Desenvolvimento de ferramentas para elaboração de um

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS PARA ELABORAÇÃO
DE UM BANCO DE DADOS E ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE
FATORES DE TRANSCRIÇÃO DE SOJA (Glycine max)
RESPONSIVOS À FERRUGEM ASIÁTICA
ZAMIRA GUERRA SOARES
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2010
ZAMIRA GUERRA SOARES
DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS PARA ELABORAÇÃO
DE UM BANCO DE DADOS E ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE
FATORES DE TRANSCRIÇÃO DE SOJA (Glycine max)
RESPONSIVOS À FERRUGEM ASIÁTICA
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Ouro Preto, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia,
para obtenção do título de Magister Scientiae.
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2010
Aos meus pais, Beth e Lau.
Aos meus irmãos, Filipe e Paulo.
DEDICO.
“Happiness only real when shared.”
(Christopher McCandless)
AGRADECIMENTOS
À Deus por me iluminar nos momentos de dificuldade.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular pela oportunidade e pelo apoio acadêmico e institucional.
À Universidade Federal de Ouro Preto e ao Programa de Pós Graduação em
Biotecnologia pelo suporte.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pela bolsa concedida.
Aos meus pais Beth e Lau, pelo amor, dedicação e por não medirem esforços
para que eu pudesse seguir em frente sempre.
Aos meus irmãos Filipe e Paulo e a minha cunhada Rox, por todo suporte,
amor e alegria de viver.
Ao professor e orientador Luciano Gomes Fietto, por seu apoio e inspiração no
amadurecimento dos meus conceitos, que me levaram à execução e conclusão desta
dissertação.
Às professoras Andréa Ribon e Juliana Fietto, pelo suporte e conselhos
notáveis para o aprimoramento desde trabalho.
Ao grupo GENOSOJA pela disponibilização de amostras e conhecimento,
principalmente a Francismar, pela disponibilidade.
Ao meu irmão Filipe e ao amigo Raphael, pela ajuda direta na realização dos
experimentos para conclusão desta dissertação.
À amiga Daniela pela companhia e suporte durante o mestrado.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Biotecnologia Molecular, por tornar a
estadia em Viçosa mais tranqüila e pelo apoio em todos os experimentos, Adíverson,
Ananda, Ancely, Aline, Carlos, Daiane, Danielle, Daniela, Felipe, Fernanda, Glauco,
Héllida, Mary, Mariana, Marina, Mário, Patrícia, Priscilla, Raphael, Silvana e Zaira.
A todos os meus amigos, pela torcida e apoio em todas as horas.
A toda minha família, pelo incentivo e amor concedidos. Em especial meus
primos pela convivência agradável.
BIOGRAFIA
Zamira Guerra Soares, filha de Laudelino Rocha Soares Neto e Maria Elizabeth
Batista Guerra, nasceu na cidade de Timóteo, Minas Gerais, em 19 de novembro de
1984.
Em dezembro de 2002 completou o ensino médio no Colégio Dom Bosco em
Timóteo.
Em março de 2004, matriculou no bacharelado em Bioquímica da Universidade
Federal de Viçosa, MG, graduando-se em janeiro de 2009.
Ingressou no Programa de Pós Graduação em Biotecnologia em março de
2009, em nível de mestrado, na Universidade Federal de Ouro Preto. Submetendo-se
a defesa de dissertação em 16 de dezembro de 2010.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E QUADROS ............................................................................. viii
RESUMO ..................................................................................................................... ix
1.
INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1
2.
REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 3
2.1.
Ferrugem asiática .............................................................................................. 3
2.1.1. Aspectos gerais ................................................................................................. 3
2.1.2. Phakopsora pachyrhizi ...................................................................................... 4
2.1.3. Epidemiologia .................................................................................................... 5
2.1.4. Sintomatologia................................................................................................... 6
2.1.5. Ciclo da ferrugem asiática ................................................................................. 7
2.1.6. Resistência genética ......................................................................................... 8
2.1.7. Manejo da doença ............................................................................................. 9
2.2.
Fatores de transcrição ..................................................................................... 11
2.3.
Eventos de duplicação múltiplos...................................................................... 12
2.4.
Bancos de dados como ferramenta para o melhoramento de plantas ............. 13
3.
OBJETIVOS......................................................................................................... 16
3.1.
Objetivo Geral ................................................................................................. 16
3.2.
Objetivos Específicos ...................................................................................... 16
4.
MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 17
4.1.
Desenvolvimento de softwares ........................................................................ 17
4.2.
Desenvolvimento do banco de fatores de transcrição...................................... 17
4.3.
Comparação entre os bancos de dados e criação do banco consenso ........... 17
4.4.
Análise das sequências únicas do banco de dados LBM ................................ 18
4.5.
Busca de fatores de transcrição já identificados como ligados na resposta à
ferrugem ..................................................................................................................... 18
4.6.
Criação de cladogramas das famílias e identificação de possíveis genes ligados
na resposta à ferrugem ............................................................................................... 18
4.7.
Comparação entre os genes candidatos e biblioteca subtrativa ...................... 19
4.8.
Montagem de oligonucleotídeos para RT-qPCR.............................................. 19
4.9.
Síntese de cDNA para RT-qPCR..................................................................... 20
4.10. RT-qPCR......................................................................................................... 20
5.
5.1.
RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 23
BRa – BLAST Results Analysis ....................................................................... 23
5.1.1. O aplicativo e os arquivos de entrada .............................................................. 23
5.1.2. Processamento dos dados .............................................................................. 24
5.1.3. Arquivo de saída ............................................................................................. 25
5.2.
Venn Diagram For Proteins ............................................................................. 27
5.2.1. Arquivo de entrada .......................................................................................... 27
5.2.2. Processamento de dados e arquivo de saída .................................................. 27
5.3.
Desenvolvimento do banco de fatores de transcrição, comparação com os
outros bancos e criação do banco consenso .............................................................. 28
5.4.
Busca de fatores de transcrição responsivos à ferrugem asiática.................... 29
5.5.
Cladogramas e identificação de possíveis genes responsivos à ferrugem ...... 30
5.6.
Comparação dos genes candidatos com a biblioteca subtrativa ...................... 32
5.7.
RT-qPCR......................................................................................................... 33
5.7.1. Eficiência da reação e seleção de oligonucleotídeos ....................................... 33
5.7.2. Análises de expressão .................................................................................... 33
6.
CONCLUSÃO ...................................................................................................... 37
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 38
ANEXOS..................................................................................................................... 43
LISTA DE FIGURAS E QUADROS
Figura 1 - Mapa da dispersão da ferrugem asiática no país .......................................... 3
Figura 2 – Phakopsora pachyrhizi e taxonomia do fungo ............................................. 4
Figura 3 – Estágio inicial de desenvolvimento da interação durante a infecção ............ 5
Figura 4 – (A) Primeiros sintomas da ferrugem asiática e (B) lesões castanhas
avermelhadas. .............................................................................................................. 7
Figura 5 – Ciclo da ferrugem asiática. ........................................................................... 8
Figura 6 – Gel de agarose 1% .................................................................................... 22
Figura 7 – (A) Tela inicial do programa. (B) Exemplo de um arquivo de saída do
BLAST local ................................................................................................................ 23
Figura 8 – Interface gráfica do programa BRa ............................................................ 24
Figura 9 – Exemplo de um arquivo de saída tabelado do BRa.................................... 25
Figura 10 – Exemplos de arquivos de saída do BRa................................................... 26
Figura 11 – (A) Tela inicial e (B) Interface gráfica do programa Venn Diagram For
Proteins. ..................................................................................................................... 27
Figura 12 – Diagramas de Venn mostrando a comparação entre os três bancos e
quantas sequências de interseção existem entre eles (A) antes e (B) depois de
analisar as sequências únicas do banco LBM............................................................. 28
Figura 13 – Partes dos cladogramas mostrando as sequências que se agruparam mais
próximas às proteínas comprovadamente ligadas à defesa contra patógenos ........... 31
Figura 14 – Localização dos dezesseis genes candidatos dentro dos bancos de dados.
