Deficiência na expressão de CCR4 reduz a capacidade supressora

Transcrição

Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Programa de Pós Graduação em Imunologia Básica e Aplicada
THAÍS BARBOZA BERTOLINI
Deficiência na expressão de CCR4 reduz a capacidade
supressora de células CD4+Foxp3+ e aumenta a susceptibilidade
na fase crônica da infecção por M. tuberculosis
Ribeirão Preto
2015
THAÍS BARBOZA BERTOLINI
Deficiência na expressão de CCR4 reduz a capacidade
supressora de células CD4+Foxp3+ e aumenta a susceptibilidade
na fase crônica da infecção por M. tuberculosis
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor.
Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada
Orientadora: Profa. Dra. Vânia Luiza Deperon Bonato
Ribeirão Preto
2015
Catalogação da Publicação
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
Bertolini, Thaís Barboza
Deficiência na expressão de CCR4 reduz a capacidade supressora de células
CD4+Foxp3+ e aumenta a susceptibilidade na fase crônica da infecção por M.
tuberculosis
Ribeirão Preto, 2015.
134 p. : Il. ; 30cm
Tese de Doutorado. Apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Universidade de São Paulo – FMRP-USP
Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientadora: Bonato, Vânia Luiza Deperon.
1. M. tuberculosis; 2. CCR4; 3. Células Tregs; 4. Receptor de Quimiocina.
Nome: Thaís Barboza Bertolini
Título: Deficiência na expressão de CCR4 reduz a capacidade supressora de células
CD4+Foxp3+ e aumenta a susceptibilidade na fase crônica da infecção por M.
tuberculosis
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor
Aprovado em:
Banca Examinadora:
Prof. Dr.
______________________
Instituição: _______________________
Julgamento: ______________________
Assinatura: _______________________
Prof. Dr.
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Prof. Dr.
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Prof. Dr.
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Julgamento: ______________________
Assinatura: _______________________
DEDICATÓRIA
Dedico esta tese de Doutorado aos meus pais, Aércio
(in memoriam) e Vanderly, pelo amor inesgotável,
pelo exemplo de vida e pelo incentivo incessante.
AGRADECIMENTOS
o À Deus por sempre guiar meus passos.
o À minha orientadora, Prof.ª Dra. Vânia Luiza Deperon Bonato, pela
oportunidade, confiança, ensinamentos e amizade dentro e fora do laboratório.
o Aos membros da banca examinadora pela disponibilidade e sugestões.
o Aos professores, Dr. José Alves-Filho pela colaboração que fizemos para o
desenvolvimento deste trabalho.
o À Professores, Dr.ª Simone Gusmão Ramos pelo auxílio com a análise
histopatológica. À técnica Elaine Medeiros Floriano pela preparação das lâminas
histológicas.
o Aos meus amigos e companheiros de laboratório, Ana Flávia, Annie Piñeros,
Rafael Prado, Denise Fonseca, Amanda Goulart, Sandra Palma e José Seminate
pelo apoio e amizade dentro e fora do laboratório.
o Aos meus amigos e companheiros de laboratório vizinho Wendy Rios, Jeanne
Molfeta, Izaíra Brandão e Ana Masson apoio e amizade dentro e fora do
laboratório.
o Aos meus amigos da pós-graduação Isabela Cardoso Fontoura, Elyara Soares,
Mária Cláudia Silva, Marcela Davoli, Luana Soares, Thiago Malardo e Evérton
Padilha pelos apoio e pelos agradáveis momentos vividos e um agradecimento
especial à Manuela Pucca e Felipe Cerni, que me acompanham desde o mestrado
e me ajudaram a fazer a figura de conclusão.
o Aos meus pais Aércio (in memoriam) e Vanderly pela confiança, amor e
dedicação inesgotável.
o Ao meu noivo Diego Masson pelo amor, carinho, paciência, dedicação
e
compreensão nesse momento importante da minha vida.
o À minha irmã Laura e aos meus primos Gabriela, Nayara, Loreta, Viviane,
Verônica e João Miguel pelo amizade, apoio e incentivo incansável.
o Aos professores e funcionários da Pós-Graduação em Imunologia Básica e
Aplicada, pelos favores, auxílios e suporte acadêmico ao longo do doutorado.
o Ao Biotério Central e ao Biotério de Animais Especiais da USP/RP, pelo
fornecimento de animais de experimentação.
o À Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, pela infraestrutura cedida.
o À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, pelo
suporte financeiro.
o E à todos, que de alguma forma, contribuíram para a realização desse trabalho.
EPÍGRAFE
“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar
o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê”
(Arthur Schopenhauer)
RESUMO
RESUMO
Bertolini, T.B. Deficiência na expressão de CCR4 reduz a capacidade supressora de
células CD4+Foxp3+ e aumenta a susceptibilidade na fase crônica da infecção por M.
tuberculosis. 2015. 134 p. Tese (Doutorado), Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
A tuberculose (TB) é uma doença crônica causada pelo bacilo Mycobacterium
tuberculosis. A patogênese da TB é resultado da interação da persistência dos bacilos
e dos mecanismos que conferem proteção contra a infecção. Nesse sentido, o controle
de respostas efetoras é fundamental para limitar o dano tecidual do hospedeiro.
Células T CD4+Foxp3+ desempenham essa função, porém estão associadas com a
progressão da TB. Sabendo que o receptor de quimiocina CCR4 está envolvido na
migração de células T CD4+Foxp3+ para o pulmão, nós usamos animais deficientes
para CCR4 (CCR4-/-) para avaliar o papel das células T reguladoras (Treg) durante a
fase crônica da infecção (70 dias). O animais CCR4-/- e WT (Wild Type) foram
infectados com 1 x 105 bacilos pela via intratraqueal e avaliados aos 15, 30 e 70 dias
após a infecção. A deficiência na expressão de CCR4 reduziu a migração de células
Treg para o pulmão em todos os períodos avaliados, mas afetou diferencialmente a
resistência à infecção. Após 15 dias de infeção, os animais CCR4-/- apresentaram
maior resistência comparado com os animais WT e nenhuma diferença foi observada
após 30 dias de infeção. Aos 70 dias de infeção observou-se um cenário diferente.
Embora houvesse aumento de células CD4+Tbet+ e células CD4+ produtoras de IFN-γ
(Th1) que, provavelmente, resultaram na maior inflamação pulmonar encontrada, os
animais CCR4-/- foram mais susceptíveis. Além disso, as células Treg de animais
CCR4-/- apresentam menor expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73,
prejudicando sua atividade supressora como observado in vitro pela menor
capacidade em inibir proliferação de células T efetoras comparadas com as células
Treg de animais WT. A transferência de células Foxp3-GFP+ para animais CCR4-/infectados reduziu os níveis de IFN-γ e a carga bacteriana no pulmão comparados
com animais CCR4-/- que não receberam transferência celular. Esses resultados
realçam a importância de vias regulação de respostas imunológicas, principalmente
durante infecções crônicas como a TB. Nesse sentido, esse estudo mostra a
necessidade de compreendermos o limiar entre resistência ao patógeno e tolerância ao
dano na TB, para a possível manipulação de novas estratégias terapêuticas.
ABSTRACT
ABSTRACT
Bertolini, T.B. CCR4 expression deficiency reduces the CD4+Foxp3+ suppressive
ability and increases the susceptibility in the chronic phase of M. tuberculosis
infection. 2015. 134 p. Thesis (PhD), Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
Tuberculosis (TB) is a chronic disease caused by Mycobacterium tuberculosis.
The pathogenesis of TB results from the interaction of the persistence of bacilli and
the mechanisms that confer protection against infection. Accordingly, the control
effector response is crucial to limit tissue damage host. CD4+Foxp3+ T cells perform
this function, but are associated with the progression of TB. As it is already establish
the involvement of CCR4 in the CD4+Foxp3+ T cells recruitment to the lung, we used
CCR4 deficient mice (CCR4-/-) to evaluate the role of regulatory T (Treg) cells during
the infection chronic phase (70 days). The CCR4-/- and WT (Wild Type) mice were
infected with 1 x 105 bacilli by intratracheal route and evaluated at 15, 30 and 70 days
after infection. The deficiency in CCR4 expression reduced Treg cell migration to the
lung in all periods evaluated, but differentially affected the infection resistance. At 15
days of infection, CCR4-/- mice showed higher resistance compared to WT mice and
there was no difference at 30 days of infection. At 70 days of infection was observed
a different scenario. Although there was an increase of CD4+Tbet+ cells and IFN-γproducing CD4+ T cells (Th1), that probably resulted in increased lung inflammation
found, the CCR4-/- mice were more susceptible. In addition, Treg cells from CCR4-/mice exhibit lower expression of ectonucleotidases CD39 and CD73, impairing their
suppressive activity as observed, in vitro, by lower suppressive ability in inhibiting
the proliferation of effector T cells compared with Treg cells from WT mice. The
transfer of Foxp3-GFP+ cells to infected CCR4-/- mice reduced IFN-γ levels and the
bacterial load in the lung compared to CCR4-/- mice without transfer. These results
highlight the importance of pathways regulating immune responses, particularly
during chronic infections such as TB. Thus, this study shows the need to understand
the threshold between pathogen resistance and damage tolerance in TB, for possible
manipulation of new therapeutic strategies.
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Expressão de CCR4, CCL17 e CCL22 no pulmão de animais WT,
infectados ou não. ................................................................................................ 30 Figura 2. Avaliação do número de UFC no pulmão e baço em diferente tempos de
infecção. ............................................................................................................... 31 Figura 3. Porcentagem e número total de células CD4+, CD4+CD25+ e CD4+Foxp3+.
.............................................................................................................................. 33 Figura 4. Razão e Correlação entre células CD4+/CD4+CDFoxp3+ após 15, 30 e 70
dias de infecção. ................................................................................................... 35 Figura 5. Análise histopatológica do pulmão de animais WT e CCR4-/- infectados. . 37 Figura 6. Detecção de quimiocinas no homogenato pulmonar. .................................. 38 Figura 7. Porcentagem e número total de células dendríticas e macrófagos. ............. 40 Figura 8. Quantificação de genes associados com macrófagos M1 e M2. ................. 41 Figura 9. Porcentagem e número total de células NK1.1+CD3-. ................................ 42 Figura 10. Porcentagem e número total de células CD3+CD8+ e CD8+C107a+.......... 43 Figura 11. Porcentagem e número total de células CD4+ positivas para Tbet+, RORγt+
GATA-3+ e Foxp3+. ............................................................................................. 45 Figura 12. Quantificação da expressão gênica de CXCR3 e CCR5. .......................... 46 Figura 13. Detecção de citocinas no homogenato pulmonar. ..................................... 47 Figura 14. Detecção de produção de citocina intracelular no pulmão. ....................... 48 Figura 15. Correlações entre número de UFC, células CD4+IFN-γ+, CD4+Foxp3+,
CD4+Tbet+............................................................................................................ 50 Figura 16. Avaliação da expressão de receptores de inibição CD39 e CD73 em
células CD4+Foxp3+............................................................................................. 52 Figura 17. Análise da função supressora das células CD4+CD25+. ............................ 54 Figura 18. Número de CFU e quantificação IFN-γ e IL-10 no pulmão de animais
infectados com M. tuberculosis após transferência de células Foxp3-GFP+. ...... 56 Figura 19. Esquema ilustrativo dos eventos imunológicos que sucedem na presença e
ausência de CCR4 durante a TB experimental. ................................................... 66 LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Descrição dos anticorpos monoclonais utilizados nos ensaios de citometria
de fluxo. ............................................................................................................... 21 Tabela 2. Sequência de primers utilizados para quantificação de genes por PCR em
tempo real. ........................................................................................................... 24 Tabela 3. Limite de detecção de cada kit imunoenzimático. ...................................... 24 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS – Acquired Immunodeficiency Syndrome
AP1 - Activator Protein 1
Arg1 – Arginase 1
ATL – Adult T-cell Leukemia/lymphoma
BAAR – bacilo álcool-ácido resistente
BCG – Bacilo de Calmette-Guerín
CCR ou CXCR – chemokine receptor
CFP – proteína de filtrado de cultura
CpG – oligodeoxinucleotideos
CTL – Cutaneous T-cell Lymphomas
CTLA-4 – Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4
ESAT-6 – Early Secreted Antigenic Target of 6 kDa
ESX-1 – Early Secretory Antigenic target 6 system 1
GATA-3 – GATA biding protein 3
HE – Hematoxilina & Eosina
HIV – Human Immunodeficiency Virus
IDO – indoleamine 2,3-dioxygenase
IFN-γ – Interferon-gamma
IL – interleucina
iNOS – Inducible Oxide Nitric Syntase
IP-10 – Inducible Protein-10
JAK1 – Janus Kinase 1
LAM – lipoarabinomananas
LAMP1 – Lysosomal Associated Membrane Protein 1
LTA4H – Leucotrieno A4 Hidrolase
LTB4 – Leucotrieno B4
LXA4 – lipoxina A4
M1 – Macrófagos ativados classicamente
M2 – Macrófagos ativados alternativamente
MDC – Macrophage-Derived Chemokine
MHC – Major Histocompatibility Complex
MIG – Monócito induzido por IFN-γ
NET – Neutrophil Extracellular Traps
NK – Natural Killer
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
NKT – Natural Killer T
NO – Nitric Oxide
NOD – Nucleotide binding oligomerization-domain
PAMPs – Pathogen-Associated Molecular Patterns
PG – prostaglandinas
PMA – Phorbol 12-Myristate 13 Acetate
PPD – derivado de proteína purificada
PRRs – Pathogen Recognition Receptors
RANTES – Regulated on Activation Normal T Cell Expressed and Secreted
RNI – intermediários reativos de nitrogênio
RORγt – Retinoid-Acid Receptor-related Orphan Receptor gamma T
ROS – Reactive Oxygen Species
RT-PCR – Real time PCR
SBF – Soro Bovino Fetal
STAT1 – Signal Transducer and Activator of Transcription 1
TARC – Thymus Activated-Regulated Chemokine
TB – Tuberculose
Tbet – Th1 cell promoting transcription fator
TCR – T Cell Receptor
TGF-β – Transforming Growth Gactor beta
Th – T helper
TLR – Toll-Like Receptors
TNF – Tumor Necrosis Factor
Tr1 – T reguladoras do tipo 1
Treg – T reguladora
UFC – Unidades Formadoras de Colônia
WT – Wild Type
PROTOCOLO PARA USO DE ANIMAIS EM EXPERIMENTAÇÃO
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1 1.1. Resposta imunológica na TB .......................................................................................... 2 1.2. Células T reguladoras ....................................................................................................... 6 1.3. Receptor de Quimiocina 4 (CCR4) ................................................................................ 9 1.3.1 Receptores de quimiocina na TB ........................................................................................ 12 2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 14 2.1. Objetivo geral ................................................................................................................... 14 2.2. Objetivos específicos ...................................................................................................... 14 3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 15 3.1. Animais ............................................................................................................................... 15 3.2. Preparação do inóculo de Mycobacterium tuberculosis ..................................... 15 3.3. Infecção intratraqueal ................................................................................................... 16 3.4. Digestão do tecido pulmonar ...................................................................................... 16 3.5. Ensaio de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) ............................................. 17 3.5.1. Pulmão .......................................................................................................................................... 17 3.5.2. Baço ................................................................................................................................................ 17 3.6. Obtenção de células do pulmão, do baço e dos linfonodos ............................... 18 3.6.1. Pulmão .......................................................................................................................................... 18 3.6.2. Baço ................................................................................................................................................ 18 3.7. Cultura de células de pulmão ...................................................................................... 19 3.8. Quantificação de populações celulares no pulmão ............................................. 19 3.8.1. Marcação Extracelular ............................................................................................................ 19 3.8.2. Marcação intracelular ............................................................................................................. 20 3.8.3. Detecção intracelular de citocinas .................................................................................... 20 3.9. Avaliação da expressão gênica ................................................................................... 22 3.9.1. Extração de RNA ....................................................................................................................... 22 3.9.2. Preparação de cDNA ............................................................................................................... 22 3.9.3. Quantificação da expressão de genes por PCR em tempo real (RT-‐PCR) ........ 23 3.10. Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de citocinas e quimiocinas ............................................................................................................................... 24 3.11. Separação de células T efetoras e Treg ................................................................. 25 3.12. Ensaio de supressão da proliferação celular pelas células Treg .................. 26 3.13. Isolamento e transferência de células Foxp3-‐GFP+ ........................................... 26 3.14. Análise histopatológica .............................................................................................. 27 3.15.Análise estatística .......................................................................................................... 27 4. RESULTADOS ............................................................................................................ 29 4.1. Avaliação da expressão de CCR4 e das quimiocinas CCL17 e CCL22 no pulmão de animais infectados ou não .............................................................................. 29 4.2. Avaliação do número de bacilos em diferentes tempos de infecção em animais WT e CCR4-‐/-‐ .............................................................................................................. 31 4.3. Avaliação de células Treg no pulmão de animais CCR4-‐/-‐ .................................. 32 4.4. Razão e correlação de células CD4+ e células CD4+Foxp3+ ................................ 34 4.5. Avaliação da inflamação pulmonar na ausência de CCR4 ................................. 36 4.6. Detecção dos ligantes de CCR4 no pulmão de animais CCR4-‐/-‐ ........................ 38 4.7. Quantificação de células dendríticas e macrófagos no pulmão ...................... 39 4.8. Quantificação da expressão de genes característicos de macrófagos M1 e M2
....................................................................................................................................................... 41 4.9. Avaliação de células NK1.1+ em animais CCR4-‐/-‐ infectados ............................. 42 4.10. Quantificação de células CD8+ ativadas no pulmão de animais CCR4-‐/-‐ ..... 43 4.11. Análise da expressão dos diferentes fatores de transcrição ......................... 44 SUMÁRIO
4.12. Quantificação da expressão de genes de receptores de quimiocinas envolvidos no recrutamento de células Th1 .................................................................. 45 4.13. Quantificação de citocinas no pulmão ................................................................... 46 4.14. Avaliação de células CD4+ produtoras de IFN-‐γ, IL-‐4, IL-‐17 ou IL-‐10 .......... 48 4.15. Correlações entre número de UFC, células CD4+IFN-‐γ+, CD4+Foxp3+, CD4+Tbet+ ................................................................................................................................... 49 4.16. Análise da expressão de receptores de inibição nas células T CD4+Foxp3+
....................................................................................................................................................... 50 4.17. Análise da função supressora das células CD4+CD25+ ..................................... 53 4.18. Análise da susceptibilidade de animais CCR4-‐/-‐ que receberam transferência de células Foxp3+ de animais WT ........................................................... 55 8. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 58 9. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 68 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 69 8. ANEXO ......................................................................................................................... 82 INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
Após mais de 100 anos da descoberta do agente etiológico da tuberculose
(TB), Mycobacterium tuberculosis, pelo pesquisador Robert Koch, a infecção
provocada por esse patógeno ainda acarreta as maiores taxas de morbidade e
mortalidade no mundo, perdendo apenas para as infecções com o vírus da
imunodeficiência humana (HIV, Human Immunodeficiency Virus). O bacilo M.
tuberculosis é uma bactéria aeróbica que apresenta capacidade de multiplicação em
ambientes com baixa tensão de oxigênio. É considerada uma bactéria Gram+ por
possuir apenas uma membrana plasmática, mas sua parede apresenta características
bem peculiares devido a presença de 60% de lipídeos, incluindo lipoarabinomananas
(LAM) e ácidos micólicos. Essa constituição da parede celular do M. tuberculosis faz
com que quando essas micobactérias são coradas por coloração Gram não ocorra a
descoloração se álcool-ácido for adicionado, caracterizando-o como um bacilo álcoolácido resistente (BAAR) (1-3).
As formas clínicas da TB podem ser divididas em pulmonares e
extrapulmonares. O bacilo M. tuberculosis pode disseminar para órgãos sem ser o
pulmão, incluindo linfonodos, ossos e meninges, causando doença extrapulmonar.
Porém, a forma clínica predominante é a pulmonar acometendo 70% dos casos de TB
(4, 5). A maioria dos indivíduos infectados com M. tuberculosis desenvolve resposta
imunológica eficiente, com inibição do crescimento do bacilo, resultando em infecção
latente, com a bactéria persistindo em estado de dormência (6). Estima-se que um
terço da população mundial possui infecção latente e aproximadamente 5 a 10%
dessas pessoas desenvolverão a doença ativa (7). O risco de desenvolver TB é bem
maior em indivíduos portadores de outras imunodeficiências, como a síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS – Acquired Immunodeficiency Syndrome) e em
condições que afetam o sistema imunológico, como diabetes e desnutrição, o que
indica que a imunidade atua de forma a suprimir a infecção por M. tuberculosis (6).
Além disso, as últimas estimativas apontam que houve 9 milhões de novos casos de
TB em 2013 e 1,5 milhões de mortes pela doença no mundo (8). No Brasil, foram
notificados 83.310 mil novos casos de TB em 2013. Entretanto esse número deve ser
maior, pois existe uma porcentagem de casos não notificados (8).
O controle global da TB tem sido prejudicado pela falta de vacina efetiva, pelo
surgimento de cepas resistente à drogas e pela falta de diagnóstico rápido e sensível
1 INTRODUÇÃO
(9, 10). O método mais comum para o diagnóstico da TB é a microscopia de escarro e
a vacina utilizada é a BCG (Bacilo de Camette-Guérin), que previne a doença na
infância, porém, é ineficaz para combater a forma pulmonar em adultos. O tratamento
da doença, que consiste na utilização de um coquetel de drogas por, no mínimo, 6
meses (8) é frequentemente abandonado pelos pacientes. Além disso, mesmo quando
o tratamento não é abandonado, muitos pacientes apresentam prejuízo respiratório
permanente, apesar de terem sido curados da infeção (11, 12). Dessa forma, torna-se
clara a necessidade de avanço em nosso conhecimento sobre a doença, sobre os
fatores envolvidos na interação do patógeno com o hospedeiro, e sobre a biologia do
bacilo com a finalidade de desenvolver terapias direcionadas ao hospedeiro.
1.1. Resposta imunológica na TB
A infecção por M. tuberculosis é adquirida pela inalação de aerossóis
contendo bacilos expelidos durante espirros ou tosse de pacientes com TB pulmonar
ativa. Cada pessoa infectada que desenvolve a doença e não é tratada pode transmitila para cerca de 10 a 14 pessoas por ano (5).
A resposta imunológica inata mediada por macrófagos alveolares residentes
dirige os eventos iniciais da infecção por M. tuberculosis, o que resulta na ativação de
inflamassoma, produção de citocinas e início de mecanismos de defesa incluindo
produção de peptídeos antimicrobianos e espécies reativas de oxigênio (ROS –
Reactive Oxygen Species) (13, 14). Células dendríticas, neutrófilos, células epiteliais,
células natural killer (NK), NKT e células Tγδ do sistema imunológico também
participam dessa resposta (15-17). Para alguns indivíduos, que apresentam teste de
pele negativo para tuberculina, apesar da exposição prolongada ao bacilo M.
tuberculosis, a resposta imunológica inata pode ser suficiente para prevenir a infecção
(18). Entretanto, na maioria dos casos, a resposta inata não é suficiente para controlar
a infecção, a qual deve ser contida pela resposta imunológica adaptativa.
Os macrófagos e as células dendríticas identificam os bacilos por meio de
receptores de reconhecimento de padrões (PRRs, Pathogen Recognition Receptors),
como
TLR
(Toll-Like
Receptors)
2,
TLR9,
NOD
(Nucleotide
binding
Oligomerization-Domain) 2 que interagem com padrões moleculares associados ao
patógeno (PAMPs – Pathogen-Associated Molecular Patterns) (15, 19-23). O
2 INTRODUÇÃO
reconhecimento dos respectivos ligantes por TLR e NOD promove a transcrição de
genes que codificam as citocinas proinflamatórias IL(interleucina)-1, IL-6, TNF
(Tumor necrosis factor), quimiocinas, além da secreção de IL-12. Leucócitos
circulantes, dentre eles, neutrófilos e monócitos, são recrutados em decorrência da
resposta inflamatória, aumentando o aporte de células da imunidade inata, e
consequentemente, suas funções (5). Neutrófilos auxiliam na resposta por meio da
produção da proteína S100 e da transferência de grânulos, contendo agentes
antimicrobianos, para endossomos de macrófagos, onde se encontram as
micobactérias (24, 25).
