TCC04 - Faculdade de Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
ISADORA PONTES CAVALCANTE
INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DE 24PB NO ÉXON 10 DO GENE DA
QUITOTRIOSIDASE EM PACIENTES COM DOENÇA DE GAUCHER E
DOENÇA DE PARKINSON.
BELÉM
2011
ISADORA PONTES CAVALCANTE
INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DE 24PB NO ÉXON 10 DO GENE DA
QUITOTRIOSIDASE EM PACIENTES COM DOENÇA DE GAUCHER E
DOENÇA DE PARKINSON
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado
à
Biomedicina
da
Faculdade
de
Universidade
Federal do Pará, como requisito
parcial para a obtenção do grau
de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva
BELÉM
2011
ISADORA PONTES CAVALCANTE
INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DE 24PB NO ÉXON 10 DO GENE DA
QUITOTRIOSIDASE EM PACIENTES COM DOENÇA DE GAUCHER E
DOENÇA DE PARKINSON
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado
à
Biomedicina
da
Faculdade
de
Universidade
Federal do Pará, como requisito
parcial para a obtenção do grau
de Bacharel em Biomedicina.
Belém (PA), 15 de dezembro de 2011
Banca Examinadora:
_________________________________
Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva
(ICB – UFPA)
_________________________________
Prof. Msc. Erik Artur Cortinhas Alves
(CCS – UEPA)
_________________________________
Prof. Dra. Greice de Lemos Cardoso
(ICB – UFPA)
i
Agradecimentos
Aos meus pais e irmãos, pelo amor, apoio e dedicação de todos os anos
À minha avó, Lourdes, por ter sido minha grande professora e por ter
contribuído imensamente para todas as minhas conquistas
Ao Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva, meu orientador, pela paciência e
compreensão
Às amigas Ellen Queiroz, Natielle Rabelo e, em especial, à Lays Naiff, pelo
companheirismo nos anos de faculdade e pela ajuda para a realização deste
trabalho
ii
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 01. Estrutura da quitina..................................................1
Figura 02. Hibridização in situ evidenciando o gene QUIT 1....3
Figura 03. Gene QUIT1.............................................................4
Figura 04. Expressão do mRNA diante de LPS........................6
Figura 05. Expressão do mRNA diante de TNF-α.....................7
Figura 06. Expressão do mRNA diante de INF-γ......................7
Figura 07. Atividade de QT diante de LPS, TNF-α e INF-γ......8
Figura 08. Caracterização das DDLs........................................10
Figura 09. Genes relacionados à DP........................................14
Figura 10. Genótipos encontrados............................................23
Tabela 01. Frequência genotípica do gene QUIT1 em diferentes etnias..........5
Tabela 02. Condições usadas nas reações de PCR.........................................21
Tabela 03. Dosagem da QT, genótipo e dados clínicos de pacientes com DP...24
Tabela 04. Dosagem da QT e genótipo de pacientes com DG.........................25
Tabela 05. Frequências genotípica e alélica da duplicação nos pacientes.......25
iii
Abreviaturas
QT – quitotriosidase
NPMs – neutrófilos polimornucleares
QUIT1 – gene da quitotriosidase
IFN-γ – interferon-gama
TNF-α – fator de necrose de tumor
LPS – lipossacarídeos bacterianos
DA – Doença de Alzheimer
DCI – Doença cerebrovascular isquêmica
EIM – Erros inatos de metabolismo
DDL – Doenças de depósito lisossômico
DG – Doença de Gaucher
GBA – gene da glicocerebrosidase
SNC – Sistema nervoso central
TRE – Terapia de reposição enzimática
DP – Doença de Parkinson
SN – substância negra
CL – Corpúsculos de Lewy
PP – parkinsonismo primário
MPTP – 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina
SUP – sistema ubiquitina-protesossoma
iv
Resumo
A quitina é um dos biopolímeros mais abundantes da natureza e tem papel estrutural
em artrópodes, incluindo crustáceos e insetos, assim como em moluscos,
nematódeos, fungos e vermes. A função das quitinases é hidrolisar quitina, um
polímero composto por unidades de N-acetilglicosamida, o segundo maior
componente estrutural encontrado na natureza. A quitotriosidase (QT) é uma enzima
quitinolítica em humanos, que é secretada em grandes quantidades por macrófagos
ativados. A doença de Gaucher (DG) é uma esfingolipidose causada por uma
deficiência de herança autossômica recessiva da enzima lisossomal beta-glicosidase
ácida (glicocerebrosidase), que é responsável pela hidrólise de glicocerebrosídio. A
ausência ou redução na atividade da enzima leva ao acúmulo de glicosilceramida em
vários tecidos, principalmente nos lisossomos dos macrófagos. Como pacientes com
DG podem alcançar altos níveis de expressão da QT, esta tem sido utilizada como
biomarcador da doença. A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença
neurodegenerativa mais comum, com uma prevalência de 3% em pessoas acima de
60 anos de idade. O diagnóstico clássico da DP é baseado nas seguintes
características: bradicinesia, rigidez e tremor de repouso, boa resposta à levodopa, e
presença de degeneração de neurônios dopaminérgicos na parte compacta da
substancia nigra (SN), acompanhada pela presença de Corpúsculos de Lewy. O gene
CHIT1 possui 11 éxons, sendo que o éxon 10 apresenta uma duplicação de 24 pb,
sendo este o polimorfismo mais freqüente deste gene. Os objetivos deste estudo
foram identificar as freqüências alélica e genotípica da duplicação de 24 pb em
pacientes com DG e DP, além de mensurar a atividade da enzima nos mesmos.
Foram utilizados 19 pacientes, sendo 6 com DG e 13 com DP. A partir das amostras
de sangue dos pacientes foi obtido DNA nuclear para amplificação, por meio de PCR,
do éxon 10 e a partir do plasma foi dosada a atividade de QT. Os genótipos foram
visualizados em gel de agarose a 2,5%. Dos 6 pacientes com DG, apenas 1
apresentou a duplicação (16,7%), 2 heterozigotos (33,3%) e 3 homozigotos normais
(50%). Dos 13 pacientes com DP, foram observados 2 homozigotos mutantes
(15,38%), 4 heterozigotos (30,76%) e 7 homozigotos normais (53,86%). As
freqüências alélicas e genotípicas nas duas doenças foram similares, porém nível
plasmático na QT foi maior nos pacientes com DG do que nos com DP. Todos
homozigotos mutantes apresentaram deficiência na atividade da enzima em ambas as
doenças. As freqüências não diferiram das achados em estudos anteriores, e a
atividade da QT pode ser maior em DG por esta desencadear uma resposta imune,
diferentemente da DP.
Palavras-chave: quitina, quitotriosidase, Doença de Gaucher, Doença de Parkinson,
QUIT1, éxon 10
v
Abstract
Chitin is one of the most abundant biopolymers in nature. It has a structural role in
arthropods, including crustaceans and insects as well as mollusks, nematodes, fungi
and worms. The role of chitinases is hydrolyze chitin, a polymer composed of units of
N-acetilglicosamida, the second largest structural component found in nature. The
