CANAL BQ _ Stem Cells

Transcrição

n.º 7_DEZEMBRO_2010
ENCONTROS E SOCIEDADES CIENTÍFICAS
ÍNDICE
FICHA TÉCNICA
COORDENAÇÃO CIENTIFICA
João Varela (CCMAR, U. Algarve)
EQUIPA EDITORIAL
Francisco Ambrósio (IBILI, U. Coimbra)
Graça Soveral (REQUIMTE, U. Lisboa)
Leonor Cancela (CCMAR, U. Algarve)
Claúdio Soares (ITQB, UNL)
Nuno Santos (FM, U. Lisboa)
DESIGN GRÁFICO E PAGINAÇÃO
Paulo Simão
([email protected])
3.
Editorial
João Varela
4.
?
?
7.
?
?
10.
?
?
12.
?
?
14.
?
?
15.
?
TIRAGEM
Versão electrónica
PERIODICIDADE
Quadrimestral
PROPRIETÁRIO
Sociedade Portuguesa de Bioquímica
E-MAIL
[email protected]
URL
www.canalbq.spb.pt
2.
canalBQ_n.º 7_DEZEMBRO_2010
?
21.
?
EDITORIAL
João Varela
Graças ao convite do director cessante e actual presidente da Sociedade Portuguesa de Bioquímica, e com a
aprovação da direcção da SPB, foi me dada a oportunidade de continuar o projecto editorial da SPB, designado
por Canal bq. Esta oportunidade é, sem dúvida, um desafio e traz grandes responsabilidades. Canal bq — daí o
seu nome — foi concebido para ser um canal de comunicação da comunidade que ensina, investiga e negoceia
no grande mundo que é a bioquímica e campos afins, que vão desde a biotecnologia até à medicina. Desde o
início que um dos objectivos deste canal de comunicação é expandir a bioquímica para além da academia e unidades de I&D e abraçar a Sociedade, explicando os impactos que a bioquímica tem e pode ter no “Mundo Real”.
Com este novo número, pretendo iniciar um rumo um pouco diferente dos anteriores, privilegiando mais os
artigos de revisão científica, e menos as entrevistas e os artigos de opinião, embora estes não sejam excluídos
completamente da politica editorial do Canal bq. Porém, tenho a firme intenção de manter o carácter temático
de cada número. Deste modo, este número é dedicado a um tema actual que, embora potencialmente polémico
oferece grandes promessas para o futuro, nomeadamente na área da medicina regenerativa: células estaminais.
É muito provável que a maioria de vós já tenha ouvido falar sobre células estaminais, mas talvez desconheça as
várias propriedades que as caracterizam, aplicações, funções, interacções com a bioengenharia e nanotecnologia, e o número de grupos que trabalham em Portugal com este tipo de células. Com este número do Canal
bq, pretende-se não só divulgar alguns grupos portugueses que realizam I&D sobre células estaminais, mas
também explicar o que elas são, para que servem, e como são (ou poderão ser) cultivadas. Os primeiros dois
artigos (Bragança et al. e Correia & Bragança) são propositadamente introdutórios ao tema, sendo escritos em
português. Os restantes, escritos em português ou em inglês, são mais específicos e aprofundam o tema. Esta
variedade de tratamentos científicos, relativamente acessíveis a estudantes e a profissionais que se interessam
por ciência, não deixam de sumarizar o melhor que se faz em Portugal e no mundo. De modo a potenciar a
compreensão dos artigos deste número, pedi aos autores que escrevessem um glossário com definições de
termos chave, introduzidos a negrito.
Espero, sinceramente, que este número seja uma importante contribuição para uma melhor compreensão das
potencialidades das células estaminais, mas também das consequências éticas a elas associadas. O modo
como as células estaminais embrionárias humanas são obtidas tem repercussões muito semelhantes às levantadas pela Interrupção Voluntária da Gravidez (vulgo “aborto”), pois para as obter é necessário a destruição de
blastocistos, um estádio do desenvolvimento que antecede a formação do embrião e a placenta. Porém, neste
número são apresentadas alternativas muito promissoras às células estaminais embrionárias, que não implicam a desagregação de blastocistos, resolvendo, em larga medida, este problema bioético.
Por fim, desejo agradecer aos autores que contribuíram com o produto do seu esforço, tanto na forma de textos,
como figuras e diagramas, que foram concebidas propositadamente para este número.
3.
Células estaminais
e medicina regenerativa
Um admirável mundo novo
José Bragança 1,2, Álvaro Tavares 1,2 e José A. Belo 1,2
1 Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina. Universidade do Algarve, Campus de
Gambelas, 8005-139 Faro, Portugal
2 IBB-Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centro de Biomedicina Molecular e Estrutural, UAlg.
RESUMO
O progresso da investigação no domí-
Correspondência: jebraganç[email protected]
nio das células estaminais mostrou o
seu enorme potencial como fonte de
células ou de tecidos para terapias re-
INTRODUÇÃO
manas que, dada a sua capacidade de auto-
generativas, terapias génicas, desco-
As células estaminais definem-se por duas
renovação e diferenciação, têm um elevado
berta de novos fármacos, e identifica-
propriedades básicas: a capacidade de se
potencial para uso em terapia celular [1, 2]
ção dos mecanismos de aparecimento
auto-renovarem indefinidamente num es-
(Fig. 2, Tabelas 1 e 2).
e desenvolvimento de doenças. Nesta
tado indiferenciado e a possibilidade de se
revisão, apresentamos os diversos ti-
diferenciarem num ou mais tipos de células
Para além das células estaminais embrio-
pos de células estaminais com as suas
especializadas (Fig. 1 e Tabela 1). O traba-
nárias, há ainda as células estaminais ‘’adul-
características especificas, destacando
lho com células estaminais embrionárias
tas’’, que servem para manter as funções dos
algumas das suas aplicações em me-
(células ES, Embryonic Stem cells) de ra-
tecidos e órgãos onde estão presentes, bem
dicina regenerativa e terapia celular.
tinho tem sido uma ferramenta inestimável
como reparar lesões nos tecidos em caso de
na compreensão dos processos do desen-
trauma [1, 2] (Fig. 2). A diminuição da popula-
volvimento embrionário inicial, bem como
ção de células estaminais é característica de
no estabelecimento das bases moleculares
algumas doenças, por exemplo, em defeitos
da pluripotência e da auto-renovação celula-
da medula óssea, devido à malignidade das
res. Para além disso, por permitir a criação
células estaminais hematopoiéticas (resul-
de animais transgénicos (knock-outs) atra-
tando em leucemias e linfomas) ou a defeitos
vés de recombinação homóloga, estas são
genéticos nas próprias células estaminais
determinantes no estudo da função gené-
hematopoiéticas (anemia de Fanconi, por
tica in vivo. Não menos importante, os es-
exemplo). Outras doenças envolvem a des-
tudos das células ES de ratinho abriram o
truição de tecidos que não podem ser rege-
caminho à investigação das células ES hu-
nerados robustamente a partir da população
Figura 1. Propriedades das células estaminais. As células estaminais são células não especializadas que são capazes de se auto-renovar
indefinidamente, e assim dar origem a novas células estaminais não especializadas (em fundo verde), mas também têm a possibilidade
de se diferenciar em um ou múltiplos tipos de células especializadas sob condições definidas (em fundo amarelo).
4.
Tabela 1 – Características das células estaminais.
necessário mais investigação para se definir
protocolos de diferenciação mais eficientes,
em que seja garantida a pureza e estabilidade das células diferenciadas que viabilize a
sua utilização clínica.
Neste artigo de revisão, apresentamos a terminologia básica, definições e conceitos da
biologia de células estaminais e destacamos
residual de células estaminais, como por
caso de as células transplantadas estarem
algumas das suas aplicações em medicina
exemplo a diabetes tipo 1 (devida à destruição
contaminadas com células indiferenciadas,
regenerativa e terapia celular (Figs. 2 e 3,
auto-imune das células pancreáticas beta).
e (iii) risco de rejeição imunológica quando
Tabela 2). Parecem ser inúmeras as opor-
Em alguns casos, estas doenças podem ser
transplantadas em pacientes imunologica-
tunidades para o uso de células estaminais
tratadas por transplante do órgão em falên-
mente incompatíveis (Tabela 1). Contudo,
desde a terapia celular, terapia genética, en-
cia (para tratar insuficiências cardíacas, he-
em 2009, a Food Drug Administration (FDA)
genharia e regeneração de tecidos, rastreio
páticas ou pancreáticas, por exemplo), ou por
permitiu a realização do primeiro ensaio
de novos fármacos e testes toxicológicos, até
substituição da população de células estami-
clínico com células estaminais humanas
à compreensão de processos do desenvolvi-
nais (como no caso de transplante de medula
para o tratamento de pacientes com lesão
mento embrionário precoce. As células es-
óssea). No entanto, o transplante de órgãos
da medula espinal.
taminais abrem o caminho a novas áreas de
apresenta várias limitações, a maior sendo
investigação em ciência fundamental, trans-
a falta de dadores de órgãos e de tecidos,
Recentemente foi descrita a criação de cé-
lacional e em medicina.
com a dificuldade acrescida de restrições de
lulas estaminais pluripotentes induzidas (iPSC,
compatibilidade entre dador e receptor. Hou-
induced pluripotent stem cells) a partir de
ve, por isso, na década passada, um grande
células somáticas humanas ou de ratinho
ORIGEM E FONTES DE CÉLULAS ESTAMINAIS
interesse em usar células estaminais clini-
através da expressão forçada de factores de
Durante a embriogénese inicial, observa-
camente de modo a gerar células ou tecidos
transcrição definidos como essenciais para
se uma limitação gradual do potencial de
para reconstituir a população de células es-
a manutenção do estado de pluripotência
diferenciação das células constituintes do
taminais e para reparar os órgãos, respecti-
das células ES [3-9]. De acordo com os úl-
embrião (Fig. 2). O zigoto (oócito fecundado)
vamente (Fig. 2, Tabelas 1 e 2). Finalmente,
timos dados, as iPSC possuem proprieda-
e os blastómeros (células que constituem
uma limitação importante ao transplante de
des de auto-renovação e de pluripotência
a mórula no estado de 2 a 8 células) são as
órgãos tem sido a barreira imunológica, exi-
semelhantes às células ES, e foram já di-
únicas células totipotentes — isto é, células
gindo tratamentos de imunossupressão de
ferenciadas in vitro com sucesso em vários
com capacidade de originar todas as células
modo a evitar a rejeição do enxerto. A possi-
tipos celulares. Em alguns casos, as células
diferenciadas do organismo adulto, incluindo
bilidade de efectuar o transplante de células
diferenciadas foram utilizadas para corrigir
a parte fetal da placenta, o cordão umbilical
ou tecidos derivados de células estaminais
deficiências de patologias humanas em ani-
e as membranas extra-embrionárias. Após
adultas isoladas do próprio paciente (células
mais modelo. Assim, a reprogramação de
alguns ciclos de divisão celular adicionais,
autólogas) reduz essa limitação.
iPSC permite a obtenção de células com as
estas células totipotentes formam o blasto-
propriedades únicas das células ES, a partir
cisto, uma estrutura embrionária na qual as
Muito embora as células ES humanas te-
de células diferenciadas adultas do próprio
células começam a especializar-se, e a per-
nham um enorme potencial para terapia
paciente. Por isso, as iPSC são promissoras
der o potencial de se diferenciarem em todas
celular, o seu uso clínico imediato tem sido
para futuras terapias celulares tendo des-
as linhagens do organismo adulto. O blasto-
dificultado por (i) considerações éticas, (ii)
pertado a atenção generalizada de investiga-
cisto é uma esfera oca composto por uma
risco de originarem células indesejáveis no
dores e médicos (Tabela 1). No entanto, será
parede de células externas (trofoblasto) que
5.
forma uma cavidade (blastocélio) e que encerra num dos pólos um agregado de células
denominada botão embrionário. As células
do trofoblasto só são capazes de dar origem
aos tecidos extra-embrionários tal como a
placenta, ao contrário das células do botão
embrionário que vão dar origem ao epiblasto, precursor do embrião propriamente dito,
e que são o primórdio das três camadas germinais do embrião das quais derivam todos
os tecidos e órgãos. Assim, as células do
botão embrionário são consideradas pluripotentes e contêm células estaminais embrionárias (ES) com capacidade de formar todos os
220 tipos de células que constituem um organismo adulto, menos a placenta e tecidos
extra-embrionários. Por outras palavras, células pluripotentes não podem dar origem a
um indivíduo de maneira independente.
As células ES isoladas e cultivadas in vitro
podem ser propagadas como linhagens de
células estaminais embrionárias pluripotentes que têm a capacidade de proliferar
indefinidamente em cultura num estado
Figura 2. Fontes de células estaminais embrionárias e adultas. O desenvolvimento embrionário e fetal, a manutenção da homeostase dos
órgãos e tecidos adultos ao longo da vida, e respostas do organismo a lesões são governados por vários tipos de populações de células
estaminais. A temporização de alguns estádios do desenvolvimento (zigoto, mórula, blastocisto, embrião) em termos de horas e dias
após a fecundação do oócito estão indicados em caixas com fundo azul para seres humanos. Caixas com fundo cinzento indicam tempos equivalentes no ratinho, quando estes diferem dos primeiros. Até ao estádio de mórula as células são totipotentes, mas começam
gradualmente a perder a capacidade de diferenciação ao longo do desenvolvimento. As células da massa celular interna do blastocisto
pré-implantado (células verdes) podem ser isoladas e cultivadas in vitro, e assim dar origem a células estaminais embrionárias (células
ES) capazes de se auto-renovar. Estas células são pluripotentes, ou seja apresentam um potencial elevado de diferenciação, originando
todos os tipos celulares de um organismo adulto. As células estaminais do epiblasto (EpiSC) isoladas de blastocistos pós-implantados
de ratinhos (indicadas em caixa com fundo laranja) têm uma capacidade restrita de diferenciação em comparação com as células ES,
mas ainda são pluripotentes e podem dar origem a células das três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme) e a
células derivadas dessas camadas (indicadas nos quadros com fundo branco). As células ES humanas têm propriedades semelhantes
às que foram enumeradas para as EpiSC de ratinho. As células germinais embrionárias são também células pluripotentes derivadas
de células primordiais germinais, isoladas a partir de gónadas embrionárias. Muitos tecidos dos organismos adultos contêm células
imaturas que são referidas como células estaminais adultas ou somáticas e que servem para recompor as células perdidas por morte
celular normal do tecido ou para reparar o tecido danificado após uma doença ou lesão. Exemplos destas células estão indicados em
caixas de fundo roxo com os tecidos que geram referidos por baixo (a preto), bem como as patologias para as quais têm potencial terapêutico (a verde). As células estaminais somáticas têm menor plasticidade em comparação com as células ES ou EpiSC, e são apenas
multipotentes (ou por vezes unipotentes). As células estaminais dos tecidos fetais (neuronais, sangue do cordão umbilical ou líquido
amniótico, por exemplo) têm propriedades intermédias entre as células estaminais embrionárias e adultas em termos de potência
(indicadas em caixas com fundo azul com algumas linhagens que geram referidas por baixo a preto, e as patologias para as quais têm
potencial terapêutico, a verde).
indiferenciado (auto-renovação)[10-13]. Estabeleceu-se recentemente que, para além
um blastocisto hospedeiro e contribuir para
Nos tecidos e órgãos adultos dos vertebra-
das células ES habitualmente isoladas do
o desenvolvimento e formação do embrião,
dos superiores existem células estaminais
epiblasto antes da implantação do blasto-
mas são capazes de se diferenciar em múl-
adultas capazes de se auto-renovar e com
cisto no útero, também se podem derivar
tiplos tipos celulares e de formar teratomas
uma capacidade de diferenciação restrita a
células estaminais pluripotentes a partir do
se injectadas em ratinhos adultos [14, 15].
linhagens de células específicas dos tecidos
mesmo logo a seguir à implantação (Fig. 2),
As EpiSC de ratinho também se distinguem
ou órgãos onde estão localizadas [1, 2] (Fig.
chamando-se-lhes células estaminais do epi-
das células ES pelos genes que expressam e
2). As células estaminais adultas são ditas
blasto (Epiblast stem cells ou EpiSC) [14-16].
pelas vias de sinalização necessárias para as
multipotentes e provavelmente dão origem
As células ES mantêm propriedades do epi-
manter pluripotentes em cultura; vias idên-
a células progenitoras de linhagens de cé-
blasto inicial, o que lhes permite contribuir
ticas às necessárias para o crescimento de
lulas pós-mitóticas distintas que contribuem
para a formação dum embrião quando mi-
células ES humanas no estado pluripotente
para a homeostase e funções específicas
cro-injectadas num blastocisto hospedeiro
em cultura. Além disso, as EpiSC de ratinho
do órgão. No entanto, também existem nos
e consequentemente dar origem a qualquer
e as células ES humanas têm perfis de ex-
testículos neo-natais ou adultos de ratinho,
das células necessárias ao desenvolvimen-
pressão génica e capacidades de diferencia-
e por extrapolação em seres humanos, vá-
to e formação do organismo adulto [17-20].
ção semelhantes, sugerindo que as células
rios tipos de células estaminais germinais
Ao contrário das células ES, as EpiSC não
ES humanas tenham também uma origem
pluripotentes ou multipotentes. Finalmente,
são capazes de colonizar de maneira eficaz
epiblástica pós-implantação.
existem ainda as células estaminais de cancro
6.
ável ao longo da vida adulta. Por exemplo, as
células estaminais neurais do sistema nervoso central residem no ventrículo lateral
na zona subventricular ao longo da vida pósnatal e no giro dentado do hipocampo [25,
26]. No entanto, noutros casos a localização
das células estaminais pode ser muito mais
dinâmica, como por exemplo as células do
Figura 3. Células estaminais e terapia. Para utilização de células estaminais em terapia celular, é necessária a expansão de um grande
número de células em cultura. As células estaminais embrionárias (ES), adultas e fetais e as iPS derivadas de células somáticas têm
a capacidade de proliferar e de se auto-renovar em cultura. As células ES são as que proliferam melhor em cultura e que dão origem
a todos os tipos de células derivados das três camadas germinativas do embrião. As células ES são células já isoladas e estabelecidas
que não são derivadas do paciente, e por isso, estas células têm um grande potencial para utilização terapêutica alogénica. As células
estaminais fetais, tal como células as estaminais adultas ou somáticas contidas em muitos tecidos dos organismos adultos, podem ser
usadas para fins terapêuticos autólogos quando derivadas e usadas no próprio paciente. Estas células adultas também podem servir
para terapias de outros pacientes, neste caso sendo para transplantes alogénicos. No entanto, a capacidade de proliferação em cultura
destas células fetais e adultas é variável e mais limitada do que a capacidade das células estaminais embrionárias. As iPS são células
pluripotentes que poderiam ser originadas do próprio paciente e por isso seriam para fins terapêuticos autólogos e transplantes alogénicos. Depois da expansão das células estaminais em cultura, é preciso gerar tipos específicos de células diferenciadas, tais como
células musculares cardíacas, células do sangue ou células nervosas, através de, por exemplo, protocolos que modificam as condições
de cultura e a composição química dos meios de cultura. Uma vez diferenciadas, estas células de tipos específicos ou as estruturas
que estas células formam poderiam ser transplantadas nos pacientes de maneira autóloga ou alogénica para substituir, reparar ou
melhorar as funções de tecidos ou órgãos danificados.
sistema hematopoiético que em condições
quiescentes (steady-state) residem na medula óssea e ocupam nichos facultativos,
dispersos na superfície trabecular do osso
[23]. Por isso, as células estaminais hematopoiéticas estão constantemente em circulação de um compartimento da medula
óssea para outro (por exemplo, do fémur
à tíbia). Este movimento de um nicho para
outro permite a manutenção de células es-
que resultam da transformação de células
das células estaminais [23] (Fig. 4). Este
taminais hematopoiéticas em vários locais,
adultas capazes de originar e manter a mas-
microambiente tridimensional influencia e
e permite também uma mais eficiente ex-
sa celular de tumores [21, 22].
controla a expressão dos genes que defi-
pansão do número de células estaminais
nem as propriedades estaminais, ou seja, a
hematopoiéticas em resposta a estímulos. O
Finalmente, foram recentemente repro-
auto-renovação ou a diferenciação [24]. Até
baço e o fígado também contêm células es-
gramadas células estaminais pluripotentes
recentemente, os nichos eram um conceito
taminais hematopoiéticas, e, em condições
induzidas (iPSC) a partir de células somá-
teórico apoiado na observação de que as
normais ocorre apenas diferenciação limita-
ticas humanas ou de ratinho através da ex-
células estaminais transplantadas sobrevi-
da nesses órgãos. No entanto, a ocorrência
pressão forçada de factores de transcrição
viam e cresciam somente em locais espe-
de estímulos que induzem a hematopoiese
definidos [3-9]. As iPSC possuem as pro-
cíficos, presentes em números limitados
pode provocar níveis elevados de formação
priedades únicas (auto-renovação e pluri-
e saturáveis, nos tecidos transplantados.
de células sanguíneas no baço e no fígado,
potência) das células ES que lhes conferem
No entanto, tais estruturas foram recente-
indicando que estes órgãos são capazes de
um enorme potencial para futuras terapias.
mente caracterizadas em diversos tecidos
activar nichos facultativos que apoiam a
de invertebrados e permitiram estabelecer
manutenção das células estaminais hema-
princípios que provavelmente regem o com-
topoiéticas e hematopoiese a longo prazo.
NICHO DAS CÉLULAS ESTAMINAIS
portamento de nichos noutros organismos.
Esta capacidade de activação de nichos fa-
Por “nichos” entende-se estruturas celu-
É provável que, nos organismos adultos, a
cultativos não se limita ao sistema hema-
lares em tecidos e órgãos formando mi-
maior parte das células estaminais estejam
topoiético; por exemplo, a lesão da pele de
croambientes que fornecem sinais extrín-
num estado quiescente, mas que possam
um adulto pode levar à formação de novos
secos (sejam moléculas de sinalização
ser activadas por factores exógenos, en-
folículos capilares, que são depois coloniza-
intercelulares, ou interacções entre células
trando em divisão e diferenciação e assim
dos por células estaminais [27]. Foi também
estaminais e células vizinhas, ou ainda in-
contribuam para a renovação de tecidos/
demonstrado que a complexidade da organi-
teracções com a matriz extracelular) que,
órgãos ou para a reparação após lesão. Em
zação espacial das células estaminais em-
em combinação com factores intrínsecos,
alguns casos, as células estaminais ocupam
brionárias em culturas, em conjunto com os
determinam o comportamento e o destino
um nicho único, que é espacialmente invari-
factores exógenos (LIF, FGF e TGF-β, célu-
7.
Tabela 2. Aplicações terapêuticas potenciais de células para o tratamento de diversas patologias humanas adaptado da revisão feita por
Mimeault e colegas [59].
las de suporte) cria nichos ou microambientes heterogéneos que influenciam o destino
das células estaminais embrionárias [28].
CÉLULAS ESTAMINAIS PLURIPOTENTES
Células estaminais embrionárias
As células pluripotentes encontram-se apenas transitoriamente nos embriões porque
rapidamente se diferenciam em células somáticas ao longo do desenvolvimento (Fig.
com as espécies, que existem entre as célu-
factores de transcrição Nanog, Oct4 e Sox2,
2). Ainda assim, conseguiu-se pela primeira
las ES de ratinho e humanas, e também ao
os factores chave para manter as células
vez em 1981 derivar células estaminais em-
uso de meios de cultura baseados nos uti-
estaminais pluripotentes e que são necessá-
brionárias (células ES) pluripotentes do botão
lizados para células de ratinho que não se
rios para repressão da expressão de genes
embrionário de blastocisto de ratinho antes
adequaram a cultura de células ES huma-
promotores da diferenciação [14-16].
da implantação no útero [12, 13, 29]. As cé-
nas. De facto, ao contrário das células ES de
lulas ES derivadas de uma célula única têm
ratinho que se mantêm pluripotentes na pre-
Células estaminais pluripotentes induzidas
a capacidade de formar todos os 220 tipos
sença de LIF, a derivação de células ES hu-
A clonagem da ovelha Dolly demonstrou ser
de células que constituem um organismo
manas usando meio suplementado com soro
possível, em mamíferos, alterar o estado
adulto, e de formar teratomas quando in-
e LIF resultou em linhas celulares instáveis
epigenético de um núcleo diferenciado pela
jectadas em ratinhos. Células ES de rati-
que passavam rapidamente para um estado
sua integração num oócito enucleado, sen-
nho foram também obtidas por isolamento
diferenciado. Para a derivação a partir do
do esta célula híbrida uma célula totipotente
de blastómeros individuais de embriões em
botão embrionário, e para o sustento das
contendo o genoma da célula diferenciada
estado de duas a oito células [30, 31]. As pri-
células ES humanas em cultura, foi neces-
original [35]. Propôs-se imediatamente que
meiras células ES isoladas foram cultivadas
sário usar os factores de crescimento bFGF
esta técnica de transferência de núcleo so-
sobre camadas de fibroblastos inactivados
(basic Fibroblast Growth Factor) e Activin/
mático (SCNT, de somatic cell nuclear trans-
mitoticamente, mas ainda capazes de pro-
/Nodal/TGFβ (Tumor Growth Factor beta)
fer em inglês) fosse usada para a produção
duzir e secretar os factores de crescimento
que permitem a activação de vias de sinali-
de células estaminais (autólogas) específicas
necessários para manter as capacidades de
zação necessárias à auto-renovação e proli-
de pacientes para fins terapêuticos. No en-
proliferação e de pluripotência das células
feração destas células em cultura [29]. Mais
tanto, a aplicação de SCNT para material
ES. Estudos realizados para identificar os
recentemente, foram estabelecidas linhas
humano revelou-se difícil. Apenas muito re-
componentes secretados pelos fibroblastos
de células estaminais pluripotentes deriva-
centemente a reprogramação de células hu-
inactivados e que permitiam às células ES
das a partir do epiblasto (EpiSC) de embriões
manas por esta técnica resultou em células
de ratinho proliferar em cultura sem se dife-
de ratinho em fase de pós-implantação (Fig.
capazes de se desenvolverem até ao estado
renciar, conduziram à identificação do factor
2). Estas EpiSC diferem significativamente
de blastocisto em cultura [36]. Um aspecto
inibidor de leucemia (LIF), uma citocina que
das células ES de ratinho, mas no entanto
positivo destes trabalhos foi a indicação que
em complemento com o soro ou com BMP
partilham propriedades chave com células
a reprogramação de células somáticas pode
(Bone Morphogenetic Protein, outra molé-
ES humanas, tais como a derivação e a auto-
ser alcançada mediante a acção de factores
cula de sinalização), é capaz de manter as
renovação, que necessitam da activação das
externos e por isso alguns grupos de inves-
propriedades das células ES [32, 33].
vias de sinalização FGF e Activin/Nodal, mas
tigação continuaram a desenvolver rastreios
As primeiras células ES humanas só foram
não da presença de LIF ou BMP [14, 15]. Em
para identificação de factores proteicos ca-
derivadas em 1998 [34]. Este atraso deveu-
todo o caso, as células ES de ratinho e hu-
pazes de reprogramar células somáticas.
se principalmente a diferenças relacionadas
manas, tal como as EpiSC, expressam os
Em 2006, publicou-se o primeiro trabalho
8.
equivalentes de ratinho e mostraram-se
significativamente diferentes das células de
carcinoma embrionário ratinho. Por exemplo, a proteína SSEA-1, um marcador de superfície específico das células CE de ratinho,
está ausente nas células CE humanas que
por sua vez expressam as proteínas SSEA-3,
Figura 4. Nicho das células estaminais adultas. Os nichos formam microambientes fornecendo sinais extrínsecos (tal como moléculas
de sinalização intercelulares, interacções entre as células estaminais com a matriz extracelular, e com as células vizinhas) que em
combinação com os factores intrínsecos das células estaminais determinam o comportamento e o destino das células estaminais.
As condições externas (temperatura, pH, componentes do soro, factores de crescimento, hormonas, glicose e oxigénio, por exemplo)
também podem influenciar o destino das células estaminais.
SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81 [48-50]. Além
disso, ao contrário das células de ratinho, as
células CE humanas são altamente aneuplóides, o que provavelmente é responsável
que demonstrou a possibilidade de induzir
Células de carcinoma embrionário
pela incapacidade destas células humanas
a reprogramação de fibroblastos de ratinho
Os teratocarcinomas são tumores malignos
de se diferenciarem numa ampla gama de
em células pluripotentes (iPSC) com pro-
de grande raridade compostos por uma mis-
tipos de celulares somáticos. No entanto,
priedades semelhantes às das células ES. A
tura de células de carcinoma embrionário
algumas células CE humanas foram já dife-
reprogramação obteve-se por expressão for-
(CE) indiferenciadas e de células diferen-
renciadas em neurónios, que foram depois
çada de quatro factores de transcrição: Oct4,
ciadas que podem incluir as três camadas
utilizados para tratamento de pacientes que
Sox2, Klf4 e c-Myc [5]. Depois dessa primei-
germinais. Alguns trabalhos desenvolvidos
tinham sofrido acidentes vasculares cere-
ra reprogramação, outros grupos já usaram
em ratinhos demonstraram que as células
brais (AVCs) [12], indicando um potencial das
com sucesso os mesmos factores, ou outras
CE indiferenciadas funcionam como célu-
células de CE humanas para terapia.
combinações, para reprogramar uma gran-
las estaminais para originar as outras cé-
de variedade de células somáticas de ratinho
