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Carina Torres Garruth Ferreira NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS PARA INCLUSÃO DE COMPOSTOS DE ORIGEM NATURAL Monografia apresentada como parte dos requisitos necessários para a conclusão do Curso de Graduação em Farmácia. Orientadora: Prof. Mestre Ana Ferreira Ribeiro IFRJ – Campus Realengo - RJ 2013 Carina Torres Garruth Ferreira NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS PARA INCLUSÃO DE COMPOSTOS DE ORIGEM NATURAL Monografia apresentada como parte dos requisitos necessários para a conclusão do Curso de Graduação em Farmácia. Aprovada em _____ de _______________ de 2013. Conceito: ____________ (___________________). Banca Examinadora ______________________________________________ Prof. Mestre Ana Ferreira Ribeiro (Orientadora/IFRJ) ______________________________________________ Prof. Doutor Luiz Cláudio Rodrigues Pereira da Silva (UFRJ) ______________________________________________ Prof. Mestre Raquel Rennó Braga (IFRJ) ______________________________________________ Prof. Doutora Paula de Miranda Costa Maciel (IFRJ) IFRJ – Campus Realengo - RJ 2013 AGRADECIMENTOS À Deus. À minha família, que está sempre ao meu lado apoiando e estimulando. Agradeço especialmente à minha mãe Carla, cujo empenho, cuidado, carinho e compreensão foram fundamentais em todos os aspectos da minha vida. À Ana, minha querida orientadora. Obrigada por toda paciência e dedicação posta não só para a realização deste trabalho, mas que vem apresentando desde aquele domingo lá no Fundão. Aos professores, por todo conhecimento. Aos meus colegas de turma, que estiveram comigo durante este percurso e tornaram esses anos divertidíssimos. Aos meus amigos, Juliana, Letícia, Suzana, e Ygor, que foram presentes que recebi durante a graduação. Obrigada pela parceria, risadas, incentivo e por ouvirem, pacientemente, minhas lamentações. Por fim, agradeço a todos que, mesmo que não citados, contribuíram de maneira direta ou indireta para a realização desta trajetória. FERREIRA, C. G. T. Nanopartículas poliméricas para inclusão de compostos de origem natural. 41 f. Trabalho de Conclusão de Curso. Curso de Graduação em Farmácia, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Campus Realengo, Rio de Janeiro, RJ, 2013. RESUMO As nanopartículas poliméricas têm sido amplamente utilizadas para a veiculação de fármacos, visto que proporcionam diversas vantagens, como a vetorização e o aumento de solubilidade de substâncias ativas. Em contrapartida, os compostos de origem natural são utilizados desde os primórdios da civilização e vêm garantindo mais espaço no campo científico devido, principalmente, ao potencial destas substâncias e ao seu baixo custo. Diversos fatores, entre eles o método de obtenção, o tipo de polímero e a característica química do ativo, podem influenciar nas propriedades físicas e químicas dos sistemas nanoparticulados. Por outro lado, produtos naturais, em especial extratos, podem apresentar composição complexa, dificultando o desenvolvimento das formulações nanoparticuladas. Dessa maneira, esta revisão discute sobre a atual situação das nanopartículas poliméricas carreadoras de compostos naturais, com o objetivo de fornecer aos pesquisadores dados úteis no desenvolvimento de novas formulações nanoparticuladas contendo compostos naturais. Assim, o tema foi abordado tratando da influência dos métodos de obtenção e polímeros sobre as partículas, bem como as principais aplicações encontradas para estas formulações. Além disso, foi exibida breve comparação da frequência de uso de extratos e ativos isolados e também de ensaios in vitro e in vivo. Palavras-chave: Nanopartículas poliméricas, extratos vegetais, compostos naturais. FERREIRA, C. G. T. Nanopartículas poliméricas para inclusão de compostos de origem natural. 41 f. Trabalho de Conclusão de Curso. Curso de Graduação em Farmácia, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Campus Realengo, Rio de Janeiro, RJ, 2013. ABSTRACT Polymeric nanoparticles have been widely used for drug delivery, since they provide several advantages, such as improve drug solubility and the ability to target active substances to specific sites in the body. In contrast, natural compounds have been used since the dawn of civilization and have reached more space in the scientific field, mainly due to the potential for these substances and their low cost. Several factors, including the preparation methods, the polymer type and chemical characteristic of the active principles, may influence the physical and chemical properties of nanoparticle systems. On the other hand, natural products, especially extracts, may have complex composition, hampering the development of nanoparticle formulations. Thus, this review outlines the current situation of polymeric nanoparticles loaded with natural compounds, so as to provide useful information for researchers to develop new nanoparticle formulations containing natural products. In this way, the issue was addressed by discussing the influence of methods and polymers on the nanoparticles properties, as well as presenting the major applications found for these formulations. Furthermore, it was shown a brief comparison between the frequency of use of extracts and isolated natural substances and also in vitro and in vivo studies. Palavras-chave: Polymeric nanoparticles, extracts, natural compounds. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 7 2 OBJETIVOS 11 2.1 OBJETIVO GERAL 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 11 11 3 METODOLOGIA 12 4 NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS 13 4.1 MÉTODOS DE OBTENÇÃO 4.2 POLÍMEROS 13 15 5 NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS CONTENDO COMPOSTOS NATURAIS 17 5.1 PRINCIPAIS PUBLICAÇÕES NA ÚLTIMA DÉCADA 5.2 INFLUÊNCIA DO MÉTODO NAS CARACTERÍSTICAS DAS NANOPARTÍCULAS 5.3 INFLUÊNCIA DO POLÍMERO NAS CARACTERÍSTICAS DAS NANOPARTÍCULAS 5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE E APLICAÇÕES 17 20 26 30 CONCLUSÃO 33 REFERÊNCIAS 35 7 1 INTRODUÇÃO O termo nanotecnologia está relacionado ao desenvolvimento e uso de materiais e sistemas em nanoescala, isto é, 1 a 1000 nanômetros. Trata-se de um campo em ascensão, o qual une conhecimento de diversas áreas e possui ampla aplicabilidade, contribuindo para o progresso na medicina, física, química, engenharia e