Histotecnologia Óssea
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Histotecnologia Óssea
HISTOTECNOLOGIA ÓSSEA John R. Kammerman, Edna B. Prophet & Carlton F. Barnes Para a rotina da histotecnologia óssea é necessário remover os sais de cálcio sem que se altere, severamente, os detalhes celulares. O emblocamento em parafina é recomendado para os espécimens de todos os tamanhos, incluindo as preparações de montagem inteira de corte de ossos longos. FIXAÇÃO Fixe todos os espécimens tissulares em formalina a 10%, neutra, tamponada, por até cinco dias. É recomendável que os ossos longos, grandes, sejam envoltos em musselina ou em várias camadas de gaze para assegurar o contato entre o fixador e o espécime inteiro, e prevenir que fragmentos de tecido flutuem livremente. Após a fixação preliminar, os grandes espécimens podem ser cortados do tamanho apropriado ao dos cassetes padrões. Os ossos longos, da perna e do braço, são convencionalmente cortados ou seccionados utilizando-se uma serra manual. Uma fixação adicional em formalina de concentração dobrada (20%) é recomendada, especialmente para os espécimens a serem montados com superfície de corte inteira, após serem serrados. SOLUÇÃO DE FORMALINA A 20%, NEUTRA, TAMPONADA Formaldeído (37% - 40%) ............................................. 20 mililitros. Água destilada ............................................................. 80 mililitros. Fosfato de sódio, monobásico (NaH2PO4)✝..................... 4,0 gramas. Fosfato de sódio, dibásico (Na2HPO4)✝........................... 6,5 gramas. ✝ BIOSSEGURANÇA: Danosos à saúde se inalados, engolidos, ou em contato com a pele e as mucosas, podendo, inclusive, causar irritação e sensibilização. Os espécimens, provenientes de biopsia ou de curetagem, são fixados por 1 a 2 horas em formalina a 20%. Os espécimens cirúrgicos de rotina, que normalmente cabem no cassete plástico, devem ser fixados por 24 a 48 horas, e os maiores espécimens, a serem montados para corte inteiro, tais como os ossos longos, devem ser fixados por 72 horas ou mais. Todos os espécimens fixados, provenientes de biopsia ou de curetagem, são lavados em água corrente, com fluxo lento, por no mínimo 30 minutos. Os espécimens maiores são lavados por não mais que 1 hora. Evite lavar rapidamente em água corrente. Para evitar perder as amostras pequeninas decante cuidadosamente o fixador. DESCALCIFICAÇÃO SOLUÇÃO ESTOQUE DE ÁCIDO CLORÍDRICO A 8% Ácido clorídrico, concentrado (HCl)✝............................ 80 mililitros. Água destilada ............................................................ 920 mililitros. SOLUÇÃO ESTOQUE DE ÁCIDO FÓRMICO A 8% Ácido fórmico (HCOOH)✝......................................... 80 mililitros. Água destilada ........................................................... 920 mililitros. SOLUÇÃO DE TRABALHO DE ÁCIDO FÓRMICO-ÁCIDO CLORÍDRICO Combine partes iguais das soluções de ácido clorídrico a 8% e de ácido fórmico a 8%. ✝ BIOSSEGURANÇA: O ácido clorídrico e o ácido fórmico são substâncias corrosivas e tóxicas. Não respire os vapores e evite o contato com a pele, mucosas, olhos e com a roupa. Em caso de acidente lave a superficie com abundante água corrente. Procedimento 1. Os espécimens devem ser descalcificados em solução de trabalho de ácido clorídrico-ácido fórmico, numa quantidade de 20 vezes o volume do espécime. 2. Troque a solução descalcificadora diariamente, até que a descalcificação tenha se completado. 