this PDF file
Transcrição
this PDF file
ISSN 1808-4532 e-ISSN: 2179-443X Rev Ciên Farm Básica Apl., Araraquara, v. 37 Supl. 1, Agosto 2016 BB. Regulação de lanosterol sintase endógena para produção heteróloga de triterpenos José Roberto Espanhol Junior2, Tatiana Maria de Souza Moreira1, Anastasia Krivoruchko3, Sakda Khoomrung3, Jens Nielsen3, Sandro Roberto Valentini2, Maysa Furlan1, Cleslei Fernando Zanelli2. 1 Instituto de Química, UNESP, Araraquara. Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, Araraquara. 3 Chalmers University of Technology, Gotemburgo, Suécia. 2 Introdução: Triterpenos são moléculas formadas pela ciclização enzimática da molécula de 2,3oxidosqualeno e apresentam propriedades biológicas comprovadas, como antitumoral e anti-inflamatória. Em fungos e mamíferos, a enzima oxidoesqualeno ciclase (OSC) produz lanosterol, precursor dos esteroides essenciais ergosterol e colesterol, respectivamente. Por outro lado, em plantas, há uma variedade de OSCs formando triterpenos como beta-amirina, lupeol e friedelina. Assim, a molécula de oxidosqualeno em levedura também pode ser substrato para uma enzima OSC heteróloga de planta, levando à biossintese de triterpenos, cuja produção pode ser melhorada por meio de engenharia da via metabólica de ergosterol. Objetivo: O presente trabalho tem por objetivo regular negativamente a OSC lanosterol sintase (Erg7p) de Saccharomyces cerevisiae para aumento da produção de friedelina. Metodologia: Todas as modificações genéticas foram realizadas no locus de ERG7 da linhagem CEN.PK113-5D por recombinação homóloga de cassetes de DNA obtidos por PCR. As estratégias implementadas foram: 1) mudança de promotor nativo de ERG7 pelo promotor constitutivo fraco de KEX2; 2) redução da a estabilidade do mRNA de ERG7 pela adição do cassete de kanMX entre o códon de terminação e a região 3'-UTR; 3) aumento da degradação de Erg7p pela adição de um sinal de ubiquitinação conhecido como CL1. Um plasmídeo contendo a sequência codificadora de friedelina sintase sob o controle do promotor TEF1 foi transformado na linhagem modificada e na linhagem selvagem. As culturas foram mantidas a 30°C, 200 rpm, durante 96 h. O composto friedelina foi extraído utilizando clorofórmio:metanol e aquecimento a 60°C durante 10 min. A produção foi analisada por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM modelo ISQ-LT, Thermo Fischer Scientific, utilizando a coluna ZB-50, Zebron, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Resultados e discussão: Os resultados demonstram que a produção de friedelina foi 4,5 vezes mais elevada com a troca do promotor nativo de ERG7 pelo promotor fraco, mantendo a mesma taxa de crescimento em comparação com a linhagem do tipo selvagem. As estratégias de perturbação do mRNA e a adição de sinal de ubiquitinação aumentaram a produção de friedelina em 3,5 e 2,6 vezes, respectivamente. O crescimento celular foi fortemente prejudicado apenas pela adição do sinal de ubiquitinação. Conclusão: A troca do promotor nativo por um outro considerado fraco por levar a baixos níveis de expressão do gene de ERG7 foi a modificação que rendeu maior aumento da produção de friedelina. Tal fato pode ser resultado de uma economia celular de energia quanto aos processos de transcrição, tradução e degradação, redirecionando tal energia no sentido da produção heteróloga. Outras modificações em outras etapas na via de síntese de ergosterol poderão resultar em maiores rendimentos na produção friedelina. Palavras-chave: Engenharia metabólica, Saccharomyces cerevisiae, friedelina. Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, PADC-UNESP.