Desenho e Validação in silico de Primers Intragenéricos

II Workshop de Tecn. da Inf. aplicada ao Meio Ambiente – CBComp 2004
Seqüenciamento de DNA
Desenho e Validação in silico de Primers
Intragenéricos
S. P. S. Garcês e A. O. S. Lima
Resumo - Uma das principais técnicas utilizadas em
biologia molecular é a reação de polimerase em cadeia
(PCR). Por este método é possível amplificar milhares de
vezes um fragmento de DNA. Para que isso seja possível
são desenhados primers com características específicas.
Dependendo do objetivo do trabalho podem ser
desenhados primers altamente específicos (eficazes em só
uma espécie) ou genéricos (eficazes em diversas espécies).
No presente trabalho objetivou-se determinar uma rotina
para o uso de ferramentas de bioinformática que
possibilitem o desenho de primers intragenéricos, isto é,
primers que permitam a amplificação de um gene a partir
de várias espécies de um mesmo gênero. Esses primers são
de grande importância para procedimentos relacionado à
engenharia genética. Nesse sentido, foram desenhados
primers internos intragenéricos para genes que codificam
hidrolases nos gêneros Bacillus, Streptomyces e
Escherichia. Posteriormente, os primers obtidos foram
validados virtualmente. Os resultados indicam que a
rotina apresentada pode auxiliar no desenho de primers
intragenéricos.
Palavras-Chave - ferramentas de bioinformática, desenho
de primers, PCR.
A
I. INTRODUÇÃO
reação de polimerase em cadeia (Polymerase Chain
Reaction-PCR) é uma técnica utilizada para a
amplificação de ácidos nucléicos específicos. Para tanto,
são utilizados dois oligonucleotídeos sintéticos denominados
primers, os quais são complementares a duas regiões
especificas do DNA alvo a ser amplificado. Para a reação, é
obtida uma mistura contendo DNA alvo, primers,
desoxinucleotídeos, tampão e Taq DNA polimerase. Esta
mistura é submetida a uma série de ciclos de amplificação,
através da exposição a três temperaturas diferentes. Primeiro o
DNA alvo é desnaturado à temperatura de 94 ºC, em seguida
os primers são anelados às cadeias de DNA alvo (50-65 ºC) e
finalmente uma nova cadeia de DNA é polimerizada (72 ºC).
Fragmentos de DNA (<10 Kb) correspondentes à região entre
os dois primers são amplificados exponencialmente [3, 6] até
cerca de um milhão de vezes. O produto gerado pode ser
caracterizado (tamanho e seqüência nucleotídica) ou
manipulado para outras aplicações. Entre estas destacam-se a
S. P. S. Garcês e A. O. S. Lima – Centro de Ciências Tecnológicas da
Terra e do Mar, Universidade do Vale do Itajaí, R. Uruguai, 458, Itajaí-SC
88302-202, Brazil. (e-mail: [email protected]).
sub-clonagem para produção de proteínas e seu emprego
como sonda de DNA para clonagem de genes [2].
O desenho de primers para PCR é o passo chave para uma
reação bem sucedida, sendo um procedimento simples quando
a seqüência do DNA alvo a ser amplificada é conhecida.
Neste caso, é necessário respeitar algumas regras (tamanho,
composição, Tm) ou utilizar programas específicos para o
desenho de primers [2]. Contudo, quando é necessário um par
de primers eficiente para a amplificação de um gene em
diferentes espécies de um mesmo gênero [2], este processo
pode-se tornar mais complicado.
Uma das formas para se desenhar primers, é através da
utilização de programas de bioinformática. Como produto da
fusão entre as ciências da computação e biológica, a
bioinformática recebeu grande atenção nas últimas duas
décadas, principalmente devido à necessidade de se organizar
e analisar a enorme quantidade de dados gerados em biologia
molecular [1]. Hoje, mais de 22 milhões de seqüências estão
depositadas no Centro Nacional de Informação Biotecnológica
dos Estados Unidos (National Center for Biotechnology
Information - NCBI) [8]. Portanto, existe uma grande
quantidade de dados que necessitam ser analisados a fim de
gerar novas informações úteis. Isso resulta em uma crescente
necessidade de conhecimento na área da bioinformática e de
pesquisadores que saibam utilizar e desenvolver estas
ferramentas.
