Severidade da murcha bacteriana em Virgínia e interações do
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Severidade da murcha bacteriana em Virgínia e interações do
Severidade da murcha bacteriana em Virgínia e interações do Tabaco Burley com Pratylenchus brachyurus Ana R. Figueiredo1 João P. Pimentel2 RESUMO Severidade da murcha bacteriana em Virgínia e interações do Tabaco Burley com Pratylenchus brachyurus. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos sintomas causados pela interação entre Pratylenchus brachyurus e Ralstonia solanacearum (murcha-bacteriana ou selvagem Granville) em plantas de cultivo do tabaco K326 e By21. As avaliações foram realizadas através da monitorização das plantas diariamente, registando as datas de início e progressão dos sintomas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em plantas inoculadas com uma bacteriana de suspensão de R. solanacearum ajustado para 104CFU.g-1 inoculadas com distintas densidades populacionais de ovos e larvas de P. brachyurus. Quando as plantas foram inoculadas com ambos agentes patogênicos, os sintomas das selvagens, causada pela bactéria R. solanacearum começaram mais cedo e também se desenvolveram mais rapidamente, mesmo em um cultivo consideravelmente mais tolerante. Os resultados sugerem que a presença de P. brachyurus no sistema radicular das plantas, favoreceu a infecção por R. solanacearum. Palavras-chave: Pratylenchus brachyurus; Ralstonia solanacearum;Tabaco. ABSTRACT Severity of Bacterial Wilt on Virginia and Burley Tabacco Interactions with Pratylenchus brachyurus. The aim of this study was evaluate the effect of symptoms caused by the interaction between Pratylenchus brachyurus and Ralstonia solanacearum (Bacterial Wilt or Granville Wild) in plants of tobacco cultivation K326 and By21. Evaluations were performed by monitoring the plants daily, recording the dates of onset and progression of symptoms. The experimental design was completely randomized design in plants inoculated with a suspension bacterial of R. solanacearum adjusted to 104CFU.g-1 inoculated with different population densities of eggs 1UFRRJ 2 UFRRJ Rev. de Ci. da Vida, RJ, EDUR, v. 32, n 1, jan / jun, p. 106-116, 2012 FIGUEIREDO, A. R.; et al. and larvae of P. brachyurus. When plants were inoculated with both pathogens, the symptoms of wild, caused by the bacterial R. solanacearum began earlier and also developed more quickly, even in the most tolerant cultivar considered. The results suggest that the presence of P. brachyurus in the radicular system of these plants, favored infection by R. solanacearum. Key words: Pratylenchus brachyurus; Ralstonia solanacearum;Tobacco. INTRODUÇÃO Doenças complexas envolvendo nematoides e outros agentes fitopatogênicos podem dizimar extensas áreas produtoras em poucos anos (FILHO et al., 1995). As associações bactérias-nematoides e suas interações com plantas cultivadas são comumente encontradas na natureza. Bactérias fitopatogênicas podem penetrar nas raízes das plantas mecanicamente, devido a ferimentos causados por nematoides, ou ainda, se beneficiar de alterações fisiológicas provocadas pelos nematoides nas plantas parasitadas o que altera a resistência das plantas (RIEDEL, 1988). A murcha das solanáceas, causada pela bactéria Ralstonia solanacearum, é a principal doença vascular de plantas em todo mundo, afetando o fumo e solanáceas em geral (TAKATSU & LOPES,1997). Das interações envolvendo bactérias e nematoides destacam-se aquelas causas por Rathayibacter toxicus e Anguina funesta em centeio (RILEI, 1996) e Ralstonia solanacearum e Meloidogyne incognita em tomateiro (DEBERDT et al., 1999), não havendo relatos de estudos voltados à interação de R. solanacearum e Pratylenchus brachyurus em fumo. Nesse