Controle da Regulação gênica

27/04/2015
Anteriormente...
Dogma central
O fluxo da informação é unidirecional
Refutação definitiva da herança dos caracteres adquiridos
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27/04/2015
O gene eucarioto
Éxon – constitui o mRNA e se traduz em
proteína
Íntron – sequência não transcrita
Splicing do RNA
• No splicing alternativo, os éxons podem se juntar em combinações diferentes, produzindo mais de um tipo de polipeptídio a partir de um único gene.
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27/04/2015
3
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5´
N‐terminal
H H
H
‐OOC – C – N ‐ COH
‐OOC –
C ‐
NH2
R
R
Ribossomo
U A C
A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U
3´
5´
RNA mensageiro
• Formação da ligação peptídica
U A C
A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U
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• Translocação
• Requer GTP
H
‐OOC – C ‐ NH2
R
A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U
H
‐OOC – C ‐ NH2
R
A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U
5
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‐
‐ ‐
H O H H
H H
‐OOC – C – N – C – C – N – C‐ C –N ‐COH
R H R
O R
A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C C A G
Controle da Regulação Gênica
José Francisco Diogo da Silva Junior – Mestrando CMANS/UECE
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Expressão gênica diferencial
• Quase todas as células de um organismo são geneticamente idênticas
• A expressão gênica é o processo em que a informação contida em um determinado gene é decodificada em uma proteína
• Diferenças entre os tipos celulares são resultado da expressão gênica diferencial, a expressão de diferentes genes pelas células de um mesmo genoma
• A expressão gênica é regulada em vários estágios
Mecanismos para a criação de células especializadas
• As diferenças dramáticas que existem entre os diferentes tipos celulares é produzida por diferenças na expressão gênica
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27/04/2015
Como a célula controla quais proteínas ela fabrica?
• Controlando quando e como um determinado gene é transcrito
• Controlando como um transcrito primário de RNA sofre o “splicing” ou é processado
• Selecionando quais mRNA são traduzidos
• Ativando ou inativando seletivamente as proteínas depois da sua síntese
• Controlando a velocidade de degradação das proteínas ativas
Sinal
NÚCLEO
Cromatina
Modificação da cromatina
DNA
Gene disponível
para transcrição
Gene
Transcrição
RNA
Exon
Transcrito primário
Intron
Processamento do RNA
cauda
Capa
mRNA no núcleo
Transporte ao citoplasma
CITOPLASMA
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CITOPLASMA
mRNA no citoplasma
Tradução
Degradação
do mRNA
Polipeptídio
Processamento da proteína
Proteína ativa
Degradação
da proteína
Transporte para o destino celular
Função celular
Modificação da cromatina
Transcrição
• Genes presentes na cromatina altamente compactada geralmente não são transcritos
• A acetilação da histona parece soltar a estrutura da cromatina, melhorando a transcrição
• Regulação do início da transcrição: os elementos de controle do DNA se ligam a fatores de transcrição específicos
• A metilação do DNA geralmente reduz a transcrição
A dobra do DNA permite que ativadores se conectem a proteínas no promotor, iniciando a transcrição
• Regulação coordenada:
Acentuado para genes específicos do fígado
Acentuadores para genes específicos do pâncreas
Modificação da cromatina
Processamento do RNA
Transcrição
Processamento do RNA
• Splicing alternativo do RNA:
Transcrito primário do RNA
Degradação do mRNA
Tradução
mRNA
ou
Processamento e degradação proteica
Tradução
• O início da tradução pode ser controlado pela regulação dos fatores de iniciação
Degradação do mRNA
• Cada mRNA possui uma meia vida característica, determinada em parte pela sequência nas UTRs 5’ e 3’
Processamento e degradação da proteína
• O processamento e a degradação pelas proteassomas estão sujeitas a regulação
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27/04/2015
Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
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27/04/2015
O que são fenômenos epigenéticos?
