universidade federal de pernambuco centro de ciências biológicas

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universidade federal de pernambuco centro de ciências biológicas
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROJETO DE TESE
“ANÁLISE MORFOLÓGICA DE CERÂMICAS DE FOSFATO DE
CÁLCIO FIRMEMENTE ADERIDAS AO ESMALTE DENTAL
FORMADAS EM MODELO IN SITU DE CÁRIE DENTAL SOB
ESTIMULAÇÃO COM FLUORETOS E LASER”
PROF. FREDERICO BARBOSA DE SOUSA
ORIENTADORA:
PROFA. DRA. NEREIDE STELA SANTOS MAGALHÃES
LIKA/UFPE
CO-ORIENTADORA:
PROFA. DRA. SANDRA SAMPAIO VIANNA
DEPARTAMENTO DE FÍSICA/UFPE
RECIFE, DEZEMBRO DE 2001
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
....................................................................................................
2
2
1.1 FORMAÇÃO DE DEPÓSITOS CALCIFICADOS NAS LESÕES CARIOSAS ....
1.2 AVALIAÇÃO IN VIVO DA EFICÁCIA DE FÁRMACOS QUE INIBEM A
FORMAÇÃO DE DEPÓSITOS CALCIFICADOS EM BIOFILMES
BACTERIANOS DENTAIS .....................................................................................
3
1.3 INDUÇÃO DE DEPÓSITOS CALCIFICADOS EM MATERIAIS PARA
IMPLANTES OSTEOINTEGRADOS ......................................................................
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1.4 INDUÇÃO DE DEPÓSITOS CALCIFICADOS POR LASER DE BAIXA
INTENSIDADE (LBI) ...............................................................................................
2
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS .........................................................................
2.1 JUSTIFICATIVA ......................................................................................................
2.2 OBJETIVOS GERAIS
2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .....................................................................................
3
MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................
3.1 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ............................................................................
3.1.1
Preparação dos espécimes .................................................................................
3.1.2
Estudos de otimização do uso do laser .............................................................
3.1.3
Seleção dos voluntários .....................................................................................
3.1.4
Confecção do aparelho palatal removível (APR) ...........................................
3.1.5
Período in situ ....................................................................................................
3.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA E QUÍMICA ..............................................................
3.2.1
Análise em estereomicroscópio .........................................................................
3.2.2
Análise em microscopia de luz polarizada ......................................................
3.2.3
Preparo para microscopia eletrônica de varredura (MEV) ..........................
3.2.4
Análise espectroscópica de dispersão de energia (EDE) ................................
3.3 ANÁLISE DOS DADOS ...........................................................................................
4
INFRA-ESTRUTURA .............................................................................................
5
CRONOGRAMA DE ATIVIDADES ....................................................................
4
2
6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................
3
1 INTRODUÇÃO
A formação de depósitos calcificados é um processo que tem sido foco de interesse na
Odontologia e na Medicina. Na primeira, os processo da doença cárie e da formação do cálculo
dental estão diretamente implicados. Na Medicina, depósitos/cerâmicas de fosfato de cálcio –
principalmente hidroxiapatita - sintéticos ou formulados a partir de extratos de tecidos
mineralizados de animais - são usados como materiais de preenchimento em defeitos ósseos e para
recobrimento prévio de implantes de titânio a serem inseridos em tecido ósseo humano com
finalidade de estimular a neoformação óssea. Neste contexto, o controle da formação e inibição da
precipitação de depósitos calcificados biológicos tem sido foco de muitas investigações na área
biotecnológica.
