Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 1 1 29.10.07 11:24:10
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Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 1 1 29.10.07 11:24:10 Tendências em HIV•AIDS Volume 2 - Número 3 - 2007 Editor chefe Ricardo Sobhie Diaz – Universidade Federal de São Paulo Corpo editorial Adauto Castelo Filho – Universidade Federal de São Paulo André Lomar – Hospital Israelita Albert Einstein Artur Kalichman – Centro de Referência e Treinamento de DST/AIDS – SP Artur Timerman – Hospital Heliópolis Breno Riegel – Hospital Nossa Senhora da Conceição, Rio Grande do Sul. Celina Maria Pereira de Moraes Soares – Doutoranda da Universidade Federal de São Paulo Celso Ramos – Universidade Federal do Rio de Janeiro David Salomão Lewi – Universidade Federal de São Paulo – Hospital Israelita Albert Einstein Eduardo Sprinz – Universidade Federal do Rio Grande do Sul Érico A. Gomes de Arruda – Hospital São José de Doenças Infecciosas do Ceará Esper George Kallas – Universidade Federal de São Paulo Estevão Portella – Universidade Federal do Rio de Janeiro Guido Levi – Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo João da Silva Mendonça – Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo José Luiz de Andrade Neto – Universidade Federal do Paraná Jeová Keny Baima Colares – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP Jorge Simão do Rosário Casseb – Médico Pesquisador do Laboratório de Imunologia 56 – LIM56 – Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo Márcia Rachid – Assessoria de DST/Aids da Secretaria do Estado do Rio de Janeiro Marcos Vitória – Organização Mundial de Saúde Marinella Della Negra – Instituto de Infectologia Emílio Ribas Paulo Feijó Barroso – Universidade Federal do Rio de Janeiro Reinaldo Salomão – Universidade Federal de São Paulo – Casa de Saúde Santa Marcelina Ricardo Pio Marins – Organização Panamericana de Saúde Rosana Del Bianco – Secretaria Municipal de Saúde de São Paulo Unaí Tupinambás – Universidade Federal de Minas Gerais Valdez Madruga – Centro de Referência e Treinamento de DST/AIDS – SP ÍNDICE REAL TIME PCR UMA MINI REVISÃO ............................................................................................................................................................... 5 Shirley Komninakis QUAL A MELHOR ESCOLHA DE TRATAMENTO ANTIRETROVIRAL PARA PACIENTES CO-INFECTADOS HCV-HIV? ........................... 11 Paulo Roberto Abrão Ferreira e Simone de Barros Tenore VACINAS PROFILÁTICAS ANTI-HIV ................................................................................................................................................................ 16 Jorge Casseb CORECEPTORES CCR5 E CXCR4 E POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS .................................................................................................... 19 Monica Jaques de Morais DESTAQUES ..................................................................................................................................................................................................... 23 RESUMO DE TESES ......................................................................................................................................................................................... 28 Atha Comunicação & Editora Planejamento Editorial, Diagramação e Produção Gráfica Rua Machado Bittencourt, 190 - Cep: 04044-000 - São Paulo - SP - Tel: 55-11-5087-9502 - Fax: 55-11-5579-5308 E-mail: [email protected] 3 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 3 3 29.10.07 11:24:13 EDITORIAL Caro leitor Fechando a porta para o HIV. Inibição replicação do HIV interagindo nas fases mais precoces do ciclo de replicação do vírus tem sido uma grande alternativa inovadora. Além dos inibidores de fusão como o T20, desenvolvem-se os inibidores que se ligam aos receptores do vírus; CD4, CCR5 e CxCR4. Neste fascículo a Dra Monica Jaques resume as possibilidades terapêuticas relacionadas à inibição da entrada do vírus pela interação com os co-receptores CCR5 e CxCR4. Revisão oportuna, dada a recente liberação pelo FDA da droga Maraviroc, um inibidor do CCR5. A grande luz sobre a possibilidade terapêutica da inibição do CCR5 veio dos estudos sobre a observação da história natural da infecção pelo HIV e a relação com o polimorfismo do CCR5. Descobriu-se, por exemplo, que o alelo que codifica o CCR5 pode apresentar em algumas pessoas a deleção de 32 nucleotideos (∆32). Quando isto ocorre de forma homozigota, ou seja, em pessoas cujos dois alelos são ∆32, vai haver a resistência à infecção pelo HIV in vivo e in vitro1. Esta deleção está presente em 1% dos indivíduos brancos e é ausente nos negros, ameríndios ou asiáticos. Especula-se que este alelo de origem Viking tenha sido selecionado na idade média por ocasião da peste, posto que este perfil também levaria a resistência a esta infecção2. Interessante notar que os indivíduos heterozigotos, ou seja, que apresentam um alelo normal e outro ∆32, apesar de se infectarem pelo HIV, apresentam uma progressão para a doença mais lenta3 e responderiam melhor ao tratamento anti-retroviral4. Em outras palavras, esta diminuição natural das portas de entrada para o HIV em nível celular contribuiria de forma benéfica para os pacientes. Mais interessante ainda, estas pessoas que apresentam a completa ausência da expressão do receptor CCR5, que seriam as pessoas com homozigose para o ∆32, apresentam uma vida normal sem aparentes prejuízos à saúde. Disto tudo veio à luz a estratégia de bloquear o CCR5 tendo como objetivo impedir a entrada do vírus na célula sem possíveis danos à imunidade do hospedeiro, já que 1% da população sobrevive sem a expressão deste receptor em decorrência da presença do ∆32 em homozigose. Um porém nesta estratégia: o vírus eventualmente pode utilizar o CxCR4 para entrar na célula. O vírus que infecta inicialmente a pessoa tende a ser R5 (vírus com tropismo pelo CCR5), pois este é o receptor da célula dendrítica que captura o vírus durante a infecção primária para levá-lo ao linfonodo regional. Ao longo do tempo, o vírus pode mudar o seu tropismo e utilizar também (ou exclusivamente) o receptor CxCR4. Aparentemente existe um preço para a não expressão do CCR5 nas pessoas que apresentam homozigose para o ∆32. Existe nestas pessoas uma mortalidade maior na infecção pelo vírus do Nilo oriental (west Nile vírus ou WNV)5. Sabe-se que o CCR5 é um determinante chave para o tráfego de leucócitos para o cérebro e que camundongos com deleção de CCR5 sempre morrem de WNV cerebral, além de apresentarem uma redução de células NK, leucócitos e células T no cérebro6. O preço pago pela inibição do CxCR4 é ainda maior. Aparentemente a importância biológica deste receptor é muito grande. Como exemplo, ratos com knockout do CxCR4 desenvolvem anormalidades na formação das células B, do coração e do fígado. Em tempo, o inibidor de CxCR4 conhecido como AMD 3100 foi descontinuado por cardiotoxicidade. O artigo “Coreceptores CCR5 e CXCR4 e Possibilidades Terapêuticas” deste fascículo comenta também sobre a necessidade de realização de teste de tropismo para decisão sobre o uso dos inibidores do CCR5, sendo que chamo a atenção de que não só os testes de fenotipagem tem utilidade, como também existem os testes de genotipagem que poderiam ser aplicados para este fim7. Ricardo Sobhie Diaz REFERÊNCIAS 1. Liu R., Paxton W.A., Choe S., et al. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals. Revista 1996. 2. Novembre J, Galvani AP, Slatkin M. The geographic spread of the CCR5 Delta32 HIV-resistance allele. PLoS Biol. 2005 Nov;3(11):e339. 3. Dean M., Carrington M., Winkler C., et al. Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. Science1996;27:273:1856-62. 4. Accetturi C.A., Pardini R., Pinto G.H.N., Turcato G., Lewi D.S., Diaz R.S.. (2000). Effects of CCR5 genetic polymorphism and HIV-1 subtype in antiretroviral response in Brazilian HIV-1 infected patients. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, 24, 04: 399-400. 5. Glass WG, McDermott DH, Lim JK, Lekhong S, Yu SF, Frank WA, Pape J, Cheshier RC, Murphy PM. CCR5 deficiency increases risk of symptomatic West Nile virus infection. J Exp Med. 2006 Jan 23;203(1):35-40. Epub 2006 Jan 17. 6. Glass WG, Lim JK, Cholera R, Pletnev AG, Gao JL, Murphy PM. Chemokine receptor CCR5 promotes leukocyte trafficking to the brain and survival in West Nile virus infection. J Exp Med. 2005 Oct 17;202(8):1087-98. 7. Silva WP, Santos DEM, Brunstein A, Leal ES, Sucupira MCA, Sabino EC, Diaz RS. Reactivation of ancestral strains of HIV-1 in the gp120 V3 env region in patients failing antiretroviral therapy and subjected to structured treatment interruption. Virology, 2006, 354, 1:35-47. 4 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 4 4 29.10.07 11:24:13 REAL TIME PCR UMA MINI REVISÃO REAL TIME PCR A MINIREVIEW Shirley Komninakis Doutorndo do Laboratório de Retrovirologia, Disciplina de Infectologia, Departamento de Medicina – Universidade Federal de São Paulo / Escola Paulista de Medicina. RESUMO Real Time PCR tem e continuará a ter um impacto substancial nas ciências da vida por varias razões: o risco de contaminação por amplicon é mínima pois o tubo permanece fechado, processamento pós PCR não é necessário e os resultados tem uma alta precisão, reprodutibilidade e sensibilidade. As vantagens do Real Time PCR são exploradas no diagnóstico clinico, monitoramento de doenças infecciosas e tumores. Esta técnica é aplicada para medida de expressão gênica de citocinas e em tecidos, amostras forenses, monitoramento de alimentos. Real Time PCR se tornara uma das mais importantes técnicas das ciências da vida. Descritores: Real Time PCR, Ácidos nucléicos, Reação em Cadeia da Polimerase ABSTRACT Real time PCR have had an will continue to have a substantial impact on life sciences for several reasons: the risk of carry-over contamination is minimal because of the close tube, post PCR processing is not required and the results have a high precision, reproducibility and sensibility. The advantages of Real Time PCR are exploited in clinical diagnosis, monitoring infectious diseases and tumours. This technique is applied for the cytokine and tissues gene expression, forensic samples, food monitoring. Real Time PCR will become one of the most important techniques in molecular life sciences. Keywords: Real Time PCR, Nucleic acids, Polymerase chain reaction INTRODUÇÃO Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), desde o início de sua utilização, sempre representou uma importante ferramenta para a análise de genomas ou segmentos de DNA ou RNA, detecção de patógenos, pré-requisito para o sequenciamento gênico, engenharia genética, entre outras utilizações. A associação da PCR com equipamentos que detectam e monitoram sinais de fluorescências em tempo real durante o processo de amplificação representou um avanço na biologia molecular. Higuchi et al em 1992 construíram um sistema que incluía um termociclador que irradiava ultravioleta sobre as amostras e uma câmera CCD acoplada para captar a fluorescência emitida1. O sistema incluiu na reação o brometo de etideo, um reativo que quando intercala entre duas fitas de DNA emite uma fluorescência 20 - 1000 vezes maior que a basal. Ele construiu gráficos de acumulo de fluorescência versus os ciclos e, demonstrou que a fluorescência acumulada do brometo de etideo ao longo dos ciclos era diretamente proporcional a quantidade de alvo inicial. Assim, poucos ciclos são necessários para produzir um sinal detectável quando um grande numero de copias esta presente2. Um dos principais problemas do uso do intercalador é que este se liga a produtos específicos e inespecíficos, mas Holland et al em 1991, demonstraram que poderia ser utilizado um método alternativo o 5´nuclease. Neste método uma probe alvo poderia ser clivada pela atividade 5´nuclease de uma polimerase, Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 05-10) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 5 5 quando esta enzima estende um fragmento a partir do iniciador sense 3. Em 1993 Lee et al desenvolveu as probes fluorescentes que são oligonucletídeos com as porções 5´ e 3´marcadas com um reporter dye e um quencher dye, respectivamente. Enquanto a probe não é clivada pela atividade 5´nuclease, ela não emite fluorescência devido a proximidade do reporter e do quencher por meio de FRET (Foster Resonance Energy Transfer)4. Uma grande vantagem das probes fluorescentes é que se ocorrer pareamentos inespecíficos do iniciador sense ou da probe não há emissão de sinal. Outra vantagem é que podemos utilizar diferentes marcações nas probes e, isso possibilitou a detecção de vários alvos em uma única reação. Apesar do que foi mencionado acima sobre os intercalantes serem inespecíficos, atualmente se utiliza o minor-groove binding dye SYBR® Green I5. O SYBR® é muito utilizado por necessitar pouco desenho experimental e ter menor custo que as probes . Além disso, atualmente é realizada uma análise de melting curve no final da amplificação, quando se utiliza o SYBR®. A temperatura é acertada em torno de 50ºC e então aumentada gradativamente (0.1ºC/s) até alcançar os 94ºC. Assim, conforme há o aumento da temperatura ocorre a fusão das fitas (separação) e consequentemente o reativo intercalante é liberado na solução e a fluorescência diminui. Produtos de reação específica geralmente se separam a altas temperaturas ao contrario e artefatos, dímeros e outros produtos espú- 5 29.10.07 11:24:14 rios. A temperatura de melting é uma função do tamanho e da quantidade de CG do fragmento amplificado6. As vantagens da Real Time PCR são inúmeras, dentre elas, a alta eficiência da detecção comparada com análises em gel, a reprodutibilidade, a sensibilidade de detecção de até uma cópia e a rapidez por não envolver passos pós-PCR que também contribuem para evitar contaminações do ambiente e das reações com amplicons. A PCR possui quatro fases: a primeira fase se encontra escondida sob um background de fluorescência (basal); na segunda fase ocorre a amplificação exponencial que ultrapassa o background inicial; a terceira é a fase linear com eficiência e aumento da fluorescência e a quarta fase conhecida como plateau onde acontece a atenuação da taxa de amplificação exponencial correspondente aos últimos ciclos7,8. A quantidade de produto amplificado na fase exponencial é diretamente proporcional à quantidade de alvo inicial, somente nesta fase. Na fase exponencial encontramos todos os reativos necessários disponíveis na reação e, quando em concentrações adequadas, permitem que haja uma alta eficiência e análises quantitativas com alta reprodutibilidade e sensibilidade. Nos ciclos iniciais da Real Time PCR há pouca mudança no sinal de fluorescência. Isto define o baseline para o gráfico de amplificação. Quando a reação entra na fase exponencial ocorre um aumento na fluorescência acima deste basal e indica a acumulação do produto amplificado. Uma linha de base pode ser fixada acima deste baseline (threshold). O CT (cycle threshold) é definido no momento em que a fluorescência ultrapassa o baseline9. Podemos determinar o número de cópias iniciais quando o valor do CT, representativo da quantificação de amostras desconhecidas, é colocado frente a valores de uma curva padrão. O nível do threshold pode ser obtido pelo software do equipamento utilizado, que determina o desvio padrão dos pontos que formam baseline10. As quantificações podem alcançar uma larga faixa de detecção, com pelo menos oito ordens de magnitude sendo muito mais específicas que os ensaios de end-point PCR os quais possuem, duas ordens11-13. O grande problema da PCR convencional é que a fase final de plateau observada no gel não pode ser diretamente relacionada com a quantidade inicial de copias do alvo, pois nos estágios finais da PCR há escassez e degradação dos reagentes, como também cada reação apresentou uma cinética de reação, acumulando alta variabilidade12-14. A análise em tempo real da amplificação permite, ou por meio de probes ou análises de melting curve, a quantificação de alvos que podem ser DNAs ou RNAs de forma acurada, para análises de expressão gênica, diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de polimorfismos de um simples nucleotídeo (SNPs), análise de organismos geneticamente modificados (OGMs), pesquisa de contaminantes na industria de alimentos, como bactérias e fungos, entre outros. Formatos de detecção SYBR Green I O SYBR Green se liga ao minor-groove da dupla fita de DNA com uma afinidade 100 vezes maior do que o brometo de etideo15,16. Ele pode ser excitado com luz azul com comprimento de onda de 480nm. O mencionado self-quenching da ligação do SYBR com a dupla fita de DNA não é fonte de erro para a análise quantitativa, pois a taxa da marcação o sinal da fase 6 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 6 6 exponencial é usado para que a taxa de marcação dos pares de bases seja maior do que 217. Então o produto da PCR é saturado pelo SYBR e o self- quenching é proporcional a quantidade de produto da PCR. Um dos questionamentos sobre a utilização dos intercalantes é sua ligação a qualquer dupla fita, isto incluiria produtos inespecíficos. Isto pode ser minimizado pelo desenho dos iniciadores, padronização da reação, aumento da temperatura de melting dos iniciadores, definição de concentrações adequadas dos iniciadores e titulação do MgCL2. Se dímeros de iniciadores (primer-dymer) se formam nos ciclos finais de amplificação isto mascara o sinal. Outro enfoque importante é realizar um melting curve no final da reação para separar os produtos específicos dos inespecíficos, como mencionado no item anterior16. Probes de hibridização As probes de hibridização são utilizadas no formato de FRET. Há uma porção 3´doadora marcada usualmente com FAM (6-carboxi-fluorisceína) e uma probe aceptora marcada na porção 5´ com um fluoróforo (Cy3, Cy5, TET, TAMRA, ROX, entre outros)18. Para que o FRET ocorra dois fluoróforos devem estar próximos. Durante a fase de anelamento dos iniciadores as probes hibridizam adjacentemente na fita simples de DNA e a energia de excitação é transferida do doador para o aceptor. Quando a Taq polimerase é utilizada as probes podem ser em parte hidrolizadas diminuindo suas concentrações e produzir sinais subótimos. Este problema pode ser solucionado pela utilização de polimerases sem atividade 5´nuclease19,20. Probes Hidrolisáveis Este sistema se baseia na ligação de dois iniciadores e uma probe a três alvos diferentes, sendo que a probe se liga primeiro a seqüência alvo, seguido dos iniciadores, por diferença na temperatura. A “probe” possui uma fluorisceína na porção 5` (“reporter”) e na porção 3` (“quencher”) que por meio de ressonância, obtida pela proximidade das duas regiões, não permite que haja escape de fluorescência21. A separação do reporter e do quencher se dá pela atividade 5´nuclease da enzima Taq polimerase, que durante a polimerização da fita que está sendo gerada, cliva a probe tendo assim a liberação do sinal de fluorescência3,22. O desenho de uma probe com ligação eficiente ao alvo é a chave para o sinal eficiente na PCR. A utilização deste sistema para seqüências de DNA alvo ricos em AT é problemática, pois a temperatura de melting da probe tem que ser 5ºC a 10ºC acima dos iniciadores. Em alguns casos há a necessidade do desenho de uma probe com seqüência longa. Este problema pode ser solucionado pela adição de uma seqüência denominada minor grove binding (MGB) que aumenta a TM, mas aumenta também a complexidade e o custo da probe23. O sistema de probes hidrolisáveis é produzido atualmente por várias indústrias, inclusive a marca registrada Taqman é utilizada como sinônimo da Real Time PCR 23. Molecular Beacons O molecular beacon foi descrito em 1995 