Técnicas Imunológicas

Técnicas Imunológicas
Testes sorológicos no laboratório
detecção e quantificação de antígeno e anticorpo:
diagnóstico de doenças infecciosas, diferenciação da
fase da doença, avaliação de prognóstico, critério de
cura
dosagem de hormônios
reagentes não marcados ou marcados
uso de peptídeos sintéticos e anticorpos monoclonais
Hemoaglutinação
Hemoaglutinação direta:
Ex: grupo sangüíneo ABO e Rh
Hemoaglutinação indireta: hemácias usadas
como um suporte
Ex: pesquisa de Ac anti- Toxoplasma gondii
Reação de hemoaglutinação
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
fase sólida: poliacrilamida, agarose, dextran,
poliestireno, polivinil, polipropileno
Placa de ELISA
Etapas do ELISA
sensibilização (ou cobertura) da fase sólida:
adição de Ag ou do Ac
bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino,
leite desnatado) ∗
adição da amostra (em diluente) *
adição do conjugado: anticorpo purificado
marcado com enzima (ex: peroxidase) ∗
∗ lavagens
Etapas do ELISA
adição do substrato cromogênico:
peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD
(ortofenilenodiamina)
interrupção da reação: SDS ou ácido
leitura: leitor de ELISA
∗ lavagens
Etapas do ELISA
Reação de imunofluorescência direta
- A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de
fluorescência
Pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a
substância fluorescente (conjugado)*
• → microscópio de fluorescência
Reação de imunofluorescência direta
Reação de imunofluorescência indireta
A- pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico → Ag-Ac *
• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• microscópio de fluorescência
•
* lavagens
Reação de imunofluorescência indireta
B- pesquisa de anticorpos
• Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) → Ag-Ac *
• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• microscópio
• determinação do título e classe do Ac
Reação de imunofluorescência indireta
RIFI para pesquisa de Ac anti -T. cruzi
Citometria de fluxo
citômetro de fluxo ou FACS ( fluorescent-activated cell sorter)
fonte de excitação: lâmpada de argônio → raio laser (488 nm)
características detectadas: tamanho da célula, granulosidade e
fluorescênica emitida
•
•
•
tamanho da partícula: detectores situados à frente do raio laser
granulosidade: detectores a 900 do raio laser
intensidade de fluorescência:
FL1: emissão na região de 530 ± 30 nm (isotiocianato de
fluoresceína - FITC)
FL2: emissão na região de 585 ± 26 nm (ficoeritrina - PE)
FL3: emissão acima de 630 nm (peridina-clorofila)
ETAPAS DA CITOMETRIA DE FLUXO
coleta e processamento da amostra (sangue total)
incubação das células com anticorpos
monoclonais conjugados com fluorocromo
aquisição de dados no aparelho
análise dos dados: tamanho, granulosidade e
emissão de fluorescência
Expressão dos resultados
gráfico de tamanho x granulosidade (FSC x
SSC): seleção da população a ser analisada
(linfócitos, monócitos, neutrófilos e
eosinófilos)
Gráfico de fluorescência (FL1 x FL2):
avaliação de características da célula
Gráficos de citometria de fluxo
FSC x SSC
FL1 x FL2
Aplicações da citometria de fluxo
infecção pelo HIV: contagem de linfócitos T
CD4+ e CD8+
classificação das imunodeficiências e
leucemias
diagnóstico da hemoglobinúria paroxística
noturna