1.1 FORMAÇÃO DE DEPÓSITOS CALCIFICADOS NAS LESÕES CARIOSAS
As lesões cariosas são desmineralizações dos tecidos dentais duros expostos na cavidade
bucal causadas pela ação de ácidos produzidos por espessos acúmulos microbianos formados após
um certo período de tempo (THYLSTRUP & BRUUN, 1992). Após a formação inicial do biofilme
bacteriano, se não houver forças mecânicas que perturbem seu crescimento, sua espessura aumenta
e dificulta a passagem de oxigênio para as bactérias mais próximas da superfície do tecido dental
duro e, assim, passam a apresentar metabolismo anaeróbico com conseqüente formação de ácido
lático e desmineralização mineral (THYLSTRUP et al., 1994). Análises em microscopias eletrônica
de varredura e de luz polarizada, de estudos in vivo, mostraram que a inativação das lesões cariosas
ocorre quando as forças mecânicas sobre o biofilme são restauradas, causando tanto a remoção
mecânica total ou parcial do biofilme como o polimento da superfície do tecido duro, que passa a
ter uma superfície mais lisa e brilhosa sem ser remineralizada (HOLMEN et al., 1987; ÄRTUN &
THYLSTRUP, 1989). Apesar da supersaturação da saliva em fosfato de cálcio, algumas proteínas
como as ricas em prolina e a estaterina impedem a precipitação espontânea de minerais
(THYLSTRUP et al.., 1994). Por outro lado, com base principalmente em estudos in vitro, foi
demonstrado que produtos fluoretados podem remineralizar lesões cariosas e, assim, levariam à sua
inativação por remineralização (SILVERSTONE, 1984). Uma menor perda mineral também foi
demonstrada em lesões cariosas tratadas in vivo e in situ com fluoretos (DIJKMAN et al., 1990;
GERHARD & ARENDS, 1984). Porém, para produzir lesões cariosas in vivo ou in situ e mantê-las
ativas para testar qualquer outro tratamento que não seja a remoção mecânica do biofilme, é
necessário impedir a ação das forças mecânicas sobre a superfície dentária e quando estas
circunstâncias foram empregadas para testar o potencial de inativação por remineralização de
produtos fluoretados, quer sejam aplicados na forma de dentifrícios (PETERSSEN et al., 1990),
água fluoretada (THYLSTRUP et al., 1990) e até verniz com flúor (HOLMEN et al., 1986), as
lesões cariosas não paralisaram.
A remineralização requer que depósitos calcificados firmemente aderidos ao tecido duro
sejam formados. O contato de produtos fluoretados com os tecidos dentais duros gera dois produtos
de reação: a fluorapatita e o fluoreto de cálcio. A fluorapatita é o produto firmemente aderido,
porém formado em quantidades clinicamente insignificantes (RÖLLA et al., 1993; CURY, 1992). O
fluoreto de cálcio é o principal produto calcificado formado por soluções fluoretadas capazes de
criar uma concentração salivar de flúor acima de 100 ppm e é um produto solúvel na saliva e na
água, tendo sua dissolução aumentada por quedas de pH no biofilme bacteriano (ÖGAARD, 2001;
CRUZ et al., 1994). Foi mostrado que a dissolução em água de glóbulos de fluoreto de cálcio
formados sobre esmalte dental após aplicação tópica de solução de fluoreto de sódio a 2% pode
levar até oito semanas (BRUNN et al., 1983). Pelo nosso conhecimento, a dissolução em água
desses depósitos por períodos adequados não foi realizada em estudos in vivo e in situ que
utilizaram métodos óticos na avaliação da remineralização, o que pode ser um viés interferindo nas
imagens obtidas por radiomicrografia e microscopia de luz polarizada.
4
Outro viés que deve ser considerado na avaliação da remineralização promovida pelo flúor
na presença de saliva e biofilme bacteriano é a formação de cálculo dental. SOUSA (1996)
demonstrou, pela primeira vez, que a desmineralização e a formação de cálculo dental podem
ocorrer concomitantemente quando o biofilme bacteriano espesso é formado in situ na presença de
flúor. Mais recentemente, adicionando bochechos diários de soluções fluoretadas ao modelo,
SOUSA (2001) demonstrou a formação de depósitos de cálculo em quantidades visíveis ao
estereoscópio em aumentos de 40X. HAYASHI (1993), num estudo com MEV de alta resolução,
relatou que a união entre os cristais do cálculo dental e os do esmalte é tão forte que, para remover
todo o cálculo, seria preciso remover parte do esmalte. Também foi mostrado que o flúor induz in
vitro a calcificação de culturas de Streptoccocus mutans com soluções de fosfato de cálcio
(SOUCHAY et al., 1995). Estudos histopatológicos demonstraram que a camada externa
“remineralizada” de lesões cariosas dentinárias inativas representa, na verdade, bactérias mortas
calcificadas - cálculo dental – (SCHÜPBACH et al., 1992). Uma vez que a hidroxiapatita também
faz parte da composição do cálculo dental, é necessário pesquisar o seu papel no reparo mineral de
lesões cariosas ativas tratadas com fluoretos.