Neste trabalho é apresentada a utilidade da interligação das
ferramentas existentes em bioinformática, no desenho e
validação de primers para PCR. Para tanto, será construída
uma base de dados de primers intragenéricos que permitam a
amplificação de genes que codificam hidrolases de interesse
biotecnológico em três gêneros (Bacillus, Streptomyces e
Escherichia). Nesse sentido, foi estabelecida uma rotina
constituída por uma etapa de busca de seqüências
relacionadas, determinação de regiões consenso, seleção da
região consenso mais conservada, desenho de primers para a
região conservada e validação do par de primers desenhados.
II. MATERIAIS E MÉTODOS
O desenho de primers é dividido em quatro fases: busca e
escolha das seqüências de interesse; alinhamento das
seqüências e determinação do consenso; seleção da região
consenso mais conservada e escolha e teste dos primers.
A. Busca e escolha de seqüências
Para a execução de uma busca de forma eficiente é
necessário o uso de palavras-chave que sejam representativas.
No presente caso, é fundamental a designação apropriada ao
gênero e enzima que se quer estudar. A busca de seqüências
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de nucleotídeos inicia-se no taxbrowser do NCBI [12]. Esta
ferramenta é usada para se determinar a identificação numeral
atribuída, pelo NCBI, ao gênero que se deseja estudar. Para
tanto, foi colocado o nome do gênero de interesse e como
resultado foi obtido o taxonomyID. Como mencionado, é
fundamental a correta designação da enzima que se quer
estudar. Como existem vários nomes possíveis para uma
mesma enzima é importante que todos sejam usados. Nesse
sentido, os sinônimos das designações para enzimas podem
ser obtidos no banco de dados do Expasy [4]. Neste site, foi
escolhida a opção de enzima [5] e posteriormente colocado o
nome da proteína de interesse. Os resultados obtidos foram
copiados para um arquivo de texto.
Uma vez obtidas as informações referentes à nomenclatura
correta (organismos e enzima), foi acessado o banco de dados
de nucleotídeos do NCBI [10]. Na janela details, foram
colocados separadamente os sinônimos da enzima de interesse
o organismo alvo. Em ambos os casos, sempre definindo o
campo de busca, isto é, no caso enzima [protein name] e do
organismo – [organism]. Para que a busca seja executada
corretamente, o nome do organismo foi relacionado com as
designações da enzima pela expressão boleana AND e os
nomes da enzima separados pela expressão OR. A expressão
de busca também foi adicionada da expressão boleana NOT, a
qual permitiu a eliminar seqüências relacionadas a vetores,
genomas completos, genes putativos ou genes prováveis. A
seqüência completa de DNA (CDS) dos resultados obtidos foi
recuperada (formato FASTA) e armazenada em arquivo de
texto. Uma última "limpeza" das seqüências obtidas foi
necessária a fim de eliminar repetições, fragmentos que
apresentavam um número de bases muito diferente da média e
outras seqüências não relacionadas.
B. Alinhamento e consenso
Para o alinhamento das seqüências selecionadas (formato
FASTA), estas foram colocadas na janela do programa
Multialin [13]. Em seguida, foi selecionada na janela Optional
Parameters a opção Sequence Alignment Will Be Displayed
As Coloured Html Text. Já na janela Other Options a seção
Maximum Line Length and Graduation Step foi alterada para
o comprimento máximo das seqüências a serem alinhadas.
Posteriormente, foi realizado o alinhamento e a seqüência
consenso resultante foi copiada para um arquivo texto.
C. Seleção da região consenso mais conservada
A ferramenta BLAST da base de dados do NCBI [9] foi
utilizada para determinar em qual região da seqüência
consenso ela é mais conservada entre as espécies do gênero de
interesse. Para tanto, a seqüência consenso foi avaliada pela
rotina – Search for short, nearly exact matches (nucleotídeos)
do NCBI. Após a execução da busca (tecla Blast), na página
Seqüenciamento de DNA
seguinte é permitido selecionar a forma com que serão
apresentados os resultados. Nessa página, foi selecionado o
item Bacteria na seção Limit results by entrez query e Query
ancored with identities na seção Alignment view. A partir do
resultado do BLAST foram escolhidas as duas regiões mais
conservadas que possuíssem pelo menos entre 20-40 bases de
comprimento.
