Anais do I Simpósio de Reprodução Minitub
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Anais do I Simpósio de Reprodução Minitub
1 Sumário RESUMO: SELEÇÃO DE SUÍNOS MACHOS JOVENS COMO DOADORES DE SÊMEN (Prof.Dr.Dr.h.c.Karl-Fritz Weitze - Fundação Escola de Medicina Veterinária de Hannover) __________ 1 HYGIENE MEASURES IN BOAR SEMEN PRODUCTION (Prof.Dr.Dagmar WaberskiUniversity of Veterinary Medicine Hannover) _____________________________________________ 14 HOW TO IMPROVE BOAR SEMEN PRODUCTION EFFICIENCY: A VIEW OF THE US SEMEN PRODUCTION SYSTEM (Phil Burke – Minitube of America) _________________ 20 O PAPEL DO DILUENTE DE SÊMEN NA EFICIÊNCIA DE PROGRAMAS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL DE SUÍNOS (Prof.Dr.Dr.h.c.Karl Fritz. Weitze - Fundação Escola de Medicina Veterinária de Hannover) ___________________________________________________ 32 RESUMO: SELEÇÃO DE SUÍNOS MACHOS JOVENS COMO DOADORES DE SÊMEN Prof.Dr.Dr.h.c Karl Fritz Weitze Fundação Escola de Medicina Veterinária de Hannover, Alemanha Os machos jovens chegam nas centrais de inseminação com idade média de 150 – 170 dias, ou seja pré-púberes, e permanecem normalmente no quarentenário. Nesta idade pode-se coletar os primeiros ejaculados contendo espermatozóides, com diferenças entre as raças e dentro das raças. A qualidade do ejaculado é caracterizado por uma concentração baixa de espermatozóides e uma porcentagem alta de células com gota citoplasmática persistente. Dependendo da raça é recomendável começar o treinamento com 180 dias de idade. Como norma de avaliação do rendimento espermático, podem ser usados os dados da Tabela 1. Tabela 1: Requerimentos espermatológicos para cachaços jovens, com 7 meses de idade (Hühn 1970) Categoria de avaliação I II III Número de espermatozóides x10 65 45 25 Volume de ejaculado (ml) 160 140 120 0,4 0,3 0,2 9 9 Concentração 10 /ml No período de quarentena se inicia o treinamento para saltar ao manequim. Para garantir um treinamento rápido e seguro é fundamental que o quarentenário disponha de instalações adequadas para a coleta (sala de coleta) e de pessoal capacitado para realizar os procedimentos necessários. Esse manejo só é possível em centrais de grande porte. Recomenda-se realizar o treinamento dos jovens após o manejo dos demais reprodutores (antes da limpeza da sala). É fundamental que o ambiente esteja calmo, sem ações que possam distrair a atenção dos cachaços. Os machos em treinamento podem ser alojados com acesso visual da rotina de coleta dos demais doadores. Para que a aprendizagem seja mais rápida, é necessário que o cachaço já tenha contato com a mão do operador na primeira monta ao manequim. Interrupções ou transtornos durante estas primeiras tentativas de coleta podem levar a dificuldades na expressão da cadeia de reflexos e impedir a integração dos cachaços na inseminação artificial. Depois da primeira ejaculação exitosa os cachaços devem ser mantidos em repouso por 4 – 7 dias, antes da próxima coleta. Nesta fase deve-se testar os cachaços quanto a sintomas que possam impedir o seu uso na inseminação artificial, como fase pré-monta prolongada, comportamento hipersexual, agressividade. Tabela 2: Valores padrões para medidas testiculares de cachaços jovens (Hühn 1970) Característica Idade (meses) 6 7 Comprimento testículo + epidídimo 11,5cm 12,0cm Largura testículo 5,1cm 5,5cm Comprimento cauda do epidídimo 1,4cm 1,8cm Tabela 3: Requerimentos mínimos para o desenvolvimento dos orgãos sexuais de cachaços jovens (Hühn 1970) Característica 9 Limite n 10 espermatozóides/ejaculado abaixo 12 cm 15 17,63 acima 12 cm 88 24,30 abaixo 5,5 cm 23 19,82 acima 5,5 cm 80 24,33 Comprimento testículo + epidídimo Largura do testículo Considerando o desenvolvimento rápido do suíno com um intervalo de gerações curto, se examina os cachaços jovens precocemente dentro dos testes de rendimento corporal. Dentro destes exames de rendimento (engorda) também se considera características de importância para o posterior uso como reprodutor, as funções dos membros, andamento e tamanho dos órgãos genitais, etc. Com respeito ao desenvolvimento dos órgãos sexuais dos cachaços jovens existem dados padrões para a seleção/ eliminação (Tabelas 1 a 3). As medidas levantadas num número grande de animais são altamente correlacionadas à produtividade do testículo e à capacidade de armazenamento do epidídimo, facilitando assim a seleção dos animais com maior desenvolvimento na idade de 6 ou 7 meses, respectivamente. Enquanto as demais características dos órgãos como: simetria/ assimetria, forma, elasticidade do tecido, etc. existem também valores padrões a serem considerados na seleção. A conformação dos órgãos sexuais parece ser pouco considerada no trabalho diário numa central, como mostram dados obtidos de 12 cachaços com alterações das membranas plasmáticas dos espermatozóides. Foram realizados exames repetidos clínicos da saúde sexual dos animais e avaliada a higiene e técnica de coleta de sêmen na mesma central. No instituto se realizou um exame espermatológico em relação à morfologia, motilidade (Sperm Vision®), estado de membrana (citometria de fluxo) e estado de cromatina nuclear (SCSA). Na central se realizou a diluição bifásica do sêmen, aplicando a maior parte do diluente à temperatura ambiental depois de uma pré-diluição com diluente a 32°C. Aplicando uma diluição manual monofásica numa parte do sêmen resultou numa melhora significativa da porcentagem de membranas alteradas, mantendo ainda um numero elevado de cachaços com sêmen alterado (Figura 1). Na pesquisa de outras causas se considerou a coleta de sêmen e efeito de cachaço. Não encontrando erros na coleta, verificou se no exame clinico, que dentre os 12 cachaços, 11 mostraram alterações do escroto, testículos ou epidídimo como: papiloma, engrossamento da pele, assimetria testicular, microrquia, consistência flácida testicular, epidídimo pequeno. Esta alta incidência de alterações pode ser sinal de um descuido para com os animais, não apenas dos cachaços em trabalho de rotina mas também daqueles no quarentenário. Figura 1: Resultados de exames espermatológicos repetidos de 12 cachaços adultos com taxa aumentada de células com defeitos da membrana Figura 2: Achados clínicos dos órgãos sexuais Como mostra a Figura 2, os reprodutores manifestaram alterações do escroto, dos testículos e dos epidídimos, resultando em regulação térmica alterada e espermatogênese e/ou mudanças e armazenamento das células espermáticas comprometidas. A conclusão foi que quase todos os cachaços com sêmen alterado mostraram alterações dos órgãos genitais. Interações entre qualidade do sêmen, especialmente das membranas dos SPZ e a saúde sexual dos animais são então provável. Existe a impressão, que não se presta suficiente atenção à saúde sexual dos cachaços tanto no rebanho dos animais adultos como também nos jovens. Vale ressaltar, que apenas cachaços sexualmente saudáveis podem produzir continuamente SPZ em boa qualidade e número alto. Para assegurar a qualidade dos reprodutores nas centrais nacionais a Associação Nacional de Criadores de Suínos oficializou um manual de inseminação artificial, elaborado por membros da nossa unidade, que no seu capítulo do atendimento veterinário disse: A vigilância regular do plantel de reprodutores assim como o controle espermatológico/higiênico da produção de sêmen requer entre outras coisas uma vez por ano um exame clínico dos órgãos sexuais dos cachaços. Os reprodutores jovens são introduzidos apenas depois dum exame clinico realizado durante o tempo de quarentena. Em relação à aquisição de reprodutores jovens (isto é a regra nas centrais alemãs) devem ser cumpridas “prescrições de garantia”, que em relação aos órgãos sexuais e a capacidade de monta exigem que o vendedor se responsabilize, que o reprodutor possua órgãos sexuais normalmente desenvolvidos e que o cachaço mostre boa libido como pré-condição para o uso na inseminação artificial, assegurando que monte regular ao manequim e que facilite a coleta de sêmen sem transtornos. Para assegurar estas informações/ qualidades dos animais é indispensável realizar um exame andrológico dos cachaços jovens por veterinários experimentados. Pela importância do exame realizado corretamente achamos necessário de descrever os fatores fundamentais deste. O exame andrológico facilita informações diagnósticas em relação a - Saúde genética (fenotípica) - Saúde geral - Saúde sexual - Aptidão de montar (potentia coeundi) - Capacidade de fertilizar (potentia generandi) O procedimento inclui uma identificação do animal, levantamento de anamnese/ história do animal, realização do exame clinico geral e especifico do trato genital (exame morfológico, funcional do comportamento sexual e exame espermatológico). Uma lista de “check up”, como usado na Escola de Hannover, facilita muito o levantamento de todo a informação, mostrado na Figura 3. O exame morfológico verifica a completa presença dos órgãos sexuais como também o desenvolvimento segundo idade e massa corporal como também desvios existentes da norma ou sintomas patológicos (veja Tab. 1 e 2). O exame morfológico se realiza num brete ou durante a coleta de sêmen (Figura 4) Aspectos do exame do escroto são: simetria, grossura da pele, alterações da pele, aderências, vermelhidão; na palpação calor aumentado e mobilidade. Achados patológicos no escroto são lesões, abscessos, papilomas, sarna. Os testículos são examinados com as duas mãos, uma mão levanta o testículo do lado ventral, a outra mão apalpa o órgão. Se levanta informações em relação a forma, tamanho, posição, simetria, consistência, dor (Figura 5,6). Figura 3: Lista de “check up” andrológico de reprodutores suínos (Escola de Medicina Veterinária de Hannover) Figura 4: O que examinamos morfologicamente? Figura 5: a) lesões com abscessos, b) sarna no escroto Figura 6: Técnica de palpação Uma mão levanta o testículo do lado ventral, a outra palpa o órgão Figura 7: Medições com o “compasso pélvico” Tabela 4: Desenvolvimento testicular no cachaço Landrace (Meersmann) Peso em kg Idade em meses Comprimento cm Diâmetro cm 30 - 90 3-5 4,5 - 7,5 ( 3 - 8,7) 2,7 – 4,4 (1,5–5,8) 90 - 150 6-8 7,3 – 8,7 (5,8-11) 4,4 – 5,8 (3,7-7,5) 150 - 190 9 - 11 9,1 - 9,6 (7,2-11,1) 5,4 – 6,1 (3 – 7,7) 190 - 250 12 - 30 9,7 – 11 (8,2-12) 5,9 – 7,2 (4,9-8,0) Achados patológicos no testículo são orchitis, periorchitis (inflamação do tecido germinativo / das paredes testiculares), hidrocele/hematocele (infiltração do saco escrotal com liquido abdominal / sangue). Hipoplasia (subdesenvolvimento) ou atrofia (ausência). Figura 8: orchitis; aumento de tamanho, vermelhão, dor, consistência firme Em relação aos achados palpáveis nos epidídimos podemos apalpar a cabeça e cauda do epidídimo. Verifica-se a forma (por ex. ovoide, bem