Citocinas são importantes mediadores solúveis apresentando diferentes
funções durante a resposta imunológica na TB. Enquanto IL-12, IL-1β, IL-6, TNF e
IFN-γ (interferon-gamma) estão mais relacionadas ao controle da infecção (26-31).
IL-4, IL-10 e TGF-β (transforming growth factor beta) estão associadas com a
progressão da mesma (2, 32, 33). O papel das citocinas IL-23/IL-17, IL-22 e IFNs do
tipo I (IFN-α/β) ainda não está totalmente entendido (34-36).
Outros mediadores solúveis que participam da resposta imunológica durante a
TB são as PG (prostaglandinas) E2 e LXA4 (lipoxina A4). A indução de morte celular
por necrose por LXA4, causa lise celular e está relacionada com a disseminação do
bacilo, enquanto que a indução de apoptose por PGE2, está associada com a
diminuição da viabilidade do patógeno e aumento da resposta imunológica (37).
A ativação da imunidade inata é acompanhada pela migração de células
dendríticas para os linfonodos da região do mediastino e indução da imunidade
adaptativa. O balanço de citocinas pro e anti-inflamatórias produzidas por macrófagos
e células dendríticas no início da infecção depende de diversos fatores, como o
número de bacilos infectantes, o background genético do hospedeiro, polimorfismos
genéticos, populações de macrófagos e células dendríticas, densidade de PRRs nas
células e PAMPs em M. tuberculosis. Todos esses fatores, provavelmente, interferem
no estabelecimento da infecção latente ou crônica e são determinantes na indução da
resposta Th (T helper) 1 ou Th17, na magnitude dessa resposta e na presença ou não
de acentuada resposta de células Th2 e de células Treg (T reguladoras).
A resposta de células Th1 ocorre pela produção de IFN-γ e quimiocinas como
CCL5 (ou RANTES – Regulated on Activation Normal T Cell Expressed and
Secreted) e CXCL10 (ou IP-10 – Inducible Protein-10) que facilitam o recrutamento
3 INTRODUÇÃO
dessas células para o pulmão via CCR5 e CXCR3, respectivamente (38-40). O IFN-γ
desencadeia mecanismos antibacterianos em macrófagos por meio da ativação de
JAK1 (Janus Kinase 1), fosforilação de STAT1 (Signal Transducer and Activator of
Transcription 1) e produção de ROS (41). Geralmente, a produção de IFN-γ é mais
intensa no início da infecção, sendo modulada negativamente com a progressão da
doença (20, 42, 43). A importância da resposta via IFN-γ torna-se evidente em
indivíduos com mutação no gene do receptor dessa citocina, o que acarreta
susceptibilidade à infecção por M. tuberculosis e outros patógenos intracelulares (44).
Além disso, a produção de IFN-γ pelas células CD4+ Th1 induz a diferenciação de
macrófagos ativados classicamente (M1) que exercem funções microbicidas pela
produção de enzimas proteolíticas, ROS e intermediários reativos de nitrogênio (45).
Ao contrário, macrófagos ativados alternativamente, também descritos como
M2, diferenciam-se na presença das citocinas IL-4 e IL-13 (46). Eles atuam no
controle da inflamação, por reduzirem a produção de citocinas proinflamatórias, como
IL-1β, e promoverem reparo tecidual (47). A IL-4 é capaz de aumentar a expressão da
enzima arginase-I nos macrófagos, a qual compete com a enzima iNOS (Inducible
Oxide Syntase) pela arginina, impedindo a produção de NO (Nitric Oxide). Dessa
forma, macrófagos M2 prejudicam a imunidade contra patógenos intracelulares, como
M. tuberculosis (48-50), mas protegem o hospedeiro do dano tecidual. Nesse
contexto, as células T CD4+ de padrão Th2, que secretam IL-4, IL-5 e IL-13, são
associadas com suscetibilidade e encontram-se exacerbadas em pacientes com TB
ativa (51-53). Infecções por helmintos, caracterizadas por respostas Th2, representam
fator associado ao desenvolvimento e exacerbação da TB em países em
desenvolvimento (54). A IL-4 também inibe a secreção das citocinas IL-1α e IL-18 e
a autofagia (55) que é um mecanismo, atualmente, associado à proteção na infecção
experimental (56). Além disso, a IL-4 é classicamente descrita como mediador que
regula negativamente a resposta Th1 (53). Assim, as células do padrão Th2 estão
relacionadas com a modulação negativa da resposta celular protetora contra M.
tuberculosis.
As células Th17 contribuem para o recrutamento de linfócitos T CD4+ do
padrão Th1 para o pulmão de animais infectados com M. tuberculosis (57) e,
portanto, parecem estar associadas com proteção na infecção. Resultados do nosso
grupo também sugerem que as células Th17 apresentam papel protetor na TB. A
4 INTRODUÇÃO
proteção conferida pela imunização heteróloga com BCG-CFP/CpG (proteína de
filtrado de cultura/oligodeoxinucleotideos) foi associada com altos níveis de IFN-γ e
IL-17 e reduzida produção de IL-4 (58). Porém, em excesso, as células Th17 podem
induzir lesão tecidual em decorrência do acúmulo de neutrófilos e células Th1,
produção de ROS, NO, enzimas proteolíticas e indução de necrose (59).
Enquanto os linfócitos T CD4+ possuem uma função bem estabelecida, o papel
do linfócito B no controle da infecção é controverso. Existe relato de que as células B
facilitam a disseminação da bactéria para outros órgãos, sem afetar a carga bacilar
(60), assim como, reduzem a imunopatologia e o influxo de neutrófilo favorecendo o
bacilo (61). Por outro lado, a produção de anticorpos contra polissacarídeos, como o
LAM, podem favorecer o reconhecimento do bacilo e aumentar a proteção na TB
(62). Diante desses resultados contraditórios, não é possível determinar um papel para
as células B na resposta imunológica durante a TB. Da mesma forma, pouco se sabe
sobre a função mediada por linfócitos Tγδ e células NKT na resposta imunológica
contra M. tuberculosis (61, 63-65).
A TB é caracterizada como doença que cursa com estimulação crônica da
resposta imune decorrente da persistência antigênica. Nesse contexto, a interação
contínua das populações de linfócitos com macrófagos e células dendríticas resulta na
formação de granulomas. O granuloma humano é constituído por área central de
macrófagos infectados que se diferenciam em células gigantes multinucleadas, células
epitelióides, além dos macrófagos espumosos, rodeados por linfócitos recrutados com
a participação de citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão (16, 17, 66, 67). Além
dos leucócitos, fibroblastos constituem uma cápsula fibrótica externa, característica
dos granulomas (68). Essa estrutura não se apresenta tão bem definida no pulmão de
camundongos infectados. Esses animais formam estruturas que se assemelham aos
granulomas humanos, porém, sem necrose caseosa. São estruturas mais relacionadas
com a formação de infiltrados ao redor de brônquios e vasos. O granuloma limita o
ambiente tóxico, protegendo o tecido alveolar ao redor, ao mesmo tempo que dificulta
a disseminação da bactéria para o restante do pulmão (69). Por outro lado, os
mediadores inflamatórios produzidos no granuloma destroem o tecido adjacente e
podem levar à necrose da região central, o que acarreta na formação de cavidade com
perda funcional. Dessa forma, dois papéis contraditórios são atribuídos ao granuloma:
5 INTRODUÇÃO
proteção ou disseminação da infecção extracelular com concomitante dano pulmonar
(66, 67).
Apesar dos mecanismos efetores relacionados com eliminação ou restrição da
carga bacteriana, o bacilo evade da resposta imunológica por meio do bloqueio da
fusão e acidificação do fagolisossoma, produção de compostos que tornam ROS e
RNI menos tóxicos, e inibição parcial da produção IFN-γ por macrófagos infectados
(70, 71). Para evitar o dano tecidual extenso como consequência da infecção
persistente, mecanismos reguladores são imprescindíveis. van der Wel
1.2. Células T reguladoras
Durante a resposta imunológica contra patógenos vários mecanismo de
regulação são desencadeados com a finalidade de conter o patógeno causando o
menor dano possível para o hospedeiro. O próprio antígeno por si só regula o sistema
imunológico pela sua permanência, quantidade, natureza e via de entrada no
organismo. A habilidade do antígeno em estimular células apresentadoras de
antígenos (APCs – Antigen-Presenting Cell) interfere na forma com que essas células
irão apresenta-los para as células T. Expressão de poucos coestimuladores como B7 e
CD40, na superfície das APCs prejudica a ativação via CD28 e CD40L,
respectivamente, das células T (72-74). Por outro lado, os receptores da superfície de
APCs ativadas podem induzir vias de sinalização como o CTLA-4 (Cytotoxic TLymphocyte Antigen 4)/B7 e PD (Programmed Death 1)-1/PD-1L levando à inibição
de respostas imunológicas (75, 76). Além disso, a resposta de diferentes subtipos de
células T podem regular uma a outra por meio da produção de citocinas, por exemplo,
o IFN-γ produzido pelas células Th1 inibe o desenvolvimento de células Th2 (77-79).
Um grande avanço no entendimento do sistema imunológico foi a descoberta
de células T reguladoras (Treg), com fenótipo CD4+Foxp3+, como um grupo distinto
de células T que apresentam funções supressoras (80, 81). O fator de transcrição
Foxp3 é a assinatura definitiva das células Treg em camundongos (82), mas sua
expressão pode ser transitória células T humanas. Além disso, as células Treg
expressam constitutivamente a cadeia α do receptor da IL-2 (CD25), caracterizando
essa molécula como um marcador dessas células (82). Células Treg também
expressam CTLA-4, PD-1, GITR (glucocorticoid-induced TNFR family-related
6 INTRODUÇÃO
protein), ICOS (Inducible Coestimulator), OX40, CD39 e CD73 (82, 83). Entretanto,
essas moléculas não são marcadores específicos das células Treg.
As células Treg podem inibir respostas imunológicas por meio da produção
de citocinas como IL-10 e TGF-β (84, 85) e por contato direto com outras células. A
interação dos receptores de inibição expressos nas células Treg como o CTLA-4, PD1, GITR e ICOS com seus respectivos ligantes em células alvo, induz a supressão
e/ou morte da células (72-74, 76, 86, 87).
Além das células Treg CD4+CD25+Foxp3+, que são as mais conhecidas e
estudadas, existem outras populações de células Treg denominadas reguladoras do
tipo 1 (Tr1) e Th3. Essas células secretam IL-10 e TGF-β, respectivamente, após
interação com o antígeno, sendo capazes de inibir as respostas Th1 e Th2 (88-90).
Elas ainda, se diferenciam em in vivo e in vitro após estimulação repetida e na
presença de células dendríticas tolerogênicas (91-94).
As células Treg desempenham funções dicotômicas. Enquanto elas limitam a
magnitude de respostas efetoras, que pode facilitar a replicação e persistência do
patógeno, elas também limitam o dano tecidual causado pela vigorosa resposta
imunológica contra o patógeno (95). Células Treg apresentam um papel crucial em
infecções crônicas, nas quais as células Treg são necessárias para regular a constante
resposta imunológica gerada pelo hospedeiro e prevenir inflamação excessiva. Isso foi
evidenciado em modelo experimental de infecção com Pneumocystis pneumonia, no
qual as células Treg limitaram a inflamação e lesão pulmonar (96). Células Treg
também previnem o dano tecidual do fígado em infecção crônica com Schistosoma
mansoni (97). Apesar da TB ser uma doença crônica, as células Treg estão mais
associadas com aumento da persistência do patógeno (98, 99), porém seu papel em
limitar o dano tecidual durante a TB não está totalmente claro.
Em 2006, dois grupos mostraram aumento na frequência de células Treg
CD4+CD25+ ou CD4+Foxp3+ no sangue periférico de pacientes com TB (100, 101).
Logo em seguida, foi demonstrado que durante a resposta imunológica contra M.
tuberculosis as células T CD4+CD25+Foxp3+ suprimem a produção de IFN-γ pelas
células Th1 ex vivo (102). Um estudo demonstrou que crianças infectadas com TB
apresentam altas quantidades de células T CD4+Foxp3+ na lesão de granuloma e
existiu uma correlação inversa entre as células T CD4+Foxp3+ e células T CD8+ (103).
As mesmo tempo, estudos em camundongos demonstraram que as células T
CD4+Foxp3+ previnem o eficiente controle do bacilo M. tuberculosis (99). Além
7 INTRODUÇÃO
disso, foi demonstrado a presença de células Treg no granuloma em modelo
experimental de TB, além de acúmulo dessas células nos linfonodos drenantes do
pulmão e dentro do próprio órgão em uma taxa similar à de células T efetoras. A
depleção dessas células nos camundongos resultou em menor número de bacilos no
pulmão (104). A expansão das células Treg após a infecção com M. tuberculosis
requer a expressão de PD-1 e seu ligante, PD-L1, em células dendríticas. Essa
interação induz a sinalização por meio da molécula CISH (Cytokine Inducible SH2containing protein), que por sua vez, induz a expansão de células Treg CCR4+ (105).
Uma vez que houve a expansão das células Treg, a migração de células T
CD4+ e T CD8+ efetoras para o pulmão é atrasada, o que prolonga a fase inicial da
expansão bacteriana (106). Esses relatos de acúmulo de células Treg no pulmão
sugerem que as células Treg atuam localmente suprimindo a ativação da resposta
imunológica e favorecem a sobrevivência da bactéria. No entanto, estratégias de
depleção de células Treg na clínica precisam ser avaliadas cuidadosamente, pois a
depleção de células Treg por meio da administração de anticorpo anti-CD25 melhora
a resposta protetora das células Th1, mas não demonstra efeito na eliminação do
patógeno (107, 108).
Nosso grupo também demonstrou que as células Treg podem representar fator
de susceptibilidade na TB, pois camundongos BALB/c infectados exibiram menor
magnitude de resposta Th1 e Th17, maior número de bacilos no pulmão e células
Treg mais supressoras quando comparados aos camundongos C57BL/6 (43).
Recentemente, Shafiani e colaboradores demonstraram que o M. tuberculosis induz
expansão robusta de células Treg antígeno-específicas no início da infeção (3
semanas), mas, em seguida, as células Treg são eliminadas, em parte pela indução de
IL-12 dependente da expressão intrínseca de Tbet (Th1 cell promoting transcription
fector) nessas células. No entanto, a indução da resposta Th1 não resultou em
diminuição da carga bacilar (109). Se as vias que induzem a expansão inicial de
células Treg forem compreendida, novas intervenções farmacológicas para indivíduos
recém-expostos ao bacilo M. tuberculosis podem ser desenvolvidas para acelerar a
resposta de células T efetoras no início da infecção, proporcionando melhor controle
da infecção pelo hospedeiro.
Por outro lado, células Treg apresentam uma função importante em limitar
respostas inflamatórias, uma vez que respostas de células T não controladas podem
ser prejudiciais em infecções crônica como a TB (95). Animais deficientes para PD-1
8 INTRODUÇÃO
(PD-1-/-) exibem elevados número de células T CD4+ específicas para M. tuberculosis
e aumento na produção de IFN-γ, TNF, IL-1, IL-6, mas isso não foi suficiente para
controlar a infecção, visto que os animais PD-1-/- foram mais susceptíveis à infecção
por M. tuberculosis. A depleção de células T CD4 reduziu a carga bacteriana
observada nos animais PD-1-/- (110). Além disso, as células Treg estão elevadas em
animais resistentes, C57BL/6 e BALB/c, comparados com animais susceptíveis,
DBA/2 (111).
Em síntese, o equilíbrio entre número e frequência de células Treg e células T
efetoras deve ser determinante para controlar tanto a replicação da carga bacteriana
quanto a magnitude da inflamação e o dano pulmonar. Isso também pode ser ilustrado
com os trabalhos que investigaram a indução de células Treg em esquemas de
imunização. Tais estudos mostram que a indução de células Treg como consequência
de esquemas de imunização reduzia a função efetora de células T e a eficácia de
proteção vacinal (112-115). Isso também foi descrito para a vacinação experimental
com BCG (116). Nosso grupo também mostrou que a eficácia protetora de diferentes
vacinas testadas contra a TB experimental dependia da razão de células
CD4+/CD4+Foxp3+ (117).
É nesse contexto que o equilíbrio entre populações de linfócitos T CD4+
revela-se determinante para estimular mecanismos microbicidas e também para
regular a resposta inflamatória, simultaneamente. Esse é um ponto crucial para se
compreender melhor a resposta imunológica e a inflamação na TB: o limiar da
resposta protetora versus resposta deletéria decorrente da ativação crônica de
macrófagos M1 e linfócitos Th1 e Th17. Pacientes imunocompetentes que
desenvolvem TB ativa elaboram excessiva resposta inflamatória, caracterizada por
reação de hipersensibilidade do tipo IV e formação de granulomas. Porém,
dependendo dos mediadores produzidos nos granulomas e da magnitude da resposta
inflamatória, os mesmos podem facilitar a expansão da infecção em decorrência da
lesão do parênquima pulmonar e liberação de bacilos no meio extracelular (66).
1.3. Receptor de Quimiocina 4 (CCR4)
As quimiocinas representam uma família de mediadores de baixo peso
molecular, classificadas em 4 subfamílias baseadas na região N-terminal de motivos
conservados de cisteína: CXC, CC, C e CX3C. São conhecidas, pelo menos, 44
9 INTRODUÇÃO
quimiocinas para seres humanos. Dentre os receptores de quimiocinas conhecidos,
todos apresentam uma estrutura de sete α hélices transmembrana (hepta-helicoidal)
(40, 118, 119).
A função primária das quimiocinas e seus receptores é regular a migração
celular em condições fisiológicas ou patológicas, como migração de linfócitos durante
a homeostase, processos inflamatórios, reparo tecidual, angiogênese e câncer (40,
118). A interação das quimiocinas aos respectivos receptores não é altamente
específica.
O receptor de quimiocina 4 (CCR4) reconhece duas quimiocinas: CCL17 (ou
TARC – Thymus Activated-Regulated Chemokine) e CCL22 (ou MDC –
Macrophage-Derived Chemokine), ambas envolvidas com o desenvolvimento de
células T e recrutamento dessas células para sítios inflamatórios (120, 121). Células T
naive não expressam CCR4. Inicialmente, CCR4 foi relatado como marcador de
células Th2, sendo, posteriormente, descrito em plaquetas, células NK, NKT,
macrófagos, basófilos, eosinófilos e células dendríticas (122).
A expressão de CCR4 é importante para a migração de células T para o
pulmão. Células T deficientes para a expressão CCR4 (CCR4-/-) falharam em migrar
para o pulmão e proteger contra infecção por influenza (123).
Como foi descrita a expressão predominante de CCR4 nas células Th2 e seu
papel na migração celular para o pulmão, esse receptor foi estudado em doenças
alérgicas experimentais, como asma, dermatite atópica e na pneumonia eosinofílica
(124-129). Vários trabalhos indicam elevadas concentrações de CCL17 e CCL22 no
sangue de pacientes com doenças alérgicas, como dermatite atópica, asma e rinite
alérgica (130-133). Além disso, o bloqueio das quimiocinas CCL17 e CCL22 por
anticorpos específicos resultou na prevenção da hiper-reatrividade das vias aéreas e
atenuação da eosinofilia (134, 135). Atualmente, CCL17 é considerado biomarcador
disponível para monitorar atividade da doença durante a terapia da dermatite atópica
(136).
Além das células Th2, a expressão de CCR4 também está associada com
recrutamento de células Treg, especialmente para o pulmão (123, 126). Em 2001, foi
demonstrado que, em condições homeostáticas, células Treg CD4+CD25+ do sangue
periférico expressavam especificamente CCR4 e CCR8 (137). Células dendríticas
maduras parecem atrair preferencialmente as células Treg por meio da produção de
CCL17 e CCL22 (105, 137). Esses resultados sugerem que CCR4 pode guiar células
10 INTRODUÇÃO
Treg para os órgãos linfoides secundários e tecidos inflamados para atenuar ativação
de células T (137). Posteriormente, foi descrito que aproximadamente 20% da
população de células T CD4+CCR4+ apresentavam fenótipo de células Treg
(CD4+CD25+CCR4+) (138). Em estudo recente, Faustino et al. mostraram que CCR4
era necessário para a migração de células Treg para o pulmão em modelo de alergia
experimental. Animais deficientes para a expressão de CCR4-/- apresentaram aumento
da inflamação Th2 nas vias aéreas comparados com animais WT, sendo a
transferência de células T CD4+CD25+CCR4+ associada com atenuação da resposta
Th2 (126).
Além de contribuir significativamente para a migração das células Treg, CCR4
parece participar da função dessas células. Em 2009, foi demonstrado que a ausência
de CCR4 estava associada com redução da expressão da enzima IDO (indoleamine
2,3-dioxygenase) nas células dendríticas do linfonodo mesentérico, resultante de falha
na interação de CTLA-4 com B7, como consequência da migração deficiente de
células Treg (139).
A questão que permanece é se CCR4 participa equivalentemente da migração
de células Th2 e células Treg. Em modelo de osteólise inflamatória desencadeada por
infecção
com
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans,
animais
CCR4-/-
apresentaram discreta redução da migração de células Th2, com redução mais
acentuada da migração de células Treg, A transferência adotiva de células Treg
CCR4+ para esses animais reverteu a gravidade da doença (140).
Por outro lado, a expressão de CCR4 em células Treg está associado com
progressão de tumor em diferentes tipos de câncer como melanoma e carcinoma de
pulmão, proporcionando perspectivas para terapias alternativas utilizando pequenas
moléculas antagonistas de CCR4 (138, 141-145). Pacientes com carcinomas ovariano
apresentam redução na resposta antitumoral, mediada por células Treg Foxp3+CCR4+,
recrutadas para o tumor como resultado da produção de CCL17 e CCL22 (146). Além
disso, já está bem estabelecido a associação negativa de CCR4 em neoplasmas como
linfoma/leucemia de células T em adultos (ATL - adult T-cell leukemia/lymphoma) e
linfomas de célula T cutâneo (CTL - cutaneous T-cell lymphomas) (147, 148), devido
a migração de células Treg para o local favorecendo o crescimento tumoral.
Na clínica tem sido testado o uso de um anticorpo monoclonal contra CCR4,
o KW0761 ou Mogamulizumab. Entretanto, seu uso causa duplo efeito, enquanto
aumenta a atividade antitumoral, ele pode também aumentar o risco de efeitos
11 INTRODUÇÃO
adversos imunomediados, como o desenvolvimento de Síndrome de Steven Johnson,
devido a ausência de células Treg CCR4+ (149-151). Isso aumenta a preocupação da
aplicação de Mogamulizumab em doenças alérgicas, porém, mesmo assim, existe um
estudo clínico em fase I do uso de Mogamulizumab para asma no Estados Unidos
(152).
1.3.1 Receptores de quimiocina na TB
Após a infecção por M. tuberculosis ocorre rápida expressão dos receptores de
quimiocinas CCR4, CCR5 e CXCR3, detectáveis 2 horas após a infecção (153).
Dentre os receptores de quimiocinas estudados na TB, já está descrito que o CCR2
tem papel essencial no início da resposta imunológica e no controle da infecção por
M. tuberculosis. Animais deficientes para CCR2 (CCR2-/-) sucumbiram poucos dias
após a infecção e apresentaram elevada carga bacteriana no pulmão comparado aos
animais WT. Além disso, os animais CCR2-/- exibiram defeito inicial no recrutamento
de macrófagos e defeito tardio no recrutamento de células dendríticas e células T para
o pulmão (154, 155).
