Microscopia

BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I
Métodos instrumentais de análise para o estudo
de células e tecidos - Microscopia
Objectivos:
◉ Listar e descrever as ferramentas de estudo da célula
◉ Definir e analisar a metodologia usada na:
-Microscopia óptica e electrónica; -Microscopia de
fluorescência;
-Microscopia de contraste de fase; -Microscopia confocal; Microscopia Electrónica de Transmissão e de Varrimento.
◉ Listar e descrever a preparação do material biológico para a
microscopia óptica e electrónica
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Poder de
resolução
Microscopia depende de:
- técnicas de preparação
das amostras biológicas
- poder de resolução dos
microscópios
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na
história da microscopia
1611 - Kepler sugere maneiras de construir 1 microsc composto
1683 - Leeuwenhoek visualiza pela 1ªx uma bactéria
1879 - Flemming descreve o comportamento dos
cromossomas na mitose de cél animais.
1881 - Retzius, Cajal e outros desenvolvem técnicas de
coloração e lançaram os fundamentos da anatomia
microscópia
1882 a 1899 – Klebs e Pasteur utilizando variados corantes
identificam importantes agentes patogénicos.
1886 – Zeiss constroi uma série de lentes q permite revelar
estruturas nos limites teóricos da luz visível
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na
histó
história da microscopia
1898 – Golgi descreve pela 1ªx o aparelho de Golgi depois
da coloração das células com nitrato de prata
1932 – Zernicke inventa o microscópio de contraste de fase
Estes 2 microsc permitem que células vivas não coradas sejam
vistas em detalhe pela 1ª vez
1981 – Allen e Inoué – aperfeiçoam o microscópio óptico
de contraste com sistema de vídeo avançado
1988 – Microscópios confocais de varredura comerciais
passam a ser amplamente utilizados
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
O limite máximo de resolução de 1 microscópio óptico
é determinado pelo comprimento de onda da luz
visível, q varia de 0,4 µm (violeta) a 0,7 µm
(vermelho).
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
Limite de resolução – é o limite de separação pelo qual
2 objectos podem ser distinguidos.
Limite de resolução depende de:
- comprimento de onda da luz (λ
λ)
- abertura numérica do sistema de lentes (an)
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
A abertura numérica – é a capacidade do
sistema de lentes recolher a luz.
- lentes secas - an não pode ser maior que 1
- lentes de imersão – an pode chegar a 1,4
Qto > a an > a resolução e > a luminosidade.
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica Fixação
A fixação
imobiliza,
mata e
preserva e endurece as células.
torna-as permeáveis aos corantes e
produz uma ligação cruzada entre as suas
macromoléculas, permitindo que estas
permaneçam estabilizadas nas suas posições
naturais
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica Fixação
Procedimentos antigos usavam ácidos e solventes orgânicos
como o álcool. Diferentes poderes de penetração ∴ usados em
combinações.
Actualmente usam-se os aldeídos (formaldeído e glutaraldeído)
que formam ligações covalentes com os grupos amino-livres das
proteínas produzindo ligações cruzadas.
Qualquer tratamento usado na fixação pode alterar a estrutura
da célula ou das suas moléculas ∴ uma alternativa é o
congelamento rápido.
Vantagens- proteínas bem preservadas
Desvantagens- estrutura fina da célula é destruída pelos cristais
de gelo
O tecido congelado é seccionado com um criostato (micrótomo
mantido numa câmara a ↓ T)
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica Embebição
Mesmo após a fixação os tecidos são macios e frágeis e
ceras
MO
precisam de ser embebidos em
resinas,
ME
1º na forma líquida de seguida na forma sólida (por
esfriamento ou polimerização).
O material biológico embebido é seccionado com um
micrótomo/ultramicrótomo
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica Embebição
O micrótomo – é um
aparelho
com
uma
lâmina metálica afiada
As secções:
- de 1 a 10 µm de espessura,
- colocadas sobre a superfície
plana de uma lâmina de vidro
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica Coloração
Depois de fixado e seccionado, o
material biológico tem que ser corado
para poder ser observado ao microscópio.
Uma vez que que os corantes têm
diferentes afinidades e poderes de
penetração têm que ser utilizadas em
combinações.
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica Coloração
Há uma relativa falta de especificidade dos corantes a nível
molecular que tem levado ao desenvolvimento de procedimentos
de coloração mais selectivos e racionais, particularmente a
métodos que revelem proteínas específicas ou outras
macromoléculas na célula.
Assim algumas enzimas podem ser localizadas nas células
através da sua actividade catalítica.
Regiões mais sensíveis
fluorocromos
podem ser avaliadas
através de
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Microscopia
de
Fluorescência
Moléculas fluorescentes absorvem luz a 1 determinado λ e
emite um λ + longo, visualizado através de 1 filtro contra
um fundo escuro
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Microscopia
de
Fluorescência
Os fluorocromos são detectados em microsc de fluorescência q
difere dos normais por ter uma luz + potente q passa por 2
conjuntos filtros:
O 1º permite a
passagem de λ
q excitem
determinados
fluorocromos
O 2º permite
passagem de
λ emitidos
qdo o corante
fluoresce
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Microscopia
de
Fluorescência
A fluoresceina emite fluorescência verde qdo excitada com luz azul
A rodamina
“
“
vermelha “
“
“ “ amarel/verde
Imagem
de FISH
com
fluorescein
e
rodamina
As 2 cores
são vistas
separada/
alternando
conjuntos de
filtros
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Microscopia
Qdo se fixa 1a cél
de Contraste
de Fase
ela perde alguns componentes ou
são simples/ distorcidos
∴ a forma + correcta de examinar as células seria quando estas
ainda estivessem vivas, sem as fixar ou congelar.