lulas que constituem o tumor. Assim, uma
Células germinais primordiais
ou humanas [29, 37, 38]. Além disso, conse-
célula CE indiferenciada única é capaz de
Apesar de evidências obtidas na década
guiu-se diferenciar iPSC in vitro, numa varie-
auto-renovação ilimitada e diferenciação
1952-1962 de que as células germinais pri-
dade de tipos celulares que por sua vez fo-
em linhagens celulares múltiplas, o que
mordiais poderiam dar origem a teratocar-
ram utilizadas na correcção de deficiências
também serviu para estabelecer a noção de
cinomas, só em 1992 foram derivadas com
em modelos animais de patologias humanas
pluripotência [42], e demonstrar a existência
sucesso células embrionárias germinais (EG)
[39]. O avanço em células humanas tem sido
de células estaminais de cancro. As células
[51, 52]). As células EG, que são também célu-
grande e conseguiu-se, a partir de pacientes
CE de ratinho expressam antigénios e prote-
las estaminais pluripotentes, requerem uma
com várias doenças, reprogramar diversas
ínas similares aos que estão presentes nas
combinação de Stem Cell Factor (SCF), LIF e
iPSC [40]. Deste modo foi possível corrigir in
células do botão embrionário de blastocistos
FGF, e a presença de uma camada de células
vitro defeitos de células estaminais hemato-
[43, 44]. Esta observação levou ao conceito
suporte para a derivação inicial em cultura.
poiéticas de pacientes com anemia de Fan-
de que as células CE são a contrapartida in
As células EG de ratinho em cultura são mor-
coni [41]. As iPSC têm assim um potencial
vitro das células pluripotentes presentes no
fologicamente indistinguíveis das células ES
prometedor para aplicações clínicas, porque
botão embrionário [45]. Algumas linhas ce-
e à semelhança destas expressam SSEA-1
poderiam ser reprogramadas a partir de cé-
lulares CE quando são injectadas em blas-
e Oct4, e quando injectadas em blastocistos
lulas autólogas expandidas em massa e di-
tocistos de ratinho, podem contribuir para
contribuem para o desenvolvimento de rati-
ferenciadas no tipo celular necessário para
vários tipos de células somáticas do ratinho
nhos quiméricos, incluindo células germinais
a terapia do paciente (Fig. 3 e Tabela 1). No
[46], embora a maioria das linhas de células
[53, 54]. No entanto, ao contrário das célu-
entanto, antes da utilização clínica das iPSC
CE tenham um potencial muito limitado de
las ES, as células EG mantêm algumas ca-
é necessário melhorar ainda os processos
contribuição ao desenvolvimento de ratinhos
racterísticas originais das células germinais
de reprogramação e de diferenciação destas
quiméricos [47]. As células CE humanas fo-
primordiais, tal como a inteira desmetilação
células.
ram derivadas posteriormente às células
do genoma, a remoção do imprinting genómi-
9.
CÉLULAS ESTAMINAIS ADULTAS E FETAIS
uma rede complexa de factores de cresci-
De forma geral, a cada tipo de tecido cor-
mento e de citocinas controla a transição en-
responde um dado tipo de célula estaminal
tre o estado quiescente e o estado activado
adulta, e a lista de tecidos e órgãos dos
das células EH na medula óssea. A migração
quais foram isoladas células estaminais
destas células activadas da superfície en-
adultas cresce constantemente e inclui a
dosteal para os nichos vasculares, permite
co, e a reactivação dos cromossomas X [53,
medula óssea, o sangue periférico, o cére-
a libertação rápida das células EH na micro-
55, 56]. Mais recentemente derivaram-se, de
bro, a medula espinal, a polpa dentária, os
vasculatura sanguínea da medula óssea, an-
testículos do ratinho neo-natal ou adulto, vá-
vasos sanguíneos, o músculo esquelético,
tes da migração destas células para a circu-
rios tipos de células estaminais pluripotentes
o epitélio da pele e do sistema digestivo,
lação periférica em condições fisiológicas e
ou multipotentes germinais com morfologia
a córnea, a retina, o coração, o fígado e o
patológicas. As células EH derivadas da me-
e marcadores celulares específicos típicos de
pâncreas, entre outros. As células esta-
dula óssea e células derivadas das células
células ES. Estas células germinais também
minais adultas estão também presentes
EH foram localizadas na pele, músculo, pul-
se podem diferenciar em várias linhagens de
em tecidos fetais, na placenta e no cordão
mões, baço, fígado, tecidos do sistema ner-
células in vitro, formar teratomas, e contri-
umbilical. Nesta secção apresentamos al-
voso e gastrointestinais, sugerindo que estas
buir para a formação de ratinhos quimeras,
gumas fontes principais de células esta-
células podem participar na regeneração de
inclusivamente na constituição de células
minais adultas e fetais com potencial tera-
tecidos periféricos, promovendo o sistema
germinais, quando injectadas no blastocisto.
pêutico (Fig. 2, Tabelas 1 e 2).
imunológico, por fusão celular adquirin-
No entanto, estas células germinais têm um
do assim propriedades das células com as
estado epigenético distinto das células ES e
Células estaminais hematopoiéticas
quais fusionam, ou por transdiferenciação em
das células EG [57-59].
As células estaminais adultas melhor ca-
células envolvidas na reparação dos tecidos
A derivação de células EG humanas foi rea-
racterizadas são as células estaminais he-
danificados, apesar deste último mecanismo
lizada pela primeira vez em 1998 [57], mas
matopoiéticas (EH), que originam todas as
não estar solidamente demonstrado [60].
o potencial de proliferação destas células a
células sanguíneas tais como os eritrócitos,
Durante os últimos 50 anos, as células EH
longo prazo parece ser limitado [58]. No en-
linfócitos e plaquetas. As células EH estão
foram extensivamente usadas para trans-
tanto, as células humanas EG com poucas
sobretudo localizadas na medula óssea, no
plante alogénico e para tratamento de uma
passagens em cultura apresentam a capaci-
sangue periférico, mas também em alguns
variedade de doenças imunes hereditárias
dade de se diferenciar in vitro em múltiplas
órgãos (baço e fígado, por exemplo), e ainda
ou adquiridas, tal como talassemias, anemia
linhagens celulares. As células humanas EG
no sangue do cordão umbilical e na placenta
falciforme, anemia de Fanconi, erros inatos
têm uma morfologia muito distinta das célu-
[59]. Os monócitos e macrófagos, neutrófi-
do metabolismo, anemia aplástica severa,
las ES humanas e expressam o marcador de
los, basófilos, eosinófilos, eritrócitos, mega-
imunodeficiência combinada severa (SCID),
superfície SSEA-1, que está ausente nas cé-
cariócitos e plaquetas, e células dendríticas
e outras deficiências imunológicas primárias
lulas ES humanas, mas presente nas células
são gerados a partir da linhagem miéloide,
(Fig. 2 e Tabela 2). O transplante de células
germinais humanas precoces [29]. Até agora,
enquanto a linhagem linfóide dá origem aos
EH é também amplamente utilizado para o
nenhuma das linhas de células EG humanas
linfócitos T e B, e às células NK. As células
tratamento de doenças hematológicas ma-
isoladas possui capacidades de formação de
EH são caracterizadas pela expressão de
lignas, como leucemias mielóides e linfói-
teratomas e necessitam factores de cres-
marcadores de superfície celulares especí-
des, outros síndromes mielo-proliferativos,
cimento diferentes daqueles necessários
ficos que permitem também o isolamento
doenças mielo-displásicas, linfomas, mie-
às células ES humanas, o que as distingue
destas células. As células EH imaturas e
lomas, e tumores sólidos, como cancro de
assim claramente das células ES. O poten-
quiescentes estão localizadas na superfície
células renais, cancro da mama, carcinomas
cial das células EG para terapia ainda está
endosteal do osso (fina camada de células
do ovário e neuroblastomas. No entanto, en-
muito pouco explorado, mas estudos recen-
que reveste a cavidade medular de um osso),
contrar um dador histocompatível continua
tes em modelos animais demonstraram que
onde podem interagir através da formação
a ser um problema para muitos pacientes
as células germinais testiculares de ratinho
de junções aderentes com os osteoblastos
que necessitam deste tipo de procedimento
podem ser transplantadas em animais reci-
que regulam as funções das células EH [59].
terapêutico.
pientes estéreis e regenerar a espermato-
As células EH também se co-localizam com
génese, indicando que estas células têm um
células endoteliais na microvasculatura si-
Células estaminais mesenquimais
grande potencial para tratamento de infertili-
nusoidal da medula óssea. Sob estímulos
As células estaminais mesenquimais (EM)
dade masculina.
específicos, tais como lesões de tecidos,
são células adultas multipotentes, capazes
10.
de originar vários tipos celulares por dife-
regenerativa (Figs. 2 e 3; Tabela 2), embora
renciação, incluindo condrócitos, miócitos,
as propriedades de diferenciação ainda não
células adiposas, células do tecido conectivo
estarem demonstradas in vivo. Além, disso
e osteoblastos. As células EM encontram-se
as células EM poderam ainda ser transplan-
geralmente presentes nos tecidos conjunti-
tadas nos pacientes de maneira autóloga.
vos de quase todos os órgãos, mas para fins
Muito recentemente, em 2008, realizou-se
terapêuticos, são mais convenientemente
o primeiro transplante de um tecido huma-
estaminais neurais (EN) derivadas do sis-
isoladas da medula óssea e do sangue do
no produzido a partir de células estaminais
tema nervoso capazes de auto-renovação.
cordão umbilical. No entanto, embora mor-
adultas mesenquimais e epiteliais do próprio
Estas células são multipotentes, podendo
fologicamente semelhantes, as células EM
paciente [62]. O procedimento cirúrgico foi
dar origem às três principais linhagens
isoladas de diversas fontes podem ser fun-
efectuado numa paciente cujo brônquio es-
de células do sistema nervoso (neurónios,
cionalmente diferentes. As células EM pos-
querdo tinha entrado em processo de falên-
oligodendrócitos e astrócitos; Fig. 2). Em
suem uma grande capacidade de expansão
cia após uma infecção de tuberculose. Con-
modelos de lesão cerebral, as células EN
em cultura podendo ser estimuladas para
droblastos diferenciados a partir de células
proliferam nessas regiões neurogénicas,
adquirir propriedades específicas. Atra-
estaminais adultas mesenquimais e células
a partir de onde são capazes de migrar
vés de secreção de factores solúveis (IL-6,
epiteliais retiradas da mucosa brônquica da
para o local de lesão [59, 61]. A expres-
TGF-β1, factor de crescimento hepatócito,
paciente foram capazes de gerar uma estru-
são específica de marcadores neurais, tal
sintase induzível de óxido nítrico e prosta-
tura celular à volta de uma matriz cartilagi-
como a nestina, permite isolar e purificar
glandinas, por exemplo) e de interacções di-
nosa obtida da traqueia de um dador (limpa
células EN e progenitores neurais a partir
rectas com células do sistema imunológico,
de todas as suas células originais). As cé-
de embriões, tecidos de cérebro fetais ou
as células EM têm propriedades anti-infla-
lulas epiteliais e estaminais mesenquimais
adultos, para serem expandidas em cultu-
matórias e imunomoduladoras, suprimindo
adultas (isoladas a partir da medula óssea
ra. Evidentemente, para uma terapia celu-
a actividade de células T citotóxicas, células
da paciente) depositadas sobre a compo-
lar autóloga baseada em células EN, estas
B e células NK. Dadas essas propriedades,
nente cartilaginosa entraram num processo
fontes de células EN são de utilização pou-
as células EM estão a ser testadas no tra-
de maturação e diferenciação e formaram
co conveniente. No entanto, foram também
tamento de pacientes com lúpus eritema-
um tubo brônquico em cultura. Uma sec-
encontradas células EN na polpa dentária,
toso sistémico, esclerose múltipla, doença
ção desse tubo brônquico foi transplantada
no periodonto [63, 64] (tecidos que rodeiam
de Crohn, esclerose lateral amiotrófica e
para substituir a parte atrofiada do brônquio
e suportam os dentes) e na mucosa olfac-
diabetes de tipo 1, que são doenças inflama-
esquerdo da paciente e consequentemente
tiva, que já foram facilmente recolhidas por
tórias auto-imunes. Além das propriedades
ajudar a paciente na recuperação de funções
meio de biopsias nasais. Os neurónios da
anti-inflamatórias
imunomoduladoras,
respiratórias. Este ensaio clínico, único até
mucosa olfactiva têm uma regeneração rá-
mostrou-se que as células EM têm efeitos
agora, demonstra que a conjugação da dife-
pida e contínua, de modo que constituem
benéficos sobre a regeneração de órgãos
renciação de células estaminais adultas com
uma fonte ideal de células EN para reparar
(tal como o fígado e coração), provavelmen-
biomateriais apropriados poderá, a médio
lesões da medula espinal e do cérebro. O
te através de efeitos parácrinos, criando um
prazo, gerar soluções terapêuticas funcio-
transplante de células de tipo neural que
ambiente favorável à recuperação funcional
nais na área da medicina regenerativa que
promovem o crescimento e regeneração
das células endógenas dos órgãos e tecidos,
não eram possíveis até agora. Terapias des-
dos axónios olfactórios (Olfactory Enshea-
promovendo também a angiogénese e limi-
te tipo também eliminam o risco de rejeição
thing Cells) isoladas da mucosa olfactiva,
tando a remodelação cardíaca [59, 61]. Em
dos novos tecidos por parte dos pacientes, e
no local de lesão de pacientes com lesões
condições específicas de cultura, foi ainda
evitando assim a necessidade de utilização
da medula espinal — as quais resultam
demonstrada a capacidade destas células de
de imunossupressores cujos efeitos secun-
muitas vezes em deficiências motrizes
se diferenciarem em outros tipos celulares,
dários podem ser graves (como a hiperten-
permanentes, para- ou tetraplegia, e defi-
tais como cardiomiócitos, células neuronais,
são arterial, insuficiência renal e mesmo
ciências sensoriais, ou ambas — contribuiu
células pulmonares, células beta das ilhotas
aparecimento de tumores).
para o melhoramento do estado clínico de
e
alguns pacientes [65].
pancreáticas e células epiteliais, por exemplo. Por esses motivos, as células EM têm
Células estaminais neurais
As células EN têm também um grande
um grande potencial para terapias diver-
A zona subventricular dos ventrículos late-
potencial para tratamento de várias do-
sas e são cada vez mais testadas para um
rais e a zona subgranular do giro dentado
enças neurológicas e neurodegenerativas
número maior de aplicações em medicina
do hipocampo contêm nichos com células
até agora incuráveis, tal como a doença
11.
metabólicas hereditárias, anemias e imu-
adultos [70]. O isolamento das células da
nodeficiências). O potencial terapêutico das
MCU pode ser facilmente efectuado a partir
células ECU foi também confirmado em
do estroma ou da matriz do cordão umbili-
modelos animais de diabetes, doenças car-
cal, bem como do subendotélio da veia do
díacas (enfarte do miocárdio), doenças ce-
cordão umbilical. Microscopicamente estas
rebrovasculares e neuronais (AVC e doença
células podem ser identificadas através
de Parkinson (degeneração progressiva dos
de Alzheimer, por exemplo), mas a utilidade
da sua morfologia característica (parecida
neurónios produtores de dopamina, um neu-
clínica destas células em pacientes huma-
com os fibroblastos que crescem aderen-
rotransmissor que tem como função estimu-
nos ainda se encontra em análise, e neste
tes a uma superfície) e pela identificação
lar o sistema nervoso central). A “levodopa”,
momento decorrem vários ensaios clínicos
de marcadores específicos presentes na
que é convertida em dopamina no cérebro,
para testar o seu efeito regenerativo.
membrana destas células. No entanto, a
é a base actual do tratamento da maioria
característica mais importante, para fins
dos pacientes com a doença de Parkinson,
As células do Sangue do Cordão Umbilical
terapêuticos, das células EM do cordão
mas a maior parte destes pacientes acaba
(SCU) contêm essencialmente células es-
umbilical, em relação ás células EM iso-
por perder a capacidade de resposta a este
taminais hematopoiéticas com capacidade
ladas em tecidos já adultos, é não possu-
tratamento. Por outro lado, o transplante de
de se diferenciar em células sanguíneas
írem um Complexo Maior de Histocompa-
neurónios diferenciados, produtores de do-
(glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e
tibilidade completo, uma vez que os genes
pamina no cérebro, não é uma opção viável
plaquetas, tal como as células homologas
do subgrupo II e um gene do subgrupo I
uma vez que s ó uma pequena percentagem
adultas), células vasculares (endoteliais e
(HLA-DR) estão ausentes. Esta caracterís-
de neurónios sobrevivem à transplanta-
do músculo liso) bem como em outras linha-
tica é extremamente importante quando se
ção. Por isso o transplante de progenito-
gens não directamente ligadas ao sistema
trata da compatibilidade entre o dador e o
res neurais primários (isolados de tecidos
hematopoiético [59, 69]. A baixa incidência
receptor para transplantes alogénicos (Fig.
ou órgãos) derivados por diferenciação de
de rejeição das células do SCU por parte dos
3), porque assim, mesmo não havendo uma
outras células estaminais (células ES, iPS,
pacientes transplantados, em comparação
histocompatibilidade completa entre o da-
por exemplo) constituem o futuro para trata-
com transplantes de células corresponden-
dor e o paciente receptor, a probabilidade
mento de doenças neurodegenerativas [65].
tes dos organismos adultos (isoladas a par-
de ocorrer rejeição por parte do receptor é
As células EN fetais humanas, isoladas do
tir da medula óssea ou sangue periférico),
praticamente nula.
mesencéfalo geram neurónios dopaminér-
apresenta uma grande vantagem para utili-
O esforço actual para se estabelecerem
gicos funcionais após transplante no estria-
zação do sangue do cordão umbilical como
bancos públicos de células de sangue do
do de pacientes com a doença de Parkinson
fonte de células fetais EH para terapia. Esta
cordão umbilical caracterizadas irá permi-
[66-68]. Além disso, as células EN fetais têm
propriedade permite, ainda, a utilização de
tir uma disponibilização mais fácil e mais
uma capacidade imuno-activadora e tumo-
células do SCU, em transplantes, com uma
rápida de células EH e EM para transplan-
rogénica pouco elevada.
maior disparidade em termos do Complexo
tes e futuras terapias celulares.
Maior de Histocompatibilidade (HLA) relatiCélulas estaminais fetais do cordão umbilical
vamente às células EH da medula óssea. No
Células estaminais de cancro
As células estaminais do cordão umbilical
entanto, o número pouco elevado de células
As células estaminais de cancro, inicial-
(ECU) são células que, consoante a sua
EH presente nas células SCU limita a utili-
mente identificadas a partir de leucemias
proveniência, têm o potencial de se dife-
zação destas células em pacientes adultos,
mielóides agudas, apresentam marcadores
renciar em células da linhagem hemato-
para o tratamento dos quais é preciso com-
de superfície distintos das outras células
poiética e mesenquimal. As células ECU
binar células obtidas de fontes diferentes ou
tumorais também presentes no mesmo or-
multiplicam-se mais rapidamente em cul-
expandir as células ex vivo.
ganismo e com potencial de proliferação
tura do que as células homólogas isoladas
As outras células estaminais principais do
mais limitado [71]. Propôs-se então que as
da medula óssea em organismos adultos.
cordão umbilical que estão presentes na
células leucémicas estaminais resultariam
Para além disso, as ECU possuem grande
Matriz do Cordão Umbilical (MCU) são cé-
da transformação de células estaminais
plasticidade pelo que são promissoras para
lulas estaminais mesenquimais (EM) que
hematopoiéticas, tornando-se malignas. As
terapias celulares. Estas células têm sido
constituem uma população de células va-
células leucémicas estaminais encontram-
utilizadas no tratamento de doenças malig-
riada, precursora de células de osso, carti-
se em quantidades reduzidas nos pacientes,
nas (leucemias, linfomas, tumores sólidos)
lagem, tecido adiposo e fibroso conjuntivo,
são resistentes à quimioterapia e radiotera-
e não malignas (por exemplo, deficiências
tal como as células EM dos organismos
pia, e são capazes de recapitular leucemias
12.
mielóides agudas quando transplantadas
tuem um organismo, apresentam grandes
para ratinhos com deficiência imunológica
potencialidades para o desenvolvimento de
combinada. Além do mais, foram já carac-
novas terapias celulares. Assim, sob con-
terizadas outras células estaminais de can-
dições específicas, as células ES poderiam
cro em tumores sólidos tal como o cancro
ser utilizadas para formação de tecidos em
de mama, glioblastomas, cancro do pulmão,
laboratório que serviriam consequente-
cancro dos ovários, cancro da próstata e can-
mente para transplante em pacientes com
ça hereditária que afecta a área central da
cro gástrico epitelial [69-75]. Com base nes-
tecidos ou órgãos danificados. No entanto,
retina (mácula) e que conduz à cegueira.
sas observações, foi proposto um modelo de
além dos problemas técnicos ligados às
Embora estes ensaios clínicos baseados em
formação do cancro baseado na existência
condições de manutenção e de diferencia-
células ES estejam apenas na fase inicial,
de células estaminais. Segundo este concei-
ção eficiente das células ES para os tipos
ou seja, são ensaios desenhados para tes-
to, a grande maioria das células num tumor
celulares pretendidos, subsistem problemas
tar não a eficácia das células pigmentadas
teriam um potencial de proliferação limitado
éticos que têm atrasado o estudo e o desen-
mas sim a segurança de tal intervenção, eles
mas a pequena população de células esta-
volvimento de metodologias para aplicações
constituem um passo essencial em medicina
minais de cancro possui capacidade de auto-
clínicas destas células. A primeira aprovação
regenerativa. Esta nova abordagem terapêu-
renovação e de proliferação. Deste modo,
pela FDA (U.S. Food and Drug Administration)
tica é particularmente atractiva em doenças
as células estaminais de cancro poderiam
para a fase I de ensaios clínicos com células
originadas pela destruição e/ou falta de re-
originar e manter a massa de células que
derivadas de células ES humanas foi apenas
generação de células que constituem alguns
formam o tumor. Neste modelo, o cancro é
consentida em Janeiro 2009 para tratamento
tecidos (tais como as doenças de Alzheimer
uma doença que envolve a desregulação da
de lesões da medula espinal, em pacientes
e Parkinson, diabetes, enfarte do miocárdio
auto-renovação das células estaminais nor-
com lesões de menos de duas semanas.
ou degeneração da retina) para as quais não
mais por mutações oncogénicas e outros
Esta aprovação surgiu após um trabalho de
existe actualmente nenhuma cura.
defeitos genéticos e epigenéticos [72]. As cé-
investigação que mostrou que o transplante
lulas estaminais de cancro resistentes a qui-
de células ES humanas em ratos com lesões
No entanto, a utilização de células estaminais
mioterapia explicam ainda as recorrências
da medula espinal induz a recuperação loco-
adultas em medicina está mais adiantada,
de tumores e até as metástases, podendo
motora desses animais[74]. No entanto, este
certamente dado ao facto que a utilização de
expandir-se formando tumores secundários
ensaio está suspenso desde Agosto 2009
células estaminais adultas levantou menores
[73]. Procura-se agora identificar marca-
pela FDA, devido a cistos microscópicos que
problemas éticos do que a utilização de célu-
dores de superfície celular específicos das
foram observados em alguns dos animais
las ES. A menor plasticidade e capacidade de
células estaminais tumorais que permitam
transplantados. Mais recentemente, o trans-
proliferação das células estaminais adultas é
o seu isolamento e expansão em cultura de
plante de células do epitélio pigmentar da
uma desvantagem comparativamente às cé-
modo a poder-se proceder ao seu estudo e
retina, derivadas de células ES humanas, no
lulas embrionárias, limitando a possibilidade
a compreender-se as diferenças existentes
espaço sub-retinal dos olhos de ratos com
de expansão ex vivo que garanta a obtenção
nas vias de sinalização de células estaminais
degeneração gradual do epitélio pigmentar
de bancos de células necessários para tera-
normais e tumorais. Espera-se que um co-
da retina, resultou na recuperação da visão
pias celulares. Mas esta limitação pode tam-
nhecimento aprofundado dessas vias condu-
de todos os animais transplantados. Os ratos
bém ser um factor positivo, evitando os pro-
za à identificação de fármacos visando a des-
foram injectados com as células derivadas
blemas de formação de tumores inerentes as
truição selectiva de células tumorais sem
das células ES humanas antes da degenera-
células ES. Infelizmente, a maior parte das
afectar as células normais, o que seria um
ção da retina ser iniciada, mostrando a capa-
células estaminais adultas estão presentes
avanço importante para terapias anti-cancro
cidade das células humanas transplantadas
em pequenas quantidades e são difíceis de
mais adaptadas às necessidades específicas
em preservar os fotoreceptores cuja dege-
isolar e caracterizar pelo que a viabilização
de cada paciente.
neração acontece inevitavelmente nos ani-
do uso deste tipo de células está dependente
mais não tratados[75, 76]. Estes resultados
do orgão-fonte. Finalmente, a possibilidade
promissores para tratamento de cegueiras
de isolamento de certas células estaminais
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
causadas por degeneração da retina levaram
adultas do paciente, permite o seu uso em
As células ES, com a capacidade de pro-
a FDA aprovar, no início de 2010, o segundo
condições autólogas, limitando por isso a ne-
liferar de maneira eficaz em cultura e a
ensaio clínico baseado em células derivadas
cessidade de imunossupressão.
possibilidade única de dar origem a todas
de células ES humanas para tratamento da
As células estaminais isoladas da medula
células e a todos os tecidos que consti-
distrofia macular de Stargardt, uma doen-
óssea apresentam actualmente uma maior
13.
taminais adultas humanas com potencial
iPSC podem também ajudar a prevenção e
terapêutico, tais como as células de tecidos
gestão de doenças de forma personalizada
adiposo e polpa dentária [77].
para o paciente, permitindo revelar meca-
A reprogramação de células somáticas em
nismos sobre o desenvolvimento da doença
iPSC, que têm um potencial semelhante ao
e assim definir os fármacos mais apropria-
das células ES, superaram quase todas as
dos para combater a doença. Podem ainda
prevalência de utilização em terapia, por se-
preocupações éticas ligadas à origem em-
permitir a correcção de defeitos genéticos
rem células mais facilmente identificadas,
brionária das células ES humanas, e deram
in vitro, antes de serem usados para trans-
isoladas, e capazes de proliferar relativa-
um impulso novo à investigação para a uti-
plante autólogo ou alogénico.
mente bem em cultura. No entanto, nos úl-
lização de células pluripotentes em terapia.
Em conclusão, as células estaminais, prin-
timos anos, as células estaminais do sangue
As iPSC oferecem também a possibilidade
cipalmente células estaminais adultas e
do cordão umbilical tornaram-se uma fonte
de novos tratamentos terapêuticos autó-
fetais, já estão a ser utilizadas em diver-
alternativa, e por vezes preferida, de células
logos com células reprogramadas a partir
sas terapias. A reprogramação das células
estaminais hematopoiéticas para pacientes
de células somáticas do próprio paciente.
adultas em iPSC vai certamente contribuir
sem dadores de medula óssea compatíveis e
No entanto, vários obstáculos importantes
para um rápido progresso na utilização de
para crianças. Estas células, bastante plás-
devem ser ultrapassados antes das iPSC
células estaminais pluripotentes em tera-
ticas e menos imunogénicas do que as es-
poderem ser usadas em aplicações clíni-
pias futuras. No entanto, a possibilidade de
taminais hematopoiéticas da medula óssea,
cas. A maioria dos métodos actuais de re-
utilização terapêutica das células estami-
são facilmente isoladas a partir do cordão
programação são baseados na expressão
nais está ainda sub-explorada, devido à fal-
umbilical, que foi durante muito tempo um
exógena de proteínas (factores de transcri-
ta de conhecimentos fundamentais sobre
tecido desaproveitado e considerado apenas
ção) com potencial oncogénico através de
os mecanismos moleculares e biológicos
como um excedente do parto. Por esta razão,
vectores retrovirais integrativos, que eles
que regem as propriedades de prolifera-
estão agora a ser armazenadas e conserva-
próprios podem causar cancro quando se
ção e de diferenciação destas células e,
das por criopreservação em bancos de insti-
integram no genoma e perturbam a expres-
mais recentemente, da reprogramação de
tuições públicas e privadas, para possibilitar
são de genes endógenos. Porém, já foram
células adultas. Porém, os esforços actu-
e facilitar o uso destas células de sangue
desenvolvidos alguns métodos alternativos
ais para compreender esses mecanismos,
do cordão umbilical em terapias. Conside-
de disseminação dos factores de reprogra-
para estabelecer métodos mais seguros e
rando a variabilidade genética existente na
mação, como a utilização de adenovírus
mais eficazes para o isolamento, a purifi-
população portuguesa, estima-se que 8 mil
(não integrativos) ou plasmídios, com ou
cação e a caracterização das células es-
amostras seriam suficientes para abranger
sem o uso de pequenas moléculas incenti-
taminais ou células derivadas das células
a diversidade desta população. Em Portu-
vadoras. Recentemente até foi conseguida
estaminais vão contribuir, nos próximos
gal, foi criado o Banco Público de Células do
com sucesso a reprogramação de células
anos, para o desenvolvimento de terapias
Cordão Umbilical nas instalações do Centro
somáticas com proteínas recombinantes
celulares cada vez mais audaciosas e com-
de Histocompatibilidade do Norte (Despacho
produzidas e purificadas em bactérias.
plexas. A grande promessa a alcançar com
n.º 14879/2009. DR 126 SÉRIE II), tendo sido
Foi também demonstrado que, consoante