nos mais diversos setores (BHARALI et al., 2011; SAFARI & ZANEAR, 2013). Os principais tipos de nanossistema usados com a finalidade de veicular substâncias ativas são: lipossomas, dendrímeros, nanopartículas poliméricas, nanopartículas lipídicas, nanopartículas metálicas e nanotubos de carbono (LETCHFORD & BURT, 2007). Contudo, as nanopartículas poliméricas são frequentemente empregadas nas pesquisas, pois apresentam elevada estabilidade no organismo e também quando armazenadas por longo tempo. Além disso, sua principal matéria-prima é de fácil obtenção, os processos de produção são relativamente simples, é possível a utilização de matrizes biocompatíveis e biodegradáveis e há grande variedade de polímeros. Estes últimos possuem características físico-químicas bem diversificadas, permitindo a formação de sistemas com diferentes velocidades de degradação e controle de liberação no organismo (SCHAFFAZICK et al., 2003). As nanopartículas poliméricas são elaboradas a partir de polímeros que podem ter origem natural ou sintética. Entre os principais polímeros sintéticos empregados na obtenção de nanopartículas podemos mencionar a PCL (policaprolactona), o PLGA (ácido poli láctico-co-glicólico) e o PLA (ácido poli láctico). A quitosana é um polissacarídeo que também vem sendo bastante utilizado na preparação de sistemas nanoparticulados, devido à sua origem natural e sua capacidade mucoadesiva. Todos estes polímeros apresentam como principal vantagem o fato de serem biocompatíveis e biodegradáveis, reduzindo os impactos da formulação no organismo (VAUTHIER & BOUCHEMAL, 2009; KUMARI, YADAV e YADAV, 2010; PLAPIED et al., 2011). Os sistemas nanoparticulados poliméricos podem ser classificados quanto ao tipo de estrutura (Figura 1), sendo assim divididos em nanocápsulas e nanoesferas (KUMARI, YADAV e YADAV, 2010). As nanoesferas são maciças e o 8 ativo geralmente encontra-se disperso de maneira homogênea na partícula. No entanto, o ativo pode estar aderido somente à superfície (RAO & GECKELER, 2011). Já nas nanocápsulas, o polímero está presente somente na membrana, que forma um núcleo reservatório, onde o ativo pode estar na forma sólida, líquida ou em dispersão molecular. Da mesma forma que nas nanoesferas, há possibilidade do ativo apresentar-se adsorvido na membrana polimérica (KUMARI, YADAV e YADAV, 2010). Figura 1. Estrutura das nanopartículas poliméricas. O tipo de nanopartícula e o local em que o ativo estará (adsorvido na superfície ou não) dependerão do método de obtenção e da característica do ativo. Os métodos de preparo de nanopartículas poliméricas podem ser classificados em dois grandes grupos: técnicas que realizam a dispersão de polímeros pré-formados e técnicas de polimerização de monômeros. Todavia, os métodos mais comumente aplicados são os que fazem uso dos polímeros préformados. Neste grupo há diversas técnicas, mas as que se destacam são as que utilizam polímeros sintéticos, tais como emulsificação-evaporação do solvente, emulsificação-difusão do solvente, salting-out e nanoprecipitação (REIS et al., 9 2006; RAO & GECKELER, 2011), já para polímeros naturais geralmente são aplicados os métodos de coacervação e gelificação iônica (REIS et al., 2006). Na área farmacêutica, a nanotecnologia é mais utilizada para a veiculação de fármacos, pois agrega vantagens como a possibilidade de evitar a destruição do ativo no trato gastrointestinal, no caso de administração oral (PLAPIED, et al., 2011), e aumentar a estabilidade frente a fatores ambientais, já que promove proteção contra oxigênio, umidade, luz, entre outros (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). Além disso, dependendo da matriz polimérica utilizada, possibilita o aumento da solubilidade dos ativos e pode proporcionar uma liberação prolongada, diminuindo a flutuação de dose e a frequência de administração, devido ao aumento do tempo de efeito terapêutico, o que consequentemente facilita a adesão do paciente ao tratamento. Outra vantagem diz respeito à vetorização das substâncias ativas, que evita sua dispersão para tecidos que não sejam o alvo, assim permitindo o uso de doses adequadas e minimizando os efeitos colaterais (LIN TAN, CHOONG e DASS, 2010; MORAHUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). Por outro lado, a utilização de produtos naturais para o tratamento de doenças é um recurso frequentemente empregado, principalmente em países subdesenvolvidos, pois, quando comparados aos tratamentos tradicionais, os produtos de origem natural apresentam maior aceitação pelos pacientes e custos mais baixos (VEIGA JR, PINTO e MACIEL, 2005). Além disso, muitas indústrias farmacêuticas utilizam ativos isolados de plantas, extratos ou até mesmo as usam como inspiração para o desenvolvimento de novas moléculas (VIEGAS JR, BOLZANI e BARREIRO, 2006), o que ocorre por possuírem excelente potencial terapêutico (SARAF, 2010). Considerando as propriedades terapêuticas dos produtos naturais e as diversas vantagens proporcionadas pelos sistemas nanoparticulados, muitos estudos mencionando o desenvolvimento de nanopartículas carreadoras de compostos naturais vêm sendo publicados, boa parte deles empregando nanopartículas poliméricas. Um expressivo número de publicações abordando a inclusão de ativos naturais com propriedades antitumorais em sistemas nanoparticulados pode ser observado (BHARALI et al., 2011; SANNA et al., 2013), já que a vetorização destes compostos para os tecidos tumorais 10 proporciona comprovada potencialização do efeito antitumoral, tanto in vitro (NAIR et al., 2012) quanto in vivo (CIRPANLI et al., 2011). Além disto, a nanotecnologia possibilita o aumento da biodisponibilidade de compostos hidrofóbicos, como foi observado com a curcumina, que teve sua solubilidade melhorada através da inclusão em nanopartículas poliméricas (YEN et al., 2010). Diante de tantas vantagens obtidas ao se utilizar nanopartículas poliméricas para a veiculação de substâncias naturais, está havendo um avanço neste campo e muitas pesquisas estão sendo realizadas utilizando este tipo de tecnologia na área farmacêutica (BHARALI et al., 2011; SANNA et al., 2013). No entanto, diversos parâmetros devem ser considerados durante o desenvolvimento de sistemas nanoparticulados, principalmente quando se deseja otimizar as formulações obtidas com relação a propriedades como eficiência de inclusão, tamanho e perfil de