar um leite fora do padrão em relação
a acidez, em um leite padronizado. É considerado agente tóxico para ingestão. Não é permitido
para uso em leite por induzir a fraude e mascarar as boas práticas de fabricação (ANVISA, 2007).
O hipoclorito é utilizado como conservante, exercendo ação sobre o desenvolvimento de
microrganismos, retardando a multiplicação (TRONCO, 2008).
O peróxido de hidrogênio pode ser adicionado de forma fraudulenta ao leite com a função de
prevenir a proliferação de microrganismos, naturalmente presentes no leite. (MAPA, 2014).
O formol possui ação antimicrobiana, usado como conservante no leite (TRONCO, 2010).
Atualmente as adulterações no leite ficaram mais sofisticadas e outros produtos passaram a ser
adicionados com diferentes finalidades. Além disso, a adulteração passou a ser praticada por
diferentes elos da cadeia de produção, como produtores, transportadores e indústrias. Alguns
casos de adulteração no leite ganharam destaque nos jornais nos últimos meses deflagrando
inclusive a “Operação Leite Compensado” pelo Governo Federal e Ministério da Agricultura e
Pecuária onde o objetivo foi intensificar a fiscalização e identificar os fraudadores. Por este motivo
é de extrema importância a detecção dos contaminantes de interesse toxicológico por um método
prático, rápido e de fácil execução de modo que possa ser usado em campo, com a finalidade de
proteger o consumidor final.
2. Objetivo
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método qualitativo para detecção da menor
concentração possível de alguns adulterantes presentes no leite que tenham interesse
toxicológico por conferir risco para saúde humana. Para isso foi realizado levantamento dos
principais adulterantes do leite e desenvolvido métodos colorimétricos, semi-quantitativos para a
detecção de peróxido de hidrogênio, formaldeído, hidróxido de sódio e hipoclorito em amostras de
leite.
3.1 Materiais
Caixa de leite de diferentes marcas, hidróxido de sódio, formaldeído, peróxido de hidrogênio,
hipoclorito de sódio, pipetas, pipetadores, tubos de ensaio, estantes para tubos de ensaio, bastão
de vidro, solução de azul de bromotimol, iodeto de potássio, solução de ácido acético, banhomaria, termômetro, água destilada, ácido sulfúrico a 1M, solução de reagente de Schiff, fucsina,
sulfito de sódio heptaidratado, balão volumétrico, béquer, funil de vidro, carvão ativado, papel de
filtro.
3.2 Métodos
A amostra de leite utilizada foi comprada no comércio de Ponta Grossa e adulterada com os
diferentes compostos empregados para tais práticas em diferentes concentrações.
3.2.1 Pesquisa de Peróxido de Hidrogênio
Foi realizado diluições da solução de peróxido de hidrogênio 200 volumes em leite nas seguintes
concentrações: 0,5%, 1%, 3%, 6% e 9%.
Em um tubo de ensaio foram colocados 2 mL de leite e adicionado gotas de iodeto de potássio a
10%.
O preparo do reagente foi realizado pesando 10,05 g de iodeto de potássio, dissolvido em água
destilada e completado o volume de 100 ml com água destilada no balão volumétrico.
3.2.2 Pesquisa de Hidróxido de Sódio
Foi preparada solução de hidróxido de sódio a 0,05 M e realizada a diluição em leite nas
concentrações: 0,05%, 0,10%, 0,15%, 0,25%, 0,5%, 0,75% e 1%.
Em tubo de ensaio foram colocados 5 mL de leite e adicionado 4 gotas de solução de azul de
bromotimol.
A solução do indicador azul de bromotimol foi obtida com o aquecimento de 1 g do indicador com
3,2 ml de solução 0,05 M de hidróxido de sódio e 5 ml de etanol a 90%. Após a dissolução foi
completado o volume de 250 ml com etanol a 90%, obtendo uma solução 0,004 mg/ml do
indicador (ANVISA, 2010).
3.2.3 Pesquisa de Formaldeído
Foi realizado diluições da solução de formaldeído a 37%, em leite, nas concentrações: 0,005%,
0,01%, 0,05%, 0,10%, 0,15% e 0,25%.
