Linfomas cutâneos - Faculdade de Medicina da USP

DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS COM APRESENTAÇÃO CUTÂNEA PRIMÁRIA:
CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA, CLÍNICA, IMUNO-PATOLÓGICA, MOLECULAR E
EVOLUTIVA DE COORTE OBSERVADA NO AMBULATÓRIO DE LINFOMAS CUTÂNEOS DA
DIVISÃO DE CLÍNICA DERMATOLÓGICA DO HC-FMUSP / DEPARTAMENTO DE
DERMATOLOGIA DA FMUSP ENTRE OS ANOS DE 1989 E 2010
INTRODUÇÃO
1. Aspectos conceituais dos linfomas cutâneos
Os linfomas constituem um grupo de neoplasias derivadas do sistema linforreticular. Eles
são divididos em dois grandes grupos: os linfomas de Hodgkin e os linfomas não-Hodgkin.
O linfoma de Hodgkin acomete principalmente linfonodos cervicais em indivíduos adultos.
Sua incidência absoluta aparentemente não se tem modificado, em contraste com o evidente
aumento da incidência dos linfomas não-Hodgkin. Estes últimos podem ser nodais, quando
acometem primariamente os linfonodos, ou extranodais. Cerca de 30% dos linfomas nãoHodgkin acometem tecidos extranodais, sendo a pele o segundo órgão mais envolvido após
o trato gastrointestinal, compreendendo aproximadamente 18% desses linfomas. Os
linfomas cutâneos primários diferem significantemente das formas nodais equivalentes
quanto ao comportamento clínico e prognóstico.(1-3)
No passado os linfomas cutâneos não eram reconhecidos como entidade própria, e sim
como acometimento secundário da pele por linfoma nodal. Inicialmente, apenas a micose
fungóide, linfoma cutâneo de células T, era reconhecida como forma primária de linfoma
cutâneo. Os primeiros relatos de linfomas cutâneos primários, não-micose fungóide, foram
publicados nas décadas de 1960 e 1970. Baseado nas características imunofenotípicas das
células neoplásicas, ao final dos anos 70, os linfomas foram divididos em dois grandes
grupos, de células T e de células B, segundo suas origens. Nos anos 80 e 90 surgiu o
conceito de linfomas cutâneos primários e secundários, e a seguir várias classificações
foram descritas.(4)
Recentemente, conferências de consenso entre duas importantes organizações para o estudo
do câncer, a Organização Mundial de Saúde (WHO) e a Organização Européia para
Pesquisa e Tratamento do Câncer (EORTC), propuseram uma classificação que confere
1
mais uniformidade ao diagnóstico e tratamento dos processos linfoproliferativos
cutâneos.(5-8)
Classificação (WHO-EORTC) para os linfomas cutâneos primários:

Linfomas cutâneos de células T e de células NK
Micose fungóide
Micose fungóide – variantes e subtipos
MF foliculotrópica
Reticulose pagetóide
Cútis laxa granulomatosa
Síndrome de Sézary
Linfoma/leucemia de célula T do adulto
Doenças linfoproliferativas CD30+ cutâneas primárias
Linfoma cutâneo primário de grande célula anaplásica
Papulose linfomatóide
Linfoma subcutâneo de células T, paniculite-símile
Linfoma extranodal de célula T/NK, tipo nasal
Linfoma cutâneo primário de célula T periférica, sem outra especificação
Linfoma cutâneo primário agressivo de célula T CD8+ epidermotrópica
Linfoma cutâneo de célula T γδ
Linfoma cutâneo primário de pequena e média célula T CD4+ pleomórfica (provisório)

Linfomas cutâneos de células B
Linfoma cutâneo primário de células B da zona marginal
Linfoma cutâneo primário centrofolicular
Linfoma cutâneo primário difuso de grande célula B, tipo perna
Linfoma cutâneo primário difuso de grande célula B, outro (não perna)
Linfoma cutâneo primário intravascular de grande célula B

Neoplasia de precursor hematológico
Neoplasia hematodérmica CD4+CD56+ (linfoma de célula NK blástica)
2. Aspectos epidemiológicos
Estima-se, para os linfomas cutâneos, incidência anual na América do Norte e Europa
Ocidental compreendida entre 0,3 e 1:100.000 habitantes. Aproximadamente 75 a 80% dos
linfomas cutâneos primários são linfomas cutâneos de células T (LCCT), com predomínio
absoluto da micose fungóide (MF) e suas variantes. A MF caracteristicamente acomete
adultos com idades compreendidas entre 55 e 60 anos na ocasião
do diagnóstico, com ligeiro predomínio no sexo masculino (1,6-2:1). É raramente descrita
na infância e em adultos jovens, embora seja muito provável que muitos casos se iniciem
nas duas primeiras décadas de vida, mas não sejam reconhecidas como MF. A incidência
2
anual dos linfomas B, incluindo os linfomas nodais e extranodais, é muito variada. Nos
EUA a incidência é de aproximadamente 15 por 100.000 habitantes, na China 1,2 por
100.000 habitantes. América do Sul, África e Japão apresentam incidências intermediárias.