................................................................................................................................... 32
Figura 15 – Gráficos mostrando análise de expressão relativa dos genes (A) MBF1B,
(B) bZIPB, (C) WRKYA e (D) WRKYC ........................................................................ 35
Quadro 1 – Oligonucleotídeos direito e reverso dos genes analisados neste estudo. . 19
Quadro 2 – Resultado da busca textual no NCBI, mostrando os genes ligados na
resposta à ferrugem e a defesa contra patógenos e as famílias que eles pertencem. 30
Quadro 3 – Resultado do BLAST ................................................................................ 32
Quadro 4 – Valores de eficiência e slope dos oligonucleotídeos ................................. 33
viii
RESUMO
SOARES, Zamira Guerra, M.Sc., Universidade Federal de Ouro Preto, dezembro de
2010. Desenvolvimento de ferramentas para elaboração de um banco de dados e
análise da expressão de fatores de transcrição de soja (Glycine max)
responsivos à ferrugem asiática. Orientador: Luciano Gomes Fietto.
Plantas infectadas com o fungo Phakopsora pachyrhizi, causador da doença
ferrugem asiática, sofrem desfolhamento precoce acarretando grandes prejuízos para
o agricultor. As formas de manejo da doença atualmente abrangem o vazio sanitário, o
controle químico e utilização de cultivares resistentes. Como não existe um cultivar
comercial imune os gastos com prevenção e manejo são muito elevados. Dentro deste
contexto, o presente trabalho busca selecionar novos genes alvo para o
desenvolvimento de um cultivar imune à doença, focando nos fatores de transcrição.
Três bancos de dados de fatores de transcrição - SoybeanTFDB e o SoyDB, já
existentes, e um desenvolvido neste trabalho (LBM) - foram comparados para a
criação de um banco consenso, e dois softwares (BRa e Venn Diagram For Proteins)
foram desenvolvidos para a sua construção (SoyLBM). O banco consenso SoyLBM
abrange todas as sequências não redundantes dos três bancos possuindo 7202
sequências, 7,46% a mais do que o banco SoyDB e 30,09% a mais que o banco
SoybeanTFDB. Após a criação do banco de dados foram identificados dezesseis
genes candidatos a serem fatores de transcrição responsivos à ferrugem. Dentre eles,
quatro tiveram sua expressão analisada por PCR em tempo real, em dois cultivares
diferentes durante a infecção pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. Dentre os genes
analisados o fator MBF1B teve sua expressão aumentada em resposta à infecção,
mas não apresentou diferença significativa de expressão entre os cultivares suscetível
e resistente sugerindo que esteja ligado a uma resposta mais geral da planta a
infecções. Os genes bZIPB, WRKYA e WRKYC mostraram aumento da expressão
tardia no cultivar resistente em relação ao cultivar suscetível, sugerindo que estes
genes são induzidos após o estabelecimento da infecção.
ix
ABSTRACT
SOARES, Zamira Guerra, M.Sc., Universidade Federal de Ouro Preto, December
2010. Development of software for developing a database and analysis of
expression of transcription factors from soybean (Glycine max) responsive to
rust. Advisor: Luciano Gomes Fietto.
Plants infected with Phakopsora pachyrhizi, which causes rust disease and
early defoliation, suffer big losses for the farmer. The forms of the disease
management currently include the “vazio sanitário”, chemical control and use of
resistant cultivars. As there is no commercial cultivar immune spending on prevention
and management are very high. Within this context, this work seeks to select new
target genes for the development of a growing immune to the disease, focusing on
transcription factors. Three databases of transcription factors - and SoybeanTFDB
SoyDB, existing and developed in this work (LBM) - were compared for the creation of
a bank agreement, and two software (BRa and Venn Diagram For Proteins) were
developed to its construction (SoyLBM). The bank agreement SoyLBM covers all nonredundant sequences of the three banks holding sequences 7202, 7.46% more than
the bank SoyDB and 30.09% more than the bank SoybeanTFDB. After creating the
database were identified sixteen candidate genes for transcription factors are
responsive to rust. Among them, four had their expression analyzed by real time PCR
in two different cultivars during infection by the fungus Phakopsora pachyrhizi. Among
the genes analyzed MBF1B factor had to be increased in response to infection, but no
significant difference in expression between the susceptible and resistant cultivars
suggesting that it is connected to a more general plant response to infection. Genes
bZIPB, WRKYA and WRKYC showed increased late expression in the resistant cultivar
compared to the susceptible cultivar, suggesting that these genes are induced after the
establishment of infection.
x
1. INTRODUÇÃO
A primeira constatação da ferrugem asiática em lavouras de soja no Brasil ocorreu
na safra 2001/02 e rapidamente espalhou-se pelas principais regiões produtoras do país.
Plantas severamente infectadas apresentam desfolha precoce, o que impede a completa
formação dos grãos, com consequente redução da produtividade. Segundo levantamento do
Consórcio Antiferrugem (2010), a doença custa para o produtor cerca de U$ 2 bilhões, por
safra.
A ferrugem asiática possui dois agentes causais, sendo um deles uma forma mais
branda – Phakopsora meibomiae, originada na América Latina e a forma mais comum Phakopsora pachyrhizi, originada na Ásia-Austrália.
P. pachyrhizi é um parasita obrigatório que inicia sua infecção quando uredósporos
germinam e emitem um tubo germinativo que cresce sobre a superfície da folha até que se
forma um apressório. Esta ferrugem é única por ter a habilidade de penetrar diretamente
através da epiderme, ao contrário das outras ferrugens que penetram através dos
estômatos.
A disseminação da ferrugem é feita unicamente através da dispersão dos
uredósporos pelo vento e o sucesso da infecção é dependente da disponibilidade de
molhamento na superfície da folha e temperatura. Quanto às estratégias de controle, é
necessário iniciar o manejo das plantas de soja na entressafra o que depende da região.
Considerando a gravidade da doença, diversos estados adotaram o “vazio sanitário”. O
monitoramento da lavoura e da região e o controle químico com fungicidas devem ser
realizados também logo após os primeiros sintomas ou preventivamente. Cultivares com
genes de resistência já se encontram disponíveis comercialmente para a região CentroOeste. No entanto, essas cultivares não dispensam a utilização de fungicidas e devem ser
utilizadas como uma estratégia a mais de manejo.
As plantas possuem mecanismos sofisticados para percepção de patógenos, e para
traduzir essa percepção em uma resposta adaptativa. O desenvolvimento e a diferenciação
das plantas são programados primeiramente no nível de transcrição gênica, que é
controlado por fatores de transcrição e outras proteínas que recrutam ou bloqueiam o
acesso da RNA polimerase ao DNA.
A criação de um banco de dados de fatores de transcrição de soja é essencial para o
entendimento das relações de regulação da expressão gênica durante a adaptação do
vegetal frente a condições de estresses bióticos. Dois bancos de dados já foram criados:
SoybeanTFDB (Mochida et al., 2009) e o SoyDB (Wang et al., 2010). Portanto, a criação de
um banco consenso abrangendo o máximo de sequências possíveis e não redundantes
1
facilitaria a compreensão e análise dos dados, auxiliando na descoberta de novos genes de
resposta a estresses bióticos e no melhoramento de plantas.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Ferrugem asiática
2.1.1. Aspectos gerais
O agente causal da ferrugem asiática foi descrito pela primeira vez em 1899 na
China (Hinson et al., 1977) e está presente, tradicionalmente, na maioria dos países da Ásia
e Austrália (Bromfield et al., 1980). Nas Américas, foi detectado pela primeira vez no Havaí
em maio de 1994 (Killgore et al., 1994).
