Regulacao genica de eucarioto

Regulação Gênica em
Eucariotos.
• As últimas estimativas são que uma célula humana,
uma célula eucariótica, contenha aproximadamente
35.000 genes.
• Alguns destes genes são expressos na célula todo o
tempo. Eles são chamados genes constitutivos
(“housekeeping”): que são responsáveis pelas
funções metabólicas de rotina, como por exemplo a
respiração, que é comum à todas as células.
• Alguns são expressos quando a célula entra em um
padrão de diferenciação particular.
• Alguns são expressos todo o tempo nestas
células que tem um padrão de diferenciação
particular. Exemplo: células do plasma
expressam continuamente o gene para a
síntese de anticorpo.
• Alguns são expressos somente quando as
condições ao redor ou no interior da célula
muda. Exemplo: a chegada de um hormônio
pode ligar ou desligar certos genes numa
determinada célula. (genes induzíveis)
• A ênfase maior da regulação gênica em
organismos
multicelulares
está
na
especificidade, na forma e função das células
em cada tecido.
• Genes eucariotos não são encontrados na
forma de operons,
• Cada Gene tem sequências regulatórias
específicas que são essenciais no controle da
transcrição;
• Genes induzíveis: estes genes respondem a
ameaças ou estímulos ambientais, tais como:
ingestão de metais pesados, infecção viral, etc.
Como a expressão do gene é
regulada?
• Há vários métodos usados pelos eucariotos:
• Alterando a taxa de transcrição de um gene.
– Esta é a estratégia mais importante e a mais
amplamente utilizada (nós iremos examinar com
mais detalhes).
• Entretanto, eucariotos possui vários outros
métodos além da regulação a nível
transcricional:
• Alterando a taxa de processamento do RNA
transcrito, enquanto ainda dentro do núcleo.
(aula de processamento de RNA)
• Alterando a estabilidade da molécula de
mRNA, ou seja, a taxa na qual elas são
degradadas.
• Alterando a eficiência na qual os ribossomos
traduzem o mRNA em um poli-peptídeo.
Genes que codificam proteínas
possuem:
•
•
•
•
Exons: sequências que codificam os poli-peptídeos;
Introns: que serão removidos do mRNA antes de sua tradução;
O sítio de início da transcrição;
Um promotor
– O promotor basal ou fundamental (core) – localizado cerca de
40bp do sítio de iniciação;
– O promotor secundário (usptream), o qual pode estar localizado
a mais que 200bp distante e anterior ao promotor principal;
• Acentuadores (enhancers)
• silenciadores
Sítio de início da transcrição:
• Este é o local onde a molécula de RNA
polimerase II (pol II) se liga.
• A pol II é um complexo de algumas proteínas
diferentes (mostrada na figura em amarelo com
pequenos círculos coloridos superpostos.
• O sítio de início é onde a transcrição do gene
começa em mRNA.
Fatores de transcrição
Seqüência DNA-específicos
TBP
Proteína de ligação TATA
O promotor principal (core
promotor):
• O promotor principal contêm a seqüência de 7
bases (TATAAAA) chamada de TATA box.
• Esta seqüência é reconhecida por fatores de
transcrição IID (TFIID) o qual forma um
complexo com mais de 10 proteínas diferentes
incluindo a proteína de ligação TATA (TBP), a
qual reconhece e se liga na TATA box.
• O promotor principal é encontrado em todos os genes
que codificam proteínas.
• Ao contrário do promotor secundário (upstream).
– Sua estrutua e fatores de ligação associados
difere de gene para gene.
• Muitos genes diferentes e muitos tipos diferentes de
células compartilham os mesmos fatores de
transcrição – não somente aqueles que se ligam no
promotor principal, mas também alguns que se ligam
nos secundários.
• O que liga um gene específico em uma determinada
célula é provavelmente a combinação única dos sítios
promotores e os fatores de transcrição que são
escolhidos.
Uma analogia: As fileiras de
caixas de segurança num banco:
• Para abrir uma caixa em particular na sala, são
requeridas duas chaves:
• Sua chave, cujo padrão serve somente na
fechadura da caixa reservada para você (= o
promotor secundário), mas
• Essa chave sozinha não consegue destrancar a
caixa sem a chave carregada pelo empregado do
banco,
que pode ativar o mecanismo de destrave de
qualquer caixa (= o promotor principal), mas ela
sozinha não abre nenhuma caixa.