chitotriosidase (CT) is a chitinolytic enzyme in humans, which is secreted in large
amounts by activated macrophages. Gaucher disease (GD) is a Sphingolipidoses
caused by an autosomal recessive deficiency of the lysosomal enzyme acid betaglucosidase (glucocerebrosidase), which is responsible for the hydrolysis of
gluclocerebrosyde. The absence or reduction in enzyme activity leads to accumulation
of glucosylceramide in various tissues, mainly in the lysosomes of macrophages. As
patients with GD can achieve high levels of expression of the QT, it has been used as
a biomarker of the disease. Parkinson's disease (PD) is the second most common
neurodegenerative disease with a prevalence of 3% in people over 60 years old. The
classic diagnosis of PD is based on the following features: bradykinesia, rigidity and
rest tremor, good response to levodopa, and the presence of degeneration of
dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra (SN), accompanied
by the presence of Lewy bodies. The CHIT1 gene has 11 exons and the exon 10 has a
duplication of 24 pb, which is the most common polymorphism of this gene. The
objectives of this study were to identify the allelic and genotypic frequencies of the 24
bp duplication in patients with DG and DP and to measure the enzyme activity in them.
It was used 19 patients, 6 with GD and 13 with PD. From the patients' blood samples
were obtained nuclear DNA for amplification by PCR of the exon 10 and the plasma
was measured from the activity of CT. The genotypes were visualized on agarose gel
2.5%. Of the 6 patients with GD, only 1 had duplication (16.7%), 2 heterozygotes
(33.3%) and 3 normal homozygotes (50%). Of the 13 patients with PD, 2 homozygous
mutants were observed (15.38%), 4 heterozygotes (30.76%) and 7 normal
homozygotes (53.86%). The allelic and genotypic frequencies in the two diseases were
similar, but the CT plasma level was higher in patients with GD than in PD. All
homozygous mutants showed deficiency in the enzyme activity in both diseases. The
frequencies did not differ from findings in previous studies, and activity of CT may be
greater in DG trigger an immune response, unlike PD.
Keywords: chitin, chitotriosidase, Gaucher’s Disease, Parkinson’s Disease, CHIT1,
exon 10
Sumário
Agradecimentos
i
Lista de figuras e tabelas
ii
Lista de abreviaturas
iii
Resumo
iv
Abstract
v
1. Introdução..............................................................................1
1.1 Histórico.............................................................................1
1.2 Aspectos bioquímicos.......................................................2
1.3 Aspectos moleculares........................................................2
1.4 Polimorfismo no gene QUIT1.............................................4
1.5 Relação da quitotriosidase com a resposta imune...........5
1.6 Doenças associadas à quitotriosidase...............................8
1.7 Doenças de Depósito Lisossômico....................................10
1.7.1 Doença de Gaucher.....................................................11
1.8 Doença de Parkinson.......................................................12
2. Justificativa...........................................................................16
3. Objetivos...............................................................................17
4. Material e métodos...............................................................18
5. Resultados............................................................................23
6. Discussão.............................................................................27
7. Conclusões...........................................................................30
8. Referências bibliográficas..................................................31
ANEXO.......................................................................................38
1. INTRODUÇÃO
1.1 HISTÓRICO
A quitina (figura 1) é um dos biopolímeros mais abundantes na natureza.
Esta molécula tem papel estrutural em artrópodes, incluindo crustáceos e insetos,
assim como em moluscos, nematódeos e vermes. Também pode ser encontrada
em fungos, podendo fazer parte de 1% a 40% da parede celular, dependendo do
organismo (Tjoelker et al, 2000). A função das quitinases é hidrolisar quitina, um
polímero composto por unidades de N-acetilglicosamida, o segundo maior
componente estrutural encontrado na natureza (Lee et al, 2007).
Figura 1 – Estrutura da quitina Fonte: Andersen et al, 2003.
Apesar da presença antes desconhecida em mamíferos (Boot
et al,
1995), foi descoberta uma enzima quitinolítica em humanos, designada como
quitotriosidase (QT), que é secretada em grandes quantidades por macrófagos
ativados (Hollak et al, 1994).
Segundo Eijk et al. (2005), tanto neutrófilos polimornucleares (NPMs)
quanto macrófagos são fontes de quitotriosidase. A enzima fica armazenada em
grânulos específicos de NPMs humanos e é secretada a partir de estímulos de
um fator específico, o qual também induz a expressão da quitotriosidase em
macrófagos, secretando-os e em parte acumulando-os em seus lisossomos.
As quitinases são classificadas como endoquitinases e exoquitinases. A
atividade das endoquitinases é definida pela clivagem de ligações β 1,4
glicosídica em pontos aleatórios, produzindo oligossacarídeos de diferentes
tamanhos. Já a atividade das exoquitinases é definida pela clivagem de ligações
específicas β 1,4 glicosídicas dos oligossacarídeos, originando dímeros de Nacetilglicosamida a partir da extremidade não redutora do polímero (Andersen et
al, 2003).
Segundo Boot et al. (1998), a purificação e clonagem do cDNA do gene
quitotriosidase
revelaram
que
a
enzima
pertence
à
família
18
das
glicosilhidrolases. Ainda que algumas endoquitinases de plantas e lisozimas
pertençam a outra família de glicosilhidrolase, há algumas similaridades entre a
QT humana e lisozimas, como relativa estabilidade diante do calor e resistência à
degradação proteolítica (Holm e Sander, 1994). As sequências de aminoácidos NTerminal e internas da QT purificada sugerem uma homologia entre esta e as
proteínas da família das quitinases, incluindo membros enzimaticamente inativos
(Renkema et al, 1995).
1.2 ASPECTOS BIOQUÍMICOS
A quitotriosidase é uma proteína composta por 466 aminoácidos e que
apresenta isoformas heterogêneas no que diz respeito à massa molecular e ponto
isoelétrico (pI). São encontradas duas isoformas principais: uma proteína de 50Kda (pI 7,2) e outra de 39-kDa (pI 8,0) (Boot et al, 1995). A transformação
proteolítica da forma de 50-kDa para a de 39kDa ocorre nos lisossomos dos
macrófagos e apenas a enzima de 50-kDa está presente na circulação sanguínea
(Renkema et al, 1997).
A QT é formada por uma sequência de peptídeo sinal, um domínio
catalítico e um domínio de ligação com a quitina. A enzima consiste em uma