Os linfomas cutâneos primários de células B representam aproximadamente 20-25% de
todos os linfomas cutâneos primários. Segundo estudo da EORTC, os linfomas cutâneos
primários de células B apresentam discreta prevalência no sexo masculino, na proporção de
2:1 e acometem indivíduos com idade média de 59 anos.(1-3)
3. Aspectos clínicos
Os diferentes tipos de linfomas cutâneos podem ter diferentes apresentações clínicas e,
mesmo um único tipo de linfoma cutâneo pode se revelar sob a forma de diversas formas
clínicas; assim, detalharemos os aspectos clínicos das formas mais comuns.
A) Processos linfoproliferativos de célula T e NK
A micose fungóide é linfoma cutâneo de pequenos e médios linfócitos T com núcleos
circunvolutos que caracteristicamente apresentam epidermotropismo. Embora a recente
classificação WHO-EORTC reconheça apenas sua forma clássica de Alibert-Bazin e três
variantes – foliculotrópica, reticulose pagetóide e cútis laxa granulomatosa –, esse linfoma
apresenta-se com muitas variações clinico-patológicas, cujas implicações epidemiológicas,
terapêuticas e evolutivas devem ser consideradas. A síndrome de Sézary (SS) é variantes
leucêmicas da doença, que se apresenta desde seu início com eritrodermia e cursa
freqüentemente com alopecia difusa, hiperqueratose palmoplantar e linfonodos difusamente
aumentados. Na forma clássica é doença progressiva, de curso indolente, que evolui a partir
de lesões não infiltradas com formação de placas e tumores. Surgem inicialmente na pele
da cintura pélvica, de nádegas, tronco inferior, virilhas, axilas e mamas, em número
variável, disseminando-se gradativamente. Com o tempo as lesões infiltram-se, tornando-se
placas elevadas eritematosas ou eritêmato- acastanhadas, de bordas bem delimitadas e
contornos freqüentemente bizarros com aspecto foveolar, semi-anular e serpiginoso, e
eventualmente surgem tumores sobre placas preexistentes ou não. É comum os pacientes
apresentarem uma combinação de lesões não infiltradas, placas e tumores. As placas muito
infiltradas e os tumores ulceram-se com freqüência, e pode surgir eritrodermia nesse
processo evolutivo.(9,10)
3
Os pacientes com SS apresentam-se caracteristicamente com eritrodermia exfoliativa,
edematosa com ou sem liquenificação, pruriginosa, linfadenopatia generalizada e células T
neoplásicas circulantes no sangue periférico. Freqüentemente associam-se queratodermia
palmoplantar, distrofias ungueais e alopecia, e há queixa de prurido intenso. Ocorre
exclusivamente em indivíduos adultos.(9)
O linfoma cutâneo primário de grande célula anaplásico apresenta-se na maioria dos
pacientes como pápulas ou nódulos únicos que se ulceram. Mais raramente são múltiplos
localizados em determinada região anatômica, podendo ser multifocais (20% dos casos).
Pode ocorrer regressão espontânea parcial ou completa. A papulose linfomatóide apresentase como erupção pápulo-nodular ou pápulo-necrótica, auto-regressiva, que evolui em surtos
recorrentes. Acomete adultos jovens, com idade mediana de 45 anos, sendo rara em
crianças.(11,12)
O linfoma subcutâneo de célula T paniculite-símile apresenta-se com placas e nódulos
solitários ou múltiplos, habitualmente não ulcerados. Sintomas constitucionais como febre,
fadiga e perda de peso podem ocorrer. O desenvolvimento de síndrome hemofagocítica,
embora possível, provavelmente é mais comum no linfoma cutâneo de célula T gama-delta
com lesões semelhantes às da paniculite. É rara a disseminação extracutânea. Esse linfoma
pode assemelhar-se a paniculites benignas, tanto do ponto de vista clínico como histológico,
por muitos anos.(13)
O linfoma-leucemia de células T do adulto é doença linfoproliferativa associada à infecção
pelo retrovírus HTLV-1. Pode-se manifestar como forma leucêmica. Lesões cutâneas
surgem em cerca de 50% dos casos, representados na maioria por doença disseminada. São
reconhecidas quatro variantes clínicas: aguda, linfomatosa, crônica e smoldering
(indolente). A forma indolente, lentamente progressiva, tem sido descrita apresentando
apenas lesões cutâneas. É doença endêmica em áreas com alta prevalência, na população,
de infecção pelo HTLV-1, como sudeste do Japão, ilhas do Caribe, América do Sul,
incluindo Nordeste e Sudeste brasileiros, norte do Iran e determinadas regiões da África
central. O linfoma se desenvolve em cerca de um a 5% dos indivíduos soropositivos,
habitualmente após mais de duas décadas de persistência viral. O vírus pode ser transmitido
pelo leite materno e por exposição ao sangue e derivados. Ocorre em adultos (idade
mediana de 55 anos), com discreta predominância entre homens. As lesões cutâneas
4
específicas podem apresentar-se como pápulas, placas, tumores e eritrodermia, por vezes
assemelhando-se muito à MF. Xerose e ictiose adquirida freqüentemente estão presentes