D. Escolha e teste dos primers
Para a escolha dos primers com as propriedades mais
adequadas foi empregado o programa Gene Runner (Hastings
software - v3.05). Neste caso, foram avaliadas separadamente
as duas regiões consenso mais conservadas. Para tanto, a
seqüência nucleotídica foi inserida na janela de análise de
primers do programa. Em seguida, foram retiradas bases das
extremidades da seqüência até que a mesma apresentasse os
seguintes parâmetros: 30-70% G-C, reduzida formação de
dímeros e hairpins (regiões de auto anelamento) e Tm por
volta de 61 ºC (variação máxima de 2 °C). A fim de testar a
validade dos primers, estes foram comparados (como descrito
anteriormente) às seqüências de nucleotídeos depositadas no
banco do NCBI. Para tanto, no quadro query foi colocada a
seqüência selecionada para os dois primers e entre eles foi
adicionada a letra N. Tal estratégia, faz com que as duas
seqüências devam ser procuradas simultaneamente não
importando a distância existente entre elas.
III. RESULTADOS
Como resultado do procedimento para o desenho de
primers intragenéricos, foram definidos os primers
apresentados na Tabela I. Foi proposta a busca de primers
para as seguintes hidrolases: α-amilase, β-amilase, glican1,4α-glicosidase, α-glicosidase, celulase, β-glicosidase, 1,4-βcelobiohidrolase, poligalacturonase, quitinase, quitosanase,
endo-1,3(4)-β-glicanase, endo-1,4-β-xilanase, lisozima, αgalactosidase, β-galactosidase e agarase. Entretanto, não foi
possível encontrar seqüências referentes a todas as hidrolases
nos três gêneros estudados (Streptomyces, Escherichia e
Bacillus). Tal resultado era esperado, visto que cada gênero
apresenta certas características.
Na tabela II são apresentados os resultados obtidos na etapa
de validação dos primers. Neste caso, é indicado o número de
espécies encontradas no BLAST inicial, isto é em relação a
seqüência consenso. Bem como é apresentado o número de
espécies encontradas com a avaliação das seqüências dos
primers propriamente dita.
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Seqüenciamento de DNA
TABELA I
PRIMERS DESENHADOS PARA A AMPLIFICAÇÃO INTERNA DE GENES QUE CODIFICAM HIDROLASES EM TRÊS GÊNEROS
Gênero
Streptomyces
Escherichia
Bacillus
Enzima
Primer Forward
Tm
(ºC)
GTCACCGCCGTCCTCTT
62
ATGTGCTTGGCGGCG
TTCTTCGACCAGGACGG
60
ACCTCGTCGGGCAGGT
61
Celulase
TCTTCGGCGTCACGGA
62
TCGAGGGTCTGGTACCAGT
61
Quitinase
CGGCGTCGACATCGAC
61
GCCGCCGAGGTCCT
59
Quitosanase
TCGCCTACTACGACGCC
61
AGGAAGGCGTGCAGGTAG
62
α-galactosidase
GTCGACGACGGCTGGTT
63
ATCTGGCTGAATCCGTGC
62
β-galactosidase
CCGACGTCTCCTGGGA
60
GGTCCAGGTCGGCCA
60
α-amilase
CATAACGCCACGGTTTACT
60
CAGCCGTGAATTTGCTCA
62
α-galactosidase
ATTCTTGGTGATGTGTTCCATC
63
CTCAATCAAATCCTCACGAC
59
β-galactosidase
ACATCCCCCTTTCGCC
61
ATCCGCCACATATCCTGAT
61
α-amilase
AAATGGCGGTGGTATCATT
62
TAGTTCATTCGCATACCAATT
60
β-amilase
ATTTAATGGCGCCATTAAA
61
GGTGCCCCATGCTTTATT
62
α-glicosidase
CAGGGAAGTGCTTTCTCATTA
62
GTAATTGAATGAGCTTCTGATAGTA
61
Celulase
GCAATGGTATGGTGAATTTG
62
CATCCTGGCTCCATGTACC
62
β-glicosidase
CATCGTTATAAAGAAGATATCGC
62
CCGTTTTGGCATAGCGT
61
Quitinase
ATTTTATTACTCCAAATCTCGC
61
CGCAATCTTCCCAAGTTG
61
Quitosanase
AGATCAAAAGCGCCGG
61
CACGGGTGTCATGATTGG
61
AGTACATGGGAAAAGGCAGA
61
GAAAAAGGATGAGACAATTCC
60
GATTCATGGGGAACTTATAGAC
60
ACACTCCAGTACTGCGTAAAAG
61
GTTGGAAAAGCAAAATATGAAG
62
TCACGCTTAGGCGGATTA
61
TABELA II
VALIDAÇÃO DOS PRIMERS DESENHADOS
Bacillus
tamanho do
amplicon
(pares de
bases)
2
509
Enzima
α-amilase
2
αglicosidase
2
Celulase
1
S. avermitilis
Quitinase
2
S. coelicolor,
S. avermitilis
0
718
Quitosanase
0
-
0
136
1
S. avermitilis
0
588
1
S. coelicolor
0
1300
6
E. coli
5
216
α-amilase
Escherichia
IV. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
número de
espécies
presentes no
alinhamento
(seqüência
consenso)
número de
acessos do
gênero em
questão
(validação
dos primers)
αgalactosidase
βgalactosidase
α
galactosidase
βgalactosidase
62
α-amilase
Lisozima
Streptomyces
Tm
(ºC)
α-glicosidase
Endo-1,3(4)-βglicanase
Endo-1,4-βxilanase.