A formação do granuloma logo após infecção por M. tuberculosis em animais
deficientes para CXCR3 ou em animais selvagens tratados com anti-CXCL9 (ou MIG
- Monócito Induzido por IFN-γ), um dos ligantes desse receptor, foi fortemente
reduzida em termos de número de células, tamanho e densidade quando comparados
aos animais WT. Esse atraso na formação do granuloma ocorria, principalmente,
devido à diminuição do recrutamento de neutrófilos. Porém, não havia diferença na
carga bacteriana entre os animais (156). Em modelo de infeção com Mycobaterium
marinum em zebrafish, a ausência de CXCR3 limitou a disseminação da micobactéria
mediada por macrófagos (157).
O ligante de CXCR5, a quimiocina CXCL13, é constitutivamente expressa em
órgão linfoides secundários, direcionando células B CXCR5+ e células T CXCR5+
dentro dos folículos linfoides (158). Células T CD4+CXCR5+ apresentam um papel
protetor na TB, como indicado pelo maior número de bacilo recuperado a partir do
pulmão de animais deficientes para CXCR5 (159).
A expressão de CCR5 durante a TB está associada com mecanismo de evasão
induzido pelo M. tuberculosis. Após a infecção, os macrófagos aumentam a expressão
de CCR5 e induzem a produção de IL-10, que prejudica a apresentação de antígeno
12 INTRODUÇÃO
por reduzir a expressão de MHC (major histocompatibility complex) II. O
silenciamento de CCR5 por meio de RNA de interferência, bloqueia esses eventos de
imunossupressão e restaura a resposta imunológica contra M. tuberculosis (160).
Durante a resposta imunológica na TB, a expressão de CCR4 é aumentada
(153), porém seu papel nessa patologia ainda não foi avaliado. Sabe-se que em
modelo de sensibilização com Mycobacterium bovis e desafio com PPD (derivado de
proteína purificada) mais adjuvante completo de Freund, animais CCR4-/- apresentam
redução no tamanho do granuloma pulmonar e diminuição nos níveis de IFN-γ,
atribuindo um requerimento da expressão de CCR4 para sustentar resposta do tipo
Th1 à antígenos micobacterianos. Porém, a transferência de células T CD4+CCR4+
para esses animais falharam em reconstituir formação normal do granuloma,
sugerindo o envolvimento de outras populações celulares expressando CCR4+ (161).
Além disso, foi demonstrado que CCR4 é requerido para ativação ótima de
células NK em modelo de infecção com M. bovis. A ausência da expressão de CCR4
não afetou o recrutamento das células NK1.1+, mas diminuiu a produção de IFN-γ por
essas células, diminuindo o controle do crescimento do bacilo na fase inicial da
infecção. Durante a fase tardia da infecção (50 dias) por M. bovis, animais CCR4-/apresentaram redução de células T CD4+ produtoras de IFN-γ e IL-17 comparado com
animais WT, sugerindo que CCR4 sustenta resposta de células Th1 e Th17 no pulmão
(162).
Embora os trabalhos descritos acima avaliaram o papel de CCR4 em células
Th1 e NK, já está bem estabelecido a necessidade da produção de CCL17 e CCL22
no recrutamento de células Treg para o pulmão, via receptor CCR4. Sabendo disso
nós utilizamos animais CCR4-/- para avaliar o papel das células Treg durante a fase
crônica da infecção (70 dias).
Como células Treg estão associados com progressão da TB por atrasem a
chegada de células T efetoras no pulmão (106), nossa hipótese inicial era que a
deficiência de CCR4 reduziria o recrutamento de células Treg para o pulmão dos
animais infectados com M. tuberculosis, permitindo o aumento de respostas de células
T efetoras, incluindo Th1, com maior produção de IFN-γ e controle do crescimento
bacteriano.
13 OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliar a influência do receptor de quimiocina CCR4 na migração e função de
células Treg em animais infectados com M. tuberculosis e sua consequência no
desenvolvimento da doença.
2.2. Objetivos específicos
o Avaliar o papel de CCR4 em resposta imunológicas inatas e adaptativas
durante a TB;
o Avaliar capacidade supressora de células Treg que não expressam CCR4;
o Avaliar se a transferência de células Treg competentes para animais CCR4-/influência o desenvolvimento da TB nesses animais.
14 MATERIAIS E MÉTODOS
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Camundongos fêmeas, SPF (Specific Pathogen Free) C57BL/6, deficientes
para a expressão do receptor CCR4 (CCR4-/-), com background genético C57BL/6,
com idade entre 6-8 semanas foram fornecidos pelo Biotério de Animais Isogênicos e
pelo Centro de Criação de Camundongos Especiais da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Os animais transgênicos Foxp3-GFP+,
também com background genético C57BL/6, foram gentilmente cedidos pelo
laboratório do Dr. Alexander Rudensky (163). Os animais infectados com
Mycobacterium tuberculosis foram mantidos dentro de isoladores em laboratório
nível III de biossegurança, adequado para a manipulação de animais infectados com
esta micobactéria, com livre acesso à água e ração. Todos os procedimentos
realizados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (Protocolo nº
135/2012).
3.2. Preparação do inóculo de Mycobacterium tuberculosis
A preparação do inóculo de M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) para
infecção foi realizada a partir de uma alíquota de micobactérias congelada à -70ºC
(com viabilidade superior a 85%). Mil microlitros (µL) dessa alíquota foram
distribuídos em 2,5 mL de meio Middlebrook 7H9 (BD Bioscience, Franklin Lakes,
NJ, USA) enriquecido com 10% de OADCTM (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ,
USA), seguindo-se incubação por 10 dias, a 37ºC. A suspensão de micobactérias
obtida foi centrifugada a 3220 x g por 20 minutos. O sedimento foi ressuspenso em 1
mL de PBS estéril/livre de endotoxinas e agitado vigorosamente por 4 vezes, durante
20 segundos, em tubo contendo pérolas de vidro, até adquirir aspecto homogêneo. A
viabilidade da cultura foi verificada incubando-se 100 µL desta suspensão de
bactérias com 100 µL de diacetato de fluoresceína (2 µg/mL – Acros Organics, Geel,
Bélgica) e 100 µL de brometo de etídio (10 mg/mL – Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
USA) por 10 minutos a 37ºC. Após incubação, a viabilidade foi determinada com
auxílio de microscópio de fluorescência modelo Aristoplan (Leica Microsystems
GmbH, Wetzlar, Germany). As bactérias viáveis apresentavam coloração verde
enquanto as bactérias mortas coravam-se com a solução de brometo e apresentavam
coloração avermelhada. Suspensões celulares com viabilidade igual ou superior a
85% foram diluídas para determinar sua concentração utilizando como padrão a
Escala de McFarland, como descrito previamente (164, 165).
Para controle da concentração do inóculo, uma alíquota de 100 µL da
suspensão de bactérias foi utilizada para realizar diluição seriada de 100, 1000, 10.000
e 100.000 vezes. Um volume igual a 100 µL de cada uma das diluições foi distribuído
em meio 7H11 (DIFCO Laboratories, Detroit, MI, USA). As placas foram vedadas e
incubadas por 28 dias a 37°C. Após esse período as unidades formadoras de colônia
(UFC) foram contadas com auxílio lupa ZOOM 2000 (Leica Microsystems GmbH,
Wetzlar, Germany). e os números de colônias obtidos foram corrigidos pelo fator de
diluição.
3.3. Infecção intratraqueal
Uma suspensão de M. tuberculosis contendo 1 x 106 bacilos/mL foi usada para
infecção dos camundongos WT e CCR4-/-. Os animais foram previamente
anestesiados com Ketamina Agener 10% (União Química Farmacêutica, SP, Brasil) e
Dopaser (Laboratório Calier S. A., Barcelona, Espanha) a 10% em PBS estéril/livre
de endotoxinas, por via intraperitoneal. Após anestesia, foi realizado procedimento
cirúrgico para exposição da traqueia e cada animal foi infectado por meio da
administração de 100 µL da suspensão inicial, contendo então 1 x 105 bacilos de M.
tuberculosis, utilizando seringa de 1 mL (BD Ind. Cirúr, Curitiba, PR, Brasil). Os
animais foram observados até a volta da anestesia. A eutanásia dos animais para a
realização de procedimentos experimentais foi realizada quinze, trinta e setenta dias
após a infecção.
3.4. Digestão do tecido pulmonar
Os lóbulos medianos e inferiores do pulmão direito de cada animal foram
pesados, cortados em pequenos fragmentos e transferidos para tubo cônico de 50 mL
(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA) contendo 15 mL de solução de meio de
cultura RPMI-1640 contendo 0.5 µg/mL de Liberase (Liberase Blendzyme – Roche,
Indianapolis, IN, USA) e 25 U/mL de deoxiribonuclease (DNAse) I de pâncreas
bovino (Sigma-Aldrich, MO, USA). Em seguida, os tubos foram incubados a 37ºC
sob agitação constante de 250 rpm, durante 30 minutos. Após a digestão, as células
foram dispersas com auxílio de uma seringa de 10 mL (BD Ind. Cirúr, Curitiba, PR,
Brasil) e centrifugadas por 10 minutos a 453 x g a 4ºC. O sedimento celular foi
ressuspenso em 1 mL de RPMI-1640 complementado com 10% de SBF (Soro Bovino
Fetal - Gibco – Invitrogen, Grand Island, NY, USA) para inibir atividade da enzima
liberase.
3.5. Ensaio de Unidades Formadoras de Colônia (UFC)
3.5.1. Pulmão
Para determinar o número de unidades formadoras de colônia, uma alíquota de
100 µL da suspensão celular descrita no item 3.4 foi retirada para realização do
ensaio de UFC. Essa alíquota foi utilizada para realizar diluições seriadas em PBS
estéril de 10, 100, 1.000, 10.000 e 100.000 vezes. Um volume igual a 100 µL das
diluições 100, 1.000, 10.000 e 100.000 vezes foi plaqueado em meio sólido 7H11. As
placas foram vedadas e incubadas a 37oC por 28 dias. Decorrido o período de
incubação, as colônias de micobactérias foram contadas com auxílio de lupa ZOOM
2000 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany). O número de colônias foi
corrigido de acordo com as diluições e expresso em Log10 do número de UFC por
pulmão.
3.5.2. Baço
O baço foi coletado e transferido para placa de Petri de 22 mm de diâmetro
(Corning, NY, USA) estéril, contendo 2 mL de meio RPMI-1640 incompleto
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Com o auxílio do êmbolo de seringa estéril, o órgão
foi macerado para obtenção de suspensão celular homogênea. Uma alíquota de 100
µL dessa suspensão foi utilizada para realizar diluições seriadas em PBS estéril de 10,
100, 1.000 e 10.000 vezes. Um volume igual a 100 µL de cada diluição foi plaqueado
em meio sólido 7H11. As placas foram vedadas e incubadas a 37oC por 28 dias.
Decorrido o período de incubação, as colônias de micobactérias foram contadas com
auxílio de lupa ZOOM 2000 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany). O
número de colônias foi corrigido de acordo com as diluições e expresso em Log10 do
número de UFC por baço.
3.6. Obtenção de células do pulmão, do baço e dos linfonodos
3.6.1. Pulmão
Após a realização do ensaio de UFC descrito acima, 4 mL de meio RPMI
contendo 10% de SBF foram acrescentados às suspensões pulmonares. As células
obtidas foram separadas dos fragmentos de pulmão utilizando um filtro de 100 µm
(Cell Strainer, BD Biosciences, San Jose, California), o qual, posteriormente, foi
lavado com 5 mL de meio RPMI incompleto. O filtrado obtido foi centrifugado a 453
x g, por 10 minutos a 4°C. O sedimento celular resultante foi submetido ao protocolo
de lise de hemácias, adicionando 2 mL de tampão ACK (0,15M de NH4CL, 10 mM
de KHCO3, 0,1Mm de EDTA diluídos em H2O) por 2 minutos, seguido de lavagem
com 10 mL de PBS e centrifugação a 453 x g, por 10 minutos a 4°C. Posteriormente,
o sedimento celular foi ressuspenso em 1 mL de meio RPMI incompleto. A contagem
total de células foi realizada utilizando contador automático Countess™ (Automated
Cell Counter – Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) em uma diluição de 1:10. A
suspensão celular obtida a partir da digestão dos pulmões foi destinadas a diferentes
procedimentos, descritos abaixo.
3.6.2. Baço
Após obtenção da alíquota para realização do ensaio de UFC, a suspensão
celular do baço foi centrifugada a 453 x g, por 10 minutos a 4°C. O sedimento celular
resultante foi submetido ao protocolo de lise de hemácias, adicionando 3 mL de
tampão ACK por 3 minutos, seguindo-se lavagem com 10 mL de PBS, e
centrifugação a 453 x g, por 10 minutos a 4°C. Posteriormente, o sedimento celular
foi ressuspenso em 3 mL de meio RPMI incompleto. A contagem total de células foi
realizada utilizando contador automático Countess™ em uma diluição de 1:100. As
células do baço de animais WT e CCR4-/- foram destinadas ao protocolo de separação
de células T efetoras e reguladoras (item 3.11) e as células do baço de animais Foxp3GFP+ foram destinadas ao protocolo de isolamento e transferência de células Tregs
(item 3.13).
3.7. Cultura de células de pulmão
Em placa de 96 poços (BD, Franklin Lakes, NJ, USA), 5 x 105 células,
obtidas a partir da digestão dos pulmões, foram cultivadas em meio RPMI 1640
contendo 10% de SBF, 10.000 U/mL de penicilina (Gibco, New York, USA), 10.000
µg/mL de estreptomicina (Gibco, New York, USA) e 10 mg/mL de gentamicina
(Gibco, New York, USA), e foram estimuladas com 100 ng/mL de PMA (Phorbol 12Myristate 13 Acetate - Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) e 500 ng/mL de
ionomicina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA). Como controle negativo, as
células foram cultivadas apenas em presença de meio de cultura. Monensina, um
inibidor do transporte de proteína (0,6 µL/mL de GolgiStop™ - BD Biosciences,
Franklin Lakes, New Jersey, EUA) foi adicionada concomitantemente aos estímulos.
As culturas de células de pulmões foram incubadas por 6 horas, a 37ºC em 5% de
CO2.
3.8. Quantificação de populações celulares no pulmão
3.8.1. Marcação Extracelular
Para a realização da fenotipagem das populações de linfócitos T, células
dendríticas, macrófagos e células NK no pulmão, 1 x 106 células foram incubadas a
4°C por 40 minutos com sobrenadante de cultura de células 2.4G2 (contendo
anticorpos anti-FcγRII/III), diluído 1:1. Em seguida, as células foram incubadas com
os anticorpos monoclonais (tabela 1), durante 30 minutos a 4°C, no escuro. Após a
incubação, as células foram lavadas com 2 mL de tampão PBS contendo 2% SBF,
seguindo-se fixação com solução tamponada contendo 1% de formol. As amostras
foram adquiridas no citômetro FACSCantoTMII (BD, San José, CA, USA), no qual
foram coletados, no mínimo, 100.000 eventos por amostra. As células foram avaliadas
por tamanho (FSC), granularidade (SSC) e intensidade de fluorescência. Inicialmente
foi selecionada uma região para exclusão as células aderidas entre si, processo
conhecido como exclusão de doublets. Para isso, as células foram selecionadas pelos
parâmetros de FSC-A (área) e FSC-H (altura). Uma vez excluídos os doublets, foram
utilizados os parâmetros de FSC-A e SSC-A, para selecionar região correspondente às
células mieloides, (células dendríticas e macrófagos) ou linfoides (linfócitos T e
células NK). As células presentes em cada região delimitada foram utilizadas para
avaliar a expressão de diferentes moléculas utilizando os anticorpos monoclonais
descritos na tabela 1. Os dados foram analisados utilizando-se o software FlowJoTM
7.6.1 (Tree Star, Inc. Ashland, Oregon, USA). Todos os anticorpos foram adquiridos
da BD Bioscience Pharmingen ou e-Bioscience e utilizados de acordo com as
instruções do fabricante.
O número absoluto dos diferentes tipos celulares analisados foi obtido
correlacionando a porcentagem dos mesmos nos diferentes órgãos analisados em
relação ao número de células totais contadas em contador automático Countess™.
100% ––––––––––––––––––– Nº de células totais
X
% de células obtidas na citometria ––––––––––––––––––– nº de células de interesse
3.8.2. Marcação intracelular
Após a marcação das moléculas de superfície, 250 µL do tampão Foxp3
fixation/permeabilization foram adicionados por tubo, seguindo-se agitação vigorosa,
e incubação por 18 horas, a 4ºC no escuro, dando início à marcação intracelular do
fator de transcrição Foxp3 (Staining Buffer Set, eBioscience, San Diego, CA, USA) e
demais fatores de transcrição. Após o período de incubação, sem etapa prévia de
lavagem, 500 µL de Permeabilization Buffer 1x foram adicionados a cada tudo,
procedendo-se
agitação e centrifugação a 453 x g, por 5 minutos a 4°C. O
procedimento foi repetido, e após a última centrifugação, as células foram
ressuspensas em 100 µL de Permeabilization Buffer 1x e incubadas com os anticorpos
de monoclonais de interesse (tabela 1) durante 30 minutos, a temperatura ambiente,
no escuro. Em seguida, as células foram lavadas com 1 mL de Permeabilization
Buffer 1x e ressuspensas em 100 µL de PBS. As amostras foram adquiridas em
FACSCantoTMII e analisadas utilizando-se o software FlowJoTM 7.6.1, como descrito
no anteriormente.
3.8.3. Detecção intracelular de citocinas
Após a realização de cultura de células de pulmão (item 3.7.), as células foram
coletadas e fixadas com 4% de formoldeído (Synth – Diadema, SP, Brasil) diluído em
PBS, para volume final de 120 µL. As células foram agitadas vigorosamente e
incubadas por 11 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, foi adicionado 1 mL
de PBS e a suspensão celular foi incubada por 18 horas a 4ºC. Após a incubação, as
células foram centrifugadas a 453 x g, por 10 minutos a 4°C e lavada com 1 mL de
PBS. Para a permeabilização, a suspensão celular foi ressuspensa em tampão de
permeabilização contendo 1% de SBF e 0,2% de saponina (Sigma-Aldrich, St Louis,
MO, USA) diluídos em PBS para volume final de 1 mL por tubo. A suspensão celular
foi agitada vigorosamente e centrifugada a 453 x g, por 10 minutos a 4°C.
Posteriormente, as células foram ressuspensas em 50 µL de tampão de
permeabilização contendo sobrenadante de cultura de células 2.4G2, diluído 1:1 e
incubadas por 20 minutos, a 4ºC. Após o bloqueio, as células foram incubadas com os
anticorpos monoclonais (tabela 1), durante 30 minutos, a 4°C, no escuro. Em
seguida, as células foram lavadas com 1 mL de tampão de permeabilização e lavadas
novamente com 1 mL de PBS. Por fim, as células foram ressuspendidas em 100 µL
de PBS. As amostras foram adquiridas em FACSCantoTMII e analisadas utilizando-se
o software FlowJoTM 7.6.1, como descrito no anteriormente.
Tabela 1. Descrição dos anticorpos monoclonais utilizados nos ensaios de
citometria de fluxo.
Fenótipo
Linfócitos
Anticorpos
Clone
Fabricante
CD3
145-2C11
BD Bioscience, EUA
CD8
53-6.7
BD Bioscience, EUA
CD107a
1D4B
BD Bioscience, EUA
CD4
RM4-5
BD Bioscience, EUA
CCR4
2G12
Biolegend
CD25
PC61
BD Bioscience, EUA
Foxp3
MF23
BD Bioscience, EUA
Tbet
O4-46
BD Bioscience, EUA
ROR γt
AFKJS-9
eBioscience, EUA
GATA3
L50-823
BD Bioscience, EUA
Ki-67
SolA15
eBioscience, EUA
IFN-γ
XMG1.2
BD Bioscience, EUA
IL-4
11B11
Biolegend
IL-10
JES5-16E3
BD Bioscience, EUA
IL-17
TC11-18H10 BD Bioscience, EUA
Células NK
Células dendríticas
Macrófagos
CD39
Duha59
Biolegend
CD73
TY/11.8
Biolegend
NK1.1
PK136
BD Bioscience, EUA
CD11c
HL3
BD Bioscience, EUA
CD11b
M1/70
BD Bioscience, EUA
CD103
M290
BD Bioscience, EUA
F4/80
BM8
eBioscience, EUA
3.9. Avaliação da expressão gênica
3.9.1. Extração de RNA
Para a extração de RNA mensageiro (mRNA), os lóbulos esquerdos foram
coletados em 1 mL de solução de lise RA1 do kit de purificação de RNA (RNAspin
mini, GE Health Care, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) e
homogeneizados com o auxílio de homogeneizador S10NG IKA® T10 basic (IKA® Werke GMHB & Co. KG, Staufen-Alemanha). O RNA foi extraído conforme
instruções do fabricante do kit RNAspin mini. O RNA obtido foi quantificado
utilizando Nanodrop e o programa ND1000V37.1 (Thermo Fisher Scientific,
Wilmington, DE, USA). As leituras de absorbância foram realizadas no comprimento
de onda 260 nm.
3.9.2. Preparação de cDNA
Para preparar o DNA complementar (cDNA), 1 µg do RNA extraído foi
tratado com DNAse I 10x (Invitrogen by life BiotechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA)
durante 15 minutos a 25 °C. Posteriormente, as amostras foram incubadas com 1 µL
de EDTA 25mM (Invitrogen by life BiotechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA), a 65
°C, durante 15 minutos, para interromper a ação da enzima. A fim de iniciar a síntese
de cDNA, o RNA tratado com DNAse foi incubado durante 2 minutos, a 42°C, com 1
µL de dNTPs 10 mM e 1 µL de OligodT 0.5 µg/µL (Invitrogen by life
BiotechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA), 2.5 µL de Buffer 5x, 2.0 µL de DTT 0.1M
(Invitrogen by life BiotechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA), 0.5 µL de MgCl2 25 mM
e 2 µL de água ultrapura (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Em seguida, 1 µL da
enzima Reverse transcriptase SuperScriptTM II (Invitrogen by life BiotechnologiesTM,
Carlsbad, CA, USA) foi acrescentado às amostras, que foram incubadas durante 50
minutos a 42°C. Posteriormente, as amostras foram incubadas a 70°C, durante 15
minutos, seguindo-se
incubação a 4°C por 10 minutos. O cDNA obtido foi
quantificado utilizando Nanodrop e o programa ND1000V37.1 (Thermo Fisher
Scientific, Wilmington, DE, USA). As leituras de absorbância foram realizadas no
comprimento de onda 260 nm.
As amostras de cDNA foram diluídas em água livre de RNAse até atingir a
concentração 100 ng/µl. O cDNA diluído foi armazenado a -70°C até a avaliação da
expressão de genes por PCR em tempo real.
3.9.3. Quantificação da expressão de genes por PCR em tempo real (RT-PCR)
Para a quantificação de genes por RT-PCR, 3 µl do cDNA diluído foram
acrescentados a 6.5 µL de Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2x)
(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA), 0.5 µL de cada par de primer
(10µM- Invitrogen by life BiotechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA) e 2.5 µL de água
livre de nucleases. As condições para amplificação dos genes de interesse
compreendem uma fase inicial de incubação do cDNA a 50°C, durante 2 minutos.
Posteriormente, as amostras foram submetidas a um processo de desnaturação a 95
°C, durante 10 minutos. Após esse período, as amostras passaram por 40 ciclos
contendo fase de desnaturação a 95°C, durante 15 segundos, seguida de fase de
anelamento a 58°C, por 30 segundos e, finalmente, uma fase de extensão da fita de
DNA a 72°C, por 30 segundos. As reações e análises foram realizadas no aparelho
StepOnePlusTM Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). Os resultados foram analisados com base no valor de CT (Cicle Threshold – ou
ciclo limiar). O CT é o ponto que indica o número de ciclos onde a amplificação
atinge um dado limiar que permite a análise quantitativa da expressão do fator
avaliado. A fórmula utilizada para análise dos resultados foi 2-(ΔΔCt), na qual ΔΔCt
= ΔCt amostra - ΔCt controle, sendo que ΔCt = CT gene alvo – CT β-Actina (gene de
referência endógeno). As sequências dos primers avaliados encontram-se na tabela 2.