nos doentes, podendo ser manifestação inespecífica ou específica do linfoma.(14-16)
O linfoma extranodal de célula T/NK, tipo nasal acomete mais freqüentemente a cavidade
nasal e nasofaringe; entretanto, pele, partes moles e intestino podem ser afetados
primariamente. Disseminação nodal é rara. As lesões do nariz e centro da face foram
denominadas granuloma letal da linha média. Clinicamente apresenta-se com lesões
papulosas e nodulares eritêmato- vinhosas, purpúricas, que ulceram rapidamente, formando
extensas áreas de necrose.(6,16)
B) Processos linfoproliferativos de célula B
Clinicamente os linfomas cutâneos primários de células B apresentam-se usualmente como
pápulas, placas ou nódulos. A coloração pode variar de eritematosa a violácea. As lesões
podem ser solitárias ou múltiplas, disseminadas ou agrupadas em uma região corpórea, e
raramente apresentam ulceração ou necrose. Quanto à localização, podem acometer
qualquer área da pele, embora alguns subtipos apresentem áreas de predileção.
O linfoma cutâneo primário de células B da zona marginal apresenta-se habitualmente
como pápulas, placas ou nódulos; lesões únicas ou, mais freqüentemente, múltiplas
agrupadas; com predileção por tronco ou membros, principalmente os membros suerpiores.
O imunocitoma e a hiperplasia linfóide folicular com células plasmáticas monotípicas,
assim como os raros casos de plasmocitoma não associado ao mieloma múltiplo
(plasmocitoma extramedular da pele), estão incluídos nesse grupo.
O linfoma cutâneo primário centrofolicular apresenta predileção pela cabeça (couro
cabeludo e região frontal) e tronco. O linfoma descrito no passado como linfoma de Crosti
ou retículo-histiocitoma do dorso, usualmente nódulo ou placa, corresponde ao linfoma
cutâneo primário centrofolicular.(6,19,20)
O linfoma cutâneo primário difuso de grandes células B, tipo perna acomete membro
inferior, com freqüência um único membro, podendo apresentar, raramente,
comprometimento bilateral. Afeta, sobretudo, idosos e particularmente o sexo feminino. As
lesões podem ser solitárias ou múltiplas agrupadas.(6,19,20)
5
4. Aspectos patológicos e fenotípicos
A confirmação diagnóstica do linfoma cutâneo não é fácil. Os exames considerados
"padrão ouro" são a histopatologia e a imuno-histoquímica. O diagnóstico da neoplasia é
habitualmente sugerido por patologistas experientes pela avaliação citomorfológica e pela
disposição do arranjo arquitetural do infiltrado. Atualmente, para a classificação dos
linfomas é imprescindível a realização do estudo imuno-histoquimico, cujo painel de
anticorpos é racionalizado conforme os achados histológicos. Os linfócitos T são CD3+ e
quando de memória são também CD45RO+. Os linfócitos NK são CD3- CD16+ CD56+.
Os linfócitos B são CD3- CD19+ CD20+ CD79a+. Os linfócitos B do centro germinativo
são CD19+ CD20+ CD79a+ CD10+, já os linfócitos B da zona marginal são CD19+
CD20+ CD79a+ CD10-. Os plasmócitos, habitualmente, são CD19- CD20- CD79a+.
Outros marcadores complementares são importantes auxiliares diagnósticos ou
classificatórios como o CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD21, CD23, CD30, ALK, EMA,
MUM1, βF1, além das moléculas relacionadas a apoptose bcl-2, bcl-6 e do indicador de
proliferação celular Ki-67.(17,18,21)
A pesquisa do rearranjo do gene para o TCR, demonstrando proliferação linfocitária T
clonal na pele, linfonodos e ou sangue periférico, pode auxiliar no diagnóstico de
determinados casos de linfomas de células T. A pesquisa do rearranjo do gene da cadeia
pesada da imunoglobulina tem sido utilizada como método auxiliar no diagnóstico dos
processos linfoproliferativos de células B. Estas pesquisas são realizadas por PCR ou
Southern-blot.(22-26)
Na micose fungóide, que é o linfoma cutâneo primário mais freqüente, os aspectos
citológicos e o padrão arquitetural do infiltrado celular correlacionam-se com o estágio
clínico da doença. Os critérios histológicos amplamente aceitos que falam a favor do
diagnóstico da doença incluem presença de linfócitos com núcleos hipercromáticos e
convolutos, rodeados por halo claro, na camada basal da epiderme com aproximadamente o
mesmo tamanho dos queratinócitos, isolados ou alinhados formando configuração linear,
ou intensa exocitose de linfócitos, e microabscessos de Pautrier. As células neoplásicas na
MF são células com fenótipo de memória CD3+CD4+CD45RO+CD8– com negatividade
para a expressão do antígeno CD7 em cerca de 70% dos casos. Raramente podem ser
6
CD3+CD4–CD8+, apresentando o mesmo comportamento clínico e prognóstico, não
devendo ser consideradas separadamente. (6)
5. Aspectos evolutivos
Os linfomas que se apresentam primariamente na pele, sem evidência de doença
extracutânea na ocasião do diagnóstico, têm, freqüentemente, comportamento clínico e
prognóstico diverso daqueles linfomas sistêmicos de subtipo histológico semelhante.