este domínio da tecnologia das células es-
já recolhidas e preservadas 1400 dádivas de
o tipo de células utilizadas para reprogra-
taminais será o tratamento de doenças e
cordão umbilical. Em Março de 2009 Portu-
mação e a adição de compostos químicos,
lesões incuráveis até agora.
gal fez a transposição para a ordem jurídica
menos de quatro factores podem ser sufi-
interna das Directivas nºs 2004/23/CE, do
cientes para a reprogramação das iPSC.
Parlamento Europeu e do Conselho, de 31 de
GLOSSÁRIO
Março, 2006/17/CE (Lei n.º 12/2009. DR n.º
Além do potencial das iPSC para uso directo
Alogénico – Relativo a tecidos, células ou
60, Série I) em que a Assembleia da Repúbli-
em terapias celulares, a reprogramação de
proteínas originados ou derivados de dado-
ca estabelece o regime jurídico da qualidade
células somáticas de pacientes que sofrem
res que não são o próprio paciente (receptor).
e segurança relativa à dádiva, colheita, análi-
de doenças multi-factoriais complexas
Aneuplóide – Relativo a células que sofre-
se, processamento, preservação, armazena-
(como o diabetes mellitus tipo 1 juvenil e a
ram alterações do seu material genético,
mento, distribuição e aplicação de tecidos e
doença de Parkinson) oferece uma oportu-
contendo um número de cromossomas di-
células de origem humana. Noutros países,
nidade única para estudar e modelizar os
ferente do normal.
estão a ser desenvolvidas a criopreservação
acontecimentos e mecanismos molecula-
Antigénio – Partículas ou moléculas capa-
e a criação de bancos de outras células es-
res envolvidos no desenvolvimento da. As
zes de provocar uma resposta imune.
14.
Autólogo – Relativo a tecidos, células ou
lar interna que se diferencia para formar
proteínas que foram originados ou deriva-
as três camadas germinais do embrião das
dos do próprio paciente, sendo este dador
quais derivam todos os tecidos e órgãos.
e receptor.
Hematopoiético – Relativo às células do
Auto-renovação – A capacidade das células
sangue.
estaminais de passar por diversos ciclos de
Imprinting genómico – Mecanismo (epi)ge-
divisão celular e manter o estado indiferen-
nético pelo qual certos genes são expres-
têm capacidade de dar origem a todas as
ciado.
sos somente por um alelo, enquanto o outro
células diferenciadas do organismo adulto,
Blastocisto – Estrutura embrionária precoce
está inactivado por metilação do DNA. Por
incluindo a parte fetal da placenta, o cordão
esférica formada por uma camada externa
exemplo, as células germinais masculinas
umbilical e as membranas extra-embrio-
de células (trofoblasto), que irá dar origem à
e femininas de mamíferos têm padrões de
nárias.
placenta, e que encerra no seu interior uma
imprinting genómico diversos mas comple-
Transdiferenciação – Alteração de um tipo
população de células internas denominada
mentares.
de célula diferenciada para outro tipo de
massa celular interna, a partir do qual se
In vitro, In vivo e Ex vivo – Termo que des-
célula com forma e função diferente.
derivam as células estaminais embrionárias.
creve um processo que ocorre num tubo de
Unipotente – Propriedade de células capa-
Células estaminais adultas ou somáticas –
ensaio em bioquímica, que também é usa-
zes de se diferenciarem num único tecido.
Células estaminais localizadas em vários
do pelos biólogos para se referir às célu-
Zigoto ou Ovo – Célula diplóide que contém
tecidos do organismo adulto que se man-
las que crescem em cultura em condições
reservas nutritivas e que,resulta da união
têm num estado indiferenciado, ou não
controladas (in vitro) fora de um organismo
dos núcleos do óvulo e do espermatozóide.
especializado, com capacidade de auto-
(in vivo). O termo ex vivo, refere-se a expe-
O zigoto dá origem a um novo indivíduo (em-
renovação e de se diferenciar para originar
rimentações ou medições feitas em tecidos
brião) através de várias divisões mitóticas.
todos os tipos de células especializadas do
ou células num ambiente artificial fora do
tecido onde estão presentes.
organismo com o mínimo de alteração das
Células estaminais de cancro – Células can-
condições naturais.
AGRADECIMENTOS
cerosas presentes nos tumores ou cancros
Multipotente – Propriedade das células que
Os autores desejam reconhecer o apoio do
hematológicos com características asso-
podem dar origem a um número limitado
Departamento de Ciências Biomédicas e
ciadas às células estaminais normais, e
de tipos de células.
Medicina durante a sua recente instalação
que têm a capacidade de dar origem a to-
Nicho – Microambiente (in vivo ou in vitro)
na Universidade do Algarve, bem como o das
dos os tipos celulares formando o tumor
das células estaminais, que interage com
suas Instituições anteriores, nomeadamente
onde estão presentes.
as células estaminais para controlar o des-
o ITQB/IBET, IST-UTL e IGC/FCG. O apoio fi-
Células estaminais embrionárias (ES) – Cé-
tino das células estaminais.
nanceiro ao Curso de Medicina e “Programa
lulas indiferenciadas originadas da massa
Pluripotência – Potencial das células esta-
de Investigação em Medicina Regenerativa”
celular interna do blastocisto do embrião
minais embrionárias de dar origem a todos
da Universidade do Algarve, concedido pelo
antes da implantação no útero, que têm o
os tipos de célula diferenciada que consti-
Ministério Ciência, Tecnologia e Ensino Su-
potencial de auto-renovação e de se dife-
tuem um organismo adulto, excluindo as
perior através da UMIC, I.P. – Agência para
renciar em todos os tipos de célula do orga-
células de placenta e anexos embrionários.
a sociedade do conhecimento, e da FCT, I.P.
nismo adulto, excepto a placenta.
Pluripotente - Propriedade de células ca-
– Fundação para a Ciência e Tecnologia. Os
Células estaminais do epiblasto – Células
pazes de diferenciar se em todos os tecidos
autores agradecem Dr Lino Ferreira (Centro
estaminais pluripotentes derivadas a partir
do organismo adulto, excluindo a placenta
de Neurociências e Biologia Celular, Univer-
de epiblastos de blastocistos logo a seguir
e anexos embrionários.
sidade de Coimbra), o Dr João Facucho-Oli-
à implantação com capacidade de auto-
Teratocarcinoma – tumor maligno de célu-
veira (IBB/CBME, Universidade do Algarve) e
renovação.
las germinais geralmente localizadas nas
o Dr João Varela (CCMAR, Universidade do
Células estaminais pluripotentes induzidas
gónadas, constituído por elementos de
Algarve) pela revisão crítica do manuscrito.
(iPSC) – Células somáticas reprogramadas
tecido de uma ou mais das três camadas
José Bragança agradece a Câmara Muni-
em células com propriedades semelhan-
germinais, e derivado de células germinais
cipal de Oeiras pela atribuição do prémio
tes às das células estaminais embrionárias
pluripotentes.
«Professor António Xavier 2009» e a Funda-
através da expressão forçada de factores de
Teratoma – forma benigna de teratocarci-
ção Merck Sharp & Dhome - Portugal pela
transcrição.
noma.
contribuição ao desenvolvimento do projecto
Epiblasto – Tecido derivado da massa celu-
Totipotente – Propriedade de células que
“miPS: reprogramming mouse adult cells”.
15.
REFERENCIAS
tioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad
Rat Hippocampus Contains Primordial Neural Stem
Sci USA 78, 7634-7638.
Cells. Mol Cellular Neurosci 8, 389-404.
13. Evans M & Kaufman M (1981) Establishment in cul-
27. Ito M, Yang Z, Andl T, Cui C, Kim N, Millar SE & Cot-
ture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature
sarelis G (2007) Wnt-dependent de novo hair follicle re-
292, 15415-15416.
generation in adult mouse skin after wounding. Nature
14. Tesar PJ, Chenoweth JG, Brook FA, Davies TJ, Evans
447, 316-320.
EP, Mack DL, Gardner RL & McKay RDG (2007) New cell
28. Peerani R, Rao BM & Bauwens C YT, Wood GA, Nagy
lines from mouse epiblast share defining features with
A, Kumacheva E, Zandstra PW. (2007) Niche-mediated
1. Nirmalanandhan VS & Sittampalam GS (2009) Stem
human embryonic stem cells. Nature 448, 196.
control of human embryonic stem cell self-renewal and
Cells in Drug Discovery, Tissue Engineering, and Rege-
15. Brons IGM, Smithers LE, Trotter MWB, Rugg-Gunn
differentiation. EMBO J.
nerative Medicine: Emerging Opportunities and Chal-
P, Sun B, Chuva de Sousa Lopes SM, Howlett SK, Cla-
29. Yu J & Thomson JA (2008) Pluripotent stem cell li-
lenges. J Biomol Screen 14, 755-768.
rkson A, Ahrlund-Richter L, Pedersen RA & Vallier L
nes. Genes Dev 22, 1987-1997.
2. Lerou PH & Daley GQ (2005) Therapeutic potential of
(2007) Derivation of pluripotent epiblast stem cells from
30. Chung Y, Klimanskaya I, Becker S, Marh J, Lu S-J,
embryonic stem cells. Blood Rev 19, 321-331.
mammalian embryos. Nature 448, 191.
Johnson J, Meisner L & Lanza R (2006) Embryonic and
3. Blelloch R, Venere M, Yen J & Ramalho-Santos M
16. Vallier L, Mendjan S, Brown S, Chng Z, Teo A, Smi-
extraembryonic stem cell lines derived from single
(2007) Generation of Induced Pluripotent Stem Cells in
thers LE, Trotter MWB, Cho CHH, Martinez A, Rugg-
mouse blastomeres. Nature 439, 216-219.
the Absence of Drug Selection. Cell Stem Cell 1, 245-
Gunn P, Brons G & Pedersen RA (2009) Activin/Nodal
31. Wakayama S, Hikichi T, Suetsugu R, Sakaide Y, Bui
-247.
signalling maintains pluripotency by controlling Nanog
H-T, Mizutani E & Wakayama T (2007) Efficient Establish-
4. Okita K, Ichisaka T & Yamanaka S (2007) Generation
expression. Development 136, 1339-1349.
ment of Mouse Embryonic Stem Cell Lines from Single
of germline-competent induced pluripotent stem cells.
17. Beddington RS & Robertson EJ (1989) An assess-
Blastomeres and Polar Bodies. Stem Cells 25, 986-993.
Nature 448, 313.
ment of the developmental potential of embryonic stem
32. Smith AG, Heath JK, Donaldson DD, Wong GG, Mo-
5. Takahashi K & Yamanaka S (2006) Induction of Pluri-
cells in the midgestation mouse embryo. Development
reau J, Stahl M & Rogers D (1988) Inhibition of pluri-
potent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fi-
105, 733-737.
potential embryonic stem cell differentiation by purified
broblast Cultures by Defined Factors. Cell 126, 663-676.
18. Gardner RL & Rossant J (1979) Investigation of the
polypeptides. Nature 336, 688-690.
6. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka
fate of 4.5 day post-coitum mouse inner cell mass cells by
33. Ying Q-L, Nichols J, Chambers I & Smith A (2003)
T, Tomoda K & Yamanaka S (2007) Induction of Pluripo-
blastocyst injection. J Embryol Exp Morphol 52, 141-152.
BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentia-
tent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defi-
19. Nagy A, Rossant J, Nagy R, Abramow-Newerly W
tion and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in
ned Factors. Cell 131, 861-872.
& Roder J (1993) Derivation of completely cell culture-
Collaboration with STAT3. Cell 115, 281-292.
7. Maehr R, Chen S, Snitow M, Ludwig T, Yagasaki L, Go-
derived mice from early-passage embryonic stem cells.
34. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Wak-
land R, Leibel RL & Melton DA (2009) Generation of plu-
Proc Natl Acad Sci USA 90.
nitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS & Jones JM (1998)
ripotent stem cells from patients with type 1 diabetes.
20. Bradley A, Evans M, Kaufman M & Robertson E
Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blas-
Proc Natl Acad Sci USA 106, 15768-15773.
(1984) Formation of germ-line chimaeras from embryo-
tocysts. Science 282, 1145-1147.
8. Park I-H, Lerou PH, Zhao R, Huo H & Daley GQ (2008)
derived teratocarcinoma cell lines. Nature 309, 255-256.
35. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ & Camp-
Generation of human-induced pluripotent stem cells.
21. Reya T, Morrison SJ, Clarke MF & Weissman IL
bell KHS (1997) Viable offspring derived from fetal and
Nat Protoc 3, 1180-1186.
(2001) Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Na-
adult mammalian cells. Nature 385, 810-813.
9. Wernig M, Zhao J-P, Pruszak J, Hedlund E, Fu D,
ture 414, 105-111.
36. French AJ, Adams CA, Anderson L, S. , Kitchen JR,
Soldner F, Broccoli V, Constantine-Paton M, Isacson O
22. Sagar J, Chaib B, Sales K, Winslet M & Seifalian A
Hughes MR & Wood SH (2008) Development of Human
& Jaenisch R (2008) Neurons derived from reprogram-
(2007) Role of stem cells in cancer therapy and cancer
Cloned Blastocysts Following Somatic Cell Nuclear
med fibroblasts functionally integrate into the fetal brain
stem cells: a review. Cancer Cell Int 7, 9.
Transfer with Adult Fibroblasts. Stem Cells 26, 485-493.
and improve symptoms of rats with Parkinson’s disease.
23. Morrison SJ & Spradling AC (2008) Stem Cells and
37. Jaenisch R & Young R (2008) Stem cells, the mole-
Proc Natl Acad Sci USA 105, 5856-5861
Niches: Mechanisms That Promote Stem Cell Mainte-
cular circuitry of pluripotency and nuclear reprogram-
10. Batlle-Morera L, Smith A & Nichols J (2008) Para-
nance throughout Life. Cell 132, 598-611.
ming. Cell 132, 567-582.
meters influencing derivation of embryonic stem cells
24. Bajada S, Mazakova I, Richardson JB & Ashammakhi
38. Lengerke C & Daley GQ (2009) Disease Models from
from murine embryos. Genesis 46, 758-767.
N (2008) Updates on stem cells and their applications
Pluripotent Stem Cells. Annals NY Acad Sci 1176, 191-196.
11. Brook FA & Gardner RL (1997) The origin and effi-
in regenerative medicine. J Tissue Eng Regener Med 2,
39. Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, Sun C-W, Meiss-
cient derivation of embryonic stem cells in the mouse.
169-183.
ner A, Cassady JP, Beard C, Brambrink T, Wu L-C, To-
Proc Natl Acad Sci USA 94, 5709-5712.
25. Doetsch F (2003) A niche for adult neural stem cells.
wnes TM & Jaenisch R (2007) Treatment of Sickle Cell
12. Martin G (1981) Isolation of a pluripotent cell line
Curr Opin Genet Dev 13, 543-550.
Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from
from early mouse embryos cultured in medium condi-
26. Palmer TD, Takahashi J & Gage FH (1997) The Adult
Autologous Skin. Science 318, 1920-1923.
16.
40. Park I-H, Arora N, Huo H, Maherali N, Ahfeldt T,
53. Labosky PA, Barlow DP & Hogan BL (1994) Mouse
Shimamura A, Lensch WT, Cowan C, Hochedlinger K &
embryonic germ (EG) cell lines: transmission through
Daley GQ (2008) Disease-Specific Induced Pluripotent
the germline and differences in the methylation imprint
Stem Cells. Cell 143, 877-886.
of insulin-like growth factor 2 receptor (Igf2r) gene com-
41. Raya A, Rodriguez-Piza I, Guenechea G, Vassena R,
pared with embryonic stem (ES) cell lines. Development
Navarro S, Barrero MJ, Consiglio A, Castella M, Rio P,
120, 3197-3204.
Sleep E, Gonzalez F, Tiscornia G, Garreta E, Aasen T,
54. Stewart C, Gadi I & Bhatt H (1994) Stem cells from
65. Kim SU & de Vellis J (2009) Stem cell-based cell the-
Veiga A, Verma IM, Surralles J, Bueren J & Belmonte
primordial germ cells can reenter the germ line. Dev
rapy in neurological diseases: A review. J Neurosci Res
JCI (2009) Disease-corrected haematopoietic progeni-
Biol 161, 626-628.
87, 2183-2200.
tors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem
55. Tada M, Tada T, Lefebvre L, Barton S & Surani M
66. Lindvall O & Björklund A (2004) Cell Therapy in
cells. Nature 460, 53-59.
(1997) Embryonic germ cells induce epigenetic repro-
Parkinson’s Disease. NeuroRx 1, 382–393.
42. Kleinsmith LJ & Pierce GB, Jr. (1964) Multipotentia-
gramming of somatic nucleus in hybrid cells. EMBO J
67. Lindvall O & Kokaia Z (2009) Prospects of stem cell
lity of Single Embryonal Carcinoma Cells. Cancer Res
16, 6510-6520.
therapy for replacing dopamine neurons in Parkinson’s
24, 1544-1551.
56. Shovlin TC, Durcova-Hills G, Surani A & McLaren A
disease. Trends Pharmacol Sci 30, 260-267.
43. Gachelin G, Kemler R, Kelly F & Jacob F (1977) PCC4,
(2008) Heterogeneity in imprinted methylation patterns
68. Lindvall O & Kokaia Z (2010) Stem cells in human
a new cell surface antigen common to multipotential
of pluripotent embryonic germ cells derived from pre-
neurodegenerative disorders — time for clinical trans-
embryonal carcinoma cells, spermatozoa, and mouse
migratory mouse germ cells. Dev Biol 313, 674-681.
lation? J Clin Invest 120, 29-40
early embryos. Dev Biol 57, 199-209.
57. Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Lit-
69. O’Donoghue K & Fisk NM (2004) Fetal stem cells.
44. Solter D & Knowles BB (1978) Monoclonal antibo-
tlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal PD, Huggins GR &
Best Pract Res Clin Obstetrics Gynaecol 18, 853-875.
dy defining a stage-specific mouse embryonic antigen
Gearhart JD (1998) Derivation of pluripotent stem cells
70. Walther G, Gekas J & Bertrand OF (2009) Amniotic
(SSEA-1). Proc Natl Acad Sci USA 75, 5565–5569.
from cultured human primordial germ cells. Proc Natl
stem cells for cellular cardiomyoplasty: Promises and
45. Martin G (1980) Teratocarcinomas and mammalian
Acad Sci USA 95, 13726-13731.
premises. Catheter Cardiovasc Interventions 73, 917-924.
embryogenesis. Science 209, 768-776.
58. Turnpenny L, Brickwood S, Spalluto C, M, Piper K,
71. Dick JE (2005) Acute Myeloid Leukemia Stem Cells.
46. Brinster R (1974) The effect of cells transferred into
Cameron IT, Wilson DI & Hanley NA (2003) Derivation of
Annals NY Acad Sci 1044, 1-5.
the mouse blastocyst on subsequent development. J
Human Embryonic Germ Cells: An Alternative Source of
72. Wang JCY & Dick JE (2005) Cancer stem cells: les-
Exp Med 140, 1049-1056.
Pluripotent Stem Cells. Stem Cells 21, 598-609.
sons from leukemia. Trends Cell Biol 15, 494-501.
47. Atkin N, Baker M, Robinson R & Gaze S (1974) Chro-
59. Mimeault M, Hauke R & Batra SK (2007) Stem Cells:
73. Brabletz T, Jung A, Spaderna S, Hlubek F & Kirchner
mosome studies on 14 near-diploid carcinomas of the
A Revolution in Therapeutics Recent Advances in Stem
T (2005) Migrating cancer stem cells an integrated con-
ovary. Eur J Cancer 10, 144-146.
Cell Biology and Their Therapeutic Applications in Re-
cept of malignant tumour progression. Nat Rev Cancer
48. Andrews P, Banting G, Damjanov I, Arnaud D & Avner
generative Medicine and Cancer Therapies. Clin Phar-
5, 744-749.
P (1984) Three monoclonal antibodies defining distinct
macol Ther 82, 252-264.
74. Keirstead HS, Nistor G, Bernal G, Totoiu M, Cloutier
differentiation antigens associated with different high
60. Masson S, Harrison DJ, Plevris JN & Newsome PN
F, Sharp K & Steward O (2005) Human Embryonic Stem
molecular weight polypeptides on the surface of human
(2004) Potential of Hematopoietic Stem Cell Therapy in
Cell-Derived Oligodendrocyte Progenitor Cell Trans-
embryonal carcinoma cells. Hybridoma 3.
Hepatology: A Critical Review. Stem Cells 22, 897-907.
plants Remyelinate and Restore Locomotion after Spi-
49. Andrews P, Goodfellow P, Shevinsky L, Bronson D &
61. Brignier AC & Gewirtz AM (2010) Embryonic and
nal Cord Injury. J Neurosci 25, 4694-4705.
Knowles B (1982) Cell-surface antigens of a clonal human
adult stem cell therapy. J Allergy Clin Immunol 125,
75. Lund RD, Wang S, Klimanskaya I, Holmes T, Ramos-
embryonal carcinoma cell line: morphological and anti-
336-344.
Kelsey R, Lu B, Girman S, Bischoff N, Sauvé Y, Yves &
genic differentiation in culture. Int J Cancer 29, 523-531.
62. Macchiarini P, Jungebluth P, Go T, Asnaghi MA, Rees
Lanza R (2006) Human Embryonic Stem Cell-Derived
50. Kannagi R, Cochran NA, Ishigami F, Hakomori S, An-
LE, Cogan TA, Dodson A, Martorell J, Bellini S, Parnigot-
Cells Rescue Visual Function in Dystrophic RCS Rats.
drews PW, Knowles BB & Solter D (1983) Stage-specific
to PP, Dickinson SC, Hollander AP, Mantero S, Conconi
Cloning Stem Cells 8, 189-199.
embryonic antigens (SSEA-3 and -4) are epitopes of a
MT & Birchall MA (2008) Clinical transplantation of a
76. Idelson M, Alper R, Obolensky A, Ben-Shushan E,
unique globo-series ganglioside isolated from human
tissue-engineered airway. The Lancet 372, 2023-2030.
Hemo I, Yachimovich-Cohen N, Khaner H, Smith Y, Wi-
teratocarcinoma cells. EMBO J 2, 2355–2361.
63. Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N,
ser O, Gropp M, Cohen MA, Even-Ram S, Berman-Zaken
51. Matsui Y, Zsebo K & Hogan BLM (1992) Derivation
Boyde A, DenBesten P, Robey PG & Shi S (2002) Stem
Y, Matzrafi L, Rechavi G, Banin E & Reubinoff B (2009)
of pluripotential embryonic stem cells from murine pri-
Cell Properties of Human Dental Pulp Stem Cells. J
Directed Differentiation of Human Embryonic Stem
mordial germ cells in culture. Cell 70, 841-847.
Dental Res 81, 531-535.
Cells into Functional Retinal Pigment Epithelium Cells.
52. Resnick JL, Bixler LS, Cheng L & Donovan PJ (1992)
64. Silvério K, Benatti B, Casati M, Sallum E & Nociti F
Cell Stem Cell 5, 396-408.
Long-term proliferation of mouse primordial germ cells
(2008) Stem Cells: Potential Therapeutics for Periodon-
77. Thirumala S, Goebel WS & Woods EJ (2009) Clinical
in culture. Nature 359, 550-551.
tal Regeneration. Stem Cell Rev Rep 4, 13-19.
grade adult stem cell banking. Organogenesis 5, 143-154.
17.
Células estaminais
adultas em medicina
Ricardo Correia 1 e José Bragança 1,2
1 Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina. Universidade do Algarve, Campus de
RESUMO
Gambelas, 8005-139 Faro, Portugal
Todos os tecidos e órgãos presentes
2 IBB-Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centro de Biomedicina Molecular e Es-
no nosso organismo são constituídos
trutural. Universidade do Algarve, Campus de Gambelas, 8005-139 Faro, Portugal
por células especializadas, que se diferenciaram a partir de células menos
Correspondência: jebraganç[email protected]
especializadas do embrião, as chamadas células estaminais. É também com
elas que contamos, para a regeneração
INTRODUÇÃO
As células estaminais adultas possuem as
dos nossos órgãos e tecidos ao longo da
Propriedades das Células Estaminais Adultas
mesmas características básicas de todas as
vida. As células estaminais responsáveis
As células estaminais são células capazes de
células estaminais, como a capacidade de se
pela manutenção dos nossos tecidos e
se auto-renovarem e de se diferenciarem em
auto-renovarem e de se diferenciarem em al-
órgãos são as chamadas células esta-
diferentes tipos de células ou tecidos, duran-
guns tipos de células especializadas. A prin-
minais adultas ou somáticas. As células
te o desenvolvimento e na idade adulta [1]. As
cipal função das células estaminais adultas
estaminais adultas são classificadas em
células estaminais podem ser classificadas
é a manutenção e reparação dos tecidos es-
inúmeros tipos, dado cada tipo de tecido
em dois grandes grupos, relativamente à sua
pecíficos e órgãos onde se encontram. Elas
ou órgão ter uma população caracterís-
origem: células estaminais embrionárias e cé-
constituem um repositório celular que é usa-
tica de células estaminais adultas.
lulas estaminais adultas.
do constantemente na renovação dos vários
Muitos dos estudos pioneiros com célu-
As células estaminais embrionárias têm uma
tecidos e pontualmente na reparação dos
las estaminais adultas, incidiram, prin-
origem embrionária e são isoladas a partir
mesmos, aquando de qualquer episódio que
cipalmente, na sua identificação e isola-
da massa interna de blastócitos pré-implan-
interfira com o seu normal funcionamento [4,
mento a partir da enorme variedade de
tados [2]. Têm um potencial de diferenciação
5]. O seu potencial de diferenciação é, intrin-
tecidos e órgãos que constitui o nosso
quase ilimitado, podendo originar quase to-
secamente, mais reduzido, comparativamen-
organismo. Para além da compreensão
dos os tipos celulares, salvo algumas excep-
te às células estaminais embrionárias [4].
dos mecanismos celulares associados
ções, não podendo, por exemplo, originar cé-
Normalmente, as células estaminais adul-
às células estaminais adultas, durante
lulas da placenta, e são consideradas células
tas, em processo de diferenciação, geram
o desenvolvimento, renovação celular
estaminais pluripotentes [1]. A maioria das
um tipo de célula transitória antes de atin-
e resposta aos mais diversos traumas
células estaminais embrionárias foi isolada a
gir o seu estádio final de diferenciação. Es-
celulares, o conhecimento da sua bio-
partir de blastócitos excedentários dos pro-
sas células intermediárias são chamadas de
logia, bem como a nossa capacidade de
cessos de fertilização in vitro e que acabam
células precursoras ou progenitoras e são
delas tirarmos partido, tem vastíssimas
por ser doados para fins de pesquisa cien-
células parcialmente diferenciadas que, por
aplicações terapêuticas na área da me-
tífica com o consentimento informado dos
divisão celular, originam apenas células dife-
dicina, quer através da sua utilização
dadores.
renciadas (Fig. 1).
terapêutica em várias patologias e epi-
As células estaminais adultas estão presen-
sódios de trauma ou na descoberta de
tes nos órgãos e tecidos fetais e adultos, e
Identificação e Isolamento
novos fármacos e análise experimental
assim correspondem a um grupo hetero-
A Identificação de células estaminais adul-
de doenças.
géneo composto por células de diferentes
tas é actualmente efectuada numa enorme
proveniências, desde as isoladas a partir do
variedade de tecidos e órgãos e efectua-se
sangue do cordão umbilical e da placenta
através de vários critérios histológicos, mor-
até às provenientes de tecidos maduros [3].
fológicos e bioquímicos. Em condições fisio-
18.
são normalmente proteínas que estão presentes na superfície celular, particularmente proteínas da membrana, como por exemplo receptores membranares. Cada tipo de
célula tem um certo arranjo de receptores à
sua superfície, que a torna distinta de outros
tipos celulares. Os cientistas tiraram depois
camente no seio do tecido ou órgão original.
partido dessa idiossincrasia biológica nos
Para além das técnicas acima referidas,
processos de identificação estaminal.
muitas outras técnicas de biologia molecu-
Moléculas fluorescentes, muito comum-
lar são utilizadas no processo de identifica-
mente anticorpos específicos capazes de
ção de células estaminais adultas como por
reconhecer e aderir de forma específica
exemplo a reacção em cadeia da polimerase
aos receptores característicos das células
em tempo real (RT-PCR), análises northern e
a isolar são usados para marcar as células.
western ou a utilização de genes repórteres.
Os marcadores fluorescentes que emitem
Figura 1. Características distintivas das células estaminais adultas
e células progenitoras. Uma célula estaminal adulta é uma célula
capaz de se auto-renovar e diferenciar em células mais especializadas. A divisão celular de uma célula estaminal adulta resulta
sempre em pelo menos uma célula estaminal adicional com as
mesmas características. Uma célula progenitora é também ou
parcialmente uma célula não especializada mas por divisão celular
produz apenas duas células especializadas. Um exemplo de uma
célula progenitora é a células mielóide que por divisão celular origina apenas células diferenciadas como leucócitos ou eritrócitos.
energia luminosa (quando activada por uma
Plasticidade, Diferenciação e Transdiferen-
fonte de energia, como uma luz ultravioleta
ciação
ou feixe de laser) permitem a visualização
As células estaminais adultas apresentam
das células estaminais alvo (Fig. 2).
dois tipos de divisão celular: a divisão celu-
O facto de cada tipo de célula estaminal ter
lar simétrica e a divisão celular assimétrica.
marcadores característicos em conjugação
É através da divisão celular simétrica, que
com a utilização de moléculas fluorescentes
as células estaminais garantem a sua ca-
(fluorocromos) permite a identificação das
pacidade de auto-renovação e mantêm o
mesmas através de duas técnicas principais:
seu repositório celular, já que este tipo de
lógicas normais, as células estaminais adul-
triagem de células activada por fluorescên-
divisão origina duas células filhas idênticas
tas existem nos vários tecidos em pequenos
cia (FACS; do inglês fluorescence-activated
e que mantêm as propriedades estaminais
nichos celulares, sendo por isso de difícil
cell sorting) e microscopia de fluorescência.
da célula estaminal progenitora. As célu-
isolamento [6]. A dimensão das suas popu-
Na técnica FACS, uma suspensão de células
las estaminais exibem este tipo de divisão
lações celulares é muito reduzida, podendo
às quais foram adicionados moléculas fluo-
celular durante vários ciclos celulares até
nalguns casos, como por exemplo as células
rescentes, que reconhecem marcadores es-
ao momento que recebem instruções de
estaminais hematopoiéticas, existirem em
taminais, passa sob pressão através de um
diferenciação celular por parte do ambien-
proporções de uma célula estaminal para
orifício suficientemente estreito que permite
te celular onde se encontram. Após a re-
cem mil células diferenciadas [7].
a passagem de uma única célula de cada vez.
cepção desses estímulos de diferenciação
Na maioria das vezes, as células estaminais
Ao sair do orifício, as células passam então
as células estaminais deixam de dividir-se
adultas são morfologicamente idênticas ou
individualmente através de uma fonte de luz,
simetricamente e passam a exibir uma di-
muito semelhantes às células dos tecidos
geralmente um laser, e em seguida, através
visão celular assimétrica que conduzirá à
onde se encontram, o que torna o seu isola-
de um campo eléctrico. As células estami-
mento microscópico impossível. A resposta
nais pretendidas correspondem a células
a este problema de identificação estaminal,
fluorescentes que vão ser carregadas com
baseia-se na utilização de marcadores bio-
uma carga eléctrica, enquanto as células
químicos para células estaminais. As pro-
não fluorescentes não são carregadas, sen-
teínas ou factores de transcrição que são
do as mesmas depois separadas de acordo
característicos de células estaminais, ou es-
com a sua carga (Fig. 3).
pecíficos para um determinado tipo de célula
Por sua vez, a microscopia de fluorescência
estaminal adulta, são usados como marca-
utiliza moléculas fluorescentes capazes de
dores citológicos nos processos de identifi-
reconhecer os marcadores característicos
cação e posteriormente, ou em simultâneo,
das células estaminais alvo (que após acti-
nos processos de isolamento estaminal.
vação por uma fonte luminosa emitem flu-