Na América do Sul a ferrugem asiática foi constatada pela primeira vez no Paraguai,
em março de 2000 (Yorinori et al., 2002a). A primeira constatação da ferrugem asiática em
lavouras de soja no Brasil ocorreu na safra 2001/02 e rapidamente espalhou-se pelas
principais regiões produtoras do país (Consórcio Antiferrugem, 2010). Na safra de
2009/2010 a ferrugem foi constatada nas principais regiões produtoras do país, possuindo
um total de 2370 focos (Consórcio Antiferrugem, 2010 – Figura 1)
Figura 1 - Mapa da dispersão da ferrugem asiática no país (figura retirada do Consórcio Antiferrugem, 2010).
3
Plantas severamente infectadas apresentam desfolha precoce, o que impede a
completa formação dos grãos, com consequente redução da produtividade. As perdas em
grãos, ocasionadas pela ferrugem, vêm diminuindo nos últimos anos, mas ainda ocorrem,
devido a falhas no controle. A aplicação de fungicidas e o vazio sanitário são hoje as
principais ferramentas de manejo da doença para reduzir perdas. Segundo levantamento do
Consórcio Antiferrugem, a doença custa para o produtor cerca de U$ 2 bilhões, por safra
(EMBRAPA, 2009).
2.1.2. Phakopsora pachyrhizi
A ferrugem asiática possui dois agentes causais, sendo um deles uma forma mais
branda – Phakopsora meibomiae, originada na América Latina e a forma mais comum Phakopsora pachyrhizi (Figura 2), originada na Ásia-Austrália (Goellner et al., 2010).
Domínio – Eukarya;
Reino – Fungi;
Filo – Basidiomyceto;
Ordem – Uredinales;
Classe – Uredinomicetos;
Família – Phakopsoraceae;
Gênero – Phakopsora.
Figura 2 – Phakopsora pachyrhizi, mostrando a estrutura típica do apressório (acima) saindo do uredinósporo
germinativo (abaixo) (APSnet, 2010) e taxonomia do fungo (http://www.idexfungorum.org).
P. pachyrhizi é um parasita obrigatório que inicia sua infecção quando uredósporos
germinam e emitem um tubo germinativo que cresce sobre a superfície da folha até que se
forma um apressório (Figura 2). Esta ferrugem é única por ter a habilidade de penetrar
diretamente através da epiderme, ao contrário das outras ferrugens que penetram através
dos estômatos. Urédias podem se desenvolver de cinco a oito dias após a infecção e os
esporos do fungo podem ser produzidos por até três semanas (Fitopatologia.net, 2010).
Este patógeno produz dois tipos de esporos, teliósporos e uredósporos. Teliósporos
são os esporos sexuais do patógeno e são produzidos em lesões mais antigas e não
parecem germinar em condições naturais. Assim, o estagio uredinal é o responsável pelas
epidemias desta doença. Uredósporos são ovóides a elipsóides, de coloração amareloamarronzadas, possuem uma superfície coberta por pequenos espinhos (Fitopatologia.net,
2010).
4
2.1.3. Epidemiologia
A penetração do P. pachyrhizi começa com a formação de uma estrutura em forma
de funil, designada cone apressorial, a partir do apressório (Figura 3). Esse cone é contíguo
com a hifa de penetração que passa pela parede da célula epidérmica. Durante a
penetração, a célula epidérmica colapsa, se desorganiza e mostra sinais de morte celular.
Depois, a hifa cresce através da célula epidérmica e alcança o espaço intracelular; um septo
é formado que se emerge da hifa primária. Esta pode formar um braço para formar uma hifa
secundária e finalmente ocorre a diferenciação em células haustóricas mães (Koch et al.,
1983).
Quando infectam plantas que não são suas hospedeiras naturais, o fungo consegue
colonizar o mesófilo, mas nunca esporula (Goellner et al., 2010).
A disseminação da ferrugem é feita unicamente através da dispersão dos
uredósporos pelo vento (Yorinori et al., 2002b). O sucesso da infecção é dependente da
disponibilidade de molhamento na superfície da folha. Pelo menos 6 horas de água livre
parece ser necessária para promover a infecção. O fungo pode infectar a planta em
temperatura variando de 15 e 28°C, com ótimo de 22 a 24°C. Chuvas abundantes e
freqüentes durante o desenvolvimento da doença têm sido associadas com epidemias mais
severas (Fitopatologia.net, 2010).
A ferrugem asiática apresenta desenvolvimento rápido, sendo que a detecção dos
sintomas nos estágios iniciais é difícil, tornando-se possível apenas com o auxílio de lupa ou
do apoio de um laboratório de diagnose de doenças. A ferrugem da soja só é detectada a
olho nu a partir de uma severidade de 5%, sendo este nível muito elevado e arriscado para
iniciar o controle químico (Azevedo et al., 2004).
Figura 3 – Estágio inicial de desenvolvimento da interação durante a infecção. Uredósporos germinativos (sp)
produzem um único tubo germinativo (gt) terminando em um apressório (app). Uma estrutura como um túnel, o
cone apressorial (cone), é desenvolvido e continua por uma hifa de penetração (penh) que atravessa as células
epidérmicas (epi). Consequentemente as células penetradas morrem. No espaço intracelular do mesófilo uma
hifa primária (ph) se separa da hifa de penetração por um septo e forma um braço, a hifa secundária (sh).
Finalmente, uma célula haustorial mãe (hmc) é formada de onde o patógeno invade a célula da mesófila (meso)
formando o primeiro haustório (hau) e estabelecendo a interação com o hospedeiro (modificado de Goellner et
al., 2010).
5
2.1.4. Sintomatologia
O patógeno é capaz de desfolhar as plantas de soja no campo em poucos dias e
pode levar a completa destruição da lavoura. Como uma variedade resistente a todos os
isolados do patógeno ainda não está disponível e tratamentos com fungicidas são caros,
várias áreas são endêmicas tomadas pelo P. pachyrhizi (Goellner et al., 2010).
Os primeiros sintomas da ferrugem se iniciam pelo terço inferior ou médio da planta e
aparecem como minúsculas pontuações mais escuras que o tecido sadio da folha (Figura
4A). No início da infecção, a folha permanece verde, dificultando a identificação quando a
lavoura é observada de forma superficial. Para identificar a doença no início, deve ser
realizado um monitoramento cuidadoso, coletando diversas folhas da parte inferior/média da
planta e observando contra a luz para verificar a presença de pontuações escuras. Embora
doenças
como
a
mancha
parda
(Septoria
glycines),
o
crestamento
bacteriano
(Pseudomonas savastanoi pv glycinea) e a pústula bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv
glycines) causem sintomas semelhantes, a confirmação da ferrugem é feita pela
constatação no verso da folha (face abaxial), de saliências semelhantes a pequenas feridas
(bolhas), que correspondem à estrutura de reprodução do fungo (urédias). Essa observação
é facilitada com uma lupa de 10 a 20 vezes de aumento (EMBRAPA Soja, 2010).
O microclima mais favorável facilita a germinação, penetração e infecção dos
esporos. Devido ao hábito biotrófico, o fungo necessita de tecido vivo do hospedeiro, e desta
forma as células infectadas morrem somente após ter ocorrido abundante esporulação, o
que torna difícil a sua visualização no início da infecção. Com o desenvolvimento da doença,
as lesões adquirem forma angular, delimitadas pelas nervuras secundárias, podendo
alcançar 2 a 3 mm de diâmetro, adquirindo coloração castanho-avermelhada (por isto o
nome ferrugem – Figura 4B) no momento da emissão dos uredósporos (Yorinori, 1982).
