Dissertação - Adriana Spirotto Stein Mesquita

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
SELEÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS
AMAZÔNICAS PRODUTORAS DE LIPOPEPTÍDEOS
BIOATIVOS
ADRIANA SPIROTTO STEIN MESQUITA
MANAUS
2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ADRIANA SPIROTTO STEIN MESQUITA*
SELEÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS
AMAZÔNICAS PRODUTORAS DE LIPOPEPTÍDEOS
BIOATIVOS
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal do AmazonasUFAM, como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em
Química, área de concentração
Química Orgânica.
Orientador: Prof. Dr. Afonso Duarte Leão de Souza
Co- Orientadora: Profª. Drª. Antônia Queiroz Lima de Souza
*Bolsista CAPES
MANAUS
2015
ii
iii
iv
Aos meus pais José Antonio Stein e Luzia Spirotto Stein, pelo
amor, dedicação e todo esforço para me proporcionar uma boa
educação; a minha segunda mãe Risoleide Mesquita, pelo
companheirismo, carinho e motivação; e, como não podia deixar
de ser, dedico este trabalho ao meu marido Denny Mesquita que
sempre esteve ao meu lado com muito amor, carinho e paciência.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus em primeiro lugar, pela dádiva da vida, pelas pessoas que colocou em meu
caminho, pela possibilidade de realizar um trabalho tão edificante e satisfatório, e por me
auxiliar nos momentos de dificuldade e aflição.
Aos meus pais, José Antônio Stein e Luzia Spirotto Stein, o meu muito obrigada
por todo o amor, carinho, ensinamentos, além de todo esforço e dedicação para sempre
me proporcionar o melhor e por acreditarem que eu poderia alcançar todos os meus
sonhos.
À minha família em especial aos meus segundos pais Maria Risoleide e Sérgio
Mesquita, aos tios Maria Rizely e Aroldo Alves e cunhados Sérgio Junior e Rodrigo
Mesquita pelo apoio, e pelo carinho, atenção e cuidado dispensado aos meus filhos. Aos
tios Risenilde e Júnior, cunhados Lindsay Mesquita e Diogo Torres, primos Kelvin e
Simone, Ryzivan e Gabriela, avôs Lina Ramos, José Vidal e Elizabeth pelo incentivo
dedicado a mim e por acreditar que eu pudesse conseguir realizar esse sonho e alcançar
meus objetivos.
Ao meu amado marido, Denny Mesquita, a quem sou eternamente grata pela
enorme ajuda e paciência, por seu carinbho, amor e companheirismo em todo o momento,
por estar sempre perto com alguma palavra amiga e de incentivo, pelo apoio sempre com
muita disposição e compreensão nos momentos difíceis, além da confiança depositada
em mim. Aos meus dois filhos Giuseppe Mesquita e Giovanni Mesquita, que são minha
inspiração e motivação, amo muito vocês.
Ao Professor Dr. Afonso Duarte Leão de Souza, pelo voto de confiança, pelo apoio
nos momentos de dúvidas, pela orientação, pelos ensinamentos e por confiar a mim um
trabalho tão fascinante.
vi
À Professora Drª. Antonia Queiroz Lima de Souza, por sua dedicação, orientação,
amizade, pela maneira carinhosa com que resolve os problemas, pelo carinho e afetos
maternais, que auxiliaram muito na realização do meu trabalho, pela alegria em trabalhar
e ensinar, e por me guiar pelo fantástico mundo dos microrganismos, servindo como
alguém em quem eu deva me espelhar na minha vida profissional.
Aos Professores Jefferson Rocha, Marcos Machado, Rita de Cássia Saraiva, Cecília
Nunez pelos conhecimentos repassados e paciência durante as disciplinas cursadas.
Aos professores Maria Lúcia Belém e Sergio Nunomura, pelas colaborações e
esclarecimentos durante o exame de conhecimento.
À equipe do Laboratório do Grupo de Espectrometria e Microrganismos da
Amazônia-GEMMA, Sandro, Fátima, Sara, Paulo, Rafael, Larissa, Greiciane, Rachid,
pela amizade, pelo auxílio e por me ensinarem diversas técnicas de cultivos e testes
biológicos, com certeza vocês agora já fazem parte da minha vida na pesquisa.
Aos amigos do Laboratório de Espectrometria de Massas, Richardson Almeida,
Bruna Ribeiro e Elzalina Soares pelo incentivo e pelas análises realizadas.
Aos amigos Felipe Moura e Héctor Kooler pelos ensinamentos e realização de
análises por espectrometria de Massas.
Minha enorme gratidão à amiga Adriana Silva pelos primeiros ensinamentos e
ajuda na realização do cultivo das bactérias endofíticas.
A todos que direta ou indiretamente participaram da realização deste trablho
e aqueles que acreditaram em mim e tinham certeza que eu era capaz, até quando
eu mesmo duvidava, à vocês muito obrigada.
vii
“Sê forte e corajoso; não temas, nem te espantes,
porque o Senhor é contigo por onde quer que
andares”. (Josué: 1:9)
viii
RESUMO
Os microrganismos endofíticos, especialmente bactérias e fungos, são assim
denominados por viverem no interior das plantas, habitando inclusive suas raízes, sem
lhes causar aparentemente nenhum dano. As bactérias e os fungos são potencialmente
úteis na agricultura e na indústria, particularmente na alimentícia e farmacêutica, pois
produzem inúmeras classes de substâncias e podem participar de processos
biotecnológicos industriais diversos. Entre as substâncias produzidas por bactérias, os
lipopeptídeos são uma classe que tem atraído grande interesse por suas atividades
antifúngica, antibiótica e surfactante entre outras. No presente trabalho foram
selecionadas 50 linhagens de bactérias endofíticas amazônicas para serem avaliadas por
ensaios antimicrobianos e quanto à produção de lipopeptídeos por ESI-ITMS2. Destas, 25
linhagens produziram lipopeptídeos, sendo seis isoladas de planta do gênero Gustavia,
nove de Macrofita, cinco de Duguetia, uma de Pothomorpha, duas de Rollina e uma de
Bryophyllum. As análises de fragmentação por ESI-MS2 no modo negativo dos extratos
lipopeptídicos identificaram oito homólogos da surfactina de C11 - C18, entre os quais o
C11, C17 e C18 ainda não foram relatados na literatura. Em ensaios biológicos de culturas
pareadas, 48 linhagens apresentaram atividade antimicrobiana de microparasitismo
contra as bactérias Gram-negativas P. aeruginosa e E. coli, 27 linhagens contra as
bactérias Gram-positiva S. aureus, 29 linhagens contra E. faecalis e 28 contra C. albicans,
apresentando também atividade de competição frente a 21 linhagens contra E. faecalis e
C. albicans, 23 linhagens contra S. aureus e 2 linhagens contra P.aeruginosa e E. coli.
Não foi observada nenhuma linhagem com atividade antibiótica. Na avaliação da
bioatividade dos extratos lipopeptídicos, 13 extratos destas linhagens apresentaram
antibiose frente a S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans.
Palavras-Chave: Lipopeptídeos, bactérias endofíticas, espectrometria de massas.
ix
ABSTRACT
The endophytic microrganisms, particularly bacteria and fungi live in the plants,
including thein roots apparently cause no harm. Bacteria and fungi are potentially useful
in agriculture and industry, particularly in the food and pharmaceutical industries, as they
produce different chemical classes and can participate in various industrial
biotechnological processes. Among the compounds produced by bacteria, lipopeptides
belong to a class that has attracted great interest for its antifungal, antibiotic and surfactant
among others. In this stud 50 strains were selected of Amazonian endophytic bacteria for
antimicrobial evoluction and the production of lipopeptides by ESI-ITMS2. Of these, 25
strains produced lipopeptides, six plant isolated from Gustavia genus, nine Macrophyte,
five Duguetia, one Pothomorpha, two Rollina and one Bryophyllum. The fragmentation
analysis by ESI-MS2 in negative mode identified eight extracts the lipopeptide surfactin
homologs of C11 - C18, including C11, C17 and C18 not been reported in the literature.
In biological assays paired cultures, 48 strains showed mycoparasitism antimicrobial
activity against Gram-negative bacteria P. aeruginosa and E. coli, 27 strains against
Gram-positive bacteria S. aureus, E. faecalis, 29 strains against and 28 against C.
albicans, also presenting competition activity against E. faecalis 21 strains and C.
albicans strains against 23 S. aureus strains and 2 against P.aeruginosas and E. coli. No
strain with antibiotic activity observed. In assessing the bioactivity of lipopeptide
extracts, 13 of the extracts strains showed antibiosis against S. aureus, P. aeruginosa and
C.albicans.
Keywords: Lipopeptides, endophytic bacteria, mass spectrometry.
x
LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SIGLAS
IT
“Ion trap”
EM
Espectrometria de Massas
ESI
“Ionização Electrospray”
MS
“Mass Spectrometry”
m/z
Relação massa/carga
LP
Lipopeptídeos
HCl
Ácido Clorídrico
DCM
Diclorometano
DNA
Ácido desoxirribonucleíco
YM
Yeast-Malt
MH
Miller Hilton
BHI
Brain Heart Infusion
ppm
Parte por milhão
µg
Micrograma
mg
Miligrama
ESA- UEA
Escola Superior de Ciências da Saúde- Universidade do Estado do
Amazonas
GEMMA
Grupo de Espectrometria de Massas e Microrganismos da Amazônia
SPE
“Solid Phase Extraction”
DHT
Transferência dupla de hidrogênio
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
Figura 9.
Figura 10.
Figura 11.
Figura 12.
Figura 13.
Figura 14.
Figura 15.
Figura 16.
Figura 17.
Figura 18.
Figura 19.
Figura 20.
Figura 21.
Figura 22.
Estrutura do lipopeptídeos antibiótico daptomicina ..................................
Estrutura do principal homólogo (iso-C15 da surfactina). Isoformas: (A)
Surfactina A, (B) Surfactina B e (C) Surfactina C ....................................
Estrutura do principal homólogo (n-C13) da iturina. Isoforma: (A) Iturina
A, (B) Iturina C .........................................................................................
Estrutura do principal homólogo (n- C16 da fengicina). Isoformas: (A)
Fengicina A, (B) Fengicina B ...................................................................
Classes heterogêneas de compostos naturais sintetizados por NRPS .......
Rotas biossintética da surfactina ...............................................................
Microrganismos utilizados para fins científicos: (a) Staphylococcus
aureus, (b) Enterococcus faecalis, (c) Escherichia coli, (d) Pseudomonas
aeruginosas e (e) Cândida albicans ...................................
Extração líquido- líquido do extrato LP76 ................................................
Filtragem do extrato LP76 em NaOH aquoso em filtros de membrana
Millipore 0,45µ ..........................................................................................
Extração em SPE do extrato LP76 ............................................................
Extração líquido-líquido do meio ácido da amostra LP76 ........................
Espectros de massas ESI-ITMS: (A) Modo negativo e (B) Modo positivo
para as linhagens, 17 (Gh Cc3 1.2a), 42 (GhCr3 1.1a) e 50 (GhCc1 2.1)
...............................................................................................
para as linhagens, 76 (Folha BDA1.3.1), 84 (Folha BDA 1.4.1) e 164
(Ppc12.2b) .......................................................................................
para as linhagens, 196 (DgCr2 1.1b), 207 (AnspR1 1.3) e 229 (Dfga1. 1.
2) ..............................................................................................
Espectro de ESI-ITMS da amostra do método 1 no modo negativo .........
Espectro de ESI-ITMS das amostras do método 2 no modo negativo. (A)
Fração da fase orgânica e (B) Fração da fase aquosa .........................
Espectro de ESI-ITMS das frações do método 3 no modo negativo: (A)
Fração da fase aquosa da amostra e (B) Fração MeOH ............................
Espectro de ESI-IT-MS no modo negativo da amostra do meio ácido da
linhagem 76 por análise direta ...................................................................
Espectros de ESI-IT-MS no modo negativo das frações do meio ácido
obtidos por extração líquido- líquido. (A) Fração da fase orgânica e (B)
Fração da fase aquosa ................................................................................
Espectros de massas ESI-ITMS no modo positivo para as linhagens
LP17, (Gh Cc3 1.2 a), LP42 (GhCr3 1.1a), LP50 (GhCc1 2.1), LP76
(Folha BDA1.3.1), LP84 (Folha BDA 1.4.1) e LP164
(Ppc12.2b)..................................................................................................
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44
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53
57
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68
68
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80
82
83
83
84
84
86
Espectros de massas ESI-ITMS no modo positivo para as linhagens,
LP196 (DgCr2 1.1b), LP207 (AnspR1 1.3) e LP229 (Dfga1. 1. 2)
....................................................................................................................
.
87
(A) Estrutura do lipopeptídeo C15 da surfactina apresentando as regiões
de fragmentações e a nomenclatura y e b proposta por Roepstorff–
xii
Figura 23.
Figura 24.
Figura 25.
Figura 26.
Figura 27.
Figura 28.
Figura 29.
Figura 30.
Figura 31.
Figura 32.
Figura 33.
Figura 34.
Figura 35.
Figura 36.
Figura 37.
Figura 38.
Figura 39.
Figura 40.
Figura 41.
Figura 42.
Figura 43.
Figura 44.
Figura 45.
Fohlmann–Biemann. (B). Espectro de ESI no modo positivo do íon
sodiatado de m/z 1058 ...............................................................................
Fragmentação do íon de m/z 1058 por: (a) Clivagem simples (b)
Clivagem com transferência dupla de hidrogênio .....................................
Fragmentação do íon de m/z 1058 por: (b) Clivagem com transferência
dupla de hidrogênio ...................................................................................
Espectros de ESI-MS2 no modo negativo dos extratos LP: (A) 17 (B) 42
(C) 50 (D) 76 (E) 84 (F) 164 (G) 196 (H) 207 e (I) 229 ..........................
(A) Estrutura da surfactina C15 apresentando as regiões e a nomenclatura
y e b das fragmentações por ESI-MS2. (B). Espectro de massa no modo
negativo do íon de m/z 1034 ............................................
Proposta de fragmentação para o íon de m/z 1016 ....................................
Proposta de fragmentação do íon de m/z 692 ............................................
Proposta de fragmentação da surfactina para os íons de m/z 452 e 339 ....
Proposta de fragmentação da surfactina para os íons de m/z 353, 323 e
240 .............................................................................................................
Espectros de ESI-MS2 no modo negativo dos íons de m/z 978, 1062 e
1076 ...........................................................................................................
Teste por culturas pareadas (Metodologia de Christensen) para a bactéria
endofítica, linhagem 17 (GhCc3.1.2. (A) Atividade de microparasitismo,
contra as bactérias patogênicas P. aeruginosa e E. coli e (B) Atividade de
competição contra S.aureus e E. faecalis ............
Halos de inibição de C. albicans dos extratos LP 17, 39, 50, 73, 164, 196,
207 e 229 após 48 horas ....................................................................
Halos de inibição de S. aureus dos extratos LP 17, 41, 42 e 50 após 48
horas ..........................................................................................................
Halos de inibição de P. aeruginosa dos extratos LP 84, 164, 207 e 229
após 48 horas .............................................................................................
Relação da atividade de antibiose dos extratos LP da tabela 12 com os
homólogos da surfactina ............................................................................
Espectros de ESI-ITMS no modo negativo das linhagens 41, 48, 156, 174,
181, 185, 189 e 191 ...........................................................................
66, 65 e 127 .........................................................................................
Espectros de ESI-ITMS no modo negativo das linhagens 105, 109, 68,
67, 63 e 73 .................................................................................................
e 82 ............................................................................................................
222 e 223 ...................................................................................................
243 e 254 ...................................................................................................
264 e 265 ...................................................................................................
Espectros de ESI-ITMS2 dos íons fragmentos de sódio [M+Na]+ (A) m/z
1030, (B) 1044 e (C) 1072, presentes no extrato LP76 ............................
Espectros de fragmentação ESI – MS2 no modo negativo dos íons de m/z
992, 1006, 1020, 1034 e 1048 presentes no extrato LP 50 .................
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136
136
137
137
138
138
139
139
141
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Tabela 2.
Tabela 3.
Tabela 4.
Tabela 5.
Tabela 6.
Tabela 7.
Tabela 8.
Tabela 9.
Tabela 10.
Medicamentos lançados no mercado entre os anos de 2000-2010 a
partir de origem microbiana com referência ao seu composto ativo,
classificação
e
área
terapêutica
.........................................................
Sequência peptídica e principais cadeias de ácidos graxos para os
lipopeptídeos da família da surfactina ..............................................
lipopeptídeos da família da Iturina ...................................................
lipopeptídeos da família da Fengicina ..............................................
Bactérias endofíticas isoladas de plantas da Amazônia ...................
Identificação de lipopeptídeos em amostras dos sobrenadantes das
linhagens de bactérias endofíticas através da análise de ESI-ITMS
no modo negativo e positivo ............................................................
Íons detectados por fragmentação (ESI-ITMS2 ) dos homólogos da
surfactina a partir dos íons percusores de m/z 1030, 1044, 1058 e
1072
..................................................................................................
Íons detectados por fragmentação (ESI-MS2) dos homólogos da
surfactina a partir dos íons percusores [M-H]- de m/z 978, 992,
1006, 1020, 1034, 1048, 1062 e 1076 ..............................................
Resultados do bioensaio em culturas pareadas (Metodologia de
Christensen) das bactérias endofíticas contra patógenos humanos ..
Resultados do teste de antibiose em difusão em ágar dos extratos
das bactérias endofíticas e os principais íons detectados por ESIMS2
...................................................................................................
26
43
45
48
61
77
91
100
103
106
xiv
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1.
Esquema 2.
Esquema 3.
Esquema 4.
Esquema 5.
Esquema 6.
Esquema 7.
Variação dos lipopeptídeos produzidos por Bacillus subtilis
Representação da cadeia lateral ácido graxo da surfactina para n,
iso e anteiso ................................................................................
Metodologia de extração e purificação dos lipopeptídeos .............
Metodologia descrita para o bioensaio de culturas pareadas pelo
método de Christensen (1991). (A) Teste contra S. aureus, E.
faecalis, E. coli e P. aeruginosa. (B) Teste contra C. albicans ....
Representação esquemática da estrutura química geral de um
peptídeo apresentando a nomenclatura proposta por RoepstorffFohlmann-Biemann dos fragmentos formados devido à
transferência de energia para o peptídeo ........................................
Ilustração do rearranjo de McLafferty de um resíduo amino em
uma cadeia peptídica onde: (a) O local e a direção da clivagem
da transferência do γ-H pelo Rearranjo interresíduo de
McLafferty e (b) O local e a direção da clivagem γ-H pelo
Rearranjo intraresíduo de McLafferty ..........................................
Representação da clivagem γ e δ a apartir do resíduo do ácido
Aspártico .....................................................................................
39
42
70
73
87
89
94
xv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .....................................................................................
2.1 Produtos naturais derivados de microrganismos como fonte de produtos ................
2.2 Microrganismo endofítico .........................................................................................
2.3 Bactéria endofítica ....................................................................................................
2.4 Lipopeptídeos ............................................................................................................
2.4.1 Família da surfactina ........................................................................................
2.4.2 Família da iturina .............................................................................................
2.4.1 Família da fengicina .........................................................................................
2.5 Peptídeos sintetizados pela via não ribossomal ........................................................
2.6 Microrganismos mais comumente utilizados em testes microbianos .......................
2.6.1 Staphylococcus aureus .....................................................................................
2.6.2 Enterococcus falcalis .......................................................................................
2.6.3 Escherichia coli ................................................................................................
2.6.4 Pseudomonas aeruginosas ...............................................................................
2.6.5 Candida albicans .............................................................................................
3. OBJETIVOS .................................................................................... .............................
3.1 Geral .................................................................................... .....................................
3.2 Específico ..................................................................................................................
4. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................
4.1 Linhagens de bactérias endofíticas selecionadas ......................................................
4.2 Materiais e meio de cultura .......................................................................................
4.2.1 Meio de Cultivo para a Fermentação ...............................................................
4.2.2 Meio de cultivo para o crescimento dos microrganismos teste .......................
4.2.3 Esterelização dos meios e equipamentos .........................................................
4.3 Equipamentos de análises .........................................................................................
4.3.1 Seleção das linhagens produtoras de lipopeptídeos por ESI-ITMS .................
4.3.2 Análises das amostras de lipopeptídeos em equipamento de baixa resolução..
4.3.3 Análises das amostras de lipopeptídeos em equipamento de alta resolução ....
4.4 Procedimento experimental .......................................................................................
4.4.1 Pré-inóculo e condições de cultivo ...................................................................
4.4.2 Obtenção do sobrenadante ................................................................................
4.4.3 Seleção das linhagens produtoras de lipopeptídeos por espectrometria de
massas .............................................................................................................................
4.5 Extração dos Lipopeptídeos ......................................................................................
4.6 Seleção do método para purificação dos extratos lipopeptídicos .............................
4.6.1 Análise direta no ESI-ITMS do extrato LP76 ..................................................
4.6.2 Purificação por extração líquido-líquido ..........................................................
4.6.3 Purificação por extração em fase sólida (SPE) ................................................
4.7 Avaliação da extração dos lipopeptídeos por precipitação ácida ..............................
4.7.1 Análise direta no ESI-ITMS do meio ácido .....................................................
4.7.2 Extração líquido-líquido – meio ácido .............................................................
4.8 Análises dos extratos lipopeptídeos em equipamento de baixa resolução ................
4.9 Análises dos extratos lipopeptídeos em equipamento de alta resolução ...................
4.10 Avaliação da atividade antibiótica ..........................................................................
4.10.1 Microrganismos teste ...................................................................................
4.10.2 Reativação dos microrganismos teste ..........................................................
xvi
18
22
23
28
32
36
38
45
47
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54
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56
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63
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65
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66
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68
69
69
69
71
71
71
71
72
5.
6.
7.
8.
4.10.3 Bioensaio em culturas pareadas – teste de Christensen ...............................
4.10.4 Bioensaio pelo teste de difusão em Ágar .....................................................
4.10.4.1 Preparo das amostras e dos controles .............................................
4.10.4.2 Teste de difusão em Ágar ...............................................................
RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................
5.1 Seleção das linhagens produtoras de lipopeptídeos por ESI-ITMS ..........................
5.2 Extração e purificação dos lipopeptídeos ..................................................................
5.2.1 Comparação entre os métodos de purificação ..................................................
5.2.2 Avaliação da extração dos lipopeptídeos por precipitação ..............................
5.3 Identificação e caracterização dos lipopeptídeos presentes nos extratos selecionados
por ESI-ITMS de baixa resolução .............................................................
5.3.1 Caracterização dos lipopeptídeos por ESI-ITMS2 de baixa resolução ............
5.3.2 Caracterização dos lipopeptídeos por ESI-MS2 de alta resolução ...................
5.4 Avaliação da atividade antibiótica ...........................................................................
5.4.1 Teste de Christensen ..............................................................................................
5.4.2 Avaliação da atividade antibiótica dos extratos dos sobrenadantes por difusão em
ágar ............................................................................................................................
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ....................................................
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................
APÊNDICE ....................................................................................................................
xvii
73
73
74
74
75
76
81
81
83
84
86
92
102
102
106
113
115
135
1.
INTRODUÇÃO
O Brasil possui cerca de 20% da biodiversidade mundial, tendo a maior floresta
tropical, especialmente concentrada na Região Amazônica, e é fonte importante de
matérias-primas nas mais diversas áreas. No entanto, quase nada se conhece sobre sua
diversidade biológica, tão pouco em delimitar quais são todos os tipos de interações
prováveis entre microrganismos e outros integrantes do ecossistema (ROZSAK &
COLWELL, 1987; PACE, 1997). Com isso, podemos dizer que as fontes naturais ainda
estão disponíveis em abundância e oferecem as melhores possibilidades de encontrar
substâncias de interesse terapêutico.
Microrganismos, especialmente fungos e bactérias, são lembrados como
causadores de doenças. Esta associação é natural, e, infelizmente, mesmo em uma época
de tantos avanços científicos e tecnológicos, algumas infecções microbianas podem
comprometer a vida de pacientes principalmente aqueles que apresentam o sistema
imunológico debilitado. Esses processos patológicos frequentemente estão relacionados
a fatores de virulência microbianos, que podem incluir substâncias químicas conhecidas
como micotoxinas (LOPES et al., 2011). Outro fator se deve ao crescente uso de forma
abusiva e indiscriminada dos tradicionais antibióticos e fungicidas, contribuindo para o
surgimento de microrganismos patogênicos multirresistentes, tanto em humanos como
em animais e plantas tornando um grande problema de saúde no mundo todo (MACIEL
et al., 2002, SOUZA et al., 2003). Porém, microrganismos também são profícuos
produtores de substâncias químicas com grande aplicação na indústria farmacêutica, pois
são usadas como fármacos ou como estruturas-modelo para o planejamento e
desenvolvimento
de
fármacos.