por Tyagi et al24. A sua estrutura química é muito parecida com as probes hidrolizaveis, sendo eles marcados nas porções 5´e 3, por um reporTendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 05-10) 29.10.07 11:24:14 ter e quencher. O meio da probe é seqüência complementar ao alvo, enquanto 10 a 15 nucleotídeos terminais são complementares entre eles. A estrutura é em forma de “grampo” (hairpin) onde o reporter e o quencher estão intimamente próximos. Durante a fase de anelamento dos iniciadores a parte do meio da probe se liga ao DNA alvo afastando o quencher e a fluorescência é então liberada25,26. As condições de hibridização são criticas para este ensaio e difíceis de otimizar. Sunrise primers Este sistema consiste de um iniciador com a porção 5´ com estrutura em forma de “grampo” e proximidade do reporter e do quencher. Num primeiro momento o sunrise primer sense é estendido e esta seqüência serve como alvo para o iniciador reverso. No final a enzima polimerase abre a estrutura em grampo, um produto da PCR em dupla fita é formado e a fluorescência liberada pelo afastamento do quencher e reporter27. A porção posterior da alça (stem) também abre em dímeros e produtos inespecificos, ou seja, o sinal não é realmente especifico para o produto da PCR Scorpion primers Este sistema é parecido estruturalmente funcionalmente com o molecular beacon, mas serve como iniciadores na PCR. Scorpion primers possuem seqüências complementares entre eles, que forma uma estrutura em alça na porção 5´, com seqüência complementar ao alvo na alça e o final 3´ serve como um iniciador. A região posterior da alça (stem) é marcada com um fluoróforo e um quenche, No primeiro passo da amplificação o iniciador é estendido formando uma simples fita para a ligação do iniciador reverso no segundo passo. O stem se abre e a alça se liga a seqüência alvo havendo emissão de fluorescência pela separação do quencher e fluoróforo. Em contraste com o sistema sunrise a extensão reversa é bloqueada por um grupo hexetilenoglicol, assegurando que o reporter do scorpion primers permaneça com quencher em produtos inespecificos28,29. Light-up probes Light-up probes são peptídeos de ácidos nucléicos que usam thiazole orange como fluoróforo. Durante a hibridização com a seqüência alvo duplexes e triplexes são formados aumentando a fluorescência, sem necessidade de um quencher. Esta técnica apresenta fluorescência inespecifica que aumenta durante a PCR e prejudica a sensibilidade30,31. Alguns formatos aumentam o quencher por meio da presença de resíduos de guanina no produto da PCR. A medida da diminuição do sinal, especialmente durante a fase exponencial, é um problema pois somente poucas probes são quencheadas32,33. Análises quantitativas Para a realização de análises quantitativas curvas devem ser construídas. O processo deve ser monitorado por meio de reagentes intercalantes ou sistemas de probes . É essencial que as eficiências das curvas e amostras sejam iguais. A eficiência (E) pode ser estimada por meio dos valores dos Cts (cycle threshold) com concentrações conhecidas de um padrão. O valor máximo de eficiência numa reação da PCR é 2 (quantidade de produto dobra a cada ciclo). Os valores de E podem variar entre 1.5 e 1.9, mas isto implica na diminuição da senTendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 05-10) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 7 7 sibilidade, mas com alta especificidade. Uma eficiência constante na amplificação de diferentes amostras é um importante critério para comparação e análise dos dados. Os valores de Cts são muito reprodutíveis para reações com o mesmo numero inicial de cópias34,35,36. A eficiência pode ser calculada pelo uso do valor de inclinação (slope) da curva padrão: E=10-1/slope 37. Em ensaios otimizados erros padrões de ±2 ciclos podem ser alcançados. Assumindo que a eficiência da PCR é de 100%, isto implica que o erro mínimo relativo para a quantificação seria em torno de 10 a 20%38. Para construir curvas padrões para os experimentos devemos avaliar os tipos de quantificação absoluta ou relativa, ou seja, que utilizam um padrão externo ou um gene de referencia, respectivamente. Para a análise de quantificação absoluta necessitamos de um padrão diluído com concentrações conhecidas. Devemos considerar o desenho do padrão, sua produção, determinação exata da concentração e estabilidade por um longo período. Estes fatores podem ser problemáticos de serem alcançados. O intervalo de quantificação (dynamic range) da curva deve ser entre 101 a 1010 moléculas iniciais, com nove ordens de magnitude, dependendo do material amplificado(13,39). A curva de quantificação absoluta pode ser baseada em concentrações conhecidas de DNA, plasmideo com fragmento de interesse clonado (DNA recombinante), produto de RT-PCR e oligonucleotideos comerciais12,39,40. A estabilidade e reprodutibilidade dependem do tipo de padrão utilizado e da boa pratica de laboratório. DNAs e plasmideos são muito estáveis e reprodutíveis. A vantagem dos oligonucleotideos comerciais e seqüências curtas de DNA é evitar o processamento do material com ganho de tempo e o conhecimento acurado da concentração e comprimento do material8,12,39. Quando os Cts das amostras estiverem disponíveis, estes podem ser comparados aos valores de Cts obtidos e relacionados com concentrações iniciais conhecidas da curva padrão. Outro problema que deve ser evitado são os resultados falsos negativos, que podem ocorrer pela presença de inibidores de reação. Para isso, é desejável a utilização de um controle interno com concentração conhecida que pode ser adicionado na reação desde o procedimento de extração. A quantificação relativa determina as mudanças nos níveis de RNA de um gene através de múltiplas amostras e ela expressa o nível relativo a um gene de referencia. Este gene de referencia é frequentemente um gene endógeno (housekeeping) que pode ser co-amplificado no mesmo tubo, por meio de um ensaio multiplex (amplificação de dois ou mais alvos em uma mesma reação) ou pode ser amplificado separadamente13,40. A quantificação relativa não necessita de um padrão com concentração conhecida e o gene de referencia pode ser qualquer transcrito, como por exemplo um RNA mensageiro ribossômico 18S41. Quantificação relativa e’ baseada nos níveis de expressão de um gene alvo versus um gene de referencia e utilizado para determinar mudanças fisiológicas da expressão de um gene. Para calcular a expressão de um gene alvo em relação a um gene de referencia adequado vários modelos matemáticos são estabelecidos (normalização). Como exemplo temos os cálculos de crossing points (CP), valores de threshold (Ct) ou aquisição de CP de acordo com algoritmos matemáticos estabelecidos 42,43,44. O calculo de ΔCt entre os valores da amostra e gene de referencia ‘e uma ferramenta fácil para estimar mudanças relativas. Um calculo muito utilizado ‘e o 2ΔΔCt descrito por Livak45. Os resultados deste método são semi-quantitativos pois utilizam o valor fixo de 2 para a eficiência de todas as 7 29.10.07 11:24:14 amostras. Os calculo mais confiáveis são os descritos por Pfaffl que inclui a analise de eficiência46. Alguns softwares são utilizados para analise de comparação de grupos e para mais de 100 amostras, por exemplo, REST e REST-XL que utiliza a media dos valores de CP44. Estes programas se baseiam na eficiência da PCR ou uma eficiência pré-determinada de 2 (100%). A qualidade dos dados de expressão obtidos do alvo não devem ser melhores do que os dados do normalizador (gene de referencia). Qualquer variação do normalizador pode obscurecer mudanças reais e produzir artefatos41,47. Os genes de referencia mais comumente utilizados são o GAPDH, albumina, actina, tubulinas, ciclofilinas, microglobulinas, rRNA 18S ou rRNA 28S48. Uma analise de expressão pode ser prejudicada pela falta de eficiência nos métodos de extração e de transcrição reversa (RT), problemas com a integridade do RNA e presença de inibidores de reação que poderiam subestimar as quantidades de material inicial entre as amostras 49,50,51. Isto é especialmente relevante quando amostras são obtidas de indivíduos diferentes, tecidos diferentes e em tempos diferentes, pois resultaria na falta de interpretação do perfil dos genes alvo. O problema crucial da analise expressão relativa é a utilização de um gene de referencia adequado que não sofra variações sob determinadas condições experimentais e entre os individuos. No entanto, quando usada de forma adequada pode gerar informações importantes. Aplicações O Real Time PCR é utilizado para quantificacões relativas ou absolutas de moléculas de RNA e DNA e para genotipagem em uma variedade de aplicações. Este ensaio permite determinar 8 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 8 8 cargas virais, expressão gênica, presença de microorganismos e contaminações em alimentos, sangue e outros fluidos e tecidos, graus de deleção e amplificação de genes52,53. Este método esta também se tornando importante no diagnóstico de tumores, dtecção e monitoramento de doenças residuais, identificação de micrometástases em colon retal, neuroblastoma e cancer de próstata36, 54-57,58-60. Outra utilização é a quantificação de oncogenes, analises de deleções de genes supressores de tumor, como também a resposta as drogas no tratamento do câncer 61-64. Uma aplicação importante na clinica é o estabelecimento de perfis de citocinas por meio da analise da expressão gênica. Analises de quimerismo são possíveis com o uso de probes com seqüências especificas para diferenciar ou quantificar alelos. Para o quimerismo a faixa de detecção é grande baseada na inserção/deleção de polimorfismos e os SNPs (single nucleotide polimorphysm) são também possíveis65,66. O Real Time também é utilizado em analises forenses67-69. Podemos avaliar por meio do melting curve a presença de mutações, caracterização da especificidade do produto da PCR, genotipagem, entre outros. O Real Time PCR é uma técnica de alta precisão, reprodutibilidade e sensibilidade, que pode ser aplicada em varias áreas da biologia e medicina. Sua utilização minimiza o risco de contaminação por meio de amplicons pois não é necessária a manipulação pós PCR, além de podermos analisar um grande numero de amostras em pouco tempo. Por outro lado, há a necessidade da boa pratica de laboratório e conhecimentos sobre formas de análise dos resultados para que os experimentos fiquem adequados. Ainda assim, o Real Time PCR se tornará uma das mais importantes ferramentas de análise das ciências da vida. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 05-10) 29.10.07 11:24:14 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.Biotechnology 10:413–417. 2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions.Biotechnology 11:1026–1030. 3- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., and Gelfand, D. H. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’ to 3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88:7276–7280. 4- Lee, L. G., Connell, C. R., and Bloch, W. 1993. Allelic discrimination by nicktranslation PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids Research 21:3761– 3766. 5- Becker, A.; Reith, A.; Napiwotzki, J.; Kadenbach, B. 1996. A quantitative method of determining initial amounts of DNA by polymerase chain reaction cycle titration using digital imaging and a novel DNA stain. Anal. Biochem. 237:204-207. 6 - Al-Robaiy, S.; Rupf, S.; Eschrich, K. 2001. Rapid competitive PCR using melting curve analysis for DNA quantification. BioTechniques 31: 1382-1386, 1388. 7- Kainz, P. 2000. The PCR plateau phase – towards an understanding of its limitations. Biochim. Biophys Acta. 1494: 23-27. 8- Pfaffl, M.W. 2001. Development and validation of an externally standardized quantitative Insulin like growth factor-1 (IGF-1) RT-PCR using LightCycler SYBR Green I technology. In: Meuer, S.; Wittwer, C.; Nakagawara, K.; eds. Rapid Cycle Real-time PCR. Methods and Applications Springer Press, Heidelberg: 281-191. 9- Livak, K.L. ABI Prism 7700 Sequence detection System Bulletin #2 Relative quantification of gene expression. 2001. http://docs.appliediossystems.com/ pebiodocs/04303859.pdf. 10- Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. 2000. Journal of Molecular Endocrinology 25: 169–193. 11- Winer, J.; Jung, C.K.; Shacke, I.I.; Willians, P.M. 1999. Development and validation of real-time quantitative reverse transcriptase –polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac myocytes in vitro. Anal. Biochem. 270: 41-49. 12- Rasmussen, R.; Meuer, S.; Wittwer, C.; Nakagawara, K. 2001. Quantification on the LightCycler. ISBN 3-540-66736-9: 21-34. 13- Pfaffl, M.W.; Georgieva, T.M.; Georgiev, I.P.; Ontsouka, E.; Hageleit, M.; Blum, J.W. 2002. real-time RT-PCR quantification of insulin-like growth factor (IGF)1, IGF-1 receptor, IGF-2, IGF-2 receptor, insulin receptor, growth hormone receptor, IGF-binding proteins 1, 2 and 3 in bovine species. 2002. Domest. Anim. Endocrinol. 22: 91-102. 14- Schmingen, T.D.; Zakrajsek, B.A.; Mills, A.G.; Gorn, V.; Singer, M.J.; Reed, M.W. 2000. Quantitative reverse transcriptation-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Anal. Biochem. 285: 194-204. 15- Wittwer, C. T.; Herrmann, M. G.; Moss, A. A.; Rasmussen, R. P. 1997. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. BioTechniques 22: 130-131. 16- Morrison, T.B., Weis, J. J., and Wittwer, C.T. 1998. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques., 24: 954-962,. 17- Zipper, H.; Brunner H.; Bernhagen, J.; Vitzthum, F. 2004. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Research: 32 12 e103. 18- Cardullo, R.A.; Agrawal, S.; Flores, C.; Zamecnik, P.C.; Wolf, D.E. 1998. Detection of nucleic acid hybridization by non-radioative fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 8790-8794. 19- Fôrster, T. 1948. Intermediatemolecular energy migration and fluorescence Annals of physics. 437: 55-75. 20- Clegg, R.M. 1992. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211: 353 ± 388. 21- Livak, K.J.; Flood, S.A.J.; Marmaro, J.; Giusti, W.; Deetz, K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR products and nucleic acid hybridization. PCR Methods and Applications. 4: 357-362. 22- Gibson, U. E.; Heid, C. A.; Williams, P. M. 1996. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6: 995-1001. 23- Lunge, V. R.; Miller, B. J.; Livak, K. J.; Batt, C. A. 2002. Factors affecting the performance of 5′ nuclease PCR assays for Listeria monocytogenes detection. J.Microbiol.Methods. 51: 361-368. 24- Tyagi, S.; Kramer, F.R. 1996. Molecular Beacons, probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotech. 14:303-308. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 05-10) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 9 9 25- Kostrikis, L. G.; Tyagi, S.; Mhlanga, M. M.; Ho, D. D.; Kramer, F. R. 1998. MOLECULAR BEACONS: Spectral Genotyping of Human Alleles Science 279: 1228 -1229. 26- Tyagi, S.; Bratu, D. P.; Kramer, F. R. 1998. Multicolour molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16: 49-53. 27- Nazarenko, I.A.; Bhatnagar ,S.K.; Hohman, R.J. 1997. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer. Nucleic Acids Res. 25: 2516 ± 2521. 28- Whitcombe, D.; Theaker, J.; Guy, S. P.; Brown, T.; Little, S. 1999. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat. Biotechnol. 17: 804-807. 29- Whitcombe, D.; Brownie, J.; Gillard, H. L.; McKechnie, D.; Theaker, J.; Newton, C. R.; . Little, S. 1998. A homogeneous fluorescence assay for PCR amplicons: its application to real-time, single-tube genotyping, Clin.Chem. 44: 918-923 30- Isacsson, J.; Cao, H.; Ohlsson, L.; Nordgren, S.; Svanvik N.; Westman, G.; Kubista, M.; Sjoback, R.; Sehlstedt, U. 2000. Rapid and specific detection of PCR products using light-up probes. Mol.Cell. Probes 14: 321-328. 31- Svanvik, N.; Westman, G.; Wang, D.; Kubista, M. 2000. Light-up probes: thiazole orange-conjugated peptide nucleic acid for detection of target nucleic acid in homogeneous solution. Anal.Biochem. 281: 26-35. ,32- Kurata, S.; Kanagawa, T.; Yamada, K.; Torimura, M.; Yokomaku, T.; Kamagata, Y.; Kurane, R. 2001. Fluorescent quenching-based quantitative detection of specific DNA/RNA using a BODIPY® FL-labeled probe or primer. Nucleic Acids Res. 29: e34. 33- Crockett, O.; Wittwer, C. T. 2001. Fluorescein-Labeled Oligonucleotides for Real-Time PCR: Using the Inherent Quenching of Deoxyguanosine Nucleotides. Anal.Bioch. 290: 89-97. 34- Sails, A. D.; Fox, A. J.; Bolton, F. J.; Wareing, D. R.; Greenway, D. L. A. 2003. Real-Time PCR Assay for the Detection of Campylobacter jejuni in Foods after Enrichment Culture Appl. Environ.Microbiol. 69: 1383-1390. 35- Verhagen, O. J.; Willemse, M. J.; Breunis, W. B.; Wijkhuijs, A. J.; Jacobs, D. C.; Joosten, S. A.; van Wering, E. R.; van Dongen, J. J.; van der Schoot, C. E. 2000. Application of germline IGH probes in real-time quantitative PCR for the detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia Leukemia 14: 1426-1435. 36- Marcucci, G.; Livak, K. J.; Bi, W.; Strout, M. P.; Bloomfield, C. D.; Caligiuri, M. A. 1998. Detection of minimal residual disease in patients with AML1/ ETO-associated acute myeloid leukemia using a novel quantitative reverse transcription polymerase chain reaction assay Leukemia 12: 1482-1489. 37- Pfaffl, M. A new mathematical model for relative quantification real time RTPCR. 2001. Nucleic Acids Research. 29: 2002-2007. 38- Wilhelm, J.; Pingoud, A.; Hahn, M. 2003. SoFAR: software for fully automatic evaluation of real-time PCR data. Biotechniques 34:324-32. 39- Pfaffl, M.W.; Hageleit, M. 2001. Validities of mRNA using real-time reverse transcriptation polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol. 23: 275-282. 40- Wittwer, C.T.; Herrmann, M.G.; Gundry, C.N.; Elenitoba-Johnson, K.S. 2001. Real-time multiplex PCR assays. Methods 25: 430-442. 41- Bustin, S.A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Trends and problems. 2002. J. Mol. Endocrinology 29: 23-39. 42- Tichopad, A.; Didier, A.; Pfaffl, M.W. Inhibition of real time RT-PCR quantification due to tissue specific contaminants. 2004. Molecular and Cellular Probes 18: 45-50. 43- Tichopad, A.; Dzidic, A.; Pfaffl, M.W. 2002. Improving quantitative real-time RT-PCR reprodutibility by boosting primer-linked amplification efficiency. Biotechnology Letters. 24: 2053-2056. 44- Pfaffl, M.W.; Horgan, G.W.; Dempfle, L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. 2002. Nucleic Acids 30 (9): e36. 45- Livak, K.J.; Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^{-delta delta C(T)} Method. Methods 25: 402- 408. 46- Pfaffl, M. A new mathematical model for relative quantification real time RTPCR. 2001. Nucleic Acids Research. 29 (9) e45. 47- Bustin, S. A.; Benes, V.; Nolan, T.; Pfaffl, M.W. 2005. Quantitative real-time RT-PCR – a perspective. Journal of Molecular Endocrinology 34: 597–601. 48- Vande Sompele, J.; De Preter, K.; Pattyn, F.; Poppe, B.; Van Roy, N.; De Paepe, A.; Speleman, F. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genomy Biology 3: 0034.1-0034.11. 49- Mannhalter, C.; Koizar, D.; Mitterbauer, G. Evaluation of RNA isolation methods and reference genes for RT-PCR analyses of rare target RNA. 2000. Clin. Chem. Lab. Med. 38: 171-177. 9 29.10.07 11:24:15 50- Wong, L.; Pearson, H.; Fletcher, A.; Marquis, C.P.; Mahler, S. 1998. Comparison of the efficiency of Moloney Murine Leukaemia Virus (MMuLV)) Reverse Transcriptase, RNase H-M-MuLV Reverse Transcriptase and Avian Myeloblastoma Leukaemia Virus (AMV) Reverse Transcriptase for amplification for Human Immunoglobulin genes. Biotechnology Techniques 12:485-489. 51- Karge, W.H.; Schaefer, E.J.; Ordovas, J.M. 1998. Quantification of mRNA by polymerase chain reaction (PCR) using an internal standard and nonradioactive detection method. Methods Mol. Biol. 110: 43-61. 