Estas lesões podem também aparecer nos pecíolos, nas vagens e nos ramos, porém são
mais abundantes nas folhas, principalmente na face inferior. Assim, a ferrugem asiática
causa a perda de clorofila e queda prematura das folhas, podendo ocasionar redução no
número de vagens e massa das sementes (Bromfield, 1984).
6
B
A
Figura 4 – (A) Primeiros sintomas da ferrugem asiática e (B) lesões castanhas avermelhadas.
2.1.5. Ciclo da ferrugem asiática
O ciclo da doença (Figura 5) se inicia com a disseminação dos esporos que foram
produzidos nas plantas que serviram como hospedeiras na entressafra. Os esporos são
disseminados pelo vento e se depositam sobre as folhas das plantas de soja. Caso as
condições estejam favoráveis, temperatura entre 18oC e 26oC, molhamento foliar de pelo
menos seis horas (o ideal é de 12 a 14 horas), os esporos germinam e o fungo penetra na
folha diretamente rompendo a epiderme (diferente da maioria dos fungos causadores de
ferrugem, que só penetram por estômatos) e começa a colonizar os tecidos da folha. Em
condições ótimas de temperatura, ao redor de cinco dias após a penetração, é possível
visualizar, com a ajuda de uma lupa, os primeiros sintomas, que são os pontos escurecidos
vistos mais facilmente olhando a folha contra um fundo claro (Consórcio Antiferrugem,
2010).
Com mais uns quatro a seis dias, as urédias (saliências) podem ser vistas e novos
esporos começam a ser liberados. Cada urédia permanece produzindo esporos por
aproximadamente 21 dias. Esses esporos vão iniciar novas infecções na mesma lavoura ou
vão, através do vento, alcançar lavouras mais distantes. Quando chega o fim do ciclo da
cultura o fungo passa a sobreviver nas plantas voluntárias ou outros hospedeiros (Consórcio
Antiferrugem, 2010).
7
Figura 5 – Ciclo da ferrugem asiática (Consórcio Antiferrugem, 2010).
2.1.6. Resistência genética
As cultivares atuais de soja são extremamente uniformes, ou seja, relativamente poucos
acessos contribuíram com a maioria dos genes das atuais cultivares, e existe uma
diversidade genética limitada em germoplasmas elite de soja. Uma base genética estreita
traz algumas dificuldades para programas de melhoramento, como falta de variabilidade no
germoplasma elite para genes de resistência a doenças, possibilidade de uma doença,
como a ferrugem asiática, devastar a produção por ser toda ela geneticamente semelhante
e o eminente alcance de um limite de produtividade (Mulato, 2009).
A transferência vertical de genes de resistência é facilmente utilizada em programas de
melhoramento genético e é obtida através de cruzamentos. No entanto, genótipos com este
tipo de resistência é mais vulnerável à reação do patógeno, que possui meios de geração de
variabilidade genética (mutações e recombinações), tornando a resistência raça-específica
pouco durável. A identificação e a utilização de genes de resistência provenientes de
transferência horizontal em programas de melhoramento têm sido limitadas em função das
dificuldades relacionadas com a avaliação fenotípica e da incorporação desta resistência
nos programas de melhoramento. Essas dificuldades levam ao desenvolvimento de
estratégias para selecionar genótipos que são definidos como tolerantes ou de produção
estável a despeito da infestação por determinado patógeno (Martiello et al., 1997).
Na literatura já foram comprovados cinco genes com efeito principal na resistência à
ferrugem asiática, sendo eles rpp1, rpp2, rpp3, rpp4 e rpp5. Como genes de resistência
8
provenientes de transferência vertical submetem o fungo à intensa pressão de seleção,
espera-se que o patógeno evolua, suplantando essa resistência ao longo do tempo. Já
foram confirmadas quebras da resistência conferidas pelos genes rpp1 e rpp3 no Brasil,
rpp2 e rpp4 na Ásia (Bromfield et al., 1980; McLean et al., 1980; Hartwig et al., 1983;
Hartwig, 1986; Calvo et al., 2008; Garcia et al., 2008).
2.1.7. Manejo da doença
No Brasil, a ferrugem tem atingido, por vezes, níveis de redução de produtividade
que frequentemente inviabilizam as colheitas quando não se realiza seu efetivo controle.
Cabe ressaltar que a extensão territorial das lavouras, aliada à monocultura contínua,
favorece a maior produção de inóculo e a disseminação deste fungo. Ainda pode-se citar
como principais agravantes ou fatores suplementares que diminuem a eficiência do controle
da doença: (a) o aparecimento de diferentes isolados do patógeno; (b) as falhas nas
aplicações de fungicidas; (c) a utilização de alta população de plantas; (d) o atraso na época
de semeadura, além da (e) sobrevivência do patógeno em plantas voluntárias de soja ou em
outras espécies hospedeiras, no período de entressafra (Yorinori et al., 2006).
Quanto às estratégias de controle, é necessário iniciar na entressafra com o manejo
das plantas de soja e isso depende da região. Considerando a gravidade da doença,
diversos estados adotaram o “vazio sanitário”. Devem ser realizados também o
monitoramento da lavoura e da região e o controle químico com fungicidas logo após os
primeiros sintomas ou preventivamente. Cultivares com genes de resistência já se
encontram disponíveis comercialmente para a região Centro-Oeste. No entanto, essas
cultivares não dispensam a utilização de fungicidas e devem ser utilizadas como uma
estratégia a mais de manejo (Consórcio Antiferrugem, 2010).
(A) Vazio Sanitário
Vazio sanitário da soja é o período de ausência de plantas vivas dessa cultura no
campo. É uma estratégia adicional no manejo da ferrugem asiática da soja, objetivando
reduzir a quantidade de uredósporos no ambiente durante a entressafra e, dessa forma,
reduzir a possibilidade de incidência precoce da ferrugem. Esse período, que varia de 60 a
90 dias, foi estabelecido considerando que o período máximo de viabilidade de uredósporos
de P. pachyrhizi registrado é de 55 dias (Consórcio Antiferrugem, 2010).
9
(B) Uso de fungicidas
No caso da ferrugem da soja, apesar do grande número de produtos comerciais, até
o momento, os fungicidas se restringem à apenas dois grupos ativos: as estrobilurinas e os
triazóis (Godoy et al., 2004).
As estrobilurinas, também chamados de β-methoxiacrilatos, interferem na respiração
mitocondrial, bloqueando a transferência de elétrons pelo complexo citocromo bc1, através
da inibição da óxido-redutase de ubihidroquinona-citocromo c (Ghini et al., 2000). Há a
necessidade de aplicação do fungicida antes da ocorrência da doença (Hewitt, 1998).
Os triazóis são fungicidas sistêmicos muito efetivos no controle de agentes
patogênicos em culturas. O modo de ação está relacionado à inibição na biossíntese de
esteróis, cuja função está relacionada à manutenção da integridade da membrana a qual
está presente em todos os eucariotos. A redução da disponibilidade de ergosterol (principal
esterol presente em fungos) resulta na disrupção da membrana e escoamento eletrolítico
(Hewitt, 1998).
Como a fase inicial de estabelecimento da doença ocorre de forma assintomática,
devido à interferência metabólica do patógeno sobre a planta hospedeira (Balardin, 2002) a
proteção de plantas com fungicidas deveria ser sempre realizada de forma preventiva
(Azevedo, 2001), acarretando gastos para o agricultor mesmo antes da confirmação da
doença.