liberação. A escolha de um método de obtenção e de um polímero é diretamente influenciada por fatores como as características físicoquímicas do composto a ser incluso, o tecido alvo, a via de administração utilizada, o tipo de liberação desejada, entre outros (REIS et al., 2006; RAO & GECKELER, 2011). Produtos naturais, principalmente quando na forma de extratos, apresentam característica complexa e a inclusão pode envolver uma mistura de diversos componentes, dificultando o desenvolvimento da formulação (RIBEIRO et al., 2013). O conhecimento das características dos sistemas nanoparticulados obtidos até então pode auxiliar o pesquisador, possibilitando o direcionamento do estudo a ser realizado. Assim, este trabalho visa a facilitação da construção de futuros projetos de pesquisa, trazendo informações não só sobre polímeros e métodos de obtenção, mas também sobre as principais aplicações das formulações, suas propriedades físico-químicas, se são feitos testes in vivo e in vitro, em suma, um resumo da atual situação em relação ao desenvolvimento de formulações de nanopartículas poliméricas contendo substâncias naturais. 11 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Realizar levantamento bibliográfico e análise crítica de publicações dos últimos 10 anos que abordam o desenvolvimento de nanopartículas poliméricas contendo compostos de origem natural. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Verificar se está havendo aumento das publicações ao longo dos últimos 10 anos e a extensão deste aumento; Relacionar polímeros e métodos de obtenção utilizados na preparação das formulações desenvolvidas, comparando-as com relação à eficiência de inclusão e tamanho de partícula; Verificar a proporção de artigos que empregam ativos isolados ou extratos, avaliando comparativamente suas características propriedades; Verificar se há ampla utilização de testes in vitro (células) e in vivo; Verificar quais são as principais aplicações das formulações. e 12 3 METODOLOGIA A pesquisa foi realizada na base de dados da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), nos seguintes sites: National Center for Biotechnology Information (NCBI), Science Direct, Scientific Electronic Library Online (Scielo) e Scirus. As palavras-chaves utilizadas foram: nanoparticle, polymeric nanoparticle, polymers, natural products, plant extract, herbal drug, herbal medicine, medicinal plant, review, PLGA, PCL, PLA, chitosan, quitosana e eudragit. Estas palavras-chaves foram usadas em diferentes combinações de duas ou três palavras a fim de ampliar a pesquisa, sendo que só foram utilizados artigos a partir do ano de 2003. Para o processamento dos resultados foram utilizados tabelas e gráficos. As tabelas foram usadas para relacionar o ativo ou extrato com o método e o polímero utilizados para a obtenção das nanopartículas. Foi realizada análise crítica comparativa entre as formulações mencionadas nas diferentes publicações, com relação a diferentes informações, tais como porcentual de inclusão, tamanho de partícula, realização de testes in vitro ou in vivo, entre outros. Gráficos de coluna, pizza e ação foram empregados para facilitar a visualização das comparações realizadas no corpo do trabalho. 13 4 NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS As nanopartículas poliméricas possuem diversas aplicabilidades e as substâncias nelas inclusas podem exprimir características variadas, interferindo na escolha do tipo de estrutura que a partícula deve apresentar. Consequentemente, o método de síntese dessas partículas e o polímero apropriado também diferem de acordo com estas informações sobre o ativo (KUMARI, YADAV e YADAV, 2010). No entanto, o polímero e as técnicas de obtenção influenciam não só estruturalmente, mas também atuam sobre as propriedades físico-químicas das partículas, a eficiência de inclusão e a cinética de liberação do ativo (TRIERWEILER, 2009). 4.1 MÉTODOS DE OBTENÇÃO Existem métodos de obtenção de nanopartículas poliméricas onde se executa a polimerização de monômeros (polimerização in situ), onde os polímeros são formados simultaneamente às nanopartículas, e métodos que trabalham com a dispersão de polímeros pré-formados, sendo estes últimos os mais comumente utilizados (REIS et al., 2006; RAO & GECKELER, 2011). Um dos métodos mais empregados para a obtenção de nanopartículas a partir de polímeros pré-formados é a emulsificação-evaporação do solvente, a qual ocorre em duas etapas. Na primeira, ocorre a homogeneização, sob alta agitação, de duas fases imiscíveis, sendo estas a fase aquosa, que contem um tensoativo disperso e a fase orgânica, composta pelo ativo e o polímero dissolvidos em solvente orgânico, dando origem, então, a uma emulsão O/A. A evaporação do solvente orgânico confere a segunda etapa, realizada geralmente por rota-evaporação. Dessa maneira, é promovida a precipitação do polímero contido na fase interna da emulsão, formando nanoesferas, que se apresentam em suspensão. Devido às características da emulsão formada, esta técnica é 14 mais indicada para ativos com características lipofílicas (RAO & GECKELER, 2011). A dupla emulsificação-evaporação do solvente é realizada de maneira parecida, mas em três fases, duas emulsificações e a evaporação. Ou seja, na segunda etapa, a fase dispersa é uma emulsão A/O, dando origem a uma emulsão A/O/A. Ao final de todo o processo, são obtidas nanocápsulas constituídas por um núcleo aquoso contendo ativos de característica hidrofílica (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). Já a nanoprecipitação, também conhecida como método por deslocamento do solvente, é considerada uma das técnicas mais simples, econômica, reprodutível e rápida (VAUTHIER & BOUCHEMAL, 2009). Para sua realização, o solvente orgânico deve ser miscível em água. A fase orgânica, onde se encontra o polímero dissolvido, deve ser vertida sobre a aquosa. Assim, com o sistema sob agitação magnética, o polímero, insolúvel na fase aquosa, precipita quando o solvente orgânico se mistura à água, dando origem às nanopartículas (TRIERWEILER, 2009; MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). Os métodos salting-out e emulsificação-difusão do solvente são bem parecidos. No salting-out, o solvente orgânico deve ser miscível em água, como a acetona (REIS et al., 2006). Porém, na emulsificação-difusão do solvente, o solvente orgânico deve ser parcialmente