Tabela 2. Sequência de primers utilizados para quantificação de genes por PCR
em tempo real.
GENE
TIPO DE PRIMER SEQUÊNCIA 5' --> 3'
β-Actina
CCR4
CCL17
CCL22
CXCR3
CCR5
NOS2
Sense
CCC TAG GCA CCA GGG TGT GA
Antisense
GCC ATG TTC AAT GGG GTA CTT C
Sense
CGA TTC CAA AGA TGA ATG CCA
Antisense
TCC CCA AAT GCC TTG ATA CC
Sense
GAA GTC CCT GTT CCC TTT TTT
Antisense
TGT GTT CGC CTG TAG TGC ATA
Sense
ATG GTG CCA ATG TGG AAG A
Antisense
TAAAGC TGA TGG CAG AGG GT
Sense
AAC GTC AAG TGC TAG ATG CCT
Antisense
TCT CGT TTT CCC CAT AAT CG
Sense
TGC ACA AAG AGA CTT GAG GCA
Antisense
AGT GGT TCT TCC CTG TTG GCA
Sense
TGC TGT TCT CAG CCC AAC AAT A
GTC CAG GGA TTC TGG AAC ATT CT
Arginase 1
Sense
CAA AAG GAC AGC CTC GAG GAG
Antisense
CCC GTG GTC TCT CAC GTC AT
3.10. Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de citocinas e
quimiocinas
Para a detecção de citocinas e quimiocinas no homogenato pulmonar foram
utilizados os kits imunoenzimáticos BD OptEIA TM Set (BD Biosciences, San Diego,
CA, USA) e DuoSet® ELISA Development System (R&D Systems, Minneapolis,
MN, USA). As especificações de cada kit estão descritas na tabela 3. Todos os
ensaios foram realizados de acordo com as instruções dos fabricantes.
Tabela 3. Limite de detecção de cada kit imunoenzimático.
Kit
IFN-γ
24 Limites de Detecção Número de Catálogo Fabricante
31,3 – 2000 pg/mL
55138
BD
MATERIAIS E MÉTODOS
IL-10
31,3 – 2000 pg/mL
555252
BD
IL-4
7,8 – 500 pg/mL
55232
BD
IL-17
15,6 – 1000 pg/mL
DY421
RD
IL-12
62,5 – 8000 pg/mL
555256
BD
TGF-β
15,6 – 1000 pg/mL
DY1679
RD
IL-1β
15,6 – 1000 pg/mL
DY401
RD
IL-23
39 – 2500 pg/mL
DY1887
RD
CCL17
31,3 – 2000 pg/mL
DY529
RD
CCL22
7,8 – 500 pg/mL
DY439
RD
3.11. Separação de células T efetoras e Treg
As células T efetoras (CD4+CD25-), foram isoladas a partir da população de
células totais do baço de animais WT não infectados. Células Treg, (CD4+CD25+),
foram isoladas a partir da população de células de animais WT e CCR4-/- infectados
ou não. As duas populações foram purificadas utilizando MACS CD4+CD25+
Regulatory T cells Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) de
acordo com as instruções do fabricante.
Primeiramente, foi realizada a seleção negativa das células T CD4, seguida da
marcação para CD25, como descrito a seguir. Após a obtenção de células do baço dos
animais (item 3.6.2), a suspensão foi centrifugada a 453 x g, por 10 minutos a 4°C.
Para cada 1 x 107 células, foram adicionados 40 µL de tampão de beads contendo
0,5% de albumina bovina fração V (BSA- Inlab, São Paulo, SP, Brasil) e 2 mM de
EDTA (Invitrogen by life BiotechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA) diluídos em PBS
pH 7.2. Em seguida, adicionou-se 10 µL de Biotin-Antibody Cocktail e então a
suspensão foi agitada vigorosamente e incubada por 10 minutos, a 4ºC.
Posteriormente, foram adicionados à suspensão 30 µL de tampão de beads e 20µL de
Anti-Biotin MicroBeads, seguindo-se a homogeneização e incubação por 15 minutos,
a 4ºC. Dois mL de tampão de beads foram adicionados para lavar a suspensão. O
sedimento celular foi ressuspenso em 500 µL de tampão de beads. As colunas
magnéticas de depleção LD (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) foram
preparadas em MACS Separator, e, então, a suspensão celular foi aplicada. Após a
passagem na coluna, as células não marcadas (células T CD4+) que passaram pela
coluna, foram coletadas e centrifugadas a 453 x g, por 10 minutos, a 4°C. Para cada 1
x 107 células, foram adicionados 70 µL de tampão de beads e 10 µL de CD25-PE. As
células foram agitada vigorosamente e incubadas por 15 minutos, a 4ºC, no escuro.
Após a incubação, as células foram lavadas com 2 mL de tampão de beads. Após
centrifugação, 90 µL de tampão de beads e 10 µL de esferas magnéticas marcadas
com anticorpos contra PE (Anti-PE Microbeads) foram adicionados. A suspensão foi
homogeneizada e incubada por 15 minutos, a 4ºC, no escuro. A suspensão foi lavada
com tampão de beads e ressuspensa em 500 µL do mesmo tampão. Colunas
magnéticas LS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), para seleção positiva
de células Tregs (CD4+CD25+), foram preparadas em campo MACS Separator. A
suspensão celular foi aplicada e devidamente lavada na coluna LS. As células que
passaram pela coluna são as células CD4+CD25- e as células que ficaram retidas na
coluna são as células CD4+CD25+. A coluna foi removida do separador e com auxílio
do êmbolo as células Treg foram obtidas. A contagem total de células efetoras e Treg
foi realizada utilizando contador automático Countess™.
3.12. Ensaio de supressão da proliferação celular pelas células Treg
Após a separação de células Tregs e células T efetoras, as concentrações
celulares foram ajustadas para as proporções de células reguladoras : efetoras = 1:4
(0,25 x 105 : 1 x 105). As células foram distribuídas em placas de 96 poços de fundo
em U (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) e estimuladas com 40 µg/mL de Concavalina A
(ConA- Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Como controle positivo, foi realizada a
cultura de células T efetoras estimuladas com ConA, na ausência de células Treg.
Como controle negativo, células T efetoras foram cultivadas apenas com meio de
cultura. As culturas foram incubadas por 96 horas, a 37ºC em 5% de CO2. Após o
período de incubação, as células foram coletadas e submetidas ao protocolo de
marcação intracelular para avaliação da expressão de Ki-67.
3.13. Isolamento e transferência de células Foxp3-GFP+
Células Treg foram isoladas de animais transgênicos Foxp3-GFP+ normais.
Células totais do baço foram purificadas de acordo com a expressão de Foxp3-GFP
utilizando FACSAriaTM III Cell Sorter (BD, San Jose, CA, USA). Após a separação, a
contagem total de células Foxp3-GFP+ foi realizada através de contador automático
Countess™. Concentrações de 5 x 105 células foram ajustadas para volume final de
50 µL em salina estéril e, então, transferidas pela via intratraqueal para animais WT e
CCR4-/- com 60 dias de infecção. Dez dias após a transferência, os pulmões foram
coletados e submetidos ao ensaio de UFC.
3.14. Análise histopatológica
Para a análise histopatológica, o lóbulo direito superior foi armazenado em
tampão de fosfato, contendo 37% de formaldeído (pH=7.0). Posteriormente, foi
realizada a inclusão em parafina e confecção das lâminas. Os cortes histológicos do
pulmão foram corados com Hematoxilina e Eosina (H&E) para a visualização do
infiltrado celular. Todos os procedimentos de montagens das lâminas foram
realizados no laboratório da patologista Prof.ª. Dr.ª Simone Gusmão Ramos
(Departamento de Patologia FMRP-USP). As imagens coradas com H&E foram
capturadas utilizando aumento de 200x em microscópio Olympus BX50 acoplado à
câmera Olympus DP71 (Olympus Corporation, Japan).
3.15.Análise estatística
Para a realização da análise estatística entre dois grupos experimentais foi
utilizado o programa Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA, USA).
Inicialmente, foi realizado o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Os
experimentos, cujos dados foram positivos para o teste de normalidade, foram
analisados aplicando teste t não pareado (two tailed). Os dados que não passaram no
teste de normalidade foram analisados utilizando o teste não paramétrico de Mann
Whitney.
Para a realização da análise estatística em experimentos com mais de dois
grupos foi utilizado o programa StatSoft, Inc. (2004) STATISTICA (data analysis
software system), version 7, (Tulsa, OK, USA). Os dados de experimentos com mais
de dois grupos, foram submetidos ao teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov e ao
teste de igualdade de variâncias Levene’s. Os experimentos cujos dados passaram nos
dois testes foram analisados utilizando análise de variância de uma via (ANOVA),
aplicando One-way analysis of variance com pós teste de Tukey. Os dados que não
passaram em nenhum dos testes anteriores foram transformados utilizando a função
log10 e analisados novamente. Para os dados transformados que não passaram em um
dos dois testes foi aplicado o teste não paramétrico Kruskall Wallis com análise de
médias. Os valores com p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos.
28 RESULTADOS
4. RESULTADOS
4.1. Avaliação da expressão de CCR4 e das quimiocinas CCL17 e CCL22 no
pulmão de animais infectados ou não
Inicialmente, nós nos propusemos a avaliar a expressão de CCR4 e de seus
ligantes, CCL17 e CCL22, no pulmão de animais com infecção crônica (grupo TB)
comparando à expressão pulmonar basal, ou seja, no pulmão de animais não
infectados (grupo CT, controle). No pulmão de animais infectados foi detectado
aumento significativo na expressão de CCR4. Porém, não observamos diferença entre
animais infectados ou não na expressão relativa dos transcritos de mRNA para
CCL17 e CCL22 (Figura 1A). No entanto, a quantificação proteica revelou aumento
significativo na produção de CCL17 (Figura 1B) e CCL22 (Figura 1C) no pulmão
de animais infectados. Além da análise da expressão gênica para CCR4,
quantificamos a população de células T CD4+ do pulmão que expressavam CCR4 e a
população de células CD4+Foxp3+ que expressavam CCR4 (Figura 1D).
Encontramos aumento significativo na porcentagem e no número total de células
CD4+CCR4+ (Figura 1E, F) e células CD4+Foxp3+CCR4+ (Figura 1G, H) nos
animais infectados comparado com os animais não infectados.
29 RESULTADOS
Figura 1. Expressão de CCR4, CCL17 e CCL22 no pulmão de animais WT,
infectados ou não. Animais C57BL/6 foram infectados com 1 x 105 bacilos de M.
tuberculosis por via intratraqueal. Setenta dias após a infecção, os pulmões foram
coletados e separados para diferentes protocolos. Os lóbulos superior e inferior
esquerdo foram homogeneizados para quantificação CCR4, CCL17 e CCL22 por RTPCR (A). A expressão relativa do gene de interesse foi determinada em relação à
expressão do gene endógeno β-Actina (ΔCt) e em relação à expressão do gene de
interesse no grupo WT não infectado (ΔΔCt). Os mesmos lóbulos também foram
homogeneizados e utilizados para a quantificação de citocinas por ELISA. Foi
avaliado a produção de CCL17 (B) e CCL22 (C). Os limites de detecção do
experimento foram: CCL17 = 31,2 a 4000 pg/mL; CCL22 = 15,6 a 1000 pg/mL. Os
lóbulos mediano e inferior direito foram digeridos e suspensões celulares foram
submetidas ao protocolo de citometria de fluxo. Foram adquiridos, no mínimo,
100.000 eventos por amostra. A análise foi realizada a partir da exclusão prévia de
células não viáveis (doublets), utilizando os parâmetros FSC-H e FSC-A.
Posteriormente, foi feita uma seleção na população de linfócitos de acordo com
parâmetros de tamanho (FSC) e granuladidade (SSC), e também de acordo com a
marcação positiva para CD4. Dentro dessa última população a expressão de CCR4 e
Foxp3 foi avaliada por dot plot (D). A partir da porcentagem de expressão de
CD4+CCR4+ (E) e Foxp3+CCR4+ (G), obtivemos o número total das respectivas
células (F, H). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. Os
dados são representativos de 2 experimento independentes (n = 5-12). Barras
horizontais demonstram a diferença (P < 0,05) entre os grupos.
30 RESULTADOS
4.2. Avaliação do número de bacilos em diferentes tempos de infecção em
animais WT e CCR4-/Embora a participação de CCR4 na fase inicial da infecção com M. bovis
tenha sido descrita (162), não existe relato sobre o papel deste receptor na infecção
por M. tuberculosis. Para estudar o papel de CCR4, considerando o recrutamento de
células Treg e progressão da doença, como previamente descrito, utilizamos animais
deficientes para a expressão do receptor (CCR4-/-) comparando-os aos animais WT.
Apesar de nosso interesse na fase crônica, julgamos ser importante avaliar em qual
período da infecção CCR4 poderia afetar a resistência ou susceptibilidade dos
animais. Nesse contexto, aos quinze, trinta e setenta dias de infecção, o número de
Unidades Fomadoras de Colônia (UFC) no pulmão e baço foram avaliados. Aos
quinze dias de infecção, pudemos observar diminuição no número de UFC no pulmão
(Figura 2A) dos animais CCR4-/- infectados comparados aos animais WT infectados.
No entanto, nesse período, não observamos diferença no número de UFC no baço
entre os grupos avaliados (Figura 2B). Aos trinta dias de infecção, não observamos
diferença no número de UFC no pulmão nem no baço de animais CCR4-/- e WT
infectados (Figura 2A, B). Aos setenta dias de infecção, aumento significativo no
número de UFC foi observado no pulmão e baço de animais CCR4-/- infectados
comparados aos animais WT com mesmo período de infecção (Figura 2A, B).
Esses resultados sugerem que na fase inicial (15 dias), a ausência de CCR4
favorece a resistência à infecção, enquanto na fase crônica (70 dias), promove
susceptibilidade.
Figura 2. Avaliação do número de UFC no pulmão e baço em diferente tempos
de infecção. Animais WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos de M.
tuberculosis por via intratraqueal. Quinze, trinta e setenta dias após a infecção, os
pulmões foram coletados e separados para diferentes protocolos. Os lóbulos mediano
e inferior direito foram digeridos. Suspensões celulares foram diluídas em série para
31 RESULTADOS
realização do ensaio de UFC/pulmão (A). O baço também foi coletado, processado e
diluído em série para a realização de ensaio de UFC (B). Os resultados estão
expressos como média ± erro padrão da média. Os dados são representativos de 1
experimento repetidos 2-4 vezes (n = 3-9). Barras horizontais demonstram a diferença
(P < 0,05) entre os grupos.
4.3. Avaliação de células Treg no pulmão de animais CCR4-/Sabendo que CCR4 participa do recrutamento de células Treg para o pulmão,
quantificamos a população de células CD4+CD25+ e células CD4+Foxp3+, além da
população total de linfócitos T CD4+ nos animais CCR4-/- e WT aos 15, 30 e 70 dias
de infecção. A Figura 3A mostra a análise representativa usada para avaliar as
populações mencionadas. Não houve diferença na porcentagem de células CD4+
(Figura 3B) entre os grupos infectados em nenhum das fases avaliadas. Porém, a
análise do número total de linfócitos T CD4+ mostra aumento significativo dessa
população no pulmão de animais CCR4-/- comparado com os animais WT em 15 e 70
dias após a infecção (Figura 3E).
Quanto às células Treg, a análise representativa e as representações gráficas
referentes às frequências e números totais de células CD4+CD25+ e CD4+Foxp3+,
mostram diminuição significativa das células Treg em animais CCR4-/- comparados
aos animais WT, especialmente em 15 e 70 dias após a infecção (Figura 3A, C-F, DG).
32 RESULTADOS
Figura 3. Porcentagem e número total de células CD4 , CD4 CD25 e
CD4+Foxp3+. Animais WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos de M.
tuberculosis por via intratraqueal. Quinze, trinta e setenta dias após a infecção, os
pulmões foram coletados e os lóbulos mediano e inferior direito foram digeridos.
Suspensões celulares foram submetidas ao protocolo de citometria de fluxo. Foram
adquiridos, no mínimo, 100.000 eventos por amostra. A análise foi realizada a partir
da exclusão prévia de células não viáveis (doublets), utilizando os parâmetros FSC-H
e FSC-A. Posteriormente, foi feita uma seleção na população de linfócitos de acordo
com parâmetros de tamanho (FSC) e granuladidade (SSC). As populações de células
CD4+, CD4+CD25+ e CD4+CDFoxp3+ foram delimitadas. Como podemos observar no
representativo (A), a porcentagem e o número total de células CD4+ (B, E), células
CD4+CD25+ (C, F) e células CD4+CDFoxp3+ (D, G) foram obtidas. Os resultados
estão expressos como média ± erro padrão da média. Os dados são representativos de
2-3 experimento independentes (n = 8-20). Barras horizontais demonstram a diferença
(P < 0,05) entre os grupos.
+
+
+
33 RESULTADOS
4.4. Razão e correlação de células CD4+ e células CD4+Foxp3+
Como os animais CCR4-/- apresentaram aumento no número de células CD4+
e, em contrapartida, diminuição na população de células CD4+Foxp3+, avaliamos a
razão entre essa células. Houve aumento na razão tanto na frequência como no
número de células CD4+/CD4+Foxp3+ nos animais CCR4-/- comparado com os
animais WT em 15, 30 e 70 dias após a infeção (Figura 4A, B).
Para validar os resultados descritos acima, também realizamos a correlação
das populações CD4+ e CD4+Foxp3+. Não encontramos correlação entre a
porcentagem de células CD4+ e CD4+Foxp3+ de animais WT infectados em nenhum
dos tempos avaliados (Figura 4C, D, E). Entretanto, houve significativa correlação
inversa apenas na frequência de células CD4+ e células CD4+Foxp3+ de animais
CCR4-/- após 70 dias de infecção (Figura 4F, G, H). Esses resultados sugerem que,
durante a fase crônica da infecção, o aumento de células T CD4+ observado nos
animais CCR4-/- está associado ao aumento de outras subpopulações de células T, sem
ser as células Treg, podendo ser células Th1, Th2 ou Th17.
34 RESULTADOS
+
+
+
Figura 4. Razão e Correlação entre células CD4 /CD4 CDFoxp3 após 15, 30 e
70 dias de infecção. Razão entre a porcentagem (A) e o número total (B) de células
CD4+ e células CD4+Foxp3+ de animais WT e CCR4-/-. Correlação da porcentagem de
células CD4+ em função de porcentagem de células CD4+Foxp3+ analisadas no
pulmão de animais WT (C, D, E) e CCR4-/- (F, G, H) infectados com M. tuberculosis.
Os dados são representativos de 2-3 experimentos independentes (n = 10-22). Os
resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. Barras horizontais
demonstram a diferença (P < 0,05) entre os grupos. Para análise estatística da
correlação, foi aplicado o teste de Pearson (R). Valores de P < 0,05 foram
considerados significativos. Os números de R e P foram indicados apenas quando
houve diferença estatística.
35 RESULTADOS
4.5. Avaliação da inflamação pulmonar na ausência de CCR4
Mecanismos de regulação da resposta imune são determinantes para reduzir a
magnitude de processos inflamatórios e a extensão de dano tecidual. Porém, a redução
da inflamação pode refletir também em redução de mecanismos efetores e,
exatamente por isso, as células Treg podem contribuir para a progressão de infecções
crônicas. Como os animais estavam mais susceptíveis na fase crônica e apresentaram
diminuição na frequência e número de células Treg, avaliamos a inflamação
pulmonar.
Aos 15 dias de infecção, os animais CCR4-/- apresentam uma discreta redução
no comprometimento do parênquima pulmonar comparado com os animais WT
(Figura 5A). Aos 30 dias de infecção, o comprometimento do parênquima pulmonar
é similar entre os animais CCR4-/- e WT (Figura 5A).
Aos 70 dias de infecção, o maior comprometimento do parênquima pulmonar
de animais CCR4-/- foi evidente em relação aos animais WT. Além disso, nesse
período de infecção, os animais WT contêm melhor o crescimento do bacilo como
observado pela formação de estrutura como granuloma, o que não observamos no
pulmão dos animais CCR4-/- (Figura 5A).
Os resultados apresentados até o momento mostram que a ausência na
expressão de CCR4 afetou a capacidade de controlar a carga bacteriana, tornando-os
mais susceptíveis à infecção. O aumento da susceptibilidade foi associado com
redução no número e frequência de células CD4+Foxp3+ e aumento na inflamação
pulmonar.
36 RESULTADOS
Figura 5. Análise histopatológica do pulmão de animais WT e CCR4-/infectados. Animais WT e CCR4-/- foram infectados ou não (CT) com 1 x 105 bacilos
de M. tuberculosis por via intratraqueal. Quinze, trinta e setenta dias após a infecção,
os pulmões foram coletados. O lóbulo superior direito foi utilizado para a análise
histopatológica do pulmão. As fotomicrografias de secções de pulmões corados com
Hematixilina e Eosina são mostradas em aumento de 200x (A). Os dados são
representativos de, no mínimo, 3 experimento independentes.
37 RESULTADOS
4.6. Detecção dos ligantes de CCR4 no pulmão de animais CCR4-/Nossa hipótese de estudo está embasada no fato de que a infecção progride
porque os bacilos causam desequilíbrio entre mecanismos efetores/inflamatórios e
anti-inflamatórios. O número de células Treg aumenta em pacientes com TB e no
pulmão de animais infectados (42, 100, 101). As células Treg, recrutadas a partir dos
15 dias de infecção para pulmão de animais infectados com M. tuberculosis (106),
favorecem a multiplicação de bacilos nos hospedeiros infectados (43, 104). Além
disso, CCR4 está envolvido com a migração de células Treg para o pulmão (123).
Nesse contexto, acreditamos que as células Treg não tenham papel crítico na fase
inicial, mas que tenham papel crucial na fase crônica da infecção. Por isso, focamos
nosso estudo na fase crônica da infecção experimental com M. tuberculosis.
Realizamos uma análise de diversos parâmetros que estão envolvidos na
resposta imune contra M. tuberculosis, os quais são descritos a seguir, comparando os
animais CCR4-/- e WT com 70 dias de infecção.
Inicialmente, detectamos a produção de CCL17 e CCL22 no pulmão dos
animais WT e CCR4-/- infectados. Enquanto a produção de CCL17 foi
significativamente reduzida nos animais CCR4-/- (Figura 6A), a produção de CCL22
foi similar entre os grupos estudados (Figura 6B).
Figura 6. Detecção de quimiocinas no homogenato pulmonar. Animais WT e
CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via intratraqueal.
Setenta dias após a infecção, os pulmões foram coletados e os lóbulos superior e
inferior esquerdo foram homogeneizados para a quantificação de citocinas por
ELISA. Foi avaliado a produção de CCL17 (A) e CCL22 (B). Os limites de detecção
do experimento foram: CCL17 = 31,2 a 4000 pg/mL; CCL22 = 15,6 a 1000 pg/mL.
38 RESULTADOS
Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. Os dados são
representativos de 3 experimento independentes (n = 9-12). Barras horizontais
demonstram a diferença (P < 0,05) entre os grupos.
4.7. Quantificação de células dendríticas e macrófagos no pulmão
Em seguida, quantificamos leucócitos da imunidade inata que participam da
resposta contra M. tuberculosis. Nós mostramos, recentemente, que as células
CD11c+CD103+, mas não as células CD11c+CD11b+, do pulmão de animais C57BL/6
infectados com M. tuberculosis induzem maior frequência de células CD4+ produtoras
de INF-γ ou IL-17 (166).