estrutura N-terminal em conformação de barril, contendo uma fenda catalítica e
um domínio C-terminal de ligação com a quitina, sendo conectado por uma região
curta em dobradiça (Aguilera et al., 2003). Ainda de acordo com Renkema et al
(1997), o domínio C-terminal que está presente na isoforma de 50-kDa, porém
ausente na de 39-kDa, é o mediador da ligação à quitina.
1.3 ASPECTOS MOLECULARES
O gene da quitotriosidase (QUIT1) foi localizado no cromossomo 1q3132 utilizando a técnica de Hibridização in situ fluorescente (Boot et al, 1995).
Figura 2 – Hibridização in situ fluorescente de cromossomos humanos metafásicos, evidenciando
o gene QUIT1. Fonte: Boot et al, 1995.
O gene QUIT1 é composto por 12 éxons e abrange 20kb de DNA
genômico. A extensão dos éxons vai de 30 a 461 pares de bases (pb). O éxon 11,
contendo 71 pb, normalmente não participa do processo de splicing, pois introduz
um códon de parada prematura. Nestas situações é gerado um mRNA que
codifica uma proteína de 50-kDa. No entanto, o éxon 11 pode sofrer splicing
alternativo, gerando um mRNA com um códon de parada prematura, que produz
uma quitotriosidase de 40-kDa quase idêntica à isoforma de 39-kDa, gerada
proteoliticamente (figura 3) (Boot et al, 1995).
Figura 3 – Gene QUIT1 composto por 12 éxons e as duas formas de QT. Fonte: Malaguarnera, 2006.
1.4 POLIMORFISMOS NO GENE QUIT1
Em um estudo conduzido por Renkema et al. (1998), macrófagos de
indivíduos com deficiência não apresentavam produção da QT. Com o
seqüenciamento, foi constatado que o cDNA destes indivíduos e o de controles
eram idênticos, com exceção de uma deleção de 87 nucleotídeos no éxon 10 do
RNA mutante. Este mRNA anormal codifica uma proteína que apresenta perda da
sequência de aminoácidos entre 344 e 372, uma região altamente conservada da
família das quitinases.
O polimorfismo mais comum no gene QUIT1 consiste na duplicação de
24 pb no éxon 10, originando um sítio de splicing, causando a deleção de 87
nucleotídeos (Boot et al, 1998).
Como ilustrado na tabela1, o alelo mutante da QT foi encontrado em
uma
de
freqüência
de
33-35%
em
judeus
Ashkenazi
e
holandeses,
respectivamente, enquanto que em ambas as populações 6% eram homozigotos
para este alelo (Boot, 1998). Em um estudo feito na população portuguesa foram
encontrados 6% de homozigotos pra este polimorfismo e 40% de heterozigotos
(Rodrigues, 2004). Na área do Mediterrâneo foi encontrada uma freqüência para
heterozigotos de 44-54% na Sicília e 32,7% na Sardenia, enquanto que 5,45% e
3,73%, respectivamente, são homozigotos mutantes. Na África, no entanto, não
foram encontrados indivíduos homozigotos para a deficiência e uma baixa
incidência de heterozigotos em Benin e Burkina, 0% e 2%, respectivamente
(Malaguarnera, 2003).
Tabela 1 - Frequência genotípica da duplicação de 24 pb no exon 10 do gene
da QT em diferentes etnias. Fonte: Malaguarenra, 2006.
1.5 RELAÇÃO DA QUITOTRIOSIDASE COM A RESPOSTA IMUNE
Os
macrófagos
são
geralmente
considerados
como
elementos
importantes da imunidade inata na maioria, senão em todos, os organismos e
estão estrategicamente posicionados para proteger o microambiente em que se
encontram (Malaguarnera, 2005). A QT é produzida principalmente por
macrófagos ativados (Hollak et al, 1994), logo esta ativação leva a um aumento
da atividade desta enzima no plasma (Malaguarnera, 2006).
A QT pode ser encontrada com atividade aumentada em indivíduos com
sarcoidose (Hollak et al, 1994). Já foi observado aumento da atividade da QT em
indivíduos portadores de malária (Barone et al, 2003) e em outras desordens
hematológicas, como talassemia (Barone et al,1999).
Em resposta a vários outros estímulos, como interferon-gama (IFN-γ),
fator de necrose de tumor (TNF-α) e lipossacarídeos bacterianos (LPS), os
macrófagos produzem metabólitos reativos oxigenados usados para destruir
microorganismos (Babior, 1978). Com bases nesses dados, foi realizado um
estudo para analisar o nível da expressão de mRNA em macrófagos sob o
estímulo de LPS (figura 4), TNF-α (figura 5) e IFN-γ (figura 6) pela técnica de Real
Time PCR e a atividade da QT diante do estímulo de cada um (Figura 7)
(Malaguarnera, 2005).
Figura 4- Detecção da expressão de mRNA da QT nos tempos de 2h, 4h, 8h e 24h por estímulo de
LPS. Fonte: Malaguarnera, 2006.
Figura 5 - Detecção da expressão de mRNA da QT nos tempos de 2h, 4h, 8h e 24h por estímulo de
TNF-α. Fonte: Malaguarnera, 2006.
Figura 6 - Detecção da expressão de mRNA da QT nos tempos de 2h, 4h, 8h e 24h por estímulo de
INF-γ. Fonte: Malaguarnera, 2006.
Figura 7 – Atividade da QT nos tempos de 2h, 4h, 8h e 24h. Fonte: Malaguarnera, 2006.
Os resultados de Malaguarnera et al (2005) sugerem que a QT está
envolvida na resposta celular estimulada por citocinas regulatórias e por
lipossacarídeos bacterianos, como evidenciado nas figuras acima.
A QT, portanto, tem sido considerada como um importante componente
da resposta imune inata (Piras et al, 2006).
1.6 DOENÇAS ASSOCIADAS À QUITOTRIOSIDASE
Van Eijk et al. (2005) demonstraram que na presença da enzima QT o
crescimento de fungos, como o Cryptoccoccus neoformans e Candida albicans,
foi inibido, sugerindo que a QT é um importante componente da imunidade inata.
Outros estudos mostraram que a expressão da QT aumenta significativamente
nas células de Kupffer na esteatoepatite não-alcóolica,
se comparado com
esteatose simples. Este aumento da expressão da QT foi relacionado ao O₂¯ e a
produção de peróxidos lipídicos (Malaguarnera, 2006).
Há achados de relação da enzima QT também com o hipotireodismo
subclínico, uma vez que nos pacientes ocorreu um aumento significativo dos
níveis de QT quando houve restauração do eutireoidismo a partir da reposição do
hormônio. A restauração pode ter relação com o TNF-alfa ou com os receptores
alfa de IL-2, que são aumentados por conta do hormônio tireoidiano administrado
(Erdal, 2008). Além disso, segundo Sonmez et al. (2010), a atividade de QT
também esteve significativamente aumentada em pacientes portadores de
diabetes mellitus tipo 2 recém diagnosticada.
Boot et al. (1999) demonstraram que a atividade da QT foi elevada em
até 55 vezes nos extratos de tecidos de ateroesclerose, mostrando uma ligação
entre a expressão da QT com macrófagos carregados de lipídios na parede dos
vasos ateroescleróticos humanos. Uma característica comum dessas células em
diferentes condições é o acúmulo de material lipídico no lisossomo. A atividade
sérica de QT foi significativamente maior em indivíduos que sofrem de doença
aterosclerótica e está relacionada com a gravidade da lesão aterosclerótica,
sugerindo um possível papel como um marcador de ateroesclerose (Boot, 1999 e
Artieda, 2003 e Canudas, 2001). No entanto, o mecanismo de como a atividade
de QT afeta a progressão da aterosclerose, e se o nível sanguíneo dessa enzima