Dentro da nova classificação dos linfomas cutâneos pela WHO-EORTC, eles podem ser
separados de acordo com o comportamento clínico. São considerados linfomas indolentes a
micose fungóide e suas variantes (MF foliculotrópica, Reticulose pagetóide, Cútis laxa
granulomatosa) o linfoma cutâneo primário de grande célula anaplásica, a papulose
linfomatóide, o linfoma subcutâneo de célula T, paniculite-símile, o linfoma cutâneo
primário de pequena e média célula T CD4+ pleomórfica, o linfoma cutâneo primário de
células B da zona marginal e o linfoma cutâneo primário centrofolicular. Os linfomas
indolentes caracterizam-se por história natural prolongada. Na MF, por exemplo, os
pacientes com doença limitada com boa resposta aos tratamentos tópicos apresentam
expectativa de sobrevida semelhante à da população normal. Estudo recente demonstra que
apenas 2% daqueles com lesões localizadas morrem após 32 anos de evolução e que
somente 9% mostram progressão para placas e tumores com disseminação linfonodal e
visceral. Sepse, principalmente por Staphylococcus aureus, representam uma das causas
mais freqüentes de óbitos nos casos avançados. A sobrevida em 10 anos é de 97% para
pacientes com lesões não infiltradas ou placas localizadas (< 10%. da superfície cutânea),
83% para pacientes com lesões generalizadas (≥ 10%. da superfície cutânea), 42% para os
pacientes com tumores, e cerca de 20% para aqueles com doença linfonodal.
São considerados linfomas agressivos a síndrome de Sézary, o linfoma extranodal de célula
T/NK, tipo nasal, o linfoma cutâneo primário agressivo de célula T CD8+ epidermotrópica,
o linfoma cutâneo de célula T γδ, o linfoma cutâneo primário de célula T periférica, em
outra especificação. Estes se caracterizam por apresentar prognóstico reservado;
geralmente tem curso rápido e agressivo com alta taxa de mortalidade a despeito do
tratamento. Na síndrome de Sézary, por exemplo, as taxas de sobrevida de cinco anos
7
variam entre 10 e 20%; nestes casos freqüentemente se observa progressão para um linfoma
de grandes células, freqüentemente associada ao evento terminal. (27-31)
Entre os linfomas agressivos e os indolentes existe um grupo de linfomas com
características evolutivas que não os permitem ser classificado dentro dessas duas
categorias. São os linfomas de comportamento intermediário o linfoma cutâneo primário
difuso de grandes células B, tipo perna, o linfoma cutâneo primário difuso de grandes
células B, outro (não perna) e o linfoma cutâneo primário intravascular de grandes células
B.(32-35)
OBJETIVOS
Este projeto visa estudar os pacientes (n=700) acompanhados no Ambulatório de Oncologia
Cutânea da Divisão de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (HCFMUSP) entre os anos de 1989 e 2010, e aqueles
acompanhados prospectivamente a partir da aprovação deste projeto, com os seguintes
objetivos:
1.
Analisar o perfil dos pacientes estudados quanto às:
a. Características demográficas, clínicas e evolutivas
b. Características histológicas e imuno-histoquímicas
2.
Reclassificar os pacientes portadores de linfomas com apresentação cutânea
primária utilizando as classificações propostas pela WHO (2008)
3.
Correlacionar os subtipos de linfomas cutâneos com características demográficas,
clínicas e evolutivas dos pacientes
4.
Avaliar a frequencia dos diversos subtipos de linfomas cutâneos
5.
Avaliar a evolução dos pacientes portadores de linfomas com apresentação cutânea
primária durante o período de acompanhamento ambulatorial
6.
Avaliar a sobrevida dos pacientes acompanhados ambulatoriamente,
correlacionado-as com os subtipos de linfomas cutâneos.
7.
Avaliar o comprometimento linfonodal e visceral na ocasião do óbito, quando
ocorrer, assim como a causa mortis
8
8.