trabalho, objetivou-se avaliar a severidade da interação entre as variedades K326 e By21 de Tabaco (suscetíveis à e Ralstonia solanacearum), tendo em vista a escassez de estudos na cultura do fumo para esses agentes. MATERIAL E MÉTODOS Preparo das mudas As variedades de fumo escolhidas para este ensaio pertencem a dois grupos de fumo distintos: tabaco de estufa (fumo Virgínia K326) e tabaco de galpão (fumo By21). Rev. de Ci. da Vida, RJ, EDUR, v. 32, n 1, jan / jun, p. 106-116, 2012 107 Severidade da murcha bacteriana em Virgínia... As sementes de fumo Virgínia K326 e fumo By21 foram semeadas diretamente em substrato comercial e mantidas em ambiente de casa de vegetação. As mudas após recém-emergidas, foram selecionadas conforme a uniformidade e transplantadas para sacos plásticos de um Litro de volume contendo uma mistura de areia e terra previamente autoclavadas, na proporção de 50% cada. Preparo do inóculo de Pratylenchus brachyurus Amostras de solo foram coletadas em diferentes áreas e processadas de acordo com Jenkins (1964). Para obtenção de Pratylenchus brachyurus em quantidade massal, os nematoides foram axenizados e mantidos em discos de cenoura, conforme O`Bannon e Taylor (1968) & Moody et al. (1973). Os discos de cenoura foram triturados em liquidificador com água, por 15 segundos. A solução foi vertida em peneiras de 60 e 500 mesh e os nematoides separados pelo método do funil de Baermann modificado (BAERMANN, 1917; HOPPER, 1970), para a obtenção de suspensão de ovos, larvas e adultos de P. brachyurus. Preparo do inóculo de Ralstonia solanacearum Uma amostra de solo infestada naturalmente por Ralstonia solanacearum foi destorroada e exposta ao ar para secagem. Um grama da amostra de solo seco foi diluída em tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina estéril. A seguir, foi feita uma diluição seriada, retirando-se 1 mL de solução desse tubo onde foi feita a diluição da amostra de solo e transferindo-a para outro tubo contendo 9 mL de água salina, e assim por diante até a diluição de 109. Logo após, foram coletadas 0,3 mL de cada tubo de ensaio e espalhados em placas de petri contendo meio de cultura de Kelman. As placas de Petri foram colocadas em uma estufa incubadora, a uma temperatura de 27º C, onde permaneceram por 72 horas. Decorrido esse período, as placas foram levadas para a contagem de células de Ralstonia solanacearum. Estimou-se então a densidade populacional da bactéria por grama de solo seco (106 CFU.g-1). A amostra de solo seco, estimada quanto à concentração da bactéria, foi separada em volumes de 50 mL que foram usados como inóculo. Rev. de Ci. da Vida, RJ, EDUR, v. 32, n 1, jan / jun, p. 106-116, 2012 108 FIGUEIREDO, A. R.; et al. Interação P. brachyurus X R. solanacearum em fumo O delinemaento experimental utilizado nesse ensaio foi o fatorial 2 X 4, ou seja, com dois tratamentos (cultivares de Tabaco) e quatro variáveis (sem inóculo, somente com nematoide, somente com bactéria e nematoide + bactéria) e 16 repetições por variável/cultivar (Tabela 1). Para variável somente inoculada com nematoides, plantas individuais de tabaco com quatro pares de folhas definitivas foram inoculadas com uma suspensão de 3.000 ovos, larvas e adultos de P. brachyurus / vaso. Com o auxílio de um pipetador automático, o inóculo foi depositado ao redor do sistema radicular das mudas, em quatro orifícios que foram abertos na hora da inoculação e fechados logo após. Foram feitas correlações entre o número de espécimes inoculadas, número final de espécimes e dano às plantas. O programa estatístico utilizado para as avaliações foi o SISVAR e para testar a homogeneidade dos dados foi usado o teste Shapiro-Wilk que está disponível no mesmo programa. A inoculação com R. solanacearum