• São alterações herdáveis na expressão gênica sem modificações na sequência de bases do DNA ‐ Reversíveis
Onde os processos epigenéticos ocorrem?
• DNA
METILAÇÃO
Promotor
Silenciamento ACETILAÇÃO
METILAÇÃO
• HISTONAS
“Código de histonas”
BIOTINILAÇÃO
FOSFORILAÇÃO
UBIQUITINAÇÃO
SUMOilação
Compactação da cromatina
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Como os fatores de transcrição acessam o DNA?
• DNA – empacotado para ocupar menos espaço na célula
• Organização de DNA, RNA e proteínas (histonas) em um complexo chamado cromatina
• Histonas – proteínas que compõe a cromatina
• Heterocromatina • DNA condensado
• Eucromatina
• DNA estendido
EUCROMATINA/HETEROCROMATINA
• Vai depender do tipo celular que genes estarão ativos ou inativos
Ativa
Inativa
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Histonas
• Determinam grau de condensação da cromatina  reprime a transcrição
• Interação entre elas  grupamentos adicionados
• Eventos epigenéticos:
•
•
•
•
•
Acetilação (lisina)
Metilação (lisina ou arginina)
Fosforilação (serina)
Ubiquitinação (lisina)
Ribosilação
Histonas
• As histonas possuem caudas que poder ser acetiladas pela enzima HAT (histona acetil transferase) • A acetilação da histona faz sua carga (+) mais neutra, para que a interação com o DNA seja reduzida
Grupo Acetil
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27/04/2015
Histonas
• As subunidades das histonas são:
•
•
•
•
DNA ligante liga um
nucleossomo ao próximo
2 unidades de H2A
2 unidades de H2B
2 unidades de H3
2 unidades de H4
• A histona H1 não está no centro, mas age como um grampo e mantêm o DNA ligante no lugar
• As histonas são carregadas positivamente, por isso o DNA, que é carregado negativamente, se enovela ao seu redor
Empacotamento do DNA como controle gênico
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27/04/2015
Influência da Estrutura da Cromatina na Transcrição em Eucariotos
• A maior parte do DNA em uma célula eucariótica está complexada nos nucleossomos e a estrutura espiralada dificulta o acesso de fatores de transcrição e da RNA‐polimerase.
• A iniciação da transcrição depende da remoção dos nucleossomos da região promotora do gene.
• Durante a síntese de DNA, quando os nucleossomos são substituídos, poderia haver competição entre as histonas e os fatores de transcrição (p.ex. TFIID) pelos sítios promotores.
• A ligação e ruptura dos nucleossomos por ativadores. Expressão gênica
• O DNA se enovela ao redor de proteínas de histonas para formar uma estrutura chamada nucleossomo. Os nucleossomos ajudam o empacotamento do DNA no cromossomo
• Quando grupos acetil se ligam a histona, o DNA nos cromossomos se soltam para permitir a transcrição
• A adição de grupos metil à histona pode causar a condensação do DNA e com isso prevenir a transcrição
• No imprinting genômico, a metilação regula a expressão tanto dos alelos maternos como dos paternos de alguns genes no início do desenvolvimento
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Estrutura do DNA : nucleossomos e cromatina Unidade básica da heterocromatina
NUCLEOSSOMOS
Nucleossomos: aproximadamente 147 nucleotídeos enrolados sobre um octâmero de histonas com 2 cópias de cada tipo de histona
Ativadores e cromatina
Ativador se liga ao DNA
Complexo de remodelagem da cromatina
Remodelagem da cromatina
Enzimas modificadoras das histonas: histona‐acetilases Modificação covalente das histonas Outros ativadores
Outros ativadores ligados às regiões reguladoras
Fatores de transcrição e RNA pol II conseguem acessar o DNA Montagem do complexo de iniciação no promotor
Outros ativadores e rearranjo das proteínas do complexo
INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO
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27/04/2015
Metilação do DNA
Metilação do DNA
• Dinucleotídeos 5’‐CpG‐3’: união de uma citosina a uma guanina por uma ligação fosfodiéster na mesma fita de DNA  ilhas CpG
 regiões promotoras dos genes
• Metilação do DNA: ocorre normalmente em cerca de 70 a 80% dos sítios CpG, sendo que essa porcentagem aumenta com o envelhecimento.