Estabelecemos a caracterização geral de células dendríticas e macrófagos
através da marcação de CD11c, CD11b e CD103 para células dendríticas e F4/80 para
macrófagos alveolares, de acordo com a análise representativa ilustrada na Figura
7A. Houve uma diminuição na porcentagem de células CD11c+ (Figura 7B) nos
animais CCR4-/- comparados com os animais WT, mas não houve diferença no
número absoluto dessas células (Figura 7F). Observamos aumento na porcentagem
(Figura 7C) e no número total (Figura 7G) de células de células dendríticas
CD11c+CD11b+CD103-, associadas com perfil de susceptibilidade. Enquanto, houve
uma diminuição na porcentagem, mas não no número, de células CD11c+CD11bCD103+ (Figura 7D,H), relacionadas com resistência á infecção por induzirem
produção de IFN- γ pelas células T CD4+. Nenhuma diferença foi observada na
porcentagem (Figura 7E) ou no número (Figura 7I) de células F4/80+ entre os
grupos.
39 RESULTADOS
Figura 7. Porcentagem e número total de células dendríticas e macrófagos.
Animais WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos de M. tuberculosis por
via intratraqueal. Setenta dias após a infecção, os pulmões foram coletados e os
lóbulos mediano e inferior direito foram digeridos. Suspensões celulares foram
Posteriormente, foi feita uma seleção na população de células dendríticas e
macrófagos de acordo com parâmetros de tamanho (FSC) e granuladidade (SSC).
Após delimitarmos as populações de interesse (A) obtivemos a porcentagem e o
número total de células dendríticas CD11c+ (B, F), CD11c+CD11c+CD103- (C, G),
CD11c+CD11c-CD103+ (D, H) e macrófagos F4/80+ (E, I). Os resultados estão
expressos como média ± erro padrão da média. Os dados são representativos de 2-3
experimentos independentes (n = 10-19) para células dendríticas. Para macrófagos os
dados são representativos de 1 experimento repetidos 2 vezes (n = 4-6). Barras
40 RESULTADOS
4.8. Quantificação da expressão de genes característicos de macrófagos M1 e M2
Macrófagos M2 produzem CCL17 e CCL22, podendo contribuir para o
recrutamento de células que expressam CCR4 (46). Desse modo, o aumento na
expressão de genes associados com macrófagos M2 pode estar associado com
recrutamento de células Treg nos animais WT. Por isso, avaliamos a expressão de
NOS2, um dos marcadores que caracteriza a população de macrófagos M1, e a
expressão de Arg1, que caracteriza macrófagos M2 no pulmão de animais CCR4-/- e
WT infectados (45, 46, 50).
Não houve diferença na expressão gênica para NOS2 entre os grupos (Figura
8A). Os animais CCR4-/- apresentaram expressão de Arg1 significativamente reduzida
no pulmão quando comparados com animais WT (Figura 8B).
Esses resultados sugerem que a redução de células Treg pode ter relação com
a diminuição na expressão gênica de Arg1 encontrada nos animais CCR4-/-.
Figura 8. Quantificação de genes associados com macrófagos M1 e M2. Animais
WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via
intratraqueal. Setenta dias após a infecção, os pulmões foram coletados e os lóbulos
superior e inferior esquerdo foram homogeneizados para a quantificação de mRNA
para NOS2 (A) e Arg1 (B) por RT-PCR. A expressão relativa do gene de interesse foi
determinada em relação à expressão do gene endógeno β-Actina (ΔCt) e em relação à
expressão do gene de interesse no grupo WT infectado (ΔΔCt). Os resultados estão
experimentos independentes (n = 5-9). Barras horizontais demonstram a diferença (P
< 0,05) entre os grupos.
41 RESULTADOS
4.9. Avaliação de células NK1.1+ em animais CCR4-/- infectados
CCR4 é necessário para o desenvolvimento de resposta efetora de células NK
e controle da infecção com M. bovis (162). Dessa forma, a ausência de CCR4 pode
interferir no desenvolvimento de células NK, comprometendo a resposta imunológica
contra M. tuberculosis.
Para avaliar essa população celular, nós realizamos a marcação com
anticorpos contra NK1.1 e CD3. Foram caracterizadas como NK, as células que
expressavam NK1.1, mas não CD3 (NK1.1+CD3-), conforme análise representativa
(Figura 9A). Houve diminuição na porcentagem de células NK1.1+CD3- no pulmão
de animais CCR4-/- comparados com os animais WT (Figura 9B). Nenhuma
diferença foi observada no número total dessas células (Figura 9C).
+
-
Figura 9. Porcentagem e número total de células NK1.1 CD3 . Animais WT e
Setenta dias após a infecção, os pulmões foram coletados e os lóbulos mediano e
inferior direito foram digeridos. Suspensões celulares foram submetidas ao protocolo
de citometria de fluxo. Foram adquiridos, no mínimo, 100.000 eventos por amostra. A
análise foi realizada a partir da exclusão prévia de células não viáveis (doublets),
utilizando os parâmetros FSC-H e FSC-A. Posteriormente, foi feita uma seleção na
população de linfócitos de acordo com parâmetros de tamanho (FSC) e granuladidade
(SSC). A população de células NK1.1+CD3- foi delimitada. Como podemos observar
no representativo (A), a porcentagem (B) e o número total (C) de células NK1.1+CD3-
42 RESULTADOS
foram obtidas. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. Os
dados são representativos de 2 experimentos independentes (n = 11-13). Barras
4.10. Quantificação de células CD8+ ativadas no pulmão de animais CCR4-/Iniciamos a avaliação do perfil de ativação dos linfócitos T por meio da
análise de células CD8+, pois a quantificação de células CD4+ e CD4+Foxp3+ foi
previamente determinada considerando o papel de CCR4 no recrutamento de células
Treg para o pulmão (123). A análise representativa ilustrada na Figura 10A mostra
como foi avaliada a expressão do marcador de citotoxicidade CD107a. Verificamos
aumento na porcentagem (Figura 10B) e número total (Figura 10C) de células T
CD3+CD8+ no pulmão de animais CCR4-/- infectados comparado com os animais WT.
Devido ao aumento em linfócitos T CD8+ e o aumento da inflamação observado na
análise histopatológica, avaliamos o perfil de ativação dessas células através da
expressão do marcador de citotoxicidade CD107a. A frequência (Figura 10D) e o
número (Figura 10E) de células CD8+ que expressavam CD107a estavam
aumentadas significativamente no pulmão dos animais CCR4-/-.
+
+
+
+
Figura 10. Porcentagem e número total de células CD3 CD8 e CD8 C107a .
Animais WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos de M. tuberculosis por
via intratraqueal. Setenta dias após a infecção, os pulmões foram coletados e os
lóbulos mediano e inferior direito foram digeridos. Suspensões celulares foram
43 RESULTADOS
parâmetros de tamanho (FSC) e granuladidade (SSC). As populações de células
CD3+CD8+ e CD8+CD107a+ foram delimitadas. Como podemos observar no
representativo (A), a porcentagem e o número total de células CD3+CD8+ (B, C) e
células CD8+CD107a+ (D, E) foram obtidas. Os resultados estão expressos como
média ± erro padrão da média. Os dados da analise de CD3+CD8+ são representativos
de 3 experimento independentes (n = 14-20), enquanto os dados da análise de
CD8+CD107a+ são representativos de 1 experimento (n = 5-7). Barras horizontais
4.11. Análise da expressão dos diferentes fatores de transcrição
Sabendo que a deficiência na expressão de CCR4 reduz o influxo de células
CD4+Foxp3+ para o pulmão, o aumento de células T CD4+ observado nos animais
CCR4-/- deveria estar associado com outras populações de células T, como Th1, Th2
ou Th17.
Avaliamos, então, a expressão de Tbet (Th1 cell promoting transcription
factor), RORγt (Retinoid-Acid Receptor-related Orphan Receptor gamma T) e
GATA-3 (GATA biding protein 3) nas células CD4+ do pulmão.
A Figura 11A mostra a análise representativa dos fatores de transcrição
avaliados. Nos pulmões de animais CCR4-/- houve aumento na frequência e número
total de células CD4+Tbet+, e redução significativa de células CD4+RORγt+ e células
CD4+GATA-3+ comparados com animais WT (Figura 11B, 11C). Em adição,
confirmamos a redução significativa na população CD4+Foxp3+ nos animais CCR4-/infectados, como previamente descrito (Figura 3F).
Esses resultados sugerem que o aumento observado em células T CD4+ está
associado com aumento de células CD4+Tbet+, ou seja, com aumento de células
efetoras Th1.
44 RESULTADOS
+
+
Figura 11. Porcentagem e número total de células CD4 positivas para Tbet ,
RORγt+ GATA-3+ e Foxp3+. Animais WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105
bacilos de M. tuberculosis por via intratraqueal. Setenta dias após a infecção, os
pulmões foram coletados e os lóbulos mediano e inferior direito foram digeridos.
Suspensões celulares foram submetidas ao protocolo de citometria de fluxo. Foram
CD4+Tbet+, CD4+RORγt+, CD4+GATA-3+ e CD4+CDFoxp3+ foram delimitadas.
Como podemos observar no representativo (A), a porcentagem (B) e o número total
(C) de células que expressam os diferentes fatores de transcrição foram obtidas. Os
resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. Os dados são
representativos de 3 experimento independentes (n = 12-14). Barras horizontais
4.12. Quantificação da expressão de genes de receptores de quimiocinas
envolvidos no recrutamento de células Th1
Os receptores de quimiocina CXCR3 e CCR5 estão envolvidos no
recrutamento de células Th1 para locais inflamados (39, 40). Como observamos que o
45 RESULTADOS
aumento de células T CD4+ em animais CCR4-/- estava associado com aumento de
células Th1, nós avaliamos a expressão gênica de CXCR3 e CCR5 no pulmão de
animais CCR4-/- e WT infectados.
Os
animais
CCR4-/-
apresentaram
expressão
de
CXCR3
e
CCR5
significativamente aumentada no pulmão quando comparados com animais WT
(Figura 12A, B).
Esses resultados sugerem que o aumento da expressão dos receptores de
quimiocina CXCR3 e CCR5 induziu o aumenta de células Th1 para o pulmão de
animais CCR4-/- infectados.
Figura 12. Quantificação da expressão gênica de CXCR3 e CCR5. Animais WT e
inferior esquerdo foram homogeneizados para a quantificação de mRNA para CXCR3
(A) e CCR5 (B) por RT-PCR. A expressão relativa do gene de interesse foi
determinada em relação à expressão do gene endógeno β-Actina (ΔCt) e em relação à
expressão do gene de interesse no grupo WT infectado (ΔΔCt). Os resultados estão
experimentos independentes (n = 8-13). Barras horizontais demonstram a diferença (P
< 0,05) entre os grupos.
4.13. Quantificação de citocinas no pulmão
A próxima etapa foi avaliar a produção de citocinas associadas com a função
efetora de células Th1, Th2, Th17 e Treg no pulmão.
Houve aumento significativo na produção de IFN-γ (Figura 13A) detectada
nos pulmões de animais CCR4-/-. A produção de IL-4 foi similar entre animais CCR4/-
e WT (Figura 13B). Houve redução significativa na secreção de IL-17 no pulmão
46 RESULTADOS
de animais CCR4-/- (Figura 13C). A produção de IL-10 estava significativamente
aumentada nos animais CCR4-/- comparados aos animais WT (Figura 13D). Porém,
não houve diferença na produção de TGF-β entre os grupos CCR4-/- e WT (Figura
13E).
Determinamos também as concentrações de citocinas secretadas por
leucócitos da imunidade inata, que contribuem para a diferenciação dos perfis de
populações de células CD4+. Apesar de observarmos aumento de células Th1, não
encontramos diferença na produção de IL-12 entre os grupos CCR4-/- e WT (Figura
13F). Além disso, embora a produção de IL-17 estivesse reduzida, as concentrações
de IL-1 e IL-23 aumentaram de modo significativo no pulmão de animais CCR4-/(Figura 13G, H).
Esses resultados sugerem a existência de perfil pro-inflamatório Th1, mas não
Th17, no pulmão de animais CCR4-/- infectados com M. tuberculosis.
-
Figura 13. Detecção de citocinas no homogenato pulmonar. Animais WT e CCR4
/foram infectados com 1 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via intratraqueal.
inferior esquerdo foram homogeneizados para a quantificação de citocinas por
ELISA. Foi avaliado a produção de IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-17 (C), IL-10 (D), TGF-β
(E), IL-12 (F), IL-1β (G) e IL-23 (H). Os limites de detecção do experimento foram:
INF-γ = 7,8 a 2000 pg/mL; IL-4 = 15,6 a 1000 pg/mL; IL-17 = 7,8 a 1000 pg/mL; IL10 = 31,2 a 4000 pg/mL; TGF- β = 7,8 a 2000 pg/mL; IL-12 = 125 a 8000 pg/mL; IL1β = 31,2 a 1000 pg/mL; IL-23 = 39 a 1250 pg/mL. Os resultados estão expressos
como média ± erro padrão da média. Os dados são representativos de 1-4 experimento
independentes (n = 8-21). Barras horizontais demonstram a diferença (P < 0,05) entre
os grupos.
47 RESULTADOS
4.14. Avaliação de células CD4+ produtoras de IFN-γ, IL-4, IL-17 ou IL-10
A avaliação de citocinas em homogenatos de pulmão por ensaio
imunoenzimático ELISA fornece a quantificação ex vivo dos mediadores. Contudo,
não é possível determinar a população celular produtora de citocinas. Desse modo,
procedemos a análise de células CD4+ produtoras de IFN- γ, IL-4, IL-17 e IL-10.
A Figura 14A ilustra a análise representativa usada para determinar as
populações de células CD4+ produtoras de citocinas. Confirmando os resultados que
mostraram aumento de células CD4+ que expressavam Tbet, encontramos aumento
significativo de células CD4+ produtoras de IFN-γ (Figura 14B). Enquanto as
populações de células CD4+IL-17+, CD4+IL-4+ e CD4+IL-10+ foram semelhantes
entre animais CCR4-/- e WT (Figura 14B).
Esses resultados confirmam o aumento de células de perfil Th1, caracterizadas
pela produção de IFN-γ, no pulmão de animais que não expressam CCR4.
Figura 14. Detecção de produção de citocina intracelular no pulmão. Animais
WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via
intratraqueal. Setenta dias após a infecção, os pulmões foram coletados e os lóbulos
mediano e inferior direito foram digeridos. Suspensões celulares foram submetidas ao
protocolo de citometria de fluxo. Foram adquiridos, no mínimo, 100.000 eventos por
amostra. A análise foi realizada a partir da exclusão prévia de células não viáveis
(doublets), utilizando os parâmetros FSC-H e FSC-A. Posteriormente, foi feita uma
seleção na população de linfócitos de acordo com parâmetros de tamanho (FSC) e
granuladidade (SSC). De acordo com o representativo (A), a porcentagem (B) de
48 RESULTADOS
células CD4+ produtoras de IFN-γ+, IL-17+, IL-4+ e IL-10+ foram obtidas. Os
resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. Os dados são
representativos de 2-3 experimento independentes (n = 7-15). Barras horizontais
4.15. Correlações entre número de UFC, células CD4+IFN-γ+, CD4+Foxp3+,
CD4+Tbet+
Com intuito de tentar associar diretamente a carga bacteriana com as células
CD4+ produtoras de IFN-γ e com as células CD4+Foxp3+, estabelecemos correlações
entre tais parâmetros avaliados em animais WT e CCR4-/-.
Análise mostra a correlação positiva significativa do número de UFC e células
CD4+IFN-γ+ (r = 0.7886; p = 0.0008) avaliados no pulmão de animais WT (Figura
15A). Esses animais apresentaram ainda correlação positiva significativa do número
de UFC e células CD4+Foxp3+ (r = 0.7001; p = 0.0006) (Figura 15B). Finalmente,
também encontramos correlação positiva entre células CD4+Tbet+ e células
CD4+Foxp3+ (r = 0.8409; p = 0.045) (Figura 15C).
Quando os mesmos parâmetros foram usados para estabelecer correlações nos
animais CCR4-/-, encontramos também correlação positiva significativa do número de
UFC e células CD4+IFN-γ+ (r = 0.5687; p = 0.0215) (Figura 15D). Entretanto, não
houve correlação de número de células CD4+Foxp3+ com número de UFC (Figura
15E), enquanto as células CD4+Tbet+ e CD4+Foxp3+ foram correlacionadas
positivamente (r = 0.9045; p = 0.0003) (Figura 15F).
Esses resultados sugerem que nos animais WT, tanto o aumento da função
efetora de células Th1 como o aumento na frequência de células Treg favorecem a
multiplicação da carga bacteriana no hospedeiro infectado. No entanto, nos animais
CCR4-/-, o excesso de ativação de células produtoras de IFN-γ parece favorecer o
aumento da carga bacteriana na fase crônica da infecção.
49 RESULTADOS
Figura 15. Correlações entre número de UFC, células CD4+IFN-γ +, CD4+Foxp3+,
CD4+Tbet+. Realizamos análise de correlação da porcentagem de células CD4+INFγ+ e número de UFC (A, D), porcentagem de células CD4+Foxp3+ e número de UFC
(B, E) e porcentagem de células CD4+Foxp3+ e porcentagem de células CD4+Tbet+
(C, F) a partir do pulmão de animais WT e CCR4-/- infectados com M. tuberculosis. O
teste de Pearson (R) foi aplicado para a realização da análise estatística. Os dados são
representativos de 2-3 experimentos independente (n = 7-20). Valores de P < 0,05
foram considerados significativos. O número de R e P foram indicados apenas quando
houve diferença estatística.
4.16. Análise da expressão de receptores de inibição nas células T CD4+Foxp3+
A deficiência na expressão de CCR4 afetou o influxo de células CD4+CD25+ e
CD4+Foxp3+ para o pulmão de animais infectados com M. tuberculosis. Além disso, a
ausência deste receptor foi associada ao aumento da inflamação pulmonar, da
produção de IFN-γ e de células CD4+ produtoras de IFN-γ. Nós nos questionamos se
CCR4 poderia alterar a função supressora das células Treg.
As
ectonucleotidases
CD39
(ENTPD1;
ectonucleoside
triphosphate
diphosphohydrolase 1) e CD73 (ecto-5′-nucleotidase), responsáveis por converter
ADP/ATP em adenosina, medeiam atividade supressora de células Treg (83, 167).
Para avaliar a função supressora de células Treg, analisamos a expressão de CD39 e
CD73 nessas células. Encontramos diminuição na frequência e número total de
células CD4+Foxp3+CD39+ (Figura 16A, B) e células CD4+Foxp3+CD73+ (Figura
50 RESULTADOS
16D, E) no pulmão de animais CCR4-/- comparados aos animais WT. Não houve
diferença na intensidade mediana de fluorescência (MIF) para nenhuma
ectonucleotidase avaliada no pulmão (Figura 16C, F).
Devido ao pequeno número de células T CD4+Foxp3+ encontrado no pulmão,
para o experimento de proliferação foram utilizadas células Treg do baço. Por isso,
nós também avaliamos as populações de células CD4+Foxp3+CD39+ e células
CD4+Foxp3+CD73+ no baço de animais CCR4-/- e WT infectados. Não houve
diferença na frequência de células CD4+Foxp3+CD39+ (Figura 16G), mas
observamos, assim como no pulmão, diminuição no número total de células
CD4+Foxp3+CD39+ (Figura 16H) e na frequência e número total de células
CD4+Foxp3+CD73+ (Figura 16J, K). Além disso, a intensidade mediana de
fluorescência de CD39 e CD73 em células CD4+Foxp3+ estava reduzida em animais
CCR4-/- comparada aos animais WT (Figura 16I, L).
Avaliamos
também
populações
de
células
CD4+Foxp3+CTLA-4+,
CD4+Foxp3+PD-1+ e CD4+Foxp3+GITR+, porém não encontramos diferenças
significativas entre os grupos estudados (dados não mostrados).
51 RESULTADOS
Figura 16. Avaliação da expressão de receptores de inibição CD39 e CD73 em
células CD4+Foxp3+. Animais WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos
de M. tuberculosis por via intratraqueal. Setenta dias após a infecção, os pulmões
foram coletados e os lóbulos mediano e inferior direito foram digeridos. Suspensões
celulares foram submetidas ao protocolo de citometria de fluxo. Foram adquiridos, no
mínimo, 100.000 eventos por amostra. A análise foi realizada a partir da exclusão
prévia de células não viáveis (doublets), utilizando os parâmetros FSC-H e FSC-A.
parâmetros de tamanho (FSC) e granuladidade (SSC). A partir de células CD4+,
obtivemos a frequência e número total de células CD4+Foxp3+CD39+ (A-B, G-H) e
células CD4+Foxp3+CD73+ (D-E, J-K), assim como a intensidade mediana de
fluorescência (MIF) de CD39 (C, I) e CD73 (F, L) em células CD4+Foxp3+ do
pulmão e baço de animais infectados. Os resultados estão expressos como média ±
erro padrão da média. Os dados são representativos de 1 experimento repetidos 2
52 RESULTADOS
vezes (n = 4-5). Barras horizontais demonstram a diferença (P < 0,05) entre os
grupos.
4.17. Análise da função supressora das células CD4+CD25+
A
diminuição
das
populações
celulares
CD4+Foxp3+CD39+
e
CD4+Foxp3+CD73+, assim como a reduzida intensidade mediana de fluorescência de
CD39 e CD73 em células CD4+Foxp3+ nos animais CCR4-/-, sugere que as células
Treg apresentam função supressora prejudicada. Realizamos ensaio de proliferação
para avaliar da atividade funcional das células Treg. Para isto, células T efetoras
(CD4+CD25-) do baço de animais WT normais foram co-cultivadas com células Treg
(CD4+CD25+), purificadas do baço de animais WT ou CCR4-/-, infectados ou não,
como representado na Figura 17A.
A Figura 17B, D mostra a estratégia de gate utilizada para quantificar a
proliferação de células efetoras CD4+CD25- de acordo com a expressão de Ki-67.
Além disso, quantificamos a expressão de Foxp3 em células CD4+CD25+ e células
CD4+CD25+ (Figura 17D). Apenas 25% das células CD4+CD25- expressaram Foxp3,
contra 80% de expressão de Foxp3 entre as células CD4+CD25+ utilizadas na cultura.
As células Treg de animais WT, infectados ou não, inibiram a proliferação de
células T efetoras. No entanto, as células Treg de animais CCR4-/- não infectados
demonstraram menor capacidade de suprimir a proliferação de células T efetoras
quando comparadas com as células Treg de animais WT. Além disso, as células Treg
purificadas de animais CCR4-/- infectados com M. tuberculosis perderam totalmente a
capacidade de supressão, visto que a proliferação das células efetoras co-cultivadas
com Treg de animais CCR4-/- infectados foi similar à proliferação de células efetoras
cultivadas na ausência de células Treg (Figura 17E).
Esses resultados sugerem que a ausência de CCR4 nas células Treg prejudica
sua atividade funcional, devido a menor expressão das ectonucleotidases CD39 e
CD73 nessas células. A menor capacidade supressora de células Treg de animais
CCR4-/- pode estar diretamente associada ao aumento da magnitude da inflamação
pulmonar.
53 RESULTADOS
+
+
Figura 17. Análise da função supressora das células CD4 CD25 . Animais WT e
CCR4-/- foram infectados, ou não, com 1 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via
intratraqueal. Setenta dias após a infecção, células CD4+CD25- e CD4+CD25+ do baço
foram purificadas através de seleção magnética. Após a separação foi realizada uma
co-cultura de 0,25 x 105 células Tregs (CD4+CD25+) com 1 x 105 células T efetoras
(CD4+CD25-) (proporção 1:4). A co-cultura foi estimulada com ConA (40 µg/mL)
por 96 horas à 37ºC em 5% CO2 (A). Como controle positivo células T efetoras foram
54 RESULTADOS
estimuladas com ConA na ausência de células Treg (barra cinza). Após o período de
incubação as células foram submetidas ao protocolo de citometria de fluxo. Foram
CD4+CD25- foram delimitadas (B) e a expressão de Ki-67 foi avaliada (C).
