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Curso: Análises Clínicas
Disciplina: Bioquímica Clínica
Módulo: II
Aula 02 – Técnicas de Medição
Técnicas de Medição ....................................................................................................................... 2
Medição de Volumes .................................................................................................................... 2
Medição volumes de sólidos ..................................................................................................... 2
Medição de temperaturas ......................................................................................................... 4
Medição de massas .................................................................................................................. 4
Medição volumes de líquidos.................................................................................................... 5
Erros associados à posição incorreta do observador. ........................................................... 6
Pipetas .................................................................................................................................. 8
Pipetas de vidro ................................................................................................................. 8
Técnicas de pipetagem (pipetas de vidro) ......................................................................... 9
Pipetas automáticas ........................................................................................................ 10
Verificação de Desempenho Padrão de Pipetas Automáticas: .................................... 11
Bibliografia Recomendada ............................................................................................................. 12
Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini
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Módulo: II
Técnicas de Medição
Medição de Volumes
A técnica de medição do volume de uma amostra depende do estado físico da amostra
(líquido ou sólido) e da sua forma (regular ou irregular).
Os resultados obtidos podem ser expressos em unidades do Sistema
istema Internacional (SI):
metro cúbico (m³), ou em unidades submúltiplas deste, que é o caso mais frequente.
Normalmente, as unidades submúltiplas mais usadas são o mililitro (mL),
(mL), ou centímetro cúbico
cú
(cm³), e o litro (L),
), ou o decímetro cúbico (dm³).
Medição volumes de sólidos
A técnica para medir o volume de um composto sólido depende da sua forma: regular ou
irregular. Se o composto for um sólido de forma regular (cubo, esfera, paralelepípedo, pirâmide,
etc.) medem-se
se os comprimentos necessários a aplicam-se
aplicam se as fórmulas que permitem calcular os
respectivos volumes.
A
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Módulo: II
B
C
Sólido em formato de cruz é formado por 5 cubos
idênticos.
Cada aresta mede 2,0m.
Volume de cada cubo = 2,0³ 2,0 x 2,0 x 2,0
Volume de cada cubo = 8m²
Volume d o sólido figura = Σ volume 5 cubos
D
Volume do sólido = 5x8 = 40 m³
Figura 01. Volume de sólidos: A) Sólidos de diferentes formatos e as fórmulas para calcular o
volume, B) Volume do cubo, C) Volume
olume da pirâmide, D) Volume de um sólido em formato de cruz.
cruz
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Módulo: II
Medição de temperaturas
Na medição de temperaturas usam-se
usam se termômetros, em geral de mercúrio, graduados,
normalmente, em graus Celsius (˚˚ C).
Antes de se fazer qualquer leitura, deve estudar-se
se a escala do termômetro utilizado, de
modo a evitar erros, e deve verificar-se
verificar se o seu alcance está adequado à temperatura a medir.
Figura 02:: Comparação entre as escalas de temperatura.
Exemplo 1: Qual a temperatura do corpo humano em oF?
(TC/5) = [(TF-32)/9] 37/5 = [(TF-32)/9]
[(TF
TF-32 = (37/5) x 9 TF = [(37/5)
(37/5) x 9 ]+32 = 98,6oF
Exemplo 2: Ao tomar a temperatura de um paciente, um médico só dispunha de um termômetro
graduado na escala Fahrenheit. Se o paciente estava com febre de 42oC,, qual a leitura feita pelo
médico no termômetro por ele utilizado?
(TC/5) = [(TF-32)/9] 42/5
/5 = [(TF-32)/9]
[(TF
TF-32 = (42/5) x 9 TF = [(42
42/5) x 9] + 32 = 107,6 oF
Exemplo 3: A temperatura ideal da cerveja é em torno de 4 oC,, antes de beber. Se dispomos
apenas de um termômetro com escala Kelvin, qual a temperatura correspondente ao mesmo
estado térmico da cerveja ideal?
(TC/5) =[(T-273)/5] (4/5) =[(T-273)/5]
273)/5] T = [(4/5)x5]+273 T = 277K
Medição de massas
Medir a massa de uma amostra é uma operação de “pesagem”.
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O instrumento necessário para essa operação é a balança, que está geralmente graduada
em grama (g), unidade submúltipla do quilograma (kg). Existem vários tipos de balanças, com
alcance e sensibilidade diversas.
O alcance é o valor máximo que é possível medir utilizando a balança; a sensibilidade é o
valor da menor divisão da sua escala.