hidromiscível como, por exemplo, álcool benzílico (SOUTO, SEVERINO e SANTANA, 2012). Dessa maneira, o polímero e o ativo devem ser solubilizados neste solvente. Na fase aquosa, em ambas as técnicas, deve conter um tensoativo para estabilizar a emulsão. Porém, no saltingout, além disso, esta fase também deve se apresentar saturada com eletrólito, como cloreto de magnésio, ou não-eletrólito, como, por exemplo, a sacarose. Posteriormente, a emulsão é diluída em quantidade suficiente de água que permita a difusão do solvente orgânico para essa fase externa, fazendo com que o polímero precipite e forme nanoesferas. Com esta técnica, ativos lipofílicos tendem a apresentar maior percentual de inclusão do que ativos hidrofílicos (REIS et al.,2006; SOUTO, SEVERINO e SANTANA, 2012). Para obtenção de nanocápsulas através destes métodos, é possível realizar a dissolução do ativo lipofílico num óleo, que deve ser adicionado ao solvente orgânico (SOUTO, SEVERINO e SANTANA, 2012). 15 Na coacervação, procedimento também chamado de complexação de polieletrólitos, utiliza-se dois ou mais polímeros hidrofílicos e com cargas opostas. Dessa forma, as frações aquosas e seus respectivos polímeros são homogeneizados sob forte agitação, que pode ser ultrassônica ou mecânica, para que haja interação eletrostática. Geralmente, são usados polímeros de origem natural, como os polissacarídeos quitosana (carga positiva) e condroitina (carga negativa), por exemplo (MOHANRAJ & CHEN, 2006; MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). De maneira similar é feita a gelificação iônica, onde duas fases aquosas são misturadas, todavia é necessário somente um polímero. Portanto, é empregada uma solução com o polímero catiônico e outra solução com tripolifosfato de sódio, um poliânion (MOHANRAJ & CHEN, 2006; HU et al., 2008). 4.2 POLÍMEROS A maioria dos polímeros utilizados na produção de nanopartículas é biodegradável e biocompatível ou, no mínimo, estes polímeros são totalmente eliminados do organismo num relativamente curto período de tempo para que não ocorra o acúmulo do mesmo caso haja repetição de administração. Além disso, não podem ser ou ter produtos de degradação que sejam tóxicos ou imunogênicos. Respeitando estas condições, alguns dos principais polímeros empregados para este fim são: PCL (policaprolactona), PLGA (poli ácido lácticoco -ácido glicólico), PLA (ácido polilático), quitosana e eugragit. Todos estes polímeros são sintéticos, exceto a quitosana, que tem origem natural (VAUTHIER & BOUCHEMAL, 2009; KUMARI, YADAV e YADAV, 2010). O PLA, o PLGA e o PCL são poliésteres alifáticos, suscetíveis à degradação em meio biológico e são muito utilizados para revestimento de medicamentos implantáveis. Dentre estes polímeros, o PLGA é o que possui menor tempo de degradação (VILLANOVA, ORÉFICE e CUNHA, 2010). O PLGA se decompõe em ácido láctico e ácido glicólico, monômeros endógenos. Logo, não há grandes problemas para o organismo metabolizá-los. A composição do polímero pode variar de acordo com a proporção de monômeros 16 adotada, o que interfere no perfil de liberação do ativo pela partícula (DANHIER et al., 2012). Como o PLGA possui natureza ácida, ou seja, carga residual negativa, é necessário atentar para a característica do ativo a ser incluso. No entanto, há técnicas para neutralizá-la, como a realização de uma associação com polietilenoglicol, quitosana ou pectina, por exemplo (KUMARI, YADAV e YADAV, 2010; DANHIER et al., 2012). O PCL, polímero de baixo custo, é o mais recomendado para sistemas de liberação prolongada devido a sua lenta degradação no organismo. Assim, comparado a outros, o PCL apresenta maior estabilidade e atividade terapêutica (KUMARI, YADAV e YADAV, 2010). Há décadas este polímero vem sendo usado para sistemas de liberação controlada, principalmente para proteínas e peptídeos (WOODRUFF & HUTMACHER, 2010). O Eudragit® é um copolímero muito utilizado para revestimento de comprimidos e formação de películas (TANG et al., 2011). Alguns tipos de Eudragit®, quando aplicados, promovem gastrorresistência, visto que só é dissolvido em pH mais elevado, como o pH intestinal. Consequentemente, o referente polímero pode ser utilizado para a proteção de fármacos sensíveis ao fluido gástrico, ou em caso de ativos irritantes para a mucosa estomacal (CETIN, ATILA e KADIOGLU, 2010; VILLANOVA, ORÉFICE e CUNHA, 2010). Ultimamente, este tem sido empregado tanto em microcápsulas quanto em nanoformulações a fim de melhorar a solubilidade de fármacos pouco solúveis em água (TANG et al., 2011). Já a quitosana é proveniente da desacetilação da quitina, um polissacarídeo presente no exoesqueleto de animais como crustáceos, moluscos e insetos (SONIA & SARMA, 2011). Trata-se de um polímero com propriedade mucoadesiva, que possui solubilidade limitada em pH acima de 6,5 (PLAPIED et al., 2011). Assim, devido a essas características, tem sido relatado o uso da quitosa visando o aumento da permeação de ativos na mucosa nasal, bucal e intestinal (SONIA & SARMA, 2011). Além da quitosana, existem outros polímeros naturais modificados que são aplicáveis em sistemas nanoparticulados, tais como os derivados de alginato, gelatina, albumina, colágeno e ácido hialurônico, contudo são empregados com 17 menor frequência comparados à quitosana (VILLANOVA, ORÉFICE e CUNHA, 2010). 5 NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS CONTENDO COMPOSTOS NATURAIS 5.1 PRINCIPAIS PUBLICAÇÕES NA ÚLTIMA DÉCADA A nanotecnologia aplicada à farmácia e, especificamente, para carreamento de ativos é uma linha de pesquisa relativamente recente. Além disto, para esta revisão, foram considerados apenas artigos que relatam a inclusão de substâncias de procedência natural em nanopartículas com estrutura polimérica, restringindo ainda mais a seleção dos trabalhos. Tais fatores tornam o assunto tratado nesta revisão bastante específico, resultando em um número de referências razoavelmente baixo. Mesmo assim, é possível observar o crescimento do referente tema analisando as datas das publicações levantadas durante os últimos dez anos, como pode ser visto na figura 2. Figura 2. Frequência de publicações nos últimos 10 anos, considerando as referências levantadas nesta revisão. 