1.1 AVALIAÇÃO IN VIVO DA EFICÁCIA DE FÁRMACOS QUE INIBEM A FORMAÇÃO DE
DEPÓSITOS CALCIFICADOS EM BIOFILMES BACTERIANOS DENTAIS (CÁLCULO
DENTAL)
O cálculo dental constitui o biofilme bacteriano calcificado, formado sobre os tecidos
dentais duros ou qualquer outra superfície dura na cavidade bucal em decorrência da deposição de
sais de fosfato de cálcio (THEILADE, 1992). Sua composição é de cerca de 70-80% de sais
inorgânicos, dos quais dois terços se apresentam na forma cristalina com uma relação entre o cálcio
e o fosfato que varia de 1,6 a 2 (THEILADE, 1992). As principais formas cristalinas encontradas
são: hidroxiapatita, fosfato de octacálcio, whitloquita e brushita (KODAKA & MIAKE, 1991;
KAKEI et al., 2000), dos quais os três primeiros são variantes da matriz de hidroxiapatita e a
brushita é uma fase intermediária produzida durante a formação da hidroxiapatita e/ou whitloquita
(SCHROEDER & BANBAUER, 1966).
O cálculo dental é um fator contribuinte na patogênese da doença periodontal devido à sua
capacidade de reter biofilme bacteriano (e dificultar a higienização) e não à sua simples formação
sobre os tecidos dentais duros (THEILADE, 1992; GAARE et al., 1990). Sua formação pode ser
parcialmente inibida pela ação de substâncias como pirofosfato, citrato de zinco, cloreto de zinco,
ácido Gantrez e hexametafosfato de sódio, que são adicionados a colutórios bucais e dentifrícios –
anti-tartáricos - formulados para tratamento de indivíduos que formam muito cálculo (WHITE,
1992; WHITE & COX, 2001). Os fármacos anti-tartáricos são comercializados com finalidade
estética (impedir a formação de cálculo supra-gengival) e terapêutica (tratar e controlar a doença
periodontal). Em humanos, a eficácia destes produtos é testada por estudos que utilizam indivíduos
potencialmente formadores de tártaro (SANTOS et al., 1999; SOWINSKI et al., 1999), o que
dificulta a eliminação de alguns vieses. Foi demonstrado que a simples instrução de uma escovação
sem dentifrício iniciando pelos locais onde há tártaro leva a uma significativa inibição da formação
clínica de tártaro (O’HEHIR & SUVAN, 1998), indicando um forte fator contribuinte da própria má
higienização do paciente. Este pode vir a mudar momentaneamente de hábitos quando participar de
um estudo, mascarando o efeito dos fármacos pela ação abrasiva do dentifrício e da escova. Os
fármacos antitártaro precisam ter sua eficácia in vivo testada em modelos que permitam separar sua
ação de ações abrasivas e de peculiaridades na composição salivar de certos indivíduos que podem
não estar presentes na cavidade bucal do consumidor médio.
1.3 INDUÇÃO DE DEPÓSITOS CALCIFICADOS EM MATERIAIS PARA IMPLANTES
OSTEOINTEGRADOS
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Depósitos (cerâmicas) de fosfato de cálcio, principalmente hidroxiapatita (HA), são
empregados na Medicina para cobrir implantes osteointegrados de titânio e servirem de material de
preenchimento em uma gama de procedimentos cirúrgicos envolvendo o tecido ósseo, ambos com a
finalidade de estimular a formação de matriz óssea mineralizada com base na propriedade da HA de
promover adesão biológica com o osso (JARCHO et al., 1977). Implantes colocados com depósitos
de fosfato de cálcio mostraram um melhor reparo ósseo comparado àqueles sem os depósitos
(JANSEN et al., 1991). Os depósitos formados sobre os implantes são sintéticos, enquanto que
hidroxiapatitas biológicas são extraídas de certos animais para preparar materiais com finalidade de
preenchimento. Dentre as técnicas usadas para formar estes depósitos, há as deposições por laser
pulsátil ablativo (CLERIES et al., 2000; FERNANDEZ-PRADAS et al., 1999), pela técnica
eletroforética (DUCHEYNE et al., 1990) e pela aplicação de spray de plasma (DE GROOT et al.,
1987), esta última sendo a mais usada pela vantagem de promover, em curto espaço de tempo,
espessos depósitos em larga escala (SARDIN et al., 1994). Porém, os depósitos formados pela
técnica de spray de plasma apresentam pouca durabilidade, fraca adesão ao substrato, formação de
compostos de fosfato de cálcio não cristalinos, limitada performance de biocompatibilidade e baixa
resistência mecânica (CLERIES et al., 1999). A técnica do laser pulsátil ablativo consegue formar
camadas de espessura menor e aumentar a quantidade de cristais de hidroxiapatita, pouco solúveis,
porém estes depósitos apresentam fraca resistência mecânica e são associados com outros
compostos bastante solúveis (CLERIES et al., 1998; CLERIES et al., 2000).