Foram colocados 2 mL de leite em tubo de ensaio e adicionado gotas de ácido sulfúrico 1 M, em
seguida foram adicionados 2 mL do reagente de Schiff. Após agitação, foi deixado em repouso
por 5 min.
Para o preparo do reagente de Schiff foi pesado 100 mg de fucsina em béquer e dissolvido em 75
ml de água a 80ºC. Após resfriamento foi acrescentado 2,5 g de sulfito de sódio heptaidratado, foi
adicionado carvão ativado e posteriormente a solução foi filtrada com papel de filtro e completado
o volume para 100 ml com água destilada (ANVISA, 2008).
3.2.3 Pesquisa de Hipoclorito
Foi realizado diluições da solução de hipoclorito de sódio a 12%, em leite, nas concentrações:
0,025%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,3%, 0,4% e 0,5%.
Em tubo de ensaio foi misturado5 mL de leite com gotas de solução de iodeto de potássio à 7,5%
e agitado para detecção da presença de cloro livre. Para pesquisa do adulterante hipoclorito foi
adicionado ao tubo 4 mL de solução de ácido acético, colocado em banho-maria a 80 ºC por 10
minutos e posteriormente resfriado em água corrente.
O reagente iodeto de potássio a 7,5% foi preparado pesando 7,5 g de iodeto de potássio, diluído
em água destilada e completado o volume para 100 ml com água destilada.
A amostra de leite foi comprada no comércio de Ponta Grossa e adulterada com os diferentes
compostos utilizados para fraudar o leite: formaldeído, hidróxido de sódio; hipoclorito de sódio e
peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações.
O resultado dos métodos propostos foi obtido com sucesso pela reação colorimétrica após reação
do leite adulterado no laboratório com os reagentes utilizados em cada metodologia. Após as
reações houve mudança da coloração que pode ser observada nas figuras de 1 a 4.
Na pesquisa por formaldeído foi possível observar a formação de cor discreta a partir das
concentrações de 0,005%, com crescente aumento da tonalidade violeta até a concentração de
0,25% como pode ser observado na figura 1. A formação de cor é resultado da reação do
formaldeído com o reagente de Schiff. O surgimento de coloração rosa ou malva após 5 minutos
indica presença do adulterante (MARTINS, 2012). Essa metodologia foi adaptada da pesquisa de
metanol e aldeídos em diferentes produtos comerciais (MARTINS & SUAREZ, 2012).
Figura 1 – Detecção de formaldeído em amostras de leite.
A pesquisa da presença de hidróxido de sódio no leite foi realizada com a adição de solução de
azul de bromotimol 0,004 mg/ml. Foi observada coloração esverdeada a partir da concentração
0,15%, acentuando até a concentração de 1%. Nas concentrações 0,10 e 0,05% foi adquirida
coloração amarelada. Essas mudanças de cor podem ser observadas na figura 2. O
aparecimento de coloração verde e azul indica a presença do adulterante e coloração amarela
indica ausência (ALMEIDA, 2013).
A mudança da coloração é decorrente da ação do indicador azul de bromotimol, que em soluções
fracamente ácidas fornece coloração amarela, em soluções fracamente alcalinas fornece cor azul
e em meio neutro, coloração verde.
Figura 2 – Detecção de hidróxido de sódio em amostras de leite.
A pesquisa do adulterante hipoclorito de sódio foi realizada com adição de solução de iodeto de
potássio a 7,5% ao leite adulterado e em seguida agitado. O aparecimento de coloração amarela
foi visualizado nas concentrações de 0,4 e 0,5% imediatamente após a reação, indicando a
presença de cloro livre, podendo ser observada na figura 3. Foram adicionados 4 ml de solução
de ácido acético e colocado
olocado em banho-maria
banho maria a 80 ºC por 10 minutos e resfriado em água
corrente. Foi observado o aparecimento de cor amarela fraca a partir da concentração 0,2% e
acentuada conforme o aumento da concentração, como pode ser observado na figura 3,
indicando a presença
sença de hipoclorito (BRASIL, 2006).