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27/04/2015
Metilação do DNA
• É essencial para o desenvolvimento normal • Tem ação:
•
•
•
•
•
•
•
no controle da expressão gênica espacial e temporal
na integridade cromossômica e segregação centromérica
nos eventos de recombinação
inativação do cromossomo X
proteção contra elementos genéticos móveis
imprinting genômico
envelhecimento A remodelação da cromatina A acetilação das histonas melhoram o acesso à região promotora e facilita a transcrição
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27/04/2015
Metilação do DNA e controle da transcrição
• Uma pequena porcentagem do DNA recém sintetizado (~3% em mamíferos) são quimicamente modificados pela metilação
• A metilação ocorre mais frequentemente em sequências simétricas CG
• Genes transcricionalente ativos possuem níveis significantemente inferiores de DNA metilado do que genes inativos
• A metilação resulta na síndrome do X frágil; o gene FMR‐1 é silenciado pela metilação
Papel da Metilação/Desacetilação na Repressão do Genoma
• Ilhas CpG não metiladas e histonas acetiladas 
nucleossomos em configuração aberta 
cromatina descondensada 
acesso aos fatores de transcrição  Genes transcricionalmente ativos
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27/04/2015
Papel da Metilação/Desacetilação na Repressão do Genoma
• Ilhas CpG hipermetiladas e histonas desacetiladas 
regiões de heterocromatina 
inativação gênica
•  nucleossomos mais compactados  cromatina condensada  grupos metil fornecem barreira física para acessibilidade aos fatores de transcrição  inibe acesso de proteínas reguladoras que promovem a transcrição
Metilação do DNA
• O resultado da metilação do DNA: silenciamento dos genes através da inibição direta ou indireta da ligação dos fatores de transcrição devido ao processo de metilação
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27/04/2015
Baccarelli A et al. Circ Cardiovasc Genet 2010;3:567-573
REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO
CA CANCER J CLIN 2010;60:376–392
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27/04/2015
Imprinting genômico
• É um subgrupo distinto de regulação epigenética em que a atividade de um gene é reversivelmente modificada dependendo do sexo do genitor que o transmitiu
• Processo em que genes específicos são diferencialmente “marcados” durante a gametogênese parental → expressão diferencial de alelos dependendo da origem materna ou paterna
Imprinting genômico
• Assegura a expressão transcricional herdada paternalmente ou maternalmente
• Somente um dos 2 alelos parentais herdados é normalmente expresso e o outro alelo é reprimido
• Expressão monoalélica devido a padrão de metilação
• Imprinting pode ser tecido específico ou tipo celular específico: AS → expressão monoalélica em neurônios mas não na glia.
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27/04/2015
Imprinting genômico
Imprinting confirmado:
Materno: 1, 7, 11, 14, 15, 18, 20
Paterno: 1, 6, 7, 11, 14, 15, 19 e 20
Entre 100 a 500 transcritos imprintados
de 13 cromossomos diferentes
Genes imprintados atuam no crescimento embrionário e desenvolvimento e outros influenciam o comportamento após nascimento.
Consequência Funcional: Para que serve
• Funcionalmente estes genes serão “haplóides”.
P M
• O gene A tem somente expressão “materna” (alelo paterno inexpressivo), enquanto o C somente “paterna” (alelo materno inexpressivo). O produto de ambos é o normal e suficiente para o funcionamento da célula. • O gene B tem expressão em ambos os alelos, e seu produto também é normal para o funcionamento da célula.
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27/04/2015
Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
Exemplos de Sinais que Regulam a Expressão Gênica em Eucariotos
•
•
•
•
•
Hormônios (ex: hormônios esteróides)
Fatores de Crescimento e de Diferenciação Celular
Contato célula‐célula (adesão celular)
Alterações nutricionais (resposta é limitada!)