O material ideal para substituir osso deveria ser: (1) osteocondutivo, para permitir uma
rápida integração com o tecido ósseo receptor; (2) biodegradável, para ser substituído por um novo
tecido ósseo natural; e (3) suficientemente resistente para suportar as forças mecânicas sofridas no
período inicial pós-implante, antes de sua substituição por osso natural (PILLAR et al., 2001).
Recentemente foi demonstrado que os cristais de HA do cálculo dental, assim como os do osso e
outros tecidos mineralizados, também apresentam uma linha escura central (KAKEI et al., 2000).
Esta linha é considerada como o sítio inicial do crescimento de cristais de tecidos mineralizados
(MARSHALL & LAWLESS, 1981; KAKEI et al., 1997) e não está presente nas HA sintéticas.
Esse achado indica que a formação do cálculo pode ser regida pelos mesmos mecanismos dos
tecidos mineralizados (KAKEI et al., 2000). Também foi demonstrado que o cálculo esterelizado
pode ficar encapsulado no tecido conjuntivo sem causar inflamação acentuada (ALLEN & KERR,
1965) e que, em certas condições clínicas, mesmo sobre cálculo aderido à coroa dental pode haver
aderência do epitélio gengival (LISTGARTEN & ELLEGAARD, 1973). No tocante à adesão a
materiais não biológicos, o cálculo pode se aderir firmemente à resina acrílica (HAYASHI, 1995),
ao vidro (UYEN et al., 1989), ao amálgama de prata (HOHENWALD et al., 1987) e ao titânio
(SPEELMAN et al., 1992). Mesmo a remoção mecânica ultrasônica com instrumentos metálicos
pode não conseguir remover todo o cálculo aderido ao titânio (SPEELMAN et al., 1992). Assim, o
cálculo dental apresenta excelentes características biológicas e físicas para ser um promissor
substituto de osso.
1.4 INDUÇÃO DE DEPÓSITOS CALCIFICADOS POR LASER DE BAIXA INTENSIDADE
(LBI)
A aplicação de LBI tem sido usada para induzir a precipitação de depósitos calcificados.
GOODMAN & KAUFMANN (1977) demonstraram um crescimento de cristais de esmalte dental
após aplicação de LBI de argônio em solução com pó de esmalte e fluoreto de sódio. A formação de
depósitos calcificados (de 0,5 a 2 µm) sobre o esmalte dental após aplicação in vitro de LBI de
argônio também foi demonstrada através de MEV (WESTERMAN et al., 1996). WESTERMAN et
al (1999), também num estudo com MEV, demonstraram um aumento na formação de glóbulos
calcificados (de 2 a 3 µm) semelhantes a fluoreto de cálcio em resposta ao tratamento in vitro da
superfície radicular dental com flúor fosfato acidulado seguido de LBI de argônio. Outros estudos
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mostraram uma menor solubilidade do esmalte dental em ácido após tratamento com soluções
fluoretadas seguidas da aplicação de LBI de argônio (HICKS et al., 1995), de neodímio-YAG
(HUANG et al., 2001), de dióxido de carbono (KAKADE et al., 1996) e semicondutor (YU et al,
2001).
A formação de depósitos de cálculo dental em modelo in situ de cárie demonstradas por
SOUSA (1996) e SOUSA (2001) poderia ser estimulada por adicional aplicação de flúor e/ou de
laser de baixa intensidade, criando um modelo para formação de cerâmicas de fosfato de cálcio
firmemente aderidas contendo hidroxiapatita biológica, tendo importantes e promissoras aplicações
na Odontologia e na Medicina.