Após a seleção da balança, pesa-se a amostra com os seguintes cuidados:
•
Não colocar a amostra diretamente sobre o prato da balança, mas, sim dentro de um
recipiente limpo e seco que pode ser um vidro de relógio, um copo de precipitação ou até
um simples papel de filtro. Estes recipientes devem estar à temperatura ambiente;
•
Evitar derrame de líquidos ou reagentes sólidos sobre o prato da balança.
Figura 03. Cartoon cômico sobre a utilização da balança
para pesagem de mulheres.
Medição volumes de líquidos
Para medir volumes de líquidos usam-se diversos instrumentos (Tabela 01):
•
Para medições rigorosas: pipetas, buretas ou balões volumétricos.
•
Para medições menos rigorosas: provetas.
Qualquer um destes instrumentos tem inscritas algumas informações importantes, tais como:
•
Volume máximo (capacidade);
•
Graduação da sua escala, normalmente em mililitros;
•
Tolerância (limite máximo do erro);
•
Traço de referência, no caso de pipetas ou balões volumétricos;
•
Temperatura de calibração (temperatura a que deve ser feita a medição e que é,
normalmente, 20˚C).
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Erros associados à posição incorreta do observador.
A leitura deverá ser feita de modo a que a direção
direção do olhar coincida com a linha tangente à
parte interna do menisco se este for côncavo (ex: água), ou à parte externa do menisco se este
for convexo (ex: mercúrio).
Figura 04.. Modo de leitura volumétrica de um
líquido. A direção do olhar coincida com a linha
tangente à:
• parte interna do menisco côncavo
• parte externa do menisco convexo
medi volumes líquidos
Tabela 01. Principais instrumentos para medir
Instrumento
Imagem
Características
1) Pipetas Graduadas
Escala graduada (mL)
2) Pipetas Volumétricas
Há um traço de referência na parte
superior, indicador do nível a que deve
Dão medidas rigorosas
(exa
exatas) do volume de
líquidos.
ficar o líquido, para que o volume medido
seja o que está assinalado na pipeta.
1. Lava-se a pipeta com água deionizada e, em seguida, com um pouco do líquido a medir.
2. Mergulha-se
se a extremidade da pipeta no líquido a medir e, com um pipetador ou pêra, aspirase o líquido até ligeiramente acima do nível do volume pretendido, com a pipeta
pi
sempre na
posição vertical;
3. Deixa-se
se cair o excesso de líquido até o nível pretendido, pressionando pipetador ou pêra;
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4. Deixa-se, finalmente, escoar o líquido para o recipiente de recolha, com a extremidade da
pipeta encostada à parede do recipiente, pressionando do mesmo modo pipetador ou pêra.
Dão medidas rigorosas de
Buretas
Escala graduada, normalmente, em mL.
volumes de líquidos.
Na extremidade inferior têm
uma torneira que permite
controlar a quantidade de
liquido.
1. Lava-se a bureta duas vezes, com um pouco do liquido a medir, rodando a bureta quase
horizontalmente.
2. Prende-se a bureta num suporte.
3. Com o auxilio de um funil enche-se a bureta até um pouco a cima do nível desejado.
4. Deixa-se escoar o liquido em excesso, garantindo a eliminação de bolhas de ar que possam
existir ao longo da bureta.
5. Faz-se a leitura do nível inicial do líquido (Vi).
6. Para os destros, com a mão esquerda controla-se a torneira que permite o líquido a escoar,
para um recipiente de recolha, em geral um erlenmeyer, enquanto que com a mão direita se
agita esse recipiente, caso não acha agitador magnético.
7. Faz-se a leitura final do líquido (Vf). O volume do líquido escoado será V= Vf-Vi
Balões volumétricos
Dão medidas exatas do
Há um traço de referência na zona tubular,
volume de soluções.
o colo do balão, indicativo do nível a que
Usam-se na preparação de
deve ficar o líquido a medir, para que
soluções a partir da
tenha o volume correspondente à
dissolução de sólidos ou
capacidade do balão.
na diluição de soluções de
concentração conhecida.
1. Na preparação de soluções de soluções a partir de sólidos diluem-se os sólidos num pouco de
água deionizada num copo de precipitação.
2. Aguarda-se que a solução fique à temperatura ambiente e só depois se transfere para o balão
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com a ajuda de um funil e de uma vareta.
3. Lava-se o copo de precipitação mais uma ou duas vezes com um pouco de água deionizada
que será transferida para o balão do mesmo modo.