Os marcadores estaminais mais recorrentes
orescência) para identificá-las microscopi-
Figura 2. Identificação de marcadores estaminais através da ligação
de moléculas florescentes à molécula sinalizadora.
19.
sua diferenciação em células mais especializadas. Acredita-se que é a segregação
diferencial das proteínas membranares entre as células filhas que estará na origem
da passagem das divisões celulares simétricas para assimétricas e consequentemente da diferenciação celular [6].
Apesar da capacidade de diferenciação
ser menor nas células estaminais adultas,
sob condições especiais, especialmente in
vitro, as mesmas podem gerar linhas de
células que não gerariam em condições fisiológicas normais. Esse processo celular é
induzido através da cultura das células estaminais em meios de crescimento diferentes daqueles que seriam expostas in vivo
ou quando as mesmas são transplantadas
para um órgão ou tecido ou órgão diferente
do qual foram isoladas originalmente [8].
Figura 3. Representação esquemática da triagem de células activada por fluorescência.
Tipos de Células Estaminais Adultas
As células estaminais hematopoiéticas po-
As células estaminais neurais encontram-
A lista que dos tecidos e órgãos dos quais
dem originar todos os elementos sanguíne-
se, predominantemente, nas zonas sub-
foram isoladas células estaminais adultas
os, quer eritrócitos, quer linfócitos e plaque-
ventriculares cerebrais e zona sub-granu-
cresce constantemente e inclui a medula ós-
tas. Encontram-se, sobretudo, na medula
lar do hipocampo e originam neurónios,
sea, o sangue periférico, o cérebro, a medula
óssea, mas também no sangue circulante,
oligodendrócitos e astrócitos [11].
espinhal, a polpa dentária, os vasos sanguí-
bem como no sangue do cordão umbilical
As células estaminais epiteliais originam
neos, o músculo-esquelético, o epitélio da
e na placenta. Tipicamente origina dois ti-
todas a células epiteliais do nosso organis-
pele e do sistema digestivo, a córnea, a re-
pos de células progenitoras: a mielóide e
mo, desde as que constituem as superfícies
tina, o fígado e o pâncreas, entre outros [9].
linfóide. Da linhagem linfóide são gerados
externas (como a pele e as mucosas) até às
Dado que de uma forma geral, a cada tipo
monócitos, macrófagos, neutrófilos, basófi-
que delimitam o tubo digestivo e as vias
de tecido corresponde um dado tipo de cé-
los, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos /
respiratórias, bem como todos os vasos,
lula estaminal adulta, para além dos mui-
plaquetas e células dendríticas. Da linhagem
glândulas e outras cavidades [2].
tos tipos de células estaminais já identifi-
linfóide são derivados linfócitos T e B e B e
cados, pensa-se que existirão muitos mais,
células NK [2].
Células Estaminais Adultas versus Embrio-
dado que teoricamente, em cada tecido
As células estaminais mesenquimais origi-
nárias
específico existirá uma pequena população
nam por diferenciação condrócitos, miócitos,
Muito do interesse emergente no uso de
estaminal característica. As células esta-
células adiposas, células do tecido conectivo
células estaminais adultas em medicina,
minais adultas estão também presentes
e osteoblastos e encontram-se geralmente
deve-se ao facto da sua utilização levantar
em tecidos fetais, na placenta e no cordão
em tecidos conectivos, em especial na me-
menores questões éticas do que as levan-
umbilical [3]. As células estaminais adultas
dula óssea, tecido adiposo e no sangue do
tadas pela utilização de células estaminais
mais estudadas e usadas são as células es-
cordão umbilical e encontram-se entre as
embrionárias, já que a mesma pode ser
taminais hematopoiéticas, mesenquimais,
células estaminais adultas mais fáceis de
considerada, embora de forma simplificada,
neurais e epiteliais [2].
isolar [10].
como apenas um mero transplante.
20.
Para além da ausência de problemas éticos,
tipos de células diferenciadas, através do
a menor plasticidade e capacidade prolifera-
uso de factores de crescimento e outras
tiva das células estaminais adultas, compa-
moléculas reguladoras.
rativamente às embrionárias, é paradoxalmente também um factor positivo. Apesar
Aplicações Clínicas
das células estaminais embrionárias se
Há mais de 40 anos que são usadas células
apresentarem, aparentemente, como uma
estaminais adultas em medicina, nomea-
las diferenciadas in vitro a partir de células
solução mais vantajosa, dado a sua pluripo-
damente células estaminais hematopoié-
estaminais ou através da estimulação da di-
tência natural, capacidade proliferativa e ao
ticas e mais recentemente células estami-
ferenciação das células estaminais adultas
facto de, teoricamente, possuírem uma gama
nais isoladas a partir do sangue do cordão
presentes nos tecidos ou órgãos danificados.
de aplicações mais extensa do que as células
umbilical, em doenças como a leucemia e
estaminais adultas, a sua enorme plasticida-
anemia aplástica ou em linfomas [13].
Transplante de Órgãos
de e capacidade proliferativa são propensas
A comunidade médica e científica pre-
Para além da utilização de células estami-
à formação de tumores no local alvo ou pe-
vê que num futuro próximo, será possível
nais na reposição celular de tecidos danifi-
rifericamente sob a forma de metástases. O
utilizar células estaminais no tratamento
cados, as mesmas podem ser utilizadas na
uso das células estaminais embrionárias é
de cancro, diabetes, doença de Parkinson,
produção ex vivo de tecidos e órgãos com
também limitado pelas dificuldades técnicas
doenças auto-imunes, insuficiência cardía-
posterior transplante. Para além da supres-
em conduzir a sua diferenciação para o tipo
ca, traumas musculares e até em pertur-
são dos problemas associados à escassez de
celular pretendido [12].
bações neurológicas entre muitas outras
órgãos e tecidos nos bancos de transplante,
Para além de serem menos propensas à for-
patologias [14-22]. É no entanto necessário
os tecidos e órgãos gerados por diferencia-
mação de tumores, as células estaminais
que se saiba mais sobre a biologia das cé-
ção estaminal eliminam os riscos de rejeição
adultas têm ainda outros pontos a seu favor,
lulas estaminais bem como sobre os me-
e os seus efeitos colaterais [13].
como por exemplo o facto de já estarem pro-
canismos das patologias que queremos
Em 2008 foi realizado o primeiro transplan-
gramadas para originar células diferenciadas
tratar, até que a utilização das células es-
te de um órgão humano produzido a partir
o que potencia regenerações ou integrações
taminais seja uma prática clínica comum.
de células estaminais adultas [23]. O pro-
mais eficazes. Por outro lado, apresentam
cedimento cirúrgico foi efectuado numa
algumas desvantagens, como a sua menor
Reposição Celular
paciente, em que um dos brônquios tinha
capacidade de proliferação em relação às
A utilização de células estaminais na repo-
entrado em colapso, devido a uma tuber-
células estaminais embrionárias e o facto
sição celular, em tecidos ou órgãos danifi-
culose, o que conduziria inevitavelmente à
de poderem conter um maior número de er-
cados, é um procedimento terapêutico utili-
falência do pulmão por ele arejado.
ros genéticos (devido a possíveis exposições
zado com sucesso há vários anos e que tem
O transplante brônquico não é medicamen-
a agentes mutagénicos ou erros durante a
como expoente máximo o transplante de
te recomendado, dados os brônquios se-
replicação) e são de mais difícil identificação
medula óssea. As células estaminais adul-
rem dos órgãos mais propensos à rejeição
e isolamento (visto existirem em pequenas
tas hematopoiéticas, utilizadas nos trans-
imunológica, mas o Professor Macchiarini
populações celulares no seio dos tecidos e
plantes de medula óssea, após proliferação
e colaboradores decidiram avançar com
órgãos de interesse) [12].
e diferenciação, restabelecem os níveis
um pioneiro transplante brônquico autólogo
normais de todos os elementos sanguíneos
[23]. Um tubo brônquico híbrido foi produzi-
em pacientes com anemias aplásticas ou
do a partir de uma componente cartilagino-
TERAPIA ESTAMINAL
leucemias leucemias [19].
sa acelular de um dador, de condroblastos
Produção
A utilização de outros tipos de células esta-
(diferenciados a partir de células estaminais
O facto das células estaminais adultas exis-
minais é também cada vez mais uma opção
adultas mesenquimais da paciente) e de cé-
tirem sob a forma de pequenas populações
clínica, dados os bancos de órgãos ou tecidos
lulas epiteliais (retiradas da mucosa brôn-
celulares no seio de tecidos muitas vezes
destinados a transplante serem insuficientes
quica da paciente). Foi colhida uma secção
complexos, como por exemplo o cérebro,
e os mesmos terem um potencial limitado
de traqueia de um dador, da qual foi remo-
dificulta em grande medida a sua identifi-
em órgãos mais complexos como o cérebro.
vida toda a componente celular pertencente
cação, isolamento e produção. De um modo
A reposição celular por células estaminais
ao dador e apenas permaneceu a compo-
geral, após a sua identificação é necessá-
efectua-se, basicamente, através de três
nente cartilaginosa. Foram então deposita-
rio seleccioná-las, expandi-las in vitro e
processos distintos: por injecção directa nos
das células epiteliais e células estaminais
promover a sua diferenciação nos diversos
tecidos afectados, por transferência de célu-
mesenquimais adultas (isoladas a partir da
21.
te usam-se vírus como vectores de inserção
dos os tipos de células hematológicas [25].
genética. Embora a terapia genética seja
Porém, a potencial utilização de células es-
uma tecnologia recente, ela tem sido utiliza-
taminais adultas, em terapia genética, não se
da com sucesso em alguns campos da medi-
limita apenas a doenças do foro hematológi-
cina humana [24, 25].
co. Estudos de terapia genética recentes, em
As células estaminais adultas apresentam
ratinhos, com células estaminais mesenqui-
medula óssea da paciente) sobre essa com-
um enorme potencial no âmbito da tera-
mais e neurais, mostram resultados anima-
ponente cartilaginosa e procedeu-se duran-
pia genética devido às suas capacidades de
dores em alguns tipos de distrofias muscula-
te quatro dias a um processo de maturação e
auto-renovação, inclusão histológica e pos-
res e em gliomas, respectivamente [28].
diferenciação in vitro. O novo tubo brônquico
terior diferenciação. Essas características
As células estaminais mesenquimais isola-
foi depois transplantado, substituindo com
celulares torna-as vectores muito apetecí-
das a partir da medula óssea, após diferen-
sucesso o brônquio esquerdo da paciente,
veis em terapia genética, já que o número de
ciação em mioblastos in vitro, incorporam-se
com a consequente recuperação da função
processos de inserção genética poderia ser
muito bem por injecção no tecido muscular,
respiratória no pulmão esquerdo (Fig. 4).
reduzido e a sua acção amplificada ao longo
diferenciam-se em miócitos maduros e asso-
A conjugação da diferenciação de células
do tempo devido aos mecanismos de prolife-
ciam-se perfeitamente às fibras musculares
estaminais adultas e os biomateriais apro-
ração estaminal adulta [12].
originais. Estas células estaminais poderão
priados, poderá a médio prazo gerar solu-
A primeira utilização, com sucesso, de cé-
facilmente ser modificadas geneticamente e
ções terapêuticas funcionais na área dos
lulas estaminais adultas em terapia genéti-
ser usadas como ferramenta de terapia ge-
transplantes de tecidos e órgãos. Para além
ca com humanos ocorreu em 1992, quando
nética através da expressão de genes causa-
da eliminação dos riscos de rejeição por par-
Bordignon realizou o primeiro procedimento
dores de miopatologias, como por exemplo a
te pacientes dos novos tecidos, esta prática
de terapia genética clínica, utilizando células
distrofina na distrofia de Duchenne [29].
elimina a necessidade de utilização de imu-
estaminais hematopoiéticas como vectores
Recentemente, foram também utilizadas cé-
nossupressores cujos efeitos secundários
de entrega de um gene para a adenosina
lulas estaminais neurais em terapia genética
podem ser graves, tais como: hipertensão ar-
desaminase em crianças com a síndrome
no tratamento de gliomas. As células esta-
terial, insuficiência renal e mesmo tumores.
de imunodeficiência combinada severa [26].
minais foram modificadas in vitro de modo
Este trabalho culminou em 2002, com a pu-
a expressarem uma enzima que catalisa a
Terapia Genética
blicação do processo como acto terapêutico
formação de uma substância tóxica para as
A terapia genética baseia-se na inserção de
da mesma síndrome [27].
células tumorais e que despoleta a sua morte
genes em células ou tecidos de modo a tratar
As células estaminais adultas hematopoié-
celular [30].
as mais diversas patologias. Geralmente um
ticas apresentam-se como as células esta-
gene normal é inserido em células ou tecidos
minais de eleição em terapia genética, dado
Descoberta de Fármacos e Análise de Doenças
nos quais a expressão do gene é anormal e
serem facilmente isoladas do sangue e, após
Duas das valências das células estaminais
origina uma patologia específica, como por
modificação genética, serem de fácil inser-
adultas, potencialmente importantes para a
exemplo em doenças hereditárias nas quais
ção nos pacientes através de transplantes
medicina, são a sua utilização em processos
um alelo mutante e pernicioso é substituído
autólogos. Elas oferecem ainda a possibilida-
de descoberta de novos fármacos e na aná-
por um alelo funcional [8]. A inserção do gene
de de corrigir defeitos em todas as linhagens
lise de doenças. Os investigadores poderão
pode ser de difícil execução e frequentemen-
hematopoiéticas, dado poderem originar to-
usar as células estaminais adultas como
A Uma traqueia é removida dum dador
Figura 4. Transplante brônquico autólogo.
22.
B Remoção da componente celular da traqueia do dador
C Deposição de células epiteliais e células estaminais
mesenquimais adultas (da paciente) sobre a componente
cartilaginosa do dador e processo de maturação e diferenciação in vitro 4 Inserção do novo brônquio na paciente.
“tubo de ensaio” para testar a segurança e
ceiro ao Curso de Medicina e “Programa
qualidade de novos medicamentos.
de Investigação em Medicina Regenerativa”
Populações homogéneas de células diferen-
da Universidade do Algarve, concedido pelo
ciadas, a partir de células estaminais adul-
Ministério Ciência, Tecnologia e Ensino Su-
tas, poderão ser usadas para testar os efei-
perior através da UMIC, I.P. – Agência para
tos farmacológicos, específicos para cada
a sociedade do conhecimento, e da FCT, I.P.
tipo de tecido, sob o efeito de um extenso nú-
– Fundação para a Ciência e Tecnologia. José
14. Totey S & Pal R (2009) Adult stem cells: a clinical upda-
mero de compostos químicos. Essas popula-
Bragança agradece a Câmara Municipal de
te. J Stem Cells 4, 105-21.
ções celulares poderão também ser criadas
Oeiras pela atribuição do prémio «Professor
15. Ferrari M et al. (2007) Adult stem cells: perspectives for
a partir de células isoladas de pacientes que
António Xavier 2009» e a Fundação Merck
therapeutic applications. Vet Res Commun 31 Suppl 1, 1-8.
padeçam de uma determinada doença e se-
Sharp & Dhome - Portugal pela contribuição
16. Coulombel L (2007) [Adult stem cells: their scientific
rem usadas na descoberta de novos fárma-
ao desenvolvimento do projecto “miPS: re-
interest and therapeutic future]. Gynecol Obstet Fertil 35,
cos que possam ser úteis no tratamento da
programming mouse adult cells”.
806-10.
doença bem como na compreensão dos seus
17. Hamilton CG (2005) Advances and challenges in the the-
mecanismos patológicos.
rapeutic use of stem cells. Nurs Times 101, 21-3.
REFERÊNCIAS
18. Schafer R et al. (2008) Basic research and clinical applications of non-hematopoietic stem cells, 4-5 April 2008,
FUTUROS DESENVOLVIMENTOS
1. Jaenisch R & Young R (2008) Stem cells, the molecular
Tubingen, Germany. Cytotherapy 11, 245-55.
E CONCLUSÕES
circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming. Cell
19. Perl L et al. (2010) Cellular therapy in 2010: focus on
A utilização de células estaminais adultas é
132, 567-82.
autoimmune and cardiac diseases. Isr Med Assoc J 12,
em medicina é claramente um campo muito
2. Kasper D. et al. (2008) Harrison’s Principles of Internal
110-5.
promissor. Transplantes baseados em célu-
Medicine 17th Edition. p. 425-435.
20. Brignier AC & Gewirtz AM (2010) Embryonic and adult
las estaminais adultas começam a ser usa-
3. Tuch BE (2006) Stem cells--a clinical update. Aust Fam
stem cell therapy. J Allergy Clin Immunol 125 (Suppl 2),
dos frequentemente e são constantemente
Physician 35, 719-21.
S336-44.
aperfeiçoados no âmbito clínico dando mos-
4. Leeper NJ, Hunter AL & Cooke JP (2010) Stem cell the-
21. Doetsch F (2003) A niche for adult neural stem cells.
tras de uma versatilidade superior à que se
rapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and indu-
Curr Opin Genet Dev 13, 543-50.
lhes era inicialmente vaticinada. Contudo, os
ced pluripotent stem cells. Circulation 122, 517-26.
22. Gomperts BN & Strieter RM (2007) Stem cells and chro-
estudos e ensaios clínicos envolvendo célu-
5. Janssens S (2010) Stem cells in the treatment of heart
nic lung disease. Annu Rev Med 58, 285-98.
las estaminais adultas encontram-se ainda
disease. Annu Rev Med 61, 287-300.
23. Macchiarini P et al. (2008) Clinical transplantation of a
numa fase muito seminal e serão necessá-
6. He S, Nakada D & Morrison SJ (2009) Mechanisms of
tissue-engineered airway. Lancet 372, 2023-30.
rios alguns anos e vários estudos científicos
stem cell self-renewal. Annu Rev Cell Dev Biol 25, 377-406.
24. Knoell DL & Yiu IM (1998) Human gene therapy for here-
e ensaios clínicos até que possamos tirar
7. Health National Institutes (2006) Stem Cells: Scientific
ditary diseases: a review of trials. Am J Health Syst Pharm
partido das enormes potencialidades clíni-
Progress And Future Research Directions. NIH.
55, 899-904.
cas das células estaminais adultas.
8. Comyn O, Lee E & MacLaren RE (2009) Induced pluri-
25. Nathwani AC, Davidoff AM & Linch DC (2005) A review of
Apesar dos imensos problemas técnicos, que
potent stem cell therapies for retinal disease. Curr Opin
gene therapy for haematological disorders. Br J Haematol
ainda têm que ser debelados, a utilização de
Neurol 23, 4-9.
128, 3-17.
células estaminais adultas em medicina hu-
9. Thirumala S, Goebel WS Woods EJ (2009) Clinical grade
26. Abbott A (1992) Gene therapy. Italians first to use stem
mana trará benefícios inimagináveis, quer
adult stem cell banking. Organogenesis 5, 143-54.
cells. Nature 356, 465.
através do melhoramento dos mecanismos
10. Djouad F et al. (2009) Mesenchymal stem cells: inno-
27. Aiuti A et al. (2002) Correction of ADA-SCID by stem cell
naturais de regeneração, transplante de ór-
vative therapeutic tools for rheumatic diseases. Nat Rev
gene therapy combined with nonmyeloablative conditio-
gãos, terapia génica e até na descoberta de
Rheumatol 5, 392-9.
ning. Science 296, 2410-3.
novas drogas e análise de doenças.
11. Frank RT et al. (2009) Neural stem cells as a novel pla-
28. Health National Institutes (2006) Regenerative Medici-
tform for tumor-specific delivery of therapeutic antibodies.
ne. NIH.
PLoS One 4(12), e8314.
29. Cossu G & Mavilio F (2000) Myogenic stem cells for the
AGRADECIMENTOS
12. Watt FM & Driskell RR (2009) The therapeutic poten-
therapy of primary myopathies: wishful thinking or thera-
Os autores desejam reconhecer o apoio do
tial of stem cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 365,
peutic perspective? J Clin Invest 105, 1669-74.
Departamento de Ciências Biomédicas e
155-63.
30. Aboody KS et al. (2000) Neural stem cells display ex-
Medicina durante a sua recente instalação
13. Singec I et al. (2007) The leading edge of stem cell the-
tensive tropism for pathology in adult brain: evidence from
na Universidade do Algarve. O apoio finan-
rapeutics. Annu Rev Med 58, 313-28.
intracranial gliomas. Proc Natl Acad Sci USA 97, 12846-51.
23.
no contexto geral da saúde dos cidadãos
europeus. As doenças do sistema nervoso
representam 35% dos problemas de saúde da Europa, e no total são mais dispendiosas que o conjunto “cancro e diabetes”.
No entanto, a União Europeia só atribuiu
Células estaminais
neurais
A caminho da reparação cerebral?
ao cérebro 8% do orçamento disponível
para financiar as ciências da vida, relativamente ao V Programa Quadro, o que representou menos de 0,01% do custo total
das doenças do cérebro no período 19982002.
Estes números são bem exemplificativos
do enorme desfazamento entre o peso
real das doenças do sistema nervoso (social e económico) e o investimento na sua
João O. Malva e Liliana Bernardino
investigação nas sociedades europeias.
Neuroprotecção e Neurogénese na Reparação Cerebral, Centro de Neurociências e Biologia
Muitos factores contribuem para este des-
Celular, Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra, 3004-504 Coimbra, Portugal.
fazamento. O desconhecimento da Sociedade no que respeita à base fisiológica do
funcionamento do cérebro contribui para
Correspondência: [email protected]
o estigma social das doenças cerebrais.
Devido à abrangência de disciplinas bioAS DOENÇAS DO CÉREBRO – A URGÊNCIA DA
para uma grande dependência dos seus
lógicas que estudam o cérebro criou-se
REPARAÇÃO CEREBRAL
familiares, cuidadores e profissionais de
uma área interdisciplinar de estudo do
As doenças do cérebro na Europa
saúde.
cérebro designada Neurociência que en-
As doenças do cérebro representam um
Um estudo da European Brain Council
globa diversas especialidades científicas
dos principais problemas de saúde com
concluiu que em 2004 as doenças do Siste-
e clínicas, nomeadamente, neurologia,
que se debatem as Sociedades moder-
ma Nervoso foram responsáveis pelo con-
psicologia, psiquiatria, neuroendocrinolo-
nas. No seu conjunto, constituem uma das
sumo de 386 biliões de euros, numa po-
gia, entre outras. Para este cenário muito
principais fontes de sofrimento tanto para
pulação de 466 milhões de habitantes, em
contribui a grande diversidade de mani-
os doentes como para os seus familiares
28 países da Europa. Estes números per-
festações que vão desde predominante-
e são responsáveis pelo consumo de uma
mitem concluir que em média o custo das
mente físicas até quase exclusivamente
parte muito significativa do orçamento da
doenças do sistema nervoso é de 829 eu-
neuropsicológicas. Entre as principais
União Europeia para o sector da saúde [1].
ros por habitante, repartidos pelos gastos
doenças do cérebro encontram-se: ansie-
As doenças do sistema nervoso atingem
com os cuidados de saúde, os transportes,
dades, enxaquecas, depressões, toxicode-
cerca de 35% da população europeia e re-
serviços de acção social, baixas médicas
pendências, demências, epilepsias, esqui-
presentam a principal causa de incapaci-
e aposentações antecipadas. Este estudo
zofrenia, doença de Parkinson, acidentes
dade e a segunda causa de mortalidade na
indica ainda que os custos económicos,
vasculares
União Europeia. Além do impacto directo
com este grupo de doenças, irão aumen-
esclerose múltipla e tumores cerebrais.
das doenças do sistema nervoso no pa-
tar fortemente nos próximos anos, devido
Esta diversidade de patologias, com todos
ciente, mais ou menos profundo e mais ou
sobretudo ao aumento da prevalência das
os custos sociais e económicos associa-
menos incapacitante, estas doenças ainda
diversas doenças do sistema nervoso com
dos, deveria contribuir para mobilizar a
são muito pouco compreendidas e desper-
o aumento da esperança de vida [1].
sociedade e os decisores políticos para a
tam sentimentos que levam à rejeição so-
Verifica-se que o investimento europeu
urgência de compreender o cérebro e de-
cial. Por outro lado, as pessoas afectadas
na investigação do “cérebro”, tratamen-
senvolver tratamentos eficientes para as
por este grupo de doenças tornam-se fre-
to e apoio aos doentes e seus familiares
suas doenças. No entanto, a diversidade
quentemente doentes crónicos, o que po-
é claramente insuficiente face ao peso
nem sempre contribui para a eficiência.
tencia o sofrimento do paciente e contribui
que as doenças do sistema nervoso têm
Bons exemplos (pela positiva) de eficiência
24.
cerebrais,
traumatismos,
cirúrgicas mais eficientes e menos debilitantes. Neste conjunto de técnicas cirúrgicas podemos destacar a estimulação cerebral profunda, pela robustez de efeitos
e pelos seus efeitos secundários mínimos.
No entanto, como referimos anteriormente, a comunidade científica e médica continua a não dispôr de boas estratégias para
curar o sistema nervoso doente.
Medicina Regenerativa do cérebro – espeFigura 1. Neurogénese no cérebro adulto. (A) Representação ilustrativa de um corte sagital do cérebro adulto de roedor mostrando a
localização dos nichos neurogénicos: região subventricular (SVZ) e região subgranular (SGZ) do giro dentado no hipocampo. As células
estaminais/progenitoras presentes na SVZ dão origem a novos neurónios que migram pela via rostromigratória (RMS) em direcção ao
bolbo olfactivo (OB) onde se diferenciam em interneurónios e se integram nos circuitos neurais pré-existentes. Fotografias representativas de microscopia confocal de novos neurónios (identificados a verde ou vermelho pelo marcador DCX - “doublecortin”) no giro dentado
do hipocampo (B), na região SVZ (C) e na via rostromigratória (D).
rança para o futuro?
A falta de tratamentos eficientes para as
doenças do cérebro contribui muito significativamente para o seu impacto na Sociedade, uma vez que a maior parte das
e unidade na transmissão de mensagens,
terapêuticas curativas para a maioria das
terapias existentes está muito mais voca-
e de “lobby” positivo eficiente, encontram-
doenças do sistema nervoso. Numa pers-
cionada para o alívio de sintomas do que
se na área do cancro ou da SIDA. Nestes
pectiva histórica, as doenças do cérebro
para a sua cura propriamente dita. Por ou-
casos o foco ajuda à transmissão da men-
foram inicialmente tratadas com recurso
tro lado, estas doenças são muito desco-
sagem e claramente favorece positiva-
a técnicas cirúrgicas ou químicas agres-
nhecidas tanto do ponto de vista das suas
mente o “lobby” e a colheita de dividendos
sivas e pouco eficientes que provocavam
causas primárias como do ponto de vista
no que respeita ao maior investimento re-
efeitos secundários incapacitantes para os
da eficácia terapêutica.
lativo que estas áreas da ciência recebem
doentes. Com o aumento do conhecimento
Assim, é essencial desenvolver novas
em comparação com o cérebro.
sobre os mecanismos bioquímicos envol-
terapias para reparar o tecido nervoso
A European Brain Council e os movimentos
vidos na comunicação entre as células do
lesado, o que poderá constituir um ele-
nacionais emergentes, com a constituição
cérebro foram criadas condições para o
mento central no desenvolvimento futuro
de grupos de acção ou de conselhos nacio-
desenvolvimento racional da neurofarma-
das Neurociências. Neste contexto, no-
nais para o cérebro, procuram reforçar o
cologia. As companhias farmacêuticas co-
vas estratégias neuroprotectoras, com
“lobby” social e político do “cérebro”, jun-
locaram grande esforço de investigação e
capacidade de prevenir a morte neuro-
tando profissionais, doentes, familiares e
desenvolvimento em novos fármacos mais
nal resultante da agressão do cérebro, e
companhias farmacêuticas dedicadas ao
robustos e selectivos, que permitiram
o desenvolvimento de novas estratégias
estudo do cérebro. Através de acções edu-
controlar vários sintomas das doenças
reparadoras do tecido nervoso afectado,
cativas concertadas procura-se desmisti-
do sistema nervoso. O desenvolvimento
recorrendo a células estaminais, poderão
ficar o cérebro e aumentar o investimento
de novos fármacos com acção no sistema
contribuir determinantemente para a futu-
em investigação científica e em cuidados
nervoso teve particular importância na
ra terapia do cérebro doente.
de saúde dedicados ao sistema nervoso.
segunda metade do século XX e continua
A ideia dogmática de que o cérebro é des-
uma actividade relevante no início do Sé-
provido de capacidade regenerativa mu-
O tratamento das doenças do cérebro – es-
culo XXI. Paralelamente com o desenvol-
dou drasticamente nos últimos anos com
tado actual
vimento de novos fármacos e com a evo-
a descoberta de nichos de células estami-
O conhecimento científico insuficiente so-
lução de técnicas de imagiologia cerebral
nais neurais com capacidade de gerar no-
bre o funcionamento do cérebro contribui
funcional a comunidade médica contribuiu
vos neurónios no cérebro adulto de mamí-
de forma determinante para a ausência de
com o desenvolvimento de novas técnicas
feros, incluindo nos Humanos. A presença
25.
para as zonas de lesão. Esta neurogénese
um processo de neurogénese constitutiva.
estimulada pela lesão contém um enorme
Este nicho neurogénico ladeia os ventrí-
potencial reparador do cérebro e lança um
culos laterais e é o local de formação de
desafio importante aos neurocientistas: o
neuroblastos que migram para os bolbos
aproveitamento deste potencial reparador
olfactivos, onde se diferenciam e integram
para desenvolver novas estratégias tera-
como novos neurónios funcionais. O nicho
de células estaminais e progenitoras
pêuticas para as patologias que afectam o
neurogénico da SVZ está organizado em
residentes no cérebro adulto, e o avanço
sistema nervoso [5-7].
rosetas celulares constituídas por três ti-
vertiginoso no conhecimento sobre o seu
pos distintos de células. As células B que
funcionamento e manipulação, alimentam
Neurogénese no hipocampo
são as células com propriedades estami-
a esperança do desenvolvimento futuro de
Na camada subgranular do giro dentado
nais, e fenótipo próximo dos astrócitos.
novas estratégias para a eficiente repara-
existem células estaminais neurais e cé-
Estas células proliferam lentamente e
ção cerebral. Em particular, é necessário
lulas progenitoras que se diferenciam em
são muito ramificadas, o que lhes permi-
desenvolver esforços para compreender
astrócitos e em células granulares do giro
te entrar em contacto com os outros par-