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
2.1 JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de um modelo que possa induzir a formação de cerâmicas de fosfato de
cálcio em humanos, sob a forma de cálculo dental, em condições controladas, a despeito da
tendência individual de formar tais depósitos, pode trazer inúmeros benefícios para o tratamento de
lesões cariosas, do próprio cálculo dental e para a bioestimulação óssea após procedimentos
cirúrgicos envolvendo o preenchimento de defeitos ósseos e/ou a colocação de implantes de titânio.
Assim, este projeto testará o emprego de um modelo in situ de cárie dental, que demonstrou poder
induzir a formação de cálculo, juntamente com aplicações de produtos fluoretados e laser de baixa
intensidade, que foram comprovados como potenciais indutores da deposição de compostos
calcificados.
2.2 OBJETIVOS GERAIS
Avaliar a morfologia e a composição química de cerâmicas de fosfato de cálcio firmemente
aderidas (CFCFA) ao esmalte dental formadas em modelo in situ de cárie dental na presença de
flúor.
Avaliar o efeito indutor dos lasers de argônio e de neodímio na formação de cerâmicas de
fosfato de cálcio firmemente aderidas ao esmalte dental formadas em modelo in situ de cárie dental
na presença de flúor.
2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
-
-
Partindo do princípio que lesões cariosas de esmalte serão induzidas in situ por espessos
biofilmes bacterianos em todos os espécimes inseridos nos aparelhos intrabucais, os objetivos
específicos serão:
realizar aplicações semanais de flúor gel para induzir a formação de CFCFA nos biofilmes
bacterianos;
realizar duas aplicações semanais de laser de argônio e neodímio-YAG para induzir a formação
de CFCFA nos biofilmes bacterianos;
avaliar a formação de CFCFA na superfície de lesões cariosas de esmalte dental visíveis ao
estereoscópio e quantificar o tamanho da área coberta por tais depósitos;
avaliar, em microscopia de luz polarizada, a profundidade das lesões cariosas de esmalte
produzidas, a distribuição de área positiva e negativamente birrefringentes em três meios de imersão
(ar, água e quinolina) e quantificar a birrefringência em diversas camadas dessas lesões antes e após
a remoção de depósitos solúveis em água;
analisar, ao microscópio eletrônico de varredura, a morfologia dos CFCFA na superfície das
lesões cariosas de esmalte e realizar a análise química qualitativa e semi-quantitativa desses
depósitos.
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Este projeto será submetido à avaliação pelo comitê de ética de pesquisas em seres humanos
da Universidade Federal de Pernambuco.
3.1.1 Preparação dos espécimes
Os espécimes constarão de fragmentos de esmalte dental suportados por dentina hígida de
dentes humanos permanentes não irrompidos. Estes fragmentos terão uma superfície com
dimensões de 3 mm x 3 mm, com uma espessura de esmalte de 1-1,5 mm e um suporte de dentina
hígida de 2 mm; e serão obtidos a partir dos terços cervicais de coroas de terceiros molares. Os
espécimes serão obtidos pelo corte das coroas dentais com disco diamantado em aparelhos
rotatórios refrigerados de baixa rotação. A fim de remover as coberturas orgânicas, serão limpos
com solução de hipoclocrito de sódio a 2,5% por 10 minutos em um aparelho sonicador. Em
seguida, serão autoclavados e acondicionados em solução de água destilada e timol até a inserção
nos aparelhos intra-orais.
3.1.2 Estudo de otimização da utilização do laser
Os parâmetros de utilização de laser aplicados para estimulação de depósitos calcificados
em associação com flúor têm sido aplicados diretamente no esmalte dental. Uma vez que, neste
estudo, o laser será aplicado sobre o biofilme bacteriano, é importante um estudo de otimização dos
seguintes parâmetros: densidade de energia e tempo e freqüência de aplicação. Dois tipos de laser s
serão utilizados: o laser de argônio e o de neodímio-YAG. Voluntários serão selecionados para este
estudo, de acordo com os critérios estabelecidos no item "3.1.3", aplicando os mesmos tratamentos
e duração do estudo definitivo para o período in situ. Como ponto de partida utilizaremos
parâmetros que apresentaram resultados satisfatórios em estudos anteriores, como: laser de argônio
aplicado por 10s, com uma densidade de energia da ordem de 12 J/cm2 (HICKS et al., 1995) numa
freqüência inicial de duas vezes por semana.