52- Brodman, P. D.; Ilg, E. C.; Berthold, H.; Herrmann, A. J. AOAC Int. 2002, 85: 646-653. 53- Locatelli, G.; Santoro, F.; Veglia, F.; Gobbi, A.; Lusso, P.; Malnati, M. S. 2000. Real-Time Quantitative PCR for Human Herpesvirus 6 DNA. Journal of Clinical Microbiology November 38: 4042-4048. 54- Krauter, J.; Heil, G.; Ganser, A. 2001. The AML1/MTG8 Fusion Transcript in t(8;21) Positive AML and its Implication for the Detection of Minimal Residual Disease; Malignancy. Hematol.J. 5: 369-381. 55- Krauter, J.; Hoellge, W.; Wattjes, M. P.; Nagel, S.; Heidenreich, O.; Bunjes, D.; Ganser, A.; Hei, G. 2001. Detection and quantification of CBFB/MYH11 fusion transcripts in patients with inv(16)-positive acute myeloblastic leukemia by real-time RT-PCR. Genes Chromosomes Cancer 30: 342-348. 56- Elmaagacli, A. H.; Beelen, D. W.; Opalka, B.; Seeber, S.; Schaefer, U. W. 2000. The amount of BCR-ABL fusion transcripts detected by the real-time quantitative polymerase chain reaction method in patients with Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia correlates with the disease stage. Ann. Hematol. 79: 424-431. 57- Amabile, M.; Giannini, B.; Testoni, N.; Montefusco, V.; Rosti, G.; Zardini, C.; Terragna, C.; Buonamici, S.; Ottaviani, E.; Soverini, S.; Fiacchini, M.; Bassi, S.; de Vivo, A.; Trabacchi, E.; Saglio, G.; Pane, F.; Baccarani, M.; Tura, S.; Martinelli, G. 2001. Real-time quantification of different types of bcr-abl transcript in chronic myeloid leukemia. Haematologica, 86, 252 ± 259. 58- Bustin, S. A.; Gyselman, V. G.; Williams, N. S.; Dorudi, S. 1999. Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients. Br.J.Cancer. 79: 1813-1820. 59- Cheung, I. Y.; Cheung, N. K. 2001. Quantitation of marrow disease in neuroblastoma by real-time reverse transcription-PCR. Clin.Cancer Res. 7: 1698 1705. 10 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 10 10 60- Gelmini, S.; Tricarico, C.; Vona, G.; . Livi, L.; Melina, A. D.; Serni, S.; Cellai, E.; Magrini, S.; Villari, D.; Carini, M.; Serio, M.; Forti, G.; Pazzagli, M.; Orlando, C. 2001. Real-Time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for the measurement of prostate-specific antigen mRNA in the peripheral blood of patients with prostate carcinoma using the taqman detection system. Clin. Chem. Lab. Med. 39: 385-391. 61- Bieche, I.; Laurendeau, I.; Tozlu, S.; Olivi, M.; Vidaud, D.; Lidereau, R.; Vidaud, M. 1999. Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay. Cancer Res. 59: 2759-2765. 62- Lehmann, U.; Glockne,r S.; Kleeberger, W.; vonWasielewski, H. F.; Kreipe, H. 2000. Detection of gene amplification in archival breast cancer specimens by laser-assisted microdissection and quantitative real-time polymerase chain reaction. Am.J. Pathol. 156: 1855-1864. 63- Konigshoff, M.; Wilhelm, J.; Bohle, R. M.; Pingoud, A.; Hahn, M. 2003. HER2/neu gene copy number quantified by real-time PCR: comparison of gene amplification, heterozygosity, and immunohistochemical status in breast cancer tissue. Clin.Chem. 49: 219-229. 64- Lyon, E.; Millson, A.; Lowery, M.C.; Woods, R.; Wittwer, C.T. 2001. Quantification of HER2/neu gene amplification by competitive pcr using fluorescent melting curve analysis. Clin.Chem. 47: 844-851. 65- Wilhelm, J.; Reuter, H.; Tews, B.; Pingoud, A.; Hahn, M. 2002. Detection and quantification of insertion/deletion variations by allele-specific real-time PCR: application for genotyping and chimerism analysis. Biol.Chem. 383:1423-1433. 66- Maas, F.; Schaap, N.; Kolen, S.; Zoetbrood, A.; Buno, I.; Dolstra, H.; De Witte, T.; Schattenberg, A.; Van De Wiel-Van Kemenade, E. 2003. Quantification of donor and recipient hemopoietic cells by real-time PCR of single nucleotide polymorphisms. Leukemia 17: 621-629. 67- von Wurmb-Schwark, N.; Higuchi, R.; Fenech, A. P.; Elfstroem, C.; Meissner, C.; Oehmichen, M.; Cortopassi, G. A. 2002. Quantification of human mitochondrial DNA in a real time PCR. Forensic Sci.Int. 126: 34-39. 68- Ye, J.; Parra, E. J.; Sosnoski, D. M.; Hiester, K.; Underhill, P. A.; Shriver, M. D. J. 2002. Melting curve SNP (McSNP) genotyping: a useful approach for diallelic genotyping in forensic science. Forensic Sci. 47: 593-600. 69- Andreasson, H.; Gyllensten, U.; Allen. M. 2002. Real-time DNA quantification of nuclear and mitochondrial DNA in forensic analysis. BioTechniques 33: 402- 404, 407-411. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 05-10) 29.10.07 11:24:15 QUAL A MELHOR ESCOLHA DE TRATAMENTO ANTIRETROVIRAL PARA PACIENTES CO-INFECTADOS HCV-HIV? WHICH IS THE BEST CHOICE OF ANTIRETROVIRAL THERAPY TO PATIENTS WITH HCV-HIV COINFECTION? Paulo Roberto Abrão Ferreira1, Simone de Barros Tenore2 1- Médico do ambulatório da Disciplina de Infectologia – UNIFESP 2- Médica do ambulatório da Disciplina de Infectologia – UNIFESP. Médica de Referência em Genotipagem (MRG) pelo Ministério da saúde/BR RESUMO A importância do tratamento das morbidades associadas ao vírus da hepatite C (HCV) em uma população crescente de pacientes co-infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem aumentado desde a introdução do tratamento anti-retroviral altamente potente (HAART). Como resultado, as atenções investigativas têm se voltado para doença hepática causada pelo HCV e para questões associadas ao tratamento na co-infecção. Pacientes co-infectados HCV-HIV têm cargas virais do HCV mais elevadas e mostram progressão mais rápida de fibrose em relação aos monoinfectados. O tratamento combinado com interferon peguilado e ribavirina (RBV) é considerado o padrão para pacientes co-infectados HCV-HIV. Este tratamento reduz a progressão de fibrose, mas a toxicidade atrapalha a identificação da dose ideal de RBV. Pacientes co-infectados têm cerca de três vezes mais risco de hepatotoxicidade associada aos anti-retrovirais, quando comparados com monoinfectados HIV. Outros desafios incluem anemia, toxicidade mitocondrial, interações medicamentosas e leucopenia. Consequentemente, a hepatite C crônica deve ser tratada em co-infectados, mas alguns passos têm que ser seguidos para se prevenir e tratar potenciais efeitos adversos. Descritores: HIV, HCV, Anti-retroviral, Interferon, Ribavirina ABSTRACT The importance of treating hepatitis C virus (HCV)-associated morbidities in a growing population of patients coinfected with human immunodeficiency virus (HIV) has increased since the introduction of highly active antiretroviral therapy. As a result, investigative attention is turning to HCV-related liver disease and treatment-associated issues in coinfection. HIV/HCV-coinfected patients have higher HCV RNA loads and show more rapid progression of fibrosis than do monoinfected patients. Combination therapy with pegylated interferon plus ribavirin (RBV) is the standard of care for HCV in coinfected patients. Therapy slows fibrosis progression, but toxicity prevents identification of the most effective RBV dose. Coinfected patients have about a threefold greater risk of anti-retroviral therapy-associated hepatotoxicity than patients with HIV only. Other challenges include anaemia, mitochondrial toxicity, drug-drug interactions and leucopenia. Thus, chronic hepatitis C should be treated in HIV/HCV-coinfected patients, but steps must be taken to prevent and treat potential toxicities. Keywords: HIV, HCV, Antiretroviral, Interferon, Ribavirin 1. O Problema da Co-infecção HCV/HIV Atualmente, a doença hepática é uma das causas mais comuns de morbi-mortalidade em pacientes portadores do HIV, em áreas onde há um alto número de usuários de droga intravenosa, com alta prevalência de hepatite(1). Esta prevalência pode chegar a 95% em pacientes usuários de drogas ilícitas, porém tende a ser menor em homens que fazem sexo com homens (11%)(2). No ambulatório da disciplina de infectologia da UNIFESP a prevalência global de hepatite C crônica em pacientes infectados pelo HIV é de 17,5%. O aumento da imTendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 11-15) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 11 11 portância das complicações hepáticas entre pacientes infectados pelo HIV resulta da queda significativa da ocorrência de infecções oportunistas, com a utilização do tratamento anti-retroviral com alta potência (TARV) e do aumento da sobrevida nestes pacientes. Há uma interferência bidirecional entre as infecções pelo vírus da hepatite C (HCV) e o vírus da imunodeficiência humana (HIV). A infecção aguda pelo HCV evolui mais facilmente para hepatite crônica em pacientes infectados pelo HIV, especialmente se houver imunossupressão avançada. Uma vez instalada a infecção crônica pelo HCV, os níveis de HCV RNA ten- 11 29.10.07 11:24:15 dem a ser muito mais elevados que em indivíduos infectados exclusivamente pelo HCV, no plasma e no tecido hepático(3). A progressão para fibrose é mais acelerada em pacientes coinfectados, proporcionalmente à imunossupressão(4). Dados recentes mostram que o paciente co-infectado tem de 2 a 6 vezes mais cirrose que o paciente exclusivamente infectado pelo HCV. Consequentemente, a progressão para hepatopatia em estágio terminal e o aparecimento do hepatocarcinoma são mais rápidos(5,6). Estudos clínicos mostraram resultados conflitantes sobre a influência do HCV na evolução da infecção pelo HIV e na capacidade de recuperação do CD4 com o uso de TARV(7). A infecção pelo HCV pode influenciar negativamente a recuperação do CD4, de forma indireta, pela baixa adesão ao TARV dos usuários de drogas intravenosas e pela maior hepatotoxicidade(8). A hepatite C crônica foi identificada em vários estudos como um dos principais fatores de risco para hepatotoxicidade do TARV, particularmente nos pacientes com fibrose mais avançada. Atualmente, a melhor forma de tratamento da hepatite C em pacientes infectados pelo HIV é a combinação interferon peguilado (pegINF) e ribavirina (RBV), porém o sucesso deste tratamento é menor quando se compara com pacientes infectados apenas com o HCV. Várias informações recentes têm possibilitado aumento do sucesso terapêutico em co-infectados HCV-HIV, particularmente, no que se refere à escolha dos anti-retrovirais (ARV). 2. Interações entre os Anti-retrovirais, Interferon e Ribavirina Os inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos formam o “backbone” da maioria dos esquemas antiretrovirais. Estes componentes mimetizam os nucleosídeos fisiológicos e entram nas vias intracelulares de fosforilação, causando inibição competitiva e interrupção do alongamento da cadeia, quando incorporados à síntese do DNA nascente. Interações entre ARV e RBV, a qual é um análogo de guanosina, tem sido motivo de preocupação, visto que mais que 75% dos pacientes co-infectados HCV-HIV, em tratamento com pegIFN e RBV, também estão recebendo ARV(9-15). A administração concomitante dos anti-retrovirais pode afetar a atividade terapêutica do interferon peguilado e ribavirina (RBV) de duas formas. Primeiramente, pode aumentar o risco de efeitos adversos pela sobreposição de toxicidades, tais como anemia mais profunda quando se usa zidovudina (AZT) concomitantemente(16). Estudo com interferon convencional alfa 2b e RBV mostrou que pacientes, ao receberem AZT, apresentaram redução de hemoglobina significantemente mais importante em relação aos que não utilizaram (-3,64 versus -2,08 g/dL de hemoglobina; p<0,01) e uma maior percentagem de pacientes apresentaram um nadir de hemoglobina menor que 10g/dL (67% versus 0%; p<0,001). Houve uma maior taxa de redução da dose de RBV nos pacientes em uso de AZT (60% versus 16%, sem AZT; p<0,01)(17). O mesmo fenômeno foi observado durante o tratamento com pegIFN alfa 2a e RBV no estudo APRICOT. A máxima redução de hemoglobina foi maior em pacientes utilizando AZT (-3,9 g/dL) comparativamente aos que não estavam utilizando AZT (-3,1 g/dL), e mais pacientes, usando AZT, apresentaram nadir de hemoglobina <10g/dL (26% versus 8%, sem AZT)(18). Ambos, AZT e pegINF, são mielossupressores a RBV pode levar à anemia hemolítica(19,20). Uma vez que a exposição à RBV é 12 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 12 12 muito importante para o sucesso terapêutico contra o HCV(21), é desejável que se evite o uso de AZT durante o tratamento da hepatite C, evitando-se a redução de dose da RBV. O aumento da lesão mitocondrial parece ser a via mais comum para explicar as interações deletérias entre RBV e alguns análogos de nucleosídeos como a didanosina (ddI) e estavudina (d4T)(22, 23, 24). Soma-se a este fato a lesão mitocondrial direta do HIV e do HCV, que é comprovada pela depleção de DNA mitocondrial em diferentes tipos de células, facilitando esta toxicidade(25). A RBV aumenta a fosforilação intracelular de metabólitos da didanosina (ddI) e, por isto, tem sido relatado maior risco de pancreatite, acidose lática e cirrose hepática descompensada, com o uso concomitante destas duas medicações(26,27,22,23). Atualmente, esta associação está contra-indicada. Em 31 casos relatados ao Food and Drug Administration (FDA) ocorreram 51 episódios de toxicidade mitocondrial em pacientes utilizando, concomitantemente, ddI e/ou d4T e RBV. Comparando-se com todos os pacientes, o risco (OR) de toxicidade mitocondrial foi de 12,4 vezes maior para ddI + d4T, 8,0 para ddI e 3,0 para d4T (todos p<0,05)(28). A perda de gordura subcutânea, tipicamente associada à estavudina e pode ser exacerbada durante o tratamento com pegINF e RBV, mimetizando lipoatrofia rapidamente progressiva(29). Mais do que a RBV, parece que o pegINF é o principal responsável por este efeito adverso, porém um aumento da toxicidade mitocondrial no tecido subcutâneo pela associação RBV e estavudina tem que ser considerada. O segundo mecanismo, pelo qual os ARV análogos de nucleosídeos podem influenciar o tratamento do HCV, pode ser através da interferência na atividade da RBV contra o HCV. Relatos preliminares mostraram que a farmacocinética da RBV não foi afetada pelo uso concomitante de tenofovir (TDF). O uso de RBV com TDF pode aumentar a fosforilação de metabólitos intracelulares do TDF, como ocorre com o ddI, já que ambos são análogos de adenosina. Entretanto, não há evidências de aumento do risco de nefrotoxicidade(30) e nem redução da resposta ao tratamento do HCV, quando do uso combinado do TDF com RBV(32,33). Estudos “in vitro” têm mostrado que metabólitos ativos da RBV podem reduzir a fosforilação de outros análogos de nucleosídeos no compartimento intracelular(34), o que poderia reduzir a atividade terapêutica dos ARV. No entanto, observações clínicas(35) e estudos de farmacocinética(36) não têm confirmado quaisquer relevâncias destas interações. Relatos recentes relatos indicam que o abacavir pode comprometer a eficácia da RBV e, consequentemente, o resultado final do tratamento da hepatite C crônica, reduzindo a possibilidade de sucesso(37,38[113,114]). Ambas as medicações são análogos de guanosina e podem competir no compartimento intracelular pelas mesmas vias de fosforilação (FIGURA 1). Em um grande estudo, envolvendo 426 pacientes co-infectados HCV-HIV, tratados com pegIFN e RBV, 46% dos pacientes sem uso de abacavir apresentaram resposta virológica sustentada, o que ocorreu em apenas 26% dos pacientes em uso de abacavir. Este efeito negativo persistiu após o ajuste para potenciais variáveis confundidoras. Este pior resultado foi ainda mais importante no grupo e pacientes com concentrações séricas mais baixas de RBV(38[114]). Estas observações geraram novas reflexões sobre o mecanismo de ação da RBV. A pesar de ainda haver controvérsias(39,40,41-46), estes dados, indiretamente, mas fortemente, suportam uma verdadeira ação antiviTendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 11-15) 29.10.07 11:24:15 ral da RBV contra o HCV, não apenas como imunomoduladora. É possível que o efeito antiviral da RBV contra o HCV seja semelhante ao já demonstrado contra outros vírus RNA(47-49). frequentemente envolvidos na toxicidade hepática relacionada ao dano mitocondrial(64). Mais grave, o uso prolongado de ddI tem sido reconhecido como fator de risco independente para o desenvolvimento de fibrose hepática amassada em pacientes portadores do HIV, quando outras causas de lesão hepática são excluídas(65). Inibidores de transcriptase reversa não-nuclesídeos podem causar lesão hepática no contexto das reações de hipersensibilidade ou por toxicidade direta. As apresentações clínicas variam conforme o mecanismo de toxicidade hepática (Tabela 1), Quase todos os estudos mostram que a nevirapina é mais hepatotóxica que o efavirenz(66-68). A presença de coinfecção com o HCV aumenta o risco de desenvolvimento de elevações de enzimas hepáticas em pacientes que recebem nevirapina, o que, geralmente, ocorre após 4 a 6 meses de tratamento(69,70). Este segundo pico de incidência de hepatoxicidade da nevirapina não está associado com reação de hipersensibilidade (54,70 nem com o aumento dos níveis da droga como conseqüência da doença hepática crônica pelo HCV(71). Precoce Intervalo Figura 1. Mecanismo proposto para a competição intracelular entre os análogos de guanosina abacavir e ribavirina. ABC = sulfato de abacavir; ABV = abacavir; CBV = carbovir; DP = difosfato; MP = monofosfato; RBV = ribavirina; TP = trifosfato. 3. Hepatotoxicidade Relacionada à Utilização de Antiretrovirais As elevações de enzimas hepáticas em pacientes infectados pelo HIV são multi-fatoriais(50,51). Em pacientes expostos aos ARV, quatro diferentes mecanismos de hepatotoxicidade têm sido descritos: (1) lesão mitocondrial em pacientes recebendo análogos de nucleosídeos, especialmente após exposição prologada ao ddI e d4T(52,53); (2) reações de hipersensibilidade envolvendo o fígado (por exemplo, nevirapina, efavirenz ou abacavir), geralmente após 12 semanas de tratamento e associada à farmacodermia(54); (3) lesão hepática direta (dose dependente), como no caso de uso de ritonavir (RTV) em dose plena(55); e (4) fenômeno de reconstituição imune, principalmente em pacientes gravemente imunossuprimidos, com infecção crônica de base pelo HBV (HCV?), no primeiro mês de tratamento com ARV(56). Em pacientes com infecção pelo HCV, hepatotoxicidade medicamentosa pode ser mediada por quaisquer destes mecanismos, mas as reações de hipersensibilidade são mais prováveis(57-59). Análogos de nucleosídeos podem contribuir para a ocorrência de esteatose hepática, a qual é frequentemente observada em pacientes portadores do HIV(60). A esteato-hepatite acelera a progressão da fibrose hepática em pacientes com hepatite C crônica. Resistência à insulina, dislipidemia e lipodistrofia estão associadas com esteatose. Em pacientes portadores do HCV genótipo 3, a esteatose é mais prevalente e isto poderia explicar a progressão mais acelerada de fibrose hepática nestes pacientes(61) e a maior incidência de hepatotoxicidade nos mesmos(62,63). O ddI e o d4T são os medicamentos mais Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 11-15) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 13 13 Mecanismo 1 semanas Imune Dose-dependente Relação com o HCV Relação com o CD4 Fármacos mais comuns Não Não Sim Abacavir e nevirapina Tardia 4 4-8 meses Toxicidade direta, cumulativa Sim Sim Não Estavudina, didanosina, nevirapina, ritonavir, tipranavir Tabela 1. Apresentação clínica da hepatotoxicidade aos anti-retrovirais A maioria dos inibidores de protease tem sido associados com episódios de toxicidade hepática, sendo menos hepatotóxicos: lopinavir/baixa dose de RTV, fosamprenavir/baixa dose de RTV, nelfinavir(72,73), darunavir/baixa dose de RTV(31). Tipranavir/baixa dose de RTV mostrou-se mais hepatotóxicos(75). Hiperbilirrubinemia está frequentemente associada com atazanavir e/ou indinavir, mas não reflete lesão hepática e está relacionada com a inibição da UDP-glucuronosyltransferase(76). Apesar da preocupação pela, relativamente, alta incidência de toxicidade hepática com o uso de ARV em pacientes coinfectados HCV-HIV, os benefícios superam os riscos. Muitos relatos têm, claramente, demonstrado baixas de mortalidade por causa hepática em pacientes co-infectados HCV-HIV, usando ARV, mesmo naqueles com doença hepática em estágio terminal(77), comparado com pacientes não recebendo ARV ou tratados com combinações subótimas(78,79). Dado que a imunossupressão acelera a progressão de fibrose relacionada à hepatite C(80,81,82), é recomendável iniciar o uso de ARV até mais precocemente em co-infectados HCV-HIV(83). A carga viral elevada do HIV está diretamente relacionada com o curso da fibrose hepática em co-infectados HCV-HIV(84), e o sucesso do uso de ARV é capaz de prevenir a rápida progressão da fibrose hepática(85). 