Apresentação do PowerPoint

Lima, LM©
Glutationa reduzida (GSH) é um dos principais antioxidantes do meio intracelular e está
implicada na prevenção de inúmeras doenças promovidas pelo excesso de radicais livres ou
espécies reativas oxigênio (câncer; aterosclerose, artropatias, diabetes e envelhecimento).
GSH apresentar elevada capacidade de doar e- (forte redutor), o que é evidenciado por seu elevado potencial redox
negativo GSH/GSSH (E’0 = -0.33 V). Para seu efeito antioxidante é necessário sua oxidação à glutationa dissulfeto
(GSSG) via GO e GSH-Px
glutationa peroxidase
glutationa oxidase
glutationa redutase
HUBER, Paula C.; ALMEIDA, Wanda P. and FATIMA, Ângelo de. Glutationa e enzimas relacionadas: papel
biológico e importância em processos patológicos. Quím. Nova [online]. 2008, vol.31, n.5, pp. 1170-1179.
 GSH é abundante no interior das células (atingindo concentrações na ordem dos mM)
 O fígado é o órgão mais envolvido na destoxicação de xenobióticos e também é o local de maior
reserva de GSH (exportando GSH para outros órgãos).
 glutationa atinge a sua maior concentração intracelular nas células parenquimatosas (cerca de 10 mM)
do fígado saudável
 Os hepatócitos são as células mais especializadas na síntese de GSH a partir dos seus percursores, na
reciclagem de GSH a partir de GSSG
 A eliminação do conjugados de S-glutationa a partir da célula é um processo dependente de ATP
mediado por glicoproteínas membranares pertencentes à família MRP (mutidrug-resistance protein).
Logo, as proteínas da família MRP são essenciais no transporte de conjugados de S-glutationa para o
espaço extracelular
 A razão GSH/GSSG é normalmente utilizada para estimar o estado redox dos sistemas biológicos
 Em situações normais a GSSG representa apenas uma pequena fracção da glutationa total (<10%)
GSH synthesis. Synthesis of GSH occurs via a two-step ATP-requiring enzymatic
process. The first step is catalyzed by glutamate-cysteine ligase (GCL), which is
composed of catalytic and modifier subunits (GCLC and GCLM). This step conjugates
cysteine with glutamate, generating γ-glutamylcysteine. The second step is catalyzed
by GSH synthase, which adds glycine to γ-glutamylcysteine to form γglutamylcysteinylglycine or GSH. GSH exerts a negative feedback inhibition on GCL.
Shelly C. Lu, Glutathione synthesis Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects.
Volume 1830, Issue 5, May 2013, Pages 3143–3153
http://www.medicinacomplementar.com.br/temaSET04.asp
??
Lima, LM©
Estrógenos 
(androstenodiona) via adrenal e
(androstenodiona e
testosterona) via tecidos
periféricos  Pós-menopausa
Biossíntese de estrogênio por ação de Aromatases (Membro da família de enzimas
monooxigenase CYP450, a qual converte andrógeno C-19 em estrogênio C-18 através de três
hidroxilações sequenciais)
N
N
N
NC
Before therapy: Androgen (a hormone found in both men and women)
is produced by fat, muscle, and adrenal glands. Aromatase enzyme is
needed to convert androgen into estrogen, which results in tumor
growth.
With therapy: FEMARA (Novartis) binds to the aromatase enzyme
and blocks it from converting androgen to estrogen, thereby reducing
growth of the tumor.
http://www.us.femara.com/info/page/about-assistance
Lima, LM©
Femara®
CN
N
N
N
N
N
N
NC
CN
H 3C
CH3
CH3
CH3
NC
Anastrozole (Arimidex®)
Brodie, A. Trends in Endocrinology & Metabolism (2002) 13: 61-65
CN
Letrozole (Femara®)
O
CH3
O
CH3
CH3
CH3
H
H
H
O
O
CH2
Exemestane (Aromasin®)
Lima, LM©
H
H
H
OH
Formestane (Formastat®)
NH 2
HO
serotonina
se rotonina
Me diador Inflamatório
Aume nto da Pe rme abilidade
Vascular
N
H
Me rck
Scre e ning ca. 350 compostos
indólicos
1963
OH
MAO
OH
H3CO
OH
O
HO
O
HO
Fase I
CH 3
N
H
N
H
O
CH3
N
O
Hidrólise
O-demetilação
me tabólito ativo
Indometacina
(Indocid®, 1963)
Psicose, cefaléia
frontal, depressão,
Vertigem,
alucinações, etc.