Gênero
Primer Reverso
Nome das
espécies
(validação
dos primers)
S. griseus,
S. limosus
S. limosus,
S. coelicolor
2
542
0
518
6
E. coli
5
780
5
E. coli
1
512
α-amilase
0
-
0
210
β-amilase
2
B. cereus
0
611
αglicosidase
3
B. subtilis
1
752
Celulase
0
-
0
513
β-glicosidase
4
B. subtilis
2
267
Quitinase
0
-
0
349
Quitosanase
3
B. subtilis
3
590
Endo-1,3(4)β-glicanase
1
B. macerans
0
210
2
124
1
251
Endo-1,4-βxilanase.
11
Lisozima
3
B. circulans,
B. subtilis,
Bacillus sp.
B. cereus,
B. athracis
A rotina proposta para o desenho de primers internos
intragenéricos, indicou ser de grande valia para pesquisas em
biologia molecular. Pois além de ser uma rotina simples, que
utiliza somente programas disponíveis gratuitamente na
Internet, seus resultados parecem ser consistentes. Isso faz
com que seu uso possa ser implementado facilmente, o que
por sua vez, permitirá uma economia de tempo e de recursos
em testes laboratoriais. Entretanto, deve ser considerado que
nem todos os primers desenhados foram validados
positivamente. Sendo observado casos, onde somente um ou
outro primer era reconhecido durante a validação in silico.
Conclui-se então que os resultados obtidos por essa estratégia
podem sim orientar o pesquisador na seleção de primers com
grande probabilidade de serem eficazes. No presente
momento, alguns dos primers apresentados estão sendo
testados in vitro.
V. REFERÊNCIAS
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
D. W. Mount, "Bioinformatics – Sequence and Genome Analysis," 1st
ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 2001, pp. 1 – 19
J. Sambrook, D. W. Russel, "Molecular Cloning – A Laboratory
Manual," 3rd ed., vol. 2, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 2001, pp. 8.04 – 8.102
http://bip.weizmann.ac.il/mb/bioguide/pcr/PCRwhat.html
http://bo.expasy.org/
http://bo.expasy.org/enzyme
http://www.books.md/P/dic/PCR.php
http://www.generunner.com/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
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II Workshop de Tecn. da Inf. aplicada ao Meio Ambiente – CBComp 2004
Seqüenciamento de DNA
[10] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&cmd=Se
arch&dopt=DocSum&term=txid561[Organism:exp]
[11] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/
[12] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi
[13] http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/
VI. BIOGRAFIAS
S. P. S. Garcês é aluno do curso de graduação em
Engenharia Biotecnológica na Universidade do Algarve, Faro,
Portugal. A. O. S. Lima é professor junto ao curso de Ciências
Biológicas da UNIVALI, Itajaí-SC. É licenciado e bacharel
em Ciências Biológicas pela UNESP de Rio Claro-SP.
Obteve título de mestre (1997) e doutor (2001) em agronomia
junto ao Departamento de Genética da ESALQ-USP,
Piracicaba-SP. Concluiu em 2002 o pós-doutorado em
Genética na ESALQ-USP, Piracicaba-SP.
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