(C) Cultivares resistentes
Tecnologias de melhoramento genético tradicional (obtidas através de cruzamentos
de variedades distintas de soja) ou com o uso da transgenia, apresentam avanços no
controle de uma das pragas que mais afeta a produção atualmente.
Duas tecnologias podem servir de ferramenta para o sojicultor para melhor controle
da doença. A primeira, através da variedade desenvolvida pela EMBRAPA Soja em parceria
com a Secretaria de Agricultura, Pecuária e Abastecimento do Estado de Goiás (Seagro) – a
cultivar BRSGO 7560, e a segunda, a soja Inox® (TMG 801 e TMG 803), obtida por
pesquisas da Fundação de Apoio à Pesquisa Agropecuária de Mato Grosso (Fundação MT)
e da empresa Tropical Melhoramento Genético (Revista Rural, 2009).
Os cultivares TMG 801 e TMG 803 são resultado de sete anos de pesquisa do
Programa de Melhoramento Genético de Soja da Fundação MT e da empresa TMG. As
variedades as quais são caracterizadas pela “tecnologia Inox®” já foram disponibilizadas aos
produtores de sementes na safra de 2008/2009. As cultivares são adaptadas para o cultivo
no Estado de Mato Grosso (Fundação MT, 2010).
10
A tecnologia Inox® torna mais fácil a detecção da doença na planta. Quando atacada,
a planta terá uma reação de hipersensibilidade criando uma lesão escura que necrosa o
tecido foliar ao redor do ponto de incidência, eliminando a fonte de alimento do fungo e
evitando a multiplicação e esporulação. A lesão RB (Redish Brown) facilitará a detecção de
ferrugem asiática na lavoura e facilitará o manejo com aplicações de fungicidas (Fundação
MT, 2010).
Resultado de 13 anos de pesquisa, a cultivar de soja BRSGO 7560 é portadora de
um gene maior recessivo, que confere resistência vertical à ferrugem. Avaliada em estufas e
em condições de campo, a cultivar apresentou reação de resistência à doença, resultando
na formação de lesões escuras. Como a BRSGO 7560 apresenta resistência vertical à
ferrugem asiática, a cultivar está sujeita à quebra dessa resistência devido à variabilidade
genética do fungo Phakopsora pachyrhizi, causador da doença. Por isso, o seu uso não
exclui a necessidade do produtor seguir as atuais recomendações técnicas para o manejo
da doença. As sementes serão disponibilizadas para a safra de 2010/2011 (EMBRAPA,
2010).
Nenhum dos cultivares garante que a lavoura fique imune ao fungo. Continua
necessária a aplicação do fungicida e de outras práticas de manejo. Desta forma, a busca
de novos genes para o melhoramento da planta e a produção de um cultivar que seja
totalmente resistente ao patógeno é crucial para a diminuição dos custos e prejuízos na
lavoura.
2.2. Fatores de transcrição
Estresses abióticos (temperatura, seca) e bióticos (patógenos) causam as maiores
perdas na produtividade da agricultura mundial. Segundo levantamento do Consórcio
Antiferrugem, a ferrugem asiática custa para o produtor brasileiro cerca de U$ 2 bilhões, por
safra (EMBRAPA, 2009).
Estresses bióticos são resultados de uma bateria de pragas em potencial: fungos,
bactérias, nematóides e insetos, capazes de interceptar os fotoassimilados produzidos pelas
plantas e os vírus que usam o maquinário de replicação do hospedeiro. As plantas, por sua
vez, desenvolveram mecanismos sofisticados para perceber tais ataques, e para traduzir
essa percepção em uma resposta adaptativa (Dangl et al., 2001).
O desenvolvimento e a diferenciação das plantas são programados primeiramente
no nível de transcrição gênica, que é controlado por fatores de transcrição e outras
11
proteínas que recrutam ou bloqueiam o acesso da RNA polimerase ao DNA (Udvardi et al.,
2007).
As plantas possuem grande parte do genoma codificando proteínas envolvidas na
transcrição e sua regulação. Aproximadamente 7% do genoma de Arabidopsis codificam
sequências de fatores de transcrição, o que comprova a complexidade da regulação
transcricional nesses organismos (Udvardi et al., 2007).
Fatores de transcrição são proteínas regulatórias que modulam a expressão de um
grupo específico de genes através de ligação sequência-específica com o DNA e interações
proteína-proteína. Eles interagem com a maquinaria geral de transcrição, proteínas de
remodelação de cromatina e/ou com outros fatores de transcrição. Podem atuar como
ativadores ou repressores da expressão gênica, mediando tanto o acréscimo ou decréscimo
do acúmulo do RNA mensageiro (Latchman, 2003). Um fator de transcrição vegetal típico
contém, com poucas exceções, uma região de ligação ao DNA, um sítio de oligomerização,
um domínio de regulação da transcrição e um sinal de localização nuclear (Liu et al., 2001).
Segundo o banco de dados de fatores de transcrição de Arabidopsis (DATF, 2010)
existe um total de 2290 fatores de transcrição, divididos em 64 famílias. A classificação dos
fatores de transcrição depende de suas características estruturais e as famílias são, às
vezes, subdivididas de acordo com o número e o espaçamento dos resíduos conservados
dos domínios mais similares (Liu et al., 2001).
As sequências de fatores de transcrição são conservadas entre as espécies e um
fator conservado que responde a um determinado estímulo em uma espécie, provavelmente
vai responder ao mesmo estímulo nas outras espécies. Estudos com a família NAC de
fatores de transcrição demonstram a ligação direta entre similaridade de sequências com
similaridade de funções (Pinheiro et al., 2009). Vários genes de famílias distintas de fatores
de transcrição estão ligados à resposta da planta ao ataque de patógenos (Zhang et al.,
2009; Desveaux et al., 2004; Singh et al., 2002; Dröge-Laser et al., 1997).
2.3. Eventos de duplicação múltiplos
O genoma da maioria, senão de todas, as angiospermas sofreu eventos de duplicação
durante sua evolução. O impacto desses eventos de poliploidia é pouco conhecido, assim
como o destino dos genes duplicados (Innes et al., 2008).
Um comportamento comum aos poliplóides estabelecidos é a sua diploidização, ou seja,
apesar de terem mais de dois genomas, iguais ou semelhantes, a tendência é que, ao longo
do tempo, passem a comportarem-se como diplóides (Ramsey & Schemske, 2002).
12
Ao nível gênico, a duplicação gênica é a consequência imediata da poliploidização
(Wendel, 2000). Todas as informações recentes mostram que a diploidização ocorreu por
uma ampla reestruturação genômica, com alterações e mudanças ao nível gênico, incluindo
evolução coordenada, silenciamento gênico, reestruturação cromossômica, ação de
transposons e novos padrões de expressão gênica (Wolfe, 2001).
Genes duplicados por poliploidia podem reter sua função original ou similar, sofrer
diversificação na função ou na regulação ou uma das cópias pode ser silenciada através de
mutação ou mudanças epigenéticas. Genes duplicados podem também interagir através de
recombinação interlocos, conversão gênica ou evolução coordenada. Duplicação gênica e
conseqüente silenciamento são dois dos aspectos mais marcantes da evolução por
poliploidia, mas as taxas de silenciamento são mais baixas do que o esperado pelos
modelos de genética de populações, pela possibilidade de manutenção de uma função
similar, aquisição de novas funções e interação entre genes duplicados (Wendel, 2000). Em
alguns poliplóides os genes duplicados podem sofrer uma divergência imediata de função
(Otto, 2003).
A soja teve seu genoma duplicado pelo menos duas vezes, uma delas ocorreu por volta
de 10 a 14 milhões de anos atrás e a outra, mais antiga, provavelmente de 50 a 60 milhões
de anos atrás (Shoemaker et al., 2006). Dos 46.430 genes seqüenciados de soja, 31.264
apresentam parálogos recentes e 15.166 são de cópia única. No total de 5.671 possíveis
fatores de transcrição preditos no genoma da soja, 9,5% deles são duplicados (Schmutz et
al., 2010).