delimitada), tamanho (cm), posição, simetria, consistência (flácida, tenso elástica), separável do testículo (bem delimitado) sensibilidade (dor). Na figura 9 a. e b. verificamos a posição obliqua do epidídimo com a cabeça na posição ventro-cranial, a cauda dorso-caudal e o corpo na face cranial do testículo. Achados patológicos podem ser o subdesenvolvimento (hipoplasia uni- ou bilateral), a aplasia (falta do órgão), que pode ser parcial (segmental). Aumento de volume devido a espermatocele (obturação do canal epididimal), e a inflamação do órgão (epididimite) com aumento de volume e sensibilidade (dor). Figura 9 a., b.: Posição do epidídimo. (eixo longitudinal inclinado) Figura 10: Cordão espermático e linfonodos inguinais O cordão espermático (musculus cremaster, conducto espermático, plexo pampiniformis) se apalpa com uma mão, quando a outra levanta o testículo em posição cranial. Grossura, consistência, simetria, motilidade e dor são achados a levantar. Em relação aos linfonodos inguinais (apalpável na fenda inguinal) e necessário verificar o tamanho e a consistência, eventualmente a sensibilidade no caso de aumento. Figura 11: Pênis emitido com balanopostite (inflamação aguda da mucosa). A adspecçao facilita levantar informações sobre forma, lesões, cor e umidade da mucosa, neoformações. O prepúcio é visível no animal em andamento e durante a monta ao manequim. Achados do prepúcio e do divertículo prepucial são principalmente aumento de volume em consequência de acúmulo de líquido (esmegma, urina). Muitos cachaços jovens já mostram desde logo esta dilatação, que torna se aumentar com a idade levando dificuldades e emitir o pênis a contaminação do sêmen com germes, que crescem em numero grande no líquido acumulado (Figura 12). Figura 12: Prepúcio dilatado (urina no divertículo prepucial) O exame funcional (comportamento sexual) realiza se quando o cachaço monta ao manequim. A libido se mede via tempo de reação (intervalo entre primeiro contato visual até a primeira tentativa de montar). O tempo de reação deve ser menos do que 15 minutos. A cadeia de reflexos sexuais deve ser completa e não perturbada inclusive uma coleta de sêmen fisiológica. Atividade sexual reduzida (falta de libido) pode ser um problema nos cachaços adultos (especialmente em época de verão) assim como nos cachaços jovens quando introduzidos na quarentena. O comportamento sexual do cachaço é coordenado pelo sistema nervoso central , baseado na presença de hormônios sexuais, secretados pelas gônadas, que estão controladas pelo sistema nervoso central. Como o suíno atual descende do ancestral selvagem, sua atividade reprodutiva depende de certos câmbios estacionais, que podem afetar também a atividade sexual no verão, associado com níveis reduzidos de andrógenos. Esta diminuição da atividade sexual frequentemente está associada com um número aumentado de ejaculados de má qualidade, caracterizados por motilidade reduzida e taxa incrementada de alterações morfológicas (gota citoplasmática persistente, acrossomas em desprendimento etc.). Tempo quente, especialmente associado com alta umidade, está associado com este problema já desde muito tempo. Interessante é que parece existir uma clara variação individual entre cachaços em relação a sua “resistência térmica”, como mostram experiências de centrais de sêmen. Por definição, a falta de libido pode ser diagnosticada, quando cachaços bem treinados necessitam mais do que 15 minutos para montar ao manequim. Falando de problemas de libido no senso mais amplo, diferentes fatores podem ser associados com atividade sexual reduzida: 1. Problemas físicos e de saúde 2. Uso excessivo, especialmente em cachaços jovens 3. Deficiência nutritiva, super nutrição 4. Problemas psíquicos (estresse, tratamento falso durante a coleta) 5. Masturbação frequente 6. Estresse climático (tempo quente e úmido) Movimento excessivo dos membros traseiros durante a coleta pode indicar membros ou pés coxos ou debilidade do sistema muscular e/ou circulatório. Infecções ou apenas influenza podem reduzir o interesse do cachaço na atividade de monta. Quando não existem dúvidas de que técnicas inadequadas de coleta podem ser a causa, o cachaço deve ser examinado pelo veterinário para identificar o problema. Cachaços jovens (6 ate 10 meses de idade) devem ser usados com cautela, como já foi mencionado anteriormente, coletando sêmen não mais do que 3 vezes em duas semanas (intervalos de 6/7 dias). Também cachaços adultos não podem ser usados excessivamente (geralmente 2 vezes por semana) exceto para tempo curto 3 vezes por semana, menos devido a sua força física, mas mais devido a resultados de câmbios na composição da secreção acessória que pode alterar a sobrevivência dos SPZ durante a preservação. Subnutrição severa e falta de libido não acontecem em condições normais de uma central, mas é conhecido muito tempo, de que cachaços “super-condicionados”, nutridos com excesso de carbohidratos sobre tempo mais longo, mostram libido reduzida, assim que a manutenção de cachaços em condições corporais corretas é importante, não somente em relação a problemas de libido, mas também para otimizar produção espermática e “output”. Quando a outro lado níveis baixos de nutrição são aplicados para manter um estado físico bom, então durante períodos frios de inverno podem acontecer uma redução da produção espermática e / ou qualidade seminal em consequência duma retenção reduzida de proteína e gordura, quando temperaturas ambientais descem abaixo de 20°C. Problemas psicológicos também podem ser importantes. O efeito de isolamento durante o desenvolvimento puberal parece ser relatado à falta de experiência em participar no comportamento de monta durante adolescência. Experiência negativa durante o período de treinamento de cachaços jovens ou tamanho inadequado do manequim etc. podem impedir comportamento de monta normal também. Tratamento hormonal de cachaços com problemas de libido (aplicação de testosterona) pode intuitivamente ser uma tentativa lógica, podendo produzir melhora de curto tempo em desejo sexual e atividade de monta, mas resultando também numa supressão de espermatogênese quando usado em tempo prolongado. A aplicação de medicamentos (prostaglandinas etc.) para melhorar a libido não é recomendável em muitos casos em que uma causa genética deve ser considerada, para evitar a transmissão destes defeitos na cria. Finalmente estresse climático, mencionado já anteriormente, não é responsável somente para a chamada “sub-fertilidade de fêmeas no verão”, mantidas em temperaturas temperadas ou subtropicais (mais ou menos pronunciados pela alteração da duração da luz do dia sobre o ano), mas também afeta cachaços com a descrita redução de libido e qualidade seminal. Mantendo os cachaços em condições confortáveis, facilitando refrigeração extra e circulação de ar, e um problema ainda não resolvido mundialmente, pois refrigeração normalmente está associada com fluxo de ar alto e/ou incremento significativo de umidade relativa, quando ventiladores fortes são usados para manter sistemas laminares úmidas. Manter cachaços em condições refrigeradas durante o verão é recomendável facilmente, mas difícil de realizar. O exame espermatológico inclui a avaliação do ejaculado em relação a volume, concentração, numero total de SPZ, cor, consistência, cheiro do sêmen, motilidade e morfologia dos SPZ, tempo de sobrevivência do sêmen diluído, conteúdo bacteriano (exame microbiológico). A suma dos achados andrológicos baseado nas informações de anamnese, exame geral clínico, exame específico do trato genital e do comportamento sexual (exame morfológico via adspeccao e palpação), da avaliação do comportamento sexual e do exame espermatológico facilita: - Melhorar significativamente a seleção dos cachaços jovens - Identificar futuros candidatos de risco - Decidir sobre o futuro de cachaços com achados espermatológicos alterados HYGIENE MEASURES IN BOAR SEMEN PRODUCTION 1* 1 2 1 Prof.Dr.Dagmar Waberski , A. Weyand , J. Seedorf , K.F. Prof.Dr.Dr.h.c.Karl Fritz Weitze 1 Unit for Reproductive Medicine / Clinic for Pigs and Small Ruminants, University of Veterinary 2 Medicine Hannover, Germany, Faculty Agricultural Science, University of Applied Sciences Osnabrück, Germany Summary Extended boar semen is highly susceptible to bacterial growth. Bacterial contamination may occur at all steps during semen collection and processing. In the present paper the sources and consequences of bacterial contamination in boar semen are reviewed. Special emphasize is laid on the description of hygiene measures and sanitary guidelines for boar AI centres. Introduction In the last decade, semen production efficiency in boar AI stations has increased enormously with up to 2,000 semen doses produced per hour. At the same time, demands on semen quality have become increasingly important. Semen doses aim to be a quality product exhibiting high biosecurity, high genetic value and high fertility. In addition, a shelf life enabling a few days storage on farm or long distance shipping is wanted. Bacterial contamination during semen collection and processing is a main concern in production of semen portions. The purpose of the present paper is to review critical steps in hygiene on the route from semen collection to processing. Recommendations for hygiene measures and sanitary guidelines in boar AI stations will be given. Sources of bacterial contamination Bacterial contamination may occur during complete semen processing starting from semen collection until sealing of semen tubes or bags. Freshly collected boar semen commonly contains bacteria, mostly being gram-negative such as Enterobacteriaceae. Sources of bacterial contamination during semen collection are listed in Table 1. Bacteria are either from the animal‟s origin, from the environment or from human. In addition to the cleanness of the boar, the semen collection area and the personnel, the collection technique will strongly influence the initial number of bacteria in an ejaculate. Although not completely avoidable, the degree of bacterial contamination during semen collection should be as low possible. Further bacterial contamination may arise during semen examination and semen processing as listed in Table 2. Bacteria can enter the semen by direct contact with any material or fluid or simply by air. Field data demonstrate that the bacterial content in semen differs between AI centers. Raw semen and extended semen of 3 boars from 17 German semen collection centres were examined for quantitative bacterial content, type of bacteria and resistance to common antibiotics. Bacterial content varied between less than 1000 up to 100 million CFU/ml in raw ejaculates and between 0 and 1 million CFU/ml in extended semen, depending on the