3.1.3 Seleção de voluntários
Cinqüenta voluntários serão selecionados para usar o aparelho palatal removível (APR)
com os espécimes de esmalte. Estes voluntários serão selecionados de acordo com os seguintes
critérios:
a) ter entre 18 e 30 anos de idade;
b) apresentar dentes posteriores superiores hígidos ou com restaurações adequadas e sem
problemas pulpares e/ ou periodontais, para que o uso do aparelho palatal de acrílico não
seja prejudicado ou venha a causar danos;
c) apresentar fluxo salivar estimulado normal, de acordo com o padrão de, no mínimo, um ml
de saliva por minuto;
d) estar em bom estado de saúde geral e não estar tomando nenhuma medicação antibiótica
e/ou antidepressiva durante o período de estudo;
e) não apresentar depósitos visíveis de cálculo dental: (l) nas faces vestibulares e oclusais de
todos os dentes; (2) nas porções visíveis das faces proximais dos dentes posteriores; (3)
nem depósitos de cálculo dental nas faces proximais dos dentes ântero-inferiores que
cubram todo espaço interproximal; e nem depósitos de cálculo dental nas faces linguais dos
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dentes ântero-inferiores que ultrapassem mais de um terço do comprimento da coroa ou que
estejam unidos a depósitos de cálculo nas faces proximais;
f) e não ter sofrido tratamento de raspagem supra ou subgengival para remoção de cálculo
dental nos últimos dois anos.
A todos os voluntários selecionados serão fornecidos dentifrícios fluoretados (com
concentrações de 1500 ppm de flúor) e colutório bucal fluoretado para bochechos diários. Cada
voluntário se submeterá a uma série de atividades, que serão a seguir descritas. Inicialmente, será
realizada a moldagem do arco superior com alginato e obtenção do modelo de trabalho com gesso
pedra. Em seguida, cada voluntário será agendado para a instalação do aparelho palatal removível
(APR).
3.1.4 Confecção do aparelho palatal removível (APR)
Sobre os modelos em gesso de cada voluntário será aplicada a resina acrílica e adaptada
manualmente para formar uma camada de cerca de três mm de espessura na região do palato.
Quando da acrilização do APR, dois pares de espécimes serão imersos na resina acrílica, ainda não
totalmente polimerizada, sendo cada par localizado em um dos lados do palato, na altura dos
primeiros molares permanentes. O APR se estenderá das faces palatais dos incisivos superiores até
a superfície distal primeiros molares superiores. Após a polimerização da resina acrílica, os
espécimes serão cobertos por tela plástica perfurada, cujas extremidades serão coladas com novas
camadas de resina acrílica, deixando um espaço de um a dois mm entre a tela e os espécimes.
3.1.5 Período in situ
Cinqüenta voluntários serão selecionados e, quando da instalação do APR, as seguintes
instruções serão dadas ao voluntário:
a) o APR deve ser usado pelo maior período de tempo possível, inclusive durante o sono,
sendo permitido removê-lo durante as refeições e os procedimentos de higiene bucal;
b) o APR deverá ser removido durante a prática de esportes que exijam esforço físico;
c) o APR pode ser higienizado, atingindo apenas as partes de acrílico. Não se deve limpar os
espécimes localizados abaixo das telas de plástico;
d) uma solução de sacarose a 50% (mesma concentração usada por SOUSA, 1996) deve ser
aplicada quatro vezes ao dia sobre os espécimes. Para tanto, cada voluntário será suprido
com um recipiente, disposto com uma tampa conta-gotas, contendo 50 ml da solução.
Durante cada aplicação, duas gotas devem ser aplicadas no espaço entre a tela de plástico e
os espécimes. A aplicação deve ser feita após o café-da-manhã, o almoço, o jantar e antes
de deitar-se;
e) e realizar bochecho com a solução de fluoreto de sódio a 0,002 % uma vez por dia com o
aparelho na boca.
O período in situ será de 21 dias. Cada espécime (total de quatro por voluntário) será
tratado de uma forma específica, que o incluirá em dos grupos abaixo:
1- sem tratamento com flúor gel e laser durante os 21 dias (controle – GC);
2-
com aplicação de flúor gel uma vez por semana e sem laser (experimental 1 – GE1);
3-
com aplicação de laser e sem flúor gel (experimental 2 – GE2);
4-
com aplicação de laser e aplicação de flúor gel uma vez por semana (experimental 3 –
GE3).