13 29.10.07 11:24:15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Reisler R, Han C, Burman W, Tedaldi E, Neaton J. Grade 4 events are as important as AIDS events in the era of HAART. J Acquir Immune Defic Syndr 2003; 34: 379-86. 2. Roca B, Suarez I, Gonzalez J, et al. Hepatitis C virus and human immunodeficiency virus coinfection in Spain. J Infect 2003;47:117–124 3. Bonacini M, Govindarajan S, Blatt L, Schmid P, Conrad A, Lindsay K. Patients coinfected with HIV and hepatitis C demonstrate higher levels of hepatic HCV RNA. J Viral Hepat 1999; 6: 203-8. 4. Martín-Cabonero L, Benhamou Y, Puoti M, et al. Incidence and predictors of severe liver fibrosis in HIV-infected patients with chronic hepatitis C – a European collaborative study. Clin Infect Dis 2004; 38: 128-33. 5. Soto B, Sanchez-Quijano A, Rodrigo L et al. HIV infection modifies the natural history of chronic parenteral acquired hepatitis C with an unusually rapid progression to cirrhosis. J Hepatol 1997; 26: 1-5. 6. Garcia-Samaniego J, Rodriguez M, Berenguer J, et al. Hepatocellular carcinoma in HIV-infected patients with chronic hepatitis C. Am J Gastroenterol 2001; 96: 179-83. 7. Tedaldi E, Baker R, Moorman A, et al. Influence of coinfection with HCV on morbidity and mortality due to HIV infection in the era of HAART. Clin Infect Dis 2003; 36: 363-7. 8. Dronda F, Zamora J, Moreno S, et al. CD4 cell recovery during successful antiretroviral therapy in naive HIV-infected patients: the role of intravenous drug use. AIDS 2004; 18: 2210-2. 9. Chung RT, Andersen J, Volberding P, Robbins GK, Liu T, Sherman KE, Peters MG, Koziel MJ, Bhan AK, Alston B, Colquhoun D, Nevin T, Harb G, van der Horst C; AIDS Clinical Trials Group A5071 Study Team. Peginterferon Alfa-2a plus ribavirin versus interferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C in HIV-coinfected persons. N Engl J Med. 2004 Jul 29;351(5):451-9. 10. Carrat F, Bani-Sadr F, Pol S, Rosenthal E, Lunel-Fabiani F, Benzekri A, Morand P, Goujard C, Pialoux G, Piroth L, Salmon-Ceron D, Degott C, Cacoub P, Perronne C; ANRS HCO2 RIBAVIC Study Team. Pegylated interferon alfa2b vs standard interferon alfa-2b, plus ribavirin, for chronic hepatitis C in HIV-infected patients: a randomized controlled trial.JAMA. 2004 Dec 15;292(23):2839-48. 11. Torriani FJ, Rodriguez-Torres M, Rockstroh JK, Lissen E, Gonzalez-Garcia J, Lazzarin A, Carosi G, Sasadeusz J, Katlama C, Montaner J, Sette H Jr, Passe S, De Pamphilis J, Duff F, Schrenk UM, Dieterich DT; APRICOT Study Group. Peginterferon Alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection in HIV-infected patients. N Engl J Med. 2004 Jul 29;351(5):438-50. 12. Laguno M, Murillas J, Blanco JL, Martinez E, Miquel R, Sanchez-Tapias JM, Bargallo X, Garcia-Criado A, de Lazzari E, Larrousse M, Leon A, Lonca M, Milinkovic A, Gatell JM, Mallolas J. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for treatment of HIV/HCV coinfected patients. AIDS. 2004 Sep 3;18(13):F27-36. 13. Santin M, Shaw E, Garcia MJ, Delejido A, de Castro ER, Rota R, Altes J, Baguena F, Valero S, Sala M, Casanova A; HCV/HIV-01 Study Team. Efficacy and safety of pegylated interferon-alpha2b plus ribavirin for the treatment of chronic hepatitis C in HIV-infected patients. AIDS Res Hum Retroviruses. 2006 Apr;22(4):315-20. 14. Voigt E, Schulz C, Klausen G, Goelz J, Mauss S, Schmutz G, Jessen H, Weitner L, Mutz A, Schranz D, Rockstroh JK, Kaad Study Group. Pegylated interferon alpha-2b plus ribavirin for the treatment of chronic hepatitis C in HIV-coinfected patients. J Infect. 2006 Jul;53(1):36-42. 15. Soriano V, Perez-Olmeda M, Rios P, Nunez M, Garcia-Samaniego J, Gonzalez-Lahoz J. Hepatitis C virus (HCV) relapses after anti-HCV therapy are more frequent in HIV-infected patients. AIDS Res Hum Retroviruses. 2004 Apr;20(4):351-3. 16. Brau N, Rodriguez-Torres M, Prokupek D, Bonacini M, Giffen C, Smith J, et al. Treatment of chronic hepatitis C in HIV/HCVcoinfection with interferon alpha-2b R ribavirin full-course vs 16-week delayed ribavirin. Hepatology 2004; 39:989–998. 17. Bra¨u N, Rodriguez-Torres M, Prokupek D, et al. Treatment of chronic hepatitis C in HIV/HCV-coinfection with interferon alpha-2bþ full-course vs. 16-week delayed ribavirin. Hepatology 2004;39:989–998. 18. Bra¨u N, Torriani FJ, Rockstroh J, et al. Safety of peginterferon alfa-2a (PEGASYS) 180 mcg weekly plus THERAPY OF HIV/HCV COINFECTION: PEG-IFN +RBV/BRA¨ U 49 ribavirin (RBV) 800 mg daily in HIV/HCV coinfection compared to HCV monoinfection. Presented at: the XV International AIDS Conference (abstract MoPeB3311), July 11–16, 2004: Bangkok. 19. Poynard T, Marcellin P, Lee SS, et al. Randomised trial of interferon alpha2b plus ribavirin for 48 weeks or for 24 weeks versus interferon alpha2b plus placebo for 48 weeks for treatment of chronic infection with hepatitis C virus. International Hepatitis Interventional Therapy Group (IHIT). Lancet 1998;352:1426–1432. 14 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 14 14 20. Shiffman ML, Hofmann CM, Sterling RK, Luketic VA, Contos MJ, Sanyal AJ. A randomized, controlled trial to determine whether continued ribavirin monotherapy in hepatitis C virus-infected patients who responded to interferon-ribavirin combination therapy will enhance sustained virologic response. J Infect Dis 2001;184:405–409. 21. Hadziyannis SJ, Sette H Jr, Morgan TR, et al. Peginterferon-alpha2a and ribavirin combination therapy in chronic hepatitis C: a randomized study of treatment duration and ribavirin dose. Ann Intern Med 2004;140: 346–355. 22. Lafeuillade A, Hittinger G, Chapadaud S. Increased mitochondrial toxicity with ribavirin in HIV/HCV coinfection. Lancet 2001; 357:280–281. 23. Moreno A, Quereda C, Moreno L, Perez-Elias MJ, Muriel A, Casado JL, et al. High rate of didanosine-related mitochondrial toxicity in HIV/HCV-coinfected patients receiving ribavirin. Antivir Ther 2004; 9:133–138. 24. Garcia-Benayas T, Blanco F, Soriano V. Weight loss in HIV-infected patients. N Engl J Med 2002; 347:1287–1288. 25. de Mendoza C, Sanchez-Conde M, Timmermans E, Buitelaar M, de Baar MP, Gonzalez-Lahoz J, et al. Mitochondrial DNA depletion in HIV-infected patients is more pronounced with chronic hepatitis C and enhanced following treatment with pegylated interferon plus ribavirin. Antivir Ther 2005; 10: 557–561. 26. Mauss S, Valenti W, Depamphilis J, Duff F, Cupelli L, Passe S, et al. Risk factors for hepatic decompensation in patients with HIV/HCV coinfection and liver cirrhosis during interferonbased therapy. AIDS 2004; 18:F21–F25. 27. Bani-Sadr F, Carrat F, Pol S, Hor R, Rosenthal E, Goujard C, et al. Risk factors for symptomatic mitochondrial toxicity in HIV/hepatitis C virus-coinfected patients during interferon plus ribavirin-based therapy. J Acquir Immune Defic Syndr 2005; 40:47–52. 28. Fleischer R, Boxwell D, Sherman KE. Nucleoside analogues and mitochondrial toxicity. Clin Infect Dis 2004;38:e79–e80. 29. Garcia-Benayas T, Blanco F, Soriano V. Weight loss in HIV-infected patients. N Engl J Med 2002; 347:1287–1288. 30. Sanchez-CondeM, Gil P, Sanchez-SomolinosM,Gonzalez-Lahoz J, Soriano V. Hepatic and renal safety profile of tenofovir in HIV-infected patients with hepatitis C, including patients on interferon plus ribavirin. HIV Clin Trials 2005; 6:278–280. 31. Madruga JV, Berger D, McMurchie M, Suter F, et al.. Efficacy and safety of darunavir-ritonavir compared with that of lopinavir-ritonavir at 48 weeks in treatment-experienced HIV-infected patients in TITAN: a randomised controlled phase III trial. Lancet 2007; 370:49-58. 32. Kearney B, Benhamou Y, Flaherty J, Sayre J, Yake K, Currie G, et al. Lack of systemic and renal drug interactions of tenofovir DF with ribavirin or adefovir dipivoxil. XV International Conference on AIDS. Bangkok, July 2005 [abstract Po4628]. 33. Margot N, Miller M. In vitro combination studies of tenofovir and other nucleoside analogues with ribavirin against HIV-1. Antivir Ther 2005; 10:343– 348. 34. Sim S, Hoggard P, Sales S, Phiboonbanakit D, Hart C, Back D. Effect of ribavirin on zidovudine efficacy and toxicity in vitro: a concentrationdependent interaction. AIDS Res Hum Retroviruses 1998; 14:1661–1667. 35. Landau A, Batisse D, Piketty C, Jian R, Kazatchkine MD. Lack of interference between ribavirin and nucleosidic analogues in HIV/HCV co-infected individuals undergoing concomitant antiretroviral and anti-HCV combination therapy. AIDS 2000; 14:1857–1858. 36. Rodriguez-Torres M, Torriani F, Soriano V, Borucki M, Lissen E, Sulkowski M, et al. Effect of ribavirin on intracellular and plasma pharmacokinetics of nucleoside reverse transcriptase inhibitors in patients with HIV-hepatitis C virus coinfection: results of a randomized clinical study. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49:3997–4008. 37. Bani-Sadr F, Denoeud L, Morand P, Lunel-Fabiani F, Pol S, Cacoub P, Perronne C, Carrat F; Agence Nationale pour la Recherche contre le SIDA et les Hepatites Virales HC02-Ribavic Study Team. Early virologic failure in HIV-coinfected hepatitis C patients treated with the peginterferon-ribavirin combination: does abacavir play a role? J Acquir Immune Defic Syndr. 2007 May 1;45(1):123-5. 38. Vispo E, Barreiro P, Maida I, et al. Abacavir-containing HAART reduces the chances for SVR to peg-interferon plus RBV in HIV-infected patients with chronic hepatitis C. Program and abstracts of the 3rd International Workshop on HIV and Hepatitis Coinfection; June 7-9, 2007; Paris, France. Abstract 46. 39. Graci JD, Cameron CE. Quasispecies, error catastrophe, and the antiviral activity of ribavirin. Virology. 2002 Jul 5;298(2):175-80. 40. Neyts J. Selective inhibitors of hepatitis C virus replication. Antiviral Res. 2006 Sep;71(2-3):363-71. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 11-15) 29.10.07 11:24:16 41. Hofmann WP, Polta A, Herrmann E, Mihm U, Kronenberger B, Sonntag T, Lohmann V, Schönberger B, Zeuzem S, Sarrazin C. Mutagenic effect of ribavirin on hepatitis C nonstructural 5B quasispecies in vitro and during antiviral therapy. Gastroenterology. 2007 Mar;132(3):921-30. 42. Lutchman G, Danehower S, Song BC, Liang TJ, Hoofnagle JH, Thomson M, Ghany MG. Mutation rate of the hepatitis C virus NS5B in patients undergoing treatment with ribavirin monotherapy. Gastroenterology. 2007 May;132(5):1757-66. 43. Perelson AS, Layden TJ. Ribavirin: is it a mutagen for hepatitis C virus? Gastroenterology. 2007 May;132(5):2050-2. 44. Chevaliez S, Brillet R, Lazaro E, Hezode C, Pawlotsky JM. Analysis of ribavirin mutagenicity in human hepatitis C virus infection. J Virol. 2007 Jul;81(14):7732-41. 45. Lanford RE, Chavez D, Guerra B, Lau JY, Hong Z, Brasky KM, Beames B. Ribavirin induces error-prone replication of GB virus B in primary tamarin hepatocytes. J Virol. 2001 Sep;75(17):8074-81. 46. Vignuzzi M, Stone JK, Andino R. Ribavirin and lethal mutagenesis of poliovirus: molecular mechanisms, resistance and biological implications. Virus Res. 2005 Feb;107(2):173-81. 47. Sun Y, Chung DH, Chu YK, Jonsson CB, Parker WB. Activity of ribavirin against Hantaan virus correlates with production of ribavirin-5’-triphosphate, not with inhibition of IMP dehydrogenase. Antimicrob Agents Chemother. 2007 Jan;51(1):84-8. 48. Sierra M, Airaksinen A, Gonzalez-Lopez C, Agudo R, Arias A, Domingo E. Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe. J Virol. 2007 Feb;81(4):2012-24. 49. Sanchez-Conde M, Gil P, Sanchez-Somolinos M, Gonzalez-Lahoz J, Soriano V. Hepatic and renal safety profile of tenofovir in HIV-infected patients with hepatitis C, including patients on interferon plus ribavirin. HIV Clin Trials. 2005 Sep-Oct;6(5):278-80. 50. Nuñez M, Soriano V. Hepatotoxicity of antiretrovirals: incidence, mechanisms and management. Drug Saf 2005; 28:53–66. 51. McGovern B.Hepatic safety andHAART. J IAPAC(International Association of Physicians in AIDS Care) 2004; 3 (suppl 2):23–40. 52. Chariot P, Drogou I, Lacroix-Szmania I, Eliezer-Vanerot M, Chazaud B, Lombes A, et al. Zidovudine-induced mitochondrial disorder with massive liver steatosis, myopathy, lactic acidosis, and mitochondrial DNA depletion. J Hepatol 1999; 30:156–160. 53. Lenzo N, Garas B, French M. Hepatic steatosis and lactic acidosis associated with stavudine treatment in an HIV patient: a case report. AIDS 1997; 11:1294–1296. 54. Sanne I, Mommeja-Marin H, Hinkle J, Bartlett J, Lederman M, Maartens G, et al. Severe hepatotoxicity associated with nevirapine use in HIV-infected subjects. J Infect Dis 2005; 191:825–829. 55. Sulkowski M, Thomas D, Chaisson R, Moore R. Hepatotoxicity associated with antiretroviral therapy in adults infected with HIV and the role of hepatitis C or B virus infection. JAMA 2000; 283:74–80. 56. Velasco M, Moran A, Tellez MJ. Resolution of chronic hepatitis B after ritonavir treatment in an HIV-infected patient. N Engl J Med 1999; 340:1765–1766. 57. Rodriguez-Rosado R, Garcia-Samaniego J, Soriano V. Hepatotoxicity after introduction of highly active antiretroviral therapy. AIDS 1998; 12:1256. 58. Aceti A, Pasquazzi C, Zechini B, De Bac C, for the LIVERHAART Group. Hepatotoxicity development during antiretroviral therapy containing protease inhibitors in patients with HIV. The role of hepatitis B and C virus infection. J Acquir Immun Defic Syndr 2002; 29:41–48. 59. Den Brinker M, Wit F, Wertheim-van Dillen P. Hepatitis B and C virus coinfection and the risk for hepatotoxicity of highly active antiretroviral therapy in HIV-1 infection. AIDS 2000; 14:2895–2902. 60. Piroth L. Liver steatosis in HIV-infected patients. AIDS Ver 2005; 7:197–209. 61. Barreiro P, Martin-Carbonero L, Nuñez M, Rivas P, Morente A, Simarro N, et al. Predictors of liver fibrosis in HIV-infected patients with chronic hepatitis C: assessment using transient elastometry and role of HCV genotype 3. Clin Infect Dis 2006; 42:1032–1039. 62. Nuñez M, Ríos P, Martín-Carbonero L, Pérez-Olmeda M, González-Lahoz J, Soriano V. Role of hepatitis C virus genotype in the development of severe transaminase elevation after the introduction of antiretroviral therapy. J Acquir Immun Defic Syndr 2002; 30:65–68. 63. Torti C, Lapadula G, Puoti M, Casari S, Uccelli M, Cristini G, et al. Influence of genotype 3 hepatitis C coinfection on liver enzyme elevation in HIV-1positive patients after commencement of a new highly active antiretroviral regimen: results from the EPOKA-MASTER cohort. J Acquir Immune Defic Syndr 2006; 41:180–185. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 11-15) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 15 15 64. Batisse D, van Huyen J, Piketty C, Canali G, Karmochkine M, Weiss L, et al. Severe liver mitochondriopathy with normal liver histology and normal lactate levels in patients receiving nucleoside analogues. AIDS 2002; 16:2370–2371. 65. Maida I, Nuñez M, Rios MJ, Martin-Carbonero L, Sotgiu G, Toro C, et al. Severe liver disease associated with prolonged exposure to antiretroviral drugs. J Acquir Immune Defic Syndr 2006; 42:177–182. 66. Sulkowski M, Thomas D, Mehta S, Chaisson R, Moore R. Hepatotoxicity associated with nevirapine or efavirenz-containing antiretroviral therapy: role of hepatitis C and B infections. Hepatology 2002; 35:182–189. 67. Martin-Carbonero L, Nuñez M, Gonzalez-Lahoz J, Soriano V. Incidence of liver injury after beginning antiretroviral therapy with efavirenz or nevirapine. HIV Clin Trials 2003; 4:115–120. 68. van Leth F, Phanuphak P, Ruxtrungham K, Baraldi E, Miller S, Gazzard B, et al. Comparison of first-line antiretroviral therapy with regimens including nevirapine, efavirenz, or both drugs, plus stavudine and lamivudine: a randomised openlabel trial, the 2NN Study. Lancet 2004; 363:1253–1263. 69. Martinez E, Blanco JL, Arnaiz J, Perez-Cuevas J, Mocroft A, Cruceta A, et al. Hepatotoxicity in HIV-infected patients receiving nevirapine-containing antiretroviral therapy. AIDS 2001; 15:1261–1268. 70. Gonzalez de Requena D, Nuñez M, Jimenez-Nacher I, Soriano V. Liver toxicity caused by nevirapine. AIDS2002; 16:290–291. 71. Gonzalez de Requena D, Jimenez-Nacher I, Soriano V. Changes in nevirapine plasma concentrations over time and its relationship with liver enzyme elevations. AIDS Res Hum Retroviruses 2005; 21:555–559. 72. Sulkowski M, Mehta S, Chaisson R, Thomas D, Moore R. Hepatotoxicity associated with protease inhibitor-based antiretroviral regimens with or without concurrent ritonavir. AIDS 2004; 18:2277–2284. 73. Eron J, Yeni P, Gathe J, Estrada V, De Jesus E, Stazewski S, et al. The KLEAN study of fosamprenavir-ritonavir versus lopinavirritonavir, each in combination with abacavir-lamivudine, for initial treatment of HIV infection over 48 weeks: a randomized non-inferiority trial. Lancet 2006; 368:476–482. 74. Rockstroh J, Sulkowski M, Neubacher D, Mayers D, Stern J. 24-week efficacy of tipranavir boosted with ritonavir in hepatitis B or C coinfected patients. 45th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, December 2006 [abstract H-525]. 75. Pineda J, Palacios R, Rivero A, Abdel-Kader R, Marquez M, Cano P, et al. Low incidence of severe liver toxicity in patients receiving antiretroviral combinations including atazanavir. J Antimicrob Chemother 2006; 57:1016– 1017. 76. Benhamou Y, Mats V, Walczak D. Systemic overview of HAART-associated liver enzyme elevations in patients infected with HIV and co-infected with HCV. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, February 2006 [abstract 88]. 77. Merchante N, Giron JA, Gonzalez-Serrano M, Torre-Cisneros J, GarciaGarcia JA, Arizcorreta A, et al. Survival and prognostic factors of HIV-infected patients with HCV-related endstage liver disease. AIDS 2006; 20:49–57. 78. Bonacini M, Louie S, Bzowej N, Wohl A. Survival in patients with HIV infection and viral hepatitis B or C: a cohort study. AIDS 2004; 18:2039–2045. 79. Qurishi N, Kreuzberg C, Luchters G, Effenberger W, Kupfer B, Sauerbruch T, et al. Effect of antiretroviral therapy on liverrelated mortality in patients with HIV and hepatitis C virus coinfection. Lancet 2003; 362:1708–1713. 80. Benhamou Y, Bochet M, di Martino V, Charlotte F, Azria F, Couteliier A, et al. Liver fibrosis progression in HIV and hepatitis C virus coinfected patients. Hepatology 1999; 30:1054–1058. 81. Martínez-Sierra C, Arizcorreta A, Díaz F, Roldan R, Martin-Herrera L, PerezGuzman L, et al. Progression of chronic hepatitis C to liver fibrosis and cirrhosis in patients coinfected with hepatitis C virus and HIV. Clin Infect Dis 2003; 36:491–498. 82. Puoti M, Bonacini M, Spinetti A, Putzolu V, Govindarajan S, Zaltron S, et al. Liver fibrosis progression is related to CD4R cell depletion in patients with hepatitis C and HIV coinfection. J Infect Dis 2001; 183:134–137. 83. Shafran S. Early initiation of antiretroviral therapy: the current best way to reduce liver-related deaths in HIV/HCV-coinfected patients. J Acquir Immune Defic Syndr 2007; in press. 84. Brau N, Salvatore M, Rios-Bedoya C, Fernandez-Carbia A, Paronetto F, Rodriguez-Orengo J, et al. Slower fibrosis progression in HIV/HCV-coinfected patients with successful HIV suppression using antiretroviral therapy. J Hepatol 2006; 44:47–55. 