Avaliar a expressão de proteínas regulatórias de proliferação, apoptose e “homing
para a pele” nos linfócitos neoplásicos nas fases iniciais e avançadas da doença
cutânea assim como na doença extracutânea.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
Trata-se de um estudo de coorte prospectivo não concorrente. As análises serão realizadas
em todos os pacientes protocolados e acompanhados no Ambulatório de Oncologia Cutânea
da Divisão de Clínica Dermatológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (HCFMUSP), no período compreendido entre os anos de 1989 e
2010 (os pacientes estão registrados em banco de dados próprio – planilha Excel), assim
como nos pacientes incluídos a partir do ano de 2011.
Dados clínico-demográficos
Através da análise do banco de dados complementada por informações constantes dos
prontuários médicos serão coletados dados demográficos (sexo, idade na ocasião do
diagnóstico e cor).
Informações referentes ao quadro clínico, como história, data da primeira consulta, tempo
de história pregressa da doença atual, data do diagnóstico serão consideradas. Constarão,
quando descritas, as co-morbidades e outras neoplasias antecedentes, concomitantes ou
subseqüentes ao diagnóstico de linfoma cutâneo.
As lesões da pele serão descritas quanto à sua morfologia, se lesões não infiltradas, placas
ou tumores. Quanto à localização das lesões, serão descritos o acometimento de um ou mais
seguimentos corpóreos (segmento cefálico, tronco e membros) e a área corpórea total
afetada, em porcentagem, segundo a “regra dos nove” conforme preconizada para avaliar a
extensão do acometimento cutâneo nas queimaduras.
Em relação ao acometimento sistêmico, será avaliada a disseminação extracutânea do
processo linfoproliferativo. Será considerado acometimento linfonodal quando a presença
de linfonodo aumentado (>1,5 cm no maior diâmetro) ou endurecido for detectada ao
exame físico (palpação) ou por métodos de imagem (ultra-som ou tomografia
computadorizada) e confirmada histológicamente através da biópsia do linfonodo. Quanto
ao acometimento visceral, será considerado positivo quando houver comprovação
9
histológica de envolvimento linfomatoso de lesão evidenciada por exame clínico ou método
de imagem (ultra-som e/ou tomografia computadorizada e/ou PET/CT). Exceção faz-se a
esplenomegalia, considerada envolvimento visceral mesmo sem exame histopatológico,
excluídas outras possíveis causas para tal alteração. Infiltração da medula óssea
(diagnosticada por exame histopatológico) será considerada envolvimento visceral. Quanto
ao sangue periférico, será considerado positivo quando houver hemograma e/ou
imunofenotipagem de linfócitos no sangue periférico que evidenciaram doença
linfoproliferativa circulante.
Quanto aos exames laboratoriais, serão avaliados, quando presentes, hemograma completo,
dosagens séricas de desidrogenase lática, gama glutamiltransferase e fosfatase alcalina,
sorologia para HTLV-1, pesquisa de células de Sezáry no sangue periférico, eletroforese de
proteínas séricas, testes de função hepática.
Exame histopatológico
O material anátomopatológico, referente aos pacientes estudados, será revisado: através das
lâminas com fragmentos de pele obtidos para diagnóstico e corados pela HematoxilinaEosina (HE). Serão considerados os critérios a seguir:
1.
Epidermotropismo: presença discreta, moderada ou intensa de células
mononucleares na epiderme ou ausência deste;
2.
Características das células epidermotrópicas: presença ou ausência de
linfócitos grandes, atípicos, com núcleos convolutos;
3.
Espongiose: ausente ou discreta, moderada e intensa;
4.
Paraqueratose: ausente, focal ou difusa;
5.
Infiltrado celular dérmico: localização (superficial e/ou profundo) e
densidade (discreto, moderado ou intenso);
6.
Densidade do infiltrado dérmico: classificado como denso na derme
superficial (mais intenso na derme superficial ou chamado top-heavy), denso na derme
profunda (mais intenso na derme profunda ou chamado botton-heavy) ou acometendo
igualmente derme superficial e derme profunda;
10
7.
Arranjo arquitetural: classificado quanto à distribuição do infiltrado celular
em difuso (células distribuídas difusamente na derme) ou nodular (células agrupadas na
derme formando nódulos);
8.
Esboço folicular: presente ou ausente (células agrupadas formando estruturas
semelhantes aos folículos linfóides secundários);
9.
Infiltração intersticial dérmica: presença ou ausência de células linfóides
dissecando fibras de colágeno;
10.
Reatividade endotelial: intumescimento da parede vascular, avaliada se
ausente ou presente (se presente, classificada em discreta, moderada ou intensa);
11.
Comprometimento de anexos e nervos: pelo infiltrado celular; quando
presente será descrito se circunda ou invade a estrutura anexial e nervos;
12.
Angiocentrismo: presença do infiltrado celular predominantemente ao redor
dos vasos sanguíneos; descrito se o infiltrado celular circunda ou destrói o vaso;
13.