Quantificação de Foxp3 entre as células CD4+CD25- e as células CD4+CD25+ (D). A
porcentagem de proliferação, de acordo com a marcação para Ki-67, das células
CD4+CD25- nas diferentes condições, foram avaliadas (E). Os resultados estão
experimento repetido 2 vezes (n = 3). Barras horizontais demonstram a diferença (P <
0,05) entre os grupos.
4.18. Análise da susceptibilidade de animais CCR4-/- que receberam
transferência de células Foxp3+ de animais WT
Diante da alteração na atividade supressora de células Treg in vitro obtidas de
animais deficientes para a expressão de CCR4, nosso próximo passo foi determinar a
função supressora dessas células in vivo. Para isto, 5 x 105 células Foxp3-GFP+ de
animais não infectados foram transferidas por via intratraqueal para animais WT ou
CCR4-/- com 60 dias de infecção. Dez dias após a transferência de células Foxp3GFP+, os pulmões foram coletados para realização do ensaio de UFC (Figura 18A).
A transferência de células Foxp3-GFP+ para animais CCR4-/- infectados
causou diminuição significativa no número de UFC no pulmão (Figura 18B, C)
comparado com o número de UFC recuperadas do pulmão de animais CCR4-/infectados que não receberam células Foxp3-GFP+. Não houve diferença no número
de UFC no pulmão comparando animais WT infectados que receberam ou não células
Foxp3-GFP+ (Figura 18B, C). Esses resultados sugerem que o aumento da
susceptibilidade na fase crônica da infecção com M. tuberculosis observado nos
animais CCR4-/-, pode ser decorrente de falha na regulação da resposta inflamatória,
mediada por células CD4+Foxp3+.
Para avaliar se a transferência de células Treg modificava a produção de IFNγ, cujas concentrações estavam significativamente aumentadas no pulmão de animais
CCR4-/- infectados (Figuras 12 e 13), determinamos a produção tanto de IFN-γ como
de IL-10 após a transferência de células Foxp3-GFP+. No pulmão de animais CCR4-/infectados que receberam células Foxp3-GFP+ foi detectada menor produção de IFNγ comparada com a produção detectada em animais CCR4-/- apenas infectados, que
55 RESULTADOS
não receberam células Treg. Não houve diferença na produção de IFN-γ entre animais
WT que receberam ou não células Foxp3-GFP+. No entanto, animais CCR4-/- que
receberam células Foxp3-GFP+ tiveram níveis de IFN-γ significativamente menores
que aqueles detectados em animais WT que também receberam células Foxp3-GFP+
(Figura 18D). Nenhuma diferença foi observada na produção da citocina IL-10
(Figura 18E).
Esses resultados confirmam que o aumento da resposta inflamatória mediada
por IFN-γ na ausência de CCR4, é resultante de falha no recrutamento de células
CD4+Foxp3+ e na capacidade reguladora dessas células.
Figura 18. Número de CFU e quantificação IFN-γ e IL-10 no pulmão de
animais infectados com M. tuberculosis após transferência de células Foxp3GFP+. Animais WT e CCR4-/- foram infectados com 1 x 105 bacilos de M.
tuberculosis por via intratraqueal. Sessenta dias após a infecção, os animais
56 RESULTADOS
receberam 5 x 105 células Foxp3-GFP+ pela via intratraqueal. Seguidos 10 dias os
animais foram sacrificados e ensaio de UFC foi realizado (A). Os lóbulos mediano
e inferior direito foram digeridos. Suspensões celulares foram diluídas em série
para realização do ensaio de UFC/pulmão do experimento 1 (B) e experimento 2
(C). Os lóbulos superior e inferior esquerdo foram homogeneizados para a
quantificação de citocinas por ELISA. Foi avaliado a produção de IFN-γ (C) e IL10 (D). Os limites de detecção do experimento foram: INF-γ = 7,8 a 2000 pg/mL;
IL-10 = 31,2 a 4000 pg/mL. Os resultados estão expressos como média ± erro
padrão da média. Os dados são representativos de 2 experimento independente (n
= 6-9). Barras horizontais demonstram a diferença (P < 0,05) entre os grupos.
57 DISCUSSÃO
8. DISCUSSÃO
Nesse estudo nós investigamos a participação de CCR4 na migração de células
CD4+Foxp3+ para o pulmão de animais infectados com M. tuberculosis, e também se
este receptor afeta a função supressora das células Treg.
Sabendo que CCR4 é um dos receptores que promove influxo de células T
reguladoras para o pulmão (123, 126), formulamos a hipótese de que a deficiência na
expressão de CCR4 diminuiria o recrutamento de células CD4+Foxp3+ para o pulmão,
e consequentemente, a resposta efetora proinflamatória atuaria de forma mais
eficiente no controle da carga bacteriana.
Nossos resultados mostram que a hipótese estava parcialmente correta, pois
houve diminuição na migração de células CD4+Foxp3+ para o pulmão, e também
diminuição no influxo de células CD4+GATA-3+ (Th2), acompanhada de aumento de
células CD4+Tbet+ e células CD4+ produtoras de IFN-γ (Th1). Comparado com
animais WT, animais CCR4-/- exibiram maior expressão de CXCR3 e CCR5, que
provavelmente auxiliou no maior recrutamento de células Th1 para o pulmão desses
animais (39, 40). No entanto, o aumento na magnitude da resposta mediada por IFN-γ
não foi suficiente para controlar a progressão da infecção. Animais CCR4-/- foram
mais susceptíveis na fase crônica (70 dias) da infecção por M. tuberculosis, mas
resistentes na fase inicial (15 dias de infecção) e apresentaram aumento na inflamação
pulmonar
Estudo prévio de nosso grupo mostrou o aumento na produção de IL-10 e na
frequência de células Foxp3+ no pulmão na fase crônica da infecção quando
comparada à fase mais inicial (30 dias de infecção) (32, 43). Esses resultados
corroboram com dados da literatura que atribuem às células Foxp3+ um papel
deletério na TB (104, 109), e sugerem que as células Treg podem representar fator de
susceptibilidade dependendo do background genético do hospedeiro.
Desse modo, considerando resultados prévios de nosso grupo sobre as células
Treg na TB e os resultados da literatura, em princípio, foi surpreendente constatar nos
animais CCR4-/- a incapacidade de controlar a carga bacteriana na fase crônica,
acompanhada por redução na frequência e número de células CD4+Foxp3+.
Uma questão relevante a ser discutida é o impacto da ausência de CCR4 em
diferentes períodos da infecção: fase inicial (15 e 30 dias) e fase crônica (70 dias).
Nossos resultados mostram que a deficiência na expressão de CCR4 afeta
58 DISCUSSÃO
diferencialmente a resistência à infecção. Durante a fase inicial (15 dias), a ausência
de CCR4 aumentou a resistência à infecção, mas não teve efeito aos 30 dias de
infecção. Na fase tardia, observamos um cenário diferente, pois a deficiência na
expressão de CCR4 aumentou a susceptibilidade. Acreditamos que as células
CD4+Foxp3+ afetam de modo distinto a cinética que acompanha a progressão da
infecção. As células Treg sofrem expansão na fase inicial da infecção e atrasam a
migração e ativação de células T CD4+ e T CD8+ favorecendo a tolerância ao
patógeno (98, 106). Dessa forma, reduzir o influxo de células Treg já no início da
infecção, como ocorreu nos animais CCR4-/-, pode remediar o atraso na indução da
resposta adaptativa, já descrito na TB (20, 109), e melhorar o controle da replicação
do patógeno no pulmão. Aos 30 dias, de acordo com estudos de nosso grupo e
também dados da literatura (43, 166, 168-170), os animais C57BL/6 geram forte
resposta celular dependente de IFN-γ, porém, não controlam a infecção. Portanto,
reduzir ou não o influxo de células CD4+Foxp3+ neste período da infecção, não exerce
efeito evidente no controle da mesma, e parece alterar o perfil da inflamação, embora
a magnitude seja similar entre animais WT e CCR4-/-. Aos 70 dias, ou seja, na fase
crônica, o desequilíbrio no influxo de células CD4+Foxp3+, que proporciona aumento
na função efetora de linfócitos T, é deletério. Esses resultados nos levam a concluir
que as células CD4+Foxp3+ apresentam funções tempo-dependente na TB.
Imunoterapias que tenham como alvo esse tipo celular precisam levar em
consideração a fase da doença, e possivelmente, estabelecer medidas para avaliar o
grau da resposta inflamatória.
Assim, de acordo com nossa hipótese inicial, esperávamos recuperar menor
número de bacilos do pulmão de animais CCR4-/- que àquele encontrado em animais
WT, aos 70 dias de infecção. Como esses animais tiveram redução na frequência e
número de células CD4+Foxp3+ e aumento de IFN-γ, e as células Treg podem exercer
papel dual na fase crônica da infecção, impedindo a resistência contra o patógeno ou
promovendo a tolerância contra o dano pulmonar, nós focamos nosso estudo na fase
crônica, mais complexa do ponto de vista de regulação da resposta imune por parte do
hospedeiro, cujo desequilíbrio culmina com progressão da infecção.
O potencial da resposta inflamatória em comprometer o controle da
multiplicação dos bacilos na TB é questionado desde estudos histológicos em
humanos na era pré-droga (171). Assim, embora antigo, o conceito das reações
59 DISCUSSÃO
imunopatológicas ou doenças imunomediadas tem recebido destaque ultimamente. A
proteção que leva ao controle da carga do patógeno pode vir dissociada da tolerância
contra o dano tecidual que preza pela preservação da arquitetura tecidual e função do
órgão-alvo da doença (172-176). Nesse contexto, estudos elegantes mostram que a
resposta patológica na TB, mediada por reação de hipersensibilidade do tipo IV,
necessita ser equilibrada por mecanismos reguladores. Relatos clínicos tem observado
que apesar de indivíduos HIV positivos coinfectados com M. tuberculosis
apresentarem alta carga bacteriana e extensiva disseminação, a capacidade de
transmissão do bacilo é muito menor quando comparados à indivíduos
imunocompetentes (177-179). Isso ocorre devido a inabilidade do M. tuberculosis em
gerar granuloma com necrose central e cavitação em indivíduos coinfectados,
prejudicando o transporte do bacilo para as vias aéreas e sua subsequente transmissão.
Em modelo experimental de infecção com M. marinum, polimorfismo no gene
do LTA4H (Leucotrieno A4 Hidrolase) induzindo produção deficiente do mediador
proinflamatório LTB4 (Leucotrieno B4) e aumento na produção de LXA4 (Lipoxina
A4), mediador anti-inflamatório, gerou resposta inflamatória inadequada, que resultou
em susceptibilidade à infecção por M. marinum e permitiu o crescimento do bacilo
dentro de macrófagos. Polimorfismo no mesmo gene, mas que resulta em alta
produção de LTB4 e inflamação excessiva, também foi associado com aumento da
susceptibilidade como consequência do aumento da necrose de macrófagos e
subsequente crescimento extracelular da bactéria (180). Além disso, terapia adicional
com corticoides tem alcançado sucesso em pacientes com tuberculose que apresentam
alta atividade de LTA4H (180). O mecanismo pelo qual os corticoides exercem seus
efeitos benéficos ainda não está claro, mas um estudo com pacientes HIV positivo
associou o melhor controle bacteriano induzido pelo tratamento com corticoide à
redução dos níveis de TNF (181). Shaler e colaboradores mostraram que inflamação
excessiva, induzida por elevados níveis de IFN-γ, contribui para lesão pulmonar e
disseminação da infecção (66). Dessa forma, baixos ou altos níveis de inflamação são
deletérios para o hospedeiro infectado com M. tuberculosis.
Nesse sentido, nosso estudo mostra que a frequência de células CD4+Foxp3+
estava positivamente correlacionada com a frequência de células efetoras e também
com o número de bacilos nos animais WT, sugerindo a importância do balanço entre
células efetoras e Treg para o controle da infecção. Assim, parece que quanto mais
células efetoras, maior a necessidade de se recrutar células reguladoras para balancear
60 DISCUSSÃO
carga bacteriana e dano tecidual. Esses dados são reforçados pela ausência de
correlação entre células CD4+Foxp3+ e número de bacilos nos animais CCR4-/-, e pela
correlação positiva entre células CD4+ produtoras de IFN-γ e número de bacilos
também nesses animais, sugerindo que a falha em mecanismo regulador, relacionada
com deficiência na migração de células CD4+Foxp3+, aumenta a susceptibilidade,
como consequência de excesso de inflamação.
Um dos fatores ligados à magnitude da inflamação na TB é resposta imune
celular mediada por IFN-γ, que confere proteção contra a multiplicação dos bacilos. O
papel do IFN-γ no controle da infecção experimental é clássico (26). No entanto,
apenas IFN-γ não é capaz de erradicar os bacilos, e seu uso na clínica requer cautela
(182). O primeiro teste clínico para uso terapêutico de IFN-γ em pacientes com TB foi
bem sucedido. Cinco pacientes que apresentavam resistência a múltiplas drogas
receberam 500 µg de IFN-γ três vezes na semana por um mês. Após o tratamento, os
pacientes apresentaram resultados negativos para a baciloscopia e o número de UFC
demonstrava tendência à diminuição (183). No entanto, outro teste clínico com 8
pacientes utilizando IFN-γ por seis meses não foi capaz de reproduzir os resultados do
estudo anterior (184). Pacientes com TB ativa têm elevada expressão de transcritos
induzidos por IFN-γ e IFN-tipo I comparado com pacientes com infecção latente
(185-189). Essa assinatura inflamatória também é observada em crianças com TB e,
atualmente, a análise da expressão dos níveis de RNA para IFN-γ e IFN-tipo I está
sendo utilizada como diagnóstico de TB em crianças da África (190). Além disso,
recentemente, foi descrito que M. tuberculosis explora a produção de IFN-γ para
induzir macrófagos humanos a liberarem DNA formando armadilhas extracelulares,
como as NET (Neutrophil Extracellular Traps) produzidas por neutrófilos, além da
indução de agregação de micobactérias. Esses processos são dependentes do sistema
de secreção ESX-1 (Early secretory antigenic target 6 system 1). Em adição, IFN-γ
também amplifica a indução de necrose de macrófagos mediada pelo sistema de
secreção ESX-1 (191). Tais processos facilitam a replicação de M. tuberculosis,
prejudicando o hospedeiro. Esse efeito não foi observado em macrófagos murinos.
Assim, IFN-γ induz resposta protetora contra a infecção, e, simultaneamente, M.
tuberculosis utiliza essa citocina para favorecer sua sobrevivência. Na incapacidade
do sistema imune do hospedeiro erradicar por definitivo a infecção, há persistência
antigênica, havendo a necessidade de redes reguladoras que controlam a inflamação,
61 DISCUSSÃO
com a finalidade de manter a integridade do tecido. É nesse contexto que nos
deparamos com o paradoxo da TB: resposta protetora versus dano tecidual.
Embora o recrutamento de células CD4+Foxp3+ para o pulmão possa ser
mediado por outros receptores que não o CCR4, nossos resultados sugerem a
participação deste receptor no influxo das células Treg, pois houve aumento na
expressão gênica de CCR4 e na população de células CD4+Foxp3+CCR4+ no pulmão
de animais infectados comparado com animais não infectados. Além da expressão do
CCR4, também encontramos aumento das quimiocinas CCL17 e CCL22, ligantes de
CCR4, nos animais infectados.
O aumento na expressão de CCR4 já havia sido descrito na TB (153, 192).
Porém, o papel de CCR4 na patologia da TB ainda não foi elucidado.
Freeman e colaboradores, em 2006, avaliaram a participação de CCR4 em
modelo de granuloma pulmonar mediado por células Th1. Os autores desafiaram com
derivado de proteína purificada (PPD) em presença de adjuvante completo de Freund
por via intravenosa, animais sensibilizados com M. bovis. Animais CCR4-/apresentaram redução no tamanho do granuloma pulmonar e diminuição nos níveis de
IFN-γ. Porém, a transferência de células T CD4+CCR4+ para esses animais falhou em
reconstituir formação normal do granuloma (161).
Em infecção com M. bovis, CCR4 mostrou ser essencial para a ativação de
células NK, uma vez que a ausência desse receptor diminuiu a produção de IFN-γ
pelas células, reduzindo o controle do bacilo na fase inicial da doença (162). Além
disso, esse mesmo trabalho sugeriu que CCR4 é importante para sustentar resposta de
células Th1 e Th17 durante a fase tardia da infecção com M. bovis, devido a
diminuição de células CD4+ produtoras de IFN-γ e IL-17 (162). Mas atualmente
sabemos que CCR4 é requerido principalmente para o recrutamento de células Treg.
Além da análise quantitativa de células Treg, nós nos questionamos se a
deficiência na expressão de CCR4 poderia afetar também a função dessas células.
Experimentos de transferência de células Treg CD4+CD25+ de animais WT e CCR4-/demonstraram o requerimento de CCR4 para a atividade supressora dessas células
(126, 193). Enquanto a transferência de células Treg CCR4+/+ protege contra o
desenvolvimento de colite, a transferência de células Treg CCR4-/- falham em
prevenir o desenvolvimento da doença (193). Resultado similar foi observado em
modelo experimental de asma alérgica, no qual a transferência de células Treg
62 DISCUSSÃO
CCR4+/+, mas não Treg CCR4-/-, causou a atenuação dos parâmetros imunológicos da
asma como eosinofilia, produção de IL-4 e IL-5 e inflamação das vias aéreas (126).
Confirmamos in vitro que as células CD4+CD25+ purificadas do baço de animais
CCR4-/- suprimem menos a resposta proliferativa de células CD4+ ativadas quando
comparadas com as células CD4+CD25+ de animais WT. Para confirmar a redução da
função supressora in vivo, mostramos que a transferência de células Foxp3-GFP+ para
animais CCR4-/- infectados foi associada com redução nos níveis de IFN-γ e na carga
bacteriana no pulmão quando comparadas com animais CCR4-/- que não receberam
transferência celular. Então, além de CCR4 participar do recrutamento de células
CD4+Foxp3+ para o pulmão, ele também participa da função efetora dessa população
celular.
Para tentar compreender como CCR4 afeta a capacidade supressora das
células Treg, nós avaliamos moléculas relacionadas com função celular, como CTLA4, CD39, CD73, PD-1, GITR (72, 73, 76, 83, 86, 87). Animais CCR4-/- apresentaram
diminuição na população de células CD4+Foxp3+CD39+ e CD4+Foxp3+CD73+ no
pulmão comparados aos animais WT, assim como reduzida intensidade mediana de
fluorescência para CD39 e CD73, indicando menor expressão desses receptores na
superfície de células Treg CCR4-/-. Nenhuma diferença significativa foi observada
para expressão de CTLA-4, PD-1 e GITR. Devido aos altos níveis de expressão das
ectonucleotidases CD39 e CD73 em sua superfície (83, 167), as células Treg são
capazes de converter ADP e ATP extracelular em adenosina, que medeia as
propriedades supressoras dessas células. De acordo com o fato de que Foxp3 induz a
expressão de CD39 (194), animais deficientes para CD39 perdem a capacidade de
suprimir a proliferação de células CD4+CD25-. Efeito que foi convertido pela adição
da forma solúvel de CD39 (83). Uma vez gerada, adenosina media as propriedades
supressoras das células Treg por se ligar em seu receptor A2A nas células T efetoras e
inibir a sinalização mediada pelo TCR (T Cell Receptor), prevenindo a fosforilação de
ZAP70 e ativação do fator de transcrição AP1 (Activator Protein 1). A diminuição na
sinalização do TCR reduz a produção de IL-2 e expressão de CD25 resultando em
menor proliferação de células T efetoras (195). Em adição, as células Treg também
expressam o receptor A2A e sua ativação induz a expressão de Foxp3 nessas células
(196). Dessa forma, nosso resultados sugerem que a ausência da expressão de CCR4
63 DISCUSSÃO
em células Treg afeta sua função supressora por diminuir a expressão das
ectonucleotidases CD39 e CD73.
Nossos resultados para IL-10 ainda são inconclusivos, pois houve aumento na
produção ex vivo de IL-10 nos animais CCR4-/- comparado aos animais WT, mas, por
outro lado, a produção dessa citocina não foi associada com aumento do controle do
bacilo observado nos animais CCR4-/- que receberam células Foxp3-GFP+. Para
confirmar o papel de IL-10, será necessário avaliar a produção desta citocina por
células CD4+Fopx3+ de animais CCR4-/- e por células CD4+Fopx3+CCR4+ de animais
WT.
A complementação de nosso estudo seguiu por meio da análise fenotípica de
células da imunidade inata e adaptativa. Já estava descrito que células dendríticas
expressam CCR4 (197, 198), produzem CCL17 e CCL22 durante processos de
homeostase e inflamação (199, 200).
O papel das células dendríticas CCR4+ ou produtoras de CCL17/CCL22 não
está claro na TB. No entanto, sabe-se que células dendríticas produtoras de CCL17
atraem células T ativadas para o local da inflamação (201), como o pulmão. As
células T parecem migrar para o pulmão como consequência das células dendríticas
induzirem a expressão de CCR4 em linfócitos T, sendo a deficiência na expressão de
CCR4 apontada como falha para a migração das mesmas (123). No entanto, este
estudo não avaliou se havia expressão diferencial de CCR4 nas populações de células
CD4+. Esse é um ponto de interesse na continuidade de nosso estudo: avaliar se as
células CD4+Foxp3+ expressam quantitativamente mais CCR4 que as células Th1,
Th2 e Th17.
Observamos diminuição na frequência de células dendríticas CD11c+CD103+
e aumento na população CD11c+CD11b+, além de diminuição na produção de CCL17
no pulmão de animais CCR4-/- comparado com animais WT. Não sabemos se as
células CD11c+CD103+ seriam produtoras de CCL17 no pulmão de animais
infectados. Entretanto, recentemente, nós mostramos que as células CD11c+CD103+
de animais C57BL/6, mas não as células CD11c+CD11b+, induziam maior frequência
de CD4+ produtoras de IFN-γ e IL-17 (166). No presente estudo, mostramos que a
ausência de CCR4-/- interfere nas populações de células dendríticas. Porém,
esperávamos que houvesse maior população de células CD11c+CD103+ no pulmão,
considerando nosso estudo prévio, uma vez que os animais CCR4-/- infectados
64 DISCUSSÃO
apresentaram maior produção de IFN-γ. Essa questão permanece para ser mais bem
explorada.
Macrófagos M2 representam fonte adicional de quimiocinas ligantes de
CCR4. As citocinas IL-4 e IL-13 estimulam a diferenciação e ativação de macrófagos
M2, que expressam CCL17 e CCL22, e contribuem para o recrutamento de células
Treg e Th2 (202, 203). A deficiência na expressão de CCR4 foi associada com
redução na expressão gênica para Arg1, marcador de macrófagos M2 (45), sugerindo
que o aumento na resposta inflamatória pode, em parte, estar relacionado com esse
achado. Com relação às respostas adaptativas, verificamos que além das células T
CD4+, as células T CD8+ também estavam aumentadas no pulmão dos animais CCR4/-
infectados. Células T CD8+CCR4+ são predominantemente células de memória
imaturas, que não expressam perforina nem granzima (204). O uso de antagonistas de
CCR4 combinado com vacinas anti-tumorais induz aumento de células T CD8+
efetoras que controlaram o crescimento tumoral (205). Em adição, a depleção de
células T CCR4+ induziu o aumento, in vitro, de células T CD8+ específicas para
antígenos tumorais em pacientes com melanoma (206). Esses resultados sugerem que
a ausência de CCR4, com consequente diminuição de células Treg, possibilita a
proliferação e ativação de células T CD8+ específicas ao antígeno. Esses dados
corroboram com nossos achados de aumento no número de células T CD8+ ativadas
em camundongos deficientes de CCR4. Isso foi confirmado pela marcação da
molécula CD107a, também conhecida como LAMP1 (Lysosomal Associated
Membrane Protein 1), um marcador da atividade citotóxica de células T CD8 que é
expresso durante a liberação dos grânulos citotóxicos dessas células (207-209).