Qdo a luz atravessa 1a cél viva a fase do λ é alterado de acordo com o
índice de refracção da cél.
A luz ao passar através do núcleo é retardada e deslocada em relação à
luz que atravessam áreas + delgadas.
O microsc de contraste de fase explora os efeitos da
interferência qdo estes 2 conjuntos de ondas se recombinam,
criando uma imagem da estrutura da célula
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia
As partes coradas
da cél
Reduzem a
amplitude e ∴
A imagem colorida
da cél é vista
de Contraste
de Fase
A luz q passa
através de 1a cél
não corada
sofre pouca
alteração de
amplitude e ∴
os detalhes das
estruturas não se
conseguem ver
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Microscopia
Confucal
Para a microscopia óptica 1 tecido tem q ser cortado em secções
q, qto + fina a secção + nítida é a imagem.
Neste processo a informação 3D é perdida.
Com
o
Mic
confucal
de
varrimento a partir de 1a série
de secções tiradas em ≠s
profundidades e armazenadas
em
computador
é
fácil
reconstruir a imagem 3D
o Mic confucal de varrimento é para o
microscopista o que o CAT scanner é
para o radiologista. Ambos fornecem
imagens seccionadas detalhadas do
interior de uma estrutura intacta.
Gastrula – Drosophila
mic convencional e de fluorescênc confucal
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia Electró
Electrónica de Transmissão (TEM)
TEM – ‘Transmissiom Electron Microscope’
Microscope’
Teorica/ tem 1a resolução 10 000x > q o MO e 1 poder de
resolução - 1Å
Na prática tem 1a resolução 100x > q o MO e 1 poder de
resolução 20Å
Porquê?
Devido a problemas na preparação da amostra
Contraste e
Danos causados pela radiação
No TEM os electrões atravessam a amostra para formar a imagem
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na
histó
história da microscopia electró
electrónica
1897 – J. Thompson anuncia a existência de partículas carregadas
–va/ + tarde denominadas “electrões”
1931– Ruska et al constróem o 1º TEM
1935 – Knoll demonstra a viabilidade do mic electrónico de
varredura
1939 - Siemens produz o 1º TEM para fins comerciais
1945 – Porter, Claude e Fullam, usam o TEM para examinar célula
em cultura depois de fixadas e contrastadas com OsO4
1948 – Pease e Baker, preparam secções de mat biológico de 0,1 a
0,2 µm
1952 – Palade, Porter e Sjöstrand desenvolvem métodos de
fixação e corte q possibilitam pela 1ªx a visualização de várias
estruturas intracelulares
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na
histó
história da microscopia electró
electrónica
1953 – Porter e Blum desenvolvem o 1º ultramicrótomo
1956 – Glauert et al propõem a resina epoxi araldite como agente
de inclusão.
1961 – Luft introduz a resina Epon
1957 – Robertson descreve a estrutura trilaminar da membrana
celular vista pela 1ªx no TEM
1959 – Singer usa anticorpos acopolados à ferratina para
detectar moléculas da célula
1965 – Cambridge instruments produz o 1º microscópio de
varrimento
1968 – De Rosier e Klug descrevem técnicas para a reconstituição
de estruturas 3D a partir de micrografias electrónicas
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a
microscopia electrónica
Fixaç
Fixação
1º com gluteraldeído que faz com que as moléculas de proteínas
façam ligações covalente/ cruzadas com os seus vizinhos
2º com tetróxido de ósmio q se liga e estabiliza as bicamadas
lipídicas assim como as proteínas
Desidrataç
Desidratação
Como a amostra é exposta ao vácuo mto forte não pode ser
analisada viva, com H2O, ∴ é feita a desidratação numa série
crescente de alcoóis
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Preparação do material biológico para a
microscopia electrónica
Embebiç
Embebição
Feita com uma resina q se polimeriza formando 1 bloco sólido de
plástico
Corte
Cortes ultrafinos (na ordem
dos
50
a
100nm
de
espessura)
feitos
num
ultramicrótomo e colocados
numa grelha
Contrastaç
Contrastação
Feito com sais de metais pesados como o urânio e o chumbo
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Preparação do material biológico para a
microscopia electrónica
mitocôndria
vacúolo
nucléolo
ribossomas
Golgi
RE
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia
Electró
Electrónica de Varrimento
Secções finas obtidos por TEM são pedaços bidimensionais de
tecidos e não transmitem de imediato a organização 3D dos
componentes celulares
Este é conseguido usando o microscópio
electrónico de varrimento, q é num
aparelho <, + simples e + barato do q
um TEM.
Utiliza os electrões q são dispersos ou
emitidos da superfície da amostra ∴
somente características da superfície
podem ser examinadas e a resolução
atingível não é mto alta
macrófago
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia
A amostra é
Electró
Electrónica de Varrimento
fixada,
desidratada e
coberta com uma camada fina de metal pesado de
seguida
varrida por um feixe de electrões.
Cílio do ouvido interno do boi
A quantidade de electrões emitidos é medido para controlar a intensidade
de um 2º feixe, q se move em sincronia com o 1º e forma a imagem num
écran.
Como a imagem tem brilhos e sombras dá 1a aparência 3D.