os processos de modulação do desen-
dentado. Nesta estrutura o nicho neuro-
ceiros celulares e moleculares do nicho
volvimento, diferenciação e migração das
génico inclui células estaminais e célu-
neurogénico, que inclui a lâmina basal da
células imaturas, de modo a obter um pro-
las progenitoras do tipo 1, do tipo 2 e do
vasculatura sanguínea da SVZ. As células
cesso de substituição de neurónios mor-
tipo 3, com capacidade proliferativa e que
B possuem ainda um prolongamento es-
tos e integração funcional de novas célu-
apresentam marcadores de imaturidade/
pecial em forma de cílio que atravessa o
las nos circuitos neuronais [2].
célula estaminal como a nestina, Sox2 e
espaço apertado entre as células ependi-
GFAP (“Glial Fibrillary Acid Protein”). Os
mais, ciliadas, que revestem a parede do
Neurogénese no cérebro adulto
progenitores do tipo 3 encontram-se em
ventrículo lateral. Através desta estrutura
A neurogénese no cérebro adulto é um pro-
fase proliferativa mas começam a perder
as células B têm acesso directo ao líquido
cesso que ocorre continuamente ao longo a
os marcadores de imaturidade e adquirem
cefalorraquidiano dos ventrículos laterais.
vida. Em nichos restritos do sistema nervo-
características fenotípicas da linha neu-
As células B dão origem às células C que
so existem células estaminais neurais e cé-
ronial (PSA-NCAM, “Poly-Sialated Neural
são células com grande capacidade proli-
lulas progenitoras que proliferam continu-
Cell Adhesion Molecule”), num proces-
ferativa e que são responsáveis pela gran-
amente e que produzem células do sistema
so que leva à diferenciação funcional de
de dinâmica proliferativas da SVZ. As célu-
nervoso, que se integram funcionalmente
neurónios jovens. O nicho neurogénico
las C dão origem às células A que saem do
em circuitos neurais. Este processo de dife-
está intimamente associado a lâmina ba-
ciclo celular e formam neuroblastos que
renciação constitutiva de novos neurónios,
sal da vasculatura que fornece contacto
se organizam em cadeias migratórias em
astrócitos e oligodendrócitos ocorre em
físico e químico essencial à manutenção
direcção ao bolbo olfactivo. Estas cadeias
duas regiões principais: a região subventri-
do estado de imaturidade estaminal. Os
de neuroblastos são rodeadas por estru-
cular, que ladeia os ventrículos laterais, e
neuroblastos resultantes da divisão assi-
turas tubulares formadas por astrócitos
a camada subgranular do giro dentado do
métrica dos progenitores saem do ciclo de
que saem da SVZ e se juntam na região
hipocampo [2-4] (Figura 1).
divisão celular e migram localmente para
anterior da SVZ formando a via rostromi-
Este processo de renovação e integração
a camada granular do giro dentado, onde
gratória. As cadeias migratórias de neuro-
de novas células no sistema nervoso cen-
se integram funcionalmente como novos
blastos (células A) da via rostromigratória
tral, e mais especificamente no cérebro,
neurónios granulares. Este processo de
organizam-se intimamente com uma rede
ocorre de modo constitutivo, produzindo
neurogénese
desempenha
muito rica de vasos sanguíneos. Assim,
células que desempenham um papel acti-
um papel muito importante na renovação
para que ocorra a migração dos neuro-
vo na fisiologia do tecido nervoso. Por ou-
da arquitectura sináptica do hipocampo
blastos através da via rostromigratória
tro lado, a neurogénese também pode ser
e provavelmente desempenha um papel
parece ser muito importante o suporte fí-
estimulada em resposta à agressão cere-
importante na formação e recordação de
sico e químico (que inclui sinalização pelo
bral. O tecido cerebral danificado produz
memórias armazenadas [3,8].
factor neurotrófico BDNF - “Brain derived
constitutiva
um ambiente permissivo para a neurogénese, estimulando a produção de novas
neurotrophic factor”) fornecido pelos asNeurogénese na região subventricular
trócitos e pelos vasos sanguíneos. Além
células neurais e facilitando a migração
A região subventricular (SVZ) do cérebro
disso, parece haver um gradiente químico
de progenitores das zonas neurogénicas
adulto é um local onde ocorre activamente
na via rostromigratória com propiedades
26.
repulsivas com origem na SVZ e quimio-
um processo benéfico. Assim, o estudo da
atractivas com origem no bolbo. Actuan-
neurogénese no hipocampo em condições
do em conjunto, estes factores forçam a
de epilepsia é um bom exemplo para as
migração rostral dos neuroblastos em di-
enormes dificuldades que se vislumbram
recção ao bolbo olfactivo. Ao chegarem ao
para a Medicina Regenerativa do cérebro
bolbo olfactivo os neuroblastos abando-
[3,15-17]. No giro dentado do hipocampo
nam a sua migração tangencial e migram
verifica-se que as crises epilépticas poten-
berta constitui em si um facto espantoso,
radialmente para as diferentes camadas
ciam a diferenciação de novos neurónios
e além disso promete novos e fascinantes
celulares do bolbo, onde se diferenciam
granulares. No entanto, nestas condições
desenvolvimentos científicos. Estas célu-
como neurónios granulares e glomerula-
as células apresentam uma menor com-
las, já descritas por Ramón e Cajal, pe-
res. Este processo de neurogénese cons-
pactação e inserção na camada granular
maneceram “adormecidas” para a neuro-
titutiva do bolbo olfactivo é muito impor-
do giro dentado, e formam sinapses aber-
ciência durante décadas revelando agora
tante para a discriminação de odores em
rantes que contribuem para o fenómeno
o seu potencial “estaminal”, que inclui a
roedores [2,9-11].
de “sprouting” das fibras musgosas, bem
associação física à rede vascular angio-
descrito em modelos animais e humanos
génica da zona de lesão. Se a comunidade
Neurogénese e lesão cerebral
de epilepsia do lobo temporal.
científica desenvolver estratégias farma-
Vários estudos publicados recentemente
Os nichos neurogénicos do cérebro, espe-
cológicas ou genéticas de manipulação
indicam que há uma estimulação da di-
cialmente a região SVZ, não fornecem ex-
dos astrócitos reactivos para que estes
ferenciação de neurónios e de oligoden-
clusivamente neurónios para o parênqui-
adquiram propriedades de diferenciação,
drócitos em várias patologias do sistema
ma cerebral. Há, de facto, uma produção
nos fenótipos celulares de interesse para
nervoso. Esta neurogénese tem potencial
muito activa de células que expressam
cada patologia particular, então o próprio
“reparador” pois pode vir a constituir uma
GFAP e que constituem uma reserva de
cérebro já resolveu um grande problema
fonte regeneradora do tecido cerebral;
células imaturas e de diferenciação em
aos neurocientistas… como colocar célu-
assim os neurocientistas aprendam a ma-
astrócitos. Por outro lado, verificou-se
las reparadoras na zona de lesão!
nipular os processos de controlo de dife-
que em modelos animais de doenças des-
No entanto, como acontece em tantos fe-
renciação, migração, integração e sobre-
mielinizantes há diferenciação de novas
nómenos biológicos, também o potencial
vivência de novas células no parênquima
células da linha oligodendrocítica, o que
estaminal do cérebro apresenta a sua du-
cerebral [7].
pode revelar o carácter bipotente da dife-
pla face de Janus. Dados recentes indicam
Em resposta a agressões isquémicas ce-
renciação de células SVZ (na linha neuro-
que os nichos neurogénicos além de re-
rebrais há uma estimulação da prolifera-
nial e oligodendrocítica) [5]. A estimulação
presentarem uma fonte de produção cons-
ção de células nos nichos neurogénicos e
de diferenciação de novos oligodendróci-
titutiva e fisiológica de células neurais, e
posterior migração de neuroblastos para
tos em doenças desmielinizantes tem uma
ainda uma fonte de células com potencial
regiões onde a neurogénese não é cons-
importância acrescida no corpo caloso e
reparador, podem também ser uma fonte
titutiva como no córtex cerebral ou no
pode vir a revelar-se uma linha de inves-
de problemas e contribuirem directa ou
estriado. Esta migração “atípica” de neu-
tigação de importância crescente para fu-
indirectamente para a geração de alguns
roblastos parece ser favorecida por mo-
turas abordagens reparadoras do cérebro
tipos de tumores cerebrais, especialmen-
dificações do parênquima cerebral lesado
em pacientes com esclerose múltipla [12].
te gliomas. As células tumorais cerebrais
(incluindo resposta inflamatória) que se
Recentemente ganhou força uma nova
apresentam muitas características seme-
torna permissivo à migração e diferencia-
ideia que lança enorme esperança sobre
lhantes às células imaturas/estaminais
ção de neurónios. Por outro lado, foi de-
o verdadeiro potencial reparador do cé-
do cérebro. Estas características incluem
monstrado que a migração de neuroblas-
rebro adulto doente. Verificou-se que em
autorenovação e grande capacidade pro-
tos para as zonas de lesão cerebral ocorre
áreas de lesão cerebral existem astrócitos
liferativa; elevada associação funcional à
em estreita associação com a diferencia-
reactivos que apresentam marcadores fe-
lâmina basal da vasculatura sanguínea;
ção de novos vasos sanguíneos, que po-
notípicos de imaturidade, como marcação
marcação fenotípica de imaturidade que
derão fornecer substrato físico e químico
para nestina ou Sox-2. Além disso, verifi-
inclui nestina, Sox-2, CD133; sinalização
para a migração de neuroblastos [12-14].
cou-se que é possível reprogramar gene-
por EFG (“Epidermal Growth Factor”) e
No entanto, é muito importante ter em
ticamente estas células para adquirirem
PDGF (“Platelet-derived Growth Factor”);
mente que a adição de mais neurónios às
a capacidade de se diferenciar em neuró-
pluripotência (revisto por Agasse et al. [2]).
redes neuroniais não é necessariamente
nios com diferentes fenótipos. Esta desco-
Por outro lado, têm sido identificados ca-
27.
sos clínicos em que os gliomas parecem
ter uma localização estreitamente associada com os nichos neurogénicos, especialmente em SVZ. Em conjunto, estes
dados levam a supôr que em determinadas circunstâncias, favorecidas por susceptibilidade genética, a desregulação do
ambiente químico ou físico do nicho neurogénico pode ser um elemento determinante na desregulação do controlo do ciclo
celular das células imaturas e levá-las a
adquirir propriedades cancerosas.
No laboratório desenvolvemos uma metodologia que nos p ermite identificar
funcionalmente, em tempo real, uma diversidade de tipos celulares derivados de
culturas de células estaminais neurais da
SVZ (Figura 2). Desenvolvemos um protocolo de estimulação das culturas SVZ que
nos permite induzir e registar alterações
de cálcio intracelular em células individu-
Figura 2. Cultura de células estaminais neurais. As células espaminais neurais e progenitoras de roedores (pós-natal) podem ser cultivadas em laboratório. Suspensões celulares são isoladas a partir de fatias coronais de cérebro de onde se extraem as células da região
adjacente aos ventrículos laterais (região subventricular - SVZ).
As células com potencial mitório proliferam em cultura (na presença de factores de crescimento como EGF e FGF-2) e originam agregados clonais designados neurosferas. As neurosferas derivadas das células da SVZ têm grande potencial proliferativo e podem atingir
muitas dezenas de células no espaço de uma semana. Numa segunda fase, é possível inibir a proliferação das células e promover a
sua diferenciação. Para isso, retiram-se os factores de crescimento e depositam-se as neurosferas sobre uma lamela de vidro revestida
com substrato adequado como poli-lisina ou laminina. Nestas condições, as neurosferas aderem ao substrato e um conjunto de células
migra radialmente para fora da neurosfera, formando uma pseudo-monocamada de células que diferencia (A e B). Nesta pseudomonocamada é possível identificar uma diversidade de células que incluem: células imaturas, progenitores, astrócitos, oligodendrócitos
e neurónios (B).
ais. Esta plataforma permite associar função a fenótipo, célula a célula, e revela-se
que nos levarão a aplicações clínicas con-
da equipa de investigação do grupo “Neu-
de grande importância para estudos far-
cretas.
roprotecção e Neurogénese na Reparação
macológicos e consequentemente para a
Ainda há poucas centenas de anos quem
Cerebral”. Agradecimento especial para
descoberta de novos alvos terapêuticos de
iria imaginar que o homem poderia cruzar
Fabienne Agasse, Sofia Grade, Alexandra
doenças do cérebro (Figura 3).
Oceanos em máquinas voadoras? Há pou-
Rosa, Maria Francisca Eiriz, Sara Xapelli,
cas dezenas de anos quem poderia ima-
Tiago Santos e Bruno Silva pelo seu en-
O futuro…
ginar que o Homem poderia reprogramar
volvimento na concepção e execução dos
Neste artigo não se pretende concluir que
fibroblastos, de tecido adulto, vindo estes
trabalhos que permitiram optimizar pro-
a utilização de recursos neurogénicos en-
a adquirir propriedades de células pluri-
cedimentos e técnicas experimentais e so-
dógenos do cérebro ou que terapias celu-
potentes? Em ambos os casos, a ciência
lidificar um grupo de investigação. Finan-
lares recorrendo ao transplante de outras
desafia constantemente a nossa imagi-
ciado por PTDC/SAU-NEU/68465/2006,
fontes de células estaminais/progenitoras
nação impelindo-nos para esta missão
PTDC/SAU-NEU/104415/2008 e FEDER.
irão resultar, a curto e médio prazo, em
científica, cívica e cultural, que se projecta
avanços concretos da Medicina com apli-
para além das fronteiras do conhecimento
cação em doenças do Sistema Nervoso
actual e nos ajuda a moldar e a construir
humano. No entanto, não é menos verda-
o futuro.
de que a grande dinâmica da investigação
REFERÊNCIAS
1. Olesen J, Baker MG, Freund T, di Luca M, Mendlewi-
científica nesta área, e o enorme avanço
cz J, Ragan I and Westphal M (2006) Consensus docu-
no conhecimento que daqui resulta, per-
AGRADECIMENTOS
ment on European brain research. J Neurol Neurosurg
mite alimentar esperanças, bem funda-
Os autores agradecem a colaboração
Psychiatry 77 (suppl 1): i1-i49.
mentadas, para novos desenvolvimentos
sempre activa e generosa dos membros
2. Agasse F, Bernardino L and Malva JO (2007) Subven-
28.
9. Kohwi M, Galvão RP and Alvarez-Buylla A (2006)
Birth, migration and function of SVZ-der ived neurons
in the adult brain in: Mammalian subventricular zones;
pp. 84-116; Edited by SW Levison; Springer, New York.
10. Lledo P-M (2008) Adult neurogenesis in the olfactory
bulb in: Adult Neurogenesis; pp. 425-444; Edited by F
Gage, G Kempermann and H Song; Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York.
11. Lim DA, Huang Y-C and Alvarez-Buylla A (2008) Adult
subventricular zone and olfactory bulb neurogenesis in:
Adult neurogenesis; pp. 176-206; Edited by F Gage, G
Kempermann and H Song; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
12 . Nait-Oumesmar B, Decker L, Picard-Riera N and
Evercooren AB (2006) Responses of the SVZ to demyelinating diseases in: Mammalian subventricular
zones; pp. 260-280; Edited by SW Levison; Springer,
New York.
Figura 3. Imagiologia de cálcio intracelular em células individuais: associação fenótipo-função. No laboratório desenvolvemos uma metodologia que nos permite identificar funcionalmente, em tempo real, uma diversidade de diferentes tipos celulares derivados de culturas
de células estaminais neurais. Recorrendo a imagiologia de cálcio intracelular em célula individual, usando para isso a sonda fluorescente “Fura-2”, desenvolvemos um protocolo de estimulação das culturas SVZ que nos permite induzir e registar respostas celulares
selectivas. Através do recurso a lamelas de vidro marcadas com uma micro-grelha pudémos localizar conjuntos de células submetidos
às experiências de cálcio intracelular em célula individual e, posteriormente, as mesmas células são tratadas para experiências de
imunocitoquímica e o seu fenótipo é revelado. Esta plataforma permitiu optimizar um método que nos permite identificar em tempo
real, e no espaço de cerca de 15 minutos, o fenótipo funcional de cerca de centena e meia de células, que incluem: células imaturas,
astrócitos, progenitores, oligodendrócitos, neuroblastos e neurónios. Esta plataforma tecnológica mostra-se particularmente robusta
para estudos funcionais e farmacológicos pois tira partido de células vivas e permite revelar o seu fenótipo – assim, abrem-se novas
oportunidades para a descoberta de novos fármacos selectivos para alvos moleculares restritos a linhagens celulares que derivam de
células estaminais neurais.
13. Lie DC and Götz M (2008) Adult neurogenesis: similarities and differences in stem cell fate, proliferation,
migration, and differentiation in distinct forebrain regions in: Adult Neurogenesis; pp. 227-266; Edited by F
Gage, G Kempermann and H Song; Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York.
14. Lindvall O and Kokaia Z (2008) Neurogenesis following stroke affecting the adult brain in: Adult Neuroge-
tricular zone cells as a tool for brain repair in: Interac-
444; Edited by JO Malva, AC Rego, RA Cunha and CR
nesis; pp. 549-570; Edited by F Gage, G Kempermann
tion between neurons and glia in aging and disease; pp.
Oliveira; Springer, New York.
and H Song; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
81-108; Edited by JO Malva, AC Rego, RA Cunha and CR
6. Deierborg T, Li J-Y and Brundin P (2007) Adult neu-
York.
rogenesis in neurodegenerative diseases in: Interac-
15. Bernardino L, Ferreira R, Cristóvão AJC, Sales F
3. Gray WP and Laskowsky A (2007) Glia and hippocam-
tion between neurons and glia in aging and disease;
and Malva JO (2005) Inflammation and Neurogenesis in
pal neurogenesis in the normal, aged and epileptic brain
pp. 445-460; Edited by JO Malva, AC Rego, RA Cunha
Temporal Lobe Epilepsy. Current Drug Targets – Cen-
in: Interaction between neurons and glia in aging and
and CR Oliveira; Springer, New York
tral Nervous System & Neurological Disorders 4: 349-
disease; pp. 375-390; Edited by JO Malva, AC Rego, RA
7. Galvão RP, Álvarez-Buylla A and García-Verdugo
360.
Cunha and CR Oliveira; Springer, New York.
JM (2008) Adult neural stem cells: prospects for
16. Jessberger S and Parent JM (2008) Epilepsy and
4. Ma DK, Ming G-I, Gage FH and Song H (2008) Neu-
brain repair in: Cell Therapy; pp.309-336; Edited by D
adult neurogenesis in: Adult Neurogenesis; pp. 535-
rogenic niches in the adult mammalian brain in: Adult
García-Olmo, JM García-Verdugo, J Alemany and JA
548; Edited by F Gage, G Kempermann and H Song; Cold
neurogenesis; pp. 207-226; Edited by F Gage, G Kem-
Gutiérrez-Fuentes. Mc Graw Hill, Madrid.
Spring Harbor Laboratory Press, New York.
permann and H Song; Cold Spring Harbor Laboratory
8. Kempermann G, Song H and Gage FH (2008) Neuro-
17. Sperk G, Drexel M, Tasan R and Wieselthaler A (2007)
Press, New York.
genesis in the adult hippocampus in: Adult neuroge-
Epilepsy, brain injury and cell death in: Interaction be-
5. Bruce CC, Franklin RJM and Relvas JB (2007) Remye-
nesis; pp. 159-174; Edited by F Gage, G Kempermann
tween neurons and glia in aging and disease; pp. 365-
lination of the central nervous system in: Interaction
and H Song; Cold Spring Harbor Laboratory Press,
376; Edited by JO Malva, AC Rego, RA Cunha and CR
between neurons and glia in aging and disease; pp. 427-
New York.
29.
Bioengineering
strategies for stem
cell expansion
and differentiation
Margarida Serra 1,2, Catarina Brito 1,2, Paula M. Alves1,2*
ABSTRACT
Human stem cells, with their unique
1 Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa, Oeiras, Portugal
characteristics for indefinite prolifera-
2 Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Oeiras, Portugal;
tion and multi-lineage differentiation,
are an appealing source for cell re-
*Corresponding author: Paula Marques Alves
placement therapies, tissue engineer-
ITQB-UNL/IBET, Apartado 12, 2781-901 Oeiras, Portugal (Phone: +351 21 446 94 12; FAX: +351 21 442 11 61;
ing, drug discovery and in vitro toxicol-
e-mail: [email protected]; website address: http://tca.itqb.unl.pt)
ogy. For the clinical implementation of
these cells, there is the need for translating the culture protocols developed
INTRODUCTION
plications, it is critical to exactly direct stem
at research laboratories into validated
The search for effective therapies for a myr-
cell differentiation to the desired lineage; in-
bioprocesses that can guarantee re-
iad of degenerative diseases considered in-
creasing differentiation efficiency, population
producibility, scalability, standardiza-
curable, such as Parkinson’s disease and
purity and improving cell functionality are the
tion, robustness and safety.
Type I diabetes, has been a long-lasting chal-
major technological challenges.
The success of stem cell utilization relies
lenge for the scientific community. In the last
This review will address current develop-
on the i) development of scalable and
decade, the potential of stem cell therapy has
ments in stem cell bioprocessing. We will
robust bioreactor devices, ii) design of
become well established and it is envisioned
focus on the identification of the essential
flexible culture strategies and iii) moni-
that in a near future stem cells will be used
requirements for the successful transition of
torization and control of the culture en-
as a new source of neurons or insulin produc-
stem cells into cell therapy and industrial ap-
vironment. This article provides an over-
ing cells to replace the degenerating tissues
plications. The impact of the stem cell source
view of current bioengineering strategies
and/or impaired cells.
as well as of the culture conditions, including
that could be used to generate large
In addition to cell therapy applications, stem
bioreactors, culture strategies and operation
numbers of stem cells and/or their de-
cell technology platform holds enormous
parameters, for controlling stem cell fate de-
rivatives with potential application in re-
prospective for the development of novel
cisions will be discussed.
generative medicine and drug discovery.
strategies in tissue engineering, drug screen-
30.
ing and in vitro toxicology [1-4].
Stem Cell Sources
In order to fulfill such promise large numbers
There are several classes of stem cells in-
of high quality cells are needed. This demand
cluding embryonic and adult stem cells, and
for stem cells requires, on a first approach,
more recently induced stem cells, each one
the implementation of scalable and afforda-
presenting its own benefits, limitations and
ble culture systems for the production of pure
challenges in bioprocess development (Fig.
populations of undifferentiated cells without
1). All of them share as common features
compromising their stem cell characteris-
the ability to proliferate indefinitely (unlimited
tics (self-renewal ability and differentiation
self-renewal capacity) and vary in their differ-
potential). In the next step, consisting in gen-
entiation potential.
erating particular cell types for specific ap-
Human embryonic stem cells (hESCs), iso-
clinical applications, circumventing the ethical concerns regarding the use of embryos.
Additionally, iPSCs present the benefit of being patient-derived cells, avoiding immune
rejection in cell therapy applications. iPSC
research is expanding rapidly, including modeling complex diseases in vitro and pursuing
novel therapeutics [14]. Currently, the possibility of reprogram somatic cells into less
immature developmental stages that could
be more directly applicable to therapeutic applications is being intensely explored [15-17].
Bioreactors for stem cell cultivation
Traditionally, culture of stem cells is performed on flat two-dimensional (2D) surfaces
(well-plates and tissue culture flasks) (Fig. 2)
due to their simplicity, low cost and easy handling. However, scale-up through the generation of multiple, parallel manual processes
is unattractive because of the high labor cost
and potential variability of output; rather, the
Figure 1. Stem cell sources and characteristics (Adapted from Placzek et al., 2009).
use of more efficient, robust and scalable
culture configurations is highly desirable to
lated from the inner cell mass of blastocysts
contributing to the regeneration/repair of the
generate cells on a scale suitable for clinical/
(Thomson et al, 1998), are pluripotent cells,
tissue/organ where they reside [10]. Depend-
/industrial applications. Stem cell bio-
i.e., they can differentiate into all cell types
ing on the source, ASCs can be isolated with
processing will require the use of specialized
that compose an adult body, derived from
relative ease. However, they presently have
devices that facilitate mass/gas transport,
the three germ layers — e.g. cardiomyocytes,
major limitations, such as the difficulty in ob-
environment monitorization and control, as
neurons, pancreatic islets, hepatocytes, and
taining pure populations, their limited expan-
well as able to support high cell densities.
chondrocytes [5-9]. However, hESCs are dif-
sion capacity and the restricted differentia-
Moreover, automation and the use of repro-
ficult to control with respect to their stem cell
tion potential, as they are often committed to
ducible platforms are imperative for the cre-
fate, and elicit ethical considerations, requir-
their original cell lineage (multipotent cells).
ation of cell-based products.
ing the manipulation of human embryos. For
One of the most promising achievements in
An optimal and universal stem cell culture
clinical applications, these cells still present
the stem cell field was the reversion of so-
system does not exist so far; however biore-
limitations related with immune rejection and
matic cells (e.g. fibroblasts, keratinocytes) to
actor development throughout the last dec-
the possibility of teratoma formation.
a state of pluripotency using defined repro-
ades has brought technological advances into
On the other hand, adult stem cells (ASCs) do
gramming strategies [11-13]. The creation of
the field. Microfluidic devices, rotary cell cul-
not present immunogenic complications on
these induced pluripotent stem cells (iPSCs)
ture (RCC) systems and stirred culture ves-
implantation since they can be isolated direct-
elicited an explosion of scientific curios-
sels have been the main bioreactors explored
ly from the patient. ASC exist in specific nich-
ity and industrial interest. This is mainly be-
in this field (Table 1) and are described in de-
es in the different organs (e.g. bone marrow,
cause iPSCs are similar to ESCs [11,12] and
tail in the following sections. There is howev-
peripheral blood, pancreas, lung, brain, liver)
thereby could potentially replace ESCs for
er, a large range of designs available, which
31.
include fluidized bed, packed bed, airlift and
disposable wave bioreactors (revised in [18].
Microfluidic culture systems
Microfluidic devices, or micro-bioreactors,
Figure 2. 2D and 3D strategies for cultivation of human embryonic stem cells.
are efficient small-scale systems mainly
used for the optimization of culture condi-
brane. Rotary cell culture systems have been
characterized, enable culture homogeneity
tions for cell growth and differentiation while
used for expansion of aggregates of differen-
and easy non-invasive sampling for continu-
also providing the precise control over the
tiated cells formed by hESC (human embry-
ous culture monitorization. In particular, fully
cell microenvironment [19,18]. Arrays of mi-
oid bodies – hEB) and for multiple ASC using
controlled stirred tank bioreactors provide an
cro-bioreactors have been developed to study
scaffolds [27-29]. Amongst the main disad-
automated control of the environment (tem-
growth and differentiation of hESC and ASC
vantages of RCC are the limited control of ag-
perature, pH and dissolved oxygen) manda-
in a three dimensional (3D) perfusion system
gregate size and nutrient/gas concentrations
tory for reproducible stem cell cultivation.
[20-26]. The microenvironment can be con-
throughout the vessel. This may result in the
These bioreactors are highly flexible as they
trolled by adjusting specific operating param-
formation of necrotic centers, leading to cell
can operate in different culture operation
eters such as the perfusion rate, resulting in
death inside the aggregates, and uncontrolled
modes (batch, fed-batch, perfusion), can
a high-throughput system for evaluating the
microenvironments, caused by the concen-
be adapted to different type of bioprocesses
effects of concentration gradients of soluble
tration gradients resulted from mass transfer
(stem cell expansion and/or differentiation)
factors on various cell processes. However,
limitations. In addition the working volume
and can be accommodated to different 3D cell
the main limitations of these culture systems
of these bioreactors is still low, thus limiting
culture strategies (cell aggregates, microcar-
are the high shear stress associated to per-
their use in a clinical and/or larger scale.
riers, encapsulated cells), presenting wide-
fusion as well as and the continuous removal
spread potential in stem cell bioengineering
of important factors secreted by the cells that
Stirred culture vessels
[15,30-32].
could ultimately compromise stem cell per-
Stirred culture vessels including spinner
culture vessels is the hydrodynamic stress
formance.
vessels and stirred tank bioreactors have
promoted by stirring. In addition, the minimal
been widely used in research laboratories
volume required to set up the experiments is
Rotary cell culture systems
and industries for the scale up of animal
very high (approximately 50 mL), demanding
Developed by NASA, RCC bioreactors are
cells for the production of recombinant pro-
higher starting cell numbers, increasing the
composed by a rotating 3D chamber in which
teins, enzymes, vaccines, antibodies, virus.
costs associated to optimization studies and
cells remain suspended in near free-fall,
The knowledge cumulated from this previ-
compromising the use of stirred bioreactors
simulating microgravity conditions. These low
ous experience facilitated their transition to
for high-throughput applications.
shear stress bioreactors can provide a well
stem cell bioengineering, in which the cells
As discussed below, the combination of