Alterações ambientais (ex: choque térmico)
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27/04/2015
Regulação da expressão de genes por hormônios esteroides
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27/04/2015
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27/04/2015
Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
Fatores Gerais de Transcrição
• Os fatores gerais de transcrição são proteínas responsáveis: • pelo posicionamento correto da RNA‐polimerase no promotor • ajudam na separação das fitas de DNA, para permitir o início da transcrição e • liberam a RNA‐polimerase do promotor quando a transcrição se inicia.
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27/04/2015
Região de controle gênica
• Região de controle gênica – todo o DNA envolvido na regulação de um gene
• Quantidade de proteínas reguladoras de genes
• FTs são similares, as proteínas reguladoras do gene podem ser bastante diferentes para diferentes regulações gênicas
Genes Eucarióticos São Regulados por Combinação de Proteínas
• A maioria das proteínas reguladoras de genes atuam como parte de um “comitê” de proteínas reguladoras, todas essenciais para a expressão de um determinado gene na célula correta, em reposta a uma dada condição, no tempo certo e no nível requerido.
• O termo controle combinatorial refere‐se a forma como grupos de proteínas trabalham juntas para determinar a expressão de um único gene. 28
27/04/2015
Ação de fatores de transcrição gerais e seletivos
Uma única proteína pode coordenar a expressão de diferentes genes
• Embora o controle da expressão gênica em eucariotos seja combinatorial, o efeito de uma única proteína reguladora pode ser decisiva para ligar e desligar, simplesmente completando a combinação necessária para ativar ou reprimir um gene. • Exemplo: Em seres humanos, o receptor de glicocorticóide. Para se ligar aos sítios no DNA, o receptor precisa formar um complexo com uma molécula de um hormônio esteróide (p.ex. cortisol). Em resposta aos hormônios glicocorticóides, as células do fígado aumentam a expressão de vários genes. 29
27/04/2015
Fatores cis e trans
• Fatores Trans‐Atuantes
• Genes que codificam estes fatores de regulação estão em outra região da molécula de DNA, tendo que migrar ao local de ação
• Ligam‐se ao DNA, mas provém de outra região do DNA, que os codifica para agirem sobre os fatores em cis
• Fatores Cis‐Atuantes
• Sequências reguladoras, região de ligação dos fatores trans‐
atuantes, estão na mesma molécula que o gene, ou transcrito de RNA, que está sendo regulado
• Estão na fita de DNA. São as regiões reguladoras, como as regiões promotoras dos genes, que são regiões que podem “ligar ou desligar” a expressão do gene
Fatores cis e trans
Ativadores
Repressores
Reforçadores
Elementos isolantes
Regiões reguladoras e regiões promotoras
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27/04/2015
Controle da expressão gênica
• Sob controle positivo
• A transcrição não se iniciará sem a formação do complexo de transcrição
• Fatores de transcrição são proteínas reguladoras que se ligam a região acentuador, ao promotor (TATA box) e uns aos outros
• Uma vez que os fatores de transcrição são formados ao redor do promotor, eles são chamados de complexo de transcrição
Fatores de transcrição se ligam a região promotora
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27/04/2015
Fatores de transcrição diferentes se ligam a RNA polimerase
Esse complexo de holoenzima reconhece o fator de transcrição original
Acentuadores agem como ativadores da transcrição
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27/04/2015
Promotor
Ativadores
DNA
Acentuadores
Elemento de
controle distal
TATA
box
Promotor
Ativadores
DNA
Acentuadores
Elemento de