Diversos
antibióticos,
anticancerígenos,
imunossupressores e agentes redutores do colesterol sanguíneo, entre outros, têm suas
origens em produtos naturais microbianos. Os microrganismos apresentam, portanto, uma
19
surpreendente capacidade de produzir substâncias químicas com elevado potencial
biológico (LOPES et al., 2011).
É muito provável que os produtos naturais sejam resultados das interações entre
organismos entre si e destes com o ambiente, e que desempenhem funções precisas e
definidas nessas associações simbióticas, representando uma das vantagens adaptativas e
evolutivas para os organismos produtores. Como consequência dessa função ecológica,
os produtos naturais microbianos constituem fontes promissoras para a bioprospecção de
novas moléculas com potencial aplicação na medicina (fármacos), agricultura
(agroquímicos) e nos estudos de processos biológicos (biologia química). De fato, a
investigação de microrganismos que vivem em associações simbióticas com outros
organismos (ex.: plantas, insetos, organismos marinhos, nematoides), e mesmo em
associação com outros microrganismos, vem sendo cada vez mais explorada na química
de produtos naturais como uma alternativa para a busca de moléculas com atividade
biológica. Desta forma há um imenso mercado para novas drogas de atividade
antimicrobiana e sua descoberta em países de grande biodiversidade como o Brasil, o que
faz com que as perspectivas para os estudos dos microrganismos endofíticos sejam
bastante promissoras principalmente com a possibilidade da descoberta de novos
antimicrobianos.
Dentre os microrganismos endofíticos destacam-se as bactérias. Entre as
substâncias produzidas por estes microrganismos, os lipopeptídeos têm atraído grande
interesse na área científica por suas atividades antifúngica, antibiótica, surfactante
(BARROS et al., 2007) e anti-inflamatórias (KIM et al., 1998).
Os lipopeptídeos são capazes de alterar as propriedades físicas e/ou químicas de
interfaces. Estes compostos podem atuar como antibióticos, agentes antivirais e
antitumorais, imunomoduladores ou inibidores de enzimas e toxinas. O modo de ação de
20
muitos desses compostos não foi esclarecido até o momento, apesar de se saber que suas
atividades de superfícies e de membrana desempenham um papel importante em diversos
sistemas. Muitos lipopeptídeos possuem potentes atividades antibióticas e foram
submetidos a diversos estudos na descoberta de novos antibióticos (BARROS et al.,
2007).
Visando contribuir com o conhecimento químico e biológico de bactérias
endofíticas amazônicas, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a partir de análises
por ESI-ITMSn a produção de lipopeptídeos e realizar ensaios biológicos em busca de
novas substâncias com potencial antibiótico.
21
2.
REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA
22
2.1 PRODUTOS NATURAIS DERIVADOS DE MICRORGANISMOS COMO
FONTE DE PRODUTOS BIOATIVOS
Produtos naturais microbianos representam uma apreciável fonte de estruturas
químicas únicas que têm sido otimizadas durante a evolução e produzidas por
comunicação e em resposta a mudanças no habitat microbiano, incluindo estresse
ambiental. Assim, esses compostos possuem importante papel no processo de descoberta
de fármacos (GROSS, 2009; GUNATILAKA, 2006; HERTWECK, 2009).
Os produtos naturais microbianos ao longo da última metade do século têm
fornecido um valor de substâncias bioativas considerável para a indústria farmacêutica.
Em particular, as áreas terapêuticas de doenças infecciosas e de oncologia têm se
beneficiado muito das numerosas classes de fármacos derivados de fontes naturais, além
de servirem como moldes para a modificação sintética. Cerca de 40 novos medicamentos
lançados no mercado entre 2000 e 2010 são provenientes de plantas, microorganismos,
organismos marinhos, vertebrados terrestres e invertebrados (BRAHMACHARI, 2012).
A alta diversidade química em produtos naturais, moléculas produzidas por
organismos vivos, está relacionada com a disponibilidade de precursores e reações
biossintéticas, além de sua função em determinado sistema biológico. A evolução das
rotas biossintéticas dos produtos naturais está ligada às necessidades funcionais de seus
ligantes, por isso há uma grande expectativa quanto à afinidade dos produtos naturais
pelos diversos alvos biológicos existentes. Os produtos naturais possuem alta diversidade
química, especificidade bioquímica e elevada afinidade quanto à ligação com receptores
específicos (MOLINARI, 2009). Além disso, possuem outras características que ilustram
a sua importância na busca de novos fármacos, como a complexidade e singularidade
estrutural, asociada ao amplo potencial biológico; são importantes ferramentas
bioquímicas, seguindo como guia para a biologia molecular e estudos biossintéticos e
23
investigação das funções celulares (CLARDY & WALSH, 2004); auxiliam na descoberta
de novos mecanismos de ação de fármacos (URIZAR et al., 2002), no desenho de
compostos sintéticos e são as principais fontes de farmacóforos (KNIGHT et al., 2003).
Comparando-se as principais fontes fornecedoras de compostos protótipos de novos
fármacos (síntese orgânica, produtos naturais, química combinatória e coleções virtuais
de compostos), a mais ampla diversidade química está associada às substâncias de origem
natural (HARVEY, 2008).
Os microrganismos são uma fonte promissora na busca de diversos metabólitos
bioativos e têm originado alguns dos mais importantes produtos para a indústria
farmacêutica com aplicações em diversas áreas: antibacterianos, antifúngicos, antivirais,
imunossupressores, antitumorais, inibidores enzimáticos, agentes estimulantes da
mobilidade
gástrica,
fármacos
hipocolesterolêmicos,
inseticidas,
herbicidas,
antiparasitários entre outras (DEMAIN & SANCHEZ, 2009).
A exploração de microrganismos como fonte de substâncias terapeuticamente úteis,
além de ser muito mais curta em relação ao uso de plantas na medicina, tem se destacado
pela grande quantidade de substâncias ativas. Desde a descoberta da penicilina por
Fleming em 1928, surgiram vários fármacos importantes baseados em metabólitos de
fungos,
incluindo antibióticos antibacterianos (β-lactâmicos, aminoglicosídeos,
tetraciclinas,
macrolídeos,
glicopeptídeos,
lipopeptídeos
e
estreptograminas)
(GUIMARÃES et al., 2010) e antibióticos antitumorais (antraciclinas, bleomicinas,
actnomicinas, mitomicinas) (PUPO et al., 2006).
Os produtos naturais, seus derivados sintéticos e compostos modelados em
substâncias naturais representam grande contribuíção dentre os fármacos aprovados no
período de 1981-2010 (NEWMAN & CRAGG, 2007). Cerca de 38 medicamentos
baseados em produtos naturais foram aprovados e lançados no mercado durante o período
24
de 2000 a 2010 (BRAHMACHARI, 2012), sendo 19 destes todos de origem microbiana
(Tabela 1) incluíndo a daptomicina (Cubicin) (RAJA et al., 2003), equinocandina B
(Anidulafungina) (VAZQUEZ & SOBEL, 2006), pneumocandina B (Caspofungin)
(GRAUL, 2002), FR901379 (micafungina) (JARVIS, et al., 2004) como representantes da
classe dos lipopeptídeos antibióticos.
O desenvolvimento de resistência nos microrganismos patogênicos e células
tumorais tem sido um dos maiores problemas de saúde da população, portanto, existe uma
necessidade contínua de novos agentes antibióticos e antitumorais. Além disso, a
toxicidade de antimicrobianos e antitumorais utilizados em tratamentos clínicos é
responsável por uma série de efeitos colaterais, jutificando assim a busca por substâncias
mais eficazes e menos tóxicas (CLARDY et al., 2006; DEMAIN & SANCHEZ, 2009).
25
Tabela 1. Medicamentos lançados no mercado entre os anos de 2000-2010 a partir de origem microbiana com referência ao seu composto ativo, classificação
e área terapêutica.
Nome Genérico /
Classe do
Ano
Composto Ativo
Classific.
Área Terapêutica
Referências
Comercial
Composto
Gemtuzumab
Antibiótico do tipo
BROSS et al., 2001; GILES
2000 ozogamicina
caliqueamicina
DPN**
Anticâncer
Enedina
et al., 2003
®
(Mylotarg )
GRAUL, 2002;
2001 Caspofungina
Lipopeptídeo
***
pneumocandina
B
SPN
Antifúngica
McCORMACK & PERRY
(Cancidas®)
antibiótico
2005
Ertapenem
Carbapenem
2001
tienamicina
DPN**
Antibacteriano
SHAD & ISSACA, 2003
(Invanz®)
antibiótico
Cefditoren pivoxil
Antibiótico βDARKES & PLOSKER,
2001
cefalosporina
DPN**
Antibacteriano
(Spectracef®)
Lactâmico
2002
MALANOSKI, 1993; CHEN
Biapenem
Carbapenem do tipo
2002
tienamicina
DPN**
Antibacteriano
®
(Omegacin )
β- lactâmico
& LIVERMORE, 1994.
Hidrocloridrato de
FRANTZ & SMITH, 2003;
2002 amrubicina
doxorrubicina
Antraquinona
DPN**
Anticâncer
GRAUL, 2004
(Calsed®)
Daptomicina
RAJA et al., 2003; TALLY
2003
daptomicina
Lipopeptídeos
PN*
Antibacteriano
(CubicinTM)
& DEBRUIN, 2000
Micofenolato de sódio
Antibióticos GRAUL, 2004; FRANTZ,
2003
ácido micofenólico
PN*
Imunosupressor
®
(Mifortic )
ácidos graxos
2004
ACKERMANN &
Telitromicina
RODLOFF, 2003;
2004
eritromicina A
Macrolídeos
SPN***
Antibacterianos
(Ketek®)
WELLINGTON, NOBLE,
2004
2005 Tigeciclina (Tigacil®)
tetraciclina
Tetraciclinas
SPN***
Antibacteriano
ROSE & RYBAK, 2006
Doripenem
Carbapenem do tipo
2005
tienamicina
PN*
Antibacteriano
LISTER, 2007
(Finibax®/DoribaxTM)
β-lactâmico
2005 Micafungina
Lipopeptídeos
FR901379
SPN***
Antifúngica
JARVIS et al., 2004
(Micamina®/Funguard ®)
macrocíclicos
2005
2006
2007
2007
2009
2009
2010
Fumagilina (Flisint®)
Anidulafungina
(EraxisTM/ EcaltaTM)
Temsirolimus
(ToriselTM)
Ixabepilona
(Ixempra TM)
Telavancina
(VibativTM)
Romidepsin
(Istodax®)
Aztreonam
(CaystonTM)
fumagilina
equinocandina B
sirolimus
epotilona B
vancomicina
romidepsin
aztreonam
Fonte: Adaptado de BRAHMACHARI, 2012.
Antibiótico
Lipopeptídeo
antibiótico
Antibiótico
macrólideo
Antibiótico
macrólideo
Lipoglicopeptídeo
Antibiótico
Depsipeptídico
Antibiótico
PN*
Antiparasitários
SPN***
Antifúngica
VAZQUEZ &SOBEL, 2006
SPN***
Anticâncer
GORE, 2007
DPN**
Anticâncer
CONLIN et. al., 2007
SPN***
Antibacteriano
PN*
Anticâncer
DPN
**
Antibacteriano
LEFKOVE et al., 2007
LAOHAVALEESON et al.,
2007
WOO et al., 2009
RETSCH-BOGART et, al,
2009; ORLICEK & SHARI,
1999
*PN - Produto natural; **DPN - Derivado de produto natural; ***SPN - Semissintético a partir de produto natural.
27
2.2 MICRORGANISMO ENDOFÍTICO
Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e estão presentes
nos mais variados ambientes interagindo com diversas formas de vida. Suas
características peculiares conferem adaptação e sobrevivência em ambientes
considerados hostis, desempenhando funções únicas e cruciais no funcionamento de
ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos
biogeoquímicos (MYERS, 1996; SCHIMEL, 1995).
A palavra endofítico origina-se do grego (endon, no interior; phyton, planta) e o
uso deste termo é tão amplo quanto sua definição literal. A denominação endófitos
compreende principalmente fungos e bactérias (SCHULZ & BOYLE, 2005), mas algas
(PETERS, 1991) e insetos (FELLER, 1995) também podem ser incluídos nesse grupo.
Petrini (1991) considerou microrganismos endofíticos ou simplesmente endófitos,
aqueles que colonizam o interior de tecidos aéreos das plantas em alguma fase do seu
ciclo de vida, sem lhes causar danos aparentes. Uma interpretação mais recente de
Azevedo & Araújo (2007) define como microrganismos endofíticos todos aqueles
cultiváveis ou não, que habitam o interior dos tecidos vegetais, sem causar danos
aparentes ao seu hospedeiro. A colonização dos endófitos pode ser intracelular e limitada
a uma única célula, intercelular e localizada, e intra e intercelular sistêmica (STONE et
al., 2000). A disseminação dos fungos e bactérias para as diversas partes da planta ocorre
de maneira sistêmica, habitando de forma ativa o apoplasto e os vasos condutores
(HALLMANN et al., 1997). Os mais variados órgãos vegetais como folhas, ramos,
caules, raízes e estruturas florais, tais como pólen, ovários, anteras e estames, podem ser
colonizados. Contudo, fungos e bactérias endofíticos parecem apresentar diferentes
preferências quanto às regiões da planta hospedeira que colonizam (ARAÚJO et al.,
2010).
A comunidade microbiana endofítica, representada principalmente por diferentes
espécies de fungos e bactérias, desempenham funções importantes no processo de
adaptação da planta com o meio ambiente (AZEVEDO, 1998; MENDES & AZEVEDO,
2007). Deste modo, os endófitos diferem dos microrganismos epifíticos, os quais vivem
na superfície das plantas, bem como dos microrganismos fitopatogênicos, que causam
sintomas de doenças aos seus hospedeiros. Diferentemente dos microrganismos
simbióticos, a colonização das plantas pelo endófito não forma estruturas visíveis no
hospedeiro, como é comumente observada pela formação de nódulos em raízes
colonizadas por bactérias fixadoras de nitrogênio conhecidas coletivamente como
rizóbios (AZEVEDO, 1998).
Os microrganismos endofíticos são um grupo ainda pouco estudado e, embora
tenham sido descritos desde o século XIX, só receberam importância no final do século
XX a partir dos anos 70. Além de exercerem funções importantes para a sobrevivência
do seu hospedeiro, os endófitos podem produzir metabólitos bioativos como toxinas,
antibióticos e outros compostos de potencial interesse biotecnológico (AZEVEDO,
1998).
Endófitos têm sido detectados em todas as espécies vegetais já pesquisadas (STONE
et al., 2000; STROBEL & DAISY, 2003). Estudos revelam uma diversidade cada vez
maior de microrganismos endofíticos (OKI et al., 2008). Evidências de microrganismos
associados às plantas foram detectadas em tecidos de folhas e ramos fossilizados
(TAYLOR & TAYLOR, 2000), indicando que essas relações endofíticas podem ter
evoluído a centenas de milhões de anos a partir do momento em que as plantas surgiram
pela primeira vez sobre a terra (STROBEL, 2003).
Os microrganismos endofíticos tiveram um papel crucial na adaptação e seleção de
diferentes espécies vegetais, estabelecendo, com a planta hospedeira, uma interação
29
mutualística, onde a planta protege e alimenta o microrganismo endofítico que, em troca,
melhora o crescimento e a competitividade da planta hospedeira. Durante o processo
evolutivo, a presença de alguns deles em determinadas plantas permitiu que elas se
desenvolvessem melhor e fossem mais resistentes tanto a ataques de insetos, animais
herbívoros e organismos patogênicos, quanto a condições ambientais adversas, como
baixa umidade e/ou elevadas temperaturas e radiações (AZEVEDO, 1998; AZEVEDO et
al., 2000; OKI et al., 2008). Isto ocorre devido aos endófitos serem capazes de modificar
as respostas das plantas aos estímulos ambientais, principalmente em relação à variação
espacial e dinâmica vegetativa. Isso se deve à capacidade dos endófitos de modificar as
plantas em nível genético, fisiológico e ecológico (LUCERO et al., 2006). Numa
abordagem biotecnológica, fungos endofíticos podem ser alterados geneticamente com
objetivo de introduzir características de interesse nas plantas hospedeiras (PAMPHILE et
al., 2004).
Acredita-se que os metabólitos secundários bioativos produzidos por esses
microrganismos possam estar diretamente associados com a planta hospedeira através da
recombinação gênica entre as espécies durante a fase evolutiva. De fato, alguns dados da
literatura têm mostrado a habilidade dos fungos endofíticos de produzir in vitro
metabólitos secundários idênticos aos da planta hospedeira (BORGES et al., 2009;
STROBEL et al., 2004). O mais marcante exemplo foi o isolamento do antitumoral taxol
nos anos 90 realizado por Stierle et al. (1993) provando que o fungo endofítico Taxomyces
andreanea, encontrado no interior da planta Taxus brevifolia, foi capaz de produzir este
complexo diterpenoide, com atividade antimitótica, utilizado contra câncer de ovário e de
mama, bem como no tratamento de inúmeras doenças proliferativas de humanos. Outros
produtos
naturais
vegetais
anticancerígenos
como,
vincristina,
camptotecina,
podofilotoxina e hipericina (BORGES et al., 2009), foram também isolados de fungos
30
endofíticos associados aos respectivos hospedeiros vegetais, evidenciando que uma
correspondência entre o metabolismo secundário da planta e de seus endófitos pode ser
bastante comum (PIMENTEL et. al., 2011). Nesse contexto, fica evidente a importância
da etnobotânica nos estudos de bioprospecção por microrganismos endofiticos. Novos
produtos naturais bioativos têm sido frequentemente descritos na literatura, demonstrando
a relevância desses microrganismos (BORGES et al., 2009).
Deste modo, estes microrganismos representam um fornecedor alternativo de
compostos fitoquímicos característicos das plantas (STROBEL & DASY, 2003;
STROBEL et al., 2003). Do ponto de vista ecológico é extremamente importante a
descoberta de fontes microbianas produtoras de fármacos de alto valor agregado, porém
produzidos em quantidades reduzidas por espécies vegetais para garantir a preservação
destas espécies, mantendo a produção de compostos que garantam a vida de pessoas
afetadas por inúmeras doenças (AZEVEDO et al. 1998).
O estudo sobre o potencial de fungos e bactérias endofíticas para a área
farmacêutica e biotecnológica tem sido relevante há vários anos, devido à descoberta de
novas substâncias para uso terapêutico humano, como por exemplo, antibióticos,
antifúngicos (AZEVEDO et al., 2000), antimaláricos e anticancerígenos (STROBEL et
al., 2002; STROBEL & DAISY, 2003). Logo, o isolamento e caracterização de
microrganismos endofíticos de plantas ainda não estudadas possibilitam a descoberta de
novas espécies com potencial para produzir substâncias de interesse, tais como compostos
com atividade antimicrobiana, que são de extrema importância para indústria
farmacêutica (STROBEL & DAISY, 2003).
31
2.3 BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS
A constatação de bactérias endofíticas em tecidos de plantas saudáveis tem sido
relatada para muitas espécies cultivadas, em diferentes estágios de crescimento
(JACOBS, 1985; HINTON & BACON, 1995; STURZ, 1995).
Os gêneros mais comumentes isolados destes microrganismos incluem: Bacillus,
Agrobacterium, Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas e Pseudomonas, que
foram isoladas a partir de plantas agrícolas e macrófitas, sendo um dos principais e mais
abundantes grupos de microrganismos que interagem com as plantas (HALLMAN et al.,
1997; LODEWYCKX et al., 2002).
Rizobactérias que se instalam no interior das raízes das plantas, formando
associações, são endofíticas. Mas o conceito estende-se ainda para bactérias que podem
ser isoladas de plantas cujos tecidos foram desinfectados superficialmente ou extraídas
do interior das plantas, e que não causam prejuízo visível às mesmas (GRAY & SMITH,
2005). Com isso, as bactérias endofíticas têm sido isoladas de raiz, nódulos, caules, folhas
e frutos em uma extensa variedade de plantas (ARAÚJO et al., 2000). Acredita-se que as
bactérias endofíticas se dispersam nas plantas através das sementes, propagação
vegetativa, implementos agrícolas, ventos ou insetos (BALDANI, 1997). Uma vez
presentes no solo, elas penetram na planta, via zona radicular, através de aberturas que
ocorrem naturalmente como resultado do crescimento das plantas ou através de pelos
radiculares (SPRENT & FARIA, 1988).
A maneira de penetração também pode ser pelas aberturas naturais, estômatos,
lenticelas, hidatódios, ou por injúrias causadas por insetos e maquinário agrícola. Além
disso, essas bactérias são capazes de degradar a parede celular das plantas pela liberação
de enzimas hidrolíticas como celulases e pectinases, sendo essa uma possível forma de
penetração. Embora observações demonstrem a possibilidade de mecanismos de
32
penetração ativa de algumas bactérias endofíticas, muito pouco se sabe sobre a origem e
regulação dessas enzimas (LODEWYCKX et al., 2002). Uma maneira diferente de
penetração é descrita por Ashbolt & Inkerman (1990) em cana-de-açúcar através da
associação com cochonilha, e por Kluepfel (1993) via diferentes insetos.
Então, pode-se dizer que a colonização endofítica pode ser intracelular e limitada
ao interior de algumas células, intercelular localizada, e intra e intercelular, ao mesmo
tempo, de maneira sistêmica (STONE et al., 2000). Os diferentes mecanismos de
distribuição das bactérias endofíticas podem estar relacionados com interações com
outras bactérias ou com os diferentes mecanismos de cada microrganismo, que lhes
permitem habitar vários nichos, representado pelos tecidos e, mais especificamente, pelos
espaços intercelulares no interior de cada tecido (DI FIORI & DEL GALLO, 1995). Além
disso, sua habilidade de sobreviver dentro de tecidos vegetais com pouca ou nenhuma
competição microbiana, faz delas candidatas potenciais a aplicações biotecnológicas.
Um dos primeiros trabalhos com bactérias endofíticas foi realizado por Colombo
(1978), no qual observou a presença de bactérias endofíticas nas zonas mais jovens dos
talos de algas, entre sifões e dentro dos filamentos cenocíticos, além de se encontrarem
próximo aos cloroplastos, o que indicaria uma ligação com a atividade fotossintética da
alga e sua provável dependência de oxigênio. Esta ocorrência foi sugerida pelo autor
como sendo um equilíbrio fisiológico entre a bactéria e seu hospedeiro.
As bactérias endofíticas têm sido alvo de vários estudos, com diferentes culturas,
uma vez que elas possuem a habilidade de se manter dentro dos tecidos vegetais isentos
da competição microbiana, além de serem menos afetadas pela temperatura, potencial
osmótico e radiação ultravioleta (LODEWYCKX et al., 2002), o que é uma vantagem
ecológica sobre as bactérias epifíticas. Embora não seja, ainda, totalmente compreendida
a interação entre esses microrganismos e seu hospedeiro (planta), o progresso tem sido
33
feito na aplicação dos metabólitos produzidos por essas bactérias, visto que estes possuem
diversas funções biológicas (HALLMANN et al., 1997).
Dentre as bactérias endofíticas mais conhecidos, podemos destacar o grupo dos
actinomicetos que são bactérias Gram-positivas as quais podem desenvolver micélio
superficial e submerso (STROBEL, 2003). Estes constituem um grupo de bactérias
conhecido principalmente por sua ampla produção de metabólitos secundários
(antibióticos; enzimas extra-celulares, entre outros) (INBAR et al., 2005).
Os actinomicetos são também utilizados como agente de controle biológico, devido
à sua ampla produção de antibióticos e compostos bioativos que atuam controlando
fitopatógenos (GOODFELLOW & WILLIAMS, 1983).
O gênero Streptomyces spp, pertencente ao grupo dos actnomicetos, tem sido um
dos mais estudados devido à diversidade de metabólitos secundários por ele produzidos
com aplicações na medicina e na agropecuária (INBAR et al., 2005). Tal fato justifica o
grande interesse comercial nesse grupo de bactérias, pois mais de 80% dos antibióticos
produzidos industrialmente são processados por espécies desse gênero (CHALLIS &
HOPWOOD, 2003).
CASTILLO et al. (2002) isolaram Streptomyces ssp. a partir de Kennedia
nigriscans, planta medicinal nativa do norte da Austrália, produtora de mununbicina E4
e E5, um antibiótico de amplo espectro contra patógenos humanos e de plantas. Outro
exemplo foi o trabalho realizado por STROBEL (2007) através do qual ficou constatada
a atividade antifúngica de três Streptomyces endofíticos isolado das plantas medicinais
Thottea grandiflora, Polyalthia ssp. e Mapania spp.
O gênero Bacillus é citado em alguns trabalhos como a principal bactéria endofítica
que ocorre em determinadas plantas (HALLMANN et al., 1997). As espécies mais
frequentemente citadas como endofíticas são: Bacillus cereus (ARAÚJO et al., 2002,
34
ARAÚJO et al., 2001, PLEBAN et al., 1995), B. subtilis (BAI et al., 2002, ARAÚJO et
al., 2001), B. insolitus (STURZ et al., 1997), B. brevis (STURZ et al., 1997), B. pumilus
(ARAÚJO et al., 2002, ARAÚJO et al., 2001) e B. lentus (ARAÚJO et al., 2001).