DNA
Nuclear
Empacotamento, metilação, rearranjos,
amplificação, Heterocromatina, Inativação-X,
organização do DNA
Transcrição em RNA Promotores, acentuadores, fatores
de transcrição, proteínas de ligação,
repressores
de CAP, cauda Poli A, splicing,
RNA Funcional Adição
Splicing alternativo
Pré-tradução
Citoplasma
Tradução
Degradação do mRNA
Ligação no ribossomo, Regulação do
produto final
Proteína
Quebras, dobras, fosforilação
Proteína ativa
Proteína Inativa
Inibição, degradação
Hormônios funcionam como fatores de
transcrição
• Os hormônios exercem muitos de seus efeitos
pela formação de fatores de transcrição.
• Os complexos de hormônios com seus
receptores representam uma classe de fatores
de transcrição – elementos de reposta hormonal
– cujo complexo se liga nos sítios dos
promotores.
Acentuadores (enhancers)
• Acentuadores: são sítios de reconhecimento de
proteínas ativadoras. Essas proteínas estimulam a
transcrição pela interação física com a RNA
polimerase e outros fatores transcricionais que se
ligam ao promotor.
-são localizados longe dos seus promotores (milhares de
bases distantes,
-podem estar anteriores ou posteriores aos promotores
que controlam,
- a interação requer a formação de DNA looping.
Acentuadores
Silenciadores
• Silenciadores são regiões de controle do DNA,
que como os acentuadores, podem estar
localizados milhares de bp longe do gene que
eles controlam.
• No entanto, quando os fatores de transcrição se
ligam à eles, a expressão do gene que eles
controlam é reprimida.
Isoladores (insulators):
• Problema:
• Nós vimos que os acentuadores podem se ligar
nos promotores dos genes localizados milhares
de bp distantes. O que impede um acentuador
de se ligar inapropriadamente e ativar o
promotor de algum outro gene na mesma região
do cromossomo?
• Resposta: um isolador
• Genes adjacentes (genes codificando RNA e
aqueles codificando proteínas) são geralmente
separados por um “isolador” (insulator).
• A função do isolador é impedir a atuação
desordenada entre os seus promotores e
acentuadores (e/ou silenciadores)
Isoladores são:
• Segmentos de DNA (~ 42bp)
• Localizados entre: acentuadores e
promotores e ou silenciadores e promotores
de genes adjacentes.
• Sua função é impedir um gene de ser
influenciado pela ativação ou repressão dos
seus vizinhos.
Exemplo:
O acentuador para o promotor do gene para a cadeia delta do
receptor de célula T gamma/delta
está localizado próximo do promotor para a cadeia alfa do receptor
alfa/beta no cromossomo 14 humano. Há um isolador entre o
promotor do gene alfa e o promotor do gene delta que garante que
a ativação de um não se espalhe sobre o outro
• Todos os isoladores descobertos até o
momento em vertebrados, funcionam somente
quando ligados por uma proteína chamada
CTCF (fator de ligação CCCTC).
• Denominada pela sequência de nucleotídeos
encontrada em todos os isoladores.
• CTCF tem 11 zinc fingers.
(Adapted from N. Pavletich and C. Pabo, Science252:810-817, 1991. © 1991 the AAAS.)
Controle Transcricional :
Inativação de Genes
• O DNA é empacotado numa forma
bastante compacta. A estrutura dos
cromossomos determina se os genes
podem ser ativamente transcritos.
• Heterocromatina e eucromatina:
– hetorocromatina é em grande parte inativa
como molde para a síntese de RNA.
• Os Puffs em cromossomos politênicos:
eucromatina.
• Eucromatina: a porção mais ativa do genoma
dentro do núcleo da célula.
•
•
•
Corpúsculos de Barr: cromossomo X
condensado, inativo em células
somáticas femininas.
Metilação do DNA.
Rearranjos do DNA
Demonstração da inativação do
cromossomo X
• Num estágio precoce do desenvolvimento
embrionário em indivíduos com mais de um
cromossomo X por célula, o cromossomo X
extra se condensa, tornando-se
heterocromático, e os seus genes não são
mais transcritos.