Os eventos poliploidia da soja e consequente duplicação gênica podem levar a erros de
interpretação do nível de expressão gênica. Genes que foram duplicados devem ser bem
analisados e fatores como similaridade de funções e regulação devem ser levados em conta
para que seu nível de expressão seja corretamente exposto.
2.4. Bancos de dados como ferramenta para o melhoramento de plantas
Uma solução para aumentar a produtividade dos cultivares é desenvolver plantas
baseando-se no entendimento molecular das funções gênicas e das vias regulatórias
envolvidas na tolerância ao estresse, desenvolvimento e crescimento (Takeda et al., 2008).
O progresso recente em genômica de plantas permite a identificação e isolamento de genes
importantes para analisar funções que regulam a produtividade e tolerância a estresses
ambientais (Mochida et al., 2010).
13
A identificação, caracterização e classificação dos fatores de transcrição de genomas
irão proporcionar uma fonte importante para pesquisadores interessados em estudar a
regulação da expressão gênica (Mochida et al., 2009). Menos de 1% dos fatores de
transcrição foram geneticamente e funcionalmente caracterizados em leguminosas (Udvardi
et al., 2007).
Com a recente publicação do genoma da soja (www.phytozome.net) a identificação,
o isolamento e a análise funcional de importantes genes serão acelerados. Essa ferramenta
será importante para o estudo de genes regulatórios envolvidos na produtividade da planta,
qualidade da semente, fixação de nitrogênio e percepção/resposta e adaptação às
mudanças do ambiente (Mochida et al., 2009).
O desenvolvimento de recursos “ômicos” (genômica, proteômica, metabolômica) e o
conjunto de dados de várias espécies, permitem a comparação das propriedades “ômicas”
entre as espécies. Isso promete ser um meio eficiente de encontrar evidências de funções
gênicas que são evolucionariamente conservadas. Plataformas de bioinformática tornaramse ferramentas essenciais para acesso aos conjuntos de dados “ômicos” e para a mineração
e integração eficiente dos conhecimentos (Mochida et al., 2010).
A criação de um banco de dados de fatores de transcrição de soja é crucial para o
entendimento das relações de regulação da expressão gênica durante a adaptação do
vegetal frente a condições de estresses bióticos. Dois bancos de dados já foram criados:
SoybeanTFDB (Mochida et al., 2009) e o SoyDB (Wang et al., 2010).
(A) SoybeanTFDB (http://soybeantfdb.psc.riken.jp/index.pl)
Banco de dados público, hospedado pelo RIKEN Plant Science Center, que fornece
5035 predições de fatores de transcrição codificados por sequências gênicas anotadas no
genoma da soja – modelo Glyma1.0 – do Phytozome (Mochida et al., 2009).
A busca por sequências específicas de ligação ao DNA de fatores de transcrição foi
realizada utilizando 51 modelos ocultos de Markov (HMMs) do banco de dados do Pfam,
além de 11 modelos originalmente criados através do HMMbuild1 do pacote HMMER2. De
todo o genoma da soja 6,56% foi predito como codificante de fatores de transcrição
(Mochida et al., 2009).
Os fatores de transcrição foram classificados em 61 famílias baseado na presença
de domínios específicos para cada família descrita anteriormente para Arabidopsis (Mochida
et al., 2009).
14
(B) SoyDB (http://casp.rnet.missouri.edu/soydb/)
Banco de dados apoiado pelo National Science Foundation (NSF) e pela
Universidade do Missouri que fornece 6665 sequências de fatores de transcrição separados
em 64 famílias baseadas no genoma da soja do Phytozome (Wang et al., 2010).
O programa InterProScan (Zdobnov et al., 2001) foi utilizado para uma busca
sistemática dentro dos bancos de dados do InterPro usando a metodologia correspondente
de cada banco para localização de domínios específicos. As proteínas preditas contendo
domínios relatados como de fatores de transcrição foram consideradas como tal. Uma
triagem manual foi realizada utilizando como referência o banco de dados PlnTFDB (RiañoPachón et al., 2007) e os fatores de transcrição de Medicago truncatula para eliminar
sequências erroneamente classificadas (Wang et al., 2010).
Para a classificação em famílias, as sequências de fatores de transcrição de cada
uma das 64 famílias de Arabidopsis foram alinhadas através do programa MUSCLE (Edgar,
2004). O alinhamento múltiplo originado foi então utilizado como input do programa SAM
3.52 para construção do modelo oculto de Markov (HMM), ou seja, predição de domínios
específicos que identificam cada família. Cada sequência de fator de transcrição de soja foi
alinhada com cada um dos 64 HMMs e o alinhamento que resultou em um menor e value foi
considerado como de melhor desempenho e a sequência foi então classificada como sendo
daquela família (Wang et al., 2010).
A criação de um banco consenso abrangendo o máximo de sequências possíveis e
não redundantes facilitaria a compreensão dos fatores de transcrição em soja.
1
2
http://www.csb.yale.edu/userguides/seq/hmmer/docs/node19.html
http://compbio.soe.ucsc.edu/sam.html
15
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
O trabalho teve como objetivo geral a criação de um banco de dados consenso de
fatores de transcrição com o maior número de sequências possíveis e utilizá-lo para a
identificação de genes possivelmente ligados na resposta à ferrugem.
3.2. Objetivos Específicos
•
criação softwares para facilitar a análise e organização dos dados;
•
desenvolvimento um banco de dados (LBM) de fatores de transcrição;
•
comparação o banco de dados criado e o SoybeanTFDB e SoyDB;
•
criação um banco consenso (SoyLBM);
•
identificação na literatura fatores de transcrição de outras espécies vegetais
comprovadamente ligados na defesa contra patógenos/ferrugem;
•
criação cladogramas para seleção de genes do banco consenso possivelmente
ligados na resposta à ferrugem;
•
validação dos genes selecionados por RT-qPCR.
16
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Desenvolvimento de softwares
Para facilitar a análise do resultado do BLAST local (Altschul et al., 1990), a criação
do banco de dados LBM, o consenso e a comparação entre o banco de dados criado e os
existentes, dois softwares foram desenvolvidos, BRa – BLAST Results Analysis e o Venn
Diagram For Proteins, em parceria com o Engenheiro Filipe Guerra Soares.
Os programas foram desenvolvidos na plataforma Borland Delphi, na linguagem
Pascal para Windows. O registro do software BRa foi publicado na revista do Instituto
Nacional de Propriedade Intelectual (INPI) no dia 03 de novembro de 2010 (processo
número 10991-1).
4.2. Desenvolvimento do banco de fatores de transcrição
As sequências de ESTs de fatores de transcrição de soja foram obtidas do banco de
dados Soybean Transcription Factor Database¹ e as sequências do genoma da soja foram
obtidas do banco de dados Phytozome². Um BLASTX local foi realizado com e value de 1e05 entre os bancos.
As sequências foram organizadas em famílias de acordo com a separação do banco
Soybean Transcription Factor Database.
Utilizando o software BRa, o resultado do BLAST foi tratado e organizado numa lista,
formando o banco de dados de fatores de transcrição - LBM.
4.3. Comparação entre os bancos de dados e criação do banco consenso
Para a comparação entre os três bancos foi utilizado o software Venn Diagram For
Proteins, que identifica sequências comuns entre os bancos e cria um Diagrama de Venn
com os dados.
Todas as sequências foram agrupadas, sem redundância para a criação do banco de
dados consenso.