4. Por fim enche-se o balão cuidadosamente até o traço de referência, com o auxilio de um contagotas.
5. Tapa-se o balão e inverte-se (agita-se) para homogeneizar a solução.
Provetas
Dão medidas pouco rigorosas
Normalmente, graduadas em mL.
de volumes de líquidos.
1. Após a medição do volume do líquido, escoa-se o líquido pela parede da proveta, lentamente,
com a ajuda de um bastão de vidro.
2. A quantidade de líquido vertida é inferior à leitura efetuada, pois fica sempre um pouco de
líquido aderido à parede da proveta.
Pipetas
Pipetas de vidro
Dentre deste tipo de pipetas devemos diferenciar entre as pipetas volumétricas e as
pipetas graduadas.
•
Pipetas Volumétricas: permitem pipetar um volume único de líquido.
•
Pipetas Graduadas: permitem a pipetagem de diferentes volumes.
Ainda deve ser reconhecida uma diferença importante: as pipetas (seja de um tipo ou de
outro) possuem uma ou duas listras no extremo superior. A existência de duas listras significa
que quando o liquido é despejado, o que restar dentro da pipeta não deve ser extraído (ou
soprado). Caso a pipeta apresente apenas uma lista, o líquido que restar, deve ser extraído (ou
soprado).
É importante neste ponto considerar que diferentes tipos de soluções podem ter distintas
viscosidades e/ou tensão superficial, com o qual um especial cuidado deve ser tomado quando se
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pipeta um líquido viscoso com uma pipeta de duas listras. Se o liquido é despejado muito
rapidamente, a tendência será a que fique maior quantidade deste líquido no interior da pipeta,
com o qual o volume pipetado será menor ao valor nominal. Uma pipetagem prévia do líquido é
aconselhável para minimizar problemas de tensão superficial.
Figura 05. 1) Pipeta graduada com uma lista, quando o liquido é
despejado, o que restar dentro da pipeta deve ser extraído (ou
soprado); B) Pipeta Volumétrica com duas listas, quando o liquido é
despejado, o que restar dentro da pipeta não deve ser extraído (ou
soprado).
Técnicas de pipetagem (pipetas de vidro)
1. Segura-se a pipeta entre o polegar e os 3 últimos dedos da mão.
2. Coloca-se a pipeta no líquido (bem abaixo de sua superfície) e aspira-se cuidadosamente até
que a coluna do líquido esteja um pouco acima da marca superior (a aspiração deve ser feita
com pêras de aspiração ou pipetadores automáticos).
3. Fecha-se a abertura com o dedo indicador e retira-se a pipeta da solução. Deixando entrar um
pouco de ar vagarosamente pela extremidade superior (controlar com o dedo indicador),
permite-se escorrer a coluna de líquido até a coluna atingir a marca superior (mantendo em
posição vertical e a marca ao nível dos olhos).
4. Remove-se então o líquido aderente a parede externa da pipeta por um papel absorvente.
5. Em seguida, coloca-se a ponta da pipeta junto à parede interna do tubo receptor, deixando
escoar lentamente o conteúdo da pipeta até o nível desejado. No escoamento completo é
importante remover a última gota encostando a pipeta na parede do tubo.
Recomendações:
-
Ao pipetar soluções cujo frasco contém depósito de soluto, introduzir a pipeta no
sobrenadante.
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-
Nunca introduzir pipetas sujas em frascos que contenham soluções ou reativos químicos
puros.
-
Deve-se sempre usar pipetas secas para não diluir o líquido.
Pipetas automáticas
As pipetas automáticas têm como vantagem a rapidez de uso. Cuidados especiais, porém,
devem ser considerados. Toda pipeta automática tem dois estágios no seu êmbolo. No momento
de sugar o líquido, o êmbolo deve ser colocado no primeiro estágio. Para expulsar o líquido das
ponteiras, o êmbolo tem que ser levado ao segundo estágio. Vários pontos devem ser
cuidadosamente verificados:
a. Nunca sugar um líquido ou solução colocando o êmbolo no segundo estágio. Se for
assim, o volume pipetado será maior do que o valor nominal.
b. Quando selecionar o volume, verificar que o volume escolhido esteja dentro da baixa de
volumes da pipeta automática a ser utilizada. Ou seja, se uma pipeta tem uma faixa de volumes
que vai de 200 a 1000 µl, sob nenhuma circunstância deve ser pipetado um volume de – por
exemplo- 1100 µl.