mixed environment for cell growth as well as
are the main products. Stirred culture ves-
stirred tank bioreactor technology with 3D
efficient gas transfer through a silicon mem-
sels are scalable and hydrodynamically well
culturing approaches has demonstrated sig-
Table 1. Culture systems for stem cell expansion and differentiation (Adapted from Placzek et al. [18] and Azarin and Palecek [19]).
32.
The main limitation of stirred
nificant advances in stem cell bioprocessing
most robust method for generating differenti-
by increasing the yields of stem cell expan-
ated cell from ESCs is through the formation
sion, enhancing differentiation efficiency and
of EBs, where ESC cultured in suspension
improving cell functionality.
self-aggregate and spontaneously differentiate into multiple tissues [42]. EB differentia-
3D cell culture strategies
tion has been shown to recapitulate aspects
ESCs and ASCs are traditionally cultured in
of early embryogenesis, including the for-
Cultivation of stem cells in microcarriers
2D systems. In particular, hESCs are usually
mation of a complex 3D arrangement where
A microcarrier is a support matrix allowing
propagated as colonies on a top of a feeder
cell-cell and cell-matrix interactions are
for the growth of anchorage-dependent cells
layer of inactivated fibroblasts (Fig. 2). The
thought to support the development of three
in suspension systems. Microcarrier cultures
inherent variability, lack of control and low
embryonic germ layers and their derivatives
are characterized by high surface-to-volume
cell production yields associated to these
[43,44]. The main limitation of this system is,
ratio, accommodating higher cell densities
methodologies make them unattractive and
in fact, the lack of control in directing stem
than those obtained in static cultures; the area
unsuitable for a clinical or industrial scale.
cell differentiation towards a specific lineage,
available for cell growth can be adjusted eas-
Therefore, moving stem cell culture protocols
thus resulting in a mixture of different cell
ily by changing the amount of microcarriers,
from 2D cell monolayers to 3D cultures is fun-
types. This drawback demands the need of
which further facilitates the process scale-up.
damental to enhance their performance and
efficient integrative downstream approaches
From industrial/commercial/clinical points of
fully exploit their potential. The general rec-
to further purify the culture outcome into a
view, this feature has a tremendous impact in
ognition of the importance of the spatiotem-
desired cell type population.
reducing the costs of cell manufacturing by
poral cell environment for cell behavior has
Results from our lab have shown that the
reducing the amount of media, growth factors
contributed for acceptance that 3D provides a
differentiation process of human embryonal
and other expensive supplements required in
cellular context closer to what actually occurs
teratocarcinoma stem cells (NT2 cells – cell
stem cell cultivation. For each stem cell type
in vivo. Mechanical and chemical properties,
model system of hESCs) into neurons is high-
and bioprocess it is important to optimize
such as surface tension, gravity, cell adhesion
ly improved when cells are cultivated as 3D
specific parameters including microcarrier
and movement are key players in determining
aggregates using stirred bioreactors. In fact,
type, concentration and inoculum density.
cell/tissue/organ functions, as cells integrate
when compared to 2D protocol the effect is
A wide range of microcarrier types are com-
external signals, including those from cell-
striking - by integrating both expansion and
mercially available today; supports can be
cell direct interaction, secretion/exchange of
differentiation steps in a controlled bioproc-
porous or non-porous, composed by gela-
soluble factors and/or metabolites. Extracel-
ess, we were able to increase significantly
tin, glass, collagen, cellulose, presenting
lular matrices (ECM) provide not only a physi-
the neuronal differentiation efficiency by 10-
dimensions within the range of 170 to 6000
cal support for cell growth and maintenance
fold while reducing drastically, by 30%, the
µm. In addition, these microcarriers can be
but are also critical for cell-cell communica-
time required for the differentiation process
functionalized with different coating materi-
tion within the 3D microstructures, improving
[1,31,45].
als (ECM proteins, small molecules) in order
cell behavior, identity and function [33-35].
In the last two years, many efforts were done
to further improve cell culture performance
Thus, engineered 3D microstructures have
to develop of 3D aggregate systems for con-
(attachment and growth). Thus, microcarrier
the potential to provide a higher degree of ef-
trolled expansion of undifferentiated hESCs
technology allows the flexibility of culturing
ficiency, robustness, consistency and more
[46-48] and their directed differentiation into
the cells in different conformations and on
predictive cultures. A variety of microstruc-
functional cell types, such as neurons [49]
different matrixes.
tures have today been established. Examples
and cardiomyocytes [30].
Cells cultured in macroporous beads (e.g.
are self-aggregated spheroids (3D cell ag-
The cultivation of ASCs as 3D aggregates has
Cytopore2, CultisphereS) are cultured in 3D,
gregates), microcarriers and more complex
also been explored. For instance, the efficient
protected from the shear stress, although the
scaffolds based on natural, non-animal poly-
expansion of human neural stem cells as
diffusion of oxygen and nutrients within the
mers such as gels and sponges, like alginate
neurospheres [4, 50-51] and neonatal porcine
bead could be limited. These systems have
and cellulose microfibers or synthetic mate-
pancreatic cells as islet-like tissue [52] rep-
been used for the expansion and differentia-
rials [36-41] (Fig. 2).
resents a significant milestone towards cell
tion of mouse embryonic stem cells [53,54]
therapy applications by providing sufficient
and for propagation of mesenchymal stem
Culture of stem cells as aggregates
numbers of functional cells required to treat
cells [55]. In non-porous microcarriers (e.g.
The cultivation of ESCs as 3D aggregates is
neurodegenerative diseases (such as Parkin-
Cytodex 1 and Cytodex 3), cells are attached
usually associated with differentiation; the
son’s disease) and Type 1 diabetes.
to the surface of the beads, assuming a simi-
33.
similar to those of native tissues. Within this
in regulation of cell behavior, providing sur-
context, several scaffolds have been used in
vival, proliferation and differentiation signals.
stirred bioreactors to enhance the formation
Thus perfusion mode has been preferentially
of 3D structures and the differentiation of
adopted in the majority of stem cell bioproc-
stem cells to myocardium [62], hepatocytes
esses since it assures the continuous renew-
[37,38], pancreatic islets [63,40], bone [64],
al of nutrients and other factors as well as
lar configuration to that of 2D monolayers.
cartilage [65], hematopoietic cells [66], neu-
the continuous removal of metabolic byprod-
In this case, cells are equally exposed to the
ronal cells [67] and vascular grafts [68].
ucts [62,31].
bulk medium avoiding the existence of diffu-
Another benefit of encapsulating cells is the
The interactions between growth factors and
sion gradients in the cell culture. Adult stem
possibility to circumvent the harmful effects
other process parameters are not fully un-
cells including mesenchymal and pancreatic
associated to shear stress.
derstood. It is therefore critical to quantify
stem cells demonstrated higher expansion
It is important to highlight that encapsula-
and clarify these effects and their interac-
yields while keeping their phenotype and dif-
tion technology will also contribute for the
tions in order to design the culture process
ferentiation potential on non-porous micro-
success of transplantation tests. In contrast
for optimal production of a specific cell type
carriers [32,56]. One of the challenges that
to cells in suspension, encapsulated tissue
population.
still need to be addressed is the optimization
constructs are less susceptible to immu-
Finally, the propagation and differentiation
of cell harvesting protocols after expansion/
norejection, their delivery is better target and
of stem cell cultures have also been found to
differentiation process, to guarantee efficient
the in vivo degradation kinetics can be tuned
be dependent of physiochemical conditions
cell-bead separation and high cell recovery
permitting a more efficient and functional in-
including temperature, pH and dissolved oxy-
yields without compromising their viability,
tegration of cells in the host organ [67,39].
gen (pO2). Up to now few studies have been
potential and/or functionality.
conducted on the effect of temperature and
Results from our laboratory as well as from
Bioprocess parameters
pH in stem cell culture. For instance, it has
other teams have shown that human hESCs
Successful stem cell bioprocessing, in terms
been shown that mesenchymal stem cell dif-
exhibit improved cell growth and retain their
of expansion and differentiation, depends
ferentiation is enhanced at lower tempera-
differentiation potential when cultured on
on the control of key process variables: (i)
tures (32ºC) than in 37ºC conditions [70] while
dextran or cellulose-based microcarrier sup-
nutrients and metabolites concentration,
high temperatures (39ºC) demonstrated to
ports, coated with matrigel or denatured col-
(ii) growth factors composition and (iii) the
enhance megakaryopoiesis in CD34- en-
lagen [57-61]. Seeding hESC as single cells
physiological environment, i.e, temperature,
riched cord blood cells [71]. Concerning pH, it
into microcarriers avoided formation of EBs
pH and oxygen.
was shown that high values (pH 7.60) enhance
and the consequent uncontrolled differentia-
The concentration of nutrients and metabo-
differentiation and maturation of megakaryo-
tion. Furthermore, after microcarrier coloni-
lites should be strictly monitored and con-
cyte progenitors [72] whereas low pH values
zation, there is the formation of hESC-micro-
trolled during cultivation since it affects cell
(7.1) increase their expansion capacity [73].
carriers aggregates in culture (Fig. 2). This
growth, viability and differentiation. The out-
Oxygen is a critical factor in hESC culture [18]
3D cell growth results in additional increase
come of stem cell culture depends on the
and there is emerging evidence suggesting
in cell yields, when compared to 2D culture
presence/concentration of growth factors
that reducing oxygen concentration towards
systems. These cells retained the ability to
which provide survival, proliferation, differen-
low levels [74,75] is beneficial for the in vitro
differentiate into cells of the 3 germ layers
tiation signals to the cells.
maintenance of pluripotent hESCs, support-
[59,61].
In order to enhance stem cell metabolism
ing self-renewal, reducing spontaneous dif-
and further improve culture performance
ferentiation and maintaining karyotypic integ-
Cultivation of encapsulated stem cells
different operation modes can be adopted,
rity, [76,77] in contrast to normoxia conditions
Cell encapsulating strategies offer the pos-
including fed-batch and perfusion. The fed-
(20%). Within this context, we recently devel-
sibility of customizing/designing the scaffold
batch strategy is often considered the most
oped a robust strategy for the mass produc-
environment with specific biomaterials (ex:
suitable for tuning and optimizing cell me-
tion of undifferentiated hESC using pO2-con-
alginate, poly lactic-co-glycolic acid, poly
tabolism; by providing nutrients in a rational
trolled bioreactors [61]. In this work, a 12-fold
L-lactic acid, hyaluronic acid), thus creating
manner, their uptake and consumption are
improvement in the expansion yield was ob-
microenvironments that may be suitable for
energetically more efficient leading to re-
served, over the standard 2D protocols, when
the self-renewal of stem cells or for direct-
duced accumulation of metabolites in culture
dissolved oxygen was controlled at low levels.
ing their differentiation along with promoting
supernatant [31,69]. However, in the case of
Overall, these developments highlight the fact
the organization of cells in 3D configurations
stem cells, growth factors play a crucial role
that process variations in the culture environ-
34.
ment could be strategically applied to direct
CT-2004-500039; Clinigene Network of Excel-
and manipulate stem cell behavior in vitro.
lence, LSHB-CT-2006-018933; HYPERLAB
- high yield and performance stem cell lab,
223011).
CONCLUSION
Along with the opportunities offered by ESCs,
ASCs and iPSCs, together with the tremen-
GLOSSARY
Reprogramming – A process by which a dif-
dous advances in manipulating their pluripo-
ASC – Adult stem cells: undifferentiated cells,
ferentiated cell reverts to a pluripotent state
tency and differentiation, many technological
found in tissues or organs of the body after
Self-renewal – The capacity of a cell to divide
issues remain to be solved. Culturing stem
embryonic development, that are capable of
into cells that are identical to the original
cells relies still on both “science and art”
self-renewal and differentiate into special-
stem cell.
and defining the optimal and robust cultiva-
ized cells to replenish dying cells and regen-
Teratoma – A tumor which is made up of a
tion strategies and culture conditions to ma-
erate damaged tissues.
heterogenous mixture of tissues, such as
nipulate stem cell fate decisions are yet to
Bioreactor – Devices or systems used to grow
bone, cartilage, muscle, neuronal cells, etc.
be determined. The definition of engineering
large quantities of biochemical cultures, as to
Totipotent – The ability of the cell to give rise
principles and practices towards achieve-
produce enzymes, antibiotics, virus, vaccines
to all cell types of the body. The zygote is
ment of control, automation, standardization,
or cells (bacteria, yeast, animal and vegetal
totipotent.
validation, reproducibility and safety of the
cells as well as stem cells).
Unipotent – The ability of a cell to develop into
process and the product will be critical for
Differentiation – A process by which a pluripo-
only one type of cell or tissue.
implementation of therapeutic and industrial
tent or multipotent stem cell becomes a
applications.
more specialized cell type.
An optimal/universal stem cell-based bio-
EB – Embryoid body: aggregate of cells de-
process capable of embracing all the appli-
rived from embryonic stem cells. Upon ag-
cations of these cells does not exist so far.
gregation, the cells spontaneously differenti-
1. Davila JC, Cezar GG, Thiede M, Strom S, Miki T & Trosko
Nonetheless, the knowledge gained during
ated into multiple cell types derived from the
J (2004) Use and application of stem cells in toxicology.
the last years, in which the quantitative char-
three germ layers, recapitulating embryonic
Toxicol Sci 79, 214-23.
acterization of expansion and differentiation
development.
2. Jensen J, Hyllner J & Bjorquist P (2009) Human em-
processes is included, provides important in-
ESC – Embryonic stem cells: undifferentiated
bryonic stem cell technologies and drug discovery. J Cell
sights for the implementation of such univer-
cells derived from a preimplantation embryo
Physiol 219, 513-519.
sal stem cell production platforms.
(inner cell mass of blastocyst) that are ca-
3. Krtolica A, Ilic D, Genbacev O & Miller RK (2009) Hu-
Over the next few years, we anticipate sig-
pable of self-renewal, and can develop into
man embryonic stem cells as a model for embryotoxicity
nificant developments in this field, that will
cells and tissues of the three primary germ
screening. Regen Med 4, 449-59.
include innovative culture systems that al-
layer.
4. Nirmalanandhan VS & Sittampalam GS (2009) Stem
low the integration of sophisticated monitor-
iPSC – Induced pluripotent stem cells: stem
cells in drug discovery, tissue engineering, and regenera-
ing platforms in order to ensure continuous
cells generated from somatic cells differen-
tive medicine: emerging opportunities and challenges. J
culture evaluation at a cellular level. These
tiation by the induced expression of specific
Biomol Screen 14, 755-68.
advances in stem cell bioprocessing will for
reprogramming factors.
5. Hay DC, Zhao D, Ross A, Mandalam R, Lebkowski J & Cui
sure contribute to the implementation of nov-
Microcarriers – Bead matrix that supports at-
W (2007) Direct differentiation of human embryonic stem
el therapies and fulfill at least the expecta-
tachment and growth of anchorage depend-
cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.
tions posed by stem cells.
ent cells in suspension culture.
Cloning Stem Cells 9, 51-62.
Multipotent – The ability of cell to develop into
6. Kroon E, Martinson LA, Kadoya K, Bang AG, Kelly OG,
more than one cell type of the body. Multipo-
Eliazer S, Young H, Richardson M, Smart NG, Cunningham
ACKNOWLEDGMENTS
tent cell types in the body comprise lineage-
J, Agulnick AD, D’Amour KA, Carpenter MK & Baetge EE
The authors acknowledge the financial sup-
committed progenitors, including organ-
(2008) Pancreatic endoderm derived from human embry-
port received from the Portuguese Foun-
specific adult stem cells.
onic stem cells generates glucose-responsive insulin-se-
dation for Science and Technology (PTDC/
Pluripotent – The ability of a cell to give rise
creting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-52.
BIO/72755/2006 and SFRH/BD/42176/2007)
to all different cell types of the body except
7. Mummery C, Ward-van Oostwaard D, Doevendans P,
and from the European Commission (Cell
extra-embryonic tissues. Pluripotent cells in-
Spijker R, van den Brink S, Hassink R, van der Heyden M,
Programming by Nanoscaled Devices, NMP4-
clude ES and iPS cells.
Opthof T, Pera M, de la Riviere AB, Passier R & Tertoolen
REFERENCES
35.
Blanco T, Lim M, Cha JM, Fauzi I, Kang Y, Yeo DC, Ma CY,
30. Niebruegge S, Bauwens CL, Peerani R, Thavandiran
Polak JM, Panoskaltsis N & Mantalaris A (2009) Stem cell
N, Masse S, Sevaptisidis E, Nanthakumar K, Woodhouse
bioprocessing: fundamentals and principles. J R Soc Inter-
K, Husain M, Kumacheva E & Zandstra PW (2009) Genera-
face 6, 209-232.
tion of human embryonic stem cell-derived mesoderm and
19. Azarin SM & Palecek SP (2010) Development of Scal-
cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-
able Culture Systems for Human Embryonic Stem Cells.
controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng 102, 493--507.
L (2003) Differentiation of human embryonic stem cells to
Biochem Eng J 48, 378.
31. Serra M, Brito C, Costa EM, Sousa MF & Alves PM (2009)
cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-
20. Cimetta E, Figallo E, Cannizzaro C, Elvassore N & Vun-
Integrating human stem cell expansion and neuronal dif-
like cells. Circulation 107, 2733-40.
jak-Novakovic G (2009) Micro-bioreactor arrays for control-
ferentiation in bioreactors. BMC Biotechnol 9, 82.
8. Toh WS, Guo XM, Choo AB, Lu K, Lee EH & Cao T (2009)
ling cellular environments: design principles for human
32. Serra M, Brito C, Leite SB, Gorjup E, von Briesen H,
Differentiation and enrichment of expandable chondrogen-
embryonic stem cell applications. Methods 47, 81-9.
Carrondo MJ & Alves PM (2009) Stirred bioreactors for the
ic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell
21. Fong WJ, Tan HL, Choo A & Oh SK (2005) Perfusion cul-
expansion of adult pancreatic stem cells. Ann Anat 191,
Mol Med 13, 3570-90.
tures of human embryonic stem cells. Bioprocess Biosyst.
104-115.
9. Zhang SC, Wernig M, Duncan ID, Brustle O & Thomson
Eng. 27, 381-387.
33. Cukierman E, Pankov R & Yamada KM (2002) Cell in-
JA (2001) In vitro differentiation of transplantable neural
22. Gerlach JC, Hout M, Edsbagge J, Bjorquist P, Lubber-
teractions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell
precursors from human embryonic stem cells. Nat Bio-
stedt M, Miki T, Stachelscheid H, Schmelzer E, Schatten G
Biol 14, 633-9.
technol 19, 1129-33.
&Zeilinger K (2010) Dynamic 3D culture promotes sponta-
34. Lund AW, Yener B, Stegemann JP & Plopper GE (2009)
10. Lanza R, Blau H, Melton D, Moore M, Thomas ED, Ver-
neous embryonic stem cell differentiation in vitro. Tissue
The natural and engineered 3D microenvironment as a
faiillie C, Weissman I & West M, (2004) “Handbook of Stem
Eng Part C Methods 16, 115-21.
regulatory cue during stem cell fate determination. Tissue
Cells, Volume 2: Adult and Fetal Stem Cells,” Elsevier Aca-
23. Gerlach JC, Lubberstedt M, Edsbagge J, Ring A, Hout M,
Eng Part B Rev 15, 371-80.
demic Press, Boston, Massachusetts.
Baun M, Rossberg I, Knospel F, Peters G, Eckert K, Wulf-
35. Pampaloni F, Reynaud EG & Stelzer EH (2007) The third
11. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka
Goldenberg A, Bjorquist P, Stachelscheid H, Urbaniak T,
dimension bridges the gap between cell culture and live
T, Tomoda K & Yamanaka S (2007) Induction of pluripotent
Schatten G, Miki T, Schmelzer E & Zeilinger K (2010) Inter-
tissue. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 839-45.
stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.
woven four-compartment capillary membrane technology
36. Dean SK, Yulyana Y, Williams G, Sidhu KS & Tuch BE
Cell 131, 861-72.
for three-dimensional perfusion with decentralized mass
(2006) Differentiation of encapsulated embryonic stem
12. Takahashi K & Yamanaka S (2006) Induction of pluripo-
exchange to scale up embryonic stem cell culture. Cells
cells after transplantation. Transplantation 82, 1175-84.
tent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast
Tissues Organs 192, 39-49.
37. Maguire T, Davidovich AE, Wallenstein EJ, Novik E,
cultures by defined factors. Cell 126, 663-76.
24. Gottwald E, Lahni B, Thiele D, Giselbrecht S, Welle
Sharma N, Pedersen H, Androulakis IP, Schloss R & Yar-
13. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget
A&Weibezahn KF (2008) Chip-based three-dimensional
mush M (2007) Control of hepatic differentiation via cellular
J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stew-
cell culture in perfused micro-bioreactors. J Vis Exp 21.
aggregation in an alginate microenvironment. Biotechnol
art R, Slukvin, II & Thomson JA (2007) Induced pluripotent
25. Zhao F, Grayson WL, Ma T & Irsigler A (2009) Perfusion
Bioeng 98, 631-44.
stem cell lines derived from human somatic cells. Science
affects the tissue developmental patterns of human mesen-
38. Maguire T, Novik E, Schloss R & Yarmush M (2006) Al-
318, 1917-20.
chymal stem cells in 3D scaffolds. J Cell Physiol 219, 421-9.
ginate-PLL microencapsulation: effect on the differentia-
14. Selvaraj V, Plane JM, Williams AJ & Deng W (2010)
26. Zhao F & Ma T (2005) Perfusion bioreactor system for
tion of embryonic stem cells into hepatocytes. Biotechnol
Switching cell fate: the remarkable rise of induced pluripo-
human mesenchymal stem cell tissue engineering: dy-
Bioeng 93, 581-91.
tent stem cells and lineage reprogramming technologies.
namic cell seeding and construct development. Biotechnol
39. Murua A, Portero A, Orive G, Hernandez RM, de Castro
Trends Biotechnol 28, 214-23.
Bioeng 91, 482-493.
M&Pedraz JL (2008) Cell microencapsulation technology:
15. Jang S, Cho HH, Cho YB, Park JS & Jeong HS (2010)
27. Come J, Nissan X, Aubry L, Tournois J, Girard M, Per-
towards clinical application. J Control Release 132, 76-83.
Functional neural differentiation of human adipose tissue-
rier AL, Peschanski M & Cailleret M (2008) Improvement
40. Wang N, Adams G, Buttery L, Falcone FH & Stolnik S
derived stem cells using bFGF and forskolin. BMC Cell Biol
of culture conditions of human embryoid bodies using a
(2009) Alginate encapsulation technology supports embry-
11, 25.
controlled perfused and dialyzed bioreactor system. Tissue
onic stem cells differentiation into insulin-producing cells.
16. Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Sud-
Eng Part C Methods 14, 289-98.
J Biotechnol 144, 304-12.
hof TC & Wernig M (2010) Direct conversion of fibroblasts to
28. Gerecht-Nir S, Cohen S & Itskovitz-Eldor J (2004) Bio-
41. Xing Q, Zhao F, Chen S, McNamara J, Decoster MA &
functional neurons by defined factors. Nature 463, 1035--41.
reactor cultivation enhances the efficiency of human em-
Lvov YM (2009) Porous biocompatible three-dimensional
17. Zhu XQ, Pan XH, Wang W, Chen Q, Pang RQ, Cai XM,
bryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnol
scaffolds of cellulose microfiber/gelatin composites for cell
Hoffman AR & Hu JF (2010) Transient in vitro epigenetic
Bioeng 86, 493-502.
culture. Acta Biomater 6, 2132-9.
reprogramming of skin fibroblasts into multipotent cells.
29. King JA & Miller WM (2007) Bioreactor development
42. Dang SM, Gerecht-Nir S, Chen J, Itskovitz-Eldor J &
Biomaterials 31, 2779-87.
for stem cell expansion and controlled differentiation. Curr
Zandstra PW (2004) Controlled, scalable embryonic stem
18. Placzek MR, Chung IM, Macedo HM, Ismail S, Mortera
Opin Chem Biol 11, 394-398.
cell differentiation culture. Stem Cells 22, 275-82.
36.
43. Itskovitz-Eldor J, Schuldiner M, Karsenti D, Eden A,
expansion in a microcarrier-based stirred culture system.
Yanuka O, Amit M, Soreq H & Benvenisty N (2000) Differ-
J Biotechnol 132, 227-36.
entiation of human embryonic stem cells into embryoid
55. Eibes G, dos Santos F, Andrade PZ, Boura JS, Abeca-
bodies compromising the three embryonic germ layers.
sis MM, da Silva CL & Cabral JM (2010) Maximizing the ex
Mol Med 6, 88-95.
vivo expansion of human mesenchymal stem cells using
44. Keller GM (1995) In vitro differentiation of embryonic
a microcarrier-based stirred culture system. J Biotechnol
stem cells. Curr Opin Cell Biol 7, 862-9.
146, 194-7.
tures significantly increase hematopoietic differentiation
45. Serra M, Leite SB, Brito C, Costa J, Carrondo MJ &
56. Sart S, Schneider YJ & Agathos SN (2009) Ear mesen-
efficacy of embryonic stem cells. Tissue Eng 11, 319-30.
Alves PM (2007) Novel culture strategy for human stem cell
chymal stem cells: an efficient adult multipotent cell popu-
67. Delcroix GJ, Schiller PC, Benoit JP & Montero-Menei
proliferation and neuronal differentiation. J Neurosc Res
lation fit for rapid and scalable expansion. J Biotechnol 139,
CN (2010) Adult cell therapy for brain neuronal damages
85, 3557-3566.
291-9.
and the role of tissue engineering. Biomaterials 31, 2105-
46. Amit M, Chebath J, Margulets V, Laevsky I, Miropolsky
57. Lock LT & Tzanakakis ES (2009) Expansion and differen-
-20.
Y, Shariki K, Peri M, Blais I, Slutsky G, Revel M & Itskovitz-
tiation of human embryonic stem cells to endoderm prog-
68. Nieponice A, Soletti L, Guan J, Deasy BM, Huard J, Wag-
Eldor J (2010) Suspension culture of undifferentiated hu-
eny in a microcarrier stirred-suspension culture. Tissue
ner WR & Vorp DA (2008) Development of a tissue-engi-
man embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem
Eng. Part A 15, 2051-2063.
neered vascular graft combining a biodegradable scaffold,
Cell Rev 6, 248-59.
58. Nie Y, Bergendahl V, Hei DJ, Jones JM & Palecek SP
muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seed-
47. Krawetz R, Taiani JT, Liu S, Meng G, Li X, Kallos MS
(2009) Scalable culture and cryopreservation of human
ing technique. Biomaterials 29, 825-33.
& Rancourt D (2009) Large-Scale Expansion of Pluripotent
embryonic stem cells on microcarriers. Biotechnol Prog
69. Xie L & Wang DI (1994) Fed-batch cultivation of animal
Human Embryonic Stem Cells in Stirred Suspension Biore-
25, 20-31.
cells using different medium design concepts and feeding
actors. Tissue Eng. Part C Methods
59. Oh SK, Chen AK, Mok Y, Chen X, Lim UM, Chin A, Choo
strategies. Biotechnol Bioeng 43, 1175-89.
48. Singh H, Mok P, Balakrishnan T, Rahmat SN & Zweig-
AB & Reuveny S (2009) Long-term microcarrier suspen-
70. Stolzing A & Scutt A (2006) Effect of reduced culture
erdt R (2010) Up-scaling single cell-inoculated suspension
sion cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell
temperature on antioxidant defences of mesenchymal
culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res 4,
Res. 2, 219-230.
stem cells. Free Radic Biol Med 41, 326-338.
165-79.
60. Phillips BW, Horne R, Lay TS, Rust WL, Teck TT & Crook
71. Proulx C, Dupuis N, St-Amour I, Boyer L & Lemieux R
49. Steiner D, Khaner H, Cohen M, Even-Ram S, Gil Y, It-
JM (2008) Attachment and growth of human embryonic
(2004) Increased megakaryopoiesis in cultures of CD34-
sykson P, Turetsky T, Idelson M, Aizenman E, Ram R, Ber-
stem cells on microcarriers. J Biotechnol 138, 24-32.
enriched cord blood cells maintained at 39 degrees C. Bio-
man-Zaken Y & Reubinoff B (2010) Derivation, propagation
61. Serra M, Brito C, Sousa MF, Jensen J, Tostoes R, Clem-
technol Bioeng 88, 675-80.
and controlled differentiation of human embryonic stem
ente J, Hyllner J, Strehl R, Carrondo MJT & Alves PM (2010)
72. McAdams TA, Miller WM & Papoutsakis ET (1998) pH is
cells in suspension. Nat Biotechnol 28, 361-4.
Improving expansion of pluripotent human embryonic stem
a potent modulator of erythroid differentiation. Br J Hae-
50. Baghbaderani BA, Behie LA, Sen A, Mukhida K, Hong M
cells in perfused bioreactors through oxygen control. J Bio-
matol 103, 317-25.
& Mendez I (2008) Expansion of human neural precursor
technol 148, 208-215.
73. Yang H, Miller WM & Papoutsakis ET (2002) Higher pH
cells in large-scale bioreactors for the treatment of neuro-
62. Bauwens C, Yin T, Dang S, Peerani R & Zandstra PW
promotes megakaryocytic maturation and apoptosis. Stem
degenerative disorders. Biotechnol Prog 24, 859-70.
(2005) Development of a perfusion fed bioreactor for em-
Cells 20, 320-8.
51. Baghbaderani BA, Mukhida K, Sen A, Kallos MS, Hong
bryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation:
74. Fischer B & Bavister BD (1993) Oxygen tension in the
M, Mendez I & Behie LA (2010) Bioreactor expansion of hu-
oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output.
oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rab-
man neural precursor cells in serum-free media retains
Biotechnol Bioeng 90, 452-461.
bits. J Reprod Fertil 99, 673-679.
neurogenic potential. Biotechnol Bioeng 105, 823-33.
63. Lee SH, Hao E, Savinov AY, Geron I, Strongin AY & Itkin-
75. Ottosen LD, Hindkaer J, Husth M, Petersen DE, Kirk J
52. Chawla M, Bodnar CA, Sen A, Kallos MS & Behie LA
Ansari P (2009) Human beta-cell precursors mature into
& Ingerslev HJ (2006) Observations on intrauterine oxygen
(2006) Production of islet-like structures from neonatal
functional insulin-producing cells in an immunoisolation
tension measured by fibre-optic microsensors. Reprod Bi-
porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Bio-
device: implications for diabetes cell therapies. Transplan-
omed Online 13, 380-385.
technol Prog 22, 561-7.
tation 87, 983-91.
76. Ezashi T, Das P & Roberts RM (2005) Low O2 tensions
53. Akasha AA, Sotiriadou I, Doss MX, Halbach M, Winkler J,
64. Goldstein AS, Juarez TM, Helmke CD, Gustin MC &
and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl
Baunach JJ, Katsen-Globa A, Zimmermann H, Choo Y, He-
Mikos AG (2001) Effect of convection on osteoblastic cell
Acad Sci USA 102, 4783-4788.
scheler J & Sachinidis A (2008) Entrapment of embryonic
growth and function in biodegradable polymer foam scaf-
77. Prasad SM, Czepiel M, Cetinkaya C, Smigielska K, Weli
stem cells-derived cardiomyocytes in macroporous biode-
folds. Biomaterials 22, 1279-88.
SC, Lysdahl H, Gabrielsen A, Petersen K, Ehlers N, Fink T,
gradable microspheres: preparation and characterization.
65. Kuo CK, Li WJ, Mauck RL & Tuan RS (2006) Cartilage
Minger SL & Zachar V (2009) Continuous hypoxic culturing
Cell Physiol Biochem 22, 665-72.
tissue engineering: its potential and uses.Curr Opin Rheu-
maintains activation of Notch and allows long-term propa-
54. Fernandes AM, Fernandes TG, Diogo MM, da Silva CL,
matol 18, 64-73.
gation of human embryonic stem cells without spontane-
Henrique D & Cabral JM (2007) Mouse embryonic stem cell
66. Liu H&Roy K (2005) Biomimetic three-dimensional cul-
ous differentiation. Cell Prolif 42, 63-74.
37.
Stem cell research
meets nanotechnology
Ricardo Pires das Neves, 1,2 e Lino Ferreira 1,2
SUMMARY
The recent application of nanotechnolo-
1 CNC - Center of Neurosciences and Cell Biology, University of Coimbra, Portugal
gies into the stem cell field promises to
2 Biocant - Center of Innovation in Biotechnology, Cantanhede, Portugal
open new avenues in regenerative medicine. Nanotechnologies can be a valu-
Corresponding Author Contact: [email protected]
able tool to track and image stem cells,
to drive their differentiation into specific
cell lineages, and ultimately to under-
INTRODUCTION
and other nanomaterials with sizes down to
stand their biology. This will hopefully
The existence of a multipotent hematopoi-
10 nm. In 1959, Richard Feynman launched
lead to stem cell-based therapeutics for
etic stem cell was demonstrated for the first
the foundation of the nanotechnology field.
the prevention, diagnosis, and treatment
time by Till and McCulloch in 1961. They
Since then, several extraordinary discover-
of human diseases. Despite these op-
demonstrated that a single hematopoietic
ies have been made: Richard Smalley dis-
portunities, nanotechnologies also pose
stem cell could (i) give rise to a mixed popu-
covered fullerenes in 1985, Sumio Iijima
several risks since they can be cytotoxic
lation of blood cells (granulocytes, macro-
discovered carbon nanotubes in 1991, and
and affect the differentiation program of
phages, red blood cells, etc…) and (ii) had
Louis Brus the quantum dots in 1996.
stem cells. Here, we discuss the future
the ability to self-renew [1]. The isolation
The intersection of nanotechnologies with
opportunities and challenges that face
of mouse embryonic stem cells by Martin
stem cell research is recent and has been re-
this young field of research.
Evans in 1981, human embryonic stem cells
viewed by us elsewhere [2, 3]. In this work we
by James Thompson in 1998, and inducible
will review the current research topics in this
pluripotent stem cells by Shinya Yamanaka
area: stem cell microenvironment and tissue
in 2006, propelled the scientific community
engineering, stem cell tracking and imaging,
to understand the properties of these cells
stem cell transfection, isolation and sorting,
and evaluate their therapeutic effect in the
and molecular detection (Fig. 1). When ap-
context of the regenerative medicine.
propriate, we will describe some examples
The first observation of nanomaterials was
about the research that we are conducting
made by Richard Adolf Asigmondy in 1914.
at Centre for Neuroscience and Cell Biology
He performed a detailed study of gold sols
(CNC) and Biocant in this research area.
Figure 1. Nanotechnology applications in Stem Cell Biology and Medicine. Nanodevices can be used in stem cell tracking and imaging but also
in isolation and sorting of stem celis, both for basic science and translational medicine. Stem cell fate can be modulated by internalization
of nanocarriers with biological molecules or by external cues given by biomimetic scaffolds. Stem cell transfection and molecular detection
make use of nanodevices for intracellular access but also for intelligent delivery and sensing of biomolecules. These technologies have a
great impact in stem cell microenvironment and tissue engineering studies and have a great potential for biomedical applications.
38.
Modulation of stem cell-fate by the microen-
the following aspects: (i) Laser fabricated
vironment
nanogrooves to study cell-cell interactions;
Stem-cell biology has been studied mainly
(ii) nanowires to study intra- and intercel-
in vitro with cells cultured on flat substrates
lular biological processes; (iii) nanophase
coated, for example, with collagen or lam-
thin film to study cell adhesion and pro-
inin, or in co-culture systems where feed-
liferation; (iv) Lab-on-a-chip with nano-
er-cell layers are used to support stem cell
reservoir to study environmental cues; (v)
ters in a given tissue is critical in deter-
growth. These culture conditions are very
Self-assembly peptides and nanofibers to
mining how cells behave within that tissue.
different from the environment that stem
mimic ECM; (vi) Nanoliter-scale synthesis
The ECM can be reproduced in vitro by the
cells experience in the body. For example,
of arrayed biomaterials; (vii) Micro/nanopat-
use of 3D scaffolds. For that purpose, sev-
the extracellular matrix (ECM) is difficult to
terned surface to study stem cell response
eral natural (fibrin, collagen, hyaluronic
mimic in plastic dishes; most frequently
to topography and mechano-transduction;
acid, etc…) or synthetic (polyethylene
stem cells are cultured in rigid polystyrene
and (viii) Nanoparticles to control release
glycol, poly(lactic acid-co-glycolic acid),
tissue-culture plastic where cells are ex-
growth factors and biochemicals.
poly(glycerol sebacate) etc…) biomaterials
posed to soluble factors in liquid media.
It is clear from this previous list that bio-
can be used. Recently, we have prepared
This is different in the body where the ECM
material design for stem cell applications
a hyaluronic acid-based gel to create a 3D
creates a soft microenvironment where
is progressively abandoning the strategy
microenvironment for the self-renewal of
these molecules are anchored in close
of developing an inert mechanical sup-
human embryonic stem cells [5].
proximity to cell surfaces. This much more
port and adopting the notion that this type
When a greater control over the properties
constrained three-dimensional (3D) niche
of cells need a more dynamic substrate
of the material is required the best option
is a unique microenvironment that has a
capable of directing interactions at the
is to produce synthetic bioactive scaffolds.
prominent role in the maintenance and dif-
cell-material interface and may stimulate
Issues like immunogenicity, pathogen
ferentiation of stem cells. This micro-envi-
and commit cell behaviour through physi-
transmission and purification difficulties
ronment is formed by different components
cal forces, biochemical interactions or to-
have encouraged this option. An example
including cell-cell interactions, extracellu-
pography. This interaction of biomaterials
of a synthetic scaffold is (polyethylene gly-
lar matrix, mechanical properties and se-
with the chemical and physical features of
col) (PEG) gels which can be chemically
creted factors. Collectively, they constitute
stem cells occurs at the micro- and nano
modified to incorporate a compendium of
a complex microenvironment that is diffi-
scales.
bioactive molecules [6]. Immobilization
cult to recapitulate in vitro. Stem cell niche
Cell-cell interaction studies generally rely
seems to increase the stability of the mol-
research uses nanotechnologies to mimic
on co-culture strategies where the effects
ecules, promote persistent signalling and
this microenvironment in order to deter-
of particular molecules are hidden in the
induce receptor clustering [7]. It was re-
mine what are the mechanisms underlying
great complexity of the culturing system.
cently shown that the covalent attachment
the conversion of a stem cell into different
It is therefore difficult to discern the role
of fibroblast growth factor 2 (FGF2) to a
cell types. On the other hand, these biomi-
of soluble or tethered molecules in terms
synthetic nanofibrillar surface composed
metic approaches to create synthetic mi-
of cell-cell interactions. In tissues, the
of a network of polyamide nanofibers re-
croenvironments are very challenging be-
ECM contains many macromolecules such
sulted in the stabilization of the growth
cause there is much we do not understand
as proteoglycans, collagens, laminins,
factor and increased its potency 100-fold
about the natural stem cell niche. Several
fibronectin and sequestered growth fac-
relative to FGF2 in solution. In response to
researchers believe that it may be possible
tors. This molecular repertoire is respon-
the tethered FGF2, embryonic stem cells
to create synthetic stem cell niches that are
sible for the bioactivity of the ECM. For
exhibited increased proliferation through
more bioinspired than biomimetic and po-
example, the sequences of many ECM pro-
activation of mitogenic pathways [8]. An-
tentially more efficient than those observed
teins or receptor ligands are presented to
other example that illustrates the impor-
in nature. Therapeutically, it may be more
stem cells and are recognized by dimeric
tance of ligand presentation in stem-cell
useful to take this bioinspired approach in
cell-surface receptors known as integrins.
fate and function is the immobilization of
the design of the synthetic niche so that it
Binding of integrins to these molecules
leukaemia inhibitory factor (LIF), which led
acts on the stem cells in an unnatural way
can trigger a cascade of signalling events
to more efficient and prolonged activation
to achieve a therapeutic goal [4].
that will impact the gene expression pat-
of LIF targets and maintenance of embry-
Current research efforts in both biomimetic
tern of the stem cell. Therefore, the type of
onic stem cells in an undifferentiated state
and bioinspired strategies are focussing in
ECM molecules that a stem cell encoun-
when compared with soluble LIF [9].
39.
ness has a primary role in stem cell line-
factors, and small chemicals present an
age specification. This study reported that
excellent tool to control the differentia-
human mesenchymal stem cells (MSCs)
tion of stem cells. Some of these biomol-
were able to differentiate into tissues that
ecules/chemicals have (i) poor solubil-
had their mechanical properties more
ity, (ii) can be quickly cleaved by cellular
closely mimicked by the polyacrylamide
enzymes, (iii) and have side effects when
A major challenge in tissue engineering is
substrate upon which they were cultured.
administered systemically. Therefore, bio-
to vascularise the transplanted tissue con-
Thus, MSCs that were cultured on rigid
degradable and biocompatible nanoparti-
structs to meet the metabolic demands of
(bonelike) gels differentiated into osteob-
cles able to target stem cells and release
recovery and integration into the organism.
lasts, those that were cultured on medium
the payload in their cytoplasm with conse-
Therapeutic application of the main vas-
stiffness (muscle-like) gels differentiated
quent activation of signalling cascades will
cular signalling molecules (e.g. vascular
into muscle cells, and those that were cul-
be of great interest. Recently, we have re-
endothelial growth factors (VEGFs), FGFs,
tured on more elastic gels (neural-like)
ported the successful delivery of vascular
TGFs, angiopoietins, ephrins and various
differentiated into neural cells [12]. The
growth factors into hESCs, by incorporat-
chemokines) can be a promising approach
acknowledgment that matrix mechanical
ing growth factor-release particles in hu-
to enhance blood supply and neovasculari-
properties impact on stem-cell fate led to
man embryoid bodies (EBs) [15]. These bio-
sation processes around the transplanted
the exploration of further links between
degradable nanoparticles are compatible
tissue. For example, the immobilization of
stem cell behaviour and matrix elasticity.
with cell viability and proliferation and are
VEGF onto a metal substrate using a bio-
Since then, several studies have reported
extremely effective in terms of differentia-
mimetic polymer film was able to promote
that substrate stiffness modulates the
tion. In some cases, the effect on vascu-
the survival and proliferation of endothe-
proliferation and differentiation of em-
lar differentiation of particles containing
lial cells and to induce the differentiation
bryonic stem cells and certain types of
growth factors was superior to the one ob-
of hMSCs into endothelial cells[10].
adult stem cells. For example, adult neu-
served by exposing EBs to large extrinsic
In order to discover novel biomaterials that
ral stem cells cultured on a relatively soft
doses of the same growth factors. Moreo-
have effects on stem cells, high-through-
matrix to mimic brain tissue gave origin to
ver, nanoparticles were taken up by human
put approaches are likely needed. Recent
more neurons than cells grown on a stiffer
embryonic stem cells and accumulated in
efforts have used acrylate-based poly-
synthetic matrix, where glial cells were
the perinuclear region indicating that they
mers spotted in arrays composed of hun-
predominant [13]. Another study found that
could constitute a delivery platform not
dreds of different polymer combinations
the rate of adult skeletal-muscle stem-
only for growth factors but also for other
and found several platforms that could
cell proliferation increased with substrate
type of biomolecules [15].
promote embryonic stem cell attachment,
stiffness [14]. We predict that more stud-
proliferation and differentiation [11]. Simi-
ies will show that the physical properties
Stem Cell Engineering
lar studies must be conducted this time
of culture substrate have a major impact
Various micro-/nanofabrication technolo-
aiming at incorporating many other bio-
on stem-cell fate. With time different cul-
gies have been used to design scaffolds
physical and biochemical parameters in
ture platforms based on soft biomaterials
able to drive the differentiation of stem
this type of high throughput approaches.
are likely to largely replace those made of
cells into specific cell lineages. For ex-
Different matrices, natural and/ or syn-
the standard, rigid, tissue-culture plastic
ample, nanofibers are able to provide an
thetic, can be produced to generate cell-
in order to specifically modulate differen-
in vivo-like extracellular scaffolding to
culture substrates with defined physical
tiation into different fates.
promote regeneration of specific tissues.
characteristics like rigidity (stiffness) and
Usually stem cell cultures are presented
Nanopatterned or nanostructured scaf-
topography. Unlike regular tissue culture
with soluble growth factors and biochemi-
folds are designed to trigger stem cells to
plastic substrates, they provide diffusion of
cals in their culture media. This approach
become specific cell types comprising the
soluble molecules to the basal surface, as
may not always be possible due to specific
tissues and organs in the body.
well as the apical surface. They are espe-
chemical properties of the molecules to
Current research efforts in nanotechnol-
cially interesting in the context of studies
be delivered. Instead, it may be more ben-
ogy applications in tissue engineering are
of homeostatic and disease-related matrix
eficial to deliver these molecules directly
focussing in the following aspects: (i) Mi-
stiffness impact on stem-cell behaviour.
inside the cell to better control their bio-
cro/nano structured scaffolds for tissue
A groundbreaking study by Engler and
availability. Nanoparticles that can carry
engineering; (ii) magnetic nanoparticles
collaborators [12] found that matrix stiff-
molecular payloads of proteins, growth
for magnetic force-based tissue engineer-
40.
ing; (iii) nanocomposites for bone tissue
timing and delivery methods, etc…It is of
engineering; and (iv) micro/nanoencapsu-
utmost importance to demonstrate the
lation for cell therapy
long-term safety of these cell-based ther-
The ultimate goal of tissue engineering is
apies. For example, studies in mice have
to recreate the right conditions to support
showed that stem cells injected into the
the massive growth, physical folds and
heart following myocardial infarction gave
twists and cellular and molecular events
origin to mineralized tissue [17]. This was
and ECM derived from the pericardium
of great complexity that occur during re-
possibly due to the reaction of the trans-
of horses can be used as a reconstruc-
generation or replacement of a tissue. The
planted cells to the stiffer mechanical en-
tive material in the dura mater layer of the
general strategy is to grow cells in a scaf-
vironment of the scar tissue that was not
brain meninges following a craniotomy.
fold engineered to define the geometry of
appropriate to induce cardiogenesis.
In a recent development, it was possible
the replacement tissue and provide the
Stem cell based therapy is in hand when
to engineer a bioartificial heart through
right environmental cues that promote tis-
compared with the major challenge that
a decellularization process with deter-
sue regeneration.
is replacing an entire organ with a com-
gents to produce a biocompatible cardiac
Stem cell research has been showing that
plex repertoire of cell types carefully or-
ECM scaffold with a perfusable vascular
stem cells or at least progenitor cells can
ganized to maximize its functional output.
tree, patent valves and a four-chamber-
be isolated from almost every tissue in
Self-organization seems to be an intrinsic
geometry template for biomimetic tissue
the body. With the appropriate conditions
characteristic of cells; cells will cluster
engineering. These researchers man-
it may be possible to stimulate these cells
and communicate with cells that express
aged to populate this ECM scaffold with
to form new tissue. Several studies have
the same cellular adhesion molecules and
an appropriate cell composition, and the
tried to use this biologic intrinsic regener-
under the right conditions can form com-
maturation of this construct developed a
ative potential. Stevens and collaborators
plex structures like the sprouting tubular
nascent pump function [19]. Almost at the
have injected alginate gels or modified hy-
networks formed by endothelial cells lining
same time another group reported the
aluronic acid gels into an artificial space
blood vessels. Simple artificial cell adhe-
transplant of a tissue engineered airway
between the tibia and the periosteum (the
sions have been engineered using biotin
confirming that this approach can in fact
outer lining of the bone). This stimulated
conjugated to cell surfaces and the addition
produce whole-organ tissue engineering
bone and cartilage formation from resi-
of avidin to trigger the assembly of multi-
products that are clinically relevant [20].
dent progenitor cells in the inner layer of
cellular clusters due to the biotin-avidin in-
The scaffold in this case was a decellular-
the periosteum [16]. This is an example of
teraction in order to aid in the development
ized human donor trachea that was seeded
how simple biomaterials can support the
of more complex cellular interactions [18].
with the patient’s own bone marrow cells
generation of complex tissue by using the
Communication between cells in the tis-
that had been differentiated into cartilage
body as a bioreactor and without the need
sue is essential but a lot of information is
cells. In contrast with traditional trans-
of exogenous cell transplants. In situa-
also coming to cells from their extracel-
plant surgery, the decellularization proc-
tions where the regenerative potential is
lular environment; the scaffold that sur-
ess solved the problem of tissue rejection
low due to different factors like age, trau-
rounds and separates cells within a tissue
because it removed human leukocyte an-
ma, scarring or inflammation like the ones
is a complex material called the Extracel-
tigen traces that are major determinants
that follow myocardial infarction or brain
lular Matrix (ECM). Tissue engineering
in tissue compatibility with the advantage
stroke for example, biomaterial interven-
takes lessons from the characterization
that the patient did not need any immuno-
tions that include cells of external origins
of natural bioactive scaffolds in order to
suppressive drugs [20].
must be included.
construct artificial ones. When possible, a
Both decellularized tissues and synthetic
Several clinical studies with stem cell-
very efficacious strategy is to use cadaver-
scaffolds offer distinct and important
based therapies are currently being per-
or animal-derived decellularized ECM be-
benefits for tissue engineering. Typically,
formed worldwide. Despite the consider-
cause these products have an inherent bi-
biomaterials-engineering approaches fo-
able knowledge gathered in the last years
oactivity to induce regeneration. This type
cus on chemical and/ or physical mecha-
in stem cells biology, further pre-clinical
of approach has found clinical applications
nisms by which the ECM influences cells
and clinical studies are needed to clarify
in routine medical procedures and in life-
and try to reproduce those effectively for a
what is the best stem cell source for cer-
saving scenarios. Products derived from
given tissue. For instance, it may be some-
tain medical applications, the mechanism
the small intestinal submucosa of pigs are
times necessary to work the anisotropic
underlying their regenerative effect, the
used routinely in reconstructive surgery,
features of the culturing system to better
41.
teraction of cells with these nanogrooved
electrophysiological application; and (iv)
surfaces was recently analysed by live cell
photothermal nanospectroscopy to identify
imaging [23]. These studies have shown
stem cells in the body.
that cells acquire elongated morphologies
Nanotechnology enables labelling stem
on a surface with nanogrooved patterns and
cells using magnetic, genetic or fluores-
align along that pattern. In this study, the
cent probes which can be monitored by
mimic the tissue. Nanogrooves induced by
dynamic behaviours of living mesenchymal
magnetic resonance imaging (MRI) or fluo-
laser irradiation are an example of this type
stem cells on a nanogroove substrate with
rescence imaging. For example, super-
of approach in bone differentiation studies.
a 200 nm groove depth, an 870 nm ridge
paramagnetic iron oxide (SPIO) nanopar-
The alignment of bone cells and collagen
width and a 670 nm groove width were ob-
ticles can be used to label stem cells and
matrix is closely related to the mechani-
served using time-lapse microscopy. These
analyse their fate in transplantation assays
cal properties of bone. Scaffolds that are
researchers found that filopodia moved
by MRI. In fact, several SPIO nanoparticle
able to promote osteoblast differentiation
as if they were probing the surroundings
formulations (e.g., Feridex/ Endorem and
and modulate their orientation to generate
of the cell protrusion, and then some cell
Ferucarbotran) have FDA (United States
mineralization in a preferred direction are
protrusions invaded the probed areas. Cell
Food and Drug Administration) approval
essential for the generation of biomimetic
protrusions that extended perpendicular to
for human use as MRI contrast agents.
bone tissue. Bangshang Zhu and collabora-
the nanogroove direction tended to retract
The development of nanoparticles for cell
tors, used nanogrooves to induce alignment
more rapidly than those that were parallel
tracking is a multidisciplinary task that
of rabbit mesenchymal stem cell (MSC)-de-
to it. From these observations, the authors
needs highly skilled biological, physical
rived osteoblast-like cells and collagen fi-
hypothesize that the retracting phase of
and chemical expertise. In most cell types,
bres. Nanoscale groove–ridge patterns (300
cell protrusions play a role in cell align-
the nanoparticles are taken up through
nm in periodicity, 60–70 nm in depth) on the
ment along the nanogroove patterns. Fur-
endocytosis during in vitro cell cultiva-
surface of polystyrene were made by polar-
ther studies using similar live cell imaging
tion and accumulate in the endosomes. Al-
ized laser irradiation. The cells and actin
strategies are required to clearly elucidate
though, some cell types are easier to label
stress fibbers were aligned and elongated
the role of filopodia-mediated cell align-
than others, one has to take into account
along the direction of the nanogrooves. The
ment in these nanopatterned substrates.
the biological features of the cells to be la-
results suggested that nanoscale fibrous
belled and sometimes use chemical tricks
cues in the longitudinal direction might
Stem Cell Tracking and Imaging
to promote the internalization of the nano-
contribute to the aligned formation of bone
To better understand stem cell biology
particles; e.g. mononuclear blood cells are
tissue [21]. A recent study has shown that
and realize the full potential of stem cell
easier to label because by their nature they
osteoblasts are responsive to nanopatterns
therapy, it is essential to monitor the traf-
are primed for internalization of other cells
down to 75 nm in width and 33 nm in depth.
ficking of labelled stem cells by molecular
or molecules by phagocytosis. Also, quite
Nanotexture-driven mineral deposition is
and cellular imaging. Monitorization and
often the internalization of nanoparticles
induced and responsive to even smaller na-
tracking of these cells inside an organism
requires the use of excipients, which may
nopatterns of 50 nm in width and 17 nm in
is a difficult task. This is why stem cells
include peptides and cationic agents [2].
depth. In addition, gene expression of os-
are usually tracked invasively by immuno-
The labelling of stem/ progenitor cells and
teoblast specific markers is upregulated by
histochemistry after removal of tissues or
their transplantation and tracking inside
nanogrooves [22]. These studies indicate
organs from small animals. On the other
the organism may enlighten the dynam-
that nanogrooves can be a very promising
hand, for pre-clinical and clinical trials,
ics of stem cell differentiation, migration
tool to direct the bone response at the in-
it will be fundamental to track stem cells
and therapeutic benefit in several disease
terface between an implant and the bone
noninvasively in order to assess their graft-
scenarios like myocardial infarction, cancer
tissue, which can benefit the installation of
ing and therapeutic effect. Research in this
and neurological conditions. In fact, not so
implants in compromised patients.
area is focussing on the development of the
long ago, Lewis and collaborators succeed-
Although various models have been pro-
following nanotechnologic approaches: (i)
ed in demonstrating that stem/progenitor
posed for how this alignment of cells in
Superparamagnetic iron oxide nanoparti-
cells labelled with magnetic nanoparticles
response to nanopatterns occurs, much
cles for stem cell labelling and diagnostics;
when injected in the blood stream of small
remains to be clarified. Studies with fixed
(ii) quantum dots and fluorophore nanoc-
animals can later be isolated by magnetic
cells do not lend themselves to answering
rystals for stem cell tracking and imaging;
separation after in vivo migration to study
these questions. The dynamics of the in-
(iii) nanoprobes for stem cell detection and
the differentiation of the cells exposed to a
42.
biological environment [24]. Although fea-
row emission and broad excitation spec-
sible these type of studies are still limited
trum which allows simultaneous analysis
by technical challenges. In some cases, it
of multiple cell targets by using a single
is difficult to distinguish SPIO-labelled cells
wavelength activation [27]. Qdot conjuga-
from other hypointense regions on MRI im-
tion has been used to follow biomolecules
ages. Such signals can arise from regions
like growth factor receptors, integrins,
containing blood hemoglobin, or blood
phospholipids, and enzymes among oth-
to pluripotent embryonic stem cells. Also,
clots/trombi [25]. The development of new
ers, when stem cells are exposed to differ-
the long-term effects of these nanopar-
nanoparticle formulations based on probes
ent environments or soluble factors [28].
ticles and their degradation products on
other than iron oxide will be of great inter-
In vivo, small animal-tracking of delivered
stem cells should be also assessed at
est for stem cell applications. Some exam-
stem cells has been difficult due to tech-