controle distal
Gene
Gene
TATA
box
Fatores de
transcrição geral
Proteína de
dobra do
DNA
Grupo de proteínas
mediadoras
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27/04/2015
Promotor
Ativadores
DNA
Acentuadores
Elemento de
controle distal
Gene
TATA
box
Fatores de
transcrição geral
Proteína de
dobra do
DNA
Grupo de proteínas
mediadoras
RNA
polimerase II
RNA
polimerase II
Complexo de iniciação
da transcrição
Síntese do
RNA
Regiões de controle da transcrição
• Promotores
• Sequencia de controle proximal no DNA
• Se liga a RNA polimersase e fatores de transcrição
• Taxa “básica” da transcrição
• Acentuadores
• Sequência de controle distal no DNA
• Ligante das proteínas de ativação
• Taxa “melhorada” (alto nível) da transcrição
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27/04/2015
Regiões de controle da transcrição
Enhancer Promotor
Elementos de controle
Gene da Albumina
Gene da cristalina
NÚCLEO DA CÉLULA HEPÁTICA
Ativadores disponíveis
Gene da albumina expresso
Gene da cristalina não expresso
(a) Célula hepática
NÚCLEO DA CÉLULA OCULAR
Ativadores disponíveis
Gene da albumina não expresso
Gene da cristalina expresso
(b) Célula ocular
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27/04/2015
Complexo de transcrição
Proteínas de ativação
• proteínas regulatórias se ligam ao DNA em locais acentuadores distantes
• aumentam a taxa de transcrição
Sítios acentuadores
Sítios regulatórios no DNA distante do gene alvo
Acentuador
Ativador
Ativador
Ativador
Coativator
B
A
TFIID
E
F
RNA polimerase II
H
Complexo promotor
e iniciador principal Complexo de iniciação no sítio promotor sítio de ligação da RNA polimerase
Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
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27/04/2015
Mecanismos da regulação pós‐transcricional
• Apenas a transcrição não é o determinante para a expressão gênica
• Mecanismos regulatórios podem operar em vários extágios da transcrição
• Tais mecanismos permitem à célula promover uma sintonia fina na expressão gênica rapidamente em resposta à mudanças ambientais
PROMOTOR
éxon 1
DNA
éxon 2
éxon 3
ATG
TAA AATAAA
TRANSCRIÇÃO
5’UTR
Pre-mRNA
CAP
3’UTR
íntron
AUG
NÚCLEO
CITOPLASMA
íntron
UAA AAUAAA
AAAAA
SPLICING DO RNA
mRNA
TRADUÇÃO
AUG
UAA AAUAAA
sequência codificante
OPEN READING FRAME
proteína MAPSSRGG…..
Regulação da expressão gênica via regulação de mRNAs maduros
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27/04/2015
Processamento normal do RNA
• Capeamento
• Logo após a transcrição
• Ligação efetiva de 7‐metilguanosina ao primeiro nucleotídeo 5’ do transcrito de RNA.
• Protege o transcrito do ataque da exonuclease 5’→3’
• Facilita o transporte do mRNA para citoplasma
• Papel no encaixe da subunidade 40S dos ribossomos no mRNA
• Poli‐adenilação
•
•
•
•
•
Após o término da transcrição – clivagem terminal do RNA
Adição de cerca de 200 resíduos de adenilato
Facilitar transporte para o citoplasma
Estabilizar o mRNA
Facilita a tradução
Estabilidade do mRNA regulando a expressão gênica
3’ UTR possui elementos regulatórios que participam da estabilidade da transcrição
Capa 5‘:
• auxilia a exportação do mRNA nuclear
• protege contra a degradação pelas exonucleases 5‘ ‐ 3‘ no citoplasma
• seleciona transcritos para o ribossomo para tradução
cauda poli‐A:
• participa da terminação da transcrição
• auxilia a exportação do mRNA nuclear
• protege contra a degradação pelas exonucleases 3‘ ‐ 5‘ no citoplasma
• seleciona transcritos para o ribossomo para tradução
Figure 7-109 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
38
27/04/2015
Estabilidade do mRNA regulando a expressão gênica
• Em eucariotos: vida‐média de várias horas
Desadenilases citoplasmáticas
p.e. PARN