ácido indolilacético
Cl
Similaridade estrutural
OH
OH
O
N CH3
O
N CH3
O
O
OH
F
O
“efeito orto”
CH3
H3C
Proscrito 1983
Reações
anafiláticas
Proteção
metabólica
Cl
H3C
Lima, LM©
sulindaco
S
O
H3C
Zomepirac (1980) Tolmetin (Tolecti n®, 1976)
F
F
CF3
N
H3C
R
Modificações
Moleculares
CF3
N
N
Modificações
Moleculares
N
N
N
inativo
S
O
R1
O
SC-58125
e sque le to básico
protótipo
IC50> 100 mM (COX-1)
IC50= 0,1 mM (COX-2)
O
S
O
CF3
R1
SO2NH2
SO2NH2
SO2NH2
SO2NH2
SO2NH2
SO2NH2
SO2NH2
SO2NH2
SO2NH2
SO2NH2
O
S
N
N
O
CF3
Cl
O
H3C
H2N
t1/2= 117h
O
S
H2N
N
H3C
Lima, LM©
CF3
N
R
CF3
Cl
F
CH3
OCH3
SCH3
NHCH2
CO2H
3-CH3
2-CH3
IC50 (COX-1)
<100 mM
17 mM
25 mM
15 mM
2,58 mM
1,19 mM
13,8 mM
>250 mM
33,9 mM
18,1 mM
IC50 (COX-2)
8,23 mM
0,01 mM
0,041 mM
0,04 mM
0,008 mM
0,009 mM
0,016 mM
11,2 mM
0,069 mM
0,11 mM
t1/2 = 8 h
celecoxib
COX-2 seletivo
IS=460
Penning, TD et al. (1997) J. Med. Chem. 40: 1347-1365
SG
N
HO
N
Cl
Cl
N
N
CYP1A2
Cl
Cl
O
alpidem 2.250
O
GTS/GSH
2.251
N
N
CH3
CH3
H3C
H3C
O
N
Cl
N
Cl
2.252
N
N
CH3
N
CO2H
CYP3A4
H3C
ADH
O
N
HO2C
O
zolpidem 2.37
2.253
N
CH3
N
H3C
H3C
homólogo inferior
Lima, LM©
CH3
O
O
N
N
N
N
F
N
N
N
N
N
N
buspirona
IC50 (5HT1A) = 0,025
t1/2 = 4,6 h
buspirona-análogo
O
ansiolítico (agonista de receptores de serotonina);
↑efeito 1ª passagem; ↓ biodisponibilidade oral
O
OH
O
IC50 (5HT1A) = 0,063
t1/2 = 52,3 h
O
O
OH
S
N
N
N
N
N
CH3
N
O
CH3
O
N
pA2 (NK2)= 9.5
t1/2 = < 10 min (HLM)
N-desalquilação
Cl
Cl
N
pA2 (NK2)= 9.3
t1/2 = ~30 min (HLM)
ansiolíticos (antagonista receptores
de taquicinina NK2)
Cl
O
Cl
pA2 (NK2)= 8.5
t1/2 = <10 (HLM)
LogD = 2.2
S
N
Cl
N
Cl
O
N
N
pA2 (NK2)= 8.5
t1/2 = <120 (HLM)
LogD = 1,7
Cl
Lima, LM©
O
Cl
↓ lipossolubilidade
NH2
Pró-Fármaco:
Substância desprovida de atividade farmacológica intrínseca, termo
cunhado por Albert em 1958.
Posteriormente modificado para:
1) substância com nenhuma ou pouca atividade farmacológica, sofrendo biotransformação a metabólitos ativos
terapêuticamente.
2) Derivado de um fármaco conhecido, de propriedades físico-químicas melhoradas, aumentando a
biodisponibilidade do fármaco original, e que mediante processo enzimático ou químico é transformado no
fármaco que lhe deu origem, antes de atingir o seu local de ação ou ainda no próprio local de ação (Korolkovas &
Burckhalter, 1988). O processo de obtenção do pró-fármaco dá-se o nome de latenciação de fármacos. Consiste
essencialmente em converter, mediante modificação química, um composto biologicamente ativo em forma de
transporte inativa que, após ataque enzimático ou químico, liberará o fármaco ativo.