boar studs. Semen doses from three semen collection centres were free of bacterial content. (Fig. 1). * Corresponding author: Unit for Reproductive Medicine, University of Veterinary Medicine Hannover, Buenteweg 15, D-30559 Hannover, Germany; [email protected] Consequences of bacterial contamination Bacterial genera from studies that examined contaminants in freshly collected, undiluted boar ejaculates (reviewed in 1) show that the majority of bacteria are not considered primary pathogens in pigs. Thus, in most cases they do not affect the clinical health status of the boar or fertility of the sows. Bacterial contamination in extended semen portions can influence fertility by several mechanisms: 1. Competition for nutrients between sperm and bacteria 2. Sperm damage of sperm by bacterial waste products 3. Sperm damage by direct cell-to-cell interaction between bacteria and sperm 4. Development of resistance against antimicrobials and transfer of resistance information to other bacteria genera 5. Genital infection with loss of fertility and /or general disease in sows. Detrimental effects of bacteria on sperm induce sperm-to-sperm agglutination, acrosome damage, loss of sperm motility and reduced shelf-life. Field investigations on 23 North American farms, in which the primary complaint was sperm agglutination in association with decreased sperm longevity and herd fertility, found single or multiple genera bacterial contamination as the causative agent in 66 % and 34 % of the cases, respectively (2). Consequences of bacterial contamination depend on the degree of contamination, the type of bacteria and their resistance to antibiotics. Contamination of semen with multi-resistant bacteria occurs mainly in the laboratory during semen processing. Experimental inoculation of semen with bacteria commonly showing multiresistency against antimicrobials, i.e. Alcaligenes xylosoxidans, Burkholderia cepacia, Enterobacter cloacae, E. coli, Serratia marcescens or Stenotrophomonas maltophilia leads to sperm agglutination and loss of motility during storage (2). This is in accordance with our own observations from field cases in which sperm in extended semen was reported to be “dead” after 48 h of storage and high numbers of such bacteria were found. The extent of microbiological growth and the consequences for sperm in extended semen are not predictable since they are influenced by the type of bacteria, the susceptibility to the antibiotic used, storage length, storage temperature, pH in the semen portions, and the presence of other bacterial genera. Semen extenders provide a perfect environment for bacterial multiplication, especially at common storage temperatures above 15°C. Many of the bacteria are very adaptive to changing situations and may survive in the laboratory even under sparse conditions. Hygiene measures to avoid bacterial contamination Hygiene measures must be based on: 1. Knowledge of sources of bacterial contamination 2. Adequate design of semen collection area and the laboratory 3. Establishment of sanitation guidelines 4. Training of personnel in individual and general hygiene 5. Regulator monitoring for bacterial contamination, definition of critical control points 6. Use of antimicrobials in extended semen to control bacterial growth Sanitation measures in the semen collection area are listed in Table 3. The semen collection area should be separated from the boar boxes, with exclusion of air from the boar housing site. Boars should be clean, dry and free of straw and other particles when used for semen collection. Hygiene during semen collection includes the use of clean, surface intact phantoms, clean single–use gloves, sterile semen collection vessels/bags covered by sterile gauze and an appropriate semen collection technique avoiding the contamination of the ejaculate with the bacterial-rich fluid of the preputial cavity and/or the pre-secretion. From the hygienic point of view, the use of automatic semen collection systems is advantageous, since the semen is not exposed to air during collection (3). Before and during transport to the laboratory, semen vessels have to be kept closed in order to prevent contamination by aerial microorganisms. Once arrived in the laboratory, further major potential sources of contamination are any materials coming into the contact with the semen or extender. High standard sanitary protocols are necessary to keep the number of microorganisms in the laboratory as low as possible. Details of hygienic measures in the laboratory are outlined in Table 4. Laboratories should be strictly separated from the collection area including air transmission. Laboratory work flow from semen examination until filling should be in-line (straight), thereby avoiding cross-traffic between personnel. Laboratory desks, floors and walls should be as empty as possible. Only single-use disposable wipes should be allowed to prevent cross-contamination. Any material or equipment is a potential source of contamination and impairs cleaning, especially where corners and niches are formed. The contact between semen and any other material should be minimized. Extenders may be a source of contamination when stored overnight at room temperature. Semen colours used in some AI stations to mark different breeds of boars have been identified as a major source of bacterial contamination in diluted semen. Antibiotics are helpful to control bacterial growth in extended semen, however, they can not compensate for hygienic deficiencies in semen collection or processing. Special care needs to be taken for triggering the development of resistant bacteria by creating reservoirs of extended semen in laboratory sinks or drains. Therefore, a semen waste procedure should be established without using laboratory sinks and drains. Modern filling machines allow a hygienic filling of semen with no major risk of contamination. However, daily care of the machine and especially of the tubes according to sanitary guidelines and manufacturer‟s recommendations is demanded. Repeated use, cleanings, sterilization and simply aging affect surface attributes of filling tubes which may attract bacteria and ultimately evolve in biofilms as a source of contamination. Formation of a biofilm begins with the attachment of free-floating microorganisms to a surface. These first colonists adhere to the surface initially through weak, reversible van der Waals forces. If the colonists are not immediately separated from the surface, they can anchor themselves more permanently using cell adhesion structures. Once colonization has begun, the biofilm grows through a combination of cell division and recruitment. The development of a biofilm may allow for the aggregate cell colony(ies) to be increasedly antibiotic resistant. Water and extender tubes are particulary susceptible to the formation of biofilms. Once created, biofilms are tenacious and hard to remove. The purpose of cleaning is to remove semen and extender residues and dirt. The purpose of disinfection is to reduce the numbers of living microorganisms. To be effective, disinfection must be preceded by thorough cleaning. Cleaning has to be both as effective and as gentle as possible in order to protect personnel, sperm and the material itself. The manufacturer‟s instructions must be followed, especially regarding the dilution of the product; too weak and the product will not work effectively; too strong and residues of the cleaning product may impair human health or sperm quality. Instructions regarding contact time must always be followed. A high hygienic consciousness of the station`s personnel has to be created and established permanently. Schedules should give clear instructions to staff on what is required to ensure effective cleaning/disinfection, and the following points should be considered: 1. What is to be cleaned and disinfected (structure, equipment, utensils coming into contact with water, extender or semen) 2. What chemicals and equipment will be used 3. The method of cleaning/disinfection 4. What protective clothing will be worn and precautions to be taken 5. When it is to be cleaned/disinfected (after use, daily, weekly, monthly) 6. Who will carry out cleaning/disinfection 7. Monitoring arrangements. Conclusion Extended boar semen is highly susceptible to bacterial growth, especially when the semen is stored for several days. Basic guidelines for hygienic boar semen production are: collection of raw ejaculates with the lowest germ content, semen processing without additional bacterial contamination, and prevention of uncontrolled bacterial growth during storage. To ensure these, efficient sanitary guidelines with regard to the collection area, the laboratory and personnel need to be established. A profound hygienic consciousness of AI staff has to be created and trained regulary. The development of future strategies including lower storage temperature and alternative sperm compatible antimicrobials with low risk of producing resistant bacteria genera should be encouraged. Acknowledgement: Studies underlying this review were supported by the Development Association for Biotechnology Research (FBF, Bonn e.V.). References: 1. Althouse GC, Lu KG (2005): Bacteriospermia in extended porcine semen. Theriogenology 63, 573584. 2. Althouse GC, Kuster CE, Clark SG, Weisiger RM (2000): Field investigations of bacterial contaminants and their effects on extended porcine semen. Theriogenology 53, 1167-1176. 