é alterado em pessoas com maior risco de aterosclerose, são eventos ainda
desconhecidos.
A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa
resultando em uma grande perda de função cognitiva, bem como na deposição de
proteína Beta Amilóide, característica patológica marcante desta enfermidade.
Uma característica do cérebro de pacientes é a liberação de citoquinas e
quemoquinas pró-inflamatórias através de microglias e astroglias ativadas, além
do estresse oxidativo produzido pela formação demasiada de espécies reativas
de oxigênio (ROS) (Chong et al, 2005).
Da mesma maneira que na DA, os eventos fisiopatológicos envolvidos na
doença cerebrovascular isquêmica (DCI) e o comprometimento cognitivo parecem
advir de mecanismos secundários substancialmente mediados por inflamação.
Assim como na DA, a DCI exibe uma superprodução de ROS, resultando em
aumento nos níveis de peroxidação lipídica e, consequentemente, sugerindo a
hipótese da participação da enzima quitotriosidase no processo inflamatório
dessas patologias (Malaguarnera, 2006).
1.7 DOENÇAS DE DEPÓSITO LISOSSÔMICO
O Erro Inato do Metabolismo (EIM) é um termo utilizado para referir-se a
doenças geneticamente determinadas, decorrente da deficiência em alguma via
metabólica que está envolvida na síntese, transporte ou degradação de uma
substância. As manifestações clínicas podem ser decorrentes do acúmulo do
substrato de uma reação, da falta de produto da mesma ou do acúmulo de uma
substância originada de via metabólica alternativa. Os EIM são divididos em três
grupos: grupo 1, que apresenta defeito na síntese ou degradação de moléculas
complexas; grupo 2, que apresenta defeito no metabolismo intermediário; grupo 3,
que apresenta defeito na produção ou utilização de energia (Saudubray &
Charpentier, 1995).
No grupo 1 encontram-se as Doenças de Depósito Lisossômico (DDL),
que são caracterizadas pela deficiência de uma ou mais enzimas lisossomais, o
que leva a um acúmulo de moléculas não degradadas. Dentre as DDL existem a
mucopolissacaridoses, glicogenoses e, finalmente, as esfingolipidoses, onde se
encaixa a Doença de Gaucher (DG). A figura 8 ilustra um esquema para o
entendimento das DDL.
Figura 8 – Esquema caracterizando as DDL. Fonte: Elsevier, 2005.
1.7.1. DOENÇA DE GAUCHER
A doença de Gaucher (DG) é uma esfingolipidose causada por uma
deficiência de herança autossômica recessiva da enzima lisossomal betaglicosidase ácida (glicocerebrosidase), que é responsável pela hidrólise de
glicocerebrosídio (Grabowski, 2004 e Beutler, 2000).
Mutações no gene da glicocerebrosidase (GBA) levam à ausência ou
redução na atividade da enzima com acúmulo de glicosilceramida em vários
tecidos, principalmente nos lisossomos dos macrófagos, comprometendo,
conseqüentemente, o baço, fígado, medula óssea e, com menos freqüência, os
pulmões, pele, conjuntiva, rins e coração (Beutler et al, 2000). Como pacientes
com DG podem alcançar altos níveis de expressão da QT (Hollak, 1994), esta tem
sido utilizada como biomarcador da doença. A DG é caracterizada pela
variabilidade da expressão sintomática, incluindo indivíduos com mesmo
genótipo. A DG apresenta desde formas neonatais letais a formas assintomáticas
e é classificada em três formas clínicas: não neuropática, neuropática aguda e
neuropática crônica (Beutler, 2000).
A DG tipo 1, forma não neuropática, é a mais freqüente, acometendo
95% dos casos (Altarescu et al, 2000). Esta forma afeta crianças e adultos em
qualquer idade e as manifestações clínicas típicas são hepatomegalia,
esplenomegalia, anemia, trombocitopenia e problemas ósseos. A citopenia ocorre
como resultado do hiperesplenismo, e manifestações hemorrágicas são atribuídas
à trombocitopenia, apesar de poderem decorrer de deficiências em fatores de
coagulação (Hollak et al, 1997). O acúmulo das chamadas células de Gaucher na
medula óssea leva a complicações, como dor óssea, osteopenia, fraturas e
osteoporose (Charrow et al, 1998). Apesar de a DG tipo 1 ser caracterizada pela
falta de envolvimento do sistema nervoso central (SNC), já foram relatados casos
de parkinsonismo, além de achados de α-sinucleína, corpúsculos de Lewy e
perda neuronal (Wong et al, 2004).
A DG tipo 2, forma neuropática aguda, ocorre em menos de 1 em
100.000
e
geralmente
afeta
crianças
nos
primeiros
meses
de
vida,
comprometendo o cérebro, baço, fígado e pulmões (Grabowski et al, 1998). Os
problemas neurológicos são graves, com envolvimento bulbar (estrabismo),
piramidal (espasmos) e atraso no desenvolvimento neuropsicomotor (Mignot et al,
2006). A evolução da DG tipo 2 é a mais rápida, levando ao óbito em até 2 anos
(Stone, 1999).
A DG tipo 3, forma neuropática subaguda, também apresenta baixa
incidência e é predominante em populações do Nordeste da Suécia (Vellodi et al,
2001). Indivíduos acometidos pela DG tipo 3 podem ter sintomas similares aos da
DG tipo 1 e o quadro neurológico é composto por crises convulsivas, ataxia e
demência (Martins et al, 2009).
Dois tipos de tratamento estão disponíveis para DG: Terapia de
Reposição Enzimática (TRE), que resulta na diminuição do acúmulo de
glicocerebrosídeo nos lisossomos de macrófagos (Czartoryska et al, 1998) e
Terapia de Redução de Substrato, que inibe a enzima ceramida-glicosilceramida
sintetase, que catalisa a transferência de glicose a ceramida, impedindo a síntese
de glicoesfingolipídeos, ambos levando à conseqüente diminuição da atividade da
QT (Moyses C., 2003).
1.8 DOENÇA DE PARKINSON
Em 1817, o médico inglês James Parkinson descreveu a doença que
denominou de paralisia agitante (Shaking Palsy), cuja principal característica era
a presença de tremores involuntários (Parkinson, 1817). A Doença de Parkinson
(DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum (Lang e Losano, 1998),
com uma prevalência de 3% em pessoas acima de 60 anos de idade (Barbosa et
al, 2006). O diagnóstico clássico da DP é baseado nas seguintes características:
bradicinesia, rigidez e tremor de repouso, boa resposta à levodopa, e presença de
degeneração de neurônios dopaminérgicos na parte compacta da substancia
nigra (SN), acompanhada pela presença de Corpúsculos de Lewy (Gelb et al,
1999).
Em 1912, Friedrich Lewy descreveu pela primeira vez os chamados
corpúsculos de Lewy (CL). De acordo com Hughes et al, 1992, faz-se necessária
a presença de corpúsculos de Lewy na substancia nigra no estudo anátomopatológico para o diagnóstico da DP idiopática. Os CL são neurofilamentos
compostos principalmente por α-sinucleína (Spillantini et al, 1997), que é
anormalmente fosforilada, nitrada e oxidada, envolvendo-se na formação de
fibrilas insolúveis. No momento, o tratamento mais eficaz para DP consiste na
reposição de dopamina através de sua precursora, a levodopa, usualmente junto
com carbidopa, um inibidor de descarboxilase periférica (Bounds et al, 1977). No