O gênero Bacillus é caracterizado como bactéria Gram-positiva, aeróbia ou
anaeróbia facultativa, formato circular, e são principalmente conhecidos como produtores
de antibióticos com atividade antagônica contra fungos e bactérias patogênicas
(LOEFFLER et al., 1986; KREBS et al., 1998). Além disso, eles formam esporos que
podem ser facilmente formulados, e tem alta viabilidade comparada com células
vegetativas (BOCHOW et al., 1995).
A maioria dos antibióticos produzida por Bacillus ssp. tem sido caracterizado como
dipeptídeos ou peptídeos cíclicos (LOEFLER et al., 1986; NAKANO; ZUBER, 1990). A
espécie de Bacillus subtilis é o principal produtor de peptídeos com aplicação tanto na
área biotecnológica como farmacêutica. Uma classe bem conhecida são os lipopeptídeos
incluindo a surfactina, iturina, fengicina, micosubtilina e bacilomicina, que possuem ação
biosurfactante por seu caráter anfifílico e são pepetídeos antibióticos com grandes
atividades antimicrobianas entre outras. (VATER et al., 2002)
Cho e colaboradores (2009) concluíram que a bactéria Bacillus pumilus pode ser
utilizada no controle dos fungos Aspergillus flavus e Aspergilus parasiticus, na inibição
de aflatoxina por eles produzida, além de promover benefícios adicionais como ação
antitumoral, antimicoplasmática, hemolítica e atividade fibrinolítica, quando adicionada
no alimento.
Várias são as razões para que investigações sejam conduzidas com bactérias
endofíticas, entre elas pode-se citar: i) carência de informações nos aspectos ecológicos,
genéticos e fisiológicos para elucidar a interação entre bactérias e plantas; ii) escassez de
dados a respeito de bactérias endofíticas em plantas da Região Amazônica, em relação ao
35
estudo de endófitos provenientes de plantas de clima equatorial; iii) vários endófitos
produzem antibióticos e outros metabólitos de interesse farmacológico (AZEVEDO, et
al, 2000; MARCON, 2002); iv) endófitos podem ser aplicados como agentes no controle
biológico de pragas e de doenças (AZEVEDO, et al., 2000; STURZ et al., 2000) dentre
outros.
2.4 LIPOPEPTÍDEOS
Os lipopeptídeos são sintetizados por uma ampla gama de gêneros de microorganismos,
incluindo
Pseudomonas,
Streptomyces
roseosporus
e
Bacillus
(NISTSCHKE & PASTORE, 2002). Devido a sua excepcional capacidade de interagir
com a membrana, os lipopeptídeos são bem conhecidos como antimicrobianos, embora
na presença de compostos hidrofóbicos possam vir a agir como poderosos surfactantes
exibindo uma ampla gama de atividades com diferentes aplicações na indústria
farmacêutica e alimentícia.
A daptomicida (Figura 1) é um lipopeptídeo isolado de Streptomyces roseosporus e
aprovado em 2003 para tratamento de infecções da pele causada por agentes patogênicos
Gram positivos, e para bacteremia e endocardite provocadas por Staphylococcus aureus
(NGUYEN et al., 2006). Seu mecanismo de ação envolve desorganização de múltiplas
funções da membrana celular bacteriana sendo provável que todos os antibióticos
lipopeptídicos apresentem alguma penetração na membrana devido às cadeias alquílicas,
o que promove sua desorganização. Com isso, muitos compostos lipopeptídicos possuem
potentes atividades antibióticas, e foram submetidos a diversos estudos na descoberta de
novos antibióticos (LANG, 2002; KUIPER et al., 2004; NGUYEN et al., 2006; PATHAK
et al., 2012). Em estudos de Lang (2002) e Kuiper e colaboradores (2004), o lipopeptídeo
36
viscosina, produzido por Pseudomonas fluorescens, apresentou atividade antifúngica no
biocontrole de fungos fitopatógenos.
O
CH3
HOOC
CH3
HN
O
NH
NH
O
O
NH
CH3
NH
O
O
COOH
N
H
NH
COOH
NH2
O
O
H3C
O
H2N
NH
O
HN
O
O
O
HN
O
O
O
H
N
OH
NH2
NH
NH
N
H
O
HOOC
Figura 1. Estrutura do lipopeptídeo antibiótico daptomicina.
Outros lipopeptídeos antibióticos são produzidos por bactérias do gênero Bacillus,
incluindo B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. globigii, B. pumilus, B.
cereus, B. megatarium e B. thurigiensis, sendo, os mais conhecidos, divididos em três
principais famílias: surfactina, iturina e fengicina (COOPER et al., 1981; NISTSCHKE
& PASTORE, 2002; PATHAK et al., 2012; PERFUMO et al., 2010).
Alguns lipopeptídeos são considerados alternativas apropriadas para agentes
antimicrobianos sintéticos e podem ser usados de modo seguro e efetivo como agente
terapêutico, o que vem a ser particularmente importante, devido ao aumento no número
de bactérias patogênicas resistentes, exigindo tratamentos constantes e a busca de outras
linhas de tratamentos (SEYDLOVA & SVOBODOVA, 2008).
Esses compostos anfifílicos são produzidos através de síntese não ribossômica de
peptídeos, que segue um mecanismo de linha de montagem, envolvendo intermediários
ativos acoplados em regiões específicas de enzimas multifuncionais, produzindo a partir
37
do crescimento microbiano, antibióticos e biossurfactantes normalmente excretados para
o meio de cultura (ETCHEGARAY et al., 2008, CHEN et al., 2007).
As famílias dos lipopeptídeos subdividem-se em isoformas (Esquema 1), que
diferem na composição dos aminoácidos da parte peptídica. As isoformas podem ainda
ser subdividas em séries homólogas, que variam no número de átomos de carbono que
compõem a cadeia lipídica (DELEU et al., 1999; VATER et al., 2002; ONGENA et al.,
2007; ROMERO et al., 2007; JACQUES, 2011). A porção peptídica destas moléculas
pode ser neutra ou aniônica e frequentemente estão dispostos em uma estrutura cíclica
ligados a ácidos graxos β-amino (iturina) ou ácido β-hidroxi (surfactina e fengicina) com
variação na cadeia lateral. (ALVAREZ et al. 2012; HATHOUT et al., 2000; JACQUES,
2011; ZHANG et al., 2013).
2.4.1 Família da Surfactina
A história da surfactina inicia-se a partir do ano de 1968, quando Arima e
colaboradores identificaram a presença de um novo composto biologicamente ativo
presente no caldo fermentativo de uma cepa de Bacillus subtillis. O nome surfactina
surgiu devido à sua alta capacidade surfactante, e a sua estrutura foi elucidada quanto a
de um lipopeptídeo macrolídeo (PEYPOUX, 1999).
A surfactina é um lipopeptídeos produzido por várias cepas de Bacillus subtillis
(ARIMA et al., 1968; COSTA, et al, 2005) sendo mais conhecida por possuir excelentes
propriedades tensoativas, capaz de baixar a tensão superficial da água de 72 mN/m para
27,9 mN/m em concentrações tão baixas quanto 0,005% , além de reduzir a tensão
interfacial do sistema água/hexadecano de 43 para valores menores que 1 mN/m. Exibe
uma grande estabilidade em variações de pH, temperatura e força iônica (BARROS et al.,
2007, DESAI & BANAT, 1997). É uma substância anfipática, que possui ampla atividade
38
(FAMÍLIAS)
Fengicina
CH3 (CH2)10-14CHCH2CO-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala/Val
Surfactina
CH3 (CH2)9-12CHCH2CO-Glu-Leu-Leu-V sse4al-Asp-Leu/Val/Ile
Iturina
CH3 (CH2)10-13CHCH2CO-Asp/Asn-Tyr-Asn-Pro-Asn-Ser
O
OH
O
NH
lle-Tyr-Gln-Pro
(ISOFORMAS)
Surfactina A
CH3 (CH2)8-12CHCH2CO-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu
Surfactina B
CH3 (CH2)9-12CHCH2CO-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Val
O
Surfactina C
CH3 (CH2)9-12CHCH2CO-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-lle
O
O
(HOMÓLOGOS)
Surfactina B, C13
CH3 (CH2)9CHCH2CO-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Val
O
Surfactina B, C14
O
Esquema 1: Variação dos lipopeptídeos produzidos por Bacillus subtilis.
Adaptado de Dexter et al., 2008 e P. Jaques, 2011.
Surfactina B, C15
O
biológica, tal como, antifúngica, bactericida, antitumoral contra o carcinoma de Ehrlich,
fibrinolítica, hemolítica, bem como a capacidade de lisar esferoplastos e protoplastos de
várias bactérias (ULLRICH et al., 1991), hipocolesterolêmico (KAMEDA et al., 1974),
anti-HIV (BONMATIN et al., 1995) efeitos imunomodulatório (PARK e KIM, 2009) e
ainda atividade anti-inflamatória (KIM et al., 1998). Em relação à capacidade de destruir
eritrócitos em meio ágar sangue, esta tem sido constantemente utilizada para ensaios de
seleção de microrganismos produtores de surfactantes, sendo o tamanho do halo de
hemólise associado com a capacidade de produção dessas substâncias (LIN, 1996), que
podem ainda sofrer influência de alguns parâmetros, como, por exemplo, o pH e a cadeia
hidrofóbica da molécula (número de carbonos e ramificações) (PROKOF’EVA et al.,
1999). Segundo Bonmatin, (1995) as atividades biológicas da surfactina estão
relacionadas com a sua capacidade de interagir com os cátions e fosfolípidios da
membrana celular.
Nitschke (2004) avaliou a atividade antibiótica do lipopeptídeo surfactina
produzido por uma cepa de Bacillus subtilis (LB5a) em meio de manipueira. Foram
testadas bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, além de alguns fungos filamentosos
e leveduras. Todas as bactérias apresentaram susceptibilidade ao produto, sendo
Pseudomonas aeruginosa a mais sensível, entre as Gram-negativas, e Micrococcus luteus
e Bacillus cereus as gram-positivas mais susceptíveis. O estudo não observou alteração
no crescimento dos fungos e leveduras avaliados na presença do lipopeptídeo.
Por outro lado, a atividade anti-inflamatória da surfactina foi comprovada tanto in
vivo quanto in vitro e deve-se à inibição direta e seletiva da Fosfolipase A2 citosólica
(PLA2), enzima lipolítica que hidrolisa fosfolipídios de membrana, liberando, na
presença de Ca+2, ácido araquidônico, precursor de mediadores químicos do processo
inflamatório, prostaglandinas e leucotrienos (KIM et al., 1997). Por sua vez, a atividade
antitumoral contra células do carcinoma de Ehrlich foi relatada por Kameda et al., (1974),
no caldo fermentado de Bacillus natto, no qual foram encontradas duas substâncias, sendo
uma delas, surfactina.
A crescente descoberta de propriedades interessantes com aplicações nas áreas da
medicina e biotecnologia promoveu o interesse em pesquisa por surfactina e como
resultado, uma grande variedade de isoformas e homólogos deste lipopeptídeos já foram
encontrados. Dependendo da composição do meio, a surfactina ocorre como um conjunto
de variantes, chamados isoformas, que se diferenciam pela composição de aminoácidos
da porção peptídica (ULLRICH et al., 1991). Sendo a família da surfactina composta por
aproximadamente 38 diferentes tipos de lipopeptídeos (BONMATIN et al. 2003)
divididas em 7 isoformas: bamilocina A, esperina, lichenisina, pumilacidina, [Ala4]
surfactina, [Leu4] surfactina, [Ile4] surfactina e as surfactinas A, B e C (Tabela 2).
Embora outros lipopeptídeos tenham surgido, a surfactina continua sendo o
principal representante e mais conhecido membro desta família (PEYPOUX, 1999). A
principal isoforma, surfactina A (Leu7 – surfactina), que constitui esta estrutura é formado
por um resíduo L-leucina com C-terminal do aminoácido ligado através de uma ligação
éster ao ácido graxo β-hidróxilado, sendo chamado quimicamente de ácido 3-hidroxi-13metil-tetradecanoico, como ilustrado na figura 2 (VATER et al., 2002; LIU et al., 2008).
Os isômeros diferem-se através do número de carbono na cadeia lipídica, que pode variar
de 12 a 16 átomos, comumente compostos pelos tipos, n, iso e anteiso (Esquema 2) bem
como, da composição da parte peptídica (LIU et al., 2008; ZHANG et al., 2013). As
isoformas da surfactina A, B e C variam na posição do sétimo aminoácido, entre Leu
(surfactina A), Val (surfactina B) e Ile (surfactina C) (Figura 2) e a proporção da produção
destas irá depender da linhagem utilizada e das condições de cultivos (LIU et al. 2012).
A porção peptídica da surfactina inclui dois resíduos ácidos (aspargina e glutamina) e
41
cinco resíduos hidrofóbicos (quatro leucinas e uma valina) com sequência quiral
LLDLLDL (Tabela 2).
O grupo de surfactinas melhor caracterizado apresenta valores de razão massa/carga
entre 1000 e 1060 (KIM et al., 2009). O enorme interesse em torno das propriedades da
surfactina vem promovendo o surgimento de inúmeras pesquisas em busca de novas
isoformas desta molécula, que apresentem aumento das propriedades biossurfactantes.
Como resultado, inúmeras variantes de surfactina tem sido citada (SONG et al., 2009;
KIM et al., 2009; LIU et al., 2008).
A1
A2
A3
Cadeia lateral ácido graxo:
A5
O C
CH2
CH
O
Cadeia lateral ácido graxo
A4
A6
C
A7
CH3-(CH2)n-CH2- (normal)
(CH3)2CH-(CH2)n-1-CH2- (iso)
CH3-CH2-CH(CH3)-(CH2)n-1-CH2 (anteiso)
O
Esquema 2. Representação da cadeia lateral ácido graxo da surfactina para n, iso e
anteiso.
42
Tabela 2. Sequência peptídica e principais cadeias de ácidos graxos para os lipopeptídeos da família da surfactina.
NOME
Família da
Surfactina
SEQUÊNCIA PEPTÍDICA
Heptapeptídeos cíclico com um anel de lactona com o grupo
β-OH ligado a cadeia de ácido graxo
PRINCIPAIS CADEIAS
DE ÁCIDOS GRAXOS
REFERÊNCIAS
PEYPOUX et al., 1999;
BONMATIN et al., 1995;
PECCI et al., 2010
Surfactina A
7
1
2
3
4
5
6
L-Glu -L-Leu -D-Leu -L-Val -L-Asp -D-Leu -L-Leu
C12, C13, iC14, nC14, iC15,
aC15, C16
Surfactina B
7
1
2
3
4
5
6
L-Glu -L-Leu -D-Leu -L-Val -L-Asp -D-Leu -L-Val
iC14, nC14, iC15, aC15
PEYPOUX et al., 1999
Surfactina C
7
1
2
3
4
5
6
L-Glu -L-Leu -D-Leu -L-Val -L-Asp -D-Leu -L-Ile
iC14, nC14, iC15, aC15
PEYPOUX et al., 1999
[Ala4] surfactina
7
1
2
3
4
5
6
L-Glu -L-Leu -D-Leu -L-Ala -L-Asp -D-Leu -L-Leu
iC14, nC14, iC15, aC15
BONMATIN et al., 2003
[Leu4] surfactina
7
1
2
3
4
5
6
L-Glu -L-Leu -D-Leu -L-Leu -L-Asp -D-Leu -L-Leu
iC15
[Ile4] surfactina
7
1
2
3
4
5
6
L-Glu -L-Leu -D-Leu -L-Ile -L-Asp -D-Leu -L-Ile
aC15
Bamilocina Aa
Glu1-Leu2-Met-Leu3-Prol4-Leu5-Leu6-Leu7
C13
LEE et al., 2007
Esperinab
1
2
3
4
5
6
7
L-Glu -L-Leu -D-Leu -L-Val -L-Asp -D-Leu -L-Leu/Val -COOH
C13, C14, nC15
[Val7] Lichenisina
7
1
2
3
4
5
6
L-Gln -L-Leu/Ile -D-Leu -L-Val -L-Asp -D-Leu -L-Val
[Ile4] Lichenisina
4
1
2
3
5
6
7
L-Gln -L-Leu -D-Leu -L-Ile -L-Asp -D-Leu -L-Ile
aC15
[Ile2,4] Lichenisina
1
L-Gln -L-
Ile2-D-Leu3-L-Ile4-L-Asp5-D-Leu6-L-Ile7
aC15
Pumilacidina
1
2
3
4
5
6
7
L-Glu -L-Leu -D-Leu -L-Leu -L-Asp -D-Leu -L-Val/Ile
a
iC13, aC13, nC14, iC15, aC15
aC15, iC15, nC16, iC16, aC17,
iC17
As formas L e D não estão definidas; bO β- carboxil da Asp5 está conectado no anel lactona.
THOMAS e ITO, 1969
LIN et al., 1994
LIN et al., 1994
LIN et al., 1994
NARUSE et al., 1990
A)
L- Glu
O
L- Leu
O
HO
O
N
H
NH
O
HN
D- Leu
O
O
H
N
O
HN
O
O
O
L-Leu
L- Val
NH
N
H
O
OH
D- Leu
L- Asp
B)
O
L-Glu
L-Leu
O
HO
O
N
H
NH
O
HN
O
O
H
N
D-Leu
O
HN
O
O
O
L-Val
L-Val
NH
N
H
O
OH
D-Leu
L- Asp
O
L-Glu
C)
L-Leu
O
HO
O
N
H
NH
O
O
O
H
N
HN
HN
D-Leu
O
O
O
O
L-Ile
L-Val
NH
N
H
D-Leu
O
OH
L- Asp
Figura 2. Estrutura do principal homólogo da surfactina, o ácido 3-hidroxi-13-metiltetradecanoico (iso-C15). Isoformas: (A) Surfactina A, (B) Surfactina B e (C) Surfactina C.
2.4.2 Família da Iturina
Iturina A é o composto principal e mais conhecido da família da iturina, que foi
isolado de Bacillus subtilis a partir de uma amostra de solo, na região de Ituri (Zaire)
durante o ano de 1957. O subsequente isolamento a partir de outras estirpes de B. subtillis
levou a identificação de outros lipopeptídeos. Além da iturina A (Figura 3-A), a literatura
realata sete homólogos de iturina que se diferenciam através do comprimento da cadeia
carbônica e da presença de cadeias laterais (NORIYASU et al., 2009) como, iturina AL e
C, micosubtilisina, bacilomicinas D, F, L e Lc (ou bacillopeptina), os quais são inseridos
no grupo da Iturina (Tabela 3) (Bonmatin, 2003).
Tabela 3. Sequência peptídica e principais cadeias de ácidos graxos para os lipopeptídeos
da família da Iturina.
Principais cadeias
Resíduos de aminoácidos
Família da Iturina
de ácido graxos
L
D
D
L
L
D
L
β-amino ácido
Iturina A
Asn Tyr Asn Gln Pro Asn Ser n-C14, i-C15, a-C15
Iturina AL
Asn Tyr Asn Gln Pro Asn Ser n-C16, i-C16
Iturina C
Asp Tyr Asn Gln Pro Asn Ser n-C14, i-C15, a-C15
Micosubtilina
Asn Tyr Asn Pro Pro Ser Asn i-C16, a-C17
Bacilomicina D
Asn Tyr Asn Gln Glu Ser Thr n-C14, i-C15, a-C15
Bacilomicina F
Asn Tyr Asn Pro Pro Asn Thr i-C16, a-C17, i-C17
Bacilomicina L
Asp Tyr Asn Gln Gln Ser Thr n-C14, i-C15, a-C15
Fonte: Adaptado de Jacques, 2011.
O esqueleto químico desta família também é lipo-heptapeptídicos assim como as
surfactinas, mas com sequência peptídica diferente (Tabela 3). Estes compostos são
lipopetídeos neutros ou monoaniônicos. Todos os compostos têm: a mesma sequência
quiral LDDLLDL, com um número restrito de resíduos: Asx, Tyr, Asn, Gln/Pro, Pro/Glx,
45
Asn/Ser, Ser/Asn/Thr, e possuem ligação β-amino ácido. As iturinas contém uma mistura
de isômeros de ácido iturínico variando entre 13 a 17 átomos de carbono (VATER et al.,
2002; ONGENA et al., 2007; ROMERO et al., 2007) com configurações n, iso e anteiso
(BONMATIN, 2003). Estes lipopeptídeos destacam-se por apresentar elevada ação
antifúngica, devido à ação sobre a membrana citoplasmática da célula alvo, que tem sua
permeabilidade de íon alterada, permitindo a saída de íons K+, resultando em morte
celular e atividade antibiótica (ALVAREZ et al., 2012; HSYEH et al., 2008; MAGETDANA et al., 1992). Esta família apresenta semelhanças à surfactina, com um forte
caráter anfipático (referente a moléculas que contêm porções hidrofílica e hidrofóbica),
sendo essa a razão da sua comprovada atividade sobre as membranas celulares. Além
disso, possui um amplo espectro de ação e baixa toxicidade como antifúngico (GRAU et
al., 2001).
A)
L-Ser
L-Asn
H2N
OH
H
N
O
H
N
N
H
O
O
O
O
HN
HO
O
NH
D-Tyr
O
O
O
O
NH2
NH
D-Asn
N
O
L-Pro
N
H
NH2
O
H2N
L-Gln
D-Asn
46
B)
L-Ser
L-Asp
HO
OH
H
N
O
H
N
N
H
O
O
O
O
HN
HO
O
NH
D-Tyr
O
O
O
O
NH2
NH
D-Asn
N
O
L-Pro
N
H
NH2
O
H2N
L-Gln
D-Asn
Figura 3. Estrutura do principal homólogo (n-C13) da iturina. Isoforma: (A) Iturina A,
(B) Iturina C.
A ação conjunta da iturina e da surfactina contra fitopatógenos foi comprovada
pela comparação in vitro de duas linhagens de Bacillus. Nos metabólitos produzidos por
B. subtilis RB14, mostrou melhor atividade inibitória contra diversos fitopatógenos do
que o B. subtilis NB22, devido à produção simultânea dessas substâncias (OHNO et al.,
1995).
2.4.3 Família da Fengicina
Essa família de lipopeptídeos inclui as isoformas da fengicina A, B e plipastatina,
que é composta por um ácido graxo β-hidroxilado ligado a uma porção peptídica de 10
aminoácidos que mostram propriedades incomuns, como a presença de ornitina na porção
peptídica. A cadeia lipídica pode variar de 13 a 18 átomos de carbono, distribuídos nas
formas n, iso, anteiso, podendo ser saturado ou insaturado. As fengicinas consistem de
47
duas principais isoformas que diferem na posição 6 da cadeia peptídica pela troca de um
aminoácido. A fengicina A (Figura 4) é composta por L-Glu-D-Orn-D-Tyr-D-allo-ThrL-Glu-D-Ala-L-Pro-L-Gln-L-Tyr-L-Ile, e na fengicina B, o resíduo de aminoácido D-Ala
é substituído por D-Val. Em ambas as isoformas, há uma ligação lactona conectando DTyr e L-Ile (ROMERO et al., 2007; ONGENA et al., 2007; VANITTANAKOM et al.,
1986; VATER et al., 2002). As fengicinas possuem forte atividade surfactante e
antifúngica, embora mais específicas para fungos filamentosos (VANITTANAKOM et
al., 1986) mas é ineficaz frente a bactérias e leveduras (ROMERO et al., 2007; ONGENA
et al., 2007; VANITTANAKOM et al., 1986; VATER et al., 2002).
Tabela 4. Sequência peptídica e principais cadeias de ácidos graxos para os lipopeptídeos
da família da fengicina.
Nome
Sequência peptídica
Família da
Fengicina
Decapeptídio com um anel de lactona
entre o grupo carboxi-terminal de Ile10
e grupo OH de Tyr.
Fengicina A
Fengicina B
L-Glu-D-Orn-D-Tyr-D-Thr
–L-Glu-D-Ala-L-
Prol-LGln-L-Tyr-L-Ile
–L-Glu-D-Val-L-
Prol-LGln-L-Tyr-L-Ile
Plipastatina
A
Plipastatina
B
–L-Glu-D-Ala-L-
Prol-LGln-D-Tyr-L-Ile
Prol-LGln-D-Tyr-L-Ile
–L-Glu-D-Val-L-
Principais
cadeias de ácidos
graxos
aC15, iC16, nC16
aC15, iC16, nC16, C17
nC16, aC17
nC16, aC17
Referências
SCHNEIDER et.
al., 1999;
JACQUES, 2011
SCHNEIDER et.
al., 1999;
JACQUES, 2011
NISHIKIORI et
al., 1986;
JACQUES, 2011
NISHIKIORI et
al., 1986;
JACQUES, 2011
48
A)
D-Orn
H2N
D-Allo Thr
NH
OH
O
H3C
HO
OH
O
O
L-Glu
NH
NH
O
N
H
O
O
OH
O
D- Tyr
NH
L-Glu
O
NH
O
O
O
H3C
D- Ala
CH3
O
O
L-Ile
O
N
NH
NH
CH3
N
H
L-Pro
L-Tyr
O
H2N
HO
L-Gln
B)
D-Orn
H2N
D-Allo Thr
NH
OH
O
H3C
HO
OH
O
O
L-Glu
NH
NH
O
N
H
O
O
OH
NH
O
D- Try
L-Glu
O
NH
O
O
O
D- Val
CH3
O
O
O
N
NH
NH
L-Ile
N
H
CH3
L-Pro
O
H2N
L-Gln
L-Tyr
HO
Figura 4. Estrutura do principal homólogo (n-C16 da fengicina). Isoformas: (A) fengicina
A, (B) fengicina B.