gene and protein level. Indeed, qdots may
ples have been recently reported based on
nical limitations in terms of labelling but
induce cytotoxic effects due to release of
nanoparticles containing fluorine or man-
also due to the autofluorescent nature of
cadmium triggered by their oxidative deg-
ganese [26].
animal tissues. With imaging platforms
radation [32]. This metal can bind to the
Stem cell differentiation programs are highly
like Caliper’s IVIS it is now possible to do
sulfhydryl groups of critical mitochondrial
regulated processes that may be sensitive
qdot-tracking in whole animals. Rosen
proteins and induce the production of re-
to nanoparticle internalization. Therefore, it
and collaborators (2007) have reported
active oxygen species, leading to mito-
will be essential to evaluate the long-term
the optimization and validation of a qdot
chondrial dysfunction and ultimately cell
effects of these nanomaterials in the biology
long-term tracking technique of labelled
death [33]. However, it might be possible to
of stem cells. It is possible that the intracel-
mesenchymal stem cells (MSCs) in the
coat qdots in a way that circumvents their
lular degradation of the nanoparticles pro-
mammalian heart. These researchers
in vivo degradation.
duces molecules that are bioactive and have
found that bright qdot crystals were able
potential to activate signalling cascades that
to illuminate MSCs in histological sections
Stem Cell Transfection
can change the differentiation program of
for at least 8 weeks following delivery
Efficient gene delivery systems are re-
the stem cells. The prospect of tracking stem
enabling the complete three-dimensional
quired to fully manipulate stem cell be-
cells with nanoparticle labelling technolo-
reconstruction of the locations of all stem
haviour. This ability is essential for studies
gies is dependent on a careful evaluation of
cells following injection into the heart [29].
of gene function, control of stem cell dif-
their impact on stem cell biology and solving
The use of these nanocrystals for stem
ferentiation, cellular labelling and purifi-
issues like dilution of nanoparticle content
cell-labelling depends on their origin and
cation, and cellular secretion of therapeu-
(and consequent decrease of signal) during
surface modification, mode of internaliza-
tic drugs. Viral methods have been widely
cell division and release by exocytosis. There-
tion and type of stem cells used [30]. Stem
used and have good transduction efficien-
fore, complementary techniques like fluores-
cells are labelled with qdots in several
cies; however they integrate into the ge-
cence must be developed to validate the MRI
ways, including receptor-mediated up-
nome of the host cell. Because of safety
results. Our group is developing nanoparticle
take, lipofection, electroporation, or pas-
issues, non-viral gene delivery systems
formulations that escape the endosome and
sive loading. Under appropriate conditions,
are preferred for stem cell transfection.
combine fluorescent and magnetic labelling
qdots are effective at labelling stem cells
The key challenge in this case is to deliver
to circumvent these issues.
without affecting their self-renewal and
genes to stem cells with high efficiency and
Other nanoparticles that are increas-
differentiation potentials. For example,
low cytotoxicity. Nanotechnology provides
ingly used in cell biology are quantum dots
hMSCs labelled with qdots (0.250 to 16 nM)
invaluable tools for stem cell transfection.
(qdots). These are another class of nano-
maintained their osteogenic differentiation
The main efforts in this area are focuss-
materials usually in the size range of 2-10
potential[30]. Also, intravenous injection of
ing on: (i) Nanomaterials for in vivo gene
nm that can be used for long-term label-
Qdots-labelled mesenchymal stem cells
delivery; (ii) nanowires for gene delivery to
ling of stem cells. Qdots have become a
into NOD/SCID mice (1×106 cells) showed
stem cells; and (iii) micro/nanofluidic de-
commercial success because they exhibit
an accumulation after 24 h in the lungs,
vices for stem cell electroporation.
a brighter fluorescent signal, have higher
liver and spleen, but not in the heart, brain
Nanoparticles have been shown to be ef-
photostability (hours) and large stokes
or kidneys [31]. At the moment, most stud-
fective vectors for gene transfection. Green
shift (difference between excitation and
ies were dedicated to labelling multipotent
and collaborators developed a class of pol-
emission wavelengths) than organic dyes
mesenchymal stem cells. Therefore, it
ymers (poly(B-amino esters)) that are able
and fluorescent proteins. They have nar-
will be important to extend these studies
to condense DNA into nanoparticles that
43.
These nanodevices are helical structures
a ferromagnetic matrix and is placed in a
of approximately 1–30 nm in diameter with
MACS Separator. The separator contains a
lengths >100 nm [39], that are able to
strong permanent magnet creating a high-
encapsulate drugs and genetic material.
gradient magnetic field in the magnetisable
These CNTs are internalized by an endocy-
column matrix. Labelled target cells are
tosis independent way and reach the peri-
retained in the column via magnetic force,
facilitate cellular uptake and endosomal
nuclear region after a few hours of contact
whereas unlabeled cells flow through. By
escape. These particles can be coated for
with the cells [40]. After 24 h, a significant
simply rinsing the column with buffer, the
ligand-specific delivery, are biodegradable
number of CNTs have been observed at the
entire untouched cell fraction can be eluted.
and have low toxicity [34]. Another approach
cell nucleus of mesenchymal stem cells
3) Elution of the labelled cell fraction: after re-
used specific recognition of cell surface
[41]. Recent advances on this type of strat-
moving the column from the magnetic field
molecules coupled to an organic-inorganic
egy have produced a novel platform for in-
of the MACS Separator, the retained labelled
hybrid carrier where carbonate apatite na-
tracellular delivery of genetic material and
cells can easily be eluted with buffer.
noparticles were coated electrostatically
nanoparticles, based on vertically aligned
The entire procedure can be performed in
with fibronectin and E-cadherin producing
carbon nanosyringe arrays of controllable
less than 30 min, and both cell fractions,
an efficient gene delivery system for embry-
height. Using this technology, Park and
magnetically labelled and untouched cells,
onic stem cells [35, 36]. These studies with
collaborators have shown that plasmid
are immediately ready for further use, such
nanoparticles reported higher efficiencies
and quantum dots can be efficiently deliv-
as flow cytometry, molecular analysis, cell
for gene delivery and expression than the
ered to the cytoplasm of cancer cells and
culture, transfer into animals, or clinical cell
ones obtained with the leading commer-
human mesenchymal stem cells [42].
therapy applications.
cially available transfection agent, Lipo-
MACS MicroBeads are superparamagnetic
fectamine 2000 [34-36].
Stem Cell Isolation and Sorting
particles made of an iron oxide core and a
Nucleic acids (DNA and RNA) can be deliv-
A key challenge in stem cell research is to
dextran coating. They are nano-sized, rang-
ered in the cytoplasm by the nanoparticles
identify and isolate stem cells from a hetero-
ing between 20 and 150 nm in diameter, and
in a gradual release profile or suddenly,
geneous cell population by a low cost, fast
form colloidal solutions, i.e., they remain
depending if the genetic modulation is in-
and easy procedure. Magnetic or fluorescent
dispersed [43]. Superparamagnetism means
tended to be sustained in time or not. This is
nanoparticles can be used to label stem cells
that in a magnetic field the iron oxide cores
of great advantage when compared with the
followed by magnetic force or flow cytometry
magnetize strongly like ferromagnetic mate-
commercially available options. Indeed, na-
sorting. In the stem cell biology research field
rial, but when removed from the magnetic
noparticles with covalently immobilized DNA
the MACS® technology, briefly described
field the particles do not retain any residual
or siRNA were shown to be a very effective
below, is the leading commercial brand and
magnetism. The dextran coating of the Mi-
strategy to regulate gene expression [37,38].
has made the separation of certain stem and
croBeads permits chemical conjugation of bi-
Rosi and collaborators have shown that
progenitor cells a routine procedure.
omolecules. Numerous highly specific mAb,
DNA-gold nanoparticles can have effective
The MACS® System is characterized by the
fluorochromes, oligonucleotides and various
intracellular target recognition and binding
use of nano-sized superparamagnetic parti-
other moieties have all been covalently linked
and can be used for antisense gene regula-
cles (approx. 50 nm in diameter), cell sepa-
to MicroBeads, thereby transferring addi-
tion on stem cells [37]. For somatic cells, it
ration columns, and MACS Separators which
tional biochemical and physical properties to
has been reported that these systems have
provide the required strong magnetic field
them [43]. The nano-sized iron-dextran parti-
high resistance to nuclease degradation and
[43]. Magnetic cell separation is performed
cles confer several unique features on MACS
high cellular uptake as a result of their oligo-
in three steps:
Technology. MACS MicroBeads are biode-
nucleotide functionalization. These nanopar-
1) Labelling: cell preparation and labelling
gradable and do not alter cell function. Ef-
ticle systems offer exciting opportunities for
methods are similar to those used in flow cy-
fects on the functional status of cells by mag-
gene expression regulation and the control of
tometry. Each target cell in a cell suspension
netic labelling with MicroBeads are primarily
stem cell fate. Our research group has sev-
is immunomagnetically labelled using MACS
dependent on the target cell surface antigen
eral projects in this area aiming to modulate
MicroBeads, which typically are covalently
and on the degree of crosslinking by mAb or
the differentiation of pluripotent stem cells
conjugated to a monoclonal antibody (mAb)
ligands conjugated to the MicroBeads, but
by the use of nanomaterials.
or to a ligand specific for a certain cell type.
not on the MicroBeads themselves. Cells la-
Other good delivery strategies to transfect
2) Separation: the cell suspension is passed
belled with MicroBeads have been used for
stem cells are carbon nanotubes (CNTs).
through the separation column that contains
numerous functional in vitro assays, experi-
44.
mental transfers into animals, and therapeu-
the fluorescence-quenching beacon [44].
tic transplantations in humans.
Other examples include pH nano-sensors
[45] and nanoparticles able to quantify enzy-
Molecular Detection and Biosensors
matic activities [46]. A recent study reported
In addition to detect labelled stem cells, it
the preparation of polymeric nanoparticles
is of paramount importance to detect par-
bearing a kinase peptide substrate and near-
ticular molecules in the stem cell pathway at
infrared fluorophore chemically coupled to
2. Ferreira L, Karp JM, Nobre L & Langer R (2008) New
the cellular level. Nanotechnology provides
the nanoparticle. In the nonphosphorylated
opportunities: the use of nanotechnologies to manipu-
advanced probes and devices for molecular
state, these nanoparticles have low levels of
late and track stem cells. Cell Stem Cell 3, 136-146.
detection. For example, (i) carbon nanotube
fluorescence because of the short distance
3. Ferreira L (2009) Nanoparticles as tools to study and
optical probes for single molecule detection
between each fluorescence probe in the na-
control stem cells. J Cell Biochem 108, 746-752.
in living cells; (ii) carbon nanotube nanoelec-
noparticle. Upon kinase phosphorylation of
4. Fisher OZ, Khademhosseini A, Langer R & Peppas NA
trode array for deep brain stimulation; (iii)
the phosphate groups that are incorporated
(2010) Bioinspired materials for controlling stem cell
nanoparticles for neurochemical detection
into the peptide substrate the polymeric na-
fate. Acc Chem Res 43, 419-428.
and biosensors; (iv) nanowires for molecu-
noparticles dissolve due to charge unbalance
5. Gerecht S, Burdick JA, Ferreira LS, Townsend SA,
lar detection in stem cells; (v) self-assem-
and the fluorescence is recovered [46].
Langer R & Vunjak-Novakovic G (2007) Hyaluronic acid
bly polymeric micelle-based bioassays; (vi)
hydrogel for controlled self-renewal and differentiation
nanoarrays in mass spectrometry for pro-
of human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA
teomic and metabolomic applications; (vii)
CONCLUSION
104, 11298-11303.
nanofluidic device for single cell genomic
This report identifies challenges and op-
6. Kraehenbuehl TP, Ferreira LS, Zammaretti P, Hubbell
analysis on a chip.
portunities where nanotechnology can be
JA & Langer R (2009) Cell-responsive hydrogel for encap-
The aim of these tools is to monitor biomol-
utilized to advance stem cell research. Al-
sulation of vascular cells. Biomaterials 30, 4318-4324.
ecules in real time without using invasive
though stem cell nanotechnology is still a
7. Irvine DJ, Hue KA, Mayes AM & Griffith LG (2002) Sim-
or endpoint procedures. Currently, most
young discipline, it is already contributing
ulations of cell-surface integrin binding to nanoscale-
strategies to analyse intracellular biochemi-
for new discoveries in stem cell research
clustered adhesion ligands. Biophys J 82, 120-132.
cal processes rely on several steps of cell-
and the development of better stem cell
8. Nur EKA, Ahmed I, Kamal J, Babu AN, Schindler M
processing like fixation, permeabilization
technology. This survey of research topics
& Meiners S (2008) Covalently attached FGF-2 to three-
and labelling, which are time consuming and
in stem cell nanotechnology will allow non-
dimensional polyamide nanofibrillar surfaces demon-
expensive when scale-up or high through-
nano-experts to realize the impact that na-
strates enhanced biological stability and activity. Mol
put screening is needed. Nanoparticles can
notechnology is having in both basic stem
Cell Biochem 309, 157-166.
be an appropriate solution for “bio-sensing”
cell biology and in translational applica-
9. Alberti K, Davey RE, Onishi K, George S, Salchert K,
inside stem cells. Sensors are usually com-
tions of stem cell research into medicine.
Seib FP, Bornhauser M, Pompe T, Nagy A, Werner C &
posed of two parts: one that recognizes and
Zandstra PW (2008) Functional immobilization of sign-
binds the target molecule and another that
aling proteins enables control of stem cell fate. Nature
signals the binding event. One way of doing
ACKNOWLEDGEMENTS
Methods 5, 645-650.
this is to immobilize the recognition mol-
We acknowledge the support of Crioes-
10. Poh CK, Shi ZL, Lim TY, Neoh KG & Wang W (2010)
ecule to the surface of a nanoparticle. This
taminal, MIT- Portugal Program, Marie Cu-
The effect of VEGF functionalization of titanium on en-
type of approach was used by Hwang and
rie Reintegration Grant, and FCT funding
dothelial cells in vitro. Biomaterials 31, 1578-1585.
collaborators to monitor neuronal differen-
(PTDC/SAU-BEB/098468/2008; PTDC/CTM/
11. Anderson DG, Levenberg S & Langer R (2004) Nano-
tiation in vivo using a molecular beacon [44].
099659/2008; PTDC/SAU-ENB/113696/2009).
liter-scale synthesis of arrayed biomaterials and appli-
They have generated a quencher-based fluo-
cation to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol
rescent beacon system to sense the neuron-
22, 863-866.
specific miR124a expression. Moreover this
REFERENCES
beacon was built upon a cobalt ferrite mag-
12. Engler AJ, Sen S, Sweeney HL & Discher DE (2006)
Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.
netic core which enables the dual-imaging
1. Weissman IL & Shizuru JA (2008) The origins of the
Cell 126, 677-689.
nanoparticle beacon system to be used for
identification and isolation of hematopoietic stem cells,
13. Saha K, Keung AJ, Irwin EF, Li Y, Little L, Schaffer
in vivo cellular tracking by magnetic reso-
and their capability to induce donor-specific transplan-
DV & Healy KE (2008) Substrate modulus directs neural
nance as well as for monitoring the changes
tation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood
stem cell behavior. Biophys J 95, 4426-4438.
in the expression of intracellular targets with
112, 3543-3553.
14. Boonen KJ, Rosaria-Chak KY, Baaijens FP, van der
45.
tized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and
herin and fibronectin embedded in carbonate-apatite
recovery of progenitor cells. Nat Biotechnol 18, 410-414.
DNA carrier on transgene delivery and expression in
25. Gilad AA, Walczak P, McMahon MT, Na HB, Lee JH,
a mouse embryonic stem cell line. Biomaterials 29,
An K, Hyeon T, van Zijl PC & Bulte JW (2008) MR track-
370-376.
ing of transplanted cells with “positive contrast” using
36. Kutsuzawa K, Chowdhury EH, Nagaoka M, Maru-
manganese oxide nanoparticles. Magn Reson Med 60,
yama K, Akiyama Y & Akaike T (2006) Surface func-
Schaft DW & Post MJ (2009) Essential environmental
1-7.
tionalization of inorganic nano-crystals with fi-
cues from the satellite cell niche: optimizing prolifera-
26. Ruiz-Cabello J, Walczak P, Kedziorek DA, Chacko
bronectin and E-cadherin chimera synergistically
tion and differentiation. Am J Physiol Cell Physiol 296,
VP, Schmieder AH, Wickline SA, Lanza GM & Bulte JW
accelerates trans-gene delivery into embryonic stem
C1338-1345.
(2008) In vivo “hot spot” MR imaging of neural stem
cells. Biochem Biophys Res Commun 350, 514-520.
15. Ferreira L, Squier T, Park H, Choe H, Kohane DS
cells using fluorinated nanoparticles. Magn Reson
37. Rosi NL, Giljohann DA, Thaxton CS, Lytton-Jean
& Langer R (2008) Human embryoid bodies containing
Med 60, 1506-1511.
AKR, Han MS & Mirkin CA (2006) Oligonucleotide-
nano- and microparticulate delivery vehicles. Advanced
27. Michalet X, Pinaud FF, Bentolila LA, Tsay JM,
modified gold nanoparticles for intracellular gene
Materials 20, 2285-+.
Doose S, Li JJ, Sundaresan G, Wu AM, Gambhir SS &
regulation. Science 312, 1027-1030.
16. Stevens MM, Marini RP, Schaefer D, Aronson J,
Weiss S (2005) Quantum dots for live cells, in vivo im-
38. Giljohann DA, Seferos DS, Prigodich AE, Patel
Langer R & Shastri VP (2005) In vivo engineering of or-
aging, and diagnostics. Science 307, 538-544.
PC & Mirkin CA (2009) Gene Regulation with Polyva-
gans: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci USA 102,
28. Chen H, Titushkin I, Stroscio M & Cho M (2007) Al-
lent siRNA-Nanoparticle Conjugates. Journal of the
11450-11455.
tered membrane dynamics of quantum dot-conjugat-
American Chemical Society 131, 2072-+.
17. Breitbach M, Bostani T, Roell W, Xia Y, Dewald O, Ny-
ed integrins during osteogenic differentiation of hu-
39. Iijima S (1991) Helical Microtubules of Graphitic
gren JM, Fries JW, Tiemann K, Bohlen H, Hescheler J,
man bone marrow derived progenitor cells. Biophys
Carbon. Nature 354, 56-58.
Welz A, Bloch W, Jacobsen SE & Fleischmann BK (2007)
J 92, 1399-1408.
40. Kostarelos K, Lacerda L, Pastorin G, Wu W, Wieck-
Potential risks of bone marrow cell transplantation into
29. Rosen AB, Kelly DJ, Schuldt AJ, Lu J, Potapova IA,
owski S, Luangsivilay J, Godefroy S, Pantarotto D,
infarcted hearts. Blood 110, 1362-1369.
Doronin SV, Robichaud KJ, Robinson RB, Rosen MR,
Briand JP, Muller S, Prato M & Bianco A (2007) Cel-
18. De Bank PA, Kellam B, Kendall DA & Shakesheff KM
Brink PR, Gaudette GR & Cohen IS (2007) Finding
lular uptake of functionalized carbon nanotubes is
(2003) Surface engineering of living myoblasts via selec-
fluorescent needles in the cardiac haystack: tracking
independent of functional group and cell type. Nat
tive periodate oxidation. Biotechnol Bioeng 81, 800-808.
human mesenchymal stem cells labeled with quan-
Nanotechnol 2, 108-113.
19. Ott HC, Matthiesen TS, Goh SK, Black LD, Kren SM,
tum dots for quantitative in vivo three-dimensional
41. Mooney E, Dockery P, Greiser U, Murphy M & Bar-
Netoff TI & Taylor DA (2008) Perfusion-decellularized
fluorescence analysis. Stem Cells 25, 2128-2138.
ron V (2008) Carbon nanotubes and mesenchymal
matrix: using nature’s platform to engineer a bioartifi-
30. Chakraborty SK, Fitzpatrick JA, Phillippi JA, An-
stem cells: biocompatibility, proliferation and differ-
cial heart. Nat Med 14, 213-221.
dreko S, Waggoner AS, Bruchez MP & Ballou B (2007)
entiation. Nano Lett 8, 2137-2143.
20. Macchiarini P, Jungebluth P, Go T, Asnaghi MA,
Cholera toxin B conjugated quantum dots for live cell
42. Park S, Kim YS, Kim WB & Jon S (2009) Carbon
Rees LE, Cogan TA, Dodson A, Martorell J, Bellini S,
labeling. Nano Lett 7, 2618-2626.
nanosyringe array as a platform for intracellular de-
Parnigotto PP, Dickinson SC, Hollander AP, Mantero
31. Lei Y, Tang H, Yao L, Yu R, Feng M & Zou B (2008)
livery. Nano Lett 9, 1325-1329.
S, Conconi MT & Birchall MA (2008) Clinical trans-
Applications of mesenchymal stem cells labeled with
43. Miltenyi S, Muller W, Weichel W & Radbruch A
plantation of a tissue-engineered airway. Lancet 372,
Tat peptide conjugated quantum dots to cell tracking
(1990) High gradient magnetic cell separation with
2023-2030.
in mouse body. Bioconjug Chem 19, 421-427.
MACS. Cytometry 11, 231-238.
21. Zhu B, Lu Q, Yin J, Hu J & Wang Z (2005) Alignment of
32. Derfus AM, Chan WCW & Bhatia SN (2004) Probing
44. Hwang DW, Song IC, Lee DS & Kim S (2010) Smart
osteoblast-like cells and cell-produced collagen matrix
the cytotoxicity of semiconductor quantum dots. Nano
Magnetic Fluorescent Nanoparticle Imaging Probes
induced by nanogrooves. Tissue Eng 11, 825-834.
Letters 4, 11-18.
to Monitor MicroRNAs. Small 6, 81-88.
22. Lamers E, Walboomers XF, Domanski M, te Riet J,
33. Lovric J, Cho SJ, Winnik FM & Maysinger D (2005) Un-
45. Coupland PG, Fisher KA, Jones DR & Aylott JW (2008)
van Delft FC, Luttge R, Winnubst LA, Gardeniers HJ &
modified cadmium telluride quantum dots induce reactive
Internalisation of polymeric nanosensors in mesenchy-
Jansen JA (2010) The influence of nanoscale grooved
oxygen species formation leading to multiple organelle
mal stem cells: analysis by flow cytometry and confocal
substrates on osteoblast behavior and extracellular
damage and cell death. Chem Biol 12, 1227-1234.
microscopy. J Control Release 130, 115-120.
matrix deposition. Biomaterials 31, 3307-3316.
34. Green JJ, Zhou BY, Mitalipova MM, Beard C, Lang-
46. Kim JH, Lee S, Park K, Nam HY, Jang SY, Youn I,
23. Fujita S, Ohshima M & Iwata H (2009) Time-lapse ob-
er R, Jaenisch R & Anderson DG (2008) Nanoparticles
Kim K, Jeon H, Park RW, Kim IS, Choi K & Kwon IC
servation of cell alignment on nanogrooved patterns. J
for gene transfer to human embryonic stem cell colo-
(2007)
R Soc Interface 6 Suppl 3, S269-277.
nies. Nano Lett 8, 3126-3130.
meric nanoparticles for imaging protein kinase ac-
24. Lewin M, Carlesso N, Tung CH, Tang XW, Cory D,
35. Kutsuzawa K, Akaike T & Chowdhury EH (2008)
tivities in single living cells. Angew Chem Int Ed Engl
Scadden DT & Weissleder R (2000) Tat peptide-deriva-
The influence of the cell-adhesive proteins E-cad-
46, 5779-5782.
46.
Protein-phosphorylation-responsive
poly-
ESPERAMOS A SUA
CONTRIBUIÇÃO
S
erão considerados para publicação artigos de revisão, divulgação
científica, aplicação pedagógica, opinião ou investigação social e/
ou histórica sobre bioquímica ou ciências afins. Artigos de opinião
são particularmente preferidos desde que com argumentação sustentada
que reduza o factor meramente especulativo.
A comissão editorial aceita apreciar para publicação artigos escritos em
português ou inglês com as características supra-mencionadas, desde que
submetidos por correio electrónico para [email protected]. Os artigos terão
MANUSCRIPT SUBMISSION
que seguir escrupulosamente as directivas de formatação indicadas em
seguida. Artigos aceites para publicação têm de ser fornecidos em formato
SPB accepts manuscripts in Portuguese, Spanish and English.
electrónico apropriado.
If you wish to submit a manuscript, please after following the instructions
below carefully, send your manuscript to [email protected] .
INFORMAÇÃO PARA OS AUTORES
FORMATAÇÃO DE MANUSCRITOS
As submissões, independentemente do seu tipo (de comunicações rápidas
MANUSCRIPT FORMAT
a artigos de fundo), devem compreender duas partes:
Submission is composed of two documents, regardless of the manuscript
Carta de submissão explicando o mérito associado ao artigo na óptica dos
type:
autores e a escolha da revista Canal bq como um meio adequado de publi-
A submission letter stating why the author(s) think Canal BQ is appropriate
cação. O autor deve declarar nesta carta a cedência de direitos de repro-
to publish the manuscript. The letter should include an explicit statement
dução do seu artigo à Sociedade Portuguesa de Bioquímica, em suporte
giving the Portuguese Biochemical Society the right to reproduce your ma-
papel e suporte digital. Caso o artigo tenha mais que um autor, todos os
nuscript in print or in digital support. All authors should sign this letter,
autores devem assinar a carta ou, alternativamente, o autor signatário deve
or alternatively, the main author must clearly mention (s)he is acting on
explicitamente mencionar que age com o conhecimento e em nome dos
the behalf of all authors. The copyright is kept by the authors for other
restantes autores. A cedência deste direito não implica a sua transferência:
purposes.
os direitos de autor para outros fins são mantidos pelo(s) autor(es).
Manuscripts should be prepared in MS-Word and A4 pages with double spa-
Manuscrito em folhas A4 escritas a 2 espaços com margem de 3 cm em
cing between the lines. Three cm margins all over the page are required.
todo o redor. O manuscrito deve constar de um único ficheiro MS-Word. Nas
Embedded pictures are allowed for submission but should the manuscript
versões preliminares do manuscrito para revisão, as figuras podem ser in-
be accepted for publication, graphics and pictures should be made availa-
corporadas no ficheiro Word, mas a versão final para publicação deverá
ble in individual files with adequate quality for printing (e.g. TIFF format).
ser acompanhada de versões individualizadas das figuras em ficheiros que
In case the authors are using protected material from third parties, it is
garantam boa impressão (e.g. TIFF).
the authors’ duty to make sure that all the legal authorizations have been
Caso os autores usem material de terceiros protegidos por direitos de autor
obtained.
ou de qualquer outra natureza que delimite o uso de propriedade intelectual, é dever dos autores garantir que os seus manuscritos/artigos estão
conformes as exigências legais.
THE MANUSCRIPT MUST INCLUDE:
Title page. Concise title, author(s) and synoptic title (up to 50 characters,
including spaces).
O MANUSCRITO DEVE COMPREENDER:
Abstract (except discussion papers). In a separate page and limited to no
Página do título. Título conciso, autor(es), afiliação, título sinóptico (até 50 ca-
more than 250 words.
racteres) e o endereço de correio electrónico do autor para correspondência.
References must be numbered sequentially and listed in the end of the ma-
Resumo (excepto artigos de opinião). Em página separada e até 250 palavras.
nuscript with the format demanded for FEBS J, namely:
Corpo de texto com as referencias bibliográficas numeradas sequencialmen-
1. Tsubokawa M, Tohyama Y, Tohyama K, Asahi M, Inazu T, Nakamura H,
te e listadas no final com o formato exigido no FEBS J., nomeadamente:
Saito H & Yamamura H (1997) Interleukin-3 activates Syk in a human mye-
1. Tsubokawa M, Tohyama Y, Tohyama K, Asahi M, Inazu T, Nakamura H,
loblastic leukemia cell line, AML193. Eur J Biochem 249, 792-796.
Saito H & Yamamura H (1997) Interleukin-3 activates Syk in a human mye-
2. Sambrook J, Fritsch EF & Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Labo-
loblastic leukemia cell line, AML193. Eur J Biochem 249, 792-796.
ratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
2. Sambrook J, Fritsch EF & Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Labo-
Harbor, NY.
ratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
3. Langer T & Neupert W (1994) Chaperoning mitochondrial biogenesis. In
Harbor, NY.
The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones (Morimoto
3. Langer T & Neupert W (1994) Chaperoning mitochondrial biogenesis. In
RI, Tissières A & Georgopoulos C, eds), pp. 53-83. Cold Spring Harbor La-
The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones (Morimoto
boratory Press, Plainview, NY.
RI, Tissières A & Georgopoulos C, eds), pp. 53-83. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY.
Figure legends should be gathered in a single section of the manuscripts,
and placed before the reference list. When figures are embedded in the
As legendas das figuras devem ser condensadas numa secção autónoma
text file, they should be placed after the reference list. The final decision
a inserir imediatamente antes das referências bibliográficas. As figuras, se
on publication or rejection of the manuscript rests with the Editorial Board,
inseridas no texto, devem ser devidamente identificadas e colocadas depois
which will make use of the peer review system for advice.
das referências bibliográficas. A decisão final sobre a publicação ou não do
manuscrito é da comissão editorial, eventualmente suportada pela opinião
arbitral de terceiros.
47.

CANAL BQ _ Stem Cells

Transcrição

Documentos relacionados

MITOSIS (III ANO

Subproject 12: Lymphocytes expansion for neoplasia and immune

20 DICAS PARA SER MAIS FELIZ

Relatório Anual da Worldfund 2014

BRIAN CUMMINGS Brian Cummings é Professor e Vice

Papel A4

Informativo Biotecnologia Animal – Novembro 2011

Embryonic steam cells

Semana do Desporto: adizero f50 + Speed_Cell in Itech Media

Project 14: Generation of T lymphocytes and NK cells from