fim dos anos 70, os CL passaram a ser identificados em outras áreas do encéfalo,
inclusive no córtex cerebral de indivíduos que faleceram com quadro demencial,
representando uma nova afecção, denominada Demência com Corpúsculos de
Lewy (DCL), na qual as características predominantes são demência, geralmente
associada a quadro alucinatório-visual e parkinsonismo (Mark, 2001).
As afecções clínicas que se assemelham à DP são coletivamente
denominadas parkinsonismo. As formas monogênicas de parkinsonismo primário
(PP) podem ser de origem esporádica ou familiar, e geralmente manifestam-se
mais precocemente que os casos de DP. Quando a doença inicia-se antes dos 20
anos de idade, é denominada parkinsonismo juvenil, e entre 20 e 40 anos de
parkinsonismo de início precoce (Paviour et al., 2004). Geralmente os aspectos
clínicos do parkinsonismo genético são indistinguíveis da DP. Dentre as formas
familiares a mutação do gene PARK2 é a mais freqüente, enquanto que as formas
esporádicas estão associadas a mutações no gene LRRK2. A figura 9 ilustra os
genes que estão associados aos casos genéticos de DP.
Figura 9 – Genes envolvidos no parkinsonismo de causa genética. Fonte: CHIEN, 2007.
Muitas hipóteses já foram levantadas na tentativa de desvendar possíveis
etiologias para a DP, tais como toxinas exógenas, inflamação e mutações
genéticas. No entanto, é mais aceito que a DP é desencadeada pela interação
desses fatores, como um resultado da conjugação entre fatores genéticos e
ambientais. De acordo com esta teoria, a interação entre o ambiente e a
predisposição genética induz à falência do funcionamento mitocondrial (Schapira
et al, 1992) e ao estresse oxidativo em neurônios da SN, levando à morte celular
(Mark, 2001).
Um estudo conduzido por Lagston et al. (1999) revelou que MPTP (1-metil4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina) pode causar uma síndrome parkinsoniana muito
similar à DP, levando à hipótese de toxinas exógenas como fatores causadores
de DP, o que foi reforçado pelo fato de que pessoas que viviam em um ambiente
com pesticidas com MPTP em sua constituição apresentaram risco aumentado a
desenvolver DP (Firestone et al, 2005).
A neurodegeneração na DP também pode ser causada pela atividade
reduzida do sistema ubiquitina-protesossoma (SUP), que degrada o excesso de,
ou proteínas malformadas do cérebro, levando a casos genéticos ou esporádicos
de DP (Mcnaught et al, 2003). Mutações em alguns componentes do SUP, como
parkina e ubiquitina C, são responsáveis pelo desenvolvimento de casos
hereditários de DP (Kitada et al, 1998; Leroy et al, 1998). Níveis excessivos de αsinucleína, também associada ao desenvolvimento de DP, podem inibir a
capacidade do SUP de remover proteínas do cérebro (Mcnaught e Olanow, 2003).
O elo entre a falta de dopamina e desenvolvimento da DP foi confirmado
por estudos bioquímicos post mortem, mostrando menores quantidades de
dopamina e seus metabólitos no nucleus caudatos, putamen, nucleus accumbens,
substancia nigra e globus pallidus (Hornykiewicz, 2006). Danos a múltiplos
sistemas neuronais, causando mudanças bioquímicas complexas podem explicar
a variabilidade do quadro clínico da DP, incluindo sintomas motores autonômicos,
disfunção cognitiva, depressão e alucinações.
A primeira suposição que poderia haver uma relação entre DP e DG foi
baseada na observação entre pacientes com DP e parentes de pacientes com
DG. Tanto indivíduos heterozigotos quanto homozigotos para o gene da
glicocerebrosidase (GBA) podem desenvolver DP (Lopez & Sidransky, 2010).
Recentemente foi demonstrada uma alta freqüência de mutações no gene GBA
em pacientes com DP, sugerindo uma associação entre o GBA e DP (Sidransky
et al, 2009). A associação entre parkinsonismo e QT ainda não foi elucidada na
literatura, no entanto, a DP já foi relacionada a outras DDLs, que apresentam
níveis plasmáticos de QT aumentados, como a Doença de Niemann-Pick (Wajner
et al, 2004).
2. JUSTIFICATIVA
A enzima quitotriosidase tem sido associada a diversas patologias e seu
papel vem sendo cada vez mais estudado em grupos de estudos dos mais
variados segmentos, com o objetivo de entender sua função fisiológica no
organismo humano.
A DG e a DP são similares no sentido de que em algumas formas, ambas
apresentam depósito de substâncias, já que na DG ocorre acúmulo de
glicocerebrosídeo e na DP normalmente ocorre acúmulo de α-sinucleína. Devido
à forte associação da QT com a DG, este estudo tenta fazer um paralelo entre a
QT, a DG e a DP.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Investigar a relação entre alterações bioquímicas e moleculares da
enzima QT em pacientes com DP e DG.
3.2 Objetivos específicos
Identificar a freqüência alélica do polimorfismo (duplicação de 24 pb no
éxon 10) do gene QUIT1 em pacientes com DP e DG.
Identificar a freqüência genotípica do polimorfismo (duplicação de 24 pb
no éxon 10) no gente QUIT1 em pacientes com DP e DG.
Mensurar a atividade da enzima QT em pacientes com DP e DG.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
A amostra foi composta por pacientes com DG e DP, provenientes da
Fundação HEMOPA e do Hospital Universitário João de Barros Barreto,
respectivamente. Os dados referentes ao quadro clínico, idade e gênero foram
obtidos a partir dos prontuários analisados no ano de 2009 e 2010.
O grupo amostral para este estudo constou de 19 indivíduos distribuídos
da seguinte forma:
Grupo 1: 13 indivíduos com DP, nos quais foi realizado ensaio
enzimático para determinar a atividade da QT e análise molecular para investigar
a presença da duplicação de 24 pb no gene QUIT1.
Grupo 2: 6 indivíduos com DG, nos quais também foi realizado ensaio
enzimático para QT, assim como análise molecular para investigar a presença da
duplicação de 24 pb no éxon 10 do gene QUIT1.
4.2. COLETA E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS
Para a análise molecular do gene QUIT1 uma amostra de sangue total
(5 mL) foi obtida por punção venosa e colhida em frascos de vidro contendo 54L
de EDTA. A amostra foi adequadamente identificada (nome do paciente e data de
coleta) e armazenada a -20ºC até o momento da extração de DNA.
Para a análise bioquímica da QT uma amostra de sangue (5 mL) foi
coletada em tubos de vidro contendo heparina. Após a coleta, o sangue foi
centrifugado para obtenção de plasma, o qual foi posteriormente armazenado a 20º C até o momento do ensaio.
4.4. PROTOCOLO PARA ENSAIO ENZIMÁTICO DA QUITOTRIOSIDASE
(Adaptado de Hollak et al, 1993).
4.4.1. REAGENTES:
● 4-Metilumbeliferil-ß-D-N-N´-N´´-triacetilquitotriosideo 0,026 mM
 Pesar 1mg de 4-Metilumbeliferil-ß-D-N-N´-N´´-triacetilquitotriosidase.
 Medir 23 mL do tampão citrato 100mM-fosfato 200mM
 Completar com água destilada até o volume de 50 mL. Manter em
freezer a -20°C.
● Tampão citrato 100 mM – fosfato 200mM pH 5,2