PRO-FÁRMACO
Design Ad hoc x Post hoc
5% do total de
medicamentos disponíveis
são pro-fármacos
Lima, LM©
Lima, LM©
OH
H
Cl
OH
N
Cl
O
OH
O2N
H
OH
Cl
H
Cl OH
N
N
CYP450
Post- hoc
O
OHO
O2N
O2N -cloridrina
cloranfenicol
amargo
Cl
Cl
OPalmitato
Farmicetina®
OH
H(Pfizer)
insípido
O
N
Cl
lipases pancreáticas (duodeno)
O
OH
O2N
HO
HO
NH2
NH2
Post- hoc
CO2H
HO
HO
MAO/COMT
dopamina
L-Levodopa/carbidopa
(Doença de Parkinson)
descarboxilação via dopa-descarboxilase(SNC)
Lima, LM©
spontaneous
Lima, LM©
spontaneous
Inhibit CYP 2B6 (in human)
Lima, LM©
HN
HN
N
N
H2N
N
N
N
N
adenosina
fosfotransferase
HN
H2N
N
N
HO O
HO
5'
P
HO
5'
1'
4'
O
5'
4'
2'
2'
3'
abacavir [t1/2 = 3h]
Monophosphato de abacavir
abacavir [t1/2 = 3h]
N
N
HO
1'
3'
2'
3'
H2N
4'
N
N
Fase 1
(Alc. desidrogenase= ADH
hepática)
desaminase
citossólica
Fase 2
(UDPGA)
HN
HN
O
O
HO
O
P OH
O
OH H2N
P HO
O
O
O
5'
P
O
N
HN
N
H2N
HO
1'
4'
3'
2'
Triphosphato de Carbovir
Lima, LM©
H2N
HO
N
N
N
N
N
HN
quinases
celulares
H2N
N
O
O
N
N
O
5'
HO
N
OH
OH
HN
1'
4'
3'
HO2C
N
HO O
5'
P
O
N
N
2'
Monophosphato de Carbovir
[metabólito ativo t1/2 = 15~20h]
Yuen, GJ et al Clin Pharmacokinet. 2008;47(6):351-71.
N
N
H2N
H
N
O
N
reações
alérgicas
e/ou tóxicas
D= Asp
E= Glu
adenine
Lima, LM©
Adenine deaminase (ADE)
Kamat , S S et al., Biochemistry, 2011, 50 (11), pp 1917–1927
hypoxanthine
NH2
N
N
O
O
O
O
O
O
O
O
NH2
N
N
N
N
Esterase
CYP(?)
CH3
P
HO
5'
4' O
3'
CH3
P
5'
HO
1'
N
N
O
O
Tenofovir
2'
O
adenilato
quinase
Tenofovir disoproxilfumarato
NH2
HO
O
N
HO P
N
OH
O P
N
N
O
O
CH3
P
HO
O
Tenofovir difosfato
Lima, LM©
NH2
OH
nucleosideo
difosfoquinase
O
P
O
HO
OH
N
N
N
O
N
CH3
P
5'
O
NH2
H
H
N
Otimização de
Propriedades
farmacocinéticas
S
O
N
S
aumenta 87-94%
N
N
O
a biod. oral
da ampicilina
O
ampicilina
(uso oral)
OH
O
H
Biodisponibilidade oral: 36-44%
pivampicilina
N
O
O
O
S
O
N
O
O
talampicilina
HO
OH
H
N
N
O
Hidrólise
antiasmático via colinesterases
OH
O
O
N
Lima, LM©
H
N
O
Terbutalina
dose = 3 x ao dia
O
O
antviral
OH
O
1 dose diária
Bambuterol (Pró-f'ármaco)
ácido sufênico
sulfenamida
ATPase inativada
Lima, LM©
CO2H
F
CO2H
F
CH3
CH3
H3C
H3C
S
O
O
acumulado
na urina e plasma
metabolismo
Estereoespecífico
enantiômero S
S-sulindaco
R-sulindaco
CO2H
S
[H]
FMO
[O]
F
CO2H
CYP450
F
CH3
CH3
H3C
S
O
O
70% da dose
administrada
metabólito inativo
Lima, LM©
H3C
S
Hamman, M.A. et al. Biochem.