Figure 7-109 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Processamento do RNA
• No splicing alternativo, diferentes moléculas de mRNA são produzidas a partir do mesmo transcrito primário, dependendo de qual segmento de RNA são tratados como éxons e quais são íntrons
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27/04/2015
Sequência
Poli-A
Elementos de
Acentuadores
controle proximal
(elemento de controle distal)
Região de
terminação
Éxon
DNA
Upstream
Íntron
Éxon
Íntron Éxon
Downstream
Promotor
Sequência
Poli-A
Elementos de
Acentuadores
controle proximal
(elemento de controle distal)
Região de
terminação
Éxon
DNA
Upstream
Íntron
Promotor
Transcrito
primário de RNA 5’
Éxon
Íntron Éxon
Downstream
Transcrição
Éxon
Íntron
Éxon
Íntron Éxon
Final 3’ do
transcrito primário
Sinal
Poli-A
40
27/04/2015
Sequência
Poli-A
Elementos de
Acentuadores
controle proximal
(elemento de controle distal)
Região de
terminação
Éxon
DNA
Upstream
Íntron
Promotor
Transcrito
primário de RNA 5’
Éxon
Íntron Éxon
Downstream
Transcrição
Éxon
Íntron
Éxon
Íntron Éxon
Processamento
do RNA
Sinal
Poli-A
Íntron do RNA
Final 3’ do
transcrito primário
Segmento codificante
mRNA
3’
5’ Cap
5’ UTR
Códon Códon
inicial
final
3’ UTR
cauda
Poli-A
Tipos de splicing alternativo
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27/04/2015
Regulação do transporte de RNA
• Somente mRNA com estrutura de capa 5’ e cauda poli–A vão para o citoplasma
• Grande parte dos RNAs mensageiros nem saem do núcleo
• O mRNA pode ir para locais específicos no citoplasma, próximo de onde a proteína atua
• Região 3’‐ UTR é que quem regula esse direcionamento
Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
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27/04/2015
Início da tradução
• O início da tradução de mRNA selecionados pode ser bloqueado por proteínas regulatórias que se ligam a sequências ou estruturas do mRNA
• A tradução de todos os mRNAs em uma célula podem ser regulados simultaneamente
• Por exemplo, fatores de iniciação da tradução são ativados simultaneamente em um óvulo logo após a fertilização
Controle da tradução
• Bloqueio do início da tradução
• Proteínas regulatórias se ligam à porção 5’ do mRNA
• Prevenir a ligação das subunidades ribossomais e tRNA iniciador
• Bloquear a tradução de um mRNA em protéina
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27/04/2015
Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
Processamento e degradação de proteínas
• Após a tradução, vários tipos de processamento proteico, incluindo a ligação e a adição de grupos químicos estão sujeitos a controle
• Proteassomas são complexos gigantes de proteínas que ligam moléculas de proteínas e os degradam
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27/04/2015
Processamento e degradação de proteínas
• Processamento de proteínas
• Dobramento, ligação, adição de grupos de açúcares, transporte par o sítio alvo
• Degradação de proteínas
• Ligação com a ubiquitina
• Degradação por proteasomas
Regulação pela estabilidade da proteína
• Proteólise dependente da ubiquitina
• A molécula de proteína é sinalizada para degradação pela ligação de uma proteína de 20 kDa, a ubiquitina
NH2
NH2
+
Molécula de proteína para degradação
ATP
COOH
CO NH
CO NH
Ubiquitina ligase
26S
proteasoma
• A estabilidade de uma proteína depende do aminoácido N‐
terminal
• N‐terminal: por exemplo arginine, lisina: vida media = 3 minutos
• N‐terminal: por exemplo metionina, alanine: vida media = > 20 horas
45
27/04/2015
Ubiquitina
Proteassoma
Proteína a ser
degradada
Proteína
Ubiquitinada
Proteassoma e
ubiquitina para
reciclagem
Proteína entrando
no proteasoma
Fragmentos
de proteína
(peptídeos)
Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos
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