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Nenhum dos espécimes receberá qualquer tipo de limpeza durante o período in situ. As
aplicações semanais de flúor gel serão feitas com gel de fluoreto de sódio neutro aplicado
topicamente apenas sobre o espécime específico, por quatro minutos. As aplicações de laser serão
feitas segundo os parâmetros obtidos no estudo de otimização. Estas aplicações serão realizadas
com o APR fora da cavidade bucal.
Após cada intervalo de sete dias, a placa dental presente sobre cada espécime será
analisada, visualizando-se através da tela plástica, e registrada de acordo com os seguintes escores:
(0) ausência de placa dental; (1) presença de biofilme bacteriano visível ao estereomicroscópio; (2)
biofilme bacteriano visível a olho nu e (3) biofilme bacteriano ocupando todo o espaço entre a tela e
o espécime. Para análise dos escores obtidos em cada indivíduo durante o período experimental, e
também entre todos os indivíduos em cada período, será usado o teste não paramétrico de KruskalWallis.
Após o período in situ, seguir-se-á a remoção do espécime do APR. Em seguida, este será
acondicionado num recipiente com solução de água destilada e timol pH 7,0. Em seguida, as
coberturas orgânicas serão removidas pela aplicação, num aparelho sonicador, de uma solução de
hipoclorito de sódio a 2,5% por 3 h, renovada a cada 30 minutos, e em seguida por mais 3 h numa
solução de água destilada, também renovada com a mesma freqüência. No final, os espécimes serão
acondicionados em água destilada e timol.
3.2
ANÁLISE MORFOLÓGICA E QUÍMICA
3.2.1 Análise em estereomicroscópio
As amostras serão analisadas sob luz refletida em aumentos de até 100X. Cada amostra
receberá um escore de acordo com os critérios da tabela 1. A área da superfície coberta por
depósitos opacos será medida para cada amostra, utilizando-se de um software de análise de
imagem captada do estereomicroscópio.
Tabela 1. Classificação das superfícies das amostras ao estereomicroscópio
Escore
significado
0
superfície polida e brilhante e sem depósitos
1
superfície polida e brilhante e com elevações brilhantes
2
superfície polida e brilhante e com depósitos opacos
3
superfície opaca e/ou com erosões e sem depósitos
4
superfície opaca e/ou com erosões e com elevações brilhantes
5
superfície opaca e/ou com erosões e com depósitos opacos
3.2.2 Análise em microscopia de luz polarizada (MLP)
Com o objetivo de estimar a distribuição de pequenos poros (áreas negativamente
birrefringentes em água e positivamente birrefringentes em quinolina) e a perda mineral nas
diversas partes das lesões (valores da diferença entre os índices de refração dos raios ordinário e
extraordinário), as análises qualitativa e quantitativa da birrefringência serão realizadas. A
metodologia será semelhante àquela usada por THYLSTRUP et al. (1976), com uma modificação
consistindo no emprego do analisador giratório e filtro de um quarto de lambda. Até dois dias após
o fim do período in situ, uma fatia de cerca de 500 µm será removida de cada espécime com um
disco diamantado. A fatia será posteriormente desgastada manualmente com auxílio de lixas dágua
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e água até uma espessura de 80-100 µm. Os cortes produzidos serão analisados qualitativamente e
quantitativamente em microscopia de luz polarizada transmitida sob imersão em ar (índice de
refração de 1,00), água (IR de 1,33) e quinolina (IR de 1,62) em dois momentos: antes e após
lavagem em água destilada por quatro semanas (de acordo com BRUUN et al., 1983). Para as
análises em água e quinolina, os cortes ficarão imersos por 24h nos respectivos meios antes da
análise. Após análise em água, as amostras serão desidratadas em soluções alcoólicas de metileno
em concentrações de 70, 80 90 e 100%, com duração de cinco minutos cada. Após a análise com
quinolina, esta será removida com banho em solução de xilol, pH 7,0, seguido dos banhos em álcool
para permitir a segunda bateria de análises.
A análise qualitativa será realizada com emprego de filtro lambda vermelho I e com a
amostra posicionada na posição diagonal de adição. A distribuição de áreas positiva e
negativamente birrefringentes e o tamanho das lesões serão analisados para cada espécime nos três
meios de imersão.
A análise quantitativa será realizada empregando o método do analisador giratório, um
filtro de 1/4 de lambda e um filtro verde (ë = 546 nm). Neste caso serão realizadas medidas de
birrefringência em vários pontos localizados a diferentes distâncias da superfície do esmalte. A
birrefringência final de cada ponto será a média obtida de cinco medições consecutivas
(THYLSTRUP et al., 1976).