¹ http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn:9010/web/index.php?sp=gm
² ftp://ftp.jgi-psf.org/pub/JGI_data/phytozome/v5.0/Gmax/annotation
17
4.4. Análise das sequências únicas do banco de dados LBM
E value é um valor que mostra o quanto a sequência, ou parte dela, é parecida com
a sequência de entrada. Um e value baixo pode significar apenas que parte da sequência
(um domínio, por exemplo) é parecida com a sequência de entrada e, por isso, fatores como
a cobertura e identidade devem ser levadas em consideração no resultado do BLAST. Como
o e value foi o único ponto de corte considerado para o desenvolvimento do banco LBM, as
sequências identificadas como únicas para este banco de dados foram analisadas através
de um BLAST realizado com o programa BLASTcl3 contra o banco de dados do NCBI, para
diminuir as contaminações provenientes de um ponto de corte baixo. Os parâmetros
utilizados no programa foram: programa utilizado tblastn (-ptblastn), banco de dados não
redundante (-dnr), e value e-10 (-e10), 20 descrições (-v20) e 1 alinhamento (–b1). No
comando de linha do programa BLASTcl3: blastcl3 –ptblastn –dnr –e10 –v20 –b1 –i(input
file) –o(output file). Todas as sequências que obtiveram resultados no BLAST como fator de
transcrição de qualquer organismo foi considerado como tal.
4.5. Busca de fatores de transcrição já identificados como ligados na resposta à
ferrugem
Uma busca textual foi feita no NCBI1 para identificação de fatores de transcrição já
documentados por estarem envolvidos na defesa contra patógenos em especial à ferrugem
de diferentes espécies. Os textos “transcription factors”, “rust”, “pathogen” e “soybean” foram
combinados de maneira a buscar as proteínas de interesse.
4.6. Criação de cladogramas das famílias e identificação de possíveis genes
ligados na resposta à ferrugem
Utilizando ferramentas do pacote CLC Main Workbench foi feito um alinhamento
acurado entre as sequências de fatores de transcrição, separados por famílias e as
sequências mineradas pelo NCBI comprovadamente ligadas à defesa contra patógenos e
ferrugem. Para o alinhamento foram utilizados os parâmetros padrões do programa (gap
open cost de 10; gap extension cost de 1). Os cladogramas foram construídos utilizando o
algoritmo Neighbor Joining e 100 repetições.
1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
18
4.7. Comparação entre os genes candidatos e biblioteca subtrativa
Utilizando o portal do Consórcio GENOSOJA1 foi realizado um BLAST dos genes
candidatos com a biblioteca subtrativa de genes diferencialmente expressos durante a
infecção pela ferrugem na tentativa de identificar se alguns genes já foram caracterizados
pelo grupo do GENOSOJA.
4.8. Montagem de oligonucleotídeos para RT-qPCR
Sequências do mesmo grupo ou alinhadas próximas nas árvores filogenéticas foram
selecionadas para montagem dos oligonucleotídeos para o RT-qPCR. O programa
Primer3Plus2 foi utilizado para desenho dos oligonucleotídeos, utilizando como parâmetros:
tamanho final dos produtos de 100-150, tamanho do oligonucleotídeo de 18-20-22, Tm do
oligonucleotídeo de 59-60-61, e porcentagem de GC do oligonucleotídeo de 40-50-60.
Oligonucleotídeos para duas sequências de genes constitutivos (Actina e GAPDH1)
foram desenhados para serem usados como calibradores endógenos.
Quadro 1 – Oligonucleotídeos direito e reverso dos genes analisados neste estudo.
Gene
Nome
Oligonucleotídeo Direito
Oligonucleotídeo Reverso
Actina
Actina
GAGACATCCGAGACCAGCTC
AATGCCTGATGCTTCCATTC
GAPDH1 GCATCGGAGGGAAGTATGAA
AATGCATGATGGTGGCATAC
GAPDH1
1
2
Glyma06g08390.1
bZIPA
CTTACCGGATGCGATGACTT
TCAATGGTTGCAGTGATGGT
Glyma03g40730.1
bZIPB
GTTGGGAGGCATTTCTTCAA
CCAGGCTAGCCACTCTATGC
Glyma20g36750.2
bZIPC
CCAAACTTCCTCCCAGATGA GGAAGAAGACGGAGGAGAGG
Glyma13g36870.1
bZIPD
GCTTCCACCAACCATCTTGT
GCATTGGCTTTCAACCTCAT
Glyma05g30170.1
bZIPE
ACAGACACAGCCACAACAGC
GTCTTGCCCTGAATTGGTGT
Glyma12g36540.4
MBF1A
TTCACAAGCCACAGTTCAGC
TCCTTTTTCCCATTTGCTTG
Glyma01g18320.1
MBF1B
CCCACCGCAATTCACTACTT
CCTCCCATAGCCACAGTTTC
Glyma02g02440.2
WhyA
AAAAACCTGCGAACATGGAG
TGGAGTTTCCAAAGGCATTC
Glyma08g40850.4
WhyB
AGCTTCACTCTCCTCCACCA
AAAAAGGGTGGTTTGGGAAT
Glyma08g23380.4
WRKYA
AGCTGCCCTGTCAAAAAGAA
AACCAAGGGTCACACTACGG
Glyma17g33920.1
WRKYB
AAAACACACCCCAAGGATGA
AAATGGGAGCCATGTAGCAC
Glyma01g06550.1 WRKYC
AAGCGCTCAAAAGACACCAT
GATGATCAGCTGTTGCCTGA
Glyma19g36100.1 WRKYD
AAGCCAGCAATGAATCAACC
GTTTTGCCGTTGGCTTGTAT
Glyma14g11960.1
WRKYE
CTGGGTGATGGAGTTTTGGT
TGCTTTTGCAGAGCCTTGTA
Glyma10g00900.1
ZF-HDA
TGAGCGCGATATTGAACAAG
TCAGGGCGCAAGTATCTTCT
Glyma08g24970.1
ZF-HDB
TCCAGTCTCGAGGCAAGTTT
AAGCAGATGGCGTACAAACC
http://bioinfo03.ibi.unicamp.br/soja/
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/oligonucleotídeo3plus/oligonucleotídeo3plus.cgi
19
4.9. Síntese de cDNA para RT-qPCR
Os RNAs utilizados no trabalho foram cedidos pelo Consórcio do GENOSOJA. Para
isto foram infectadas plantas resistentes (PI561356) e suscetíveis (EMBRAPA48) à ferrugem
asiática. A infecção foi induzida através da pulverização de uma suspensão de esporos
(3x105 esporos/mL) em plantas nos estágios V2 para V3 de crescimento em triplicata. Após
12, 24 e 48 horas de inoculação as folhas das plantas foram coletadas para extração de
RNA.
A qualidade das amostras foi avaliada em gel de agarose 1% os RNAs foram
quantificados em espectrofotômetro a 260nm, utilizando a relação 40µg/mL de RNA por
unidade de densidade óptica (Figura 6).
Para a síntese dos cDNAs, 4µg de cada RNA foi tratado com DNAse (RQ1 DNAse
Promega – 1µL/2µg de RNA) segundo protocolo do fabricante. Quatro microlitros do RNA
tratado foram utilizados para a síntese de cDNA utilizando o kit ImProm II Reverse
Transcription System (Promega), de acordo com as recomendações do fabricante. As
amostras de RNA das diferentes condições foram incubadas como 1µL de oligodT a 70oC
por 5min e, em seguida, incubadas a 4oC por 5min. Posteriormente, foram adicionados
tampão de reação ImProm II 1X, MgCl2 3mM, mix de dNTPs (0,5mM de cada), 1U/µL de
inibidor de ribonuclease RNAseOUT e enzima transcriptase reversa ImProm II (200U). As
amostras foram incubadas a 25oC por 5min, para anelamento dos oligonucleotídeos, 42oC
por 60min para extensão da fita de DNA e a 70oC, por 15min, para a inativação da
transcriptase. Os cDNAs obtidos foram armazenados a -20oC.