Pharmacol. 2000, 60, 7
metabólito ativo
(inibidor da COX, AINE)
In vitro:
Hepatócitos isolados
(humanos ou de espécies animais)
Microssoma hepático
(humanos ou de espécies animais)
CYP450 recombinantes
In vivo:
Ratos, coelhos, primatas
e humanos (plasma e urina)
Animais transgênicos
In sillico
QSAR, docking,
Programas de predição
metabólica
(e.g. Pallas, Metasite e Meteor)
Nassar, A-E.F. et al (2004) Drug Discov. Today 9: 317
Lima, LM©
LC-MC; LC-MS-MS; LC-NMR; NMR-MS
HPLC-MS; HPLC-NMR
In vitro techniques for investigating drug metabolism
enzymes
major site for the
biotransformation
of xenobiotics
Liver
Models of drug metabolism
Liver preparations
purified enzymes
tissue homogenates
differential centrifugation
Liver
Cellular system
enzymatic dissociation
using collagenase perfusion
Hepatocytes
CYP450
contain many enzymes and
cofactors not present in
the microsomal fraction
Lima, LM©
Advantages:
Easy preparation and
storage; contains
cofactors; contains
soluble and M bound
enzymes.
Disadvantages:
Crude preparation;
High protein conc.
short-term (4h)
Undergo dedifferentiation
subcellular fractions
9,000 x g
S9
S9 + 100,000 x g
microsomes
cytosolic and
membrane-bound
enzymes
membrane-bound
enzymes
CYP450
storage at -80 C
S9= submitochondrial fraction; hepatocytes = parenchymal cells of the liver
Predição Metabólica in Silico
•
•
•
•
•
QSAR
“Docking”
Reatividade Química
SoM
Banco de dados de
transfor. metabólicas
 Qual(is) é (são) a posição mais provável (is) do metabolismo?
 Qual a transformação metabólica mais provável?
 Qual isoenzima participa do metabolismo?
Lima, LM©
In silico
H
H
H
H
O
H
O
H
O
H
O
H
H
H
H
CYP1A1
H
CYP2A6
Modelagem por homologia
(estrutura cristalográfica do CYP2C5)]

CYP1A1 e CYP2A6
H
H
H
H
O
H
O
O
O
H
H
H
H
H
H
CYP1A2
Lima, LM©
H
CYP2A6
In silico
Ahlstrom, MM et al. J. Med. Chem. 2007, 50, 4444-4452
Lima, LM©
Predição Metabólica in Silico
MetaSite
Cruciani, G. et al., J. Med. Chem., 48, 6970-6979, 2005
Lima, LM©
Predição Metabólica in Silico
MetaSite
Quais sítios?
Que isoformas?
Lima, LM©
Cruciani, G. et al., J. Med. Chem., 48, 6970-6979, 2005
Predição Metabólica in Silico
MetaSite3 calculations in aprindine substrate. The reactions predicted for aprindine were: N-dealkylation
(position a), N-oxidation (b), aromatic oxidation (c), benzylic oxidation (d), aromatic oxidation (e).
Lima, LM©
Cruciani, G. et al. Drug Discovery Today: Technologies 2013, 10, e-155
Predição Metabólica in Silico
Long, A. Drug Discovery Today:
Technologies 2013, 10, e-147
Partial SMARTCyp analysis of tramadol, acenocoumarol and MK445526 using the standard (CYP3A4), 2D6 and 2C9 models.
Green bars/circles represent sites of metabolism corresponding to confirmed experimental metabolites and red
bars/circles sites of metabolism corresponding to unconfirmed experimental metabolites. The y-axis in each bar-chart
represents the relative SMARTCyp scores for each isoform model applied to each compound. Scores are relative and specific
to the model/compound combination and cannot be inter-compared.
Lima, LM©
In vitro
Preparação do fígado
Fígado
1. Centrifugação a 900 g, 30 min, 4 °C
2. Centrifugação a 10.000 g, 1 h, 4 °C
3. (remoção restos celulares e fração nuclear)
Fração S9*
Ultracentrifugação 100.000 g, 1 h, 4 °C
(sedimentar a fração microssomal)
Enzimas de Fase I:
CYP450, FMO e
Carboxilesterase
Glicuroniltransferase
Fração microssomal
Quantificação
de proteínas
Fração citosólica
Quantificação
de proteínas
Enzimas de
Fase I e II
Conservação a -80° C
CABRERA, M. et. al. Toxicology Letters 2009, 190, 140-149.