18 Observando a figura 2 é possível perceber que os trabalhos nesta área começam a aparecer a partir do ano de 2008 e até o ano de 2012 o número de publicações é praticamente duplicado. O resumo das publicações obtidas durante a pesquisa pode ser visto na tabela 1, onde já é possível reparar os métodos e polímeros mais empregados. Quanto aos ativos, estes variam bastante, sendo quase todos originados de vegetais. Uma exceção é o trabalho de Yin et al. (2011), que usa bufalina, a principal substância bioativa presente no veneno de sapo, a qual apresenta atividade antitumoral para diferentes tipos de câncer. Entre os compostos oriundos de vegetais, é válido destacar alguns como o extrato de Uncaria tomentosa (RIBEIRO et al., 2013), planta com o nome popular “unha de gato”, onde estão presentes alcaloides com atividade antitumoral. Há também ativos presentes em frutos, tal como visto nas publicações de Narayanan et al. (2010), que utiliza o extrato da semente de uva, de Samadder et al. (2012), que prepara extrato de Syzygium jambolanum, popularmente conhecido como jamelão e, de Yen et al. (2009), que faz uso de naringenina, encontrada em frutas cítricas, como tomate e cereja, por exemplo. Outro tipo de produto vegetal utilizado no setor alimentício e que vem sendo estudado para a obtenção de nanopartículas é a cúrcuma (Curcuma longa), de onde é retirada a curcumina, uma das substâncias usadas com maior frequência. Os componentes naturais, mencionados nos trabalhos com nanopartículas levantados nesta revisão, podem apresentar-se em forma de ativo isolado ou mesmo como extratos. Contudo, estes últimos são aplicados em menor proporção, representando os estudos com extratos 21% do total das publicações relacionadas. Tendo em vista que se trata de uma composição mais complexa, com diversos ativos presentes, os extratos parecem ser menos explorados neste campo. É provável que os princípios presentes nos extratos, por possuírem diferentes características e atividades, possam não ser interessantes para o trabalho e dificultar a realização do mesmo. Entretanto, não foi possível perceber diferenças marcantes entre as nanopartículas obtidas a partir de extratos e aquelas obtidas a partir de ativos isolados, seja com relação ao porcentual de inclusão ou ao tamanho. 19 Tabela 1. Estudos com nanopartículas poliméricas contendo compostos naturais, publicados na última década. Método Polímero PCL PLA Emulsificaçãoevaporação PLGA Dupla Emulsificaçãoevaporação PLGA Coacervação Quitosana Gelificação iônica Quitosana PCL PLGA Nanoprecipitação PVP Eudragit® Ativo α-tocoferol Extrato de Uncaria tomensa Vimblastina Quercitrina Betacaroteno Bufalina Camptotecina Cinamaldeído Curcumina Curcumina Referência BYUN et al. (2011) RIBEIRO et al. (2013) PRABU et al. (2008) KUMARI et al. (2011) YUSUF et al. (2012) YIN et al. (2012) McCAROON et al. (2008) GOMES et al. (2011) MISRA & SAHOO (2011) MUKERJEE & VISH WANATHA (2009) Curcumina Eugenol Extrato de Casca de canela Vincristina NAIR et al. (2012) β-escina VAN DE VEN et al. (2011) Condroitina Fucoidana Catequina Timoquinona Camptotecina Resveratrol Camptotecina Catequina Cumarina Curcumina Extrato de Gelsemium sempervirens Extrato de Ginkgo biloba Extrato de Phytolacca decandra Extrato de Polygala senega Extrato de semente de uva Extrato de Syzygium jambolanum Grandisina Kaempferol Quercetina Timoquinona Curcumina Genisteína Naringenina Quercetina GOMES et al. (2011) HILL et al. (2013) SONG et al. (2008) DA SILVA et al. (2012) HU et al. (2008) ALAM et al. (2012) ÇIRPANLI et al. (2011) SHAO et al. (2009) ÇIRPANLI et al. (2011) POOL et al. (2012) KHUDA-BUKHSH et al. (2010) ANAND et al. (2010) BHATTACHARYYA et al. (2010) HAN et al. (2012) DAS et al. (2012) PAUL et al. (2011) NARAYANAN et al. (2010) SAMADDER et al. (2012) STECANELLA et al. (2013) LUO et al. (2012) POOL et al. (2012) RAVINDRAN et al. (2010) YEN et al. (2010) TANG et al. (2011) YEN et al. (2009) WU et al. (2008) 20 5.2 INFLUÊNCIA DO MÉTODO NAS CARACTERÍSTICAS DAS NANOPARTÍCULAS Analisando os artigos, observa-se que o método de obtenção mais utilizado é a nanoprecipitação, empregada em 51% dos trabalhos (Figura 3). É possível que isso ocorra devido às características do procedimento já citadas anteriormente, como simplicidade, rapidez, baixo custo e facilidade de reprodução (REIS et al., 2006). A emulsificação-evaporação do solvente é um método também bastante empregado, ficando em segundo lugar com 36% das publicações. Por requerer alta energia para homogeneização, a transposição para produção em larga escala torna-se uma limitação deste procedimento. Já a nanoprecipitação, teoricamente, poderia ser mais facilmente adaptada (REIS et al., 2006). A gelificação iônica e a coacervação foram métodos menos utilizados para obtenção de nanopartículas contendo compostos naturais. Entre as publicações levantadas, sua aplicação se restringiu à utilização de polímeros de origem natural que apresentam carga elétrica e, portanto, naturalmente propiciam a formação de nanopartículas por estes métodos. Figura 3. Porcentual de vezes que cada método de obtenção foi utilizado. NP: Nanoprecipitação; EE: Emulsificação-evaporação; DEE: Dupla Emulsificaçãoevaporação; CP: Complexação de polieletrólitos (Coacervação); GI: Gelificação Iônica. 21 Em relação ao porcentual de inclusão, este está diretamente relacionado com a característica do ativo. No caso da nanoprecipitação, foram observados valores bem extremos de porcentual de inclusão (Figura 4A), tendo pico máximo de 100,2% (STECANELLA et al., 2013) e mínimo de 3,6% (ÇIRPANLI et al., 2011). Dessa maneira, é impossível não associar tal resultado a natureza do ativo, já que comparando os valores de inclusão das publicações obtidas por este método, todos são superiores a 50%, exceto as duas que envolvem a camptotecina. Já a inclusão mínima alcançada com a emulsificação-evaporação do solvente foi 40% (KUMARI et al., 2011), com o uso da quercitrina. No trabalho de Çirpanli e colaboradores (2011), a utilização da nanoprecipitação para inclusão da camptotecina não resultou em elevado porcentual de inclusão. Por outro lado, quando a emulsificação-evaporação do solvente foi aplicada para a camptotecina (MCCAROON et al., 2008), foi obtido 100% de inclusão da mesma. A grande diferença pode ser explicada simplesmente pelo procedimento empregado, pois neste, como sugere o nome, é formada uma emulsão, o que protege o ativo de contato direto com a fase aquosa, fazendo com que ele fique em uma fase interna. Na nanoprecipitação, a migração do