3. Lellbach C, Leiding C, Rath D, Stähr B (2007): Effects of automated collection methods on semen th quality and economic efficiency of boar semen production. Proc. 6 Int Conf on Boar Semen Preservation, Aug 12-15, 2007, Alliston, Ontario, Canada, PS1, 10. Table 1: Sources of bacterial contamination during semen collection Boar Penis Preputium Preputial cavity fluids Pre-sperm fraction Skin Hair Respiratory secretions Faeces Environment Dummy Floor Air Semen collection vessel Any other material Human Clothes Shoes Gloves Skin Hair Respiratory secretions Table 2: Sources of bacterial contamination during semen processing Material Water Extender Tubes Vat including lid (bacteria in condensation!) Semen dyes Laboratory material Non-laboratory material material not in use Environment (Laboratory) Air Insects Floor Sinks/Drains (semen reservoirs!) Furnishings Walls or Human Clothes Shoes Skin Hair Respiratory secretions Table 3: Hygiene measures during semen collection 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Semen collection area separated from animals Establish sanitary guidelines for semen collection area and personnel Clean semen collection area (dummy, floor, etc.) Clean clothes and boots for personnel Clean single-use gloves Single-use or sterilized semen vessels/bags and sterile gauze/filters Boars: clean, dry, trimmed preputial hair Hygienic semen collection technique: - if necessary: clean dry preputial opening with single-use wipe - manual removal of fluid from the preputial cavity after mounting - keep the tip of penis free during fixation of the penis thus avoiding the contact of semen with the gloved hand - hold the penis at a downward angle to the boar to avoid preputial fluid flow into the semen vessel - discard sperm-free pre-secretion (rich in bacteria!) - remove gauze/filter with gel fraction carefully (don`t wring!) immediately after collection - close the semen collection vessel/bag - fast transfer into the laboratory Table 4: Hygiene measures during semen processing 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Laboratory separated from semen collection area (including air!) and other units of the AI station (storage, packing, cleaning, office, etc.) In-line work flow without crossing of people Keep only necessary equipment and material in the laboratory Establish sanitary guidelines for cleaning and disinfection considering laboratory and equipment, water, personal hygiene Establish a semen waste procedure without use of sinks and drains in the laboratory Preferentially single-use disposable products; if not ensure cleaning and sterilization/desinfection Only use single-use disposable wipes and towels Avoid storage of extenders over night or longer No use of semen dyes raw 1,E+08 extended 1,E+07 Bacterial numbers per ml 1,E+06 1,E+05 1,E+04 1,E+03 1,E+02 1,E+01 1,E+00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Boar stud Fig. 1: Bacterial numbers in raw and extended semen of in 17 different boar studs (means of 3 boars) HOW TO IMPROVE BOAR SEMEN PRODUCTION EFFICIENCY: A VIEW OF THE US SEMEN PRODUCTION SYSTEM. Phil Burke Technical Services Manager – Porcine Minitube of America, PO Box 930187, Verona, WI, USA [email protected] What is the definition of efficiency? Simplified Definition :The ratio of the output to the input of any system What should we measure and how? What get‟s measured gets managed, so a stud needs to focus on the correct measurements to achieve these business objectives. Stud efficiency is the maximum number of processable and saleable doses produced at „least‟ cost. Background In the USA, over 95% of producers are using Artificial Insemination on their farms. This has grown from around 9% in 1993 and by 2005 this had reached 90% AI usage. Since then, slower growth has continued and today‟s prediction is 95-97% AI usage. Non-users tend to be smaller farms or groups that will not use AI on any animals based on their religious beliefs. In Canada, AI usage is more regionalized, with 90%+ usage in some provinces. In Mexico, 85% AI is being used, but this is changing rapidly with 3 or 4 large (300-400 head) studs planned to be built in 2010. Delivery logistics in Canada and Mexico can be challenging. Reproductive performance in US sow herds is at an all-time high with many farms consistently achieving over a 90% Farrowing Rate and over a 12.5 Total Born. Slower growth and less staff turnover has contributed to this success. Many studs today are only 75% utilized due to oversupply of studs and semen and better on-farm dose management. Currently there are over 141 AI studs in the US, totaling over 29,840 boar spaces. Very few new studs have been built in the last 2-3 years. The newer studs are typically 300 - 600 boar spaces. The largest single stud in the US is 800 boars in Missouri. Average stud size is 210 boar spaces. Larger, newer studs are more efficient, cost effective and can more easily justify the investment in the latest technology, as it can be leveraged over more boars and more importantly, more doses. With the challenging North American pig business in the last 2 years, many smaller (150 head or less) have closed in the US and this trend will continue. In 5 years time, there will be 30-40 fewer studs in the US as the levels of efficiency continue to improve and new technology allows the larger studs to leverage superior boars across a larger sow base. Labor costs are $700-720 per boar space or between $0.59 – 0.71 per dose on the most efficient studs. Semen production per boar space averages between 98-102 doses per working boar per month at 3 billion „viable‟ cells or 294-306 billion „viable‟ cells per boar per month. Sperm cell production per day is typically 10-12 billion cells on average, with some exceptional boar lines achieving 15 billion cells per day. Boars are typically collected 1.1 -1.2 times per week or every 4-5 days based on Monday to Friday collection days. On most commercial studs, Monday and Thursday would be the busiest collection days with around 85% of all the semen collected for the week being collected on these 2 days. The largest studs may collect up to 10,000 doses on a Monday morning. Many studs start at 2 or 3 am on a Monday. Around 6% of all collections are trashed/ discarded after assessment under the microscope. This figure can triple with some boar lines during the summer months. The greatest efficiency driver is semen sales. The best studs with the best genetics can sell in excess of 95% of all the potential doses available on each collection day and this can dramatically boost efficiency and reduce the cost per dose. On occasions, some studs have over-committed to fulfill orders and this can be damaging to the studs long term availability. Ultimately, the consumer dictates the efficiency of the stud, as he/ she buys the product, which influences the retailer, which communicates with the meat packer and this determines the boar type that offers the best meat quality, Feed Conversion (FC) and Average Daily Gain (ADG) growth characteristics. AI boars are not selected or indexed on semen output or morphology characteristics. To achieve the best efficiency, while maintaining the highest quality control standards, requires tremendous commitment and investment in talented people and new technologies. Stud Location This will always be a compromise between health and biosecurity and the access and proximity to the sow base. Keeping the stud open and healthy is the most important component of stud efficiency. Closed studs create zero efficiency. The selection of a suitable „biosecure‟ location is essential when planning a stud. In setting up an AI Stud, consideration should be given to its site in relation to the risk of disease introduction. Precautions taken against the entry of infection into health-monitored herds from outside must prevent all direct contact with other pigs and minimize indirect contact. Location The AI Stud will be: i. As far away from other pigs as possible (prefer 3km). ii. As far from public highways as possible. iii. Away from other livestock, especially swine markets and swine slaughter plants (minimum 8 km). iv. Away from workers' houses. v. Where farm roads do not go through the AI Stud. vi. Located in acceptable topography. The Compound Perimeter a. A clear demarcation of the "boar compound" should be made. The compound includes the buildings that house the AI Boars, the perimeter fence, and everything therein. b. Two types of fences should be utilized: i. Perimeter fence (away from the buildings). ii. A compound fence segregating feed bins, load-outs, etc. iii. Chain link or electrified high tensile wire is acceptable. The height and strength of fencing depends on the type of farm and other relevant circumstances. "Keep Out" signs should be placed at the active areas of the perimeter fence iv. Climate Studs in the US and in particularly the northern Midwest, have to be designed to cope with extreme weather. In the summer it can exceed 40 deg C and in the winter it can exceed minus 40 deg C. Providing an ideal climate with adequate air flow, heating, cooling and humidity control can be challenging. In the summer, the aim is to keep the temperature below 30 deg C and below 85% Relative Humidity (RH %). In arid climates, evaporative cooling works well. In areas with high humidity, evaporative cooling only intensifies the issues associated with high humidity. Several studs have attempted to use air conditioning (often large household units) over the years with little or no success. Very few of the installs used industrial AC units that would be capable of controlling, managing and surviving the challenging air quality and atmosphere in and around a boar barn. Around 30-40% of the US studs, in particular the larger 300+ commercial studs, now use air filtration in the boar barns as a disease control measure. Most use the 95% DOP filtration and relatively few use the true HEPA 98% filtration (HEPA costs 10 times more to install than the DOP with only 3% additional protection). Sows and gilts have a higher return rate in the summer and a boars semen output is lower and the ejaculate discard rate is higher. All these factors add pressure to the remaining, active and working boar population. Having a reserve of 10% more boars in the summer or connecting the isolation via a walkway or pneumatic delivery system can be of great value during the summer months, by offering some added dose availability. Stud Purpose Boar studs fall into 4 main categories – genetic nucleus, commercial, internal/integrator or a combination of all of these types. The purpose and function of the stud will determine the size, logistics and ergonomics necessary to manage the day-to-day activities performed by the facility. Present building costs in the US would be $2300-2500 per boar space, excluding genetic cost and site preparation. Site preparation can cost $900-1200 per boar space on some projects. Internal studs, utilized by the larger corporate producers, would have adequate boars to supply semen on a 1:175 to 1:200 ratio (boar: sow), with average usage around 6 – 6.25 doses per sow per year. With the down-cycle in the pig market, many producers are using and ordering around 7% less semen than rd previous years. This can be explained by lower sow inventories, fewer 3 inseminations and less wastage. Stud Size Approximately 29,840 boars are housed in 141 studs. Size breakdown:Size (head) 0-99 100-199 200-299 300-399 400-499 500++ Totals # of Studs 35 37 32 11 18 8 141 Actual Boars 1860 4820 7340 3560 7440 4820 29840 % of Total 6 16 24 13 25 16 100 Barn Design Barn design has developed well over the last 15 years. In the early days of stud construction, most studs were built as small sow farms with gilt pens and a dummy. Today, the studs are designed by managers and stockmen to optimize doses per collector per hour, ease of movement and boar and staff safety. Walkways should be a width of 0.75m maximum to the front and rear of the crate. All crates should have a front and rear gate with a „boar‟ proof