Solução I:

Pesar 3,84 g de ácido cítrico anidro.

Dissolver até o volume de 100mL com água destilada.

Solução II:

Pesar 2,84 G de Na2PO4 anidro.

Dissolver até o volume de 50 mL com água destilada.

Solução final:

23,3 mL da solução I.

26,7mL da solução II.

Adicionar 40 mL de água e calibrar o pH para 5,2. Em seguida,
completar com água destilada até o volume de 100mL.
● Ácido cítrico 0,2 M:

Pesar 3,84g de ácido cítrico.

Dissolver até o volume de 100 mL com água destilada. Conservar em
geladeira.
● Albumina 10mg/ mL:

Pesar 100 mg de albumina.

Dissolver em 10 mL de água em balão volumétrico. Conservar em
geladeira.
● Tampão Glicina/NaOH pH 10,3:
Pesar 37, 535g de glicina e 12,5g de NaOH, transferir para um beker e
dissolver com 800mL de água destilada, acertar o pH 10,3 com NaOH 10M.
Completar o volume com água até 1000 mL.
4.4.2. PROCEDIMENTOS:
O quadro abaixo mostra os procedimentos iniciais para o ensaio da
enzima QT:
PROTOCOLO PADRÃO DE CURVA DE METILUMBELIFERONA
Branco (sem alb.)
Água destilada
Testes
5 uL
Albumina 1% *
5 uL
Amostra(acidificada)
Substrato
Branco (com alb.)*
100 uL
-
100 uL
5 uL
100 uL

Incubar 15 minutos a 37ºC.

Parar a reação com 1 mL de tampão glicina pH 10,3. Ler a fluorescência
no espectrofluorômetro. Excitação 365nm - Emissão 450 nm.