Sugerimos que o aumento de células T CD8+ efetoras contribuiu para o aumento da
inflamação observado em animais CCR4-/-, mas não foi eficiente em controlar o
crescimento dos bacilos.
Os resultados deste estudo confirmam a importância das vias de regulação da
resposta inflamatória durante a infecção por M. tuberculosis. O excesso de resposta
inflamatória observada nos animais CCR4-/- gera aumento da imunopatologia, e esses
eventos estão associados com redução no número e na função reguladora das células
CD4+Foxp3+.
65 DISCUSSÃO
Nossos resultados reforçam a importância de se compreender o limiar entre
resistência ao patógeno e tolerância ao dano na TB, para a possível manipulação de
novas estratégias terapêuticas.
Considerando nossos resultados e os dados da literatura, elaboramos esquema
para ilustrar os eventos imunológicos que ocorrem na presença e ausência de CCR4
na TB experimental.
Figura 19. Esquema ilustrativo dos eventos imunológicos que sucedem na
presença e ausência de CCR4 durante a TB experimental. Após a infecção com
66 DISCUSSÃO
M. tuberculosis, células dendríticas migram para o linfonodo drenantes e induzem a
diferenciação de células T efetoras, como as células CD4+ de padrão Th1 e T CD8+,
que migram para o pulmão. As quimiocinas CXCL9, CXCL10, CCL4 e CCL5,
produzidas no pulmão, atraem células Th1 via receptores CXCR3 e CCR5.
Concomitantemente, as células Treg migram para o pulmão via CCR4 de acordo com
o ambiente quimiotático induzido por CCL17 e CCL22. No pulmão, ocorre o balanço
de respostas reguladoras e respostas efetoras. As células dendríticas e macrófagos
também participam dessa resposta. Macrófagos M0 se diferenciam em células
gigantes multinucleadas, células epitelióides e macrófagos espumosos, enquanto
macrófagos M2 auxiliam no reparo tecidual. Linfócitos Th1 ativados produzem IFNγ, que ativam macrófagos M1 a desencadearem suas atividades microbicidas,
auxiliando no controle da multiplicação de bacilos. Células Treg expressam as
ectonucleotidases CD39 e CD73 que convertem ADP/ATP em adenosina, um dos
mediadores das propriedades supressoras dessas células (a). Durante a infecção com
M. tuberculosis na ausência de CCR4, células Th1 exibem aumento na expressão de
CXCR3 e CCR5 e migram para o pulmão. No pulmão, estas células em maior
frequência, produzem mais IFN-γ, que associado com o aumento de células T CD8
ativadas, causam maior inflamação pulmonar. Em contrapartida, a ausência de CCR4
afeta a migração de células Treg para o pulmão e induz menor expressão de CD39 e
CD73, o que, possivelmente, contribui para a geração de menores níveis de
adenosina, e consequentemente, menor função supressora. O reparo tecidual induzido
por macrófagos M2 também se encontra prejudicado. A diminuição de respostas
reguladoras e no reparo tecidual, acompanhada de aumento da magnitude da resposta
inflamatória, causam a expansão da infecção e, provavelmente a liberação
extracelular de bacilos, como pode ser observado pelo aumento da susceptibilidade de
animais CCR4-/- infectados com M. tuberculosis (b).
67 CONCLUSÕES
9. CONCLUSÕES
o A ausência da expressão CCR4 alterou o perfil de resposta imunológica inata,
induzindo aumento de células dendríticas CD11c+CD11b+CD103- que estão
associadas com fenótipo de susceptibilidade a TB. Assim como reduziu a
frequência de células NK no pulmão de animais CCR4-/- comparado com WT.
o A ausência da expressão de CCR4 também modificou o perfil de resposta
adaptativa, aumentou as respostas efetoras de células T CD8+CD107a+ e
células Th1, assim como induziu um perfil de resposta inflamatória com
aumento na produção de IFN-γ e IL-1β.
o Em contrapartida, a ausência da expressão de CCR4 diminuiu a migração de
células Treg para o pulmão e prejudicou a função supressora dessas células,
impedindo o desenvolvimento de mecanismos de regulação.
o A influência de CCR4 em todos esses eventos induziu o aumento de
imunopatologia, gerando a quebra de tolerância a doença, o que aumentou a
susceptibilidade dos animais CCR4-/-. A transferência de células Treg
competentes para os animais deficientes restaurou sua capacidade em
controlar o crescimento do bacilo de forma similar aos animais WT infectados
com M. tuberculosis.
68 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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81 ANEXO
8. ANEXO
Title:
Decreased number and low suppressor function of CD4+Foxp3+ cells as
consequence of CCR4 deficiency increase the Th1 cell-mediated inflammation
and the susceptibility to M. tuberculosis chronic infection
Short title: deficiency in Foxp3+ cells induces higher Th1 inflammation and
tuberculosis progression
Thais B. Bertolini1, Annie R. Piñeros1, Rafael Q. Prado1, Ana Flávia Gembre1,
Simone Gusmão Ramos2, José Carlos Alves-Filho3, Vânia L. D. Bonato1
1-‐ Department of Biochemistry and Immunology, Medicine School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. 2-‐ Department of Pathology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil 3-‐ Department of Pharmacology, Medicine School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil Correspondence: Dr. Vânia L. D. Bonato, Medical School of Ribeirão Preto,
University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo. Av. Bandeirantes, 3900, Ribeirão
Preto, São Paulo. 14049-900, Brazil.
E-mail: [email protected]
Key Words: tuberculosis, CCR4, CD4+Foxp3+ cell, IFN-gamma, inflammation.
82 ANEXO
ABSTRACT
The pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis infection results from the interaction
of the bacillus persistence and the inflammatory response. Accordingly, the balanced
control of the effector mechanisms is crucial to limit pulmonary damage.
CD4+Foxp3+ cells, which control tissue damage, are associated with the progression
of tuberculosis. Because CCR4 participates of the recruitment of regulatory T cells to
the lung, we used CCR4 deficient mice (CCR4-/-) to evaluate the role of regulatory T
cells both in the susceptibility and in the magnitude of effector and inflammatory
response during the chronic phase of the M. tuberculosis infection. The deficiency in
CCR4 expression reduced the recruitment of CD4+Foxp3+ cells to the lung at 15, 30
and 70 days of infection. However, Day15-infected CCR4-/- mice were resistant while
Day 70-infected CCR4-/- mice were susceptible to infection compared to respective
counterparts. Increased susceptibility of infected CCR4-/- mice was associated with a
higher frequency of CD4+Tbet+ cells, IFN-γ-producing CD4+ cells, and IFN-γ levels
in lung homogenates. These animals also exhibited a greater extension of lung
inflammation. Regulatory T cells from infected CCR4-/- mice lose their suppressor
function compared to infected WT or non-infected CCR4-/- counterparts, probably by
a mechanism dependent on CD39 and CD73 ectonucleotidases. Foxp3-GFP+ cell
transfer increased the resistance of infected CCR4-/- mice and this was associated with
reduction of lung IFN-γ levels compared to infected CCR4-/- mice that did not
undergo cell transfer. Our findings suggest that CD4+Foxp3+ cells play timedependent functions in tuberculosis and highlight that the use of CD4+Foxp3+ cells as
a target for immunotherapy would take into account the phase of the disease and the
level of inflammatory response of the infected host, considering all forms of M.
tuberculosis infection.
83 ANEXO
INTRODUCTION
Despite the innumerous progress in the understanding of Mycobacterium
tuberculosis and host relation, it still remains to be defined the exact mechanisms that
allow individuals with latent infection do not develop the disease. We refer to disease
the inability to control the pathogen replication and also to minimize pulmonary tissue
damage. In this scenario, tuberculosis (TB) remains the second leading cause of
mortality worldwide when infectious diseases are considered (1).
M. tuberculosis infection induces both IFN- γ -producing CD4+ and CD8+
cells. IFN- γ is the hallmark of a protective cellular immune response because this
cytokine stimulates the antimicrobial potential of macrophages, the main niche of
bacillus multiplication (2). However, M. tuberculosis also induces IL-10 production
by macrophages and dendritic cells and the differentiation of Th2 and regulatory T
cells which contribute to inhibit innate and adaptive effector mechanisms, such as
lymphocyte proliferation, Th1 and Th17 differentiation, antigen presentation, NO
production (3, 4). It is supposed that the imbalance between effector and regulatory
cells and their respective mediators causes TB progression (5). Therefore, to
understand the balance between effector and regulatory mechanisms preventing the
suppression of the cellular immune response is essential to develop new vaccines and
targets for immunotherapies. On the other side, the deficiency in the regulatory
mechanisms may also be detrimental to the host because promotes exacerbation of
inflammation and dissemination of the infection as a consequence of the tissue
damage (6, 7). Approximately half of the patients cured with current TB drugs remain
with tissue damage generated by excessive inflammation and experience side effects
such as breathlessness and cough (8, 9).
84 ANEXO
In this context, regulatory mechanisms driven by regulatory T cells are critical to
encompass uncontrolled effector responses. (10).
The increase in the frequency of CD4+CD25+ or CD4+Foxp3+ regulatory T
cells in the peripheral blood of patients with TB is associated with down regulation of
IFN-γ production, benefiting the pathogen (11, 12). Is has been described that
regulatory T cells proliferate in the pulmonary lymph nodes (pLNs), change their cell
surface phenotype, and accumulate in the pLNs and lung at a rate parallel to the
accumulation of effector T cells (13). In the M. tuberculosis-infected lung, regulatory
T cells accumulate in high numbers in all sites where CD4+ T cells are found,
including perivascular/peribronchiolar regions and within lymphoid aggregates of
granulomas. When regulatory T cells were depleted before aerosol infection with M.
tuberculosis, there was a significant decrease in the Colony-Forming Units (CFU) in
the lung (13). Pathogen-specific regulatory T cells are capable of delaying the priming
of effector CD4+ and CD8+ T cells in the pLNs and their subsequent accumulation in
the lung. The delay in the activation of adaptive immune response mediated by
regulatory T cells prolongs the initial phase of bacterial expansion (14). These
collective data show that regulatory T cells are detrimental for the control of M.
tuberculosis infection. However, theses studies did not focus on the magnitude of
inflammation. Our group has found that regulatory T cells may represent a
susceptibility factor in TB, since infected BALB/c mice produced lower levels of
IFN-γ and IL-17, exhibited higher number of bacilli in the lung and a higher
suppressor activity regulatory T cells compared to C57BL/6 mice at the chronic phase
of the infection (15). Our study highlight that regulatory T cells may be beneficial or
detrimental depending on magnitude of inflammatory response of the host.
85 ANEXO
The adequate recruitment and function of regulatory T cells to the lung is
driven by chemokine receptor 4 (CCR4) (16-18). Although it has been described an
increase in the expression of CCR4 and its ligands, CCL17 and CCL22, during the
infection with M. tuberculosis (19, 20), the role of these receptor in TB has not been
addressed. Moreover, regulatory T cells may affect differently in a time-dependent
manner the M. tuberculosis infection.
We aimed to study the magnitude of the lung inflammation and its association
with the infection control by assessing the migration and function of regulatory T
cells in M. tuberculosis infected CCR4-deficient (CCR4-/-) mice. We found that the
absence of CCR4 impaired the recruitment of regulatory T cells in the early, initial
and chronic phase of the infection, although it had increased lung histopathology and
the susceptibility only at the chronic phase of infection. Moreover, CCR4 deficiency
decreased the suppressor function of regulatory T cells and promoted a higher
activation and migration of IFN-γ producing CD4+ cells to the lung. Adoptive transfer
of Foxp3+ cells restored the resistance of infected CCR4-/- mice likewise to infected
WT mice.
86 ANEXO
METHODS
Animals. Specific pathogen free female C57BL/6 (WT) and CCR4 deficient (CCR4-/) mice, 6-8 weeks old, were obtained from the local breeding facility of the Medical
School of Ribeirão Preto, University of São Paulo (FMRP-USP), Brazil. Transgenic
Foxp3-GFP+ mice were provided by the laboratory of Dr. Alexander Rudensky (21).
All animals were maintained under barrier conditions in a level III biosafety
laboratory with free access to sterile food and water. All procedures were performed
according to the local research ethics committee of FMRP-USP (protocol number
135/2012).
Bacteria and infection. The H37Rv M. tuberculosis (American Type Culture
Collection 27294, Rockville, MD) was grown in 7H9 Middlebrook Broth (DIFCO
Laboratories, Detroit, MI, USA) for 7 days, at 37ºC. The culture was harvested as
previously described (22). The bacterial suspension was diluted in PBS (phosphate
buffered saline) and adjusted according to the number 1 McFarland scale (22). Mice
were anaesthetized by intraperitoneal injection of 100 µL of a saline solution
containing 20% Ketamine (Ketamina Agener, Embu-Guaçu, SP, Brasil) and 10%
Xylazine (Dopazer® Laboratorios Calier S.A., Barcelona, Espanha). Followed by
administration of 1 x 105 bacilli by the intratracheal route (23). The lungs were
evaluated 15, 30 or 70 days after infection as indicated in each experiment.
Colony Forming Units assay and processing of lung cells. The lower and middle
right lobes of the lungs and the spleen were washed with sterile PBS, and each was
placed in a Petri dish containing incomplete RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO,
USA) medium and processed as previously reported (24). For Colony Forming Unit
(CFU) determination, serial dilutions (100, 1000, 10.000 and 100.000) of digested
lungs and serial dilutions (10, 100, 1000, and 10.000) of digested spleen were plated
87 ANEXO
on supplemented 7H11 agar media (Difco, Becton, Dickinson and Company, Le Pont
de Chaix, France). The CFU number was counted 28 days after incubation at 37ºC,
and results are expressed as the Log10 of CFU/lung and Log10 of CFU/spleen. For the
cell culture experiments, lungs and spleen were digested as described above and then
passed through a 100 µm Cell Strainer (BD Biosciences, Becton Circle, Durham, NC,
USA), pelleted by centrifugation for 10 minutes at 400 x g and resuspended in
complete RPMI-1640 medium (10% FBS, 10 µg/mL of gentamicin, 100 U/mL of
penicillin and 100 µg/mL of streptomycin). Total cell counts were determined in a
Countess™ automated cell counter (Invitrogen Eugene, Oregon, USA).
Flow cytometry. Lung cells were initially incubated for 40 minutes at 4ºC with Fc
Block (1 µg / 1 x 106 cells; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) followed by
incubation with monoclonal antibodies (0.5 µg / 1 x 106 cells) for 30 minutes at 4ºC in
total darkness. To characterize lymphocytes populations, the following monoclonal
antibodies were used: anti-CD3 (clone 145-2C11), anti-CD4 (clone L3T4), anti-CD25
(clone PC61), anti-CCR4 (2G12), anti-CD39 (clone Duha59), anti-CD73 (clone
TY/11.8). After staining for cell surface molecules, Foxp3 (clone MF23), T-bet
(clone: O4-46), Rorγ-t (clone: AFKJS-9), GATA-3 (clone: L50-823) and anti-Ki-67
(clone SolA15) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, eBioscience, San Diego, CA,
USA or Biolegend, San Diego, CA, USA) were stained using a Foxp3/Transcription
Factor Staining Buffer Set (eBioscience, San Diego, CA, USA) based on the
manufacturer’s instructions.
For intracellular detection of cytokines, cells were fixed with 4% formaldehyde
diluted in PBS and incubated for 11 minutes. Then, 1 mL of PBS was added to the
cell suspension, which was incubated for 18 hours at 4ºC. For permeabilization, the
cell suspension was centrifuged at 350 x g at 4ºC for 10 minutes and washed with
88 ANEXO
PBS containing 1% FBS and 0.2% saponin. After washing, cells were incubated for
20 minutes at 4ºC with 10% rabbit serum to block the Fc receptor, followed by
incubation with anti-CD4 (clone L3T4), anti-IFN-γ (clone XMG1.2), anti-IL-17
(clone TC11-18H10), anti-IL-4 (clone 11B11) and anti-IL-10 (clone JES5-16E3) for
30 minutes at 4º C in total darkness.
Data on cells were acquired by flow cytometry using BD FACSCanto II (BD
Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA). One hundred thousand events per sample were
collected and analyzed according to size, granularity and fluorescence intensity using
FlowJo 7.6.1 TM Software (Tree Star, Inc., Ashland, Oregon, USA).
Polymerase chain reaction (PCR) in real time. Total RNA was isolated and
purified from lung using an illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE
Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) according to the manufacturer's
instructions. The RNA was quantified in a NanoDropTM 1000 spectrophotometer
(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA), and cDNA synthesis was
performed using Reverse Transcriptase SuperScriptTM II (Invitrogen, Life
BiotechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA). Real-time PCR was performed using
Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2x) (Thermo Fisher Scientific, Inc.
Waltham, MA, USA) in the StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA). The samples were amplified using the following
conditions: initial denaturation at 95°C for 10 minutes, followed by 40 cycles at 95°C
for 15 seconds, an annealing phase at 58°C for 30 seconds and an extension phase at
72°C for 30 seconds. The samples were analyzed using the Ct (Threshold Cycle)
method. Gene expression was calculated as 2-(ΔΔCt), which ΔΔCt = ΔCt (sample) –
ΔCt (calibrator) and ΔCt (sample) = Ct (target gene) – Ct (normalizer = β-Actin). The
following primer sequences were used: CCR4 (sense: CGA TTC CAA AGA TGA
89 ANEXO
ATG CCA, anti-sense: TCC CCA AAT GCC TTG ATA CC), CCL17 (sense: GAA
GTC CCT GTT CCC TTT TTT, anti-sense: TGT GTT CGC CTG TAG TGC ATA),
CCL22 (sense: ATG GTG CCA ATG TGG AAG A, anti-sense: TAAAGC TGA
TGG CAG AGG GT), and β-Actin (sense: CCC TAG GCA CCA GGG TGT GA,
anti-sense: GCC ATG TTC AAT GGG GTA CTT C) CXCR3 (sense: AAC GTC
AAG TGC TAG ATG CCT, anti-sense: TCT CGT TTT CCC CAT AAT CG) e
CCR5 (sense: TGC ACA AAG AGA CTT GAG GCA, anti-sense: AGT GGT TCT
TCC CTG TTG GCA) . The primers for CCR4, CCL17, CCL22, CXCR3 e CCR5
were kindly provided by Dr. João Santana da Silva (FMRP-USP).
Cytokine production. Concentrations of IFN-γ, IL-17, IL-4 and IL-10 were
determined in the left lung lobe homogenates by ELISA using the immunoassay kit
BD OptEIA
TM
Set (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) and DuoSet® ELISA
Development System (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) according to the
manufacturer’s instructions.
Isolation of spleen CD4+CD25- and CD4+CD25+ cells. CD4+CD25+ and
CD4+CD25- cells were isolation from the total splenic cell population using a MACS
CD4+CD25+ Regulatory T cells Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Germany) according to the manufacturer’s instructions.
Proliferation analyses. After the isolation spleen cells, 1 x 105 CD4+CD25- cells and
0,25 x 105 CD4+CD25+ cells (ratio of 1:4) were co-cultured in 96 wells plate (BD,
Franklin Lakes, NJ, USA). The co-culture was stimulated with concavalin A (ConA 40 µg/mL) at 37°C and 5% CO2 for 96 hours. As a positive control, alone CD4+CD25cells were stimulated and as a negative control, CD4+CD25- cells were left nonstimulated. The proliferation was evaluated by Ki-67 expression.
90 ANEXO
Transfer of Foxp3-GFP+ cells. Foxp3-GFP+ Treg cells were isolated from the
spleens of uninfected mice by sorted according to GFP fluorescence using
FACSAria™ Cell Sorter (BD, San Jose, CA, USA). Next, mice with 60 days of
infection were inoculated intratracheally with 50 µL containing 5 x 105 Foxp3-GFP+
Treg cells. At 10 days after the transfer a CFU assay was performed.
Histopathology. The upper right lobes of the lungs were fixed in 3.7% of
formaldehyde, embedded in paraffin blocks and then sectioned for light microscopy.
For the histopathological analyses sections of 5 mm were stained with hematoxylin
and eosin (HE) to characterize the cellular infiltrate. The images were analyzed using
ImageI software (NIH Image, Bethesda, MD, USA).
Statistical analysis. The data were analyzed with PRISM 5.0 software (GraphPad
Software, Inc., San Diego CA, USA). First, the data normality was evaluated by
Kolmogorov-Smirnov test. Next, the statistical significance between two groups was
estimated using a two-tailed t test for parametric data and a Mann-Whitney U-test for
non-parametric data. The data from experiments with three or more groups were
analyzed using one-way ANOVA with the Tukey test for parametric data and
Kruskal-Wallis test for non-parametric data. The data are expressed as the mean ±
standard error of mean (SEM). Values of P ˂ 0.05 were considered significant. The
correlation analyses were determined by Pearson’s correlation coefficient.
91 ANEXO
RESULTS
Increase of the CCL17 and CCL22 production and migration of CD4+CCR4+
and CD4+Foxp3+CCR4+ cells within the lungs of M. tuberculosis-infected mice
Although CCR4 induces the recruitment of regulatory T cells to the lungs, it
also participates in the recruitment of Th2 cells. We have previously shown that
during in M. tuberculosis chronic infection there is an increase of IL-4 and IL-10
production and regulatory T cells in the lung of infected BALB/c mice (15, 25).
Therefore, we first assess the expression of CCR4 and its ligands at 70 days of
infection. We found a significant increase of CCR4 gene expression in the lungs of
infected mice (Figure 1a) as well as an increase in the CCL17 and CCL22 production
in the lung homogenates compared to uninfected mice (Figure 1b, c). In addition,
infected mice showed a higher frequency and number of CD4+CCR4+ and
CD4+CCR4+Foxp3+ cells (Figure 1d-h). These results show that M. tuberculosis
infection stimulates the migration of CCR4-expressing CD4+ cells and CCR4expressing regulatory T cells as well as the production of its ligands at the site of
infection.
CCR4 affects in a time-dependent manner the M. tuberculosis infection and it is
associated with a decreased influx of regulatory T cells
To address the role of CCR4 on M. tuberculosis infection, we first recovered
the bacilli from the lungs of WT and CCR4-/- infected mice at early, initial and
chronic phases of infection (15, 30 and 70 days, respectively). At 15 days of infection,
the deficiency in the CCR4 expression improved the resistance of animals compared
to the WT counterpart (Figure 2a), although there was no difference in the bacillus
number quantified in the spleens of CCR4-/- and WT mice (Figure 2b). At 30 days of
92 ANEXO
infection, there was no difference in the CFU counts either in lungs or spleens
(Figure 2a, b). During the chronic phase, infected CCR4-/- mice were more
susceptible to M. tuberculosis infection compared to WT counterpart, as observed the
significant CFU recovery in the lungs and spleens (Figure 2a, b).
Next, we quantified frequency and total cell CD4+ and CD4+Foxp3+ cellular
infiltrate in the lungs. The frequency of CD4+ cells was similar between infected
CCR4-/- group and WT counterpart compared 15, 30 and 70 days of infection,
respectively (Figure 2c). However, a significant increase in the number of CD4+ cells
was obtained in the lungs of infected CCR4-/- animals at 15 and 70 days of infection
(Figure 2d). As expected, a decrease in the frequency of CD4+Foxp3+ cells was
found in the lungs of infected CCR4-/- mice in each period evaluated compared to the
WT countepart (Figure 2e, g). The analysis of total CD4+Foxp3+ cells revealed a
significant decrease at 15 and 70 days of infection in the lungs of infected CCR4-/mice compared to WT mice (Figure 2f). We observed a significant inverse
correlation in the frequency of CD4+ and CD4+Foxp3+ cells evaluated in the lungs of
infected CCR4-/- mice at 70 days of infection (Figure 2n), while there was no
correlation of these cell populations for infected CCR4-/- groups at 15 and 30 days of
infection or infected WT mice in all evaluated times (Figure 2h, j, m, i, l).