2.5 PEPTÍDEOS SINTETIZADOS PELA VIA NÃO RIBOSSOMAL
Os peptídeos sintetizados pela via não-ribossomal são drasticamente modificados e
amplamente produzidos por bactérias (MACHADO et al., 2004). São exemplos os
49
glicopeptídeos como vancomicina e os lipopeptídeos como surfactina entre outros. A
síntese não-ribossômica utiliza uma grande variedade de substratos, como aminoácidos
não-proteicos, hidroxiácidos e substâncias policetídicas, especialmente elaboradas para
serem incorporadas na estrutura destes peptídeos. No processo biossintético eles podem
ser modificados de várias maneiras pelos domínios integrados ou pelas funções
codificadas por genes separados, o que propicia uma diversidade enorme de peptídeos
lineares ou cíclicos. O tamanho desses peptídeos varia de 2 a 48 aminoácidos
(MACHADO et al., 2004).
As moléculas sintetizadas por via não-ribossômica, a partir de uma rota enzimática
para a síntese de peptídeos, e que essa se desenrola através de um complexo enzimático
modular chamado não-ribossomal peptídeo sintetase (NRPS), normalmente são cíclicas
com uma grande quantidade de aminoácidos não proteicos (CHALLIS & NAISMITH,
2004).
A habilidade destes complexos multienzimáticos de incluir tais aminoácidos e
incorporá-los em ambos os peptídeos cíclicos e lineares resulta em grande estrutura
natural, diversa das espécies bacterianas e fúngicas. Os peptídeos não-ribossômicos
podem atuar como um esqueleto para a biossíntese de estruturas mais complexas ou
podem ser incorporados como ácidos graxos ou policetonas. Tais estruturas podem ser
biossintetizadas por sistemas de peptídeos sintetase mistos ou híbridos e policetídeo
sintase. O número de metabólitos secundários estruturalmente identificados produzidos
por este mecanismo de arranjo de tiois está se expandindo muito rapidamente
(MACHADO et al., 2004).
Os peptídeos produzidos em síntese não-ribossômica são de grande interesse
econômico por apresentarem um enorme potencial de atividades biológicas. Os genes que
codificam os peptídeos sintetases têm sido clonados de diferentes origens e analisados em
50
nível molecular (SYMMANK et al., 2002). Dentre os exemplos, podem ser citados o
sistema de enzimas para a produção do imunomodulatório ciclosporina A (WEBER et al.,
1994) de Tolypocladium inflatum, o precursor do antibiótico penicilina (MACCABE et
al., 1991) de várias espécies de bactérias e fungos, e o lipopeptídeo surfactina de Bacillus
subtilis (COSMINA et al., 1996). Muitos destes peptídeos são cíclicos ou ramificados.
Assim, segundo Mootz; Schwarzer; Marahiel (2000), NRPS tem a chave para síntese de
peptídeos de estrutura complexa, os quais são extremamente difíceis para sintetizar.
Estes peptídeos representam um grupo de produtos naturais, com grande
importância
farmacêutica,
sintetizado
por
microrganismos,
incluindo
fungos
filamentosos, bactérias Gram-positivas e em menor extensão as Gram-negativas. Entre as
bactérias Gram-positivas, o grupo dos Actinomicetos, assim como os membros do gênero
Bacillus são as principais produtoras de NRPSs.
Os membros desta classe heterogênea de compostos naturais compreendem o
antibiótico bacitracin A (KONZ & MARAHIEL, 1999), tirocidina A (MOOTZ &
MARAHIEL, 1997), vancomicina (VAN WAGENINGEN et al., 1998) e daptomicina
(RAJA et al., 2003) bem como o lipopeptídeos surfactina (PEYPOUX; BONMATIN;
WALLACH, 1999). Sendo também de origem não-ribossômica o imunossupressor
ciclosporina A (WEBER et al., 1994) (Figura 5).
51
O
O
O
O
N
H2N
NH
NH
S
NH
O
bacitracina A
O
OH
H
N
O
O
O
O
O
HN
NH2
NH
O
N
H
NH
N
H
N
H
O
N
NH
O
OH
NH2
H
N
H
N
N
O
O
O
O
N
H
O
OH
O
O
NH
O
H
N
OH
NH
N
H
O
N
H
O
Cl
O
tirocidina A
HO
NH2
HO
O
O
N
H
Cl
H
N
O
OH
O
H
N
N
H
NH
O
O
NH2
OH
O
vancomicina
HO
NH
O
H
N
O
OH
O
NH
O
HO
O
HO
O
N
H
NH
O
O
OH
O
.
NH2
O
O
H2N
O
HN
O
HO
NH2
O
HN
O
O
O
NH
N
H
O
OH
surfactina
O
CH3
HOOC
HN
CH3
O
NH
N
H
O
NH
CH3
NH
O
O
COOH
NH2
O
O
N
H
O
H3C
NH
NH
NH
COOH
O
H2N
NH
NH
O
HN
O
O
O
O
O
O
O
H
N
HN
OH
NH2
daptomicina
HOOC
Figura 5. Classes heterogêneas de compostos naturais sintetizados por NRPS
52
NH
O
A complexidade estrutural dos NRPSs reflete seu amplo espectro de atividades. O
conjunto multienzimático, responsável pela síntese da surfactina, consiste de três grandes
NRPSs: srfA-A (402 kDa), srfA-B (401 kDa) e srfA-C (144 kDa), compreendendo um
total de sete módulos. Os genes NRPSs correspondentes são organizados no operon srfA
(Figura 6).
Imediatamente abaixo da região codificadora de srfA-C, está localizado o gene srfAD, seqüência que codifica para a thiosterase tipo II (TE II). Aproximadamente 4 kb abaixo
do operon srfA, está localizado o gene sfp, o qual codifica para fosfopanteinase (PPTase),
requerida para a conversão do domínio PCP do complexo biossintético da surfactina de
sua forma inativa para forma ativa (LAMBALOT et al., 1996). De acordo com Lee et al.
(2005), o gene sfp, o qual é requerido juntamente com o operon srfA para a biosíntese de
surfactina (NAKANO et al., 1992), está localizado vários quilobases abaixo do operon
srfA e codifica uma fosfopanteina transferase (PPTase) necessária para ativar a surfactina
sintetase por modificação pós-transcricional.
Figura 6. Rota biossintética da surfactina (Fonte: CHIOCCHINI, 2006.)
53
2.6 MICRORGANISMOS MAIS COMUMENTE UTILIZADOS EM TESTES
ANTIMICROBIANOS
Dentre os vários microrganismos utilizados em testes antimicrobianos, pode-se
ressaltar, pela importância epidemiológica, as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
como Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli e Pseudomonas
aeruginosas respectivamente. Entretanto, outros microrganismos também são de
interesse na área científica como o fungo leveduriforme Candida albicans, as bactérias
Gram-positivas não patogênicas Bacillus sp e Bacillus subtillis (SOUZA et al., 2004), o
fungo filamentoso, fitopatogênico Trichoderma sp (SANTOS et. al., 2012) entre outros.
2.6.1
Staphylococcus aureus
O Staphylococcus aureus (Figura 7- a) é considerado o principal agente etiológico de
infecções nosocomiais e comunitárias. Esta bactéria, pertencente ao grupo dos cocos Grampositivos, pode ser facilmente encontrada na pele e nas fossas nasais de indivíduos saudáveis
(SANTOS, 2007). As doenças provocadas pelo S. aureus vão desde uma simples infecção
(espinhas, furúnculos e celulites) até infecções graves (pneumonia, meningite, endocardite,
síndrome do choque tóxico, septicemia, entre outras) (SANTOS, 2007), sendo que a maioria
delas é proveniente de fonte endógena (PERL et al, 2002 apud CAVALCANTI et al., 2006).
2.6.2 Enterococcus faecalis
Os enterococos são cocos Gram-positivos que geralmente se dispõem aos pares e
em curtas cadeias e são catalase negativos (MURRAY et al., 2004; TEIXEIRA et al.,
2003). Os enterococos são microrganismos que atuam como patógenos oportunistas em
humanos e que frequentemente causam infecções em pacientes hospitalizados. O
principal reservatório humano de E. faecalis (Figura 7- b) é o trato gastrointestinal, porém
pode ser encontrado, embora com menos freqüência, em cavidade oral, vesícula biliar,
54
vagina e uretra masculina (HORNER et al., 2005). Também podem ser encontrados no
solo, em alimentos, na água, em animais, pássaros e insetos (TEIXEIRA et al., 2003).
Tornaram-se, porém, importantes agentes de doenças humanas devido principalmente à
sua resistência a agentes antimicrobianos (HORNER et al., 2005).
2.6.3
Escherichia coli
Escherichia coli (Figura 7-c) é um bacilo Gram-negativo da família
Enterobacteriaceae, utilizado como indicador de contaminação fecal em alimentos, por
pertencer à microbiota normal do trato entérico do homem (RODRIGUES et al., 2008).
Do ponto de vista de suas relações com o homem, podem-se distinguir dois grandes
grupos de amostras. O primeiro, chamado E. coli comensal, habita o intestino humano
desde o nascimento até a morte. O segundo, denominado E. coli patogênica, pode causar
diferentes tipos de infecção e é constituido por varios patótipos. A E. coli comensal difere
evolutivamente da E. coli patogênica e não apresenta, em seu genoma, os genes que
codificam os fatores de virulência presentes nos diferentes patótipos (FOCACCIA, 2005).
A E. coli associada às infecções intestinais, conhecida por DEC (Diarreiogenic
Escherichia coli), são divididas em seis patótipos: E. coli enteropatogênica (EPEC), E.
coli
enterohemorrágica
(EHEC),
E. coli
enterotoxigênica
(ETEC),
E. coli
enteroagregativa (EaggEC), E. coli enteroinvasora (EIEC) e E. coli de aderência difusa
(DAEC) (FOCACCIA, 2005; MURRAY et al., 2000; TRABULSI, 2002).
E. coli enteropatogênicas (EPEC) são a maior causa de diarreia em crianças com
idade inferior a um ano nos países em desenvolvimento. Atualmente são divididas em
EPECs típicas e atípicas. Dentre os vários sorotipos de EPEC, os que predominam no
meio brasileiro são O:111: H2, O:119: H6, O:55: H6 e O:86: H34 (FOCACCIA, 2005).
55
O mecanismo patogênico envolve adesão à membrana plasmática dos enterócitos
causando destruição das microvilosidades adjacentes. A diarreia resulta da perda das
propriedades absortivas das células infectadas, caracterizando-se pela presença de muco
abundante, sem sangue, acompanhada de dores abdominais, febre, vômitos e
desidratação, sendo reconhecida inclusive por causar diarreia crônica.
2.6.4
Pseudomonas aeruginosa
Peseudomonas aeruginosa (Figura 7- d) é um organismo Gram-negativo aeróbico e
ubíquo, que dificilmente causa doenças em pessoas saudáveis (HANCOCK & SPEERT,
2000), porém é uma das principais espécies bacterianas que ocasionam infecções em
pacientes hospitalizados (GOLDBER, 2010).
Na América Latina, P. aeruginosa ssp. é responsável por 7,5% das infecções de
corrente sanguínea, por 31,2% dos casos de pneumonia e por 13,8% das infecções da pele
e dos tecidos moles (GALES et al., 2012).
Sua importância se deve pela expressão de múltiplos mecanismos de resistência,
dificultando a ação de antibacterianos, ocasionando elevados índices de morbidade e
mortalidade (GALES et al., 2004; LAMBERT et al., 2011).
2.6.5
Candida albicans
A Candida (Figura 7- e) é um fungo diploide e polimórfico responsável pelo
desenvolvimento de várias patologias (LIMA et al., 2004). Em condições normais, este
fungo está presente nos humanos sem que isso implique em quaisquer efeitos prejudiciais
à sua saúde (CARDOSO, 2004). Entre 25 a 75% dos indivíduos saudáveis podem
apresentar Candida spp. (WILLIAMS et al., 1997). Entre as mulheres, cerca de 20 a 30%
apresentam colonização na mucosa vaginal, sendo Candida albicans a espécie prevalente
(OLIVEIRA et al., 1993; VAL & ALMEIDA FILHO, 2001). Podem colonizar a cavidade
56
oral, tratos gastrointestinal, respiratório e urinário, além da circulação sanguínea. A
candidíase manifesta-se quando fatores predisponentes, fisiológicos, patológicos e
mecânicos modificam o relacionamento que ocorre entre o hospedeiro e a microbiota
natural. Neste caso, a candidíase pode ser localizada, determinando sintomatologia
restrita a essa área, ou sistêmica e fatal (COLOMBO & GUIMARÃES, 2003; PFALLER
& DIEKEMA, 2007; JOUAULT et al., 2009). Segundo Colombo & Guimarães (2003) a
candidíase pode ainda se manifestar em locais diferentes do corpo, incluindo órgãos como
rins, fígado, baço e cérebro.
a)
b)
d)
c)
e)
Figura 7. Microrganismos utilizados para fins científicos: (a) Staphylococcus aureus,
(b) Enterococcus faecalis, (c) Escherichia coli, (d) Pseudomonas aeruginosas e (e)
Candida albicans.
Fonte: ahttp://lib.jiangnan.edu.cn/asm/078 acesso em 16/08/15;
b
http://www.floriental.org/293186-enterococcus-faecalis-on-agar acesso em 17/08/15;
c
http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xec/xec03-04.html acesso em 17/08/15;
d
http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/biospip/spip- - acesso em 16/08/15 e
e
http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com.br/2009/12/candida-albicans.html acesso em 17/08/15.
57
3. OBJETIVOS
58
3.1 GERAL
Contribuir para o conhecimento químico e biológico de bactérias endofíticas
amazônicas produtoras de lipopeptídeos, através da análise por ESI-ITMS2 e ensaios
biológicos em busca de novas substâncias com potencial antibiótico.
3.2 ESPECÍFICOS

Selecionar, por ensaios preliminares, bactérias endofíticas produtoras de
lipopeptídeos, cedidas pelo laboratório de Genética Aplicada à Saúde e à
Biotecnologia da ESA/UEA;

Avaliar a atividade antimicrobiana das bactérias selecionadas, pela metodologia
de Christensen;

Analisar, por ESI-ITMS2, o líquido fermentado das linhagens de bactérias
selecionadas para confirmar a produção de lipopeptídeos;

Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos lipopeptídicos pelo bioensaio por
difusão em ágar;

Caracterizar quimicamente os lipopeptídeos dessas linhagens.
59
4. MATERIAIS E
MÉTODOS
60
4.1 LINHAGENS DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS SELECIONADAS
Ensaios preliminares de coloração por Sudan Black (SB), um ensaio tipicamente
utilizado para a seleção de bactérias produtoras de PHAs (Polihidroxialcanoatos),
seguidos de análises por espectrometria de massas indicaram que diversas linhagens com
resultados positivos nesse ensaio eram produtoras de lipopeptídeos. Desta forma, foram
selecionadas 50 linhagens de bactérias endofíticas isoladas de plantas e uma de solo da
Amazônia com resultado positivo para SB, todas pertencentes à coleção do laboratório de
Genética Aplicada a Saúde e a Biotecnologia da ESA/ UEA (Tabela 5).
Tabela 5. Bactérias endofíticas isoladas de plantas e uma de solo da Amazônia.
N°
Código de Identificação
Planta de referência
1
17
Gh Cc3 1.2 a
Casca do caule de Gustavia hexapetala
2
39
GhCr3 2.1.1
Casca da raiz de G. hexapetala
3
41
Gh F1 1.2 bBB
4
42
GhCr3 1.1ª
Casca da raiz de G. hexapetala
5
47
GhCg1 2.2b
Casca do galho de G. hexapetala
6
48
GhCc1 1.2d
Casca do caule de G. hexapetala
7
50
GhCc1 2.1ª
Casca do caule de G. hexapetala
8
54
Caule aveia + CT 1.4.1ª Caule de Macrófita aquática 01
9
56
Caule BDA + CT 1.1.1B Caule de Macrófita aquática 01
10
59
Caule BDA + CT 1.1.1ª Caule de Macrófita aquática 01
11
63
12
64
13
65
Folha BDA 1.3.1
14
66
Flor 1.1.3b1
15
67
ISP2 + CT Folha 1.1.3
Folha de Macrófita aquática 01
16
68
MaO6 Caita 2.2.3
Caule da Macrófita aquática 06
17
73
BDA Caule 1.2.1
Caule Macrófita aquática 01
18
76
Folha BDA 1.3.1a
Folha Macrófita aquática 01
19
81
Caule aveia 1.2.2
Caule Macrófita aquática 01
20
82
Folha aveia 1.4.1
21
84
Folha BDA
22
91
MaO6 Caule TG 2.1.3
Caule da Macrófita aquática 06
23
105
DgC2 1.1 s/assep.
Caule de Duguetia stelechantha
BDA + CT Flor 2.4.1
Folha de G. hexapétala
Flor de Macrófita aquática 02
BDA + CT Folha 2.4.1 Folha de Macrófita aquática 02
1.4.1
Folha de Macrófita aquática 01
Flor de Macrófita aquática 01
61
24
108
DgG1 1.3b
Galho de D. stelechantha
25
109
DgCc1 2.1
Casca do caule de D. stechantha
26
127
DgC1 3.3b s/ assep.
27
148
Stsp Cr2 3.3.1c
28
156
Stsp R2 1.3
Raiz de Strychnos sp
29
158
Stsp R1 1.1
Raiz de Strychnos sp
30
164
Ppc12.2b
Caule de Pothomorpha peltata
31
174
DgCr 1.2.3
Casca da raiz de Duguetia stel.
32
181
DgR1 2.2
Raiz de D. stelechantha
33
185
DgR2 1.2
Raiz de D. stelechantha
34
189
DgFr1 2.3c
Fruto de D. stelechantha
35
191
DgFr1 2.3b
Fruto de D. stelechantha
36
196
DgCr2 1.1b
Casca da raiz de D. stelechantha
37
207
AnspR1 1.3
Raiz de Rollinia sp
38
222
AnspCr1 2.2c
Casca da raiz de Rollinia sp
39
223
AnspCg2 1.3
Casca do galho de Rollinia sp
40
224
Ansp C2 2.1c
Caule de Rollinia sp
41
229
Dfga 1.1.2
Galho de Duguetia flagelares
42
234
Dffg 1.1.2b
Flagelo de D. flagelares
43
239
Cosp R2 13 la7.B Ac
44
243
Cosp R3 Bac. ac
Raiz de B. Pinnatum
45
254
Cosp H BDA 2 Ac
Haste de B. Pinnatum
46
257
Cosp R2 Bac. ac
Raiz de B. Pinnatum
47
258
Cosp H BDA ac
48
259
Cosp R2 3.3 Cito
Raiz de B. Pinnatum
49
264
Cosp H Bac. Ac
50
265
Bactéria 2 solo 4
Solo, ponto 4 da ESA/UEA.
Caule de D. stelechantha
Casca da raiz de Strychnos sp
Raiz de Bryophyllum pinnatum
4.2 MATERIAIS E MEIO DE CULTURA
4.2.1 Meio de cultivo para a fermentação
Para a fermentação das bactérias endofíticas e a de solo foi utilizado o meio de
cultura YM (“Yeast-Malt”), com a seguinte composição, em g/L: sacarose = 20; peptona
= 9; extrato de levedura = 2,7; extrato de malte = 2,7; pH =6,5.
62
4.2.2 Meio de cultivo para o crescimento dos microrganismos teste
Para a realização dos testes biológicos, os patógenos foram reativados, para as
bactérias, nos meios de cultura BHI (Brain Heart Infusion) (extrato BHI = 10; dextrose =
4; ágar power = 15)*; e no meio MH (Müller Hinton) (extrato MH = 10; dextrose = 4;
ágar power = 15)*. Para a levedura utilizou-se o meio Sabouraud (extrato de Saboraud =
10; dextrose = 4; ágar power = 15)*. As bactérias endofíticas e a de solo foram reativadas,
utilizando o meio de cultura ISP2 (amido = 10; glicose = 4; extrato de malte = 10; extrato
de levedura = 4; ágar power = 15)*.
Para o ensaio de difusão em ágar, os meios utilizados para o crescimento dos
patógenos foram os mesmos descritos acima, porém em meio líquido.
4.2.3 Esterilização dos meios e equipamentos
Para garantir as condições estéreis, os meios de cultivos e os materiais utilizados
foram esterilizados em autoclave a 121 ºC e 1 atm durante 15 minutos, antes do início de
qualquer procedimento.
4.3 EQUIPAMENTOS DE ANÁLISES
4.3.1 Seleção das linhagens produtoras de lipopeptídeos por ESI-ITMS
As análises dos metabólitos extracelulares produzidos pelas linhagens das bactérias
endofíticas foram realizadas no aparelho de espectrometria de massas marca Thermo
Fisher, modelo íon trap (LCQ Fleet) equipado com fonte de ionização por eletrospray
(ESI) nos modos positivos e negativos. Os parâmetros da fonte ESI foram as seguintes:
voltagens do capilar e da fonte foram, respectivamente 23 V e 4,95 kV, no modo positivo
e -20 V e 4,95 kV no modo negativo. As taxas de fluxo dos gases (hélio) auxiliar e de
bainha variaram de 11 a 13% para os dois modos de ionização. Temperatura do capilar
*composição em g/L
63
foi de 219 ºC e Tube lens à 114 V no modo positivo e -110 V no modo negativo, na região
de m/z 200-2000.
4.3.2 Análises das amostras de lipopeptídeos em equipamento de baixa resolução
As análises dos extratos lipopeptídicos foram realizadas no aparelho de
espectrometria de massas marca Thermo Fisher, modelo íon trap (LCQ Fleet) equipado
com fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo positivo. Os parâmetros da fonte
ESI foram os seguintes: voltagens do capilar e da fonte foram, respectivamente 24 V e
4,95 kV. Taxas de fluxo dos gases (hélio) auxiliar, 13%; temperatura do capilar, 260º C;
Tube lens à 115V. O MS e MS/MS foram adquiridos na gama de 200-2000 m/z.
4.3.3 Análises das amostras de lipopeptídeos em equipamento de alta resolução
Os extratos lipopeptídicos também foram analisados no aparelho de espectrometria
de massa modelo 6550 iFunnel LC-MS (Agilent) acoplado ao analisador de massa
quadrupolo time-of-flight (QTOF) equipado com uma fonte de eletrospray (ESI) no modo
negativo. Os parâmetros da fonte ESI foram as seguintes: voltagem do capilar, 3500 V;
tensão bocal, 0; Fragmentor, 100; Skimmer, 65; temperatura do gás (Argônio) 280 °C;
fluxo do gás 14 L/min e nebulizador, 45 psi. O MS e MS/MS foram adquiridos na gama
de 50-2000 m/z.
4.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.4.1 Pré-inóculo e condições de cultivo
A inoculação das bactérias foi realizada em meio líquido YM. Aproximadamente
24 h antes de dar início ao ensaio em maior escala, as bactérias passavam por um processo
de pré-inóculo que consistia na adição de 50 µL da suspensão de bactéria em tubos de
64
ensaio contendo 5 mL de meio líquido YM estéril. Após este inóculo, os tubos foram
incubados a 26 °C por aproximadamente 24 h ou até obter uma turvação correspondente
a 2 da escala de McFarland. Depois que cada pré-inóculo alcançava a turbidez desejada,
dava-se início ao ensaio em maior escala. Assim, com auxílio de uma pipeta graduada,
foi retirado 1 mL desse pré-inóculo e adicionado em erlenmeyers de 125 mL contendo 25
mL de meio líquido YM esterilizados. Em seguida, foram incubados sob agitação a 120
rpm à temperatura de 26 °C por 72 h correspondente entre 7 a 8 da escala de McFarland.
Todo este processo foi realizado em triplicata.
4.4.2 Obtenção do sobrenadante
Após a obtenção dos meios metabólitos, produzidos pelas bactérias endofíticas,
foram transferidos para tubos falcon estéreis de 50 mL.
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 4000 rpm a 4 °C por 20 minutos
para retirada da massa celular. Logo, os meios líquidos fermentados foram separados do
meio celular e transferidos para novos tubos falcon. O líquido fermentado livre de células
(sobrenadante) foi filtrado em membrana (0,22 µm) e foram separadas alíquotas de 1 mL
em Eppendorfs de 1,5 mL e armazenado a 4 °C. O restante foi mantido a -20 °C para
análise por espectrometria de massas (EM), extração e realização dos bioensaios.