Usar a curva de 4-metilumbeliferil.
CÁLCULOS:
QM = concentração MU/ fluorescência.
nmoles/h/mL = (fluorescência teste - branco) X QM X 880
4.5. ANÁLISE MOLECULAR DA DEFICIÊNCIA DA QUITOTRIOSIDASE
4.5.1. EXTRAÇÃO DE DNA
A extração do DNA foi realizada pela técnica de Fenol Clorofórmio
segundo a metodologia descrita por Sambrook & Russel (2001).
4.5.2. AMPLIFICAÇÃO DO ÉXON 10 POR REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE (PCR)
Para a identificação da duplicação de 24 pares de bases foi realizada
amplificação do gene QUIT 1 na região do exon 10 (figura 01) através da técnica
de PCR. Foram utilizados iniciadores (primers) específicos: F 5’ –GAA GAG GTA
GCC AGG CTC TGG- 3’ e R 5’ – CTG CCG TAG CGT CTG GAT GAG -3’ (Lee
et al, 2007). As condições de PCR utilizadas estão destacadas a seguir:
Tabela 2. Condições usadas nas reações de PCR.
Estágios
Número de ciclos
Temperatura
Tempo
Desnaturação inicial
1
94ºC
4’
95ºC
1’
61,5ºC
30’’
72ºC
30’’
72ºC
5’
Desnaturação
Anelamento
35
Extensão
Extensão final
1
Adaptados de Lee et al, 2007.
4.5.3. Análise dos Produtos Amplificados
Os fragmentos amplificados pela PCR foram submetidos à eletroforese
em gel de agarose 2,5% com brometo de etídio para visualização das bandas de
interesse. Os genótipos foram determinados da seguinte forma: presença de
fragmento de 195pb indica homozigoto normal; presença de um fragmento de
219pb indica o homozigoto mutante; presença de dois fragmentos (195pb e
219pb) indica heterozigoto para a duplicação de 24pb.
4.6. Análise Estatística
A freqüência da duplicação de 24 pares de base foi obtida a partir de
contagem alélica simples, dividindo a quantidade de alelos mutantes encontrados
pelo número total de alelos analisados. Os dados obtidos foram comparados com
os observados na literatura através da análise do teste-t (dados amostrais).
Para análise estatística da dosagem da enzima QT foi utilizado o teste
ANOVA (um critério), seguido de teste de Dunnet.
4.7. Aspectos éticos
Este estudo levou em considerações os princípios éticos básicos das
diretrizes e normas reguladoras de pesquisa envolvendo seres humanos:
autonomia, beneficência, não maleficência e justiça. Para tanto, o projeto do
presente estudo foi submetido e aprovado por um Comitê de Ética.
5. RESULTADOS
5.1 INVESTIGAÇÃO DA DUPLICAÇÃO DE 24PB
A presença da duplicação foi detectada através da técnica de PCR. O
produto da PCR foi visualizado em gel de agarose a 2,5%, contendo brometo de
etídio. Os genótipos foram determinados a partir do tamanho dos fragmentos
visualizados: presença de fragmentos de 197pb indica homozigoto normal;
presença de fragmento de 219pb indica homozigoto mutante; presença de ambos
fragmentos indica heterozigoto para duplicação de 24pb (figura 10).
1
2
3
Figura 10- Genótipos para a duplicação de 24 pb no exon 10 do gene QUIT1: canaleta 1:
homozigoto normal com 195pb; canaleta 2 homozigoto mutante com 219pb; canaleta 3:
heterozigoto com ambos os fragmentos (195pb e 219pb).
5.2 FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS
As freqüências genotípicas e alélicas foram determinadas por contagem
direta (procedida pela contagem simples de alterações encontradas).
A tabela 3 mostra a relação dos genótipos encontrados para a
duplicação de 24 pb no éxon 10 do gene QUIT1 nos pacientes com DP, assim
como a dosagem da enzima QT e os sintomas iniciais da doença. A idade de
início da doença variou entre 35 e 82 anos.
Tabela 3 – Dosagem da enzima QT, genótipo e dados clínicos dos pacientes
com DP.
DP 1
QT
GENÓTIPO
DADOS CLÍNICOS
(nmoles/h/mL)
26,1
Heterozigoto
Rigidez nos membros
superiores.
DP 2
Não detectável
Homozigoto mutante
Tremor
na
mão
direita,
bradicinesia, perda de memória
e dificuldade na fala.
DP 3
107,4
Homozigoto normal
Tremor
nos
membros
superiores,
bradicinesia,
dificuldade na fala.
DP 4
235,09
Homozigoto normal
Tremor na mão direita.
DP 5
86,2
Homozigoto normal
Fraqueza
nos
membros
inferiores e superior esquerdo, e
tremor no corpo inteiro.
DP 6
192,10
Heterozigoto
DP 7
233,64
Homozigoto normal
Tremor na mão e pé direitos.
Bradicinesia, rigidez e tremor no
corpo
inteiro,
alteração
da
DP 8
55,0
Homozigoto normal
marcha e da fala.
Tremor e rigidez na mão direita.
DP 9
Não detectável
Homozigoto mutante
Tremor
no
corpo
inteiro,
alterações da marcha.
DP 10
25,4
Heterozigoto
Dificuldade de movimentar o
lado direito.
DP 11
DP 12
55,0
52,4
Homozigoto normal
Rigidez e tremor em todos os
Homozigoto normal
membros.
Tremor na
mão
esquerda,
fraqueza.
DP 13
20,9
Heterozigoto
Tremor na mão esquerda.
A tabela 4 demonstra a relação de genótipos encontrados para a
duplicação de 24 pb no éxon 10 do gene QUIT1 nos pacientes com DG, assim
como a dosagem da enzima QT.
Tabela 4 – Dosagem da atividade da QT e genótipo de pacientes com DG.
QT (nmoles/h/mL)
GENÓTIPO
DG 1
9435
Homozigoto normal
DG 2
563
Heterozigoto
DG 3
6049
Homozigoto normal
DG 4
30.634
Homozigoto normal
DG 5
2,1
Homozigoto mutante
DG 6
570
Heterozigoto
A tabela 5 ilustra as freqüências genotípica e alélica para a duplicação
de 24 pb do gene QUIT1. Tanto nos pacientes com DP quanto com DG, o
genótipo
mais
encontrado
foi
homozigoto
normal
(53,86%
e
50%,
respectivamente), seguido de heterozigoto (30,76% e 33,33%, respectivamente) e
homozigoto mutante (15,38% e 16,67%, respectivamente). Quanto à freqüência
alélica, o alelo selvagem foi o mais encontrado, com uma freqüência de 70% nos
pacientes com DP e 66,7% nos pacientes com DG. O alelo mutante foi
encontrado em uma freqüência de 30% (DP) e 33,3% (DG).
Tabela 5 – Frequências genotípica e alélica da duplicação de 24pb no éxon 10
em pacientes com DP E DG.
FREQUÊNCIA GENOTÍPICA
n
HN
Heterozigoto
DP
13
53,86%
30,76%
DG
6
50%
33,33%
F. ALÉLICA
HM
Selvagem
Mutante
15,38%
70%
30%
66,7%
33,3%
16,67%
HN = homozigoto normal; HM = homozigoto mutante.
As freqüências alélicas e genotípicas dos pacientes de DG e DP não
diferiram significativamente (p>0,050).
5.3 DOSAGEM DA ATIVIDADE DA ENZIMA QT
Nos pacientes com DP a dosagem da atividade de QT variou entre
aproximadamente 0,0 e 235,09 nmoles/h/mL. Nos pacientes com DG a atividade
de QT variou de 2,1 a 30.634,0 nmoles/h/mL. Nos pacientes com DG a atividade
da enzima QT foi significativamente maior quando comparada como os pacientes
com DP (p < 0,05).
6. DISCUSSÃO
A QT tem sido considerada como um indicador da resposta imune inata
e também desempenha um papel importante na defesa contra patógenos
contendo quitina (Pitas et al, 2006).
A atividade da QT no plasma humano é considerada como biomarcador
de ativação de macrófagos e de alguma doenças de depósito lisossômico, como
a DG (Malaguarnera et al, 2005).
Embora a atividade da QT seja sugerida como marcador bioquímico
para a DG e sua atividade aumentada em diversas patologias, há polimorfismos
que interferem na atividade da enzima. O polimorfismo mais encontrado é a
duplicação de 24pb no éxon 10, causando a deleção de 87 nucleotídeos,
resultando em uma enzima inativa com ausência de 29 aminoácidos (Boot et al,
1998).
Este polimorfismo foi encontrado em diferentes etnias (Malarguarnera,
2006) e em tribos indígenas. Em um estudo conduzido por Silva (2010), a
freqüência da duplicação foi investigada na população de Belém-PA, nas