Absence of CCR4 increases the magnitude of the lung inflammation at the
chronic phase of M. tuberculosis-infection
Because CCR4-/- mice were more susceptible at the chronic phase of infection
and showed a decrease in the frequency and number of regulatory T cells, we
evaluated lung inflammation.
93 ANEXO
At 15 days of infection, infected CCR4-/- mice showed a slight reduction in the
impairment of lung parenchyma compared with infected WT mice (Figure 3a). After
30 days of infection, the involvement of the pulmonary parenchyma is similar
between infected WT and CCR4-/- mice (Figure 3a).
After 70 days of infection, the highest commitment of the pulmonary
parenchyma in infected CCR4-/- mice was evident compared to WT animals. In
addition, infected WT mice better contain the growth of the bacilli as noted by the
formation of structure granuloma, which it was no observed in the lung of infected
CCR4-/- mice (Figure 3a).
Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis-infected CCR4 deficient mice is
associated with a balance between Th1 cells and regulatory Foxp3+ T cells
Our findings show that the deficiency in the CCR4 expression affects
differentially the resistance to M. tuberculosis infection (Figure 2a), while decreases
the migration of CD4+Foxp3+ cells and increases the influx of CD4+ cells to the lungs
(Figure 2d-f). Considering that the chronic phase of the infection reflects better the
progression of the infection and the dichotomy: magnitude of the inflammation and
infection control, we focused our study on 70 days of infection.
Firstly, we quantified the ratio CD4+ cells and CD4+Foxp3+ cells in both
groups WT and CCR4-/-. Infected CCR4-/- mice exhibited a significant increase in the
ratio CD4+ / CD4+Foxp3+ cells compare to infected WT mice (Figure 4a).
Next, to address the participation of CD4+ populations, we determined the
frequency of Th1, Th17 and Th2 based on the analysis of transcription factors. The
Figure 4b shows the representative analysis of the evaluated transcription factors. In
the lungs of infected CCR4-/- mice there was a significant increase in the frequency of
94 ANEXO
CD4+Tbet+ cells and reduction in both CD4+RORγt+ cells and CD4+GATA-3+ cells
compared to infected WT mice (Figure 4c).
In an attempt to associate directly the bacterial load and CD4+Foxp3+ cells,
CD4+Foxp3+ cells and CD4+Tbet+ cells, we established correlations in the infected
CCR4-/- and WT mice. A significant positive correlation between CFU number and
CD4+Foxp3+ cells (r = 0.7001, p = 0.0006) was found for WT mice, but not for
CCR4-/- mice (Figure 4d, e). A significant correlation between CD4+Foxp3+ cells and
CD4+Tbet+ cells was found for the WT (r = 0.8409, p = 0.045) (Figure 4f) and CCR4/-
mice (r = 0.9045, p = 0.0003) (Figure 4g).
These results show that M. tuberculosis infection stimulates the migration of
both CD4+ and CD4+Foxp3+ cells to the lungs. However, while the frequency of
CD4+Foxp3+ cells was positively correlated with CFU counts in WT mice, this
correlation was not observed for CCR4-/- mice, which exhibited a significant
reduction of regulatory T cells in the lungs and higher CFU counts.
Infected CCR4-/- mice exhibit higher IFN-γ levels and IFN-γ-producing CD4+
cells
To confirm the exacerbated recruitment of Th1 cells, characterized by the
presence of high frequency of CD4+Tbet+ cells into the lungs of infected CCR4-/mice, we first evaluated the production of cytokines, which are hallmark of different
CD4+ cell populations in the lung homogenates. Significant concentrations of IFN-γ
were detected in the CCR4-/- group compared to WT group (Figure 5a). In addition, a
reduction in the IL-17 levels (Figure 5b), similar IL-4 levels (Figure 5c) and increase
of IL-10 (Figure 5d) levels were obtained for CCR4-/- animals compared to WT mice.
We also evaluated the frequency of IFN-γ-, IL-4-, IL-17 and IL-10-producing CD4+
95 ANEXO
cells in the lungs of both groups. The Figure 5e illustrates the representative analysis
of cytokine-producing CD4+ cells. Infected CCR4-/- mice exhibited a significant
higher frequency of IFN-γ-producing CD4+ cells, while there was no difference in the
IL-17, or IL-4-, or IL-10-producing CD4+ cells (Figure 5f). The correlation of
CD4+IFN-γ+ cells and CFU number was positive and significant for both groups (WT:
r = 0.7886, p = 0.0008; CCR4-/-: r = 0.5687; p = 0.021) (Figure 5g, h).
These collective findings suggest that in the M. tuberculosis-infected WT
mice, an increase of regulatory T cells is detrimental for bacterial control. However,
the absence of CCR4, which clearly reduces the recruitment of regulatory Foxp3+
cells, favors an exacerbated augment of IFN-γ-producing CD4+ cells at the site of
infection that also impairs bacterial control. Therefore, we quantified CCL17 and
CCL22 levels and observed that in the absence of CCR4, CCL17, but not CCL22, was
reduced in the lung homogenates (Figure 6a, b). Next, we evaluated the gene
expression of chemokine receptors involved in the recruitment of Th1 cells. Either
CXCR3 or CCR5 gene expression was increased in the lungs of infected CCR4-/mice (Figure 6 c, d).
Deficiency of CCR4 in regulatory T cells impairs their suppressive function
Besides to participate of regulatory T cell influx to the lungs, CCR4 also plays a role
in the function of this cell population (16, 26). Before to addressing the suppressor
function of regulatory T cells, we first analyzed the phenotype of CD4+Foxp3+ cells
based on the expression of CD39 and CD73. CD39 (ENTPD1; ectonucleoside
triphosphate diphosphohydrolase 1) and CD73 (ecto-5'-nucleotidase) are enzymes
responsible for converting ADP/ATP to adenosine, which mediate suppressive
activity of regulatory T cells (27, 28). There was no difference in the frequency of
96 ANEXO
CD4+Foxp3+CD39+ cells (Figure 7a), but there was a reduction in the total number of
CD4+Foxp3+CD39+ cells (Figure 7b) and in the frequency and total number of
CD4+Foxp3+CD73+ cells (Figure 7d, e). Furthermore, the median fluorescence
intensity (MIF) of CD39 and CD73 in the CD4+Foxp3+ cells was reduced in the
infected CCR4-/- mice compared to infected WT mice (Figure 7c, f). We also
assessed the expression of CTLA-4, PD-1 and GITR in CD4+Foxp3+ cells, but we
found no significant differences between groups (data not shown).
Next, we evaluated the suppressor function of regulatory T cells obtained from WT
and CCR4-/- mice in vitro. CD4+CD25- spleen cells obtained from uninfected WT
mice were co-cultured with CD4+CD25+ spleen cells, purified from infected or noninfected WT or CCR4-/- mice as depicted in the Figure 7g. The Figure 7h-j shows the
gate strategy used to confirm that CD4+CD25- cells were Foxp3- and CD4+CD25+
cells were Foxp3+ regulatory cells and to quantify the proliferation of effector
CD4+CD25- cells according to the expression of Ki-67. Regulatory T cells purified
from infected or non-infected WT mice inhibited the proliferation of effector T cells.
However, regulatory T cells purified from non-infected CCR4-/- mice showed a lower
suppressor function compared with regulatory T cells of non-infected WT mice. In
addition, regulatory T cells purified from infected CCR4-/- mice lost their suppressor
capacity, as the proliferation of CD4+CD25- cells co-cultured with regulatory T cells
from infected CCR4-/- mice was comparable to the proliferation of effector cells
cultured only with polyclonal stimulation, in the absence of regulatory T cells (Figure
7k).
These results suggest that in the absence of CCR4 in the Treg cells affect its
functional activity, possibly due to lower expression of CD39 and CD73
ectonucleotidases by these cells.
97 ANEXO
Foxp3-GFP+ cell transfer renders CCR4-/- mice more resistant to M. tuberculosis
infection
Considering the change in the suppressor activity of regulatory T cells of
infected CCR4-/- mice evaluated in vitro, we next evaluated the suppressor function of
these cells in vivo. Foxp3-GFP+ cells (5 x 105) were sorted from non-infected mice
and intratracheally transferred to WT or CCR4-/- mice at 60 days infection. On Day 70
post infection, the lungs were collected for the quantification of CFU number and
IFN-γ and IL-10 levels (Figure 8a).
The transfer of Foxp3-GFP+ cells to infected CCR4-/-, but not to infected WT
mice, caused a significant decrease in the number of CFU in the lungs (Figure 8b, c)
compared with the number of CFU recovered from the lung of infected CCR4-/- mice
that did not undergo cell transfer. No difference in the number of CFU was found in
the lungs of infected WT mice, independent on Foxp3-GFP+ cell transfer (Figure 8b,
c). We also observed that the Foxp3-GFP cell transfer to infected CCR4-/- mice was
associated with reduction in the IFN-γ levels (Figure 8d), although it had no effect in
the IL-10 levels (Figure 8e).
These results suggest that the increase in susceptibility of CCR4-/- mice at the
chronic phase of M. tuberculosis-infection may be due to failure in the CD4+Foxp3+
cell-mediated regulation.
98 ANEXO
DISCUSSION
The differentiation and activation of regulatory T cells in the infectious
diseases may play a dual role: contributing for the pathogen multiplication or
balancing the tissue damage (10, 29). In TB, regulatory T cells have been described as
deleterious for the host immune response because they are associated with
progression of the infection and down-modulation of IFN-γ production (13, 14, 30).
However, improved treatments to treat M. tuberculosis infection need to consider the
early activation of adaptive immune response that could promote macrophage effector
functions and could prevent mechanisms that induce lung inflammation and damage.
In this study, to address the role of CD4+Foxp3+ cells during M. tuberculosis infection
considering both susceptibility and lung inflammation, we used CCR4-/- animals
because this chemokine receptor induces the recruitment of regulatory T cells into the
lung (16, 17).
Our initial hypothesis was that the deficiency in the CCR4 expression would increase
the resistance of infected mice because it would be directly associated with the
reduction in the recruitment of regulatory T cells to the site of the infection and
indirectly associated a higher and effective proinflammatory response. Our collective
findings show an increase in gene expression of CCR4 and in the population of
CD4+Foxp3+CCR4+ cells, besides higher levels of CCL17 and CCL22 in the lungs of
infected mice compared to non-infected mice. The CCR4 deficiency was associated
with a lower migration of CD4+Foxp3+ to the lung in the early (15), initial (30) and
chronic (70) phase of the M. tuberculosis infection. These results confirm the
participation of CCR4 in the recruitment of regulatory T cells to the lungs. However,
the absence of CCR4 affected differentially the resistence to M. tuberculosis infection
because it rendered Day15-infected mice more resistent and Day 70-infected mice
99 ANEXO
more susceptible in controlling lung bacterial replication. Previous study showed that
CD4+Foxp3+ cells expand in the initial phase of M. tuberculosis infection and delay
the migration of effector CD4+ e CD8+ cells (14, 31). In this context, a reduction in the
influx of regulatory T cells at the beginning of the infection, as observed in the
infected CCR4-/- mice, could minimize the delay in the induction of adaptive immune
response, already described in TB (32, 33). At 30 days of infection, in accordance to
results obtained by our group and others (15, 24, 34-36), C57BL/6 animals generate a
strong cellular immune response dependent on IFN-γ. However, they did not control
the infection. Therefore, a reduction in the influx of CD4+Foxp3+ cells at 30 days of
infection did not play an evident role in controlling pathogen replication. At 70 days
of infection, an imbalance in the recruitment of CD4+Foxp3+ cells, that was associated
with the augment of the effector function of CD4+ cells, was deleterious. Therefore,
considering the beginning of the infection, our results confirm previous studies that
attribute a deleterious role to Foxp3+ cells in TB (32, 37). However, our results also
suggest that CD4+Foxp3+ cells play time-dependent functions in TB.
Besides the lower frequency and number of CD4+Foxp3+ cells comparative to
infected WT mice, Day 70-infected CCR4-/- mice had an increase of IFN-γ levels, Tbet-expressing CD4+ cells and IFN-γ-producing CD4+ cells. Chronic infection is
complex because it is followed with an excessive inflammation and suppressor
immune mechanisms. Therefore, we focused at 70 days of infection to address how
the lower number of regulatory T cells could increase both the susceptibility and the
magnitude of the inflammation.
We show that the frequency of CD4+Foxp3+ cells was positively correlated
with the frequency of effector cells, suggesting the importance of balancing effector
and regulatory T cells for infection control. Moreover, higher CD4+Foxp3+ cells were
100 ANEXO
positively correlated with higher CFU counts in infected WT animals. These data are
supported by the lack of correlation between CD4+Foxp3+ cells and number of bacilli
in the infected CCR4-/- mice, and a positive correlation between IFN-γ-producing
CD4+ cells and number of bacilli also observed in infected CCR4-/- mice, suggesting
that the failure of the regulatory mechanisms, associated with the impairment in the
recruitment of CD4+Foxp3+ cells, increases the susceptibility, as a result of excessive
effector function and pulmonary inflammation, as observed by lung histoplathology.
In addition, we question whether the deficiency of CCR4 expression in
CD4+Foxp3+ cells could also affect the function of these cells. Cell transfer
experiments with CD4+CD25+ Treg cells from WT or CCR4-/- mice showed the
requirement of CCR4 for the suppressive activity of these cells (16, 26). While the
transfer of CCR4+ regulatory T cells protected against the development of colitis, the
transfer of CCR4- regulatory T cells failed to prevent the development of disease (26).
Similar result was observed in experimental allergic asthma, where the transfer of
CCR4+ regulatory T cells, but not CCR4- regulatory T cells, attenuated eosinophilia,
IL-4 and IL-5 production, and airway inflammation (16). We confirm, in vitro, that
spleen CD4+CD25+ regulatory T cells purified from infected CCR4-/- mice loose their
suppressor function compared to CD4+CD25+ regulatory T cells from non-infected
CCR4-/- or infected WT mice. Therefore, CCR4- regulatory T cells are lesser
suppressor than CCR4+ regulatory T cells. During M. tuberculosis infection, CCR4regulatory T cells even loose their suppressor function. It will be important to
decipher the microenvironment factors during the M. tuberculosis infection that direct
or indirectly interfere in the suppressor function of CD4+CD25+Foxp3+ cells. Our
results raised a possible mechanism by which the suppressor function of regulatory T
cells was impaired in CCR4-/- mice. We found a lower expression of CD39 and CD73
101 ANEXO
ectonucleotidades in lung CD4+Foxp3+ cells from infected CCR4-/- mice compared to
infected WT mice. Regulatory T cells express high levels of surface CD39 and CD73
(27, 28) which convert ADP/ATP extracellular to adenosine, one of the mediators of
suppressor properties of these cells (38). Foxp3 induces CD39 expression (39), and
CD39 deficient mice loose their ability to suppress proliferation of effector
CD4+CD25- cells, while soluble form of CD39 reverts this effect (27).
The reduction in the recruitment and function of CD4+Foxp3+ cells was associated
with increased frequency of IFN-γ-producing CD4+ cells and increased IFN-γ levels.
Eexcessive inflammation, induced high levels of IFN-γ, contribute to lung injury and
infection spreading (7). Recently, it was demonstrated that IFN-γ stimulates the
formation of extracellular traps and bacterial aggregation by macrophages during M.
tuberculosis-infection. Both IFN-γ–inducible events, require the ESX-1 secretion
system. In addition, IFN-γ is found to enhance ESX-1–mediated macrophage necrosis
(40). Therefore, IFN-γ induces protective responses against infection (2, 41, 42) and,
simultaneously, M. tuberculosis uses this cytokine to promote their survival. This
evidence show that low or high levels of inflammation are deleterious to the host
infected with M. tuberculosis, and address the importance of the regulatory pathways
of the inflammatory response during M. tuberculosis infection. Excessive
inflammatory response as consequence of the reduction in the number and function of
regulatory T cells, observed in infected CCR4-/- mice, generates increased of
immunopathology. We confirm, in vivo, by transfer of Foxp3-GFP+ cells to infected
CCR4-/- mice, that during the chronic infection, regulatory T cells contribute for the
control of pathogen multiplication, possibly because they balance IFN-γ-mediated
inflammation. Our findings highlight that the use of CD4+Foxp3+ cells as a target for
immunotherapy would take into account the phase of the disease, and also the
102 ANEXO
definition of parameters to evaluate the level of inflammatory response of the infected
host, considering all forms of M. tuberculosis infection.
103 ANEXO
LEGENDS
Figure 1. Infected mice show a higher expression of CCR4, CCL17 and CCL22
in the lung than uninfected mice. WT mice were infected (black bars) with 1 x 105
M. tuberculosis bacilli by the intra-tracheal route or left uninfected (white bars).
Seventy days after infection the lung were collected. Analyze by Real-Time PCR of
CCR4, CCL17 and CCL22 relative expression (a). Production of CCL17 (b) and
CCL22 (c) by ELISA. Representative analysis showing the frequency of CD4+CCR4+
cells and CD4+Foxp3+CCR4+ cells (d) is showed. Frequency and total number of
CD4+CCR4+ cells (e, f) and CD4+Foxp3+CCR4+ cells (g, h). Data are presented as the
mean ± SEM. Data are representative of two independent experiments (n = 5-12).
Bars show the difference (P < 0.05) between the groups.
Figure 2. Absence CCR4 expression impact of time-dependent manner during
M. tuberculosis infection. WT (white bars) and CCR4-/- (black bars) mice were
infected with 1 x 105 M. tuberculosis bacilli by the intra-tracheal route. Followed
fifteen, thirty and seventy days of infection the lung were collected. CFU number
from the lung (a) and spleen (b). Frequency and total number of CD4+ cells (c, d) and
CD4+Foxp3+ cells (e, f). Representative analysis showing the frequency of CD4+ and
CD4+Foxp3+ cells (g). Correlation between CD4+Foxp3+ and CD4+ cells from lung of
infected WT and CCR4-/- mice infected at 15 (h, i), 30 (j, l) and 70 (m, n) days. Data
are presented as the mean ± SEM. Data are representative of one experiments
repeated twice or thrice
(n = 3-9) for CFU number and three independent
experiments (n = 14-20) for cytometry and correlation analyses. Bars show the
difference (P < 0.05) between the groups. To statistic analyze of correlation, Pearson
104 ANEXO
(R) test was applied. Values of R and P were indicated when there was significant
difference.
Figure 3. Infected CCR4-/- mice show a higher pulmonary immunopathology
than infected WT mice. WT (white bars) and CCR4-/- (black bars) mice were
infected with M. tuberculosis as described in Figure 2. Followed fifteen, thirty and
seventy days of infection the lung sections were stained with HE and photographed at
200x magnification are showed (a). Data are representative of 6 independent
experiments (n = 4-12).
Figure 4. Infected CCR4-/- mice exhibit higher populations of CD4+Tbet+ cells in
consequence of the higher CXCR3 and CCR5 expression. WT (white bars) and
CCR4-/- (black bars) mice were infected with M. tuberculosis as described in Figure 2.
Followed seventy days of infection the lung were collected. Ratio between frequency
(a) and total number (b) of CD4+ cells and CD4+Foxp3+ cells from lung of infected
WT and CCR4-/- mice. Representative analyses showing the frequency of CD4+Tbet+,
CD4+RORt+ and CD4+GATA-3+ cells is showed (c). Frequency of CD4+Tbet+,
CD4+RORγt+ and CD4+GATA-3+ cells (d). Correlation between CD4+Foxp3+ versus
CFU/lung (e, f) and CD4+Foxp3+ cells versus CD4+Tbet+ cells (g, h) from lung of
infected WT and CCR4-/- mice. Data are presented as the mean ± SEM. Data are
representative of three independent experiments (n = 7-24). Bars show the difference
(P < 0.05) between the groups.
Figure 5. Infected CCR4-/- mice induce a Th1 cell-mediated immune response at
a higher magnitude than infected WT mice. WT (white bars) and CCR4-/- (black
105 ANEXO
bars) mice were infected with M. tuberculosis as described in Figure 2. Followed
seventy days of infection the lung were collected. Production of IFN-γ (a), IL-17 (b),
IL-4 (c) and IL-10 (d) by ELISA. Lung cells were first previously gated on CD4+
cells for subsequent analyze. Representative analyses showing populations of
CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17+ and CD4+IL-10+ cells (e). Frequency of
CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17+ and CD4+IL-10+ cells (f). Correlation between
CD4+IFN-γ+ cells and CFU number from lung of infected WT (g) and CCR4-/- (h)
mice. Data are presented as the mean ± SEM. Data are representative of two-three
independent experiments (n = 7-15). Bars show the difference (P < 0.05) between the
groups.
Figure 6. Infected CCR4-/- mice exhibit lower levels of CCL17, CXCR3 and
CCR5. WT (white bars) and CCR4-/- (black bars) mice were infected with M.
tuberculosis as described in Figure 2. Followed seventy days of infection the lung
were collected. Production of CCL17 (a) and CCL22 (b) by ELISA. Analyze by RealTime PCR of CXCR3 (c) and CCR5 (d) relative expression. Data are presented as the
mean ± SEM. Data are representative of two-three independent experiments (n = 812). Bars show the difference (P < 0.05) between the groups.
Figure 7. CCR4- Treg cells show impaired suppressive function. WT (white bars)
and CCR4-/- (black bars) mice were infected with M. tuberculosis as described in
Figure 2 or left uninfected. Followed seventy days of infection the spleen was
collected. Frequency, total number and median intensity fluorescence of
CD4+Foxp3+CD39+ cells (a, b, c) and CD4+Foxp3+CD73+ cells (d, e, f) were
evaluated. To co-culture, CD4+CD25- (effector) cells from spleen of uninfected WT
106 ANEXO
mice and CD4+CD25+ (regulatory) cells from spleen of uninfected or infected WT or
CCR4-/- mice were purified by magnetic column. Next, 1 x 105 CD4+CD25- cells were
co-cultered with 0,25 x 105 CD4+CD25+ cells (1:4 ratio) and stimulated or not with
ConA (40µg/mL) (g). As a positive control, alone CD4+CD25- cells were stimulated
with ConA (gray bar). After 96 hours of co-culture, the cells were stained with antiCD4, anti-CD25, and anti-Ki-67 for proliferation analyses. The populations of
CD4+CD25- cells were defined (h) and the expression of Ki-67 was evaluated (i).
Determination of the expression of Foxp3 in CD4+CD25- cells and CD4+CD25+ cells
(j). The percentage of proliferation in accordance with the staining for Ki-67 into
CD4+CD25- cells, in the different conditions, was evaluated (k). Data are presented as
the mean ± SEM. Data are representative of one experiments repeated twice (n = 3-5).
Bars show the difference (P < 0.05) between the groups.
Figure 8. Transfer of functional Treg cells improved ability of infected CCR4-/mice in bacilli control. WT (white bars) and CCR4-/- (black bars) mice were infected
with M. tuberculosis as described in Figure 2. On sixty day after infection, spleen 5 x
105 Foxp3-GFP+ cells were transferred to infected WT or CCR4-/- mice by
intratraqueal route. As negative control, infected mice were left without transfer.
Followed ten days, lungs were collected (a). Lung CFU number from two
experiments (b, c). Production of IFN-γ (d) and IL-10 (e) by ELISA. Data are
presented as the mean ± SEM. Data are representative of one experiments repeated
twice (n = 4-8). Bars show the difference (P < 0.05) between the groups.
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110 ANEXO
Figure 1
111 ANEXO
Figure 2
112 ANEXO
Figure 3
113 ANEXO
Figure 4
114 ANEXO
Figure 5
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Figure 6
116 ANEXO
Figure 7
117 ANEXO
Figure 8
118

Deficiência na expressão de CCR4 reduz a capacidade supressora

Transcrição

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