solvente para a fase aquosa altera a polaridade desta última permitindo a solubilização da camptotecina e evitando que ela fique aderida ao polímero. Entretando, curiosamente, levando em consideração que, segundo os autores, a camptotecina é uma substância altamente hidrofóbica, esperava-se observar uma elevada inclusão no método de nanoprecipitação. Examinando as figuras 4B e 5B, nota-se que a diferença existente entre as técnicas de nanoprecipitação e emulsificação-evaporação é bem pequena, tanto com relação às médias de porcentual de inclusão quanto às médias de diâmetro. Já para a dupla emulsificação-evaporação do solvente foi observado, de forma evidente, um reduzido porcentual de inclusão médio e um elevado tamanho de partícula médio. Com a dupla emulsificação-evaporação do solvente foi encontrada somente uma publicação, onde os autores realizaram um planejamento para avaliar a influência de diversos fatores nas características das nanopartículas, obtendo várias formulações com diferentes porcentuais de inclusão e tamanho 22 (VAN DE VEN et al., 2011). Neste estudo, o composto natural incluído foi a βaescina, um componente anfifílico com elevada hidrofilicidade, que tende a escapar para a fase aquosa externa durante o processamento, dificultando a obtenção de eficiência de inclusão elevada. Como os próprios autores relatam, para adquirir melhores resultados através desta técnica mais complexa pode ser necessário aprimorar a estabilidade da emulsão A/O e aumentar a viscosidade da fase aquosa interna. A B Figura 4. Valores encontrados de porcentual de inclusão por método de obtenção. (A) Maior e menor porcentual de inclusão de cada técnica. (B) Porcentual de inclusão médio para cada método. 23 A B Figura 5. Resultados encontrados de tamanho de partícula organizados por métodos de obtenção. (A) Maior e menor diâmetro de cada método; (B) Diâmetro médio para cada técnica. Além das características do método e do ativo, outros parâmetros influenciam na eficiência de inclusão, como o solvente e o polímero, assim como a solubilidade da substância no solvente, que estabelece a concentração inicial submetida à formulação (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). Também deve-se atentar para a concentração de tensoativo usada, que pode aumentar a solubilidade do ativo em água, diminuindo seu coeficiente de partição e causando sua migração para a fase aquosa. Uma possível solução para 24 aumentar a eficiência de inclusão é a aplicação de um sal na fase aquosa, gerando uma saturação neste meio e forçando a migração do ativo para a fase interna (RIBEIRO et al., 2013; SONG et al., 2008). Assim como na dupla emulsificação-evaporação do solvente, foi encontrado somente um artigo fazendo uso da coacervação. Porém, este cita que a variação do porcentual de inclusão oscilou entre 25% e 70% (DA SILVA, et al. 2012). Na gelificação iônica, observa-se que a variação da eficiência de inclusão é bem pequena (Figura 4A), embora a amostragem também seja pequena, com apenas 2 artigos. Dessa maneira, o baixo número de publicações dentro do objetivo do trabalho e abordando os métodos de coacervação e gelificação iônica, prejudicou a discussão sobre fatores que os influenciam. Mudando o foco para o tamanho das partículas, desempenho semelhante à eficiência de inclusão foi observado (Figura 5), ou seja, grandes oscilações de diâmetro nos métodos de nanoprecipitação e emulsificação-evaporação do solvente e baixas variações em coacervação e gelificação iônica. Considerando que partículas pequenas têm menos chance de ser fagocitadas e dispõem de maior tempo na circulação sanguínea, desde que não tenha superfície hidrofóbica, (KUMARI, YADAV e YADAV, 2010), obter partículas de menor tamanho possível é um dos objetivos dos pesquisadores. Sem contar que o tamanho reduzido proporciona maior facilidade destas partículas atravessarem os vasos sanguíneos de determinados tecidos, permitindo o direcionamento do ativo, também conhecido como vetorização (BYRNE, BETANCOURT, BRANNON-PEPPAS, 2008; GAUMET et al., 2008). Porém, para alcançar uma formulação eficiente, o pequeno tamanho de partícula deve estar associado a uma boa inclusão. Tal objetivo nem sempre é fácil de se obter, uma vez que a diminuição do tamanho, em geral, é acompanhada pela redução do porcentual de inclusão. Na nanoprecipitação, por exemplo, foram observadas nanopartículas de 66,2 nm (YEN et al., 2009). Entretanto, em nenhum momento é citado no artigo seu porcentual de inclusão, deixando o leitor com informação incompleta. Já no outro extremo, partículas de 410,6 nm foram encontradas empregando a mesma técnica (POOL et al., 2012), mas tal registro não deve ser relacionado a influência do método escolhido e sim pelo polímero aplicado, como será visto adiante. 25 Quanto à emulsificação-evaporação do solvente, algumas diferenças no procedimento realizado com seus extremos casos foram observadas. No trabalho de Mukerjee & Vish Wanatha (2009), onde foram obtidas nanopartículas com 45 nm de diâmetro, foi notado que a solução com polímero, ativo e solvente orgânico já foi submetida à sonicação antes de ser vertida sobre a fase aquosa, o que não é feito por Byun et al. (2011), que teve partículas de 247,7 nm, e talvez isso poderia ter auxiliado na obtenção de partículas menores. No entanto, a principal justificativa para tal diferença pode não estar relacionada com a técnica, mas com a quantidade de polímero usada. Enquanto Mukerjee & Vish Wanatha (2009) aplicaram 30 mg de PLGA, Byun et al. (2011) fez uso de 300 mg a 500 mg de PCL, o que consequentemente provoca formação de partículas de tamanhos bem diferenciados. Observando o diâmetro médio obtido para cada método (Figura 5B), notase que este valor é maior para a dupla emulsificação-evaporação do solvente. O resultado era, de certa forma, esperado. Isto porque foram feitas duas emulsificações, consequentemente, a partícula gerada tende a ser maior. Seguindo o mesmo raciocínio, por mais que o seu diâmetro seja um pouco maior, o espaço interno para inclusão fica menor do que numa simples emulsificação. Além disto, geralmente a dupla emulsificação é uma técnica empregada como alternativa para inclusão de compostos hidrofílicos, que tendem a migrar para a fase aquosa externa. Logo, o poncentual de inclusão tende a ser menor (Figura 4B). Da mesma maneira que verificado na avaliação do porcentual de inclusão, foi notado que não houve grande variação do diâmetro de nanopartícula nos métodos de coacervação e gelificação iônica (Figura 5). Talvez isto se deva às poucas modificações as quais as referentes técnicas são expostas e devido ao pequeno número de publicações levantadas, em comparação ao elevado número de trabalhos obtidos para as outras técnicas, em que as formulações foram submetidas às mais variadas condições. 