Aluno: Alessandra Cristina Oliveira

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
Programa de Pós-Graduação em Toxicologia
Área de Concentração: Toxicologia
Aluno: Carolina Dalaqua Sant’Ana
Título: “Caracterização funcional e estrutural de uma nova serinoprotease do veneno
de Bothrops jararacussu"
Orientador: Porfa. Dra. Suely Vilela
Data da Defesa: 05/08/2005
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo isolar uma proteína com atividade coagulante do
veneno de Bothrops jararacussu caracterizando-a bioquímica, enzimática,
imunoquímica e estruturalmente. O isolamento da serinoprotease, denominada
BjussuSP-I, envolveu duas etapas cromatográficas, a saber uma exclusão molecular em
resina G-75 e uma afinidade em Benzamidina Sepharose 6B, e uma etapa de
ultrafiltração em sistema AMICON, conferindo um alto grau de pureza à BjussuSP-I,
confirmado por SDS-PAGE, PAGE para proteínas ácidas e HPLC de fase reversa em
coluna C18. Apresentou uma Mr ~ 55.000, 27% de carboidratos neutros totais e um pI
~ 3,8, confirmando ser uma glicoproteína de caráter ácido. Apresentou atividade
coagulante sobre o plasma, formando um coágulo semi-rígido diferente da trombina
que resulta na formação de um coágulo consistente. Sugerimos que esta trombinasímile não apresenta atividade sobre o fator XIII, responsável por estabilizar a rede de
fibrina. A enzima apresentou-se estável para esta atividade quando avaliada em
diferentes temperaturas (-70 a 100ºC) e pHs (2,5 a 10,0). Na presença de diferentes
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íons (Co , Mg , Fe , Ca , Mn e Zn ) e inibidores (PMSF, leupeptina, EGTA, EDTA,
aprotinina, B-mercaptoetanol, 1,10- phenantrolina e heparina) sua atividade
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coagulante foi mantida, com exceção para os íons Fe , Ca , Mn e Zn e os inibidores
1,10-Phenantrolina, heparina, PMSF e leupeptina, provocando uma diminuição na sua
atividade coagulante sobre o plasma. Foi observada a diminuição significativa das suas
atividades enzimáticas quando incubada com inibidores específicos, como o PMSF e a
leupeptina, confirmando sua classificação no grupo das serinoproteases. A atividade
proteolítica da trombina-símile foi confirmada sobre os substratos artificiais como (i)
BAPNA, S-2238 e S-2288 não apresentando atividade sobre a caseína, e os naturais
como (i) a fibrina e o fibrinogênio, degradando apenas a cadeia Aα. A atividade
esterásica da BjussuSP-I sobre o substrato artificial TAME foi confirmada. Apresentou
atividade pró-coagulante e calicreína-simile, mas não apresentou atividade sobre
plaquetas. A BjussuSP-I foi capaz de induzir a produção de anticorpos policlonais (antiBjussuSP-I), o qual apresentou imunorreatividade com outras espécies de venenos dos
gêneros Bothrops, Crotalus, Calloselasma e com uma enzima LAAO isolada do veneno
de B. moojeni. Os inibidores naturais, anti-BjussuSP-I e o extrato aquoso de partes
aéreas de Bauhinia forficata (AEBf) foram capazes de inibir a atividade coagulante da
enzima, sendo que apenas o AEBf foi capaz de inibir a atividade fibrinogenolítica da
BjussuSP-I. Esta enzima apresentou atividade edematogênica moderada, quando
comparada com a atividade causada pelo veneno bruto de B. jararacussu e não induziu
efeito hemorrágico nem miotóxico in vivo, apresentando, portanto, características
peculiares que a tornam uma proteína de grande interesse na área médico-científica,
em casos de pacientes com distúrbios hemostáticos. Através da clonagem e
seqüênciamento do cDNA da BjussuSP-I foi possível realizar um alinhamento múltiplo
Atualizado em 07/2013.
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Área de Concentração: Toxicologia
da estrutura primária desta enzima, confirmando a alta identidade com outras enzimas
trombina-símiles. Portanto, a BjussuSP-I confirma ser uma nova trombina-símile
isolada do veneno bruto de Bothrops jararacussu.
Atualizado em 07/2013.