se deu através de solo naturalmente infestado. Para a variável bactéria + nematoide, plantas de tabaco, cultivadas em solo naturalmente infestado com R. solanacearuam, foram inoculadas com P. brachyurus, nas mesmas condições citadas anteriormente. As testemunhas receberam amostra de solo previamente autoclavada sem qualquer fonte de inóculo. Tabela 1. Ensaio da interação Pratylenchus brachyurus e Ralstonia solanacearum em fumo Virgínia e Burley. Variedade s/i Pb Rs Pb + Rs N Virgínia K326 16 16 16 16 64 Burley By21 16 16 16 16 64 S/i plantas não inoculadas; Pb plantas inoculadas com Pratylenchus brachyurus por vaso; Rs plantas inoculadas com amostra de solo infestado com Ralstonia solanacearum; PB + Rs plantas inoculadas com Pratylenchus brachyurus e Ralstonia solanacearum; N número total de plantas de cada variedade. Rev. de Ci. da Vida, RJ, EDUR, v. 32, n 1, jan / jun, p. 106-116, 2012 109 Severidade da murcha bacteriana em Virgínia... Condução e avaliação dos ensaios As plantas foram mantidas em ambiente de casa de vegetação, irrigadas e adubadas equilibradamente com Ureia. As plantas foram avaliadas desde os primeiros sintomas, anotando-se a data em que se iniciou até a morte, quando ocorreu ou até 70 dias após as inoculações. Àquelas plantas que apresentavam sintomas de murcha foram avaliadas por isolamento da bactéria em meio de cultura de Kelman e também por inoculação com palito em plantas sadias suscetíveis e reprodução dos sintomas. Independente da percepção de sintomas aparentes externos, todas as mudas foram analisadas. Cada muda teve seu caule cortado a partir da epiderme, retirando-se parte do córtex até expor o cilindro central, na região do sistema condutor. Foi retirada uma seção com um corte vertical, pegando os tecidos do floema, câmbio, xilema e parênquima radial e analisado o fragmento em teste de exudação em gota. Este procedimento foi repetido por diversas vezes, até chegar a uma conclusão quanto a presença ou não da bactéria. Escala de notas Para a avaliação dos sintomas de severidade da doença foi empregada uma escala de notas: 1- ausência de sinais e sintomas da doença; 2- sinais da doença ou 10% das folhas com sintoma de murcha; 3- folhas apresentando sintomas de murcha e amarelecimento acima de 10%; 4- folhas apresentando sintomas de murcha, amarelecimento, necrose e/ ou morte da planta. RESULTADOS E DISCUSSÃO As mudas de ambas as variedades que serviram de testemunhas recebendo apenas água destilada e amostra de solo autoclavado permaneceram sadias, não exibindo quaisquer sintomas ou sinais de murcha bacteriana até sessenta dias, quando terminou o ensaio. Também não foi detectado sintoma de murcha nas plantas inoculadas apenas com o nematoide. Rev. de Ci. da Vida, RJ, EDUR, v. 32, n 1, jan / jun, p. 106-116, 2012 110 FIGUEIREDO, A. R.; et al. Por outro lado, nas plantas inoculadas com a amostra de solo infestada com a bactéria Ralstonia solanacearum (ASI-Rs), sintomas de murcha foram detectados nas duas variedades, tanto em plantas inoculadas apenas com a bactéria quanto em plantas inoculadas previamente com o nematoide, Pratylenchus brachyurus. As plantas infectadas apresentaram sintoma de murcha unilateral, característico do parasitismo por R. solanacearum (Fig. 2). Quando analisadas em teste de exudação em gota, a partir de fragmentos de tecido vascular, foi observado intenso exsudado bacteriano, com motilidade característica de bactéria lofotríquia. As bactérias isoladas em meio de cultura de Kelman estavam livres de contaminações. As colônias apresentaram aspecto branco leitoso a opaco com bordas irregulares e ligeiramente translúcidas. No 5º dia a contar da inoculação com ASI-Rs, 100% das plantas das duas variedades, inoculadas previamente com o nematoide, já