3. Lave os espécimens completamente por até 1 hora. Os espécimens não devem ser amontoados juntos, de modo que se consiga uma completa e rápida descalcificação. A descalcificação excessiva danificará permanentemente o espécime. Os procedimentos a seguir auxiliam determinar corretamente, o ponto final da descalcificação. Ponto final da descalcificação O ponto final da descalcificação pode ser checado pelo exame do espécime ao raio X ou por testes químicos ou físicos. O exame ao raio X é o mais preciso. Se não for possível radiografar o espécime, o seguinte teste químico, para detectar os resíduos de sais de cálcio, é recomendado, em lugar do teste físico, o qual é menos acurado e pode potencialmente danificar o espécime. Teste químico As soluções seguintes são necessárias para testar quimicamente os resíduos de cálcio. HIDRÓXIDO DE AMÔNIO A 5% (ESTOQUE) Hidróxido de amônio (NH4OH)✝, 28% ........................... 5 mililitros. Água destilada .............................................................. 95 mililitros. OXALATO DE AMÔNIO A 5% (ESTOQUE) Oxalato de amônio (COONH4)✝......................................... 5 gramas. Água destilada ............................................................... 95 mililitros. SOLUÇÃO DE TRABALHO DE HIDRÓXIDO DE AMÔNIO / OXALATO DE AMÔNIO Misture partes iguais das soluções de hidróxido de amônio a 5% e de oxalato de amônio a 5%. ✝ BIOSSEGURANÇA: Tóxicos e, ou corrosivos. Evite inalar, deglutir ou o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo. Procedimento 1. Insira uma pipeta na solução descalcificante contendo o espécimen. 2. Retire, aproximadamente, 5 ml da solução descalcificante de ácido clorídrico / ácido fórmico do fundo do frasco, onde se encontra o espécime e coloque em um tubo de ensaio. 3. Adicione aproximadamente 10 ml da solução de trabalho de hidróxido de amônio / oxalato de amônio, misture bem e deixe em repouso por uma noite. 4. A descalcificação está completa, quando nenhum precipitado é observado em dois testes químicos, feitos em dois dias consecutivos. Repita este teste a cada dois ou três dias. Testes físicos Os testes físicos incluem dobrar o espécime ou inserir um alfinete ou uma lâmina de bisturi diretamente no mesmo. A desvantagem de inserir alfinete ou uma lâmina de bisturi é a criação de artefatos de corte ou de orifício. Dobrar suavemente o espécime é mais seguro e menos danoso, porém não permitirá, de modo conclusivo, saber se todos os sais de cálcio foram removidos. Após checar a rigidez, lave completamente o espécime em água corrente, antes do processamento. REFERÊNCIA: PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994. DESCALCIFICAÇÃO COM ÁCIDO ETILENODIAMINOTETRAACÉTICO (EDTA) FIXAÇÃO: Formalina a 10%, neutra, temponada. SOLUÇÃO SOLUÇÃO DE EDTA (VERSENATO) EDTA ........................................................................10 gramas Água destilada (pH 5,5 a 6,5) ................................ 100 mililitros PROCEDIMENTO 1. Coloque o tecido ósseo, previamente fixado em formalina a 10%, neutra, tamponada, na solução de EDTA e deixe até que a descalcificação esteja completa. Leia as observações abaixo. 2. Coloque em solução de etanol a 70%. Lavagem não é necessária. 3. Desidrate, clarifique e faça a infiltração e o emblocamento em parafina, ou outro processamento que desejar. OBSERVAÇÕES a. A maioria dos espécimens ósseos, com 3 milímetros de espessura, descalcifica em 2 a 4 dias. (Deixe os fragmentos suspensos por fio, quando imersos na solução de EDTA). b. Os espécimens podem ficar na solução de EDTA por até 14 dias sem que se notem efeitos na qualidade da coloração das células. Isto é especialmente verdadeiro se a solução estiver com pH entre 5,5 e 6,5. c. A solução de EDTA deve ser usada para a descalcificação de materiais ósseos densos. Neste caso pode ser necessário longo tempo de modo que a solução de EDTA deve ser trocada no intervalo de 3 4 dias. A vantagem do EDTA é a preservação da afinidade tintorial das células. REFERÊNCIA: Birge, E.A. & Imhoff, C.E. – Versenate as a decalcifying agent for bone. Amer. J. Clin. Path. 22: 192193, 1952. In: Luna, L.G. – Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York, McGraw-Hill, 1968, pp. 9-10.