4.4.3 Seleção das linhagens produtoras de lipopeptídeos por espectrometria de
massas
As análises de EM (idem 4.3.1) para a seleção das bactérias endofíticas produtoras
de lipopeptídeos foram realizadas no Laboratório de Cromatografia e Espectrometria de
Massas da Universidade Federal do Amazonas.
65
As 50 linhagens das bactérias selecionadas (Tabela 5) foram analisadas quanto à
produção de lipopetídeos, utilizando uma alíquota de 50 µL de cada amostra
(sobrenadante) diluído, com 950 µL de MeOH, grau HPLC, e feita a análise por inserção
direta no aparelho de espectrometria de massas ESI-ITMS.
Os valores de massas obtidos das análises dos sobrenadantes foram comparados
com os da literatura.
4.5 EXTRAÇÃO DOS LIPOPETÍDEOS
A extração dos lipopeptídeos presentes nos sobrenadantes das linhagens produtoras
foram realizadas por acidificação do sobrenadante com HCl 6M a pH 2 (LIU et al, 2012,
PEYPOUX et al, 1994, RZAFINDRALAMBO et al. 1993). Após, as amostras ficaram
por 10 horas de repouso a 4 ºC para completar a precipitação e, em seguida, o material
foi centrifugado a 4000 rpm por 20 min. Em seguida, as amostras foram colocadas em
fluxo laminar e, com o auxílio de uma pipeta, o meio líquido fermentado ácido foi
separado do precipitado. Os tubos contendo os precipitados de cada amostra foram
transferidos para o dessecador para completar a secagem, gerando os extratos
lipopeptídicos - LPX onde X representa o número de cada linhagem. O meio líquido
fermentado ácido foi separado e armazenados a -6 ºC para análises posteriores.
4.6 SELEÇÃO DO MÉTODO PARA PURIFICAÇÃO DOS EXTRATOS
LIPOPEPTÍDICOS
A partir da obtenção dos extratos lipopeptídicos, foi selecionada a amostra LP76 a
partir dos dados de ESI-ITMS (item 4.4) e avaliado três métodos a partir da precipitação
ácida para a purificação dos lipopeptídeos: Método 1: Controle para fins de comparação
no ESI-ITMS do extrato LP76. Método 2: Purificação por extração líquido-líquido com
66
diclorometano (VATER et al., 2002). Método 3: Purificação por extração em fase-sólida
(SPE) (RAZAFINDRALAMBO, 1993).
4.6.1 Análise direta no ESI-ITMS do extrato LP76
Na análise direta por EM foi utilizado 1 mg do extrato LP76 e solubilizado em 1
mL de solução aquosa de NaOH 1 M a pH 8. Em seguida, com o auxílio de uma pipeta,
retiraram-se 10 µL da amostra e adicionou-se em um frasco contendo 1 mL de MeOH,
grau HPLC, atingindo 10 ppm.
4.6.2 Purificação por extração líquido-líquido
Na extração líquido-líquido foram utilizados 5 mg do extrato LP76 solubilizados
em uma solução aquosa de NaOH 1 M a pH 8. Seguiu-se a partição utilizando 2 mL de
diclorometano e água (pH 8) na proporção (1:1), agitando por 5 min e deixado por 2 h
para completar a separação das fases (fase orgânica e aquosa). Este procedimento foi
realizado por 3 vezes em duplicatas (Figura 8).
Figura 8. Extração líquido-líquido do extrato LP76.
Foram separadas as frações orgânica e aquosa e deixadas em dessecador para a
evaporação dos solventes.
67
2.6.6
Purificação por extração em fase sólida (SPE)
A extração em SPE foi realizada a partir de 5 mg do extrato da amostra LP76. O
preparo da amostra foi realizado com 1 mL de uma solução aquosa de NaOH a pH 8 e
filtrada em filtros de membrana Millipore 0,45 µ (Figura 9).
Figura 9. Filtragem do extrato LP76 em NaOH aquoso em filtros de membrana
Millipore 0,45 µ.
Para a extração em SPE foi utilizada uma mini coluna de vidro contendo 10 mg de
sílica gel C18. Para o condicionamento da mesma foi utilizado 1 mL de MeOH/H2O na
proporção de 1:1. Em seguida, foi adicionado a amostra filtrada (LP76), seguido da adição
de 1 mL de H2O destilada para lavar eventuais resíduos de sais. A coluna foi devidamente
secada. Em seguida, foi realizada a extração com 1 mL de MeOH por três vezes (Figura
10).
Figura 10. Extração em SPE do extrato LP 76.
68
4.7
AVALIAÇÃO
DA
EXTRAÇÃO
DOS
LIPOPEPTÍDEOS
POR
PRECIPITAÇÃO ÁCIDA
A fim de avaliar o método de extração dos lipopeptídeos, a partir da acidificação
com HCl foram realizadas as análises a partir do meio líquido fermentado ácido descritas
a seguir:
4.7.1 Análise direta no ESI-ITMS do meio ácido
Em um tubo Eppendorf de 2 mL foi adicionado 1 mL da amostra do meio líquido
fermentado ácido da linhagem 76 e elevado o pH a 8 com solução de NaOH 1 M. Uma
alíquota de 50 µL desta amostra foi transferida para um frasco contendo 950 µL de MeOH
e analisada por ESI-ITMS.
4.7.2 Extração líquido-líquido – Meio ácido
Uma alíquota de 3 mL do meio líquido ácido da amostra LP76 foi elevado a pH 8
com uma solução de NaOH 1M. Em seguida, foi realizada a extração líquido-líquido
utilizando 2 mL de diclorometano e água (pH 8) na proporção (1:1), agitando-se por 5
min e deixando-se em repouso por 2 h para completar a separação das fases (orgânica e
aquosa). Este procedimento foi realizado por 3 vezes em duplicatas (Figura 11).
Figura 11. Extração líquido-líquido do meio ácido da amostra LP76.
Foram separadas as frações orgânica e aquosa e deixadas em dessecador para
evaporação dos solventes.
69
BACTÉRIA
ENDOFÍTICA
1. Pré- inóculo
2. Cultivo em meio YM
3. Centrifugação
LÍQUIDO
FERMENTADO
MEIO
CELULAR
1. Acidificação com HCl 6 M a pH 2
2. Centrifugação
MEIO ÁCIDO
1.
2.
PRECIPITADO
(Extrato LPX)
Elevação a pH 8 com uma solução
aquosa de NaOH 1 M
Avaliação da extração por ESI-ITMS
1.
Solubilização em pH 8 com
uma solução aquosa de NaOH
1M
Avaliação de 3 métodos para
purificação dos lipopeptídeos
Análises no ESI-ITMS
2.
3.
1º) Pur. Ext.
direta
Extração
direta
2º) Pur. Ext.
líquido-líquido
3º) Pur. Ext.
em SPE
F. O
Extração
líquido-líquido
F. O
F. Aq
F. Aq
F. O
F. O
F. O
F. Aq
Esquema 3. Metodologia de extração e purificação dos lipopeptídeos.
F.O = fase orgânica; F. Aq = fase aquosa.
70
4.8 ANÁLISES DOS EXTRATOS LIPOPEPTÍDEOS EM EQUIPAMENTO DE
BAIXA RESOLUÇÃO
As análises por espectrometria de massas dos extratos lipopeptídicos foram
realizadas no Laboratório de Espectrometria de Massas da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM). As análises foram realizadas (idem 4.3.2) no aparelho de
espectrometria de massas marca Thermo Fisher, modelo íon trap (LCQ Fleet) equipado
com fonte de ionização por eletrospray (ESI) de baixa resolução no modo positivo.
As amostras foram preparadas com uma solução de NaOH 1 M a pH 8 a partir de 1
mg/mL. Para as análises do ESI-ITMS foram pipetadas alíquotas de 10 µL de cada
amostra para 1 mL de MeOH, grau HPLC atingindo 10 ppm.
4.9 ANÁLISES DOS EXTRATOS LIPOPEPTÍDEOS EM EQUIPAMENTO DE
ALTA RESOLUÇÃO
As análises de ESI-MS de alta resolução foram realizadas (idem 4.3.3) no
laboratório de espectrometria de massa Thomson da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP).
As amostras foram preparadas em uma solução de metanol/H2O 1:1, a partir de 1
mg/mL na concentração de 5 ppm.
4.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBIÓTICA
4.10.1 Microrganismos teste
Para os ensaios de avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica foram
utilizados como microrganismos testes representantes de bactérias Gram-positivas
(Enterococcus faecalis – CBAM 0282, Staphylococcus aureus – CBAM 324), Gramnegativas (Escherichia coli – CBAM 023, Pseudomonas aeruginosa – CBAM 222) e
71
levedura (Candida albicans- CFAM – 1342). Estes foram cedidos da coleção de
microbiologia da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ–AM) para o laboratório de
Genética Aplicada à Saúde e à Biotecnologia da Universidade do Estado do Amazonas –
ESA/UEA, parceiro do Grupo de Espectrometria de Massas e Microrganismos da
Amazônia - GEMMA.
4.10.2 Reativação dos microrganismos teste
Para a realização dos testes biológicos, os patógenos (item 4.10.1) foram reativados
em placas de Petri pelo método de esgotamento por estrias cruzadas, nos meios de cultura
BHI (Brain Heart Infusion) e MH (Müller Hinton) para as bactérias e Sabouraud para a
levedura por 18 a 24 h a 36 C em incubadora tipo BOD (demanda biológica de oxigênio).
As bactérias endofíticas e a de solo foram reativadas pelo mesmo método utilizando o
meio de cultura ISP2 (item 4.2) por 24 a 48 h a 26 ºC.
Para o teste de difusão em ágar, após o crescimento dos patógenos, foram então
transferidos com o auxílio da alça de platina uma pequena quantidade de material celular
para tubos de ensaio contendo os meios de cultura (MH e Sabourad) líquido
correspondente com um volume de 10 mL. O crescimento dos microrganismos em meio
líquido foi observado de acordo com o tubo de número 1 (3x10 8 mL) da escala de
McFarland.
4.10.3 Bioensaio em culturas pareadas – teste de Christensen
A avaliação da atividade antibiótica das bactérias endofíticas foram realizadas na
Universidade Federal do Amazonas, no laboratório do GEMMA. O método utilizado foi
pelo ensaio de culturas pareadas, descrito por Christensen (1991) (método este que avalia
a antibiose, o microparasitismo e competição entre os microrganismos testadores). Para
72
os ensaios contra as bactérias patogênicas (descritas no item 4.10.1) foi utilizado o meio
de cultura BHI em placas de Petri de 90 x 15 mm. Inicialmente, com o auxílio da alça de
platina, adicionou-se na placa de Petri (Esquema 4-A) uma pequena quantidade de
material celular na vertical (linha vermelha) da linhagem de bactéria endofítica e em
seguida foram sendo adicionadas na horizontal (linha preta) as bactérias patogênicas. Para
os ensaios contra C. albicans foi utilizado o meio de cultura Sabourand em placas de Petri
de 90 x 15 mm. Inicialmente com o auxílio da alça de platina adicionou-se na placa de
Petri (Esquema 4-B) uma pequena quantidade de material celular na vertical (linha
vermelha) do patógeno C. albicans e em seguida foram sendo adicionadas na horizontal
(linha preta) as bactérias endofíticas.
C. albicans
Bactéria endofítica
A
B
P.a
S.a
E. f.
E.coli
Bac1
Bac2
Bac3
Bac4
Esquema 4. Metodologia descrita para o bioensaio de culturas pareadas pelo método de
Christensen (1991). (A) Teste contra S. aureus, E. faecalis, E. coli e P. aeruginosa. (B)
Teste contra C. albicans.
4.10.4 Bioensaio pelo teste de difusão em ágar
A avaliação da atividade antibiótica dos extratos obtidos das 50 linhagens de
bactérias endofíticas foi realizada utilizando a metodologia de difusão em ágar de acordo
com Souza et al, 2003. Todas as análises foram realizadas na Universidade Federal do
Amazonas, no laboratório GEMMA. Os microrganismos teste utilizados foram os
descritos no item 4.8.1.
73
4.10.4.1 Preparo das amostras e dos controles
Foram pesados 2 mg de cada extrato em microtubos do tipo Eppendorf e diluídos
em DMSO (dimetilsulfóxido) até a concentração de 2 mg/mL.
Os controles positivos utilizados foram específicos para cada patógeno, na
concentração de 2 mg/mL:
a) C. albicans – Nistatina;
b) S. aureus e E. faecalis – Ampicilina;
c) E. coli – Ciprofoxacina;
d) P. aeruginosa – Tetraciclina;
Para os controles negativos foram utilizados DMSO/H2O (75%)
4.10.4.2 Teste de difusão em ágar
Foram utilizados 220 µL de cada microrganismo teste, cultivados em meio líquido,
e semeados com auxílio de uma alça de Drigalski em placa de Petri de 140 x 15 mm,
contendo os meios específicos para cada patógeno (item 4.10.1). Foram confeccionados
poços de 6 mm de diâmetro nos meios de cultura onde foi adicionado 100 µL de cada
amostra contendo os metabólitos extracelulares das bactérias endofíticas. No controle
positivo foram adicionados 100 µL da solução do antibiótico correspondente e para o
controle negativo 100 µL da solução de DMSO. As leituras dos halos ou zonas de inibição
foram realizadas com paquímetro (em milímetros) nos períodos de 24 e 48 horas sendo
demarcado o diâmetro total da zona de inibição mais o diâmetro do poço. Os testes foram
realizados em triplicatas.
74
5. RESULTADOS
E DISCUSSÃO
75
5.1 SELEÇÃO DAS LINHAGENS PRODUTORAS DE LIPOPEPTÍDEOS POR
ESI-ITMS
A análise dos sobrenadantes de cada linhagem bacteriana por espectrometria de
massas utilizando a fonte ESI tornou possível a identificação das massas moleculares dos
compostos lipopeptídicos.
Durante a ionização por “electrospray” três tipos de ionização podem ser gerados:
íons moleculares, moléculas protonadas ([M+H]+) /desprotonadas ([M-H]-) (íons quasimoleculares) e moléculas cationizadas ([M+Na]+, [M+K]+, ou anionizadas [M+Cl]– etc).
Os valores de m/z em modo positivo e negativo encontrados nos espectros de
massas dos sobrenadantes (Figuras 12-14 e Anexos 37-42 no negativo) foram
comparados com dados da literatura. Das 50 linhagens analisadas, 25 apresentaram
valores de massas típicas para lipopeptídeos, sendo que as linhagens 17, 42, 50, 76, 84,
164, 196, 207 e 229 (Tabela 6) apresentaram resultados mais satisfatórios, quanto ao
número de íons para essas substâncias.
Nos espectros de massas, tanto no modo negativo quanto no positivo, é possível
observar para as linhagens bacterianas 17, 42, 50, 76, 84, 164, 196, 207 e 229 valores de
íons coincidentes, em m/z 992, 1006, 1020 e 1034, 1048 ([M-H]-), e em m/z 994, 1008,
1022 ([M+H]+), 1016, 1030, 1044, 1058 e 1072 ([M+Na]+) (Figuras 12-14). De acordo
com dados da literatura, esses íons são coerentes com os lipopeptídeos homólogos da
surfactina: C-12, C-13, C-14 e C-15 e C-16, cujas massas moleculares são
respectivamente 993, 1007, 1021, 1035 e 1049, sendo o C-14 e C-15 os mais abundantes
(MALFANOVA et al., 2012; MORAN et al., 2010; PECCI et al., 2010; PEYPOUX et
al., 1994).
76
Tabela 6. Identificação de lipopeptídeos em amostras dos sobrenadantes das linhagens
de bactérias endofíticas através da análise de ESI-ITMS no modo negativo e positivo.
N°
Bactérias endofíticas
[M-H]992, 1006, 1020, 1034,
1048
[M+H]+ ou [M+Na]+
994, 1030, 1044,1058, 1072
1030, 1058
1
17
Gh Cc3 1.2a
2
41
Gh F1 1.2 bBB
3
42
GhCr3 1.1a
992
992, 1006, 1020, 1034,
1048
4
47
GhCg1 2.2b
1034
1030, 1036, 1044
5
48
GhCc1 1.2d
1022, 1044, 1058
6
50
GhCc1 2.1a
992, 1006, 1020
992, 1006, 1020, 1034,
1048
7
56
Caule BDA + CT 1.1.1B
1034
994, 1016, 1030,1044,1058,
1072
1044
8
63
BDA = CT Flor 2.4.1
1006, 1020, 1034
1030, 1044, 1058
9
66
Flor 1.1.3b1
1020, 1034
1022, 1044, 1058
10
67
992, 1020, 1034
1016, 1036, 1044, 1058
11
68
MaO6 Caita 2.2.3
1006, 1119
1044
12
73
BDA Caule 1.2.1
1016, 1036, 1044, 1058
13
76
Folha BDA1.3.1a
1006, 1020, 1034
992, 1006, 1020, 1034,
1048
14
81
Caule aveia 1.2.2
1022, 1036, 1044, 1058, 1072
1016, 1030, 1036, 1044, 1058,
1072
1016, 1036, 1044, 1058
15
84
Folha BDA 1.4.1
1006, 1020, 1034
992, 1006, 1020, 1034,
1048
16
109
DgCc1 2.1
1119
17
164
Ppc12.2b
992, 1006, 1020, 1034
18
185
DgR2 1.2
1006
994, 1016, 1030, 1036, 1044,
1058
1030
19
189
DgFr1 2.3c
992, 1006, 1020
1044
20
191
DgFr1 2.3b
1008, 1030, 1044
21
196
DgCr2 1.1b
22
23
207
224
Ansp R1 1.3
Ansp C2.2.1.c
24
25
229
239
Dfga1. 1. 2
Cosp R2 13 la7.BAc
1006, 1020, 1034
992, 1006, 1020, 1034,
1048
992, 1006, 1020, 1034,
1048
992, 1006, 1034
992, 1006, 1020, 1034,
1048
1034
994, 1016, 1030, 1036, 1044,
1058, 1072
1016, 1044
994, 1022, 1030, 1044, 1058,
1058
994, 1022, 1016, 1030, 1044,
1058, 1072
1016, 1020, 1058
994, 1022, 1016, 1030, 1044,
1058, 1072
1058
77
A100
NL: 9,55E1
Adriana2509neg#564-594
RT: 10,56-11,11 AV: 31 T:
ITMS - c ESI Full ms
[200,00-2000,00]
1034,61
17
80
60
1006,59
1020,62
40
Relative Abundance
20
926,33 934,14 944,60 950,87 965,58
0
100
983,56
992,60
1001,24
1064,05 1075,14
1048,64
1091,52
NL: 1,56E2
RT: 11,83-12,61 AV: 43 T:
[200,00-2000,00]
1034,62
80
60
42
1020,61
40
1006,60
20
0
100
922,25
935,19
946,30
960,90 971,21 981,59
1032,80
994,40
1048,65 1057,69
1074,08
1091,55
NL: 1,87E2
RT: 13,33-13,74 AV: 23 T:
[200,00-2000,00]
1034,64
80
60
50
1020,62
40
20
0
923,12 932,52
920
947,19 954,98 962,14
940
960
980,17
1006,58
992,56
980
1000
m/z
B
1049,40
1024,46
1020
1040
1070,33
1060
1085,39
1080
17
80
60
1030,49
40
Relative Abundance
20
981,12
974,26
1008,47
1044,55
1074,52
1022,52
1093,36
1071,44
994,47
0
100
1107,44
1119,12
1129,06
1140,49
42
980,03
40
20
978,89
1030,50
983,06
987,16
1008,49
1053,98
1044,53
1022,49
1079,32
1074,52
1072,40
0
100
1129,07
1095,39 1107,36
1123,28
50
60
20
NL: 8,42E2
Adriana2509pos#11111146 RT: 18,78-19,29 AV:
36 T: ITMS + c ESI Full ms
[200,00-2000,00]
1058,50
80
40
NL: 3,20E2
Adriana2509pos#995-1033
RT: 16,75-17,36 AV: 39 T:
ITMS + c ESI Full ms
[200,00-2000,00]
1058,46
80
60
NL: 6,50E2
RT: 3,61-4,26 AV: 42 T:
[200,00-2000,00]
1058,50
100
981,10
983,05
986,12
972,14
1008,39
1036,52 1044,50
1022,50
1030,39
1074,51
1072,56
1080,40
1130,01
1097,44 1109,54
1123,54
1137,25
0
980
1000
1020
1040
1060
m/z
1080
1100
1120
1140
Figura 12. Espectros de massas ESI-ITMS: (A) Modo negativo e (B) Modo positivo para
as linhagens 17 (Gh Cc3 1.2a), 42 (GhCr3 1.1a) e 50 (GhCc1 2.1).
78
A 100
80
1020,87
76
60
1006,81
40
20
901,34 916,94 928,44 942,22 962,58 983,78 992,76
878,76
1079,06 1091,74
1048,89
0
100
Relative Abundance
NL: 3,73E2
ADRIANA_SPIROTTO_170914_NE
GATIVO#1133-1215 RT:
11,39-12,20 AV: 83 T: ITMS - c
ESI Full ms [500,00-2000,00]
1034,92
1116,53
1139,11
NL: 4,64E2
GATIVO#824-887 RT: 8,25-8,87
AV: 64 T: ITMS - c ESI Full ms
[500,00-2000,00]
1034,91
80
84
60
1020,87
40
20
898,25
1006,91
944,33 955,80 964,37
922,19
1056,66
992,83
0
100
1078,05 1100,78 1112,99
1132,58
1034,93
80
164
60
1020,91
40
20
NL: 2,16E3
GATIVO#630-683 RT: 6,38-6,84
AV: 54 T: ITMS - c ESI Full ms
[500,00-2000,00]
1006,88
885,86
903,30
923,09
900
920
0
880
944,51
940
960
1056,83 1076,08 1091,50
993,07
970,27
980
1000
1020
1040
1060
1080
1117,24 1135,04
1100
1120
1140
m/z
B
NL: 2,32E3
Amostras_Adriana_18_12_14pos
#3032-3118 RT: 12,54-12,90
AV: 87 T: ITMS + c ESI Full ms
[200,00-2000,00]
1058,76
100
1030,77
80
1044,81
60
40
Relative Abundance
20
76
1079,74
1093,68
1074,69
1107,77
1124,06 1138,92
1016,72
902,85
953,97
927,82
1002,84
974,47
0
100
NL: 2,25E3
#2289-2369 RT: 9,47-9,80 AV:
[200,00-2000,00]
1058,78
1030,74
80
1044,78
60
84
1079,78
40
1016,70
20
913,08
937,77 948,90 965,46
1074,67
989,25 1002,50
0
100
1093,79 1107,79
1116,93
1139,74
NL: 4,70E3
#761-825 RT: 3,15-3,41 AV: 65
T: ITMS + c ESI Full ms
[200,00-2000,00]
1058,80
80
60
1044,81
20
164
1030,79
40
906,05
0
900
922,87 935,94
920
940
957,55
960
982,13
980
1080,85 1093,68
1002,24 1016,66
1000
1020
m/z
1128,93
1040
1060
1080
1100
1120
1148,88
1140
as linhagens 76 (Folha BDA1.3.1), 84 (Folha BDA 1.4.1) e 164 (Ppc12.2b).
79
A
80
196
60
1006,87
40
Relative Abundance
20
897,85 912,60
941,36 951,35
1056,76
981,15 992,95
0
100
1100,72 1114,36
1152,18
1020,81
NL: 2,72E2
12,35-13,01 AV: 69 T: ITMS - c
ESI Full ms [500,00-2000,00]
207
60
1006,75
40
898,37
917,74
1077,59
1042,17
942,40 958,97 972,36 992,74
0
100
1092,87
1139,65 1155,24 1170,75
NL: 4,77E2
11,54-12,14 AV: 64 T: ITMS - c
ESI Full ms [500,00-2000,00]
1034,92
80
1020,87
229
60
1006,81
40
20
1180,99
1034,90
80
20
NL: 9,70E2
16,24-16,78 AV: 56 T: ITMS - c
ESI Full ms [500,00-2000,00]
1034,91
100
901,35 916,92 930,91
962,59
992,76
1048,88
1116,54
1079,06
1140,25 1155,79 1175,38
0
900
950
1000
1050
1100
1150
m/z
B 100
1058,77
1030,74
1044,77
80
196
60
40
Relative Abundance
20
913,08
937,75
965,46
1079,78
1016,68
989,28 1002,48
1093,80
1139,77
0
100
1169,43
1058,81
80
60
1030,76
NL: 1,74E3
Amostras_Adriana_18_12_14po
s#2286-2409 RT: 9,46-9,96
[200,00-2000,00]
207
1044,80
NL: 5,00E3
s#1712-1801 RT: 7,08-7,45
[200,00-2000,00]
40
20
907,16
0
100
929,85
980,04 1002,07
948,85
1080,76
1016,81
1093,70
1127,96 1140,89 1162,35
1058,75
80
60
1030,77
40
20
906,07
963,73
935,96
1080,84 1093,68
1016,68
982,12
229
1044,82
1128,90 1148,90
0
900
950
1000
1050
1100
NL: 2,46E3
s#713-868 RT: 2,95-3,59 AV:
[200,00-2000,00]
1176,05
1150
m/z
as linhagens 196 (DgCr2 1.1b), 207 (AnspR1 1.3) e 229 (Dfga1. 1. 2).