85. Tural C, Fuster D, Tor J, Ojanguren I, Sirera G, Ballesteros A, et al. Time on antiretroviral therapy is a protective factor for liver fibrosis in HIV and hepatitis C virus co-infected patients. J Viral Hepat 2003; 10:118–125. 15 29.10.07 11:24:16 VACINAS PROFILÁTICAS ANTI-HIV PREVENTIVE VACCINES ANTI-HIV Jorge Casseb Médico-Pesquisador do Laboratório de Imunologia e Dermatologia – LIM56 FMUSP Médico-Infectologista do Instituto de infectologia Instituto de Infectologia “Emílio Ribas”, Secretaria de Saúde do Estado de São Paulo, Brasil. RESUMO Cerca de 60 milhões de pessoas foram infectadas pelo HIV nos últimos 25 anos da pandemia e com mais de 20 milhões de mortes. A imunidade natural e virtualmente inexiste ao vírus e uma vacina preventiva permanece um desafio de elevada proporção. O acometimento e adoecimento de milhões de pessoas, especialmente nos países pobres leva uma disruptura nessas sociedades, com elevadas perdas econômicas e sociais. Embora o uso de anti-retrovirais aumentou a sobrevida e diminuído a morbidade, o seu elevado custo e efeitos adversos ao longo prazo, como também a incapacidade de erradicação do vírus, indica que a pesquisa de uma vacina deve ser uma prioridade cientifica mundial. Existem enormes desafios, coma variedade viral e os vários mecanismos de imune escape, porém nunca na história da humanidade, houve tanto progresso contra um agente infeccioso em pouco tempo. Deste modo, a descoberta de uma vacina profilática somente será possível com envolvimento de cientistas de diversas áreas do conhecimento e de vários países trabalhando em estreita colaboração. Descritores: HIV-1, Vacina, Prevenção ABSTRACT 60 millions of persons had been infected by HIV in last the 25 years of the pandemic, with more than 20 millions of deaths. The natural immunity virtually does not exist to the virus and a preventive vaccine remains a challenge. Millions of sick subjects, especially in poor countries, may lead to distress of these societies, with raised economic and social losses. Although the use of antiretrovirals, in the long fashion, increased the survival and diminished the morbidity, its raised adverse cost and effect, as well as the incapacity of eradication of the virus, indicates that the research of a vaccine must be worldwide a scientific priority. Despite the enormous challenges, such as high viral diversity and the several mechanisms of immune escape, never in the humanity’s history, so much progress have been made against an infectious agent in a short time. In this way, the discovery of a prophylactic vaccine will only be possible with scientist engagement of diverse areas and diverse countries working in close contribution. Keywords: HIV-1, Preventive, Vaccine INTRODUÇÃO Hoje, após quase vinte e cinco anos de seu conhecimento, a Aids se tornou a mais importante doença infecciosa do globo. Somente em 2005, mais de 5,5 milhões foram infectadas pelo vírus HIV, com uma taxa de aproximadamente 15.000 novas infecções por dia. Apesar de todo o esforço científico no intuito da melhoria das terapias antiretrovirais, as medidas profiláticas continuam ser de capital importância para conter ou diminuir a evolução nos números de indivíduos contaminados. Neste sentido, o desenvolvimento de uma vacina parece ser uma resposta racional. Contudo, devido à história natural, a fisiopatogenia da doença e a diversidade viral, o desenvolvimento de uma vacina com reais capacidades protetoras tem sido de difícil obtenção. Apesar dos desafios do desenvolvimento de uma vacina contra Aids, os cientistas acreditam que nessa possibilidade. Essas convicções se baseiam no fato de que: Um pequeno numero de indivíduos permanece não infectado a despeito de uma evidente e repetida exposição ao HIV. Existe uma robusta reposta celular contra o HIV que leva ao contra parcial da infecção em poucos pacientes. Durante um curso natural da infecção, a resposta celular consegue suprimir a carga viral por um período razoável. 16 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 16 16 Até o momento nenhum dos candidatos vacinais em teste demonstraram estas características. Apesar disto, testes em macacos indicam ser possível o desenvolvimento de uma vacina pois: • Símios podem ser completamente protegidos contra SIV com uma cepa viva atenuada do vírus criada pela mutação em genes críticos; uma cepa equivalente em humanos implica em uma doença com progressão lenta; • Os macacos protegidos não são nem mesmo superinfectados pelo SHIV, de modo que a proteção não é cepa-específica; • Na infecção aguda, o sistema imune inicialmente desenvolve uma resposta citotóxica capaz de controlar parcialmente a replicação viral. O produto vacinal mais adequado deveria possuir as seguintes qualidades: • Ser de fácil administração, transporte e estável na armazenagem; • Prevenir a infecção e/ou doença; • Fornecer proteção contra a exposição de mucosa e parenteral; • Induzir uma resposta imune durável e de ampla reatividade; • Ser segura e bem tolerada. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 16-18) 29.10.07 11:24:16 A ausência de correlatos claros da proteção imune é um obstáculo para o desenvolvimento de uma vacina efetiva e segura. As interpretações da correlação da proteção imune em modelos animais da infecção pelo SIV varia amplamente na literatura incluindo anticorpos neutralizantes e respostas celulares. Formulações vacinais individuais devem induzir respostas imunes celulares e humorais distintas por diferentes mecanismos e assim proporcionar uma imunidade protetora. A importância da imunidade de mucosa para o sistema imune tem sido negligenciada no desenvolvimento de vacinas. De fato, mais de noventa porcento das novas transmissões do HIV são através da mucosa. Os tecidos de mucosa são os sítios primários da entrada do HIV e da infecção inicial e deste modo a indução de uma resposta de linfócitos T citotóxicos na mucosa pode ser crítica para o sucesso contra vírus transmitidos através da mucosa. Como exemplo, a imunização intra-retal com glicoproteínas do envelope viral em camundongos induz respostas citotóxicas nos sítios de mucosa que são mais protetoras que aquelas induzidas pela imunização sistêmica. Um dos grandes argumentos a favor do desenvolvimento das vacinas que levem a uma imunidade de mucosa é o efeito “altruísta” posto que indivíduos vacinados e com imunidade de mucosa possivelmente tendam a disseminar baixas cargas virais e talvez propagar a imunidade para indivíduos não vacinados. A interação do HIV com as células alvo é um processo dinâmico que envolve sua ligação, fusão e entrada na célula. Cada um destes processos distintos envolve diferentes moléculas do sistema imune, muitos dos quais são potenciais alvos para anticorpos que possam interromper o processo infeccioso. O primeiro passo da entrada na célula envolve a interação de alta afinidade entre a molécula CD4 da célula alvo e a glicoproteina (gp) oligomérica 120/42 expressa no envelope viral, isso resulta em mudanças conformacionais substanciais do envelope e conseqüente exposição diferencial de sítios antigênicos bloqueadores. Este passo inicial é seguido pela ligação aos receptores de quimiocinas CCR5 e CXCR4 com posterior fusão das membranas viral e da célula hospedeira mediada por regiões na gp41. O alto grau de glicosilação presente nas proteínas do envelope viral é um obstáculo na construção de peptídeos vacinais. Ensaios in vitro demonstraram que, embora uma cepa viral pudesse ser controlada através de anticorpos, estes mesmos anticorpos em sistemas biológicos (testes in vivo) não bloqueavam efetivamente os epítopos virais. Isto deve-se as diferenças entre as cepas testadas in vitro e in vivo já que as últimas apresentam em seu envelope proteínas mais glicosiladas. A alta taxa de carboidratos dificulta a apresentação antigênica eficaz e também impede a exposição dos epítopos bloqueadores. Infelizmente, até agora, a maioria dos alvos vacinais relevantes encontram-se nas áreas de grande glicosilação e que sofrem de mudança conformacional durante a fusão com a célula hospedeira, alterando os epítopos. Do ponto de vista imunológico as vacinas devem promover tanto respostas humorais como respostas celulares citotóxicas. As primeiras são importantes para promover o bloqueio da entrada do vírus nas células alvo enquanto que as últimas são necessárias para destruir células já infectadas. Esta noção é aplicada na definição de vacinas profiláticas e terapêuticas. A possibilidade de elicitar uma resposta anticórpica capaz de impedir a entrada do vírus na célula do hospedeiro foi o objetivo de grande parte das vacinas testadas ate o Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 16-18) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 17 17 momento. Ela deve ser capaz de evitar o contágio e também impedir a disseminação do vírus uma vez já dentro do organismo. Por outro lado, recentemente ficou claro que respostas baseadas em CTL (linfócitos T citotóxicos) são úteis porque possibilitam ao sistema imunológico do hospedeiro destruir células já infectadas, onde o vírus fica protegido da ação de anticorpos. Recentes pesquisas têm buscado modificar estruturalmente as glicoproteínas gp120 e gp41 do HIV-1 pela remoção de regiões variáveis ou pela deglicolizacão seletiva, produzindo isolados de HIV-1 mais suscetíveis á neutralização por anticorpos e capazes de induzir anticorpos para diferentes epítopos. As respostas neutralizantes mais potentes têm sido induzidas em camundongos pelo uso de uma vacina composta por um complexo ternário expressando a gp160, CD4 e CCR5. Os anticorpos assim induzidos neutralizam múltiplos isolados primários de HIV e sugerem que a imunogenicidade para epítopos críticos no envelope do HIV pode ser aumentada após a ligação com o CD4 e CCR5. Ao contrário das primeiras vacinas baseadas nas glicoproteínas gp120 ou gp160 do HIV-1 e que visavam induzir anticorpos neutralizantes, as atuais são projetadas para promover imunidade celular e fazem uso de vetores vivos recombinantes como o poxvirus e o canaryvirus. Mais recentemente surgiram abordagens vacinais baseadas na imunização com DNA. Os testes com estes candidatos vacinais tem se mostrados seguros e fornecidos informações importantes para novas abordagens. A VaxGen (Brisbane, CA, USA) realizou a fase III de testes com uma vacina de gp120 envolvendo 5400 voluntários no USA, na sua maioria homens homossexuais. Esta é baseada em duas variantes do vírus B do HIV-1 que são prevalentes nos estados Unidos. A fase III foi iniciada pela mesma companhia em março de 1999 na Tailândia e usou uma vacina bivalente com a gp120 que, em adição a proteína do subtipo B, inclui também uma gp120 derivada do subtipo E prevalente naquele país. Esse estudo na demonstrou proteção contra a infecção pelo HIV, porem não houve aumento de exposição dos indivíduos e os pesquisadores concluíram que apesar do fracasso na obtenção de um produto eficiente, existe a possibilidade de conduzir um estudo clinico em larga escala e em diversos paises simultaneamente. Atualmente dois grandes testes em fase II/III estão em andamento no mundo. A fase III de uma vacina construída com o vetor Canarypox para HIV-1, sozinho ou reforçada com gp120, está sendo conduzido pelo Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos e envolve 16.000 voluntários americanos e de outros países. Os resultados esperados para 2008/2009, poderão indicar se estratégia pode ser útil em vacina preventiva, ou mesmo diminuir a carga viral naqueles indivíduos que se infectarem durante o estudo. Um outro estudo usa como vetor o vírus adenovírus tipo 5, em cerca de 3000 voluntários. Alem da vacina com três genes do HIV, gag, pol e nef, o estudo também utiliza a estratégia chamada “primer booster”, cm reforço de uma vacina de peptídeos coma subunidade da gp120. Deste modo, também a resposta celular citotóxica, quanto a humoral, deverão induzidas por essas duas vacinas. Os resultados desses estudos poderão trazer importante contribuição no entendimento da resposta imune celular e possibilidade do uso de peptídeos sintéticos com dose reforço. Na Tabela 1 estão relacionadas os principais candidatos vacinais testadas ate o momento. 17 29.10.07 11:24:17 Resumos dos principais eventos relacionados ao desenvolvimento de vacina anti-HIV Fonte: www.iavi.org/trialdh; Boletim VACINAS anti HIV/AIDS – nº13 – GIV, Junho, 2005 Tabela 1. Ensaios de produtos candidatos a vacinas preventivas contra HIV/Aids testadas desde 2001 Vetor Inserto Padrão imune Canary poxvirus Env (E), Gag/Pol Celular + proteína (B), Env (B,E) humoral Fabricante ou patrocinador Aventis/Vaxgen RAd Env (E), Pol, nef Celular (B) Merck DNA/rAd Env (E), Gag/Pol Celular (B), Nef (B), Env humoral (A, B, C) VRC, NIAID, NIH AAV Gag (C), PR (C), Celular RT (C) IAVI Lipopeptídeos Gag (B), Pol (B), Celular Nef (B) ANRS Descrição de candidatas à vacina anti aids em ensaios clínicos de fase II ou fase III. Os produtos gênicos do HIV (Insertos) são mostrados e a forma de entrega (vetor); a esperada resposta imune (Padrão imune); e os fabricantes ou patrocinadores. As letras em parêntesis indicam o subtipo de origem de cada produto gênico viral. rAd, adenovirus defectivo de replicação; AAV, vírus adenoassociado. Env, proteína do envelope, Gag, antígeno grupo especifico, Nef, fator regulatório negativo, Pol, polimerase, PR, protease, RT, transcriptase reversa. Tabela 2. Vacinas anti Aids candidatas em ensaio clínico avançado Descoberta da AIDS: Problema de Saude Pública – 1981 Progressos nas áreas: Virologia, imunologia, patogênese do HIV, desenvolvimento de drogas anti-retrovirais Objetivo: • Vacina Dificuldades: • alta variabilidade do vírus, • perda de correlato de proteção, • limitações de modelo animal, • dificuldades logísticas quanto a condução de múltiplos ensaios clínicos Número de candidatos à vacina: >35 Fases de testes: I e II Número de voluntários envolvidos: 7.500 Conceitos: múltiplos Estratégias: • vacinas com vírus vivo atenuado, • vacinas com vírus inativado, • vacinas com com particulas virais simile ( VLP), • vacinas com subunidades baseadas em envolepes, • vacinas com subunidades proteicas virais não estrutural, • vacinas com DNA “naked” e recombinantes vírus • vacinas com virus recombinante vivo, • vacinas com fusão de proteinas e peptídeos, • vacinas com combinações várias. Centros envolvidos no desenvolvimento de vacinas anti- HIV : NIAID, CDC, WRAIR, USA; ANRS, França, IAVI, New York; WHO/ UNAIDS – iniciativas Mundiais; AAVP, África; Fundação Bill e Melinda Gates – USA; Global HIV Vaccine Enterprise. LEITURAS RECOMENDADAS 1. 2. 3. 4. 5. Nathanson, N; Mathieson, BJ. Biological considerations in the development of a human immunodeficiency virus vaccine. J Infect. Dis., 182(2): 579-89, 2000. Velin D, Kraehenbuhl JP. Delivery systems and adjuvants for vacination against HIV. EXS, 89: 227-37, 2000. Klein E, Ho RJ. Challenges in the development of na effective HIV vaccine: current approaches and future directions. Clin Ther, 22 (3): 295-314, 2000. Sabaj S, Mulligan MJ, Hsieh RH, Belshe RB, McGhee JR. Cytokine profiles in seronegative volunteers immunized with a recombinant canarypox and gp 120 prime-boost HIV-1 vaccine. NIAID AIDS Vacine Evaluation Group. AIDS, 14 (10): 1365-74, 2000. Esparza J, Bhamarapravati N. Accelerating the development and future availability of HIV-1 vaccines: why, wen, where, and how?. Lancet (England); 355 (9220): 2061-6, 2000. 18 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 18 18 6. Fiala C, Stewart GT; Imunization with gp 160 in HIV-1 infection. Lancet (England), 354 (9182): 948-9, 1999. 7. Loff B, Cordner S. Australian HIV vacines trial to begin in the next few months. Lancet (England), 353 (9160): 1251, 1999. 8. Moris K. New results may help design effective HIV-1 vaccine. Lancet (England), 353 (9151): 471, 1999. 9. Girard,M.P., Osmanov S.K. et Kieny M.P. A review of vaccine research and development: The human immunodeficiency virus (HIV). Vaccine 24: 4062 -4081, 2006. 11. www.iavi.org/trialdh. 12. Boletim VACINAS anti HIV/AIDS – nº13 – GIV, Junho, 2005 13. Douek DC, Kwong PD, Nabel GJ. The rational design of an AIDS vaccine. Cell, 124:677-681, 2006. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 16-18) 29.10.07 11:24:17 CORECEPTORES CCR5 E CXCR4 E POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS CCR5 AND CXCR4 CORECEPTORS ANDANTI-HIV THEIR POTENTIAL ON PREVENTIVE VACCINES ANTIRETROVIRAL THERAPY Monica Jaques de Morais Médica de Referencia em Genotipagem Ministerio da Saúde RESUMO Cerca de 60 milhões de pessoas foram infectadas pelo HIV nos últimos 25 anos da pandemia e com mais de 20 milhões de A busca recente e contínua por novas alternativas terapêuticas, seja pela demanda de drogas com menor toxicidade resultou em um foco maior nos estudos das proteínas de superfícies CCR5 e CXCR4, reconhecidas como co-receptores do Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1 (HIV-1). Estudos sobre a ação de inibidores agonistas e antagonistas de CCR5 tem sido realizados em relação ao tratamento e/ou a prevenção da infecção pelo HIV. De todas as drogas pesquisadas apenas o maraviroc (Selzentry® Pfizer), foi aprovado com bases no resultado de 24 semanas de 2 estudos clínicos (Motivate 1 e Motivate 2). Este artigo mostra os mais recentes resultados da ação benéfica desta droga apresentados, durante a 47º Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC). cientistas de diversas áreas do conhecimento e de vários países trabalhando em estreita colaboração. Descritores: CCR5, CxCR4, Coreceptores, Viral tropism, Antiretrovirals. HIV-1, vacina, prevenção, ABSTRACT The constant search for new alternative therapies, driven by the need to find drugs with less toxicity, prompted studies on HIV-1 particle surface proteins as CCR5 and CXCR4, which are used as viral coreceptors. There are already several studies on CCR5 inhibitors and their mechanisms to prevent or treat HIV-1 infections. From all studied drugs only Maraviroc, (Selzentry® Pfizer) was approved based on 2 clinical studies with patients being followed up for 24 weeks (Motivate 1 and Motivate 2). This paper is focused on the recent studies about the beneficial use of this drug presented during the 47º Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC). millions of p Keywords: CCR5, CxCR4, Co-receptores, Tropism viral, An-tiretrovirais. HIV-1, Preventive, vaccine INTRODUÇÃO As proteínas de superfície CCR5 e CXCR4 são reconhecidas como coreceptores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) desde 1995, quando Cocchi e colaboradores identificaram que ligantes naturais destas moléculas suprimiam a multiplicação viral (Cocchi et al., 1995). A necessidade contínua de novas alternativas terapêuticas, seja para tratamento de indivíduos portadores de HIV resistentes às drogas disponíveis, seja pela demanda de drogas com menor toxicidade, resultou recentemente em um foco maior sobre estes coreceptores. Drogas com atuação sobre moléculas que viabilizam a entrada do vírus na célula oferecem uma estratégia atraente não só por pertencerem a uma nova classe de drogas, mas também devido à possibilidade de supressão viral em uma fase muito precoce da infecção. CCR5 e CXCR4 são proteínas transmembrana que funcionam como receptores celulares de quimiocinas, citocinas que promovem movimento celular por quimiotaxia. Pertencem à família de receptores GPCP (do inglês G protein-coupled receptor). Suas moléculas formam alças que atravessam a membrana celular em sete domínios, constituindo alças externas à membrana celular (que interagem com as citocinas ligantes) e alças Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 19-22) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 19 19 intracelulares (que interagem com a proteína G, o que desencadeia um sinal para a resposta celular). Além da ativação intra-celular via proteína G, a ligação quimiciona-receptor pode desencadear