populações indígenas da Amazônia e em pacientes com DG. Foi encontrada uma
freqüência do alelo mutante de 24% na população de Belém, 92% para Ka’apor,
50% para Xikrin, 69% para Araweté, 71% para Parakanã, 68% Asurini, 76% para
Arara, 45 % para Gavião e 7% para DG. A freqüência do genótipo homozigoto
mutante foi de 7% para a população de Belém, 92% para Ka’apor, 38,5% para
Xikrin, 54% para Araweté, 58% para Parakanã, 57% para Asurini, 57% para
Arara, 31% gavião e nenhum para DG.
O alelo mutante da QT foi encontrado em uma freqüência de 33-35% em
judeus Ashkenazi e holandeses, respectivamente, enquanto que em ambas as
populações 6% eram homozigotos para este alelo (Boot et al, 1998). Em um
estudo feito na população portuguesa foram encontrados 6% de homozigotos pra
este polimorfismo e 40% de heterozigotos (Rodrigues, 2004). Já na área
Mediterrânea foi encontrada uma freqüência para heterozigotos de 44-54% na
Sicília e 32,7% na Sardenia, enquanto que 5,45% e 3,73%, respectivamente, são
homozigotos mutantes. Na África, no entanto, não foram encontrados indivíduos
homozigotos para a deficiência e uma baixa incidência de heterozigotos em Benin
e Burkina, 0% e 2%, respectivamente (Malaguarnera, 2003).
No presente estudo foi investigada a duplicação de 24 pb em pacientes
com DP e DG do estado do Pará. Nos pacientes com DP foi encontrada uma
freqüência do genótipo homozigoto normal de 53,86%, 30,76% do heterozigoto e
15,38% do homozigoto mutante. Nos pacientes com DG as freqüências
genotípicas foram 50% para homozigoto normal, 33,33% para heterozigoto e
16,67% para homozigoto mutante. As freqüências alélicas encontrada nos
pacientes com DP foram 70% para o alelo selvagem e 30% para o alelo mutante
e nos pacientes com DG foi 66,7% para o alelo selvagem e 33,3% para o alelo
mutante. Estes achados não diferem dos encontrados por Silva, 2010 para a
população de Belém.
A constatação de que os níveis plasmáticos de QT observados em
pacientes com DP no presente estudo ainda estão abaixo dos valores observados
em pacientes com DG pode estar associada ao fato de que a DG é uma doença
crônica e gradativa, com intensa proliferação de macrófagos, enquanto que a DP
não é conhecida por desencadear resposta imune.
Os sintomas iniciais mais comuns foram tremor nos membros superiores
e rigidez. A idade de início dos sintomas variou entre 35 e 82 anos, sendo que
apenas dois pacientes apresentaram histórico familiar positivo. O quadro clínico
dos pacientes com DP não diferiu do que já está na literatura, assim como a
resposta a agonistas dopaminérgicos (Lau & Breteler, 2006).
A QT é uma enzima secretada por macrófagos com a capacidade de
degradar quitina e o seu papel fisiológico no organismo ainda não está totalmente
elucidado. Entretanto, diversos trabalhos sugerem que a expressão de QT está
associada à resposta imune, ou que seria uma resposta natural do organismo
diante de um patógeno, como sugerido por Hollak et al, (1993), Malaguarnera et
al, (2005); Van Eijk et al (2005).
A participação da QT no processo de resposta imune é respaldada
também por sua atividade estar diretamente ligada à proliferação de macrófagos
ativos, uma vez que estes são importantes componentes do mecanismo de
defesa do organismo. Nesse contexto, Boot et al. (1995) demonstraram que, em
determinadas circunstâncias, a QT pode ser considerada a principal proteína
secretada pelos macrófagos, correspondendo a cerca de 1% das proteínas totais
secretadas.
Em um estudo desenvolvido por Barone et al. (1999) foram observados
níveis de QT aumentados em 10% dos pacientes com Beta Talassemia Maior
comparáveis aos de pacientes com DG. Uma característica desta patologia é a
sobrecarga de ferro provocada por uma eritropoiese ineficiente, bem como
transfusões a que estes pacientes são submetidos. Este evento seria um dos
fatores responsáveis pelos níveis aumentados da QT nesta patologia.
7. CONCLUSÕES
A freqüência alélica da duplicação de 24 pb encontrada para DP de
30,0% e para DG de 33,3% não apresentou diferença estatística.
As freqüências genotípicas não diferiram entre DP e DG, e ambas em
relação à população de Belém - PA.
O nível plasmático da QT foi significativamente maior nos pacientes com
Doença de Gaucher do que nos pacientes com Doença de Parkinson.
O nível plasmático da enzima não teve relação com a gravidade dos
sintomas iniciais, com a idade de início dos sintomas nem com o histórico
familiar positivo dos pacientes com Doença de Parkinson.
Os genótipos para a duplicação de 24 pb demonstraram que os
indivíduos homozigotos mutantes apresentam deficiência na atividade de QT
tanto nos pacientes com DG quanto os com DP.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXO
PROJETO: INVESTIGAÇÃO DE ALELOS MUTANTES NO GENE GBA EM
PACIENTES COM DOENÇA DE PARKINSON: RELAÇÃO COM A DOENÇA
DE GAUCHER?
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidado para participar de uma pesquisa que tem o objetivo
investigar a ocorrência da influência de fatores genéticos em indivíduos
portadores da Doença de Parkinson. A Doença de Parkinson é uma doença
que ocorre, geralmente, em pessoas com mais de 50 anos e provoca
problemas nos movimentos do corpo, como por exemplo, o aparecimento de
tremores nas mãos e a lentidão dos movimentos voluntários. A pesquisa vai
tentar identificar se esses fatores genéticos (fatores que passam de pais para
filhos) estão realmente ligados ao fato do indivíduo desenvolver a Doença de
Parkinson. Em uma etapa do estudo, você será submetido a uma série de
perguntas sobre a situação da sua doença e sobre as suas condições de
moradia e de trabalho, nos dias de hoje e no passado. Você poderá ser
escolhido para participar da etapa do estudo que envolve fazer exames de
sangue. Você terá total liberdade para recusar a participação nessa fase, sem
problema nenhum. A coleta do sangue para os testes será feita com todo o
cuidado, por pessoas treinadas e com material descartável adequado, desta
forma, oferecendo riscos mínimos para sua saúde e bem estar. Através do
material coletado serão realizados exames genéticos complexos a fim de
atingir os objetivos desta pesquisa. A finalidade desses testes é descobrir se há
possivelmente a ligação entre o quadro da doença de Parkinson e a atuação de
determinados fatores genéticos (como o gene LRRK2), e não trará nenhum
benefício imediato em termos de sua cura ou melhoria do tratamento.
Entretanto, a pesquisa poderá ajudar a esclarecer melhor como a doença surge
e se desenvolve, e, com isso poderá contribuir para melhorar a prevenção e
futuro controle da doença. Se você aceitar participar da pesquisa, seu nome e
a sua participação no estudo ficarão em total sigilo. Danos que forem,
comprovadamente, provocados pela pesquisa serão reparados. Você também
poderá interromper a sua participação no estudo a qualquer momento que
quiser sem que haja perdas ou qualquer forma de represálias. Declaro que li as
informações acima sobre a pesquisa, que me sinto esclarecido (a) sobre o
conteúdo da mesma. Declaro ainda que, por minha livre vontade, aceito
participar da pesquisa cooperando com a coleta de material para exame.
Belém, ___ / ___ /___
___________________________________________
Assinatura do participante Assinatura do Responsável