80
5.2 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DOS LIPOPEPTÍDEOS
5.2.1 Comparação entre os métodos de purificação
De acordo com os dados de análise de ESI-ITMS no modo negativo das frações
orgânicas e da fração aquosa (Método 2) obtidas pelos métodos 1, 2 e 3 foi possível
detectar a presença dos íons correspondentes aos homólogos da surfactina de m/z 992,
1006, 1020 e 1034. Na extração líquido-líquido (Método 2) observou-se através dos
espectros de ESI-ITMS (Figura 16) que ambas as frações (fases orgânica e aquosa)
apresentaram semelhanças nos íons para estes compostos. Ao comparar os dados dos
espectros de ESI-ITMS dos métodos 1 (Figura 15) e 2, observou-se que, houve
semelhanças no perfil químico das amostras. Os íons observados em m/z 503, 510 e 517
([M-2H]-2) são correspondentes aos íons de m/z 1006, 1020 e 1034 visto que, segundo
Cantú e colaboradores (2008), moléculas grandes como os lipopeptídeos adquirem
múltiplas cargas no processo de ionização por eletrospray.
A figura 17 mostra os dados das análises da extração por SPE (Método 3).
Observou-se que, na amostra da fase aquosa (solução de preparo da amostra) não foi
detectado a presença significativa de íons com massas para os lipopeptídeos, indicando
que estes compostos ficaram retidos na fase estacionária (sílica gel), o que já era esperado.
Logo, observou-se que na amostra da fração orgânica foi possível detectar os íons
homólogos dos lipopeptídeos, além do íon de m/z 653, sendo, portanto, parte de resíduos
presentes na fração aquosa.
Logo, após análise dos extratos obtidos pelos métodos de purificação dos
lipopeptídeos por espectrometria de massas, verificou-se que os métodos 2 e 3
apresentaram resultados semelhantes ao método 1. Além de produzir um perfil químico
semelhante aos demais métodos de purificação, o método 1 tornou-se mais viável, por
não ser necessário o uso de materiais cromatográficos, bem como, a utilização de maiores
81
quantidades de massa das amostras e de solventes orgânicos. Com isso, foi selecionado o
método 1 para a realização dos testes biológicos e para as análises por espectrometria de
massas.
adrianaextracoes_negativo #2594-2643 RT: 34,27-34,87 AV: 50 NL: 3,52E3
T: ITMS - c ESI Full ms [200,00-2000,00]
1034,98
100
90
80
Relative Abundance
70
60
50
517,30
1020,97
40
30
20
510,25
10
503,25
496,29
1006,95
524,23
0
400
500
737,64
616,31 699,97
780,12 859,77
600
700
800
1056,83
1091,68
992,98
900
1000
1170,50
1100
1259,67
1200
1490,09 1561,18 1620,26
1368,01
1300
1400
1500
1600
m/z
Figura 15. Espectro de ESI-ITMS da amostra do método 1 no modo negativo.
Relative Abundance
A 100
1034,93
NL: 2,68E3
adrianaextracoes_negativ
o#149-218 RT:
2,12-2,94 AV: 70 T:
[200,00-2000,00]
80
60
20
1006,89
960,98
510,19
587,71 653,56 723,66
367,57
0
100
B
1020,91
517,30
40
834,83
1056,81
1114,61
1306,37 1360,32
1477,22
1583,66
1034,97
NL: 1,76E3
adrianaextracoes_negativ
o#554-622 RT:
7,37-8,21 AV: 69 T:
[200,00-2000,00]
517,31
80
60
1020,92
40
510,26
20
0
421,45 503,19
400
500
527,67
600
675,66
737,73
700
875,63
800
900
1006,88
1000
m/z
1056,82
1091,57
1114,34 1206,08 1279,40 1368,17
1100
1200
1300
1400
1491,04 1575,23
1500
1600
Figura 16. Espectro de ESI-ITMS das amostras do método 2 no modo negativo. (A)
Fração da fase orgânica e (B) Fração da fase aquosa.
82
A
653,50
Relative Abundance
100
NL: 3,06E1
adrianaextracoes_negativo
#2251-2298 RT:
29,84-30,49 AV: 48 T:
[200,00-2000,00]
80
60
903,42
433,20
40
447,32
611,19
875,10
677,30
519,13
694,84
20
785,42
932,55
1020,73
1152,99
1241,19
0
100
1344,79 1414,45 1481,08 1583,90
1034,89
NL: 1,26E3
#1848-1905 RT:
24,25-24,97 AV: 58 T:
[200,00-2000,00]
B 80
60
40
1020,87
653,55
20
485,62
543,71
700,05
0
400
500
600
700
751,96
800
1006,86
875,37 946,75
900
1077,65
1000
1100
1154,68 1245,21
1200
1300
1360,25 1424,96 1516,31
1400
1500
1675,09
1600
m/z
Figura 17. Espectro de ESI-ITMS das frações do método 3 no modo negativo: (A) Fração
da fase aquosa da amostra e (B) Fração MeOH.
5.2.2 Avaliação da extração dos lipopeptídeos por precipitação ácida
Após análise por ESI-ITMS da fração do meio ácido da linhagem 76 por inserção
direta (Figura 18), verificou-se que não houve a detecção dos íons correspondentes para
os lipopeptídeos, apresentados anteriormente pela fração do extrato LP 76 (Figura 15 do
item 5.2.2). Da mesma forma, verificou-se resultados semelhantes nos espectros da fração
aquosa do meio ácido, obtida por extração líquido-líquido (Figura 19-B). Embora nas
análises de ESI-ITMS da fração orgânica do meio ácido ter sido detectado o íon de m/z
1034 (Figura 19-A), a intensidade do mesmo foi relativamente baixa quando comparada
com as análises do extrato (Figura 16-B) para esta mesma linhagem. Logo, as análises de
espectrometria de massas evidenciaram que o método de extração dos lipopeptídeos a
partir da precipitação ácida proposta pela literatura (LIU et al, 2012, PEYPOUX et al,
1994, RZAFINDRALAMBO et al. 1993) é eficaz.
83
adrianaextracoes_negativo #1670-1745 RT: 22,07-22,91 AV: 76 NL: 7,46E2
T: ITMS - c ESI Full ms [200,00-2000,00]
215,25
100
90
80
Relative Abundance
70
60
50
40
377,25
245,24
30
20
289,32
10
0
200
388,46 512,98
400
863,38
627,45 701,35
600
800
1007,50
1151,41
1000
1244,56
1385,12 1451,55
1200
1400
1673,74
1600
1827,86
1999,28
1800
2000
m/z
Figura 18. Espectro de ESI-IT-MS no modo negativo da amostra do meio ácido da
linhagem 76 por análise direta.
Relative Abundance
A100
215,29
NL: 3,55E2
#973-1017 RT:
12,96-13,46 AV: 45 T:
[200,00-2000,00]
80
60
339,53
40
311,48
20
0
100
377,36
465,20
477,47
1077,56
653,50
1034,85
889,21
713,80
1164,26 1245,12
1401,34 1521,74 1621,16
1798,53 1884,51
NL: 3,79E2
#1131-1180 RT:
15,04-15,61 AV: 50 T:
[200,00-2000,00]
215,26
B 80
60
40
245,24
377,27
20
477,44 567,20 645,80
0
200
400
869,94 955,59 1035,06 1119,29
600
800
1000
1254,93 1380,71 1480,96
1200
1400
1680,99 1761,15
1600
1800
1981,92
2000
m/z
Figura 19. Espectros de ESI-IT-MS no modo negativo das frações do meio ácido obtidos
por extração líquido- líquido. (A) Fração da fase orgânica e (B) Fração da fase aquosa.
5.3
IDENTIFICAÇÃO
E
CARACTERIZAÇÃO
DOS
LIPOPEPTÍDEOS
PRESENTES NOS EXTRATOS SELECIONADOS POR ESI-ITMS DE BAIXA
RESOLUÇÃO
Os extratos lipopetídicos das linhagens selecionadas (item 5.1 e tabela 6), LP17 (Gh
Cc3.1.2a), LP42 (GhCr3.1.1a), LP50 (GhCc1. 2.1), LP76 (Folha BDA1.3.1), LP84 (Folha
BDA 1.4.1), LP164, (Ppc1.2.2b) LP196, (DgCr2.1.1b), LP207 (AnspR1.1.3) e LP229
(Dfga1.1.2) foram submetidos a análises de ESI-ITMS no modo positivo, e detectados os
84
íons de m/z 1016, 1030, 1044, 1058 e 1072 ([M+Na]+) (Figura 20), sendo os mesmos íons
detectados no meio líquido dos sobrenadantes (item 5.1), característicos dos homólogos
da surfactina.
NL: 2,32E3
#3032-3118 RT: 12,54-12,90
[200,00-2000,00]
1058,76
100
LP 17
1030,77
80
1044,81
60
40
Relative Abundance
20
1079,74
1093,68
1074,69
1107,77
1124,06 1138,92
1016,72
902,85
953,97
927,82
1002,84
974,47
0
100
NL: 2,25E3
#2289-2369 RT: 9,47-9,80 AV:
[200,00-2000,00]
1058,78
1030,74
80
LP 42
1044,78
60
1079,78
40
1016,70
20
913,08
937,77 948,90 965,46
1093,79 1107,79
1116,93
1074,67
989,25 1002,50
0
100
NL: 4,70E3
#761-825 RT: 3,15-3,41 AV: 65
T: ITMS + c ESI Full ms
[200,00-2000,00]
LP 50
80
60
1044,81
1030,79
40
20
1139,74
1058,80
906,05
0
900
922,87 935,94
920
940
982,13
957,55
960
980
1080,85 1093,68
1002,24 1016,66
1000
1020
m/z
1128,93
1040
1060
1080
1100
1120
1058,50
100
1148,88
1140
NL: 6,50E2
RT: 3,61-4,26 AV: 42 T:
[200,00-2000,00]
LP 76
80
60
1030,49
40
Relative Abundance
20
981,12
974,26
1008,47
1044,55
1074,52
1022,52
1093,36
1071,44
994,47
0
100
1107,44
1119,12
1129,06
1140,49
LP 84
80
60
980,03
40
20
NL: 3,20E2
RT: 16,75-17,36 AV: 39 T:
[200,00-2000,00]
1058,46
978,89
1030,50
983,06
987,16
1008,49
1053,98
1044,53
1022,49
1079,32
1074,52
1072,40
0
100
1129,07
1095,39 1107,36
1123,28
NL: 8,42E2
Adriana2509pos#11111146 RT: 18,78-19,29 AV:
[200,00-2000,00]
1058,50
LP 164
80
60
40
20
1036,52 1044,50
981,10
983,05
986,12
972,14
1074,51
1022,50
1072,56
1008,39
1080,40
1130,01
1097,44 1109,54
1123,54
1137,25
0
980
1000
1020
1040
1060
m/z
1080
1100
1120
1140
Figura 20. Espectros de massas ESI-ITMS no modo positivo para as linhagens LP17,
(Gh Cc3 1.2 a), LP42 (GhCr3 1.1a), LP50 (GhCc1 2.1), LP76 (Folha BDA1.3.1), LP84
(Folha BDA 1.4.1) e LP164 (Ppc12.2b).
85
1030,74
1044,77
80
60
LP196
40
20
Relative Abundance
NL: 1,74E3
s#2286-2409 RT: 9,46-9,96
[200,00-2000,00]
1058,77
100
913,08
937,75
965,46
1079,78
1016,68
989,28 1002,48
1093,80
1139,77
0
100
1169,43
NL: 5,00E3
s#1712-1801 RT: 7,08-7,45
[200,00-2000,00]
1058,81
80
60
1030,76
1044,80
LP 207
40
20
907,16
0
100
929,85
980,04 1002,07
948,85
1080,76
1016,81
1093,70
1127,96 1140,89 1162,35
NL: 2,46E3
s#713-868 RT: 2,95-3,59 AV:
[200,00-2000,00]
1058,75
80
60
1030,77
40
20
906,07
963,73
935,96
1080,84 1093,68
1016,68
982,12
LP 229
1044,82
1128,90 1148,90
0
900
950
1000
1050
1100
1176,05
1150
m/z
Figura 21. Espectros de massas ESI-ITMS no modo positivo para as linhagens LP196
(DgCr2 1.1b), LP207 (AnspR1 1.3) e LP229 (Dfga1. 1. 2).
A intensidade relativa dos íons reflete a composição percentual de cada molécula nas
amostras analisadas. Desta forma, os íons de m/z 1030, 1044 e 1058 (Figuras 20 e 21)
foram os íons predominantes nas amostras dos extratos lipopeptídicos, sendo que o mais
abundante foi o m/z 1058.
De acordo com Araújo e colaboradores (2010) as bactérias endofíticas podem
colonizar os mais variados tecidos vegetais, sendo possível a mesma bactéria colonizar
diferentes partes da planta. Sendo assim, as semelhanças nos íons detectados entre as
linhagens LP17, LP42 e LP50, pode estar relacionado à mesma bactéria produtora, uma
vez que, foram isoladas da mesma planta (Gustavia hexapetala), descrito na tabela 5.
Também é observado tais semelhanças, entre as linhagens LP76 e LP84 produzidos pelas
bactérias isoladas das folhas de Macrófita aquática 01.
Os resultados das análises de ESI-ITMS apresentados acima não elucidam
especificamente detalhes estruturais e a distribuíção dos aminoácidos em cada molécula
é também a mesma para os homólogos da surfactina. Para tanto, foi feita a fragmentação
dos íons característicos para estes compostos por ESI- ITMS2, descrita a seguir.
86
5.3.1 Caracterização dos lipopeptídeos por ESI-ITMS2 de baixa resolução
A fragmentação dos lipopetídeos por EM, para a posterior análise de sua sequência
de aminoácidos, foi realizada por meio do processo de dissociação induzida por colisão
(collision induced dissociation – CID). Neste processo, os lipopeptídeos foram
inicialmente introduzidos em uma região de vácuo do espectrômetro de massas por meio
do processo de electrospray. Os lipopeptídeos ionizados foram acelerados para uma
região do espectrômetro preenchida com um gás inerte, hélio, proporcionando, assim, a
colisão entre os lipopeptídeos ionizados e as moléculas do gás inerte. Como resultados, a
energia translacional transferida em cada colisão foi convertida em energia interna,
culminando na desestabilização das ligações do esqueleto polipeptídico e, por
consequência, induzindo a formação de dois íon-fragmentos (MANN et al., 1989), que
são classificados como íon que retém a carga residual no lado N-terminal (gerando
fragmentos a, b, e c, dependendo da ligação que é fragmentada) e íons que retém a carga
residual na região C-terminal (gerando os fragmentos x, y e z, dependendo da ligação que
é fragmentada) (Esquema 5), segundo a nomenclatura proposta por Roepstorff–
Fohlmann–Biemann (1984). É importante enfatizar que os pares de íons a/x, b/y e c/z
serão sempre íons correspondentes aos fragmentos opostos e complementares entre si.
Considerando-se que as ligações peptídicas são aquelas menos energéticas, espera-se que
a formação do par de fragmentos b/y seja mais frequente que os demais pares de
fragmentos, facilitando a interpretação dos espectros (CANTÚ et al., 2008).
87
y(n-m)
x(n-m)
z(n-m)
Rm
O
n: número total de resíduos no peptídeo
m: número de resíduos correspondentes aos
íons a, b ou c.
NH
NH
Rm + 1
O
am
cm
bm
Esquema 5. Representação esquemática da estrutura química geral de um peptídeo
apresentando a nomenclatura proposta por Roepstorff-Fohlmann-Biemann dos
fragmentos formados devido à transferência de energia para o peptídeo.
A fragmentação de peptídeos cíclicos como os lipopeptídeos não ocorre de forma
usal. Nos compostos cíclicos da família da surfactina, por exemplo, existe uma ligação
de lactona na qual o aminoácido C-terminal está ligado através de uma ligação éster ao
ácido graxo β-hidróxi. A ligação éster é muito mais fraca do que a de uma amida, logo é
razoável que a abertura do anel ocorra na ligação lactônica, ou seja, na ligação do éster.
Com isso, duas séries de íons, C-terminal e N-terminal podem ser formadas, e o íon sódio
se ligará ao oxigênio alcoxi entre os resíduos C-terminal e a cadeia alifática.
Yang e colaboradores (2008) propõem dois mecanismos de fragmentação para a
clivagem do anel destes compostos. Sendo o primeiro, por heterólise da ligação éster,
denominado de clivagem simples, gerando os íons da série N-terminal. E o segundo, pelo
mecanismo de transferência dupla de hidrogênio (DHT) pelo rearranjo de McLafferty,
gerando os íons C-terminal.
De acordo com o conceito de rearranjo de McLafferty, teoricamente, alguns
resíduos de aminoácidos em uma cadeia peptídica podem sofrer rearranjo, através de duas
maneiras. Uma delas é que o hidrogênio no carbono β de um resíduo de aminoácido é
transferido ao oxigênio da carbonila do resíduo de aminoácido N-terminal adjacente,
88
ocorrendo a clivagem da ligação peptídica C(α)-N que é chamada rearranjo interresíduo
de McLafferty, tal como ilustrado no esquema 6a. A outra é a de que o hidrogênio do
carbono γ é transferido do resíduo de um aminoácido ao oxigênio da sua carbonila,
ocorrendo a clivagem na ligação C (α)-C (β) do resíduo amino, chamada rearranjo de
McLafferty intra-resíduo como ilustrado no Esquema 6b.
a
N terminal
. . .NH
CH
C
R1
O

NH
CH
C terminal
C
NH
b O
CH
C...
R2
O
H CH

a: transferência de H

b: transferência de H
HC H
+
NH3
O
-
HOOCCH2CH2CHCOO
OH
(OCH3)
NH
HOOCCH2CH2CHCOO
Glu
Resíduo de Glu
Esquema 6. Ilustração do rearranjo de McLafferty de um resíduo amino em uma cadeia
peptídica onde: (a) O local e a direção da clivagem da transferência do γ-H pelo Rearranjo
interresíduo de McLafferty e (b) O local e a direção da clivagem γ-H pelo Rearranjo
intraresíduo de McLafferty. (Fonte: Yang et. al, 2008).
De acordo com as análises de ESI-ITMS para os extratos lipopeptídicos, as
amostras analisadas apresentaram íons semelhantes entre si para lipopeptídeos, logo as
fragmentações de ESI-ITMS2 foram realizadas a partir da amostra LP84 (Folha Mácrofita
aquática 01). Cada homólogo obtido foi fragmentado, porém, somente será apresentado
o espectro obtido para o homólogo mais abundante de m/z 1058. Os espectros dos demais
homólogos encontram-se nos Apêndices (Figura 44), em exceção ao íon de m/z 1016 por
ser relativamente o íon menos abundante, não foi possível obter íons fragmentos
utilizando ESI-MS2 de baixa resolução.
As análises de fragmentação forneceram as estruturas dos homólogos descritos na
tabela 7. O íon percursor mais abundante de m/z 1058 resultou nos seguintes íons: m/z
1040, 945, 832, 814, 717, 618, 707, 594, 481, e 382 (Figura 22).
89
b1
O
O
HO
O
H2 C
N
H
H
(CH2) 9
NH
CH
CH
b6
y2
y3
y4
O
(-CH2-)9---CH---CH2---C---Glu---Leu---Leu---Val---Asp---Leu---Leu
H3C
O
HN
y5
707, 49 594, 48 481, 39 382,55
NH
C
H3C
ONa
+
b3
NH
y1
y6
b2
y5
O
O
O
y6
H
N
O
y4
O
NH
b4
618,41 717,17 832,55
945,60
b3
b6
b4
b5
y3
O
O
O
y2
-
b5- H2O
b5
fragextratoprecipitado-negativoepositivo #1590 RT: 25,44 AV: 1 NL: 7,11E2
F: ITMS + c ESI Full ms2 1059,00@cid30,00 [290,00-1061,00]
814,48
100
y6
90
80
707,49
60
b6
M + Na -H2O
50
40
945,60
y5
463,31
30
594,48
20
0
481,39
382, 55
320,38
300
365,38
350
446,26
400
450
486,40 550,93 576,34
500
550
618,41
600
671,47
650
832,55
717, 17
700
986,81
b5
b4
391,35
10
b3
y4
742,72
y3
Relative Abundance
70
796,67
750
800
915,81
960,75
887,88
850
900
950
1040,85
1022,53
1000
1050
m/z
Figura 22. (A) Estrutura do lipopeptídeo C15 da surfactina apresentando as regiões de
fragmentações e a nomenclatura y e b proposta por Roepstorff– Fohlmann–Biemann. (B).
Espectro de ESI no modo positivo do íon sodiatado de m/z 1058.
O íon de m/z 1040 corresponde à perda de água (-18 Da) a partir do íon de m/z 1058.
Os valores dos íons restantes foram identificados em duas séries a partir da abertura do
anel lactona do íon de m/z 1058. A primeira série (alifática) contém os íons N-terminal
de m/z 945 (b6), 832 (b5), 814, 717 (b4) e 618 (b3) derivados da clivagem simples
(Figuras 21 e 22-a) que correspondem, respectivamente, às perdas de Leu (-113 Da), Leu-
90
Leu (-226 Da), Leu-Leu-H2O (-244), Asp-Leu-Leu (-341 Da) e Leu-Leu-Asp-Val (-440
Da).
A segunda série (peptídica) contém os íons C-terminal de m/z 707, 594, 481, 463 e
382 formados por clivagem dos peptídeos pelo mecanismo de DHT como sugerido pela
literatura (LIU et al., 2008; YANG, et al., 2006). Este mecanismo conduziu a formação
dos íons fragmentos da série peptídica (Figura 22-b), onde os fragmentos C-terminal são
gerados pela perda da cadeia lateral β- hidróxi (x). Logo, os íons de m/z 707, 594, 481 e
382 correspondem respectivamente à perda de x-Glu (-351 Da), de x-Glu-Leu (-464 Da),
de x-Glu-Leu-Leu (-577 Da), e de x-Glu-Leu-Leu-Val (-676 Da).
a
A3
A2
A1
A1
A4
( )n
O
C
A4
A7
A1
A5
A6
ESI - ITMS
A6
CH2
CH
A3
O C
A5
O C
A2
CH2
A7
CH O.
C
A2
A3
A4
A5
A6
O C
Sódio ionizado
A7
CH2
CH
C
ONa
( )n
( )n
O
O
O
2H
392*
C 14 H 28 ONa
C
O
NH HC
C
O
NH
CH
CH2
H2C
CH2
HC
C
618.41
505*
O
O
OH
C
NH
CH
C
CH2
CH3
CH3
113 (Leu)
HC
CH3
NH
CH
HC
C
CH3
CH3
NH
HC
C
CH2
C
O
115 (Asp)
1058.88
O
NH
CH
C
HC
O
NH
CH
C.
H2C
H2C
OH
99 (Val)
945.60
O
O
CH3
113 (Leu)
832.55
717.17
O
CH3
CH3
113 (Leu)
HC
CH3
CH3
113 (Leu)
129 (Glu)
Figura 23. Fragmentação do íon de m/z 1058 por: (a) Clivagem simples. Fonte: Adaptado
de LIU et al., (2008).
91
bO
A3
A2
A1
C
A1
A4
C
( )n
O
C
A4
A3
A4
A5
A6
Sódio ionizado
A7
CH2
+2H C O
Na+
O
CH -2H
+2H C O
CH -2H
A2
O C
A7
CH2
A7
A1
A5
A6
ESI - ITMS
A6
H
HC
A3
O C
A5
H
A2
( )n
( )n
O
O
2H
707.49
C 14 H 28
C
O
O
NH HC
C
NH
CH
CH2
H2C
CH2
HC
C
O
OH
594.48
O
C
NH
O
CH
C
CH2
CH3
HC
CH3
CH3
CH3
113 (Leu)
113 (Leu)
382.55
481.39
NH
O
O
CH
HC
NH
C
HC
267*
C
CH2
CH3
CH3
C
O
CH
C
O
NH
HC
CH3
HC
115 (Asp)
COH 2 Na
CH3
CH3
CH3
129 (Glu)
CH
H2C
H2C
O
OH
99 (Val)
NH
267 (Leu+Leu+H2O+ Na)
Figura 24. Fragmentação do íon de m/z 1058 por: (b) Clivagem com transferência dupla
de hidrogênio. Fonte: Adaptado de LIU et al., (2008).
Tabela 7. Íons detectados por fragmentação (ESI-ITMS2) dos homólogos da surfactina a
partir dos íons percusores de m/z 1030, 1044, 1058 e 1072.