Figura 3 – Detecção de hipoclorito de sódio em amostras de leite. A – imediatamente após a reação. B – após a
adição de ácido acético e aquecimento.
A presença de peróxido de hidrogênio foi investigada adicionando-se
adicionando
solução de iodeto de
potássio a 10% no leite adulterado, sendo possível observar a mudança de coloração a partir da
concentração 0,5% e aumentando a tonalidade conforme aumento da concentração, como se
pode observar na figura 4; após 30 minutos as coloraç
colorações
ões foram desaparecendo e houve
aparecimento de espuma, conforme mostra a figura 4. A mudança de coloração indica presença
do adulterante peróxido de hidrogênio (MENDES, 2010).
Figura 4 – Pesquisa de peróxido de hidrogênio em amostras de leite. A - detecção
ção das concentrações 0,5 % a 9 %
imediatamente após a reação; B - detecção das concentrações 0,5 % a 9 % após 30 min.
5. Conclusão
O desenvolvimento do método permite a detecção de alguns adulterantes encontrados em
fraudes do leite. A possibilidade de utilização
utilização desses métodos em campo é de grande ajuda como
indicativo de adulteração do produto. Com a pesquisa detectou-se
detectou se concentrações mínimas de
adulterantes presentes no leite e será possível o desenvolvimento de um kit para detecção de
fraudes, com aplicação
icação como indicativo de fraude para auxiliar no controle de qualidade por
empresas, distribuidores e também consumidores finais.
Referências
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. (Brasil) (ANVISA). Informe técnico nº 33, 2007.
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. (Brasil) (ANVISA). Guia de controle de qualidade de
produtos cosméticos / Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 2ª edição, revista – Brasília: ANVISA,
2008.
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. (Brasil) (ANVISA). Farmacopeia Brasileira, v.2.
Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: ANVISA, 2010. p.546.
ALMEIDA, T.V. & NICOLAU, E.S. Detecção de Adulteração em Leite: Análises de Rotina e
Espectroscopia de Infravermelho. Goiânia, 2013.
CERQUEIRA, M.M.O.P. & SOUZA, M.R. & RODRIGUES, R. Et al. Características Microbiológicas de
Leite Cru e Beneficiado em Belo horizonte (MG). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia,
v.46, n.6, p.713 – 721, 1994.
MARTINS, G. & SUAREZ, P.A.Z. Desenvolvimento de uma metodologia portátil para análise de metanol e
aldeídos em produtos comerciais. 35ª Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química, 2012.
MENDES, C.G. & SAKAMOTO, S.M. & SILVA, J.B. & JÁCOME, C.G..M. & LEITE, A.I. Análises FísicoQuímicas e Pesquisa de Fraude no Leite Informal Comercializado no Município de Mossoró. Revista
Ciência Animal Brasileira, Volume 11, Número 2, 2010.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. (Brasil) (MAPA). Instrução
Normativa n.51. Diário Oficial da União. Brasília: MAPA, 2002;
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. (Brasil) (MAPA) Instrução
Normativa n.68, de 12 de dezembro de 2006. Estabelece métodos analíticos físicoquímicos oficiais para
leite e produtos lácteos. Diário Oficial da União, 14 dez. 2006, Seção 1, p. 8.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. (Brasil) (MAPA). Pesquisa de
Peróxido de Hidrogênio em Leite Fluido pelo Método de Guaiacol. Laboratório Nacional AgropecuárioMétodo de ensaio. Rio Grande do Sul, 2014.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. (Brasil) (MAPA). Instrução
Normativa n.37, de 18 de Abril de 2002.
TRONCO, V.M. Pesquisa de substâncias estranhas ou fraudulentas. Manual para Inspeção da Qualidade
do Leite. Santa Maria: Editora UFSM, 2003. cap. 5, p. 130-140.
TRONCO, V.M. Manual de Inspeção da Qualidade do Leite. 4ª ed. Santa Maria: Editora UFSM, 2010.

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