ativação via outras proteínas intra-celulares, que após uma cascata de reações levam à interiorização do coreceptor e, posteriormente reciclagem deste para a superfície celular. O resultado da ativação celular é a liberação de outras citocinas e quimiocinas importantes para a resposta imune inata e adaptativa (Lederman et al., 2006). Existem cerca de 15 receptores para 30 citocinas, mas apenas seis são expressos em células T (CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CXCR1 e CXCR4), dos quais apenas dois tem função coreceptora para o HIV (CCR5 e CXCR4). O CCR5 é receptor para MIP-1α, RANTES e MIP-1 , mas as duas primeiras quimiocinas também se ligam a outros receptores. O CXCR4 é receptor exclusivo da quimiocina SDF-1, que por sua vez tem o CXCR4 como seu único receptor. A relativa sobreposição desta rede pode ser responsável pelo fato de que o bloqueio de um receptor não resulte em danos maiores ao hospedeiro (Lederman et al., 2006; Kuritzkes e Tsibris, 2007). De fato, 1% da população caucasiana é homozigota para o alelo variante CCR5∆32, que resulta em não-expressão da proteína CCR5 na superfície celular, o que não incorre em qualquer 19 29.10.07 11:24:17 conseqüência clínica para estes indivíduos (Liu et al., 1996). Coreceptores e HIV: entrada do HIV na célula A entrada do HIV nas células-alvo depende da interação de glicoproteínas do envelope viral (gp120 e gp41) com receptores das células-alvo (CD4, CCR5 e CXCR4). A glicoproteína gp160, constituída pelas subunidades gp 41 e gp 120, situa-se em trímeros na superfície do envelope viral. Após a aproximação do vírus às células-alvo, cada gp120 se liga a uma molécula de CD4 da superfície da célula-alvo. Esta ligação (attachment) promove mudança conformacional na gp120, que então se aproxima do coreceptor (CCR5 ou CXCR4). A ligação entre o coreceptor e a gp120 dispara o processo de fusão: a gp41 é exposta e se insere na membrana celular. Cada uma das 3 moléculas de gp41 tem dois domínios em hélice (HR1 e HR2) que se dobram em encaixe um sobre o outro e assim forçam a aproximação da membrana celular e do envelope viral, até provocar a fusão de ambas, que leva à interiorização do vírus (Lederman et al., 2006). Em resumo, pode-se dizer que o processo de entrada do HIV na célula ocorre em três etapas: a ligação gp120-CD4 (attachment), a ligação da gp120 com o coreceptor (“disparo” da fusão) e a fusão propriamente da membrana celular com o envelope viral, que depende da ação das hélices da gp41 forçando a aproximação das membranas. Figura 1. Os três passos principais para a entrada do HIV na célula (adaptado de: Moore JP, Doms RW. The entry of entry inhibitors: a fusion of science and medicine. PNAS 2003, 100:10598-602). Fenótipo e tropismo celular A proteína viral de superfície gp120 apresenta grande variabilidade genética entre os isolados de HIV, decorrente de cinco regiões variáveis na sua seqüência de aminoácidos (V1-V5). Esta variação determina a habilidade do vírus em usar o coreceptor CCR5 ou CXCR4 (Briggs et al., 2000). Logo após a infecção predominam cepas que utilizam o coreceptor CCR5, chamadas por isso de R5. Estas cepas se multiplicam in vitro mais lentamente, não induzem a formação de sincício e crescem bem tanto em macrófagos como em linfócitos. Na infecção avançada surge a variante X4, que utiliza o coreceptor CXCR4 para entrar na célula. In vitro, é mais citopática, cresce mais rapidamente e tem tropismo por células T. Clinicamente, a presença de isolados X4 está associada com progressão mais rápida da doença e com risco de morte (Richmond & Bozzette, 1994; Japour et al., 1995). Embora seja um marcador de progressão, não se sabe se o surgimento de cepas X4 é causa ou efeito da evolução da doença. Em todas as fases da infecção, os vírus R5 são mais frequentemente isolados. À medida que a infecção progride, aumenta a freqüência de isolamento concomitante de R5 e X4. O isolamento de ambos significa ou a presença de vírus duotrópicos (que utilizam tanto CCR5 como CXCR4 como coreceptores) ou a ocorrência de populações mistas; ambos os fenômenos já foram documentados (Moyle et al., 2005). A presença exclusiva de cepas X4 é rara (Tabela 1) (Kuritzkes e Tsibris, 2007). CCR5 como alvo de drogas anti-retrovirais Logo após a identificação da função co-receptora do CCR5 e CXCR4 na infecção pelo HIV, Liu e colaboradores, estudando dois indivíduos com múltiplas exposições ao HIV que permaneciam não-infectados, identificaram a base genética dessa resistência à infecção (1996). Ambos os indivíduos eram portadores de um defeito homozigótico no gene que codifica o CCR5. O alelo variante (CCR5∆32) contém uma deleção interna de 32 pares de base e resulta na codificação de uma proteína francamente truncada que não é expressa na superfície celular. Essa alteração confere resistência à infecção pelo HIV, mas nenhuma outra alteração fenotípica foi reconhecida nestes indivíduos. Estudos subseqüentes verificaram que da população caucasiana, aproximadamente 1% é homozigota e 10 a 14% é heterozigota para esse alelo variante. Indivíduos heterozigotos apresentam risco mais baixo de infecção e, uma vez infectados, evolução mais lenta que a população portadora de dois alelos selvagens (Ioannidis et al., 2001). Estes achados prontamente situaram o receptor CCR5 como atraente sítio de ação de drogas para prevenção e tratamento da infecção pelo HIV. Dois mecanismos de ação básicos sobre a proteína CCR5 têm sido explorados no contexto de tratamento e/ou prevenção da infecção pelo HIV: inibidores agonistas e antagonistas de CCR5. Inibidores agonistas são análogos de quimiocinas que se ligam ao CCR5 e promovem sua interiorização. O seqüestro intracelular do co-receptor o indisponibiliza para o HIV. Algumas substâncias desse grupo foram exploradas para prevenção de População Amostra R5 exclusivo R5/X4 X4 exclusivo Virgem de TARV 323 88% 12% 0% Virgem de TARV 979 82% 18% 0,1% Virgem de TARV 402 81% 19% - Expostos a TARV 117 67% 28% 5% Expostos a TARV 125 78% 22% - Expostos a TARV 724 50% 48% 2% Tabela 1. Prevalência de vírus R5 e X4 em diferentes coortes de individuos infectados pelo HIV (Adaptada de Kuritzkes e Tsibris, 2007) 20 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 20 20 Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 19-22) 29.10.07 11:24:17 infecção por SIV em macacos, com resultados favoráveis (Lederman et al., 2006). A preocupação em relação a estes agonistas é que, ao promoverem a interiorização do co-receptor, desencadeiem o sinal intra-celular e a decorrente inflamação, à semelhança do que ocorre com as quimiocinas naturais. O grupo dos inibidores antagonistas de CCR5 é o que se encontra mais desenvolvido. Estes antagonistas são classificados em dois subgrupos: os inibidores competitivos (anticorpos monoclonais anti-CCR5) e os não-competitivos (pequenas moléculas). O anticorpo monoclonal PRO-140 se liga ao sítio de ligação do HIV na molécula CCR5, com isso, inibindo competitivamente a ligação do vírus à célula. Na 4a Conferência da Sociedade Internacional de Aids sobre Tratamento, Patogênese e Prevenção, realizada em Sidney em 2007, foram apresentados resultados positivos de tolerância e eficácia anti-retroviral obtidos em um estudo com 30 pacientes tratados com PRO-140 administrado por via intravenosa. Uma formulação de administração subcutânea continua sendo testada (Saag et al., 2007) e a droga continua sob investigação. Os antagonistas não-competitivos são pequenas moléculas que se ligam ao CCR5, porém não no sítio de ligação do HIV. A ligação destas pequenas moléculas ao co-receptor é nãocovalente e reversível. Promove uma mudança conformacional na molécula, de tal modo que impede a ligação do vírus ao seu sítio de ligação. Este tipo de inibição é chamada alostérica e não é competitiva. Dentro do grupo de pequenas moléculas, três drogas chegaram a fases adiantadas de desenvolvimento mostrando resultados muito bons em termos de eficácia virológica: maraviroc (Pfizer), já aprovada para uso clínico nos Estados Unidos da América, na Europa e no Brasil, vicriviroc (Schering-Plough), que está em fase avançada de estudos clínicos de fase III e aplaviroc (GlaxoSmithKline), que foi abandonada devido à alta freqüência de hepatotoxicidade. A única droga aprovada desta classe, o maraviroc (Selzentry®, Pfizer) se liga ao receptor CCR5. Não desencadeia sinalização e interiorização do receptor e, portanto não tem efeito agonista (não leva a liberação de citocinas e inflamação). Tem atividade em concentrações nanomolares baixas, se liga por tempo prolongado ao receptor e o efeito desta ligação é duradouro. De fato, é interessante que pacientes que interrompem a medicação demoram a apresentar rebote viral (Este & Telenti, 2007). O maraviroc foi aprovado com base nos resultados de 24 semanas de dois estudos clínicos que ainda estão em andamento, MOTIVATE 1 e MOTIVATE 2; recentemente os resultados de 48 semanas do MOTIVATE 1 foram apresentados na 47a Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC) (Lalezari et al., 2007). Os dois estudos MOTIVATE têm desenho idêntico: o primeiro incluiu 601 participantes da América do Norte e o segundo, 475 da Europa, Austrália e Estados Unidos. Todos os pacientes eram portadores de vírus com tropismo exclusivo para R5, apresentavam extensa experiência prévia com anti-retrovirais e portavam vírus amplamente resistentes. Foram randomizados em três grupos para receber, além de uma combinação de Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 19-22) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 21 21 drogas otimizada, 150 mg maraviroc em dose única ou em duas doses diárias ou placebo. Os resultados de 48 semanas confirmaram os achados previamente apresentados de 24 semanas: maraviroc foi superior a placebo nas duas doses (PCR-RNA HIV <50 cópias em 46,8% vs. 41,8% vs. 16,1% nos grupos de dose única, duas doses e placebo, respectivamente). A droga foi muito bem tolerada (efeitos adversos grau 3 ou 4, inclusive hepatotoxicidade, ocorreram em freqüência semelhante nos 3 grupos). Além disso, ao contrário do relato prévio, os dados de 48 semanas apontaram para sinergismo de enfuvirtide e maraviroc. Embora os dados da semana 24 não tenham apontado para benefício adicional da combinação com enfuvirtide, na realidade os indivíduos que usaram a associação apresentaram resposta mais duradoura quando se analisaram os resultados de 48 semanas (Lalezari et al., 2007). Nos estudos de fase 2, maraviroc não foi eficaz contra vírus com tropismo CXCR4, duotrópico ou misto. Deste fato decorre a exigência de se selecionar pacientes portadores de vírus com tropismo exclusivo R5 para tratamento com maraviroc. Atualmente há um único teste aprovado para determinação do tropismo viral, o teste Trofile® da Monogram Biosciences. É um teste caro, ainda não disponível comercialmente no Brasil. Com mecanismo de ação idêntico, o vicriviroc (Schering Plough) está em fase avançada de desenvolvimento. Resultados de um estudo de fase 2 de 48 semanas foram apresentados recentemente (Gulick et al., 2007), revelando resultados de eficácia e tolerância muito favoráveis. Um estudo de fase 3, também com pacientes com histórico de múltiplas falhas prévias e portadores de vírus multirresistentes está em andamento, utilizando a dose de 30 mg em uma tomada diária. Possíveis repercussões do antagonismo de CCR5 Nos estudos de fase 2 e 3, os pacientes que apresentaram falha virológica evoluíram com mais desvio do tropismo viral de R5 para X4 em relação aos pacientes que usaram placebo. A conseqüência clínica deste desvio não está clara, se é que exista alguma, porém há preocupação devido à conhecida associação entre tropismo X4 e pior evolução da infecção (Lalezari et al., 2007). Outra preocupação em relação aos antagonistas de coreceptores de entrada decorre do fato de que essas são as primeiras drogas anti-retrovirais cujo sítio de ação é uma molécula do hospedeiro e não do vírus. Esta inovação traz consigo potenciais riscos. A ligação com o receptor de quimiocina poderia ter um algum efeito agonista e resultar em liberação de citocinas e inflamação? Por outro lado, o bloqueio e o antagonismo completo poderiam resultar em algum grau de imunossupressão (aumento de risco de infecções e neoplasias, inadequação de resposta a vacinas)? De fato, sabe-se que ausência congênita de CCR5 aumenta o risco de infecção sintomática pelo vírus de encefalite do Oeste do Nilo (Glass et al., 2006). Estudos de longo prazo e vigilância pós-comercialização serão necessários para responder estas questões. 21 29.10.07 11:24:18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Cocchi F, DeVico AL, Garzino-Demo A,Arya SK, Gallo RC, Lusso P. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells. Science. 1995 Dec 15;270(5243):1811-5. 2. Michael M.Lederman;Adam Penn-Nicholson;Michael Cho;Donald Mosier.Biology of CCR5 and Its Role in HIV Infection and Treatment. JAMA. 2006;296:815-826. 3. Tsibris AM, Kuritzkes DR. Chemokine antagonists as therapeutics: focus on HIV-1. Annu Rev Med. 2007;58:445-59 4. Briggs DR, Tuttle DL, Sleasman JW, Goodenow MM. Envelope V3 amino acid sequence predicts HIV-1 phenotype (co-receptor usage and tropism for macrophages). AIDS 2000; 14:29379. 5. Este JA, Telenti A. HIV entry inhibitors. Lancet. 2007 Jul 7;370(9581):81-8. 6. Liu R, Paxton WA, Choe S, Ceradini D, Martin SR, Horuk R, MacDonald ME, Stuhlmann H, Koup RA, Landau NR. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals to HIV-1 infection. Cell. 1996 Aug 9;86(3):367-77. 7. Richman DD, Bozzette SA. 1994. The impact of the syncytium-inducing phenotype of human immunodeficiency virus on disease progression. J. Infect. Dis. 169:968–74 8. Japour AJ, Welles S, D’Aquila RT, et al. 1995. Prevalence and clinical significance of.zidovudine resistance mutations in human immunodeficiency virus isolated from patients after long-term zidovudine treatment. AIDS ClinicalTrials Group 116B/117 StudyTeam and the Virology Committee ResistanceWorking Group. J. Infect. Dis. 171:1172–79. 9. Moyle, G.J.; Wildfire, A.; Mandalia, S.; Mayer, H.; Goodrich, J.; Whitcomb, J.; Gazzard, B.G. 2005. Epidemiology and predictive factors for chemokine receptor use in HIV-1 infection. Journal of Infectious Diseases. Vol: 191 Nro: 6 Págs: 866 - 872 Data: 15/3/2005. 10. Liu R, Paxton WA, Choe S, Ceradini D, Martin SR, Horuk R, MacDonald ME, Stuhlmann H, Koup RA, Landau NR. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals to HIV-1 infection. Cell. 1996 Aug 9;86(3):367-77. 11. Ioannidis, J.P.A.; Rosenberg, P.S.; Goedert, J.J.; Ashton, L.J.; Benfield, T.L.; 22 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 22 22 12. 13. 14. 15. 16. Buchbinder, S.P.; Coutinho, R.A.; EugenOlsen, J.; Gallart, T.; Katzenstein, T.L.; Kostrikis, L.G.; Kuipers, H.; Louie, L.G.; Mallal, S.A.; Margolick, J.B.; Martinez, O.P.; Meyer, L.; Michael, N.L.; Operskalski, E.; Pantaleo, G.; Rizzardi, G.P.; Schuitemaker, H.; Sheppard, H.W.; Stewart, G.J.; Theodorou, I.D.; Ullum, H.; Vicenzi, E.; Vlahov, D.; Wilkinson, D.; Workman, C.; Zagury, J.F.; OBrien, T.R. Effects of CCR5-Delta 32, CCR2-641, and SDF-1 3 ‘ A alleles on HIV-1 disease progression: An international meta-analysis of individualpatient data. Annals of Internal Medicine. 2001 135: 782 – 795. MS Saag, JM Jacobson, M Thompson, and others. Antiviral effects and tolerability of the CCR5 monoclonal antibody PRO 140: a proof of concept study in HIV-infected individuals. 4th International AIDS Society Conference on HIV Pathogenesis, Treatment, and Prevention. Sydney, Australia, July 2225, 2007. Abstract (late-breaker) WESS201. Lalezari J, Mayer H, for The Motivate 1 Study Team. Efficacy and safety of maraviroc (MVC) in antiretroviral treatment-experienced patients infected with CCR5-Tropic HIV-1: 48-week results of MOTIVATE 1. Program and abstracts of the 47th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC); September 17-20, 2007; Chicago, Illinois; Abstract H-718a. van der Ryst E, Westby M. Changes in HIV-1 co-receptor tropism for patients participating in the maraviroc Motivate 1 and 2 clinical trials. Program and abstracts of the 47th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC); September 17-20, 2007; Chicago, Illinois; Abstract H-715. R Gulick, Z Su, C Flexner, and others (for the ACTG 5211 Team). ACTG 5211: phase II study of the safety and efficacy of vicriviroc (VCV) in HIV-infected treatment-experienced subjects: 48 week results. 4th IAS Conference. July 22-25, 2007. Sydney, AU. Abstract (oral) TuAb102. Glass, David H. McDermott, Jean K. Lim, Sudkamon Lekhong, Shuk Fong Yu, William A. Frank, John Pape, Ronald C. Cheshier, and Philip M. Murphy. CCR5 deficiency increases risk of symptomatic West Nile virus infection William G. J Exp Med 2006.Vol. 203: 35–40. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 19-22) 29.10.07 11:24:18 DESTAQUES IAS 2007, SIDNEY, AUSTRÁLIA Paulo Roberto Abrão Ferreira, Elkin Hernán Bermudez Aza, Simone de Barros Tenore Tratamento de pacientes virgens de antiretroviral (ARV) Merck 004: raltegravir em pacientes virgens de tratamento Atualmente temos duas classes disponíveis para o tratamento antiretroviral de pacientes virgens de terapia, os inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN) e não análogos de nucleosídeos (ITRNN), e os inibidores da protease (IP). Usualmente a associação é feita entre dois ITRNs e um ITRNN ou um IP associado a baixas doses de ritonavir (RTV). Apesar destes esquemas apresentarem boa tolerabilidade, não são isentos de toxicidade, e a inclusão de novas drogas, atuando em outros alvos do ciclo de vida do HIV, potentes e com boa tolerabilidade, poderiam ampliar as opções para pacientes em início de terapia. Dois estudos, MERIT e Merck004, avaliaram o uso de dois novos ARVs, maraviros e raltegravir, em pacientes virgens de terapia ARV. Em ambos os estudos o braço comparados foi o efavirenz. O raltegravir mostrou ser comparável ao efavirenz, com algumas vantagens em relação à tolerância e efeitos adversos, enquanto o maraviroc mostrou ser não inferior ao efavirenz e ususlmente bem tolerado, porém alguns critérios evidenciam que talves não seja tão potente como efavirenz. Estes estudos estão descritos abaixo. Este estudo comparou o raltegravir, um inibidor da integrase, com efavirenz em 198 indivíduos virgens de antiretroviral (Markowitz e colaboradores). Foram estudadas quatro doses de raltegravir (100, 200, 400 e 600mg duas vezes ao dia), todas comparadas com efavirenz, e usando FTC e tenofovir no esquema de base. A média de CV dos grupos variou de 4.6 a 4.8 log10 cópiasÚmL e CD4+ de 271 a 338 célsÚmm3. Os resultados demonstrados na tabela evidenciaram eficácia virológica semelhante entre as doses de raltegravir e efavirenz, sem diferenças significativas nos cinco braços do estudo. Estudo MERIT: Maraviroc em pacientes virgens de tratamento: Estudo em andamento, de fase 2BÚ3, duplo-cego, comparando maraviroc (um inibidor de co-receptor CCR5) 300mg duas vezes ao dia com efavirenz, ambos em combinação com zidovudinaÚlamivudina (AZTÚ3TC), em 721 pacientes virgens de tratamento, com tropismo R5. (Saag M,). O braço maraviroc 300mg uma vez ao dia foi descontinuado precocemente na semana 16, devido à má performance durante análise interina. Os grupos apresentavam parâmetros similares no baseline, com CD4+ variando entre 241-254 célsÚmm3, e média de carga viral (CV) de 4.9 log10 cópias mL. Dados de eficácia em 48 semanas (em tratamento) estão sumarizados na tabela. HIV RNA < 400 cópiasÚmL (%) HIV RNA < 50 cópiasÚmL (%) Incremento de CD4+ (célsÚmm3) Maraviroc 70.6 65.3 170 Efavirenz 73.1 69.3 143 Maraviroc demonstrou ser não inferior ao efavirenz na análise de CV < 400 cópiasÚmL, porém com performance inferior quando analisado CV < 50 cópiasÚmL. Maraviroc também obteve resultados insatisfatórios, comparando com efavirenz, em pacientes com CV superior a 100.000 cópiasÚmL. Outro fator importante a ser considerado são os motivos de descontinuidade do tratamento em ambos os grupos. Apesar da porcentagem de pacientes descontinuados antes de 48 semanas ser semelhante nos grupos (26.9% maraviroc e 25.2% efavirenz), descontinuidade devido a falência virológica foi maior no braço maraviroc (11.9% vs 4.2%) enquanto que no braço efavirenz o principal motivo foi evento adverso (4.1% vs 13.6%). Assim, enquanto pacientes que descontinuaram efavirenz possivelmente tem pouca ou nenhuma resistência, aqueles que interromperam maraviroc tem maior probabilidade de desenvolvimento de resistência e perda de opções de tratamento. Logo, baseado neste estudo, não temos justificativa para o uso de maraviroc em indivíduos virgens de tratamento, associado ao fato da posologia ser duas vezes ao dia. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 23-27) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 23 23 Raltegravir 100 mg 200 mg 400 mg 600 mg Efavirenz 600 mg nº 39 40 41 40 38 < 50 cópiasÚmL 85% 83% 88% 88% 87% < 400 cópiasÚmL 97% 85% 98% 90% 87% O ganho de CD4+ foi semelhante entre os grupos, e a única diferença observada foi a velocidade de resposta para alcance de supressão viral nos braços raltegravir (Murray JM, TUAB 103), porém a significância clínica deste achado ainda não está clara. Ambas as drogas foram bem toleradas, com menos efeitos colaterais relacionados ao sistema nervosos central nos braços raltegravir (13% vs 29%).Não houve relato de eventos adversos sérios nos grupos estudados. Observou-se diferença significativa na elevação do colesterol (-2.3 nos grupos raltegravir vs + 20.7 no grupo efavirenz), favorecendo o raltegravir. Os demais parâmetros lipídicos não se alteraram neste grupo. Baseado neste estudo, raltegrafir apresentou eficácia similar ao efavirenz para supressão virológica e incremento de CD4+, e menor toxicidade metabólica. A administração duas vezes ao dia do raltegravir pode limitar seu uso difundido para terapia inicial, mas pode representar uma alternativa segura neste cenário. Tratamento de pacientes com experiência antiretroviral prévia Dois importantes estudos apresentados nesta conferência evidenciaram o benefício de novas drogas, de classes já conhecidas, para o tratamento de pacientes em falência antiretroviral e resistência. O estudo TITAN demonstrou que o darunavir (DRV), um potente inibidor da protease usado para tratamento de pacientes muiti-experimentados, também pode ser uma alternativa para uso em fases mais precoces do tratamento. Já o estudo DUET evidenciou a eficácia da etravirina (ETV) em paciente extensamente experimentados de ARV. O MOTIVATE ressalta o uso do maraviroc nesta população de pacientes, como descrevemos a seguir. TITAN: Darunavir + ritonavir (DRVÚr) versus LopinavirÚr (LPVÚr) no tratamento de pacientes em falência antiretroviral Estudo aberto de fase III que comparou DRVÚr com LPVÚr em pacientes com carga viral superior a 1000 cópiasÚmL em um regime estável em falência por pelo menos 12 semanas (Valdez-Madruga e colaboradores, Lancet 2007;370:49-58). Este 23 29.10.07 11:24:18 estudo incluiu 604 pacientes que foram randomizados para receber LPVÚr 400Ú100 mg duas vezes ao dia (inicialmente cápsulas e posteriormente substituído para comprimidos) ou DRVÚr 600Ú100 mg duas vezes ao dia, associado a um esquema de base otimizado com teste de resistência, que incluía pelo menos duas drogas entre os ITRN e ITRNN. O uso de enfuvirtida e outras drogas experimentais não foram permitidas. A média de carga viral dos indivíduos era de 4.35 log10 cópiasÚmL e CD4+ de 235 celsÚmm3. Em relação ao uso prévio de ARVs, 29% recebiam ITRN+ITRNN e 22% ITRN+IP, 46% dos pacientes já haviam experimentado as três classes de ARV. A respeito do uso prévio de IPs, 32% eram virgens desta classe, 36% haviam usado um IP e 32% já haviam recebido mais de dois IPs. O uso prévio de LPVÚr representava um critério de exclusão. O número médio de mutações principais na protease foi de zero e o fold-change (FC) para DRV no braço DRV foi de 0.6 (0-37), com 2% dos indivíduos apresentando FC>10 (ação intermediária da droga), já no braço LPV o FC foi de 0.8 (0-74), com 10% apresentando FC>10. Foram apresentados os resultados de 48 semanas (o estudo está em andamento, previsto 96 semanas de duração), usando análise de intenção de tratamento, e estão resumidos na tabela. <400 cópiasÚmL <50 cópiasÚmL Média de queda de CV (log10) DRVÚr 77% 71% -1.95 LPVÚr 67% 60% -1.72 P <0.0001 0.005 0.046 Incremento de CD4+ (célsÚmm3) +88 +81 0.33 Estes dados demonstram a superioridade do DRVÚr em relação ao LPVÚr para supressão virológica (CV<400 cópiasÚmL) e um número significativamente maior de pacientes no grupo DRVÚr com CV<50 cópiasÚmL. Um menor número de indivíduos recebendo DRVÚr apresentou falência virológica em relação ao LPVÚr (10% vs 22%), aquisição de novas mutações na protease (21% vs 36%) ou perda de drogas ativas. Os grupos também foram comparados analisando-se CD4+ e CV basal, número de drogas ativas no esquema de base, número de mutações primárias na protease e FC para DRV e LPV. Em cada uma destas variáveis o DRV não foi inferior nem superior ao LPV. Ambos os IPs foram bem tolerados, com somente 7% de descontinuidade devidos a toxicidade. Exantema foi mais observado no grupo DRVÚr (16% vs 7%), enquanto diarréia foi mais comum no grupo LPVÚr (32% vs 42%). Outros eventos adversos foram similares entre os grupos, incluindo alteração no perfil lipídico. Este estudo demonstra a potência e segurança do DRVÚr e indica que nesta população, aonde 68% apresentavam falência a um ou mais IPs, que esta droga leva a maior supressão viral (<400 e <50 cópiasÚmL), menor falência virológica e desenvolvimento de resistência quando comparado ao LPVÚr, representando uma opção de tratamento para pacientes com falha precoce aos IPs. DUET: atividade da Etravirina (ETV) em vírus resistentes aos ITRNN DUET-1 e DUET-2 são dois grandes estudos de fase III, duplocego, comparando ETV versus placebo em combinação com DRVÚr associado a um esquema de base otimizado por teste de resistência (Cohen C e colaboradores) Um total de 1203 indivíduos, todos com resistência documentada para ITRNN, foram randomizados para receber ETV 200mg duas vezes ao dia ou placebo associado a DRVÚr e pelo menos dois outros ARVs selecionados pelo investigador, incluindo ITRN eÚou enfuvirtida. 24 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 24 24 A maioria dos pacientes apresentavam duas ou mais mutações para ITRNN, e o FC demonstrava resistência fenotípica para efavirenz ou nevirapina. As características de baseline dos indivíduos estão demonstradas na tabela. Caraterísticas CV (log10 cópiasÚmL) % com CV>100.000 cpÚmL CD4+ (célsÚmm3) Mutações de ITRNN 0 1 2 3 4 Fold-change IC50 ETV Efavirenz Nevirapina Darunavir Uso prévio de enfuvirtida DUET 1 ETV Placebo DUET 2 ETV Placebo 4.8 39% 99 4.9 41% 109 4.8 37% 100 4.8 31% 108 9% 25% 28% 17% 21% 12% 21% 24% 22% 20% 16% 19% 26% 19% 20% 15% 21% 24% 19% 17% 1.6 101.5 74.3 5.6 31% 1.4 72.8 73.8 6.1 34% 1.6 39.8 77.3 6.7 49% 1.7 27.6 74.3 7.0 50% Como demonstrado na tabela, a adição de etravirina ao esquema de base otimizado aumenta significativamente a proporção de pacientes atingindo CV <400 e <50 cópiasÚmL. Quando o FC para DRV é igual ou superior a 10, o uso de ETV aumenta o número de indivíduos que atingem supressão viral em 30% ou mais. Em ambos os estudos o uso de ETV apresentou bom desempenho mesmo em indivíduos com três ou mais mutações para ITRNN. % CV < 50 cpÚmL % CV < 400 cpÚmL % CV <50 cpÚmL de acordo com mutações para ITRNN em pctes re-usando ou não usando ENF 0 1 2 3 >4 DUET 1 ETV Placebo 56% 39% 74% 51% DUET 2 ETV Placebo 62% 44% 75% 54% 47% 77% 64% 47% 44% 42% 45% 38% 34% 21% 80% 70% 48% 71% 57% 50% 44% 41% 28% 15% 33% 56% 66% 89 0% 19% 47% 64 43% 50% 73% 78 0% 17% 52% 66 % CV <50 cpÚmL de acordo com FC para DRVÚr em pctes re-usando ou não usando ENF >40 10-40 <10 Ganho médio de CD4+ (célsÚmm3) A ocorrência de eventos adversos foi similar entre os grupos. Exantema foi mais comumente observado no grupo que recebeu ETV, em comparação ao placebo (20% vs 10%); contudo descontinuidade devido a este evento foi de apenas 2%. A incidência de efeitos relacionados ao sistema nervoso central e alterações laboratoriais foi semelhante entre os braços placebo e ETV. Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 23-27) 29.10.07 11:24:18 A alta taxa de sucesso neste estudo deve-se ao fato de que o uso de ETV permitiu que a maioria dos pacientes recebesse duas ou mais drogas plenamente ativas, uma estratégia essencial para o tratamento de pacientes com resistência antiretroviral. MOTIVATE: maraviroc em pacientes em falência antiretroviral Na 14ª Conferência em Retrovirus e Infecções Oportunistas (CROI 2007) foram apresentados dados de 24 semanas dos estudos MOTIVATE 1 e 2, demonstrando a eficácia e segurança do uso do maraviroc em pacientes em falência antiretroviral, com tropismo R5. Nas duas doses testadas (300 mg uma vez ao dia e 150 mg duas vezes ao dia), em combinação com um esquema de base otimizado, maraviroc demonstrou atividade virológica, com declínio de CV de aproximadamente 1.9 log10 cópiasÚmL em ambos os braços (Lalezari J, 14ª CROI 2007, 104blB; Nelson M, 104alB). Duas subanálises destes estudos foram apresentados nesta conferência (IAS 2007) e demonstraram (1) quanto maior o número de drogas ativas no esquema de base otimizado, maior a probabilidade de pacientes tratados com maraviroc atingirem carga viral indetectável, repetindo dados de outros estudos com drogas experimentais (van der Ryst e colaboradores), e (2) apesar das duas posologias (uma ou duas vezes ao dia) serem seguras, maiores taxas de supressão virológica foram atingidas com a dose duas vezes ao dia em pacientes sem drogas ativas no esquema de base, baixos níveis de CD4+ ou alta CV (Gulick e colaboradores). Logo, parece que em indivíduos em falência antiretroviral, maraviroc deva ser usado com o maior número possível de drogas ativas e preferencialmente duas vezes ao dia. Coinfecção hepatite B e HIV Análise de pacientes coinfectados com HIV e com o vírus da hepatite B (HBV) ou hepatite C (HCV) no estudo SMART (Strategies for Management of Antiretroviral Therapy). Uma maior proporção de pacientes coinfectados com o HBV reiniciaram o tratamento (CD4<250 cél./mm3), o que não foi observado comparando-se com o grupo HCV-HIV. A coinfecção HIV e hepatite B ou C aumentou o risco de morte (3,8 vezes) por causas não relacionadas às infecções oportunistas (doença hepática, renal, neoplasias malignas e abuso de drogas ilícitas). Co-infectados apresentaram, significantemente, mais mortes por causa desconhecidas. O risco de morte por causas cardiovasculares foi maior no grupo de monoinfectados HIV. Pesquisadores espanhóis liderados por Perez-Rodriguez demonstraram maior prevalência de anti-HBc isolado em coinfectados HCV-HIV em relação aos monoinfectados HIV (23% vs 77%). A associação de infecção com HBV, anti-HBc isolado e doença hepática foi maior em coinfectados HCV-HIV, comparativamente com os monoinfectados HCV. HIV negativos (n=2577) HIV positivos (n=151) Infecção pelo HBV 340 (13%) 70 (47%) Anti-HBc isolado 45 (14%) 31 (44%) Anti-HBc isolado e HCV Doença hepática (todos com HCV) 56% 79% 13% 26% Pesquisadores poloneses, liderados por Kubicka, avaliaram a presença de anti-HBs e HBV DNA em 65 pacientes que apresentaram anti-Hbc isolado: 25 pacientes com monoinfecção HCV, 17 pacientes com coinfecção HCV-HCV, 23 pacientes Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 23-27) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 25 25 sem HCV e sem HIV. Não houve relação entre as variáveis demográficas e os parâmetros do HBV. Detecção de HCV RNA foi independentemente associado com baixos níveis de antiHBs e ausência de HbsAg. HCV RNA detectável foi preditivo independente de HBV DNA detectável. Ausência ou baixo nível de anti-HBs foi mais comum que presença de HBV DNA. Em infectados pelo HIV foi mais frequente baixos títulos ou ausência de anti-HBs (não estatisticamente significante). Infecção pelo HIV não foi preditivo de HBV DNA detectável Pesquisadores de Melbourne e Sydney, liderados por Littlejonh, demonstraram a maior freqüência de genótipos mistos do HBV em coinfectados com o HIV. Foram avaliados 44 pacientes com HBV-HIV, sendo 57% genótipo A e 35% com mais de um genótipo (11 A+G, 2 A+D, 1 C+D, 1 D+G). Dos 35 pacientes monoinfectados HBV apenas 1 (3%) A+G. O estudo TICO (Matthews e colaboradores) envolveu 36 pacientes HBV-HIV virgens de tratamento (Tailândia) randomizados (1:1:1) em 3 grupos: 3TC, TDF, 3TC+TDF. Idade média foi 36 anos e um terço eram do sexo feminino. O CD4 inicial médio foi 36, HBV genótipo C (83%), HBeAg positivo (61%), 3 com cirrose hepática. Na análise de intensão de tratar, na semana 48, o declínio do HBV DNA foi de 4 a 5 log nos três grupos e os seguintes resultados foram obtidos: HBV DNA < 200 cp Ú mL HBV DNA > 1000 cp Ú mL Soroconversão do HBeAg Soroconversão do HBsAg Normalização da ALT 3TC 46% 38% 8% 8% 31% TDF 75% 17% 8% 8% 42% 3TC+TDF 64% 0% 18% 9% 36% Nove (25%) pacientes apresentaram exacerbação, com 4 soroconversões HBeAg e 2 soroconversões HbsAg e 1 paciente foi a óbito por exacerbação e descompensação hepática. Mutações de resistência ao 3TC (L180M+M204V) foram observadas em 1 paciente no grupo 3TC e HBV DNA > 1000 cpÚ mL na semana 48 foi fator de risco para resistência. Bortman e colaboradores, em estudo retrospectivo, mostraram que a imunização contra o HBV em pacientes portadores do HIV é mais efetiva com dose dobrada. Imunização contra o HBV Idade (mediana) Sexo feminino CD4 (mediana) Aids HAART Respondedores Aids respondedores 10 mcg 0,1 e 60 (n=42) 41 33% 398 43% 88% 11 (26%) 3 (17%) 40 mcg 0,1 e 60 (n=11) 41 55% 353 64% 91% 9 (82%) p<0,001 7(100%) p<0,001 Coinfecção hepatite C e HIV Um grupo de pesquisa baseado na Índia, apresentou a análise de fatores de risco associados com UDI no cenário de países em industrialização. Foram arrolados 400 usuários de drogas intravenosas (UDI) nos quais foi feita a avaliação de infecção pelo HIV, HBV e HCV. Foram detectadas as seguintes soropositividades: 43 (10.8%) para anticorpos HIV, 190 (47.8%) para HCV; 15 (3.8%) para HBsAg. Dos 43 HIV positivos, 34 (79.1%) tinham coinfecção pelo HCV e 3 (6.9%) também pelo HBV. Usuários de heroína tiveram maior risco de monoinfecção pelo HCV (OR 3.4; P<0.0001) e coinfecção (OR 4.3; P=0.0003) do que os usuários de outros opióides como dextropropoxifeno. Outros fatores associados foram: o período acumulado de uso, o emprego de múltiplas drogas e o compartilhamento dos elementos de injeção e preparação de drogas. 25 29.10.07 11:24:18 Trabalho liderado por Danta e cols. proporcionou os dados dos clusters de infecção aguda pelo HCV em homens que fazem sexo com homens (HSH) HIV positivos observados desde o começo da década na Europa, Austrália e Estados Unidos. Nos 190 pacientes originários de quatro países europeus foi observada uma média de idade de 38 anos, em prescrição de HAART e com contagem média de CD4 de 400 a 600 células/mm3. Foi feita a genotipagem e a análise filogenética para 166 pacientes, achando 50% com genótipo 1a, 23% com genótipo 4d, 7% com 3a e 5% com 1b. Foram observados 10 clusters de cepas relacionadas, dando conta de 88% de todos os isolados. Os clusters detectados incluíram entre 3 e 36 indivíduos, sendo que um deles, de genótipo 4d incluiu 31 coinfectados provenientes dos quatro países incluídos. Desta forma os autores sugeriram a implementação de ênfase nas estratégias de prevenção e rastreamento para todos os indivíduos em risco. Outro estudo, conduzido por Fox e cols, objetivou estudar a incidência de HCV em soroconvertores para HIV. Um total de 155 HSH com infecção primária foram seguidos entre 2000 e 2006 no St Mary’s Hospital em Londres, 1 paciente tinha coinfecção na avaliação de base; e no seguimento 12 experimentaram soroconversão, nos quais o tempo médio de aquisição de HCV foi de 17 meses (5 a 41 meses), no momento do diagnóstico, unicamente 3 tinham alteradas as provas de função hepática, 4 eram assintomáticos e nenhum tinha uma outra doença sexualmente transmissível, sendo posteriormente diagnosticada em 5 indivíduos; todos reportaram práticas de sexo não protegido e uso de drogas recreacionais. 10 foram classificados como genótipo 1a e 2 tinham genótipo 4d; e durante a soroconversão para HCV, 4 experimentaram aumento na carga viral (CV) do HIV (incremento médio de 4.1 log copias/mL). Pesquisadores na Alemanha exploraram os fatores de risco em população HSH HIV positiva. Foram avaliados 22 não usuários de UDI, pareados com 44 controles, sendo estatisticamente significantes após regressão logística o uso de drogas intra-nasais e lesões com sangramento. Como dado relevante os autores aprestaram na análise bivariada a significância estatística do antecedente de cirurgia de grande porte. Tolia e cols compararam a progressão imunológica em pacientes que receberam tratamento para o HCV, foram inicialmente incluídos 57 pacientes coinfectados e com CV do HIV não detectável, tratados com Interferon alfa 2b e Ribavirina. Trinta e nove mantiveram a CV para HIV não detectável e completaram o esquema e seguimento do tratamento. Destes, 13 obtiveram resposta virológica sustentada (RVS). Foi observado que as quedas no número de células CD4 naive e CD4 de memória foram maiores nos pacientes que não alcançaram RVS, assim como, um maior aumento no número de células CD8 em pacientes do grupo de RVS. Thein e cols, apresentaram os dados de uma revisão sistemática e metanálise para avaliar o grau de progressão de fibrose, investigando a repercussão do HIV na história natural da infecção pelo HCV. Após uma seleção de 46 estudos, 17 preencheram os critérios de inclusão, dentro destes, 82% dos indivíduos tinham história de UDI; foram achados como fatores de progressão mais lenta de fibrose: menor idade no momento da infecção pelo HCV, genótipo não 1 e uso de tratamento antiretroviral altamente potente (HAART). A taxa de cirrose entre coinfectados foi o dobro frente aos HCV monoinfectados. Grupo da Escola de Saúde pública de Harvard apresentou o estudo da contribuição do HCV na disfunção neurocognitiva em indivíduos adequadamente controlados com a HAART e 26 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 26 26 sem detecção de HIV, por, no mínimo, seis meses. Os pacientes foram submetidos a provas de função neuropsicológica. As diferenças detectadas nos testes não foram estatisticamente significativas (média de -0.57 para HCV RNA-positivos e de -0.47 para HCV RNA-negativos; P=0.21). Os pesquisadores concluíram que a coinfecção não estaria contribuindo de modo importante na disfunção neuropsicológica de pacientes coinfectados e com supressão viral pelo HAART. Estudo transversal, conduzido na França, avaliou a prevalência, gravidade e fatores de risco de esteatose nos pacientes coinfectados, tendo como base 1000 pacientes HIV positivos, 40% deles coinfectados HCV-HIV, sendo incluídos para análise final 243 sujeitos, com as seguintes características: 68% homens, com CV média de HIV de 2.3 log, número médio de CD4 de 417 células/mm3, média de AST: 40 IU/mL, ALT: 61.5 IU/mL, e GGT: 83.5 IU/mL. Pela genotipagem foram encontrados: genótipo 1 (59.3%), 3 (27.5%), 4 (11.4%) e 2 (1,6%). 