• Em mamíferos, o cromossomo X que sofre o
processo de inativação é escolhido ao acaso de
célula para célula.
• Uma vez que um cromossomo X torna-se
inativo, ele permanece inativo nas células filhas
derivadas a partir da célula original.
• Isto resulta em um “efeito mosaico” no indivíduo
e pode ser demonstrado em humanos e outros
mamíferos.
Regulação pós-transcricional
• Splicing alternativo do transcrito primário
do mRNA:
– Um único gene pode codificar 2 ou mais
proteínas diferentes.
– Frequentemente isto é o resultado de 1 ou
mais introns não serem retirados do
transcrito.
– Anticorpos são exemplos típicos.
Duas proteínas Kinases levemente diferentes são produzidas
a partir do gene src porque a sequencia do exon A é incluída
somente nas células nervosas. A forma neural desta proteína
Src apresenta maior atividade.
(After J.B. Levy et al., Mol. Cell Biol. 7:4142-4145, 1987.)
Fatores que influenciam a Regulação
á nível da tradução e pós-tradução:
• Fatores que influenciam a tradução:
– 3 fatores principais afetam a taxa de tradução de
um mRNA
• Localização do mRNA na célula
• Taxa de tradução
• Estabilidade do mRNA
– A cauda poli-A é importante para a estabilidade
da molécula – quanto maior, mais estável.
– O tempo de “vida” do mRNA varia de 10min a >
24 horas.
• Fatores que influenciam a pós-tradução:
• Outros fenômenos interessantes causam
alterações na proteína (encurtamento):
– Alterações no mRNA – para produzir um stop codon.
– Iniciação da tradução AUG alternativa.
– Splicing (processamento) da proteína
Regulação da expressão gênica em
Eucariotos: Alguns exemplos
• Transcricional
– Tecido/órgão específico
• Albumina de mamífero
– Resposta a metais pesados
• Gene metalothioneína
– Luz-induzível
• Gene “rubisco”
• Tradução
– Disponibilidade dependente de metal
• Ferritina de mamífero
Transcricional
- Tecido/órgão específico
Gene da Albumina de mamífero
• As células do fígado fazem muitas enzimas e
secretam muitas proteínas que não são sintetizadas
por outras células.
• A albumina (ALB), uma glicoproteína, é expressa
somente no fígado de adultos.
• No útero a proteína é expressa no fígado e no
intestino, com somente a expressão fígado-específica
continuando até a vida adulta.
• O gene possui 20-22Kb de comprimento, com 15
exons,
• A expressão apropriada da transcrição é devido a
presença de:
– 6 elementos dentro dos 150bp “upstream” da +1 (Cada
elemento é o sítio de ligação para um fator de transcrição específico)
• Estes elementos conferem a especificidade do
fígado.
– Um acentuador a -9000 a -12000
– 3 acentuadores aproximadamente a 30.000
“dowstream”
Luz-induzível
Gene “rubisco” = ribulose-1, 5-bisfosfato
carbaxilase.
• Rubisco (rbc5) é uma enzima crítica na fotossíntese.
• Rbc5 é uma família de 5 genes na maioria das plantas, com
especificidades diferentes em cada tecido.
• Todos os genes rcb5 são induzíveis pela luz (controle
transcricional)
• Transcrição:
– Baixo nível de transcrição é mediado pelas sequências
localizadas dentro da região –90 do DNA.
– A máxima expressão na luz requer a ação das seqüências –
975 a –90 do DNA.
• Os fatores de transcrição envolvidos ainda não estão identificados.
Tradução
Disponibilidade dependente de metal
Ferritina de mamífero
• A ferritina é uma proteína de estocagem intracelular para
Fe
• A síntese da ferritina é regulada á nível da tradução, pela
disponibilidade do Fe.
• Os Níveis de mRNA são independentes do Fe.
5’
A extremidade 5’forma uma alça de 43bp(IRE =
Iron responsive element) contêm uma seqüência repetida
Invertida.
mRNA
3’
O IRE bloqueia o acesso do ribossomo ao mRNA quando o Fe é limitado;
Quando o Fe é sufficiente, o loop IRE muda sua conformação, permitindo a tradução;
O mRNA da ferretina é altamente estável, permitindo uma resposta rápida à
disponibilidade do Fe.