Na verdade, a escolha da pipeta adequada depende do volume que se deseja pipetar e da
faixa de volumes na qual cada pipeta trabalha. Exemplo: num laboratório tem 2 pipetas
automáticas. A pipeta A, tem uma faixa de volumes de 10 a 40 µl e a pipeta B tem uma faixa de
volumes de 20 a 100 µl (Figura 2a). Se fosse necessário pipetar 40 µl, a escolha certa seria a
pipeta B, devido a que o volume deseja não fica num dos extremos da faixa de trabalho da pipeta.
c. Especiais cuidados devem ser levados em consideração quando a solução que se quer
pipetar é cáustica (um ácido ou uma base forte, por exemplo). Neste caso qualquer gota do
liquido (ou ainda o vapor do composto) que fique dentro da pipeta pode danificar seriamente o
instrumental. Uma solução muito simples é colocar um pedaço de algodão dentro da ponteira,
verificando que não seja atingida pelo líquido no momento de sugar. O algodão absorverá
qualquer respingo que houver, impedindo que o líquido fique no interior da pipeta (Figura 2b).
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(a)
20 - 100 µl
40 µl
Faixas
Volume
selecionado
Botão
volumes
que
podem
ser
pipetados
para
selecionar
Ponteira
de
o
volume
(b)
20 - 100 µl
40 µl
Ponteira
Faixas
Volume
selecionado
Botão
volumes
que
podem
ser
Algodão
pipetados
para
selecionar
de
o
volume
Figura 06. Esquema indica como utilizar pipetas automáticas.
Verificação de Desempenho Padrão de Pipetas Automáticas:
Exatidão (Erro Médio ou Erro Sistemático): diferença entre o volume dispensado e o
volume nominal ou o volume selecionado na pipeta.
Calibração (Ajuste): conjunto de operações que estabelecem a relação entre o volume
dispensado e o volume nominal ou selecionado correspondente na pipeta.
Volume morto de ar: nas pipetas de deslocamento de ar, é o volume de ar entre a parte
inferior do pistão e a superfície do líquido.
Taxa de evaporação: estimativa da perda de água causada pela evaporação durante o
processo de pesagem.
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Análise gravimétrica: procedimento geral baseado na determinação da massa das
alíquotas de água dispensadas por uma pipeta. Os valores são corrigidos com relação à perda
por evaporação, e então, a massa real e o volume são calculados, com base na densidade da
água em temperaturas específicas com correções para a pressão atmosférica do local (fator Z).
Volume Nominal: maior volume selecionável pelo usuário e especificado pela Gilson.
Nota: isto significa que, para uma pipeta de volume variável com uma faixa de volume útil de 10µl
a 100µl, o seu volume nominal é 100µl.
Volume selecionado: volume ajustado pelo usuário, para a dispensa do volume escolhido
dentro da faixa de volume útil.
Nota: para as pipetas e volume fixo, o volume selecionado é igual ao volume nominal.
Precisão (Erro Aleatório): dispersão dos volumes dispensados ao redor da média dos
volumes dispensados. Também conhecida (de acordo com o contexto) como desvio padrão,
reprodutibilidade ou repetibilidade.
Repetibilidade: é a dispersão entre os resultados de medidas sucessivas (realizadas em
um curto espaço de tempo), onde não há alteração dos parâmetros nem das condições.
Reprodutibilidade: é a dispersão entre os resultados de medidas realizadas em condições
diferentes (local ou operador diferente), mantendo todos os parâmetros constantes.
Especificações Volumétricas (Erros Máximos Admissíveis): são os extremos
permitidos (superior e inferior) para o desvio entre o volume dispensado e o volume nominal ou o
volume selecionado.
Faixa de volume útil: parte do volume nominal que pode ser dispensado, dentro do erro
máximo especificado na Norma Internacional ISO/ DIS 8655. O valor superior da faixa de volume
útil é sempre o volume nominal. O valor inferior é 10% do volume nominal, se não estiver
especificado de forma diferente pelo fabricante.
Recalibração (ajuste feito pelo operador): é um procedimento que pode ser executado
pelo usuário final, para garantir que a pipeta opere conforme as especificações publicadas.
Bibliografia Recomendada
Manual de operação da Pipetman P, disponível no blog
Pipetman, Inspeção em dois minutos, disponível no blog
Procedimento simplificado para verificação da performance das pipetas Gilson, disponível no blog
Procedimento para verificação da performance das pipetas Gilson, disponível no blog
Blog: http://marilandabellini.wordpress.com
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