Célula 2

Aulas passadas
Células 1:
Procariotos e eucariotos
Células, tecidos e orgãos
Reinos filogenéticos
Compartimentalização em sistemas biológicos
- rompimento e fracionamento celular
QBQ2451- 2013
Célula 2: Marcadores químicos de organelas
- microscopia
Organelas: estrutura e função
Célula animal
Cada organela tem uma função e produz proteínas específicas: marcadores
Histonas/DNA
Monômero de tubulina
MAP4
(citoesqueleto)
Enzima Golgi-residente humana
N-acetilgalactosaminiltransferase-2
Calreticulina
KDEL
Hexoquinases
Succinato desidrogenase
(citoesqueleto)
Myristoylation/palmitoylation
Lck tyrosine kinase
Receptores proteicos
Diversas possibilidades de marcação de estruturas celulares para:
1. investigar as suas funções
2. localizá-las (identificação e isolamento)
3. acompanhar eventos celulares (influxo de Ca+2, reconhecimento, determinadas
ações biológicas, p.ex.)
Técnicas de visualização/localização de estruturas celulares:
microscopia
Tipo de
Microscopia
Resolução
Tipo de
Feixe
O que mede
Estado da
amostra
Ótica
0,2
Luz branca
(visível)
Luz absorvida
ou refletida
Amostras
molhadas ou
fixadas
microscopias de campo claro, campo escuro, fluorescência, contraste de fase
Geralmente para células intactas
Eletrônica
(transmissão
ou de
varredura)
0,05
Feixe de
elétrons
Elétrons
transmitidos,
secundários,
raios X
Amostras
secas e
fixadas
visualizar organelas com grande definição e até mesmo estruturas
intraorganelas. Também permite obter informações multidimensionais
Aumento de contraste: melhoria da imagem obtida!
(a) Microscópio óptico composto.(b) microscópios eletrônicos
Tipos: microscopias de campo claro, campo escuro, fluorescência, invertida, de
transmissão confocal (microscopia de varredura confocal) e de polarização.
Microscopia
de campo claro
Microscopia
de contraste de fase
Microscopia
de campo escuro
Largura média = 8-10 µm
Dihidrocloreto de (4',6-diamidino-2-fenilindole:
se liga a DNA
Corando/visualizando células
Marcadores químicos coloridos ou fluorescentes 
substituiram os radioisótopos
• Marcadores coloridos:
aumento de contraste na microscopia de campo claro
• Marcadores fluorescentes  fluorescência permite:
maior sensibilidade
variabilidade de cor
possibilidade de supressão
Reveladores de organelas: corantes ou fluorescentes
Compostos orgânicos que coram ou fluorescem estruturas nas células com
base em suas naturezas químicas.
Muitos: básicos: carregados +  interação com estruturas carregadas – (ác.
nucleicos, carboidratos ácidos, superfícies celulares)
Exemplos incluem:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Rastreador para mitocôndria
Corantes de ácidos nucleicos para núcleo
Lisorastreador e lisosensor para compartimentos ácidos
Corantes lipofílicos para membranas
Rastreador para retículo endoplasmático
Conjugados de ceramida para complexo de Golgi
Células vivas LBPAE incubadas
simultaneamente com:
MitoTracker® Deep Red FM -mitocôndrias
LysoTracker® Green DND-26 -lisossomas
Hoechst 33342 - núcleolo
Exemplos de corantes:
azul de metileno, cristal violeta,
safranina
Bactérias:
Gram + ou -?
Para Complexo de Golgi
N1154 NBD-ceramide
D3521 BODIPY® FL ceramide
D7540 BODIPY® TR ceramide
Células vivas ou fixadas com aldeído
Para Mitocôndria
Mais populares:
M7510 MitoTracker® Orange CMTMRos
M7512 Mitotracker® RED CMXROS 578/599 Add live and fix
M22425 MitoTracker® Red 580 580/644
M22426 MitoTracker® Deep Red 633 640/662
Células vivas e fixáveis:
M7514 MitoTracker® Green FM
Formas fluorogênicas reduzidas; menos retido; melhor para células vivas:
M7511 MitoTracker® Orange CM-H2TMRos
M7513 MitoTracker® Red CM-H2XRos
Mais eficientes:
Rhodamine 123 (R-302), TMRM (T668), TMRE (T-669). Though these
remain popular.