spring-loaded latches. All flooring under the boars should be fully slatted. This allows the boars and the collections to stay cleaner and have less bacteria/ contamination issues. In the US, welfare codes allow both crates and pens to house boars. This can range from 100% pens to 10% pens and 90% crates depending upon the stud. Typical combinations ratios of crates Vs pens would be 80:20, 90:10 or 95:5. Pens would typically measure 1.5m X 2.15m, with a totally slatted floor. Crates of different sizes would typically be used to accommodate different ages and genotypes. These would measure 0.6m X 2.1m to 0.7m X 2.4m with fully slatted floor with the slat openings perpendicular to the crates. The crates would also be 12-15cm higher than a conventional gestation crate to accommodate larger framed boars and be constructed with a heavier gauge steel. Crate divisions should be constructed of vertical steel bars to stop boars climbing. Individual drinkers should be secured to each boar space, to ensure adequate water intake. A water flow meter can be incorporated into each row of crates to monitor water usage and detect and correct water supply issues. Adequate lighting, particularly above the collection area is needed. Fluorescent lighting is preferable. Method of feeding Volumetric drop feeders are ideal for feeding boars effectively and without stress. Feeders should be adjusted every 14-days to control and manage the boars Body Condition Score (BCS). Studs in the US with over 200 boar spaces would utilize automatic drop feeders to feed their boars once a day, typically in the morning before collection commences. Some studs feed the boars after collection around 12-noon. A few studs would feed twice per day using automatic drop feeders. Studs with 100 boars or less would feed by hand. Normal feed intake would be 2.5-3kg per day, based on weight, body condition, age and genotype. General guidelines are shown below: Body weight Kg Kg/day <160 2.3 160 2.5 205 2.7 250 3.0 295 3.3 340 3.6 Collection Crates Vs Collection Pens A conventional stud could achieve 3 collections per collector per hour (approx.75 doses/person). The latest studs with collection crates, collection pits and semi-automated collection, such as the AutoMate™ from Minitube have the ability to achieve 8 (approx. 200 doses/person/hour) or more collections per collector per hour. Some studs can even achieve as high as 11 collections per collector per hour with a barn person delivering and returning boars to and from the collection area. Boars are more focused in a collection crate, as there are fewer distractions. New boars should be trained in a collection crate and then they will adapt to these surroundings. A crate should be around 0.66m internally and a minimum of 2.75m long. Entry and exit gating will be determined by the barn design. Collecting from outside the collection crate, preferably in a collection pit, is also safer for the collector. An open collection pen provides many distractions, corners to investigate and creates safety issues. This wastes time and reduces efficiency. A collection pit (0.95m deep) with a series of collection crates (normally 4 to 6) is the best alternative in a newly built stud. This is safer for the collector. The collector can also stand upright for the whole duration of the collection. The addition of a semi-automated collection dummy such as the AutoMate™ from Minitube can also increase the number of collections per hour, improve safety and minimize hand muscle fatigue. On a large stud, collectors could collect up to 50 boars per day. Some older studs are now adding new „collection rooms‟ to accommodate this concept. An example of a collection pit layout in a separate collection room is shown below. Collection technique Boars prefer to be collected by certain technicians. This is a trained response and it is essential that all boars can be collected by all technicians to optimize barn efficiency and flexibility. Analyzed collection data from hand-collection shows that certain collectors extract more semen per collection than others and this can dramatically affect the number of boars to be collected per day and also the number of hours worked on large studs on busy collection days. When correctly using a semi-automated collection system, such as the AutoMate™, you can optimize the volume and number of doses collected each and every time. Almost all boars are trainable to the AutoMate™ and this can provide rapid collection, high dose outputs and minimal bacterial contamination. Pass-through window Vs Pneumatic delivery Transferring the collection from the collection area to the lab should occur as soon as possible after the collection has been completed. Walking the collection to a pass-through window takes time and effort and slows down the collection efficiency. Installing a pneumatic delivery system into the collection area with a direct connection to the lab ensures that the collection is delivered rapidly and with minimal cooling. Blood samples and written communication can also be sent via this method. The lab stays cleaner using pneumatics rather than a pass-through window. Staffing Good staff are hard to find in all countries. Now that the US AI market is mature and fully developed, it is essential that good staff are retained, motivated and compensated. Many studs today have experienced staff on higher salaries and more vacation days. This improves the stud management and efficiency when the whole team is at work but can also impact efficiency during vacation times. However, at the end of the day, quality and experience outweigh the additional costs and higher vacation allowance. rd It is standard to work a 40-hour week in a US stud and feed and check samples every 3 weekend. US studs start early (2 or 3 am) to ensure that semen is delivered the same day as collection to the customer. Many studs are closed by Midday. No collections occur at weekends. In the 1990‟s, a ratio of 1:45 (person to boar) was normal. As studs have become more efficient and have invested in labor saving technologies, they can now operate at a 1:55 (person: boar ratio) to 1:60 ratio quite easily. Isolation intake Most studs receive 4 or 5 groups of new boars per year. This will total around 65-70% annual replacement rate. Most boars are pre-trained in Isolation in an area that replicates the collection area design in the main stud. Boars remain in isolation for 45-60 days prior to entering the main stud. Some studs use the Isolation area in summer to supply additional semen for sale. These animals would have passed all blood testing protocols. Lab Design Newer studs have high efficiency and ergonomic labs designs that minimize movement between work stations and allow the collection from arrival in the lab to follow a one-way flow through the lab to the semen cool room. Most studs now use walk-in semen cool rooms @ 15-17 deg C. rather than using multiple semen storage units. Method of measuring concentration This area has evolved dramatically over the last 10 years. No studs in the US use a hemocytometer or Bürker Chamber to measure concentration currently. Most studs use photometers to measure concentration. Many studs have now invested in Computer Aided Semen Analysis (CASA) for evaluating motility, concentration and visual morphology at line speed. Minitube‟s SpermVision™ is the best selling CASA system in the world. In 2008, Minitube launched an Auto-Morphology option to the SpermVision™ to allow for sperm morphology (proximal droplets, distal droplets and tail abnormalities) to be assessed by the computer at line-speed. The „gold‟ standard for assessing semen quality is a counting chamber, but this technique is slow and tedious and cannot be performed at line speed in large studs (200+ boars). The next best option is a photometer and these are available from many suppliers and some are more accurate than others with porcine semen. Photometer‟s are easy to use and can provide consistent results when used correctly. However, these machines calculate concentration based on the color and density of the semen in the cuvette or chamber. Other material in this cuvette or chamber can affect the accuracy of the calculation, such as gel. The photometer cannot differentiate between semen and gel. The better alternative is to invest in a CASA system that physically counts, measures and calculates concentration and motility on multiple fields using a high powered computer using a digital camera. The more fields that are measured, the more accurate the results. These machines will perform at line speed (1 machine up to 400 boars) and provide highly accurate results. An example is the SpermVision™ from Minitube. A visual morphological assessment by a lab technician still has to be performed. The best machine on the market is Minitube‟s SpermVision™ with the Auto- Morphology package that can identify and quantify the incidence of proximal droplet, distal droplet and tail abnormalities in a sample at line speed. This is the only machine of it kind, that can perform all these tasks at line-speed. Concentration per dose Most US studs target 2.25 -2.75 billion „viable‟ cells per dose and can produce most doses at this concentration with an accuracy of +/- 10%. Concentration is falling and will continue to decrease. To measure lower concentrations with a high accuracy requires investment in more sophisticated equipment, such as the SpermVision™. Studs and genetic suppliers are trying to control or lower costs by leveraging superior boars across a larger sow base by reducing the concentration per dose for terminal semen. It is likely that the concentration per dose will be below 1.5 billion „viable‟ cells by 2015 as we continue to learn and understand more about fertility. The introduction of new technologies, such as semen sexing, will also drive the concentration downwards to enable the optimal utilization of superior sires. Doses are sold as units and if you can sell more doses per collection, then your efficiency will increase incrementally. Volume per dose Volume per dose is also decreasing. Standard volume per dose in the US is 65- 75ml, with the majority still at 75ml. Using automated packaging machines will ensure (+/- 1ml) that the correct volume is added to each dose each, every time. Manual filling is less accurate with a +/- 5ml per dose and often more. This can waste valuable distilled water and extender and these incremental costs can soon add up to considerable financial loss. Extender/ Diluent Extenders are available from many suppliers. This is one of the most important investment that you can make when producing a quality dose of semen. Not all extenders are equal and not all suppliers are equal. Purchase from an established (20 