[M + Na]+ (m/z)
Produtos da 1ª série (alifática)
Fragmentações 1030 1044 1058 1072
C13
[M + Na - H2O]+
C14
C15
C16
1012 1026 1040 1054
[M + Na - Leu]+
b6
917
931
945
959
[M + Na - Leu-Leu]+
b5
804
818
832
846
[M + Na - Leu-Leu-H2O]+
b4
786
800
814
828
[M + Na - Leu-Leu-Asp-Val]+
b3
590
604
618
632
[M + Na - x-Glu]+
y6
707
707
707
707
[M + Na - x-Glu-Leu]+
y5
594
594
594
594
[M + Na - x-Glu-Leu-Leu]+
y4
481
481
481
481
[M + Na - x-Glu- Leu-Leu-Val]+
y3
382
382
382
382
Produtos da 2 ª série (peptídica)
x = cadeia lateral
De acordo com a proposta de fragmentação sugerida (Figuras 23 e 24), foi permitido
estabelecer a sequência dos aminoácidos, sendo, N-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu-C,
92
apresentando diferenças apenas nos íons referente aos fragmentos da série N-terminal.
Por exemplo, para o homólogo m/z 1030, os íons b3, b4, b5 e b6 (Tabela 7) se diferenciam
em 14 Da, referente ao grupo metilênico (-CH2-) dos íons correspondentes do homólogo
m/z 1044, e assim por diante. Com esses dados, pode-se atribuir que a cadeia de ácido
graxo varia de 13 a 16 átomos de carbono.
As isorformas A, B da surfactina variam apenas na posição 7 do aminoácido da
cadeia peptídica, sendo respectivamente, Leu e Val. Estas diferenças podem variar
dependendo da linhagem e dos meios de cultivos utilizados (BONMATIN et al., 2003).
A diferença de 18 Da entre os íons fragmentos de m/z 832 (Leu-Leu) e 814 (Leu-LeuH2O) (Figura 23) indica que o aminoácido C-terminal é a Leucina.
5.3.2 Caracterização dos lipopeptídeos por ESI-MS2 de alta resolução
Segundo Harisson & Young (2006) o uso de estudos de dissociação induzida por
colisão (CID) em espectrometria de massa para identificar e para proporcionar a
sequência de aminoácidos presentes em peptídeo linear está bem estabelecida. No
entanto, a maioria das análises de ESI-MSn de peptídeos tem sido realizada no modo
positivo, enquanto que por desprotonação são menos comuns e, como resultado menos é
conhecido sobre os modos detalhados da fragmentação de espécies desprotonadas
(BOWIE et al., 2002; HARISSON et al., 2006; MEN & WANG, 2006). Isto se deve,
porque os resíduos amino terminal dos aminoácidos básicos, ou seja, arginina, lisina,
histidina, são peptídeos que facilitam a formação de íons protonados. Porém alguns
peptídeos, no entanto, são ricos em resíduos ácidos tais como o ácido aspártico (Asp),
ácido glutâmico (Glu), aminoácidos fosforilados, ácido sulfínico cisteína [C(SO2H)], e
ácido sulfônico cisteína [C(SO3H)], sendo estes dois últimos, produtos de oxidação de
cisteína (MEN & WANG, 2006). A presença destes resíduos ácidos na molécula, irá
93
facilitar a desprotonação dos peptídeos durante a ionização, oferecendo um meio
alternativo para suas análises em ESI-MS no modo negativo. A este respeito, Bowie e
colaboradores (2002) realizaram amplas investigações sobre as fragmentações de
desprotonação dos íons de peptídeos, mostrando que, espectros contendo os íons produtos
no modo negativo podem, por vezes, oferecer informações não disponíveis a partir de
seus correspondentes íons no modo positivo. Além disso, a sequência das clivagens das
ligações por fragmentação de desprotonação podem ocorrer por vários ácidos aminados
pelas clivagens γ e δ e resultar na formação de íons c e z (Esquema 7), além da formação
dos fragmentos a/x, b/y seguindo a nomenclatura introduzida por Roepstorff et al. (1984),
assim como no modo positivo (Esquema 5). No entanto, o mecanismo de formação dos
íons no modo negativo são bem diferentes dos seus íons complementares no modo
positivo. Apesar de mais complexas, as fragmentações no modo negativo foram
realizadas, pois os experimentos no modo positivo já haviam sido realizados e se
buscavam informações complementares, das surfactinas presentes nas amostras, além do
fato de que elas possuem dois resíduos ácidos, Glu e Asp, que facilitariam a ionização
por perda de próton.
-
R1NH + HO 2C-CH=CH-CO-R2
-
HC
R1

CO2H
NH CH CO R2
-
[R 1NH (HO 2C-CH=CH-CO-R2)]

R1NH 2 +
-
O2C-CH=CH-CO-R2
Esquema 7. Representação da clivagem γ e δ a partir do resíduo do ácido aspártico.
Fonte: Bowie et. al, 2002.
Os íons principais formados pela desprotonação foram de m/z 978, 992, 1006, 1020,
1034, 1048, 1062 e 1076 (Figura 25). Todas as amostras analisadas apresentaram
94
semelhanças nos íons percussores, no entanto o íon de m/z 978 foi detectado apenas nas
amostras LP 17, 50, 76, 164, 196, 207 e 229, e os íons 1062 e 1076, na amostra LP 50.
Por isso as análises de ESI-MS2 foi realizada na amostra LP 50.
A
1020.6765
1006.6543
992.6234
978.6023
1048.6954
B
1020.6765
1006.6543
992.6234
1048.6954
C
1020.6745
1006.6643
992.6214
978..6087
1048.6954 1076.6895
1062
D
1020.6745
1006.6543
992.6234
1048.6087
978.6154
95
E
1020.6765
1006.6543
992.6234
1048.6468
F
1020.6745
1006.6543
992.6234
1048.6865
978.6135
G
1020.6745
1006.6543
992.6234
978.6032
1048.6052
H
1020.6745
1006.6543
992.6234
978.6031
1048.6794
I
1020.6745
1006.6543
992.6234
978.6352
1048.6356
Figura 25. Espectros de ESI-MS2 no modo negativo dos extratos LP: (A) 17 (B) 42 (C)
50 (D) 76 (E) 84 (F) 164 (G) 196 (H) 207 e (I) 229.
96
Os íons de m/z 992, 1006, 1020 e 1034 (Figura 25) foram os íons predominantes
nas amostras dos extratos LP sendo que o mais abundante foi o m/z 1034, coerente com
os resultados da análise no modo positivo que indica a surfactina C-15 como a mais
abundante nas amostras. As análises de fragmentação dos íons dos homólogos forneceram
as estruturas descritas na tabela 8. O íon percursor mais abundante de m/z 1034 resultou
nos íons de m/z 1016, 692, 452, 353, 339, 323 e 240 (Figura 26).
m/z 240 (y"-b2)
O
b1
O
H2 C
y"
H
(CH2 ) 9
O
Leu
y6
O
HO
NH
CH
CH
C
O
O
N
H
b2
y5
NH
Leu
O
HN
m/z 353 (y" -b3)
C
b3
NH
Leu
Val
H
N
O
b4
y3
O
Leu
O
y”-b4
y3
y6-b4
m/z 339 (y3) O
B
y” -b3
323.1666
y”-b2
O
NH
-
y4
m/z 452 (y" -b4)
m/z 323 (y6 -b4)
Asp
M- H-H2O
Glu
b4
A
1016.2345
353.2134
Figura 26. (A) Estrutura da surfactina C15 apresentando as regiões e a nomenclatura y e
b das fragmentações por ESI-MS2. (B). Espectro de massa no modo negativo do íon de
m/z 1034. (y”) corresponde à clivagem na ligação do carbono α da carbonila da cadeia lateral
com o N-terminal do ácido Glu.
Em estudos realizados por Men & Wang, (2009) e Andreazza e colaboradores (2009)
sugerem que o processo inicial de fragmentação ocorra a partir da abertura do anel
97
lactônico. Inicialmente, ocorre a desprotonação, ou seja, a perda de hidrogênio [M-H]- do
gupo carboxila da cadeia lateral da Asp. Em seguida, ocorre a transferência do átomo de
hidrogênio do carbono α da Leu (em vermelho), para o oxigênio do grupo éster por meio
da migração 1,3 de hidrogênio. Em seguida, a ligação carbono (da Leu) - oxigênio (do
grupo éster) é quebrada, abrindo o ciclo sequencialmente (Figura 27). A clivagem ocorre
na ligação lactona, formando um ceteno e um álcool (MEN & WANG, 2009;
ANDREAZZA, et al., 2009). Finalmente, o composto, que perde água [M-H-H2O] após
abertura do anel, forma o íon m/z 1016 (Figura 27).
O
Glu
H
(C H2) 9
NH
CH
HN
O
O
Leu
HN
H
N
O
O
-
O
Leu
O
O
O
HN
NH
Val
O
NH
Leu
NH
O
O
NH
O
O
Leu
Asp
-H 2O
HN
C
CH
C
NH
O
Leu
O
NH
NH
CH
Leu
O
O
O
(C H2) 9
NH
Leu
O
H2C
HN
HN
C
Val
O
NH
NH
O
H
C NH
O
C
O
Leu
O
NH
CH
CH
HO
Leu
O
HO
H
(C H2) 9
C
CH
O
N
H
Glu
O
H2C
O
H2C
Leu
HO
O
HO
O
Glu
Leu
O
Leu
-
O Asp
O
m/z 1034
Val
-
Asp
m/z 1016
Figura 27: Proposta de fragmentação para o íon de m/z 1016.
Os valores dos íons restantes foram identificados em duas séries a partir da abertura
do anel lactona do íon de m/z 1034. A primeira corresponde à série alifática que contém
o íon N-terminal de m/z 692 (b4) que corresponde a perda de Leu-Leu-Asp- (-342 Da)
(MORAN et al., 2010) (Figura 28).
Glu
O
H2C
H
CH
CH
O
NH
C
N
H
(CH2) 9
HN
CH
O
HN
NH
O
H
N
O
NH
Val
C
HN
HN
O
Asp
O
(CH2) 9
CH
O
NH
O
NH
NH
C
Leu
HN
-
O
HN
O
m/z 692
O
O
Val
NH
H
CH
NH
Leu
O
H2C
O
-
O
HO
O
O
Leu
O
-
O
Leu
NH
Leu
O
O
Leu
CH
Glu
O
NH
H
O
C
Leu
Leu
O
H2C
Leu
O
O
O
HO
O
HO
(CH2) 9
Glu
Leu
O
-
Asp
b4
C
Val
O
Figura 28. Proposta de fragmentação do íon de m/z 692.
98
A segunda série peptídica contém os íons C-terminal de m/z 452, 339, 353, 323 e
240. O íon de m/z 339 corresponde à perda de Val-Leu-Leu-Glu-x, onde x é representado
pela cadeia lateral do ácido graxo β-hidróxi. Em seguida, o íon de m/z 452 (y”-b4 referente
ao tetrapeptídeo -Glu-Leu-Leu-Val-) é formado pela perda de x e dos resíduos de LeuLeu-Asp- (Figura 29), podendo ainda gerar os fragmentos de m/z 323
Glu
O
O
Leu
-
O
O
H2C
(CH2) 9
Leu
O
-
C.
Leu
O
O
NH
NH
O
NH
O
NH
HN
O
C.
m/z 452
-
O Asp
Leu
Leu
Val
O
NH
O
NH 2
O
HN
O
O
H2 C
HN
C
HO
y3-x
O
NH
CH
CH
Glu
NH
H
O
Val
O
Leu
C.
NH
NH
O
NH2
O
O
y"-b4
Leu
O
-
m/z 339
y3
Figura 29. Proposta de fragmentação da surfactina para os íons de m/z 452 e 339.
(y6-b4 referente ao tripeptídeo -Leu-Leu-Val-) pela perda do ácido glutâmico (-129 Da),
e o fragmento de m/z 353 (y”-b3 referente ao tripeptídeo Glu-Leu-Leu-) pela perda de
Valina (-99 Da) e a perda de Leu (-113 Da) gerando o fragmento de m/z 240 (y”-b2
referente ao dipeptídeo -Glu-Leu-) (MORAN et al., 2010) (Figura 30).
99
Glu
O
O
b1
y6
-
Leu
O
O
Leu
Glu
O
H 2C
O
NH H
NH2
-
O
NH2
y5
NH
O
HN
y4
O
b2
NH H
- Val
Leu
- Glu
O
H2C
NH
b3
m/z 353
y"-b3
Val
C.
Leu
C.
O
- Leu
Leu
O
Glu
H 2N
O
NH
O
O
O
C.
O
O
H2C
Leu
HN
Leu
-
NH
C.
NH2
m/z 240
y"-b2
Val
m/z 323
y6-b4
Figura 30. Proposta de fragmentação da surfactina para os íons de m/z 353, 323 e 240.
Tabela 8. Íons detectados por fragmentação (ESI-MS2) dos homólogos da surfactina a
partir dos íons percusores [M - H]- de m/z 978, 992, 1006, 1020, 1034, 1048, 1062 e 1076.
Produtos da série alifática
978
992
1006
1020
1034
1048
1062
1076
C11
C12
C13
C14
C15
C16
C17
C18
960
974
988
1002
1016
1030
1044
1058
b4
636
650
664
678
692
706
720
734
y”-b4
452
452
452
452
452
452
452
452
y”-b3
353
353
353
353
353
353
353
353
y3
339
339
339
339
339
339
339
339
y6-b4
323
323
323
323
323
323
323
323
y”-b2
240
240
240
240
240
240
240
240
[M - H - H2O][M –H – Leu-Leu-Asp]
-
[M -H]- (m/z)
Frag
Produtos da série peptídica
[M-H - x - /Leu - Leu -Asp][M-H - x- /Leu-Leu - AspVal][M-H - x-Glu- Leu-Leu-Val][M-H - x – Glu - /Leu - Leu Asp][M-H - x- /Leu-Leu-Asp-ValLeu]-
x =cadeia lateral ácido graxo
100
De acordo com a proposta de fragmentação (Figura 27-30) é permitido estabelecer
a sequência dos aminoácidos, sendo, N-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu-C para todos os
homólogos obtidos, uma vez que, os fragmentos da série peptídica são os mesmos,
apresentando diferenças apenas nos íons referente aos fragmentos da série N-terminal
(Tabela 8). Por exemplo, para o homólogo m/z 978, o íon b4 se diferencia em 14 Da,
referente ao grupo metilênico (-CH2-) do íon correspondente do homólogo m/z 992. A
diferença de massa molar é a mesma (14 u) entre os picos correspondentes dos homólogos
992 e 1006, entre o 1006 e o 1020 e assim sucessivamente. Com esses dados, pode-se
atribuir que a cadeia de ácido graxo varia de 11 a 18 átomos de carbono.
Na literatura não há relatos da identificação dos compostos de m/z 978, 1062 e 1076,
sendo, portanto, caracterizados neste trabalho como os homólogos C11, C17 e C18 da
surfactina (Figura 31 e tabela 8). Sendo o homólogo C11 produzido pelas linhagens Gh
Cc3 1.2a (LP17), GhCc1 2.1 (LP50), Folha BDA1.3.1 (LP76), Ppc12.2b (LP164),
AnspR1 1.3 (LP207) e Dfga1. 1. 2 (LP229) e os homólogos C17 e C18 pela linhagem
323.16.03
M-H2O
b4
y7-b3
240.2370
y6-b4
y7-b2
y3
y7-b4
GhCc1 2.1 (LP50).
960.1370
636.2254
339.2018
M-H-H2O
b4
y7-b4
y6-b4
y7-b3
y3
y7-b2
353.2254
1044.2254
452.2254
101
b4
M-H-H2O
y7-b3
y6-b4
y7-b4
y3
y7-b2
339.2065
1058.7354
452.2216
Figura 31. Espectros de ESI-MS2 no modo negativo dos íons de m/z 978, 1062 e 1076.
As análises de ESI-MS2 no modo negativo permitiram confirmar os dados
apresentados no modo positivo para os homólogos mais abundantes, no entanto, a partir
da desprotonação foi possível observar a presença de três novos compostos ainda não
relatados na literatura para a surfactina. Logo, foi possível caracterizar oito homólogos
da surfactina sendo o C11 (m/z 978), C12 (m/z 992), C13 (m/z 1006), C14 (m/z 1020),
C15 (m/z 1034), C16 (m/z 1048), C17 (m/z 1062) e C18 (m/z 1076).
5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBIÓTICA
5.4.1 Teste de Christensen
O bioensaio pelo teste em culturas pareadas (Teste de Christensen) foi um ensaio
preliminar que permitiu avaliar as atividades biológicas de antibiose, micoparasitismo e
competição a partir dos metabólitos produzidos por bactérias endofíticas. A atividade
antibiótica, ocorre pela interação desarmônica, onde uma espécie produz e libera
substâncias que dificultam o crescimento ou a reprodução de outras causando a sua morte
celular. Enquanto que a atividade de microparasitismo (Figura 32-a), é uma forma comum
de associação entre organismos, por meio do qual se estabelecem relações nutricionais
favoráveis à existência do microparasita, que pode ser principalmente: necrotrófica – o
microparasita mata o hospedeiro pelo contato direto, absorvendo seu conteúdo celular
como fonte de nutrição; biotrófica – o microparasita obtém nutrientes das células do
hospedeiro, sem matá-las (INBAR & CHET, 1992). A atividade de competição (Figura
102
32-b), é a competição entre indivíduos de espécies diferentes por espaço e preferências
alimentares idênticas.
Os resultados das linhagens de bactérias endofíticas bioensaiadas contra
microrganismos patógenos de humanos estão representados na tabela 9. Para todas as
linhagens testadas não houve antibiose, porém, os resultados observados foram
destacados para competição (cp) e microparasitismo (mcp). As linhagens avaliadas
apresentaram 99% de atividade de microparasitismo contra as bactérias Gram-negativas
P. aeruginosa e E. coli e 1% por atividade de competição, 51% apresentaram
microparasitismo contra bactérias Gram-positivas S. aureus e 49% por competição, 53%
de microparasitismo contra E. faecalis e 47% por competição, 52% atividade de
microparasitismo contra C. albicans e 48% por competição.
Tabela 9. Resultados do bioensaio em culturas pareadas (Metodologia de Christensen)
das bactérias endofíticas contra patógenos humanos.
1
17
Gh Cc3
2
39
GhCr3 2.1.1
Microrganismos Patôgenicos
S. a E. f. P. a E. c C.a
cp
cp
mcp mcp mcp
mcp mcp mcp mcp cp
3
41
Gh F1 1.2 bBB
cp
cp
mcp
mcp
cp
4
42
GhCr3 1.1a
mcp
mcp
mcp
mcp
cp
5
47
GhCg1 2.2b
mcp
mcp
mcp
mcp
cp
6
48
GhCc1 1.2d
cp
cp
mcp
mcp
cp
7
50
GhCc1 2.1a
cp
cp
mcp
mcp
8
54
Caule aveia + CT 1.4.1a
cp
cp
mcp
mcp
mcp
cp
9
56
Caule BDA + CT 1.1.1B
cp
cp
mcp
mcp
cp
10
59
Caule BDA + CT 1.1.1a
mcp
mcp
mcp
mcp
cp
11
63
BDA + CT Flor 2.4.1
cp
cp
mcp
mcp
mcp
12
64
BDA + CT Folha 2.4.1
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
13
65
Folha BDA 1.3.1
cp
cp
cp
cp
mcp
14
66
Flor 1.1.3b1
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
15
67
cp
mcp
mcp
mcp
mcp
16
68
MaO6 Caita 2.2.3
cp
cp
mcp
mcp
cp
Cod.
Bactérias endofíticas
1.2 a
103
17
73
BDA Caule 1.2.1
cp
mcp
mcp
mcp
mcp
18
76
Folha BDA 1.3.1a
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
19
81
Caule aveia 1.2.2
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
20
82
Folha aveia 1.4.1
cp
cp
mcp
mcp
mcp
21
84
Folha BDA
cp
cp
mcp
mcp
cp
22
91
MaO6 Caule TG 2.1.3
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
23
105
DgC2 1.1 s/assep.
mcp
mcp
mcp
mcp
24
108
DgG1 1.3b
mcp
mcp
mcp
mcp
cp
mcp
25
109
DgCc1 2.1
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
26
127
DgC1 3.3b s/ assep.
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
27
148
Stsp Cr2 3.3.1c
cp
cp
mcp
mcp
mcp
28
156
Stsp R2 1.3
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
29
158
Stsp R1 1.1
cp
cp
mcp
mcp
mcp
30
164
Ppc12.2b
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
31
174
DgCr 1.2.3
cp
cp
mcp
mcp
cp
32
181
DgR1 2.2
cp
cp
mcp
mcp
cp
33
185
DgR2 1.2
mcp
mcp
mcp
mcp
cp
34
189
DgFr1 2.3c
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
35
191
DgFr1 2.3b
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
36
196
DgCr2 1.1b
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
37
207
AnspR1 1.3
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
38
222
AnspCr1 2.2c
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
39
223
AnspCg2 1.3
cp
cp
cp
cp
cp
40
224
Ansp C2 2.1c
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
41
229
Dfga 1.1.2
cp
cp
mcp
mcp
mcp
42
234
Dffg 1.1.2b
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
43
239
Cosp R2 13 la7.B Ac
cp
cp
mcp
mcp
cp
44
243
Cosp R3 Bac. ac
mcp
mcp
mcp
mcp
cp
45
254
Cosp H BDA 2 Ac
mcp
mcp
mcp
mcp
cp
46
257
Cosp R2 Bac. ac
mcp
mcp
mcp
mcp
cp
47
258
Cosp H BDA ac
cp
cp
mcp
mcp
cp
48
259
Cosp R2 3.3 Cito
cp
cp
mcp
mcp
cp
49
264
Cosp H Bac. Ac
cp
cp
mcp
mcp
cp
50
265
Fungo 2 solo 4
mcp
mcp
mcp
mcp
mcp
1.4.1
P.a= Pseudomonas aeruginosa, S.a= Staphylococcus aureus, E.f.= Enterococcus faecalis,
E.c=Escherichia coli, C.a= cândida albicans. (+) Antibiose, (mcp) Micoparasitismo, (cp) Competição, () nehuma atividade.
104
A)
B)
Figura 32. Teste por culturas pareadas (Metodologia de Christensen) para a bactéria
endofítica, linhagem 17 (GhCc3.1.2. (A) Atividade de microparasitismo, contra as
bactérias patogênicas P. aeruginosa e E. coli e (B) Atividade de competição contra
S.aureus e E. faecalis.
Desta forma, as linhagens 64, 66, 76, 81, 91, 108, 109, 127, 156, 164, 189, 191, 196,
207, 222, 224, 234, 265 destacaram-se por apresentar microparasitismo contra todas as
bactérias patógenas, e contra C. albicans, o que as faz agentes de controle biológico
(Tabela 9). Em estudos realizados, Benchimol e colaboradores (2000) testaram o efeito
de bactérias endofíticas isoladas de plântulas de pimenta-do-reino na redução da
mortalidade causada por fusariose, enfermidade provocada pelo fungo Fusarium solani,
e detectaram que a espécie Methylobacterium radiotolerans controlou o patógeno,
causando redução significativa do número de plantas mortas.
No trabalho de Shiomi et al. (2006), foram selecionados isolados de bactérias
endofíticas de folhas e ramos de cafeeiro com potencial para o controle biológico da
ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix. Alguns isolados foram
eficientes em controlar a ferrugem do cafeeiro, embora outros tenham aumentado a
severidade da doença.
Silva et al. (2008) selecionaram isolados de bactérias endofíticas de diferentes
espécies e gêneros obtidos de folhas e haste de tomateiro e pimentão para o controle da
pinta bacteriana (Pseudomonas syringae) do tomateiro; as espécies bacterianas mais
105
eficazes na redução da severidade da pinta bacteriana foram Acinetobacter johnsonii,
Bacillus pumilus, Paenibacillus macerans, Bacillus sphaericus, B. amyloliquefaciens e
Staphylococcus aureus.
5.4.2
Avaliação da atividade antibiótica dos extratos dos sobrenadantes por
difusão em ágar.
Os resultados da atividade antimicrobiana dos extratos contra bactérias e levedura
patogênicas são mostrados na tabela 10.