Formatted for High Content Screening/ HCS
H10295 HCS Mitochondrial Health Kit
Para Retículo endoplasmático
E34251 ER-Tracker™ Green
E34250 ER-Tracker™ Red
Boa fixação, mas sem permeabilização intensa
D273 DiOC6(3)
Usado para células vivas e fixadas com glutaraldeído
Limitado para certos tipos de célula
(corante dependente de concentração)
Muito fototóxico
ER-Tracker\u2122 Green
Para Núcleos celulares
DAPI =
Não são específicos para só um tipo de núcleo. Dependendo das
condições de “marcação”, o corante também pode aparecer no
citoplasma.
Somente alguns entram em células vivas devido à polarização da
membrana plasmática.
H1399 Hoechst 33342
S7578 SYTO® 16
S7575 SYTO® 13
D1306 DAPI
A1301 Acridine orange
Para Membrana Plasmática
CellMask™ Orange
CellMask™ Deep Red
• células 293 MSR marcadas por 1 min em
meio completo, lavadas e submetidas à
coleta de imagem
• ~100% de marcação do total de células
após 1-10 min de incubação
Aglutinina de germen de trigo
AlexaFluor 594
Produção de organelas fluorescentes
pq produzem proteinas recombinantes fluorescentes
+
1) Experimentos de co-localização:
localização de alvo intracelular de
um bioativo
2) Tráfico celular
3) Indução ou repressão da expressão
gênica
células vivas ou mortas
X
Anticorpos marcados com fluorescentes (radioativos)
Etapas
- Determinar sequência do antígeno/parte dela
(peptídeo) produzida na célula de interesse
(humana, p.ex.) 
- Produzir anticorpo 1º. contra o antígeno em
coelho ou cavalo (o anticorpo 1o. não é
marcado) 
-Produzir anticorpo 2º. (contra o 1º.) e marcá-lo
-Ligar o 1º. com antígeno e anticorpo 2º.
marcado com AF488 ao complexo (reconhece
o anticorpo 1º. de coelho ou cavalo; não liga o
antígeno humano)
-Ligação dele ao anticorpo 1º. possibilita
a visualização da organela associada ao
Anti-Calreticulina detectada com AF488
antígeno
secundário, Mitotracker Red e DAPI
Células mortas
(os últimos são referências na microscopia)
Possibilidades para estudar função ou localizar alvo
de interesse em organelas celulares
1) Introdução de “reveladores”  marcadores = corantes ou fluorescentes que
reagem com proteínas específicas ou outros alvos moleculares, p. ex.
ácidos nucleicos (mais indicados para localizar tais proteínas e alvos)
2) Detecção de proteínas específicas (antígenos) marcadores = anticorpos
(mais indicados para entender função)
3) Uso de microscopias adequadas
Células vivas ou fixadas!
Cuidados para uso de células vivas (manter a sua integridade):
1) Garantir que o tecido (células) foi incubado em condições apropriadas
2) Usar o mínimo de reagente revelador
3) Se possível, não expor as células à excitação de luz, principalmente na
presença de reagente revelador
4) Se não, usar a menor excitação de luz possível
5) Maximizar a sensibilidade de detecção antes de aumentar a excitação de luz.
Referências bibliográficas:
1) Invitrogen Corporation, Eugene OR.
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/CellAnalysis/Cellular-Imaging/Fluorescence-Microscopy-and-ImmunofluorescenceIF/Organelle-Stains-for-Fluorescence-Imaging-Selection-Guide.html
2) http://www.sanidadanimal.info/cursos/inmun/segun2.htm
3) Nelson D.L & Cox M.M. Lenhinger – Principles of Biochemistry, Fourth Edition ,
2005
4) B. Alberts e col., Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 5th. Edition,
Cap. 9, 2008
5) Microbiologia de Brock, M.T. Madigan, J.M. Martinko, P.V. Dunlap, D.P.Clark, 12ª.
edição, 2010.