years or more) AI supply company that can provide excellent quality control in manufacturing, tests each and every batch on boar semen and can offer technical service and support to your operation. With extenders, you get what you pay for and this is not an area to save cost. Select the product that best fits your needs and „invest‟ in a quality product. Studs only have a reputation once, once your reputation and credibility is gone, your business is gone. Tubes Vs Cochette Vs Pochette Currently 3 packaging options are available in the US. All are capable of producing excellent reproductive performance on the sow farm. Make sure that you buy from a reputable source that has tested the product on porcine semen and that the material is not spermicidal. Some Asian products are inexpensive, but have no quality control or testing. The least expensive of the 3 options is the tube and this has the largest market share in the US. Semen QC – Efficiency Vs Quality Semen samples need to be assessed at line-speed. With the advent of technology such as the Automate™, this has created faster collections and delivery of semen from the barn to the lab which has added pressure and urgency to get the semen samples evaluated and processed. Semen assessment takes time and attention to detail. Busy US studs can analyze 400 collections on a normal Monday and so it takes trained personnel to perform this task accurately. Starting at 2 am also adds a fatigue factor and that is why many studs have invested in technology, such as the Spermvision™ to minimize the „human‟ factor. Semen must be assessed for concentration, motility, color, odor and morphology on each and every sample consistently, repeatedly and with a high level of accuracy. By implementing CASA technology to the production line has allowed studs to assess and analyze semen samples at high speed and with high levels of quality control. Morphology assessment Real-time morphology should be performed on all ejaculates entering the lab. However, performing semen assessment on a live sample is highly subjective and often inaccurate. A large stud in the US needs to assess 300-400 ejaculates before Midday on busy days. This leads to obvious difficulties. Using stained morphology in the past was the only alternative to accurately assess morphology. This process is slow and tedious and cannot be performed at line-speed on a larger AI studs. In the1990‟s a modified morphology technique was used to assess motility, cytoplasmic droplets and tail abnormalities. Each category is scored visually and a composite score is compiled. This technique is also very subjective and variable. Today, Computer Aided Semen Analysis (CASA) will allow for real-time, line-speed measurement of concentration, motility and morphology to be performed objectively. This data can be compiled and analyzed to enable genetic companies and large integrators identify semen fertility characteristics to use in genetic selection and modeling. The large studs will invest and incorporate these new technologies quickly, efficiently and effectively. Level of Automation What is the cost of local labor? What is the cost of good labor? What is the cost of Automation? Studs are getting more and more automated every year and every time technology is developed to eliminate one area of inefficiency, it then exposes the next weakest link in the chain. There will always be a weak link. Studs can be automated in almost every area to minimize variance, optimize accuracy and reduce wastage. Additional automation options are: RFID o Each Boar has an electronic ID chip o Each technician has an electronic ID chip o Antennas‟s in the collection area track and communicate with the stud software to manage and coordinate collections as they move from collection- processing packaging to ensure that the integrity of the data and ID is maintained. Auto – Dilutor o Preparing a semen sample for concentration analysis is controlled by an electronic machine that accurately prepares, mixes and dispenses a precise sample to load into the semen chamber. This ensures that the dilution is optimized each and every time. Automatic Microscope Stage o The CASA software controls the movement of the automated stage to ensure that the semen assessment is based on all areas of the chamber to ensure an accurate concentration, motility and morphology is assessed. Manual movement by a lab technician is inconsistent and can create bias. Automatic Semen Dispenser o Once the ejaculate is analyzed and the number of doses determined, it is then essential to mix the raw semen with a precise amount of extender. Controlling this manually is time consuming and inconsistent. The lab software can communicate directly with the Automatic Semen Dispenser and precise amount of extender can be dispensed from the extender vat to mix with the semen. Maternal Vs Terminal A stud‟s efficiency can be dramatically affected by collecting and processing maternal semen doses. Maternal boars are harder to train, produce fewer doses, and have a higher percentage of abnormalities than terminal semen doses. Also, maternal boars are normally processed as Single-Sire (SS) doses and therefore are handled and processed separately to the terminal semen doses. Terminal boar semen ejaculates are „pooled‟ together. Up to 6 boars would be in a „boar pool‟. Only boars of the same terminal line are „pooled‟ together. This increases dose throughput and reduces the need to change tubing on every boar and is therefore more cost effective. Terminal semen would be processed using an automated packaging machine. A boar collection list would be created each day and all boars of the same line would be collected back-to-back. Often maternal semen is processed using a manual filling and sealing station and typically accounts for less than 10% of the weekly production. On some larger studs that supply larger quantities of SS semen, an automated packaging machine will be dedicated to this production process. Maternal semen is higher priced than terminal semen and a higher processing and handling cost is also charged to the customer or genetic company. Discard or Trash Rates All studs should trash or discard collections that do not meet the stud‟s quality specifications. All studs have different quality control parameters to determine a passing or a failing ejaculate. Studs that have zero trashed collections have inadequate semen quality criteria. As a guideline, around 30% of all boars will be infertile or sub-fertile at any given time and this is changing constantly throughout the year. During the cooler months (winter, spring, fall) a trash rate of around 6% is considered acceptable and normal. During the summer months, some boar lines are affected by the increase in temperature and RH%. Boars that have small testicles and a less pendulous scrotum are most affected by extreme heat and humidity. Below is some actual data from a large US stud:- Genetic line Nov –June in the USA July-Oct in the USA A 6% 14% B 3.5% 8.9% C 9% 23% D 7% 16% Order Accuracy VS Extender wastage Precise orders and collecting to order is the ideal approach. Collecting extra doses or having late cancellations can impact cost efficiency. At the same time, having a few additional doses can also avoid having to go out and collect more boars and prepare fresh extender. Using an accurate scale below the extender vat, using a programmable pump to dispense extender accurately and a packaging machine with optical sensors will ensure that you minimize wastage and allows for precise planning of dose output. Using glassware or plastic-ware with a graduated scale on the side is highly inaccurate and inefficient. No-one in the US uses glassware, it‟s expensive and needs replacing often. Disposable Vs Re-Usable Most studs today use predominately single-use disposable items to optimize efficiency. Tubes and hoses can be re-used multiple times, if these are washed and sterilized correctly. Tubes and hoses can be re-used for 30 days ,if they only come in contact with extender and washed/ sterilized correctly. Tubes and hoses can be used for 14-days if these are used with semen. Thorough washing and sterilization is needed. All tubes need to be inspected for splitting and cracking as these areas can harbor bacteria. Plastic pitchers with bag liners are the most cost-effective approach. All microscope slides, cover slips, chambers and cuvette‟s are single use only. Working Boars Vs Non- Working Non-producing boars cost money. Boars that have failed ejaculates for more than 30-days rarely return to full semen production. Strict culling policies need to be created and enforced. If a boar is a non-producer for 30-days, replace him with a boar that can create income. Problem boars plaque the studs efficiency and add considerable overhead in terms of feed and medication costs. Very few studs transport cull boars to slaughter, as these animals have little financial value, high transportation costs and difficult to segregate during trucking. Most boars today in the US are euthanized on-site and are then buried or composted. Data Management A modern stud uses sophisticated software to manage semen processing and to enable the stud manager to access and analyze data to make business and management decisions. This can assist in order management and day-to-day planning. Many software packages can also invoice and manage accounts receivables. Shipping and Packaging The final step in the process is as important as all the other steps. In the US, semen is delivered locally by owned couriers and state to state by UPS. Ensuring the semen is fully cooled prior to shipping is essential. Most stud‟s ship semen in a doubleboxed Styrofoam cooler and all air voids are filled with 17 deg Celsius gel packs or polystyrene chips. Sending the ordered product to the right place at the right time is paramount to all business. This is a fragile and time-sensitive package and it is essential that the product is delivered on-time, every-time. Semen is invoiced post-delivery and so the farm can see and assess the product before he/ she decides to make payment. Third party audits rd Customers expect product excellence at all times. Most studs now routinely submit samples to a 3 party to validate and certify that the semen doses meet or exceed the stud‟s dose profile. Some customers also submit purchased doses to check the semen quality. Benchmark Many discussion groups are now in place in North America. These groups meet to discuss trends, issues and new technologies. Several of these groups also benchmark stud costs and discuss areas to improve efficiency without compromising dose quality. Conclusions Efficiency is a never ending journey. Daily monitoring is needed to manage a modern stud