82.7% tinham um score METAVIR acima de F2 e 43% tinham evidência de esteatose, tendo a metade deles tanto esteatose micro como macrovesicular. A esteatose esteve correlacionada significantemente com os níveis de enzimas hepáticas, o escore METAVIR e o tempo de seguimento da infecção pelo HIV, sem ser achada associação com o genótipo de HCV ou a duração de exposição à HAART. Batisse e cols apresentaram o estudo de validação de testes comercialmente disponíveis como Fibrometer, FibroTest, Hepascore e o índice AST-plaquetas (APRI) nos pacientes coinfectados HCV-HIV. Foram comparados 825 monoinfectados com 82 coinfectados, sendo observada classificação errada por estes testes quando comparados com a escala METAVIR em entre 23 e 35% dos pacientes, e menores scores AUROC quando comparadas com testes de protrombina e alfa-2-macroglobulina. Pesquisadores de três centros na Itália estimaram a apresentação de resposta virológica rápida (RVR) (HCV RNA abaixo de 50 IU/mL na semana 4 de tratamento), em 161 indivíduos coinfectados com genótipo 3, tratados com terapia combinada. Foi feita a comparação com 173 monoinfectados pelo HCV. Nos coinfectados a RVR esteve associada, independentemente, com doses diárias de ribavirina acima de 13 mg/ kg. A RVR foi observada em 43% dos coinfectados versus 80% dos monoinfectados. Nos pacientes coinfectados, 74% com RVR e 34% sem RVR conseguiram alcançar RVS. (P < 0.0001). A taxa de RVS nos monoinfectados que tiveram RVR foi de 96% e também foi estatisticamente significante maior que em coinfectados. Estudo piloto de cinética viral apresentou a comparação de duas doses semanais de IFN peguilado nas quatro primeiras semanas do tratamento versus dose única semanal em todas as 48 semanas, no esquema que também inclui ribavirina em dose diária entre 1000 e 1200 mg. Oito de 11 pacientes (72%) no braço de dose dupla alcançaram a redução de 1 log na CV de HCV no dia 7, comparado com 1 de 11 (9%) no braço de dose única (P=0.02); adicionalmente, foi apresentado que as percentagens de sujeitos com HCV RNA < 615 IU/mL nas semanas 1, 4, 8 e 12 foram maiores no braço de dose dupla. Também foi reportado que a obtenção de RVS foi maior no grupo de dose dupla e os eventos adversos semelhantes entre os dois grupos. Estudo retrospectivo avaliou a repercussão do tratamento para HCV na progressão da doença hepática nos indivíduos coinfectados, ainda em ausência de RVS. Foram considerados 25 pacientes coinfectados não respondedores ao tratamento e com diagnostico de cirrose, pareados com um grupo controle Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 23-27) 29.10.07 11:24:19 de 25 indivíduos não tratados. Foi estimada como progressão de cirrose a presença de pelos menos um dos seguintes eventos: morte, ascite, icterícia, encefalopatía, sangrado gastrointestinal ou carcinoma hepatocelular (CHC). O modelo de regressão logística empregado detectou como fatores independentes de progressão de cirrose: CV de HIV detectável (RR 35.98); e alteração nos valores de ALT (RR 25.5) assim como o papel protetor do emprego de terapia baseada em IFN (RR 0.03). Hepatotoxicidade dos antiretrovirais O estudo KLEAN que comparou ritonavir com reforço de fosamprenavir (braço 1) versus lopinavir/ritonavir (braço 2) em combinação com abacavir/3TC, em pacientes virgens de tratamento para HIV. Neste estudo, dentre 878 voluntários da América do Norte e Europa, foram incluídos 85 pacientes (9.68%) coinfectados pelo HCV (47 no braço 1 e 38 no 2). Não foram observadas diferenças na tolerância ao tratamento no grupo de indivíduos coinfectados, porém os autores estimam que a comparação de eventos adversos e eficácia nestes subgrupos é intrincada pelo baixo número de indivíduos coinfectados. Grupo liderado por Garcia-Gasco examinou a segurança e farmacocinética de tipranavir em 66 pacientes com diferentes estágios de fibrose, medida por elastografia hepática, sua relação com coinfecção HCV-HIV e níveis farmacológicos circulantes durante 12 semanas de seguimento. Foi observado aumento de ALT durante o seguimento, especialmente, nos pacientes com estágio F4, e os níveis de tripanavir foram maiores nos Tendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 23-27) Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 27 27 pacientes com F3/4, quando comparados com os outros (51 vs 30 mcg/mL; P=0.02). Na análise multivariada, unicamente o nível de fibrose esteve relacionado com níveis elevados do fármaco (P=0.04). Outro grupo também da Espanha, avaliou a segurança de atazanavir (em reforço de ritonavir) nos pacientes coinfectados com fibrose hepática. Foram incluídos 185 pacientes coinfectados pelo HCV, 112 com grau de fibrose conhecida por: biópsia hepática (n=49), elastografia (n=31) e APRI+índice Forns (n=32). Após uma média de seguimento de 11 meses, 12 pacientes desenvolveram elevações graves de transaminases (grau 3-4). Os investigadores concluíram que a presença de graus elevados de fibrose não incrementou o risco de elevações de transaminases. Trabalho apresentado por McGovern e cols. comparou o número absoluto de células CD4 com a sua percentagem no monitoramento da progressão de HIV em pacientes cirróticos. Incluiu 6000 participantes HIV positivos da coorte italiana de pacientes virgens de tratamento. O número médio de CD4 foi de 427 células/mm3 (1-1361) e a média de percentagem de CD4 foi 23% (1%-81%). Trinta e oito por cento da coorte tinha coinfecção pelo HCV, sendo divididos em 2 grupos: com e sem evidência da cirrose. Nos pacientes com cirrose, níveis altos de CD4, mas não altas percentagens estiveram associadas com baixo risco de progressão a aids (RR 0.58 por incremento de 100 células/mm3; 0.61 por cada incremento de 10%). Concluíram que a percentagem de células CD4 poderia ter maior sensibilidade, como marcador de progressão para aids, nos pacientes coinfectados HCV-HIV com cirrose. 27 29.10.07 11:24:19 Resumo de Teses Autor: Daniela Souza Araujo de Angelis Orientador: Daisy Maria Machado Instituição: Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo Ano de Defesa: 2007 Nível: Mestrado Título: Avaliação do perfil de resistência genotípica aos anti-retrovirais de crianças infectadas pelo HIV-1 mantendo supressão viral prolongada em vigência de tratamento Resumo: O tratamento de indivíduos infectados pelo HIV-1 com terapia anti-retroviral (ARV) pode reduzir a viremia plasmática abaixo dos limites de detecção dos ensaios atuais em muitos pacientes, porém difícil de ser alcançada em crianças na vida real. Falha em alcançar ou manter a supressão da replicação viral está geralmente associada com o desenvolvimento de vírus resistentes a drogas. Nós investigamos o perfil de resistência genotípica em crianças com supressão viral prolongada (< 400 cópias/ mL de RNA viral plasmático) em vigência de tratamento anti-retroviral. Nós obtivemos 32 amostras de células mononucleares do sangue periférico (do inglês PBMC) de 16 crianças do CEADIPe - UNIFESP quem tinham tido carga viral indetectável por 12 meses ou mais, em dois momentos: a primeira amostra na inclusão e a segunda após mínimo de 9 meses de acompanhamento. A análise das seqüências foi realizada em vírus isolado de PBMC pelo “ABI PRISM 377 sequencer” (Applied Biosystems, USA). Dentre as principais características da população do estudo encontramos: mediana da idade na inclusão de 11 (6-15 anos); esquemas terapêuticos com 2 inibidores da transcriptase reversa análogos nucleosídeo (ITRN) + 1 inibidor da protease (IP) ou 2 ITRN + 1 inibidor da transcriptase reversa não-nucleosídeo (ITRNN) ou 2 ITRN + 2 IP + 1 ITRNN ou 2 ITRN + 2 IP ou 2 ITRN; mediana de células CD4 (cél/mm 3 ) de 1016 (347- 2588) e 938 (4403038) no primeiro e segundo momentos, respectivamente; classificação clínica (CDC 1994): N = 1, A = 3, B = 6; e classificação imune (CI): CI 1 = 4, CI 2 = 6, CI 3 = 6. O tempo médio de seguimento foi 15 (9 - 27) meses a partir da inclusão. Seis (37,5%) e 7 (43,75%) dos 16 pacientes mostraram no mínimo uma mutação associada aos ITRN, na primeira e na segunda amostra, respectivamente. Dois dos dezesseis (12,5%) apresentaram mutações associadas aos ITRNN na primeira amostra e 3/16 (18,75%) na segunda. Além disso, 14/16 (87,5%) mostraram pelo menos uma mutação associada aos IP nos dois momentos. A despeito do tratamento com drogas anti-retrovirais potentes e supressão do RNA do HIV-1 no plasma a níveis indetectáveis por vários meses, resistência parcial à terapia pode ter resultado primariamente de arquivos de vírus ou refletir precocemente condições sub-ótimas de tratamento. Aluno: Márcia Menezes Gomes da Silva Orientador: Daniela Riva Knauth Instituição: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Ano de Defesa: 2007 Nível: Mestrado Titulo: Características das gestantes infectadas pelo HIV, de acordo com o momento do seu diagnóstico. Resumo: Objetivo: Analisar fatores socioeconômicos, demográficos e as características do pré-natal das gestantes infectada pelo HIV, de acordo com o momento do seu diagnóstico. Métodos: Realizou-se estudo transversal com 199 gestantes infectadas pelo HIV que tiveram seu atendimento pré-natal em três centros públicos de referência de Porto Alegre, no período de julho de 2005 a janeiro de 2006. O questionário avaliou informações sócio-econômicas, demográficas e do prénatal. Durante a análise, elas foram divididas em 2 grupos: Grupo1 composto de 135 gestantes (68%) que sabiam previamente a gestação o seu diagnóstico para HIV e o Grupo 2 com 64 gestantes (32%) que conheceram o diagnóstico naquele pré-natal. Resultados: A mediana de idade das gestantes foi 26 anos (variando 15 a 42 anos). Quanto à escolaridade, 59% (n=117) delas não chegaram a concluir o ensino fundamental. 74% (n=147) não tinham nenhum tipo de renda. Em termos conjugais, 81% (n=153) das gestantes possuíam um relacionamento estável com o pai da criança e 66% (n=132) possuíam menos de 20 anos de idade quando tiveram a primeira gestação. O número mediano de gestações prévias foi 3 (variando de 1 a 13 gestações), e 37% (n=73) tiveram pelo menos um aborto prévio. Comparando os grupos, observou-se que o início do prénatal no primeiro trimestre e o desejo de realizar ligadura tubária foi significativamente mais freqüente no Grupo 1 do que no Grupo 2. p=0,005 e p=0, 012, respectivamente. Conclusões: Não houve diferenças estatisticamente significante entre os grupos nos aspectos sócio-demográficos, todavia as gestantes que já tinham o seu diagnóstico para HIV prévio a gestação iniciaram mais precocemente seu pré-natal e mais freqüentemente requisitavam a ligadura tubária. 28 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 28 28 29.10.07 11:24:19 Autor: Fernanda Tavares de Mello Abdalla Orientador: Lucia Yasuko Izumi Nichiata Instituição: Faculdade de Enfermagem da Universidade de São Paulo Nível: Mestrado Ano de Defesa: 2007 Título: Abertura da privacidade e o sigilo do HIV/AIDS nas equipes do programa saúde da família de uma unidade básica de saúde do município de São Paulo Resumo: Desde a identificação das primeiras pessoas com aids vêm ocorrendo mudanças no perfil da epidemia. Acometendo inicialmente homens, adultos com alta escolaridade e com práticas homossexuais, passou a atingir cada vez mais os jovens, os grupos sociais de maior exclusão social, as pessoas com práticas heterossexuais e as mulheres. Observa-se crescimento de casos em mulheres a partir da década de 90, embora proporcionalmente o número de casos seja ainda maior em homens. Até novembro de 2000, do total de 196 016 casos de aids notificados no Brasil, um quarto era do sexo feminino. Após o diagnóstico da infecção pelo HIV, as mulheres enfrentam dificuldades das mais variadas formas, desde aquelas relacionadas à infecção e ao adoecimento, ao tratamento e aos cuidados diários, até aquelas referidas ao campo afetivo-relacional. Dado que a doença é envolta em preconceito, estigma que podem levar a discriminação há preocupação das mulheres com o “segredo” da infecção pelo HIV. Considerando isto, o Programa Saúde da Família (PSF) pode incluir ações que desenvolvam habilidades de busca e recepção de apoio social, fortalecimento de vínculos familiares e sociais na assistência e convivência com as pessoas acometidas pelo HIV/AIDS. O PSF convergindo para a promoção da qualidade de vida das pessoas e de seu ambiente pode intensificar as ações de promoção à saúde e prevenção do HIV. Desta forma, entende-se que, considerando a autonomia da usuária, a abertura da privacidade pela usuária pode auxiliar na resposta às necessidades de saúde pelas equipes de PSF. As discussões sobre os conflitos que os profissionais de saúde do PSF encontram no seu cotidiano e que envolvem a manutenção da privacidade e sigilo das informações das usuárias, na perspectiva da Bioética, especialmente na questão do HIV/AIDS, são objetos do presente estudo. Seus resultados podem servir como subsídios para a reflexão das práticas do PSF e conseqüentemente para a melhoria da qualidade da assistência em saúde. Este estudo teve como objetivo discutir as situações que envolvem questões de privacidade e sigilo das informações nas experiências de assistência às mulheres portadoras de HIV/AIDS, vivenciadas pelas equipes do PSF. Trata-se de um estudo qualitativo descritivo, exploratório, na qual foram utilizadas as metodologias de grupo focal e entrevista semi estruturada. Foi realizada numa Unidade Básica de Saúde que opera com modelo de PSF no município de São Paulo. Foram coletadas as falas de dois grupos focais com agentes comunitários de saúde (ACS) e 25 entrevistas individuais com enfermeiros, médicos e auxiliares de enfermagem. Os depoimentos foram analisados segundo Bardin e organizados nos temas: a) a revelação do diagnóstico de HIV para a usuária; b) acolhimento e vínculo na abertura da privacidade; c) a revelação do diagnóstico de HIV aos membros da equipe de PSF e, d) discussão em equipe e o sigilo das informações. Verificou-se que os profissionais do PSF tomam conhecimento sobre o diagnóstico do HIV pela própria usuária, familiares, vizinhos, ACS ou outro membro da equipe e profissionais de saúde dos serviços de referência, além do prontuário e dos resultados de exames. A mulher revela seu diagnóstico de HIV, abrindo sua privacidade quando há confiança e vínculo na relação usuáriaprofissional. Os profissionais buscam assegurar o sigilo referente ao diagnóstico do HIV. A abertura da privacidade da informação possibilita a discussão das necessidades de saúde da usuária e o planejamento das ações pelas equipes de PSF. Aluna: Audrey Janaina Pinto. Orientadora: Alcione Artioli Machado Instituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo Nível: Doutorado Ano de defesa: 2007 Titulo: Comparação do perfil genético do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 em compartimento sangüíneo e liquórico de pacientes com afecções neurológicas. Resumo: O Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) freqüentemente invade o sistema nervoso central (SNC) durante a infecção primária, e eventualmente resulta em desordens neurológicas acima de 50% dos pacientes sem tratamento. A casuística deste estudo é de 31 pacientes com afecções neurológicas, 11 pacientes com toxoplasmose cerebral, 11 com meningite criptococócica e nove pacientes com aids demência, com níveis de RNA do HIV-1 medidos em líquido 29 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 29 29 29.10.07 11:24:19 cefalorraquidiano e em plasma, sugerindo que as doenças e os níveis de RNA do HIV-1 podem influenciar na carga viral do líquor. Assim, o objetivo deste estudo foi comparar a região do gene envelope (env) do vírus no compartimento plasmático e liquórico. Métodos: fragmentos do gene env do HIV-1 foram amplificados pela reação em cadeia polimerase (PCR) e nested PCR de plasma e líquor. Os produtos de PCR foram diretamente seqüenciados pelo seqüenciador 3.1 ABI Analysis Data Collection. Utilizou-se para o alinhamento das seqüências o programa MEGA 3.1, onde as seqüências de aminoácidos da região do env nas amostras de líquor e plasma foram comparadas intra-pacientes. Procedeu-se a análise do uso do co-receptor feita pela posição 306 e 320 da alça do V3. Pela análise filogenética das seqüências obtiveram-se os subtipos. Resultados: todas as amostras amplificadas (41) foram do subtipo B. Tiveram-se 17 pacientes que possuíam seqüências de plasma e líquor amplificadas, então, na análise intra-paciente 13 destes 17, possuíam vírus que utilizaram o co-receptor CCR5, apresentando assim, viroses R5, um paciente apresentou virose X4 e dois pacientes apresentaram viroses diferentes nos compartimentos, X4 e R5. A compartimentalização entre líquor e plasma ocorreu em 4 de 17 indivíduos (23,53%) e em 13 de 17 indivíduos (76,47%) possuíam seqüências idênticas nos dois compartimentos. Conclusão: Identificaram-se mudanças idênticas em líquor e plasma, nas seqüências do HIV-1 na região do env, especificamente na alça V3 principalmente no motif central. Autor: Fernanda Cristina Ferreira Orientador: Lucia Yasuko Izumi Nichiata Instituição: Universidade de São Paulo Ano de Defesa: 2007 Nível: Mestrado Título : As condições que levam as mulheres soropositivas ao HIV/AIDS a abrir a privacidade de suas informações às equipes do programa saúde da família Resumo : A AIDS é uma doença infecciosa que aparece na década de 1980. Desde sua descoberta até os dias atuais houve mudanças nas características das pessoas infectadas. Uma dessas mudanças foi a feminização. As mulheres devido às questões de gênero possuem singularidades na forma do enfrentamento da doença. O acompanhamento das mulheres infectadas pelo HIV é realizado principalmente, por serviços especializados de saúde. Depois da criação do Programa Saúde da Família, em 1994, e o incentivo às ações de promoção à saúde e prevenção do HIV na atenção básica, torna-se de suma importância a discussão de temas sobre bioética no caso da aids no PSF. O PSF adentra as residências das famílias e tem uma relação de maior proximidade com a comunidade, e incorpora um novo trabalhador que é o Agente Comunitário de Saúde. É a mulher infectada pelo HIV que tem o direito de decidir a quem, como, onde e quando a informação sobre sua soropositividade deve ser revelada. Este estudo teve como objetivos descrever em que condições as mulheres infectadas pelo HIV abrem sua privacidade em relação a informação sobre o diagnóstico de soropositividade a familiares, amigos e vizinhos; e identificar quais as motivações para abrir a privacidade de informações para a equipe de PSF das mulheres infectadas pelo HIV/AIDS. Trata-se de um estudo descritivo de natureza qualitativa, com enfoque bioético, realizado no Município de São Paulo, com mulheres em acompanhamento em um serviço especializado em DST/AIDS e cadastradas por uma equipe de PSF. Verificou-se neste estudo que as mulheres infectadas pelo HIV/AIDS revelam a sua condição de soropositividade a família, amigos e vizinhos quando há identificação com outro soropositivo, pressão de outros, confiança depositada em uma relação, vontade de busca de apoio, preocupação com possível transmissão do vírus ao parceiro, quando houve experiências positivas de apoio, e quando não consegue mentir quando questionada sobre sua soropositividade. E não revelam quando há medo do preconceito, medo de ex-parceiros, medo de se expor, houve experiências negativas como falta de apoio, rejeição e disseminação da informação, foi estabelecido uma pacto de silêncio, não querem que sintam pena, há medo de que a relação mude, envolve filhos menores de idade, preferem guardar para si e quando utilizam estratégias para manter o segredo. As mulheres abrem a privacidade do diagnóstico para a equipe de PSF quando o diagnóstico de soropositividade foi feito na própria unidade, quando ela sente que é melhor atendida no PSF por ser portadora do HIV, tem vínculo com os profissionais do PSF como se fossem familiares, confiam nos profissionais do PSF, sentem que os profissionais não sentem pena. E, não revelam quando a atitude inadequada do profissional gerou medo e insegurança quando comunicou à usuária o diagnóstico, acham que o PSF está ligado ao cuidado de pessoas com doenças graves e acamados, não confiam nesses profissionais por medo de quebra do sigilo,e já possuem todo suporte assistencial no SAE. 30 Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 30 30 29.10.07 11:24:19