Características da composição do infiltrado celular: classificado em
homogêneo (formado por células semelhantes em tamanho) ou heterogêneo (formado por
células diferentes em tamanho); será avaliada a presença de linfócitos pequenos e/ou
grandes, plasmócitos, eosinófilos e histiócitos.
14.
Outros achados: serão descritas alterações representativas presentes no
fragmento de pele analisado, que não enumeradas nos itens anteriores.
Imunofenotipagem
As lâminas de imuno-histoquímica serão avaliadas e descritas quanto à sua reatividade
(positiva ou negativa). As características das células marcadas pela reação, como tamanho
(pequenas, médias ou grandes células) e distribuição preferencial dessas células (difusa,
formando nódulos ou esboçando folículos) serão descritas.
Serão utilizadas as lâminas já confeccionadas anteriormente durante a investigação dos
pacientes no período que estes estavam sob acompanhamento ambulatorial e para os
imunomarcadores faltantes, novas lâminas serão produzidas, utilizando-se o material
11
armazenado incluído em parafina, em cortes de 5μm de espessura e colhidos em lâminas
histológicas tratadas com solução adesiva de aminopropyltriethoxysilane (Sigma Chemical
Co, St. Louis, MO, USA, cód A3648), na concentração de 3% em acetona PA.
Os cortes histológicos serão desparafinizados em xilol aquecido em estufa a 60°C por trinta
minutos, seguido de dois banhos em xilol à temperatura ambiente, durante 15 minutos cada.
Seguir-se-á com a hidratação dos tecidos através de cadeia descendente de etanol, sendo
dois banhos em etanol absoluto, dois banhos em etanol 95% (dois minutos cada banho)
finalizando em etanol 70%. Em seguida, as lâminas serão lavadas em água corrente por
cinco minutos e a seguir lavadas em água destilada, por cinco minutos. Completadas essas
etapas, prosseguir-se-á com as técnicas de recuperação e exposição antigênica do tecido, de
acordo com as determinações especificadas pelo fabricante de cada anticorpo marcador.
Os anticorpos anti CD3, CD20 e CD56 serão utilizados na definição da linhagem celular
neoplásica. Na complementação diagnóstica e classificação dos linfomas serão utilizados
anticorpos anti-CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD23, CD25, CD45RO, CD56,
CD30, CD15, βF-1. Para a avaliação dos mecanismos regulatórios de proliferação,
apoptose e “homing linfocitário cutâneo” serão estudadas a expressão do Ki67, do Foxp3 e
do CLA.
O anticorpo primário será aplicado sobre os tecidos, procedendo-se à incubação a 4°C por
uma noite. Os anticorpos serão diluídos em soro-albumina bovinos (BSA).
Após a incubação com os anticorpos primários, os espécimes serão lavados em tampão
TrisHCl (0,05M Tris; 0,3M NaCl), pH 7,4, por cinco minutos, por duas vezes. A seguir
serão incubados com o anticorpo secundário, utilizando-se o sistema EnVision ( Dako,
Denmark A/S Produktionsvej 42, DK-2600, Glostrup, Denmark): Rabbit/Mouse (Link) –
Secondary reagent por 30 minutos; AP Enzyme (Enhancer) – Tertiary Reagent por 30
minutos. Serão feitas duas lavagens em tampão Tris-HCl (0,05M Tris; 0,3M NaCl), pH 7,4,
por cinco minutos entre as duas incubações
A seguir o material será lavado em dois banhos com tampão Tris-HCl (0,05M Tris; 0,3M
NaCl), pH 7,4, por cinco minutos cada. Prosseguir-se-á com a revelação das reações com o
cromógeno Liquid Permanent Red (K0640, Dako, Glostrup, Denmark), adicionando-se o
bloqueador de fosfatase alcalina endógena Levamisole Endogenous Alkaline Phosphatase
12
Inhibitor (X3021, Dako, Carpinteria, CA, USA). A revelação das reações será controlada
por meio dos controles positivos para cada um dos marcadores.
Em seguida, o material será contracorado levemente, com hematoxilina de Carazzi, seguida
de lavagem em água corrente e banho de água destilada, por cinco minutos cada. As
lâminas serão secadas à temperatura ambiente e montadas com resina Permount (Fisher
Scientific, Fair Lawn, NJ, USA, cód SP15-100) sob lamínulas de vidro.
O material será analisado por três observadores.
Avaliação da clonalidade
O estudo da clonalidade para células B será realizado por meio da pesquisa do rearranjo dos
genes da cadeia pesada e da cadeia leve de imunoglobulina utilizando-se método de PCR
(reação em cadeia de polimerase) de acordo com protocolos descritos abaixo.
A. Extração do DNA através do método crude lysate
Cinco cortes de 5-10 m serão obtidos em micrótomo com lâmina virgem do material
proveniente de biópsia cutânea (fragmentos de pele fixado em formalina e emblocados em
parafina) dos doentes a serem estudados. O material será armazenado em microtubos (1.5
ml) de Eppendorf estéreis e livres de DNA. Os cortes serão submetidos ao protocolo para
desparafinação conforme descrito a seguir:
1. Centrifugação do microtubo por 10 segundos para coleta do material depositado no
fundo do tubo.