effectively and efficiently. Boars are living creatures and need to be managed as unique individuals, in an effort to create and collect as many doses as possible with the least amount of abnormalities and wastage. Studs will never be 100% efficient and this has to be acknowledged and accepted. Considerable improvements can be implemented in the barn and lab to optimize production, minimize wastage and to create value from each and every dose that is processed. Studs have come a long way in the last 20 years and the next 20 years are going to be as equally challenging and exciting as new technologies become available that will further revolutionize our unique business. O PAPEL DO DILUENTE DE SÊMEN NA EFICIÊNCIA DE PROGRAMAS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL DE SUÍNOS Prof.Dr.Dr.h.c.Karl Fritz Weitze Fundação Escola de Medicina Veterinária de Hannover, Alemanha Estender a viabilidade do sêmen líquido suíno para além do terceiro dia de preservação é ainda um fator considerável. Desde há muito se está trabalhando no desenvolvimento de novos meios de conservação visando prolongar a vida fértil do sêmen. As principais funções do diluente são: Redução do metabolismo espermático através de baixa de temperatura; Uso de soluções de tampão para alterar o metabolismo; Adição de substâncias nutritivas e protetoras como: glicose, buffer (bicarbonato- citrato, HEPES, Tris etc.); Adição de crioprotetores (glicerina,..); Inibição do crescimento bacteriano pela redução de temperatura e adição de antibióticos. Na pratica deve-se considerar alguns fatores básicos para manter a capacidade fertilizante do sêmen, como: variação de pH, concentração dos ingredientes (especialmente de íons), tipo de íons, pressão osmótica. Para o sêmen suíno estes fatores são: - pH 7 – 7,3; - baixa concentração iônica (substâncias quelatórias como EDTA – para captação de íons bivalentes -como Ca -); - pouco Na , - baixa concentração de bicarbonato (3-4 mMol/l); - pressão osmótica isotônica em relação ao ejaculado: 300 – 320 mOsmol; -substâncias não iônicas para manter isotonia (glucose). Atualmente distinguem-se três fatores altamente limitantes para a conservação do sêmen suíno liquido: - Choque térmico; - efeito de diluição; - envelhecimento durante o armazenamento. O sêmen suíno é altamente sensível frente à queda de temperatura, sobretudo imediatamente depois da ejaculação. Recomenda-se, portanto, aguardar de 10 a 20 minutos antes de resfria-lo. Para evitar o choque térmico de frio no processo de diluição é fundamental aplicar o diluente com temperatura idêntica à do sêmen. Dependendo da temperatura, as membranas espermáticas alteram sua fluidez, o que interfere com a função da membrana, especialmente no que se refere aos processos de transporte de íons e de regulação do volume celular. A adição de meios diluentes resulta em diluição da concentração de substâncias extracelulares, que tem efeito imediato sobre a regulação osmótica. Importante parece ser a concentração do plasma seminal, que no suíno é abundante no ejaculado e que devido ao grau de diluição, resulta numa diminuição considerável da concentração restante depois da diluição, o que tem efeito significativo para a manutenção do metabolismo, especialmente de energia da motilidade. O efeito negativo de altos graus de diluição manifesta-se em uma perda relativamente rápida da porcentagem de células moveis em comparação com amostras menos diluídas. Este efeito limita o rendimento da produção de numero de doses por ejaculado, que é muito baixo na espécie suína em comparação aos ruminantes. A eliminação parcial do plasma seminal na dose de sêmen tem também efeitos negativos para a sobrevivência dos espermatozóides (SPZ) no trato genital da porca, resultando numa alteração significativa da situação imune no endométrio uterino. O envelhecimento das células no transcurso do armazenamento pode ser atribuído a transtornos oxidativos da formação inadequada de espécies de oxigênios reativos (ROS) ou da subsequente peroxidação de lipídeos da membrana. As mitocôndrias são o sitio principal da formação de ROS intracelular, resultando numa interrupção do transporte de elétrons. Em consequência a produção mitocondrial de ATP e a motilidade são afetadas. Adição de substâncias antioxidativas no meio de conservação tende a reduzir o efeito nocivo de ROS. Para diminuir os efeitos acima mencionados os diluentes usados para armazenamento mais prolongado contem não apenas anti-oxidantes, mas também substâncias que podem reduzir o choque hipotérmico quando o sêmen é refrigerado a temperaturas entre 10 e 15°C. Estes meios facilitam o uso do sêmen liquido também em condições desfavoráveis de inverno europeu ou norteamericano, quando a temperatura ambiental desce abaixo de 15°C, dificultando a manutenção da temperatura das doses durante o transporte noturno para as granjas. O que é assunto de pesquisas atuais é procurar proteção do sêmen também contra temperaturas elevadas (até 25°C), que podem surgir durante um transporte em condições tropicais por longas distancias. Na presente palestra se pretende abordar as possibilidades experimentais de diminuir o efeito negativo de mudanças de temperatura, especialmente abaixo de 16°C, e o efeito nocivo de diluições de alto grau sobre a viabilidade dos espermatozóides. Foi desenvolvido um meio contendo substâncias para proteger contra o choque térmico (cold shock protector = CSP), facilitando a preservação a temperaturas entre 10 e 16 °C. Os resultados espermatológicos (Figura 1 a,b) mostram um efeito significativamente positivo em relação à motilidade e acrossomas alterados, em comparação ao diluente BTS, usado como meio de controle. Interessante é que os valores obtidos à temperatura de 10°C com o diluente AndrostarPlus não mostraram diferenças significativas em comparação àqueles do AndrostarPlus a 16°C. Figura 1 a,b: Motilidade progressiva de semen suino incubado em dois diluentes comerciais (BTS vs AndrostarPlus) a 16°C e 10°C ate 7 dias (n= 10 ejaculados) 100 95 90 85 MOT progr. % 80 75 AstarPlus16° BTS 16° AstarPlus10° BTS10° 70 65 60 55 50 45 40 d0 d3 d5 d7 AstarPlus16° 89,64 88,32 86,87 86,01 BTS 16° 89,33 86,74 82,35 80,47 AstarPlus10° 88,18 85,53 83,56 83,13 BTS10° 89,47 81,22 78,82 77,86 Storage time (days) Acrossomas defeituosas (SA) de semen suino incubado em dois diluentes comerciais (BTS vs AndrostarPlus) a 16°C e 10°C ate 7 dias (n= 10 ejaculados) 14 12 10 AstarPlus16° BTS 16° AstarPlus10° BTS 10° SA % 8 6 4 2 0 d0 d3 d5 d7 AstarPlus16° 1,5 2,8 4,4 5,2 BTS 16° 1,9 3,05 6,2 6,9 AstarPlus10° 1,75 4 5,9 7,5 BTS 10° 1,9 4,2 8,4 10,8 Storage time (days) Várias propriedades do meio de suspensão como: pH, força iônica, tipo de íons, pressão osmótica e conteúdo de substância anti-oxidantes importantes para manter a função espermática, e assim a fertilidade. A composição especifica do novo diluente AndrostarPlus, obviamente, é responsável pela redução significante do efeito de choque térmico. Os resultados levam à conclusão de que o novo diluente pode absorver alterações de temperatura não previstas – desviando da temperatura recomendada para o armazenamento e transporte a 16°C, bem como para períodos mais prolongados de armazenamento até 7 dias, e compensando quedas de temperatura a valores de 10°C. Por esta razão o diluente deveria ser especificamente útil para transporte de sêmen em condições climáticas adversas. Considerando a necessidade de aumentar a produtividade dos cachaços, especialmente no caso de reprodutores melhoradores genéticos, as centrais se vêem obrigadas a diluir mais os ejaculados do que o normalmente usado. Nestes casos se deve considerar que os SPZ são lesados devido ao choque de diluição. As células espermáticas são diluídas durante a ejaculação, pela secreção das glândulas acessórias, resultando numa estimulação da motilidade. Para aumentar a sobrevivência in vitro é necessário aplicar inibidores químicos ou uma redução de temperatura para diminuir o metabolismo, o que é realizado através de diluição. Espermatozóides reagem à diluição mostrando uma atividade aumentada, e em seguida perda de motilidade e aumento de danos de membrana. No caso de diluições excessivas, especialmente com apenas eletrólitos, acontece uma perda considerável de viabilidade celular. Apesar de não existirem explicações mais detalhadas para este chamado “efeito de diluição”, parece que surgem danos celulares, que são consequências de perdas de componentes intracelulares e/ou causa de eliminação de substâncias extracelulares protetoras do liquido seminal. Existem resultados experimentais que indicam que a eliminação de plasma seminal através da diluição progressiva pode ser compensada parcialmente pela adição de albumina e adição de + concentrações milimolares de K para manter a motilidade espermática. Supõe-se que as células sofrem lesões da membrana, que podem ser corrigidas pela adição destas substâncias. Uma série de experimentos foram conduzidos para estudar o efeito pronunciado de diluição, diluindo amostras de sêmen até graus de 1:140, resultando em números de SPZ por dose de apenas 0,5; 1 ; 1,5 bilhões de células por 80 ml (Tabela 1). Tabela 1: Graus de diluição e número de SPZ por dose correspondente (80 ml) 2,5 bilhões = 1:3 até 1:27 1,5 bilhões = 1:13 até 1:25 1,0 bilhão = 1:9,9 até 1:71 0,5 bilhões = 1:20 até 1:140 Diferentes ensaios mostraram claramente um efeito fortemente negativo sobre a motilidade e morfologia acrossômica das células quando o sêmen foi diluído a 1,5; 1 ou 0,5 bilhões de células por dose (80 ml), correspondendo a graus de diluição entre 1:20 até 1:80 e mais. Deve ser mencionado que no trabalho de rotina nas centrais o sêmen é diluído normalmente entre 1:10 e 1:20 no máximo. Como se pode ver nas Figuras 2, 3, 4, em que o sêmen diluído em alto grau foi armazenado entre 5 e 7 dias, a motilidade progressiva característica mais importante para a manutenção da viabilidade e fertilidade celular, entra em declínio de graus de diluição à partir de 1,5 bilhões por dose no terceiro dia de preservação, mostrando alguns ejaculados já imediatamente depois da diluição reações significativamente negativas da motilidade progressiva. Em todos estes casos a queda de motilidade foi acompanhada pelo aumento significativo da percentagem de acrossomas lesionados, indicando severo prejuizo da membrana celular (dados não mostrados). Dependendo da qualidade do diluente usado na experimentação, essa queda de motilidade e integridade das membranas foram parcialmente compensadas por alguns meios de proteção, desenvolvidos especialmente para esta finalidade. A Figura 2 mostra os dados comparando os diluentes BTS e AndrostarPlus, indicando que a diluição a 2,5 bilhões de células, como usual na rotina, não tem um efeito negativo sobre os parâmetros, alem