Tabela 10. Resultados do teste de antibiose em difusão em ágar dos extratos das bactérias
endofíticas e os principais íons detectados por ESI-MS2
C. albicans
S. aureus
E. faecalis
P. aeruginosa
Gram-positiva
E. coli
Gram-negativa
Extratos
Principais íons
detectados
LP
24 h
48 h
24 h
48 h
24 h
48 h
24 h
48 h
24 h
48 h
17
18
18
12
12
-
-
10
-
12
-
39
16
16
-
-
-
-
-
-
-
41
-
-
7
7
12
-
-
-
-
-
42
-
-
13
13
-
-
12
-
15
-
50
15
15
10
10
12
-
*
*
*
*
66
-
-
-
-
-
-
12
-
-
-
C13, C14, C15, C16
73
16
16
-
-
-
-
-
-
-
C11, C14, C15
84
-
-
-
-
-
-
12
12
-
-
164
15
15
-
-
-
-
19
19
-
-
196
19
19
-
-
-
-
11
-
-
-
207
19
19
-
-
-
-
18
18
-
-
C11, C12, C13, C14,
C15, C16, C17, C18
C11
C12, C18
C12, C13, C14, C15,
C16, C18
C11, C12, C13, C14,
C15, C16, C17, C18
C12, C13, C14, C15,
C16
C11, C12, C13, C14,
C15, C16
C11, C12, C13, C14,
C15, C16
C11, C12, C13, C14,
C15, C16
106
229
12
12
-
-
-
259
-
-
33
33
-
Controle
-
15
15
-
-
-
-
-
-
Nistatina
Ampicilina
Ampicilina
Tetraciclina
(2 mg/mL)
(2 mg/mL)
(2 mg/mL)
(2mg/mL)
35
40
25
25
35
40
30
30
C11, C12, C13, C14,
C15, C16
C18
Ciprofoxacia
(2mg/mL)
33
33
Valores do diâmetro dos halos de inibição média de três repetições (mm); – : Ausência de inibição;
Teste não realizado por falta de amostra.
*:
Os resultados do método de difusão em ágar mostraram que a atividade
antimicrobiana dos extratos LP (Tabela 10) foram inferiores para C. albicans, S. aureus,
P. aeruginosa, E. faecalis, E. coli quando comparado com os valores médios dos
antibióticos utilizados como controle para cada organismo testado (nistatina 25 mm,
ampicilina 35 mm, tetraciclina 30 mm, ampicilina 40 mm e ciprofoxacina 30 mm)
respectivamente.
Os extratos LP 17, 39, 50, 73, 164, 196, 207 e 229 foram capazes de inibir o
crescimento de C. albicans em teste, formando halos de 12 a 19 mm (Figura 33).
17
229
39
50
164
207
196
73
C+
C-
Figura 33. Halos de inibição de C. albicans dos extratos LP 17, 39, 50, 73, 164, 196, 207
e 229 após 48 horas.
Enquanto que os extratos LP 17, 41, 42, 50 e 259 contra S. aureus apresentaram
halos de inibição de 7 a 33 mm (Figura 34).
107
41
17
50
42
Figura 34. Halos de inibição de S. aureus dos extratos LP 17, 41, 42 e 50 após 48 horas.
Para os halos de inibição contra P. aeruginosa os extratos LP 84, 164, 207 e 229
apresentaram valores de 10 a 18 mm (Figura 35). Enquanto que, as amostras 17, 42, 66 e
196 apresentaram halos de inibição entre 10 a 15 mm apenas em 24 h, não sendo
observado inibição após o período de 48 h. Logo, a atividade destas amostras contra P.
aeruginosa é bacteriostático, ou seja, inibe a princípio o crescimento do patógeno, mas
não é capaz de causar a morte celular do mesmo. Isto também foi observado nas amostras
LP17 e 42, contra E. coli, e LP41 e 50 contra E. faecalis.
229
84
164
207
C+
C-
Figura 35. Halos de inibição de P. aeruginosa dos extratos LP 84, 164, 207 e 229 após
48 horas.
De todos os resultados apresentados contra os patógenos testadores, os testes contra
C. albicans apresentaram melhor nitidez dos halos, podendo ter assim, uma melhor
108
inibição. As amostras LP39, LP84 e LP259 apresentaram inibição específica contra C.
albicans, P. aeruginosa e S. aureus respectivamente. Esta especificidade, pode estar
diretamente relacionada com as interações dos homólogos da surfactina produzidos por
estas linhagens (Tabela 10). A linhagens LP259 apresentou inibição (33mm) próximo ao
antibiótico padrão ampicilina (35 mm), tendo, portanto, uma excelente atividade
antibiótica por ainda se tratar de um extrato bruto.
Em todas as amostras que apresentaram atividade antibiótica, foi possível detectar
neste trabalho, a partir da espectrometria de massas, a presença da surfactina. Estes dados
estão de acordo com a literatura, onde tem apresentado este lipopeptídeo com um grande
espectro de atividade, incluindo antifúngica e bactericida (ULLRICH et al., 1991; GANG
et al., 2011; YUAN, et al., 2012). Os homólogos C11, C12, C13, C16 e C18 foram os
mais detectados nas amostras com atividade biológica positiva (Figura 36). O homólogo
C11 é detectado em todas as amostras (LP17, 39, 50, 73, 164, 196, 207 e 229) que
apresentaram resultados positivos contra C. albicans (Tabela 10), não sendo detectado
nas demais amostras com resultados negativos. Isto pode indicar que este homólogo pode
ser o responsável pela atividade biológica contra a levedura. O mesmo ocorre para o
homólogo C18 contra S. aureus, pois em todas as amostras (17, 41, 50, 259) que
apresentaram atividade, este homólogo foi detectado, não sendo observado nas demais
com resultados negativos. Nos resultados para P. aeruginosa, os homólogos C13 e C16
quando comparados entre os resultados positivos e bacteriostático (LP 66 e 196), foram
os mais frequentes.
109
Homólogos da surfactina %
Relação entre a atividade antibiótica dos extratos LP e os homólogos
da surfactina
600
500
C18
400
C17
C16
300
C15
200
C14
100
C13
C12
0
C. albicans
S. aureus
P. aeruginosas
C11
Atividade antibiótica
Figura 36. Relação da atividade de antibiose dos extratos LP da tabela 12 com os
homólogos da surfactina.
Estudos realizados por Fernandes e colaboradores (2007) relatam que amostras
contendo lipopetídeos incluindo a surfactina produzidos por Bacillus subtilis R14 resultou
na
atividade
antimicrobiana
contra
as
bactérias
patogênicas
E. faecalis, S. aureus, E. coli e para P. aeruginosa tendo melhor atividade contra a
bactéria Gram positiva S. aureus, observado também neste trabalho, uma vez que, a
melhor atividade antimicrobiana foi apresentada pelo extrato LP 259 contra S. aureus
com halo de inibição de 33 mm, sendo bem próximo ao antibiótico padrão ampicilina
com halo de 35 mm (Tabela 10).
Segundo Ullrich e colaboradores (1991), entre os vários peptídeos existentes, os
lipopeptídios são bem conhecido por inibir o crescimento de fungos e bactérias incluindo
patógenos humanos. Para este efeito, a daptomicina (cubicin), um lipopeptídio aniônico
já tem sido usado para aplicações terapêuticas, sendo eficaz contra a bactéria Grampositiva S. aureus (HEINZELMANN et al., 2005; NGUYEN, et al., 2006), bem como
sensíveis a Streptococcus pyogenes, S. agalactiae, e S. dysgalactiae (STRAUS, et al.,
2006). Outro lipopeptídeo antibiótico descrito por Aretz e colaboradores (2000) é a
110
friumilicina produzido do actnomiceto Actinoplanes friuliensis, sendo um agente efetivo
contra bactéria Gram-positivo, Staphylococcus epidermidis e S. aureus.
Recentemente têm sido descritos na literatura outros novos lipopeptídeos também
com uma elevada atividade antimicrobiana, o Paenibacterin isolado de Paenibacillus
thiaminolyticus com atividades antimicrobianas contra bactérias Gram-positivas e Gramnegativas, incluindo Listeria monocytogenes, S. aureus, E. coli e Salmonella enterica
(GUO, et al., 2012; HUANG et al., 2014), o Kannurin isolado de Bacillus cereus com
atividade antifúngica (AJESH, et al., 2013), Subtulene A, isolado de Bacillus subitilis
SSE4 com atividades antifúgicas contra Colletotrichum gloeosporioidese e Sclerotium
rolfsii e antibacteriana contra P. aeruginosas (THASANA et al., 2010).
Das e colaboradores (2008) também relataram que a surfactina produzida por
Bacillus circulans tem sido ativa contra bactérias multirresistentes, como Alcaligenes
faecalis, Proteus vulgaris, P. aeruginosa, E. coli e S. aureus resistentes a meticilina, com
concentração mínima inibitória inferior aos antibióticos convencionais utilizados.
Acredita-se que a atividade antimicrobiana da surfactina seja consequência direta
da interação forte e profunda deste lipopetídeo na membrana alvo e de sua ação sobre a
estabilidade de bicamada (CARRILLO et al., 2003) causando alterações na integridade
da mesma (PEYPOUX et al., 1999). Estas interações são mais intensas no caso de
fosfolipídeos com cadeia hidrocarbônica semelhante à da surfactina em relação ao
número de carbonos. A surfactina forma “clusters” com os fosfolipídeos, estabelecendo
domínios de surfactina dentro da bicamada (KNOBLICH et al., 1995; GRAU et al.,
1999). Esta molécula pode ainda formar, nas bicamadas, agregados micelares com
organização lamelar ou pequenas vesículas fechadas, que podem solubilizar a membrana
biológica, atuando como um detergente nesta estrutura (KNOBLICH et al., 1995; GRAU
et al., 1999; CARRILLO et al., 2003). Esta atividade na membrana ocorre devido à
111
surfactina possuir uma estrutura com cárater anfipático, que compreende uma face
hidrofóbica formada por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos (quatro Leu e uma Val) e
uma face hidrofílica com os dois grupos carboxílicos formada pelos resíduos ácidos Glu
e Asp e uma cadeia de ácido graxo. Ao penetrar na bicamada, comprimento da cadeia
lipídica e a cabeça polar cíclico da surfactina promove a sua insersão na interface
hidrofóbica da membrana desestabilizando-a através da formação de poros condutores de
íons, que compromete o equilíbrio eletroquímico da membrana, explicando a possível
ação antimicrobiana destas moléculas (CARRILLO et al., 2003; HEERKLOTZ et al.,
2004).
112
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E
PERSPECTIVAS
113
Neste trabalho entre as 50 linhagens de bactérias endofíticas amazônicas préselecionadas pelo teste de coloração Sudan Black, foram identificadas por espectrometria
de massas, 25 produtoras de lipopeptídeos da classe das surfactinas.
Em ensaios pela metodologia de Crhistensen foi observado que essas linhagens
apresentam atividades de microparasitismo e competição frente a S. aureus, E. faecalis,
P.aeruginosa, E. coli e C. albicans enquanto que pelo método de difusão em ágar, 13
extratos destas linhagens apresentaram antibiose frente a S. aureus, P. aeruginosa e C.
albicans.
Na análise dos espectros de massas obtidos por ESI-ITMS no modo positivo foi
observado um alto grau de semelhança dos extratos de lipopeptídeos dessas 25 linhagens,
tendo sido identificados quatro homólogos da surfactina;
A análise dos espectros de alta resolução obtidos por ESI-MS2 no modo negativo
confirmou a semelhança dos extratos de lipopeptídeos dessas linhagens, porém revelou a
presença minoritária de mais quatro homólogos da surfactina em diversos extratos;
Uma das amostras (LP50) apresentou o maior número de homólogos da surfactina,
incluindo todos os observados nas outras amostras, três dos quais, C11, C17 e C18 ainda
não foram relatados na literatura;
Embora os espectros de massas obtidos no modo positivo são os mais utilizados
para a caracterização de lipopeptídeos, os estudos deste trabalho demontraram que o uso
da espectrometria de massas no modo negativo pode ser uma ferramenta viável na
elucidação de homólogos da surfactina, dadas as presenças do ácido glutâmico (Glu) e
ácido aspártico (Asp).
Este é o primeiro estudo químico e biológico de lipopeptídeos obtidos de bactérias
endofíticas na região e os resultados obtidos ressaltam a importância das investigações de
microrganismos endófiticos como fontes de produtos naturais.
114
7. REFERÊNCIAS
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134
APÊNDICES
135
Relative Abundance
100
387,10
NL: 4,67E2
1767,16
1968,52 ITMS - c ESI Full ms [200,00
NL: 2,03E2
48
388,26 487,14
742,74 847,38
ITMS - c ESI Full ms [200,00
1185,43
1423,83 1539,41 1675,22
1880,45
377,14
NL: 3,89E2
156
719,06
488,18
341,19
683,29 781,00 903,35 1074,30 1245,35
1487,02 1576,09 1753,01 1879,76
377,14
NL: 2,61E2
174
719,07
341,21 439,15 601,22
903,36
1074,33 1245,44
1487,21 1609,28 1769,45 1895,14
NL: 2,20E2
387,09
719,04
181
439,08 549,15
215,14
886,57
1074,77 1238,91 1362,76 1474,02 1600,31
1858,31
245,17
NL: 1,71E1
1034,68 1167,78
185
275,25
840,78 976,98
549,20 656,52
1216,62 1390,81 1485,63
1662,90
1942,52 ITMS - c ESI Full ms [200,00
377,19
NL: 3,10E1
189
1035,71 1191,42
559,31 663,21
289,19
1304,29 1464,65
946,60
1595,93
1841,28 1940,32 ITMS - c ESI Full ms [200,00
1034,58
NL: 2,37E1
358,28
559,33
191
1311,99
639,91 777,27
487,17
1795,14
961,91
1093,32
1461,89 1592,52
1979,93 ITMS - c ESI Full ms [200,00
341,19
Relative Abundance
0
100
0
100
0
100
0
100
0
100
0
100
0
100
0
200
719,05
649,34
439,13
400
600
41
903,44 991,19 1076,72 1222,72
1034,62
800
1000
1200
1521,58
1400
1600
1800
2000
m/z
Figura 37. Espectros de ESI-ITMS no modo negativo das linhagens 41, 48, 156, 174, 181, 185,
189 e 191.
100
341,11 488,20
507,19
255,28
0
100
0
100
439,11
359,16
0
100
0
100
0
1397,27
1525,71 1695,01
1944,75
1025,19
1208,73 1379,78 1487,21 1660,72 1830,37
1280,96
1486,74
56
1687,13
1969,74
1034,55
935,85
1066,46
1485,91 1628,82
1850,38
1034,54
726,41
255,26
972,47
1201,54
66
1390,25 1513,43 1698,52
1937,40
1111,92
564,94
669,01
781,40
1056,21
1375,01
1602,13
1889,29
NL: 6,39E2
AdrianaSpirottoESIneg_
36 T: ITMS - c ESI Full m
683,17
341,10
401,13
561,15
255,26
200
400
600
781,11 903,34
800
1125,81
1000
m/z
127
1262,59 1424,11
1200
1400
1685,08 1829,05
1600
1800
NL: 6,01E2
AV: 31 T: ITMS - c ESI F
NL: 1,07E2
46 T: ITMS - c ESI Full m
65
1266,35
NL: 1,68E2
NL: 7,20E2
81
1234,95
NL: 4,26E2
NL: 6,70E2
54
645,18
285,08
1197,33
894,51 1009,38
578,49
255,23
0
100
906,52
521,20 661,59
516,76
0
100
108
683,15
719,12
743,13
341,11
255,26
239,12
719,16
2000
Figura 38. Espectros de ESI-ITMS no modo negativo das linhagens 108, 54, 56, 81, 66, 65 e 127.
136
100
50
Relative Abundance
341,11
401,11
50
50
472,25
255,28
0
100
0
100
683,17
719,14
341,12 447,14
165,14
1160,93 1261,43 1434,21
814,54 908,35
1582,94 1719,97 1850,66
683,16
719,14
109
781,11
523,16
NL: 2,93E2
AdrianaSpirottoESIneg_131125
RT: 40,95-41,90 AV: 36 T: ITMS
[100,00-2000,00]
NL: 5,96E2
RT: 38,99-39,70 AV: 28 T: ITMS
[100,00-2000,00]
NL: 1,89E2
RT: 36,88-38,04 AV: 42 T: ITMS
[100,00-2000,00]
NL: 3,43E2
RT: 34,75-35,74 AV: 37 T: ITMS
[100,00-2000,00]
NL: 3,99E2
RT: 29,26-30,24 AV: 37 T: ITMS
[100,00-2000,00]
NL: 2,18E2
RT: 23,75-24,37 AV: 25 T: ITMS
[100,00-2000,00]
105
1026,60
1210,81 1338,64 1445,11 1632,47 1770,38 1889,61
1169,10
255,24
0
100
870,43
578,39 708,17
339,19
1021,98
1192,90
68
1375,02
1592,32 1695,61 1868,97
1034,57
50
516,89
447,17
285,12
0
100
705,33
1199,87
858,09
67
1386,05
1448,30
1748,58 1880,06
1034,57
50
285,13
0
100
516,84
423,35
285,11
50
516,87
341,21
0
200
400
63
1115,47 1236,60
1406,58 1503,68 1648,98
1934,45
1257,50
1034,43
922,39
73
663,31
1137,48 1291,43
758,55
1415,10
1577,53 1712,28 1844,93
896,30
697,76
600
800
1000
m/z
1200
1400
1600
1800
2000
Figura 39. Espectros de ESI-ITMS no modo negativo das linhagens 105, 109, 68, 67, 63 e 73.
683,21
100
50
583,29
0
100
719,04 812,03
903,28
1074,36
962,00
683,20
1245,38
1416,51 1487,07
1661,77 1747,22
1937,23
Relative Abundance
539,26
0
100
803,24
943,03 996,90
1145,05
1263,24 1329,96 1450,31
1595,46 1695,91 1812,54
1938,82
683,22
719,05
903,27
561,26
0
100
NL: 5,01E3
ADRIANA_SPIROTTO_170914
O#424-496 RT: 4,47-5,11 AV:
ITMS - c ESI Full ms [500,00-20
59
50
1074,32
1245,30
1416,31 1487,06 1587,59 1666,46
1871,09 1976,99
683,20
781,05
719,05
50
NL: 3,26E3
O#539-604 RT: 5,57-6,14 AV:
64
903,28
924,94
561,26
0
100
1074,31
1245,64
1416,64 1487,27 1608,14 1716,12 1810,17
1991,63
683,22
719,11
50
NL: 3,76E2
O#291-362 RT: 3,04-3,76 AV:
47
719,00
50
NL: 3,00E3
O#159-241 RT: 1,71-2,43 AV:
39
781,06
82
521,08
903,28
1074,22 1145,19
0
600
NL: 2,14E3
O#715-770 RT: 7,14-7,62 AV:
800
1000
1265,30
1200
1487,13
1400
1607,96
1600
1803,44
1800
1993,33
2000
m/z
Figura 40. Espectros de ESI-ITMS no modo negativo das linhagens 39, 47, 59, 64, e 82.
137
683,21
100
50
521,10
561,26
0
100
Relative Abundance
50
0
100
50
719,05
903,25
1024,74
1145,02 1245,30 1327,23
1486,93 1580,48 1663,73 1773,57
683,20
719,06
903,27
515,27
537,10
0
100
1981,27
NL: 1,58E3
ADRIANA_SPIROTTO_170914_
#997-1050 RT: 10,01-10,49 AV
148
781,05
521,10
NL: 1,34E3
#901-969 RT: 9,03-9,67 AV: 69
ESI Full ms [500,00-2000,00]
91
683,17 780,98
719,00
813,01
1074,30
909,20
1245,55
1416,63 1487,16 1605,71 1720,42
1868,09 1950,00
1267,35
1099,26
NL: 1,21E2
#1076-1126 RT: 10,79-11,30 A
158
1351,00 1460,07
1587,49
1745,81 1859,98 1948,65
683,20
719,01
732,30
50
521,04
0
100
NL: 2,61E3
#1315-1407 RT: 13,19-14,04 A
222
903,30
1074,27
1245,16 1326,16 1421,40 1550,37 1637,69 1769,39
1923,00
683,20
719,03
50
781,02
527,03
903,25
1074,30
1245,35 1326,76
0
600
NL: 3,67E3
#1435-1519 RT: 14,34-15,10 A
223
800
1000
1200
1487,15 1588,42
1400
1758,62
1600
1950,82
1800
2000
m/z
Figura 41. Espectros de ESI-ITMS no modo negativo das linhagens 91, 148, 158, 222 e 223.
1034,91
100
50
0
100
517,20
631,47 737,64 801,67
Relative Abundance
0
100
50
699,16
827,51
521,08
1476,03 1577,05 1683,77 1782,39 1885,55
1210,31 1300,68
1026,51 1111,13
521,10
539,34
1446,99 1517,17 1658,85 1752,48 1844,81 1985,11
1136,55
1177,47
1363,50
1382,73 1529,89
239
1676,44 1768,31 1853,62 1960,44
NL: 3,61E2
#1950-2017 RT: 19,53-20,20 A
683,13
781,08
845,24
719,08
943,01
883,15
243
1145,19
1323,41
1410,02
1542,93
1691,90 1770,60 1870,45
683,16
903,30
0
600
800
NL: 1,57E3
#2036-2095 RT: 20,44-20,99 A
254
781,02
521,09
1024,99 1122,75 1245,42 1315,95
1000
1200
1400
1487,04
NL: 4,27E2
#1779-1857 RT: 17,76-18,54 A
NL: 2,12E2
#1859-1925 RT: 18,56-19,24 A
1033,92
855,14
537,12
682,96 780,92
870,12
0
100
50
1114,37 1218,63 1292,75
234
591,17
50
1006,87
992,96
537,05
50
0
100
NL: 1,21E3
#1627-1669 RT: 16,28-16,70 A
224
1664,34
1600
1871,96 1966,03
1800
2000
m/z
138
683,18
100
50
521,10
583,31
0
100
Relative Abundance
50
781,04
903,30
683,19
537,10
1074,28
1245,18 1323,12
1486,94
1652,94 1732,15 1862,14 1960,99
258
719,00
903,37
1074,33 1145,20
1487,21 1577,74 1666,31
1316,68
1824,06
781,18 836,61
50
0
100
0
100
1970,12
684,56
658,64
50
NL: 1,76E3
ADRIANA_SPIROTTO_170914_N
#2195-2251 RT: 21,91-22,43 AV:
ITMS - c ESI Full ms [500,00-2000,
781,02
561,35
0
100
NL: 1,81E3
#2110-2175 RT: 21,13-21,73 AV:
257
933,25
1076,81 1178,86
1259,72 1359,55
1470,47 1585,16 1720,72 1827,72
NL: 1,81E2
#2291-2355 RT: 22,83-23,44 AV:
259
1961,81
683,20 781,02
719,05
521,14
569,51
903,34
752,50
683,25
50
1074,38 1145,15
1305,38
1487,10 1558,41 1671,28 1795,86 1897,86
NL: 1,76E2
#2458-2515 RT: 24,43-24,96 AV:
1034,91
858,49
973,33
265
1145,79
0
600
NL: 1,50E3
#2369-2437 RT: 23,59-24,21 AV:
264
800
1000
1305,69 1384,46
1491,11 1601,89 1732,39 1822,64 1929,31
1200
1400
1600
1800
2000
m/z
139
fragextratoprecipitado-negativoepositivo #1303-1427 RT: 22,08-22,65 AV: 34 NL: 7,10E1
786,55
100
90
707,58
A
80
1030,76
Relative Abundance
70
60
50
40
800,54
917,66
30
463,32
693,54
20
931,68
594,43
10
391,37
320,42 365,25
0
300
350
449,40 481,22
400
450
714,62
548,55 590,51
500
550
1012,71
958,72
643,62
600
679,42
650
m/z
804,60
728,77 768,54
700
750
800
899,62
859,75
850
986,86
900
950
1000
fragextratoprecipitado-negativoepositivo #1520 RT: 24,25 AV: 1 NL: 1,80E2
800,54
100
90
B
80
707,47
Relative Abundance
70
931,68
60
463,36
50
40
1026,75
30
814,54
728,62
972,89
594,43
20
391,34
901,72
481,26
693,50
10
320,30
491,41
365,17
0
300
350
400
450
500
548,61
574,38
550
671,69
604,48
600
650
818,51
742,34 782,81
700
750
832,87
800
945,59
1016,34
897,78
1000,89
886,15
850
900
950
1000
m/z
fragextratoprecipitado-negativoepositivo #1811-2239 RT: 31,40-35,19 AV: 209 NL: 4,46E-1
1072,81
C
100
828,64
90
80
Relative Abundance
70
60
1054,74
707,58
50
40
721,64
959,68 1000,85
30
20
10
594,29
590,40
463,44
391,13
693,52
756,86
661,61
929,45
810,63
846,71
1036,68
973,69
895,34
0
300
350
400
450
500
550
600
650
700
m/z
750
800
850
900
950
1000
1050
Figura 44. Espectros de ESI-ITMS2 dos íons fragmentos de sódio [M+Na]+ (A) m/z 1030, (B)
1044 e (C) 1072, presentes no extrato LP76.
140
M- H-H2O
b4
y6-b4
y7-b3
y7-b2
y7-b4
y3
MS/MS
974.2254
650.2254
y7-b3
y7-b2
M- H-H2O
y6-b4
b4
y3
353.2264
988.6553
M- H-H2O
1002.6547
b4
y6-b4
678.2354
y7-b3
y7-b2
y3
y7-b4
353.2053
b4
353.2254
452.2154
M- H-H2O
y7-b4
y6-b4
y7-b3
y3
y7-b2
323.2154
1030.7031
Figura 45. Espectros de fragmentação ESI – MS2 no modo negativo dos íons de m/z 992, 1006,
1020, 1034 e 1048 presentes no extrato LP 50.
141

Dissertação - Adriana Spirotto Stein Mesquita

Transcrição

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