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Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
Programa de Pós-Graduação em Toxicologia
Área de Concentração: Toxicologia
Aluno: Maurício Homem de Mello
Título: "N-acetilcisteína e dapsona: avaliação da toxicidade hematológica e
Bioquímica em ratos Wistar"
Orientador: Profa. Dra. Regina Helena Costa Queiroz
Data da Defesa: 23/06/2005
RESUMO
Homem de Mello, M. N-acetilcisteína e dapsona: avaliação da toxicidade
hematológica e bioquímica em ratos Wistar. 2005, 120 f. Dissertação (Mestrado) –
Faculdade de Ciências farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto, 2005.
A dapsona, fármaco de escolha no tratamento da hanseníase, induz hemotoxicidade
que está diretamente relacionada à N-hidroxilação sofrida pelo fármaco, uma de suas
principais vias de biotransformação, devido à formação de produtos reativos, as Nhidroxilaminas. Com o objetivo de se avaliar a influência da N-acetilcisteína na
toxicidade hematológica e bioquímica da dapsona, foi administrado em ratos Wistar,
por via intraperitoneal, 40 mg/kg de dapsona em monoterapia e associada à Nacetilcisteína na dose de 75 mg/kg, concomitantemente e previamente. Os resultados
obtidos mostraram que a interação entre a N-acetilcisteína e a dapsona potenciava a
hemotoxicidade induzida pela dapsona, principalmente pelo incremento da
porcentagem de metemoglobinemia. Em relação aos outros parâmetros estudados:
glutationa, bilirrubina, lactato desidrogenase, hemograma completo, contagem de
reticulócitos, fragilidade osmótica e dosagem de haptoglobina, os resultados
encontrados foram controversos e pouco conclusivos. Os dados observados no
presente trabalho permitiram evidenciar que a associação da N-acetilcisteína
potenciou a hemotoxicidade da dapsona, como comprovado pelas análises estatísticas
de variância (ANOVA), através do teste de Tukey-Kramer, com nível de significância
fixado em p<0,05.
Palavras-chave: Dapsona, N-acetilcisteína, Metemoglobina, N-hidroxilamina
Atualizado em 07/2013.
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Programa de Pós-Graduação em Toxicologia
Área de Concentração: Toxicologia
Aluno: Fernando José Malagueño de Santana
Titulo: "Análise enantiosseletiva da mirtazapina em plasma: comparação de métodos
de preparação das amostras"
Orientador: Profa. Dra. Pierina Sueli Bonato
Data da Defesa: 22/06/2005
RESUMO
O crescente interesse na avaliação da estereosseletividade na farmacocinética e
farmacodinâmica de fármacos quirais, visando estabelecer as vantagens na produção
de fármacos estereoquimicamente puros, tem levado ao desenvolvimento de métodos
de análises com baixos limites de quantificação, seletividade e reprodutibilidade
compatíveis com sua utilização em estudos de disposição cinética. Nesse contexto, um
método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi desenvolvido
para a análise enantiosseletiva da mirtazapina em plasma humano. A mirtazapina foi
selecionada para esse estudo por ser um novo antidepressivo, com propriedades
farmacocinéticas e farmacodinâmicas estereosseletivas e em razão da carência de
metodologia adequada para a quantificação individual dos seus enantiômeros. O
procedimento de preparação das amostras envolveu tanto a extração líquido-líquido
(LLE) quanto uma nova técnica de microextração em fase líquida empregando fibra
cilíndrica microporosa de polipropileno (LPME), ambas usando tolueno como solvente
de extração, seguido de análise cromatográfica, com detecção por absorção no UV, em
292 nm. A separação cromatográfica das formas (+)-(S)- e (-)-(R)-mirtazapina foi obtida
em uma coluna Chiralpak AD protegida por coluna de guarda CN, usando hexano:
etanol (98:2, v/v) + 0,1% de dietilamina como fase móvel. A recuperação média dos
enantiômeros da mirtazapina empregando a LLE (96%) foi superior à obtida com a
LPME (29%); apesar disso, os limites de quantificação foram muito próximos, isto é, 5,0
ng mL-1 para a LLE e 6,25 ng mL-1 para a LPME. Nos estudos de precisão e exatidão, os
coeficientes de variação e erros relativos foram inferiores a 15% para todas as
amostras avaliadas, empregando ambas as técnicas. O método de microextração
baseado na LPME provou ser mais econômico e menos poluente e tão rápido, sensível
e reprodutível quanto a LLE. As duas técnicas de preparação de amostras provaram ser
adequadas e compatíveis para sua aplicações em estudos de disposição cinética.
Atualizado em 07/2013.