de indicar uma diferença significativa entre os dois diluente em favor do AndrostarPlus. Entretanto uma diluição a 1 bilhão de células por dose, usado frequentemente em algumas centrais, no caso de cachaços de alta genética, o declínio da qualidade é mais pronunciado. Figura 2 a,b: Efeito de alto grau de diluicao (2,5; 1 e 0,5 bilhoes / 80 ml) e meio de conservacao (BTS vs AndrostarPlus) sobre a motilidade de semen suino, n=6, 16°C 100 90 80 MOT progr. % 70 BTS 2,5 AstarPlus 2,5 BTS 1 AstarPlus 1 BTS 0,5 AstarPlus0,5 60 50 40 30 20 10 0 BTS 2,5 d0 d3 d5 87,4 84,3 78,2 91 91,1 89 81,6 72,3 53,7 AstarPlus 1 87 82,7 70,2 BTS 0,5 61 50,2 24,5 77,8 63,9 41,4 AstarPlus 2,5 BTS 1 AstarPlus0,5 tempo de preservacao dias Acrossomas defeituosos de semen suino incubado em dois diluentes comerciais (BTS vs AndrostarPlus) a 16 ° e 10°C ate dia 5 (n = 10 ejaculados) 25 Acrossomas defeituosos % 20 BTS 2,5 AstarPlus 2,5 BTS 1 AstarPlus 1 BTS 0,5 AstarPlus0,5 15 10 5 0 d0 d3 d5 2,2 6,8 9,6 AstarPlus 2,5 2 2,8 4,2 BTS 1 3 11,3 14,5 BTS 2,5 2 5,4 6,8 BTS 0,5 2,8 17,7 20,7 AstarPlus0,5 1,7 8,4 10,3 AstarPlus 1 armazenamento dias Outro experimento (Figura 3) aplicou a alta diluição em ejaculados diluídos com outros diluentes comerciais de longa duração (AndrostarPlus vs Androhep). Os dados indicam que diluições a partir de 1:20 (1 bilhão) resultam em declínio de motilidade e qualidade acrossomal, que até o dia 3 ainda é leve, mas já indicando uma reação das células ao estresse de diluição. Neste ensaio o diluente Androhep mostrou melhor resistência frente ao choque de diluição, que provavelmente é causada pelo conteúdo de albumina sérica neste meio. Este fato indica que a perda de conteúdo de plasma seminal nas doses mais diluídas pode ser compensada parcialmente por ingredientes específicos no meio de conservação. Para continuar na pesquisa de efeitos nocivos de altos graus de diluição, foram comparados os meios comerciais AndrohepPlus e AndrostarPlus, ambos meios de longa preservação com efeito especifico de proteção contra temperaturas baixas (Figura 4). Neste ensaio os graus de diluição variam entre 1:10 e 1:70 (2,5; 1,5 e 1 bilhão de células / 80 ml). Nas amostras diluídas a 2,5 e 1,5 bilhões de células, os dois diluentes mantiveram uma alta motilidade progressiva até o dia 7 de preservação, indicando um efeito significativamente positivo em relação a compensação do efeito nocivo de diluição. Nas amostras diluídas a 1 bilhão de células, o diluente AndrohepPlus mostrou ainda uma boa proteção (motilidade progressiva acima de 70 %), enquanto que no meio AndrostarPlus verificou-se um decréscimo de 50% de motilidade. Estes resultados evidenciam que até o terceiro dia de preservação obviamente existe ainda uma suficiente proteção, que no caso do diluente AndrohepPlus se estende até o dia 7, provavelmente devido a seu conteúdo de albumina sérica, que obviamente confere um efeito compensatório significativo. Figura 3 a.b: Efeito de alto grau de diluicao (2,5; 1; 0,5 bilhoes / 80 ml) e meios de conservacao (AndrostarPlus vs Androhep) sobre a motilidade de semen suino, n=6, 16°C 100 90 80 MOT progr. % 70 AstarPl 2,5 Ahep 2,5 AstarPl 1,0 Ahep 1,0 AstarPl 0,5 Ahep 0,5 60 50 40 30 20 10 0 d0 d3 AstarPl 2,5 85,2 82,9 d5 84 Ahep 2,5 88,5 85,4 87,2 AstarPl 1,0 79,8 62,5 64,5 Ahep 1,0 85,3 75,4 73,3 AstarPl 0,5 69,8 38 35,3 Ahep 0,5 80,4 59,5 54,7 tempo de armazenamento dias Efeito de alto grau de diluicao (2,5; 1; 0,5 bilhoes / 80 ml) e meios de conservacao (AndrostarPlus vs Androhep) sobre a morfologia acrossomica de semen suino , n=6, 16 °C 12 acrossomas defeituosos % 10 8 AstarPl 2,5 Ahep 2,5 AstarPl 1,0 Ahep 1,0 AstarPl 0,5 Ahep 0,5 6 4 2 0 d0 d3 d5 AstarPl 2,5 2,8 4,3 5,3 Ahep 2,5 1,8 3,1 4,2 AstarPl 1,0 4,2 5,8 7,9 Ahep 1,0 2,8 4,3 5,8 AstarPl 0,5 4,5 7,8 10,4 Ahep 0,5 3,3 6,7 7,8 armazenamento em dias Figura 4: Efeito de alto grau de diluicao (2,5; 1,5; 1 bilhoes /80 ml) e meio de conservacao (AndrohepPlus vs AndrostarPlus) sobre a motilidade de semen suino, n=6, 16°C 100 90 80 MOT progr. % 70 AhepPl 2,5 AstarPl 2,5 AhepPl 1,5 AstarPl 1,5 AhepPl 1,0 AstarPl 1,0 60 50 40 30 20 10 0 d0 d3 d5 d7 AhepPl 2,5 91 90,8 89,9 90,3 AstarPl 2,5 89,2 89,2 88 87,8 AhepPl 1,5 91,2 88,9 82,5 86,8 AstarPl 1,5 88,4 84,2 66 79,5 AhepPl 1,0 89,9 84,6 71,6 76,2 AstarPl 1,0 85,7 75,2 51,9 48,6 armazenamento dias Os dados de acrossomas alterados acompanham o transcurso da motilidade, por isto não são mostrados. Os experimentos (não mostrados por ejaculados individuais) indicam claramente, que ejaculados ricos em SPZ (e relativamente pobres em plasma seminal) reagem muito mais fortemente a altos graus de diluição do que ejaculados pobres em SPZ (isto é, ricos em plasma seminal), pois nos ejaculados com muitos SPZ se aplica uma taxa de diluição mais alta. Dependendo destas características dos ejaculados resultam diferentes graus de diluição, pois os ejaculados são diluídos visando um numero fixo de SPZ na dose de IA, como é uso na pratica. Para investigar o efeito positivo da albumina sérica, anteriormente documentado, foi realizado um ensaio na base de BTS, aplicando BSA usando três graus de diluição, anteriormente já estudados. Os resultados demonstraram claramente a hipótese de proteção da albumina contra o choque de diluição, apesar de que a proteção completa somente está assegurada quando o sêmen é diluído em forma convencional (2,5 bilhões /80 ml) (Figura 5). Figura 5: Efeito de BSA (BTS +) vs BTS e grau de diluicao (1; 1,5; 2,5 bilhoes /80 ml) sobre a motilidade progressiva de semen sunio, n=6, 16°C 100 90 motilidade progressiva % 80 70 BTS+ 1 bilh. BTS 1 bilh. BTS+ 1,5bilh BTS 1,5 bilh BTS+ 2,5 bilh BTS 2,5 bilh. 60 50 40 30 20 10 0 d0 d3 BTS+ 1 bilh. 83,47 82,07 d5 72 BTS 1 bilh. 78,13 70,1 63,57 BTS+ 1,5bilh 88,03 83 77,23 BTS 1,5 bilh 82,6 76,5 67,5 BTS+ 2,5 bilh 92,67 89,56 89,13 BTS 2,5 bilh. 89 87,86 86,27 armazenamento em dias Finalmente, foi lógico investigar o efeito hipoteticamente protetor do plasma seminal. Numa serie de experimentos, somente em sua síntese aqui apresentados, foram usados ejaculados centrifugados (livre de plasma seminal), e o plasma seminal separado adicionado posteriormente numa concentração de 10 e 20 % e comparado com as amostras preservadas sem plasma seminal. A Figura 6 mostra os resultados de diferentes experimentos, em conjunto, para evidenciar mais claramente esses efeitos, porem os dados não puderam ser calculados estatisticamente por falta de dados em split sample. Os efeitos negativos de diluição, verificável após diluições a 1 e 0,5 bilhões de espermatozóides por dose, foram claramente confirmados. Os diluentes usados mostram efeitos protetores distintos, assinalando seus conteúdos diferentes de proteção (BTS, AndrostarPlus, AndrohepPlus). Adição de plasma seminal de 10 e 20 % compensa amplamente o efeito negativo de diluição. Tem-se que 20 % de plasma seminal tem efeito melhor do que 10 %: O efeito protetor é mais verificável nos diluentes AndrostarPlus e AndrohepPlus do que no diluente BTS (não contém substâncias especificas protetoras). Os valores para acrossomas alterados correspondem amplamente aos valores de motilidade, porem não são mostrados aqui. Figura 6: Efeito de plasma seminal (10, 20 %) e dif. meios de preservacao (BTS,AstarPlus, AhepPlus) sobre a motilidade de semen altamente diluido (1; 0,5 bul). 100 90 BTS 1,0 BTS 1,0 10 BTS 1,0 20 BTS 0,5 0 BTS 0,5 10 As 0,5 20 AstPl 1,0 AstPl 1 10 AstPl 1 20 AstPl 0,5 AstPl 0,5 10 AstPl 0,5 20 AhepPl 1 AhepPl 1 10 AhepPl 1 20 AhepPl0,5 AhepPl0,5 10 AhepPl0,5 20 80 MOT progr % 70 60 50 40 30 20 10 0 d5 Num ensaio adicional final (Figura 7 a,b) foi investigado o efeito do plasma seminal usando os meios Androhep e AndrohepPlus, que se distinguem pelo conteúdo da substância de choque térmico(CSP) no AndrohepPlus. Os resultados na Figura 6 foram confirmados em forma geral. O meio AndrohepPlus se estacou por dois aspectos: primeiro mostrou apenas uma tendência não significativa da diferença entre os valores de 1 e 0,5 bilhão /dose com adição de plasma seminal (10, 20 %), segundo a diferença entre as amostras sem plasma seminal foi levemente significativa, indicando um efeito especifico adicional e positivo em comparação ao dados do meio Androhep, nos quais os valores sem e com plasma seminal se distinguiram mais claramente. Figura 7 a, b: Efeito de Plasma Seminal (10/ 20%) sobre a motilidade semen suino V 06, 05 2008 MOT progr: Zusatz von 10 / de 20% SPl bei altamente diluido 0,51,0; bilhoes) em Androhep e vs AndrohepPlus, n=6 Verd (1; Rate 0,5 Mrd.; Androhep AndrohepPlus Androhep 100 MOT progr Ahep 1 AndrohepPlus 1 Mrd. 0,5 Mrd. 1 Mrd. MOT progr Ahep10 1 0,5 Mrd. MOT progr Ahep20 1 90 MOT progr Ahep 0,5 MOT progr Ahep 0,5 10 80 MOT progr Ahep 0,5 20 MOT progr AhepPl 1 70 MOT progr AhepPl 1 10 MOT Porgfr % MOT progr AhepPl 1 20 60 MOT progr AhepPl0,5 MOT progr AhepPl0,5 10 50 MOT progr AhepPl0,5 20 40 30 0 10 20 0 10 20 0 10 20 0 10 20 SPlasma % 20 10 0 d5 Efeito seminal (10 / 20%) e alto de hohe diluicao (1; 0,5 sobre a V 06, de 05 plasma 2008 GAR %: Zusatz von 10 / 20grau % SPl, Verd. 1,0;bilhoes) 0,5 Mrd.; Androhep vs integridade acrossomal de semen suino diluido em Androhep e AndrohepPlus, n=6 AndrohepPlus Androhep 16 1 Mrd. AndrohepPlus 0,5 Mrd. 1 Mrd. 0,5 Mrd. 14 GAR % Ahep 1 12 GAR % Ahep10 1 GAR % Ahep20 1 GAR % Ahep 0,5 GAR % 10 GAR % Ahep 0,5 10 GAR % Ahep 0,5 20 8 GAR % AhepPl 1 GAR % AhepPl 1 10 6 GAR % AhepPl 1 20 GAR % AhepPl0,5 GAR % AhepPl0,5 10 4 2 GAR % AhepPl0,5 20 0 10 20 0 10 20 0 10 20 0 10 20 SPlasma % 0 d5 Concluindo, vale ressaltar que na preservação de sêmen liquido suíno ainda existem problemas relacionados com a alta sensibilidade dos espermatozóides ao choque térmico(descida de temperatura abaixo de 16 °C e ao efeito nocivo de altos graus de diluição (mais de 1:20 ou seja abaixo de 1,5 bilhões de SPZ / dose de 80 ml). Esta problemática se deve a características especificas da membrana celular do espermatozóide suíno, que apresenta alterações de fluidez da membrana quando a temperatura cai; em relação a sensibilidade de diluição tem-se uma eliminação gradual de efeitos protetores específicos do plasma seminal, que durante a preservação são eliminados gradualmente devido aos graus de diluições diferentes. Como os resultados deste trabalho mostram, estes dois efeitos nocivos mencionados podem ser compensados através da aplicação de meios de preservação específicos, que em sua composição contem substâncias protetoras contra o choque térmico e/ou alto grau de diluição. Como quase sempre numa natureza altamente complexa, estes efeitos protetores são significativos, mas não capazes de eliminar completamente as causas detrimentais provocadas pelo manuseio artificial durante a preservação do sêmen suíno liquido para a inseminação artificial.