2. Adição de 1ml de xilol ao material contido no tubo, misturando-o através da
utilização do aparelho vortex por 10 segundos e incubação à temperatura ambiente por 5 a
10 minutos.
3. Centrifugação da amostra por cinco minutos para formação de pellet no fundo do
microtubo de Eppendorf. Remoção cuidadosa do xilol por aspiração.
4. Repetição dos itens 2 e 3.
5. Adição de 1ml de álcool etílico 100% misturando vigorosamente no vortex por 10
segundos.
13
6. Centrifugação da amostra por cinco minutos para formação de pellet no fundo do
microtubo. Remoção cuidadosa do álcool por aspiração.
7. Repetição dos itens 5 e 6.
8. Manutenção do microtubo aberto e aquecido a 37oC para secagem completa do
material.
9. Adição de 50-150µl de solução para lavagem contendo proteinase K (Sigma, UK),
solução tampão para PCR (Sigma, UK), e água ultrapura livre de DNA para digestão do
material, misturando a solução ao material para que este fique completamente imerso.
Subseqüente, incubação do material por 24 horas a 37 oC e desativação da enzima
proteinase K através do aquecimento a 95oC por 15 minutos.
Após a realização do protocolo de extração do DNA, o produto será utilizado
imediatamente para amplificação por PCR ou armazenado a temperatura de menos 20oC.
B. Ampliação do DNA por PCR.
Para cada reação com o volume total de 25 μl será utilizado 23 μl de solução mastermix
adicionando-se 2 μl de DNA. O mastermix será composto por solução tampão II (Applied
Biosystems, UK), 200 μM de cada dNTP (Promega, UK), 1.5 mM de MgCl2, 1 U da enzima
Amplitaq GOLD (Taq polimerase, Applied Biosystems, UK), água ultrapura (Sigm, UK) e 5
pmol de cada primer (MWG,USA) específicos para cada reação.
14
PROTOCOLO
PRIMER - SEQUENCIA (5’→3’)
VH1-FR2 CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAA
VH2-FR2 TGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGG
VH3-FR2 GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAA
VH4-FR2 TGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGG
IgH FR2 Biomed
VH5-FR2 GGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGG
VH6-FR2 TGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAG
VH7-FR2 TTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAA
JH
CCAGTGGCAGAGGAGTCCATTC
VH1-FR3 TGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGA
VH2-FR3 CAATGACCAACATGGACCCTGTGGA
VH3-FR3 TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCC
VH4-FR3 GAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACG
IgH FR3 Biomed
VH5-FR3 CAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGC
VH6-FR3 GTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTG
VH7-FR3 CAGCACGGCATATCTGCAGATCAG
IgH FR3 Nizet
JH
CCAGTGGCAGAGGAGTCCATTC
FR3
CCGAGGACACGGCCGTGTATTACTG
JH
AACTGCTGAGGAGACGGTGACC
-1
IgL kappa
TCR gamma A e B
-2
TTCAG(C/T)GGCAGTGG(A/G)TCTGG
TTCAGTGGCAGTGGG(G/T)CAGG
J 1
TTTGAT(A/T/C)TCCACCTTGGTCCC
Vγ (A)
GGAAGGCCCCACGCRTCTT
Vγ (A)
AGCATGGGTAAGACAAGCAA
Vγ (B)
CGGCACTGTCAGAAAGGAATC
Vγ (B)
CTTCCACTTCCACTTTGAAA
Jγ
CGAGTATCATTGAAGCGGACCATT
Jγ
GAGAAACCGTCACCTTGTTGTG
Detalhes dos primers utilizados nos protocolos para amplificação do DNA e pesquisa da
clonalidade. FONTE: van Dongen JJ et al. Leukemia 2003 Dec;17(12):2257-317 e Diss TC
e col Mol Pathol. 2002 Apr;55(2):98-101.
O programa utilizado pelo termociclador, aparelho de PCR (Mastercycler Gradient, CA),
será o BIOMED 2 (7 minutos a 95 oC, seguido por 40 ciclos de 45 segundos a 93 oC, 45
segundos a 60 oC, 1 minuto e 30 segundos a 72 oC, e finalizando com 5 minutos a 72 oC). O
programa IGTCR foi aplicado ao protocolo IgH FR3 clássico (Nizet) .
Para controle da qualidade do DNA em cada amostra serão utilizados iniciadores (primers)
para amplificação de housekeeping genes de 100, 200, 300 e 400 pares de base (pb). O
programa utilizado no aparelho de PCR foi o BIOMED2. Considerar-se-á DNA de boa
qualidade quando se demonstrar presença de seqüência de nucleotídeos com 100, 200 e
15
300pb ou 100, 200, 300 e 400pb; DNA de moderada qualidade aquele com seqüência com
100 e 200pb; e de baixa qualidade aquele com seqüência de somente 100pb.