As análises serão repetidas após quatro semanas de lavagem constante com água destilada
corrente a fim de avaliar a influência dos depósitos solúveis em água.
3.2.3 Preparo para microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Os espécimes passarão, inicialmente, por um processo de desidratação, o qual consistirá em
4 banhos consecutivos com soluções de álcool em diferentes concentrações. Cada banho terá a
duração de 10 minutos, obedecendo a seguinte seqüência: álcool a 70%, álcool a 90% e dois banhos
com álcool absoluto. A desidratação a ponto crítico será realizada usando-se dióxido de carbono
líquido. Em seguida, as amostras serão fixadas em “stubs” metálicos e metalizadas com uma
camada de ouro de 10 nanômetros de espessura. Após a metalização, as amostras serão
acondicionadas num dessecador, com vácuo, até o momento da observação no MEV. Serão usadas
as fotomicrografias do estudo de SOUSA (1996) para comparação com as imagens dos depósitos de
superfície.
3.2.4 Análise espectroscópica de dispersão de energia (EDE)
Este método será usado para analisar depósitos sólidos na superfície dos espécimes,
previamente observada em MEV, para determinação de sua possível composição química. Os
espécimes serão submetidos a uma micro-sonda de raios X Edax, acoplada a um microscópio
eletrônico de varredura para análise química qualitativa e semiquantitativa deste depósito sólido.
A microanálise por raios X é feita pela emissão de elétrons que passam através de uma fina
camada de amostra, de aproximadamente 10 µm de espessura. Os átomos desta amostra liberam
raios X característicos do seu número atômico. Desta forma, o detector pode identificar e
quantificar os elementos presentes, emitindo um Espectrograma com picos característicos de cada
elemento componente da amostra e sua quantificação em peso % da composição desta camada do
espécime (GOLDSTEIN et al., 1977).
3.3
ANÁLISE DOS DADOS
Cinqüenta amostras, selecionadas ao acaso, serão tomadas para testar a variação intraindividual nas análises em estereoscópio e MLP. Essas amostras serão analisadas, para cada
microscopia, em dois momentos, com intervalo de sete dias. A variação intra-individual será
analisada com o teste estatístico Kappa.
11
Uma análise estatística será realizada a fim de determinar o grau de significância dos
resultados para o efeito dos parâmetros avaliados sobre o efeito indutor de laser de argônio e de
neodímio-YAG na formação de cerâmicas de fosfato de cálcio firmemente aderidas ao esmalte
dental formadas em modelo in situ de cárie dental na presença de flúor. Este estudo será efetuado
utilizando análise de variância (ANOVA) e testes de hipóteses paramétricos e não paramétricos
(HAUSCHKE et al., 1990). Os pontos demasiadamente afastados da reta de ajuste, correspondente
aos voluntários fora do padrão normal (outliers), serão eliminados da análise estatística dos dados.
A exclusão de voluntários no cálculo da média dos parâmetros será efetuada após estudo dos
diagramas de espalhamento (scattergram) para cada um dos parâmetros estudados para o teste e
controle.
4 INFRA-ESTRUTURA
Este trabalho será realizado nas dependências do Laboratório de Imunopatologia
Keiso Asami (LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco em colaboração com o
departamento de Física (UFPE).
5 CRONOGRAMA DE ATIVIDADES
O trabalho será desenvolvido de forma seqüenciada e sucessiva para cada fase da
metodologia proposta.
ANOS ∀
ETAPAS ?
I OBTENÇÃO DE
CRÉDITOS
II PROTOCOLO
EXPERIMENTAL
1.Obtenção de
espécimes
2. Estudo de
otimização do laser
2002
03-06 0712
X
X
2003
01-03 04- 08-12
07
0103
2004
04- 08-12
07
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
2005
01-02
12
3.
Seleção
dos
voluntários
e
confecção dos APRs
X
X
X
X
X
III ANÁLISE
MORFOLÓGICA E
QUÍMICA
X
X
1.Estudo
estereoscópio
X
X
2.Estudo em MLP
X
X
4.Período in situ
X
X
3.Estudo em MEV e
análise química
X
IV ANÁLISE DE
DADOS
X
V ELABORAÇÃO
E DEFESA DE
TESE
X
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