Lima, LM©
* Fração S9: fração submitocondrial
In vitro
Fração microssomal + amostra
(Concentração final = 100 μM)
Cofatores:
• MgCl2
• NADPH*
• Glicose 6-fosfato
• Glicose 6-fosfato-deidrogenase
Incubação a 37 °C por
0, 60 e 120 minutos
Análise do sobrenadante
por CLAE**
Controles:
• Fração microssomal na presença de
cofatores (com e sem amostra);
• Fração microssomal na ausência de
cofatores (com e sem amostra);
• Sem fração microssomal na presença de
cofatores (com e sem amostra).
Oliveira,
Lima,
LM© R. O. (2010) Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ.
Adição de 500 μL de
metanol gelado e 500 µL
de acetonitrila gelada
Centrifugação
(13000 rpm, 15 min, t.a.)
Com cofatores
 Citocromo P450 (CYP450)
 Flavina-mooxigenase (FMO)
Sem cofatores
 Carboxilesterase (CES)
Cromatogramas obtidos por CLAE-PDA para LASSBio-998 em fração microssomal hepática de ratos utilizando bifenil-4-carboxilato
de metila (20 µM) como padrão interno: LASSBio-998 no tempo 0 (A) e incubado por 120 minutos (B) com fração microssomal na
presença de cofatores; LASSBio-998 no tempo 0 (C) e incubado por 120 minutos (D) com fração microssomal na ausência de
cofatores. A concentração de incubação da amostra com a fração microssomal foi de 100 µM, diluídas para 20 µM para leitura por
CLAE-PDA [Shimadzu – LC20AD; coluna Kromasil 100-5C18 (4,6 mm x 250 mm); detector SPD-M20A (Diode Array) em UV 254
nm; fluxo: 1 mL/minuto; fase móvel: 70% de acetonitrila, 30% de água e 0,1% de TFA].
Lima, LM©
Oliveira, R. O. (2010) Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ.
In vitro
LASSBio-998 (mM)
25
20
15
10
5
0
25
t1/2= 60,6 minutos
20
Produtos
t1/2 sem
cofatores
(minutos)
t1/2 com
cofatores
(minutos)
66
75,3
15
Sem Cofatores
Sem Cofatores
Com Cofatotes
LASSBio-998
Com Cofatotes
10
LASSBio-1494
407,6
533,1
LASSBio-1495
1155
138,6
LASSBio-1496
630
74,5
LASSBio-1497
59,7
32,7
5
0
0
30
60
0
90
30
120
60
90
Tempo (min)
Tempo (min)
Lima, LM©
120
In vitro
O
O
O
O
O
O
O
N
NH2
hidrolases
LASSBio-998 (mM)
C13H12N 2O 4
PM = 260.24
30
60
Tempo
O
CH3
O
N
CH3
NH
LASSBio-998
O
Sem Cofatores
Com Cofatotes
20
N
NH
hidrolases
O
HO
O
5
HO
120
NH
C18H19N3O5
PM = 357.36
Sem Cofatores
Com Cofatotes
10
NH
O
CYP450
O-desalquilação
15
90
OH
hidrolases O
C20H23N3O5
PM = 385.41
25
O
N
NH
CH3
O
O
OH
0
(min)
0
30
60
90
120
Tempo (min)
C19H23N3O5
PM = 373.40
 Carboxilesterase (CES)
Oliveira, R. O. (2010) Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ.
Lima, LM©
O
NH
O
N
C 11H8N 2O 4
PM =232.19
NH2
O
O
O
OH
N
NH
O
C18H19N3O5
PM = 357.36
Lima, LM©
NH
Lima, LM©
Hyland, R et al Br J Clin Pharmacol (2001) 51, 239
CYP3A4
CYP2D6
CYP2C9
CYP1A2
CYP3A4
CYP2D6
CYP2C9
CYP1A2
In vitro
In vitro
O metabolismo do sildenafil na presença de enzimas CYP recombinantes
6x
Hyland, R et al Br J Clin Pharmacol (2001) 51, 239
Lima, LM©
CH3
CH3
MetaPrint2D
O
OH
SMARTCyp
CH3
CH3
O
OH
N
H
N
H
OH
propranolol
MetaSite
ACD
N
H
O
CH3
metoprolol
H3C
CH3
O
CH3
O
OH
N
H
CH3
esmolol
betaxolol
O
H3C
O
O
Fármaco
Biodisponibilidade oral (%)
Tempo de meia vida (h)
Propranolol
ca. 25
3-5
Metoprolol
ca. 40
3-4
Betaxolol
ca. 80
14-22
Esmolol
---
0.13