Para a pesquisa do rearranjo dos genes da cadeia pesada de imunoglobulina serão utilizados
os seguintes protocolos: Protocolo IgH FR2 Biomed: os primers utilizados serão
BIOMED FR2/JH reverso, o ciclo do programa BIOMED2, e o tamanho do produto
pesquisado em pares de base serão de 250 – 295; Protocolo IgH FR3 Biomed: os primers
utilizados serão BIOMED FR3/JH reverso, o ciclo do programa BIOMED2, e o tamanho
do produto pesquisado em pares de base será de 100 -170; Protocolo IgH FR3 clássico
(Nizet): os primers utilizados serão FR3 clássico/JH clássico reverso, o ciclo do programa
IGTCR, e o tamanho do produto pesquisado em pares de base será de 80 -120.
Para a pesquisa do rearranjo dos genes da cadeia leve kappa de imunoglobulina será
utilizado o seguinte protocolo: Protocolo IgL Kappa A e B: os primers utilizados serão
IgKA e IgKB/JH, o ciclo do programa BIOMED2, e o tamanho do produto pesquisado em
pares de base será 130-150.
Para a pesquisa da clonalidade dos processos linfoproliferativos de células T (LCCT/NK)
será pesquisado o rearranjo dos genes do receptor de célula T (TCR) através do seguinte
protocolo: Pesquisa do rearranjo do receptor de células T (gamma A e B): os primers
utilizados serão Biomed2 TCR gamma-A e Biomed2 TCR gamma-B/JH, o programa
utilizado será BIOMED2, e o tamanho do produto pesquisado em pares de base será A
145-255; e B 80-220.
C. Corrida eletroforética e revelação da imagem
Após a ampliação do DNA pelo aparelho de PCR, serão realizadas corridas eletroforéticas e
revelação da imagem. Inicialmente adicionando-se 8µl do produto do PCR a 2µl de blue
loading buffer (4% sucrose, TBE bromofenol blue e xylene cyanol, total 10µl) e
depositando-se por pipeta em gel de poliacrilamida a 6 ou 8% (água ionizada, TBE,
acrilogel 5, persulfato de amônia e TEMED). Realizar-se-á corrida eletroforética a 200V
por 40 minutos. A seguir, as placas de poliacrilamida receberão banho de brometo de etídio
por 5 minutos e revelação do padrão de bandas em imagens adquiridas por iluminação em
luz ultravioleta. O registro da imagem será efetuado em arquivo digital, assim como
fotografia Polaroid, obtida pelo sistema BioRad Gel Doc 2000.
16
As imagens obtidas serão analisadas e cada caso foi classificado como: Monoclonal:
visualização de banda estreita e brilhante bem definida; Policlonal: visualização de banda
alargada e pouco definida semelhante a esfregaço; Não definido: ausência de banda ou
presença de imagem sem definição
As reações serão repetidas isoladamente ou duplicadas (duas reações idênticas utilizando-se
duas amostras independentes de DNA do mesmo caso) quando houve dúvida quanto à
imagem e/ou para confirmação dos resultados.
Classificação, evolução e prognóstico
A classificação do tipo de linfoma cutâneo apresentado pelo paciente será reinterpretada,
segundo os critérios atualmente propostos pela WHO, após a análise do exame
histopatológico e imuno-histoquímico.
Tratamentos empregados serão descritos, assim como as respostas obtidas (RC: remissão
total; RP: remissão parcial; DE: doença estável; PD: progressão da doença). Serão checados
dados referentes à data da última avaliação ou óbito. Quanto ao estado do paciente serão
considerados: paciente vivo sem doença (VSD), vivo com doença (VCD), morto sem
doença (MSD) e morto com doença (MCD). A sobrevida será estudada pelas curvas
propostas pelo método de Kaplan-Meir.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para as variáveis, demográficas serão descritas a média, a mediana e o desvio-padrão. A
condição de normalidade de distribuição das variáveis será verificada pelo teste de RyanJoiner. As curvas de sobrevida serão traçadas conforme proposição do método de KaplanMeir.
17
CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
Atualização da revisão da
04/2011-
07/2011 -
01/2012 -
07/2012 -
01/2013 -
07/2013 -
01/2014-
06/2011
12/2011
06/2011
12/2012
06/2013
12/2013
06/2014
X
X
X
X
X
X
literatura, implementação do
banco de dados
Revisão do banco de dados e
X
prontuários médicos.
Compatibilização dos bancos
de dados FM & FSEADE.
Revisão e complementação
X
histopatológica, imunohistoquímica e molecular
Interpretação dos dados,
X
X
X
X
análise estatística, execução
das curvas de sobrevida
Redação dos trabalhos
oriundos do projeto,
submissão para publicação
18
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