demonstravam sintomas iniciais de murcha. Na variedade By21, apenas 37,5% das plantas inoculadas exclusivamente com a ASI-Rs, iniciaram a murcha no quinto dia, sendo que 100% das plantas apresentaram esse sintoma no 15º dia. Na variedade K326, em plantas inoculadas exclusivamente com ASI-Rs, a murcha teve início ao 10º dia após a inoculação, com apenas 12,5% das plantas apresentando o sintoma inicial. No 45º dia após a inoculação com ASI-Rs, apenas 6,25% das plantas da variedade K326 não apresentaram sintomas de murcha. Mesmo assim, essas plantas foram analisadas e chegou-se a conclusão de que não apresentavam infecção por R. solanacearum. Os ferimentos causados nas raízes por nematoides explica o efeito aditivo da interação com bactérias em relação à ação individual de cada microorganismo (DEBERT at al., 1999). Portanto, os ferimentos causados por P. brachyurus serviram de porta de entrada para Ralstonia solanacearum nas raízes das plantas de fumo. Segundo Riedel (1988), os mecanismos que atuam nessas interações são altamente desconhecidos. Esses patógenos associados causam sinergismo (o dano dos dois juntos é maior do que a soma dos dois separados) da doença causando morte de plantas de fumo (DUARTE, 2009). Rev. de Ci. da Vida, RJ, EDUR, v. 32, n 1, jan / jun, p. 106-116, 2012 111 Severidade da murcha bacteriana em Virgínia... Neste ensaio, plantas de fumo mostraram incremento na severidade da doença murcha bacteriana na presença de Pratylenchus brachyurus, principalmente na variedade K326. O aumento na severidade da doença causada por Ralstonia solanacearum em interação com Meloidogyne foi constatada por Cadet et al. (1986) e em tomateiro (Lycopersicon esculentum), quando a bactéria foi inoculada simultaneamente com Meloidogyne arenaria (SALGADO et al., 2007). O nematóide. Pratylenchus brachyurus, aumentou a severidade da doença murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, quando inoculado em conjunto em mudas de fumo das duas variedades analisadas Tabela 2. Percentual de plantas mortas e com sintomas iniciais de Murcha bacteriana n dias após a 1ª inoculação. Dias Dias após a após a inoculação inoculação com ASI-Rs com Pb Tratamen tos S/i Pb Rs Pb + Rs By21 K326 By21 K326 By21 K326 By21 K326 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 Inoculação 0 0 0 0 0 0 0 0 20 5 0 0 0 0 37,5 0 100 100 25 10 0 0 0 0 75 12,5 x x 30 15 0 0 0 0 100 93,75 x x 60 45 0 0 0 0 x 93,75 x x Ausência de sintomas e sinais de 100 Murcha bacteriana 100 100 Rev. de Ci. da Vida, RJ, EDUR, v. 32, n 1, jan / jun, p. 106-116, 2012 100 0 6,25 0 0 112 FIGUEIREDO, A. R.; et al. Tabela 3. Notas de severidade da doença em plantas com sintomas. Tratamentos Variedade Notas de severidade da doença em plantas com sintomas By21 0 S/i K326 By21 PB K326 0 0 0 By21 3 K326 2 By21 3 K326 3 RS Pb + Rs Figura 1. Sintomas iniciais de Murcha bacteriana em mudas de fumo variedade By21: com sintomas (à esquerda) e sem sintomas (à direita). Rev. de Ci. da Vida, RJ, EDUR, v. 32, n 1, jan / jun, p. 106-116, 2012 113 Severidade da murcha bacteriana em Virgínia... REFERÊNCIAS AGRIOS, G. N. Plant Pathology. Fifth Edition. Department of Plant Pathology, University of Florida, 2005. ALVES, T. C. U. Reação de cultivares de soja ao nematóide das lesões radiculares, Pratylenchus brachyurus. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical, 41p., 2008. BAERMANN, G. Eine einfache Methode Zur Auffindung Von Ankvlostomum (nematoden) Larven in Erdproben. Tijdschr. Ned. –Indie, v. 57, 1917. p. 131-137. BERGAMIN FILHO, A. B., KIMATI, H. & AMORIM, L. Manual de Fitopatologia, 3.ed, São Paulo: Agronômica Ceres, 1995. 919p. 2v.: il. BLANCARD,, D.; CAILLETEAU, B.; ANO, G. Maladies du Tabac. 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