26 5.3 INFLUÊNCIA NANOPARTÍCULAS DO POLÍMERO NAS CARACTERÍSTICAS DAS No que diz respeito aos polímeros, o mais recorrente entre os artigos selecionados é o PLGA, correspondendo a 64% das publicações, como pode ser observado na figura 6. Trata-se de um polímero bastante popular pelas características já levantadas neste trabalho, tais como a biocompatibilidade e biodegradação, igualmente ao PCL. Todavia, o que os diferencia é o tempo de degradação, que é mais curto para o PLGA, o que reduz a ocorrência de reações adversas causadas pelos fragmentos cristalinos liberados durante sua decomposição (VILLANOVA, ORÉFICE e CUNHA, 2010). Portanto, o PCL é mais aplicado quando é desejável a liberação prolongada da droga, o que nem sempre é vantajoso para quem está desenvolvendo a formulação. Assim, o PCL foi utilizado em apenas 13% dos artigos, porcentual quase três vezes menor que o visto para o PLGA, apesar de ter um custo bem mais baixo. Figura 6. Porcentual de vezes que cada polímero foi aplicado no grupo de artigos contemplado. Examinando os valores de porcentual de inclusão por polímero na figura 7A, são notados resultados bem divergentes entres os pontos máximo e mínimo do PLGA e do PCL. Contudo, foi observado que se os valores obtidos nos 27 trabalhos de Çirpanli et al. (2011) e Van de Ven et al. (2011) forem desconsiderados, já que estas foram as únicas publicações a mencionar um porcentual de inclusão tão baixo, a diferença entre os pontos diminuem consideravelmente. Deste modo, o menor porcentual seria 31,9% para o PLGA (VAN DE VEN et al., 2011) e 48% para o PCL (PRABU et al., 2008). A B Figura 7. Correlação entre o polímero e o porcentual de inclusão das nanopartículas. (A) Maior e menor porcentual de inclusão, por polímero, levantados entre os artigos selecionados. (B) Porcentual médio encontrado para cada polímero. 28 Os polímeros podem afetar a eficiência de inclusão devido a carga residual que podem apresentar, atraindo ou repelindo, dependendo também da carga presente na substância natural (KUMARI, YADAV e YADAV, 2010). Não foi possível observar se a inclusão de algum ativo, entre os artigos selecionados, foi prejudicada por este motivo. Para esta constatação é necessário a realização de uma análise minuciosa, examinando as características químicas de cada ativo. Em referência ao tamanho, este pode ser influenciado pelo peso molecular e a concentração do polímero utilizado. É dessa maneira que Pool e colaboradores (2012) justificam os 410,6 nm de diâmetro (Figura 8A), pelo peso molecular do PGLA utilizado, que é maior do que o normalmente empregado. Assim, acredita-se que isto provocou o aumento da viscosidade da fase interna, que acarretou na diminuição da força de cisalhamento, permitindo a formação de nanopartículas de maior tamanho. Entretanto, mesmo apresentando alguns resultados bem divergentes, como mostrado na figura 8A, avaliando a média de tamanho de partícula para o PLGA na bibliografia levantada (Figura 8B), pode-se dizer que foram obtidos, de modo geral, valores dentro do desejado para sistemas nanoparticulados, com média igual a 173,5 nm. Considerando as figuras 7B e 8B, é possível perceber que o PLGA aparenta formar partículas com porcentagem de inclusão media um pouco maior, mas com tamanho menor. Em contrapartida, os diâmetros médios das nanopartículas de PCL foram quase todos acima de 200 nm, exceto o trabalho de Shao e colaboradores (2009), que apresentou partículas de 78,3 nm. Com o uso de Eudragit foi obtido tamanho médio bem menor, o que também pode estar relacionado com o método de preparo, considerando que todos produziram as partículas através da nanoprecipitação. Dentre a bibliografia selecionada há cinco artigos que promovem a inclusão de curcumina, sendo que três destes produziram nanopartículas, a princípio, nas mesmas condições, ou seja, com PLGA e pela técnica de emulsificaçãoevaporação do solvente (tabela 2). Independentemente disso, os cinco artigos apresentam o porcentual de inclusão bastante elevado, com o menor igual a 83% (MISRA & SAHOO et al., 2011). 29 A B Figura 8. Análise da influência do polímero sobre o diâmetro da nanopartícula. (A) Diâmetro máximo e mínimo, para cada polímero, encontrado nos artigos contemplados na revisão. (B) Diâmetro médio obtido para cada polímero. Em compensação, não foi observada nenhuma semelhança quando se trata de tamanho, inclusive em relação aos artigos sob as mesmas circunstâncias. No trabalho de Mukerjee & Vish Wanatha (2009) foi constatado o uso de 30 mg de PLGA, como já citado, por isso apresentou tamanho tão pequeno. Porém, Nair et al. (2012) e Misra e Sahoo (2011) usam a mesma quantidade de polímero e ativo e, ainda assim, exibem tamanho bem diferenciado. Ainda assim, reparou-se que o solvente adotado diverge entre tais metodologias. Enquanto Nair et al. 30 (2012) usou uma mistura de diclorometano e acetona, Misra e Sahoo (2011) escolheram o clorofórmio. Tabela 2. Publicações com Curcumina que utilizam PLGA e foram produzidas pelo método de emulsificação-evaporação do solvente. Tamanho Porcentual de inclusão Referência MUKERJEE & VISH WANATHA (2009) 45,0 nm 90,9% 129,7 nm 90,0% NAIR et al. (2012) 239,0 nm 83,0% MISRA & SAHOO (2011) Deste modo, verificou-se que mesmo com polímero, ativo e métodos de produção semelhantes, resultados distintos podem ser obtidos. Isso nos mostra que há muitos outros parâmetros capazes de influenciar não só o diâmetro de partícula, mas a formulação como um todo. 5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE E APLICAÇÕES Os sistemas nanoparticulados podem ser utilizados para diversas finalidades, sendo a potencialização da ação antitumoral a principal aplicação encontrada (Figura 9). Tendo em vista que o câncer é uma das doenças com maior causa de morte por todo o mundo, formas de prevenção e tratamento têm sido extensivamente exploradas. Como a quimioterapia é conhecida por sua alta toxicidade e capacidade de gerar efeitos adversos, as nanopartículas à base de polímeros tem atraído interesse de pesquisadores para o carreamento de ativos naturais, que são explorados por sua eficiência, grande aceitação pelos pacientes e menor tendência em provocar reação adversa (DANHIER et al., 2012; SANNA et al., 2013). 31 A potencialização da ação é gerada pela vetorização, que direciona as substâncias para sítios específicos do organismo. Além disso, estas partículas são capazes de permear e acumular nos tecidos tumorais, devido à angiogênese desenvolvida ao redor do tumor, que dá origem a vasos com poros mais alargados, possibilitando a passagem das nanopartículas. Além disso, a ineficiente drenagem linfática no tecido faz com as mesmas permaneçam no local por mais tempo, gerando acúmulo (BYRNE, BETANCOURT e BRANNONPEPPAS, 2008; SINGH &LILLARD JR, 2009). Figura 9. Principais aplicações relatadas para as nanopartículas poliméricas com ativo de origem natural. Também pela vetorização são potencializadas as atividades antioxidante, antimicrobiana e outras, como anticoagulante e anticonvulsivante. Porém, para estes fins, as nanopartículas poliméricas são aplicadas com menos frequência, como é visto no gráfico. O uso de nanopartículas para aumento da biodisponibilidade ocupa o segundo lugar com 24% das publicações levantadas. Muitos ativos tem caráter hidrofóbico, como a curcumina (ANAND et al., 2010), por exemplo, o que compromete o desenvolvimento de uma formulação para administração oral. Para driblar essa característica, são desenvolvidas as nanopartículas com estas substâncias, já que o polímero lhes protege e garante melhora da 32 biodisponibilidade, além da inclusão nos sistemas nanoparticulados promover o aumento da solubilidade de compostos insolúveis em água. Por mais que os motivos do uso das nanopartículas poliméricas sejam diferentes, quase todos apresentam fins terapêuticos, exceto os aplicados para potencialização da atividade antimicrobiana (HILL, TAYLOR e GOMES, 2013; GOMES, MOREIRA e CASTELL-PEREZ, 2011). Estes dois trabalhos fizeram uso dessa tecnologia para empregá-la em produtos alimentícios com o propósito de inibir patógenos específicos, reduzindo a transmissão de doenças por alimentos. A fim de testar suas teses e aplicações, muitos pesquisadores elaboram testes in vivo e/ou in vitro com as nanopartículas, o que é interessante e esclarecedor para o leitor. No entanto, apenas 14% dos autores realizaram ambos os testes (Figura 10). A maioria, 60% das publicações, apresenta somente o teste in vitro, que, em geral, utiliza procedimentos mais simples e mais baratos em comparação aos ensaios in vivo. Figura 10. Porcentual de publicações que fizeram uso de estudos in vitro e/ou in vivo, ou que não os fizeram. Enquanto isso, 17% dos artigos não exibem nenhum experimento desta classe. Todavia, isto não os desclassifica, visto que muitos pesquisadores publicam seus trabalhos por partes, podendo esses testes constituir um novo artigo. Além do mais, alguns autores que fazem parte desta porcentagem relatam a importância dos ensaios in vitro e in vivo e os colocam como objetivo futuro. 33 CONCLUSÃO Embora seja um assunto bastante específico, os estudos abordando nanopartículas poliméricas com compostos naturais mostraram ser um tema crescente em meio à pesquisa científica nos últimos dez anos, havendo um aumento expressivo no número de publicações entre os anos de 2008 e 2012. A classe terapêutica que mostrou ter maior relação com este tipo de tecnologia é a antitumoral, cujos ativos têm sua atividade potencializada através de sua inclusão em nanopartículas poliméricas. No entanto, ainda se identificou o uso destas minúsculas partículas para potencialização de outras ações, como a antioxidante, e também para aumento da solubilidade e biodisponibilidade dos ativos. Examinando as publicações, foi possível perceber que o polímero mais empregado é o PLGA. Foi observado que os polímeros afetam com maior intensidade o diâmetro das nanopartículas, dependendo, principalmente, da quantidade utilizada e do peso molecular do polímero. As formulações que empregaram Eudragit® aparentemente apresentaram menor tamanho. Entretanto, muitas outras variáveis, incluindo o tipo de solvente utilizado, também podem influenciar no diâmetro das partículas. Os métodos de obtenção aparentam exercer maior influência sobre o porcentual de inclusão dos ativos. A nanoprecipitação e a emulsificaçãoevaporação do solvente, técnicas com maior número de publicações, exibiram médias de tamanho e porcentual de inclusão relativamente parecidas. Já a dupla emulsificação-evaporação do solvente produziu nanopartículas com menor inclusão e maior tamanho. Porém, as variações no porcentual de inclusão não podem ser atribuídas exclusivamente à técnica empregada, visto que outros fatores, como a característica química do ativo incluído, influenciam bastante nesta propriedade. Outra reflexão foi sobre o uso de extratos, que são menos empregados do que os ativos isolados. Isto se deve, provavelmente, à complexa composição dos extratos. Observando brevemente as características destas formulações, principalmente o tamanho da partícula e o porcentual de inclusão, não foram vistas diferenças entre as obtidas com extrato e ativos isolados. 34 Quanto aos testes realizados com as formulações, observou-se que os ensaios in vitro são mais utilizados do que os in vivo. Os possíveis motivos para tal dado é o baixo custo dos testes in vitro e também sua simplicidade. Dessa maneira, conclui-se que o desenvolvimento de nanopartículas poliméricas contendo compostos naturais pode ser afetado por uma série de fatores e, portanto, nenhuma escolha durante a formulação, seja de polímero, solvente, ou qualquer outro fator, deve ser aleatória. É necessário conhecer muito bem a característica e concentração de todos os componentes envolvidos, assim como as minúcias da metodologia aplicada. A elaboração de uma formulação deste gênero é muito laboriosa. Assim, um modo de minimizar o ofício é analisar os parâmetros e resultados de trabalhos já publicados. 35 REFERÊNCIAS ALAM, S.; KHAN, Z. I.; MUSTAFA, G., et al. Development and evaluation of thymoquinone-encapsulated chitosan nanoparticles for nose-to-brain targeting: a pharmacoscintigraphic study. International Journal of Nanomedicine, v.7, p. 5705– 5718, 2012. ANAND, P.; NAIR, H.B.; SUNG, B., et al. 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