4.10. RT-qPCR
As reações de PCR em tempo real foram feitas utilizando o aparelho ABI Prism 7500
Sequence Detection System (Applied Biosystems). Baseado nos valores de Ct (Clycle
threshold), que é o ponto em que a fluorescência aumenta apreciavelmente acima da
fluorescência ruído, foi realizado a quantificação relativa pelo método 2-∆Ct descrito por Livak
e Schmittgen (2001). A detecção foi realizada pelo sistema SYBR Green Master Mix
(Applied Biosystems), sendo que o gene que codifica a actina e GAPDH1 foram utilizados
como normalizadores para a quantificação dos genes alvo bZIPB, bZIPE, MBF1B, WhyB,
WRKYA e WRKYC.
As amostras foram analisadas em três repetições biológicas, quantificadas em
corridas independentes, sendo cada amostra analisada em duplicata em cada placa de
20
reação. As análises de quantificação relativa de cada gene foram feitas em tubos
individuais.
Inicialmente foi feito um ensaio para a determinação da eficiência da reação. O teste
de eficiência foi realizado em diluições seriadas de 100, 10-1, 10-2 e 10-3 do cDNA. Para o
cálculo do valor de coeficiente angular da reta (slope) foi utilizada a fórmula Eficiência PCR
= (10(1/-slope)-1)x100. Após 40 ciclos de amplificação todas as amostras foram submetidas à
desnaturação gradual para elaboração da curva de dissociação (melting). As amostras
foram aquecidas com incremento de 1oC durante 30seg, partindo de 60oC até atingir o limite
de 94oC.
As condições de amplificação para todos os sistemas foram 50oC por 2min, 95oC por
10min, 40 ciclos de desnaturação a 95oC durante 30seg e anelamento e extensão a 60oC
durante 30seg.
21
Figura 6 – Gel de agarose 1% mostrando a qualidade e a concentração (µg/µL) do RNA.
22
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. BRa – BLAST Results Analysis
O BRa (Figura 7) é um software que foi desenvolvido para auxiliar a organização e
análise dos dados gerados pelo BLAST local (Altschul et al., 1990). O programa ordena o
resultado do BLAST gerando uma lista no formato FASTA que pode ser usada como banco
de dados e para outras análises em outros softwares que requerem o formato FASTA. A
organização dos resultados em formato FASTA facilita a utilização e análise dos dados em
outros programas, já que este formato é o mais utilizado atualmente.
A
B
Figura 7 – (A) Tela inicial do programa. (B) Exemplo de um arquivo de saída do BLAST local. Em destaque a
sequência de entrada (1) e os resultados (2).
5.1.1. O aplicativo e os arquivos de entrada
O programa BRa utiliza três arquivos de entrada (Figura 8), sendo dois deles
opcionais:
a) .bst – é o arquivo de saída do BLAST local e arquivo de entrada principal, este é o
resultado que o BRa irá organizar de maneira simplificada;
b) .fa – arquivo contendo as sequências usadas como banco de dados para
comparação feita com o BLAST, este arquivo é opcional e recomenda-se utilizá-lo
quando se deseja obter a lista de resultados em conjunto com as sequências;
23
c) .gen – arquivo contendo sequências com a separação em famílias ou blocos, este
arquivo é opcional e recomenda-se utilizar quando os genes podem ser separados
em famílias.
Todas as extensões (.fa, .bst, .gen) são arquivos de texto simples, sem formatação.
Figura 8 – Interface gráfica do programa mostrando onde pode selecionar os inputs (.bst, .fa e .gen), assim como
escolher retirar ou não as sequências redundantes ou incompletas, o nome do arquivo de saída ou inserir as
sequências de entrada no output.
5.1.2. Processamento dos dados
O programa possui um arquivo de saída básico com uma lista dos resultados do
BLAST. O programa lê o arquivo de saída do BLAST (.bst) e reconhece as sequências de
entrada e os resultados que produziram alinhamento significante, compilando os resultados
e organizando numa lista as sequências de entrada com os resultados correspondentes
(Figura 08).
O programa pode também ser usado com um segundo arquivo de entrada - .fa – que
contém as sequências dos resultados - o BRa organiza as sequências dos resultados no
formato FASTA para que o usuário possa usar o arquivo de saída para análises futuras.
BRa pode também analisar os dados obtidos, buscando sequências completas ou
repetidas. O programa lê todas as sequências anotadas e apaga todas as que não estão
completas (não possuem o códon de iniciação ATG ou um dos códons de terminação TGA,
TAA ou TAG). Esta opção só funciona para sequências de nucleotídeos. As sequências
redundantes também podem ser removidas do arquivo de saída.
24
A separação das sequências em famílias pode ser feita com o 3º arquivo de entrada
(.fa). O usuário pode gerar uma lista com os sequências de entrada separados em famílias
para a análise e diferenciação dos resultados em famílias a partir dos sequências de
entrada.
O programa possui também a opção de organização dos dados tabelados
provenientes do BLAST. O BLAST pode gerar um arquivo de saída tabelado, usando o
comando “-m”, mas este resultado é desorganizado, sem títulos. O BRa organiza esses
dados em uma tabela mais simples de visualizar (Figura 9).
Figura 9 – Exemplo de um arquivo de saída tabelado do BRa
5.1.3. Arquivo de saída
O arquivo de saída do programa possui uma lista de resultados do BLAST. Esta lista
pode conter as sequências em formato FASTA, sem repetições, completas e separadas por
famílias, dependendo da necessidade do usuário (Figura 10).
25
A
B
C
D
Figura 10 – Exemplos de arquivos de saída do BRa. (A) Lista simples em modo FASTA com todos os resultados.
(B) Lista dos resultados separados pelas sequências de entrada. (C) Lista dos resultados separados pelas
sequências de entrada e em famílias. (D) Resultado mais completo, separado em famílias, mostrando as
sequências de entrada dos resultados.
26
5.2. Venn Diagram For Proteins
Venn Diagram For Proteins é um software para comparação entre o banco de dados
criado (LBM) e os bancos existentes (Figura 11).
A
B
Figura 11 – (A) Tela inicial e (B) Interface gráfica do programa Venn Diagram For Proteins.
5.2.1. Arquivo de entrada
Os arquivos de entrada devem conter uma lista de sequências em formato FASTA,
cada banco deve estar organizado em uma pasta e os arquivos a serem comparados devem
ter o mesmo nome dentro das pastas separadas e as pastas devem conter o mesmo
número de arquivos.
5.2.2. Processamento de dados e arquivo de saída
O programa atua de maneira simples, identificando as sequências comuns entre dois
ou três bancos e montando um output mostrando a quantidade de interseções e listando
todas as sequências não redundantes entre todos os bancos; gerando assim um banco de
dados consenso e mais completo a partir dos bancos iniciais.
O arquivo de saída do programa é um arquivo de texto simples, sem formatação
(.txt).
27
5.3. Desenvolvimento do banco de fatores de transcrição, comparação com os
outros bancos e criação do banco consenso
O banco de dados LBM, criado utilizando o BRa, possuí 4429 sequências. Quando
comparadas com as sequências dos bancos SoyDB e SoybeanTFDB, utilizando o programa
Venn Diagram For Proteins, foram identificadas 574 sequências específicas do banco LBM e
3855 sequências comuns com os outros bancos (Figura 12A).
A
B
Figura 12 – Diagramas de Venn mostrando a comparação entre os três bancos e quantas sequências de
interseção existem entre eles (A) antes e (B) depois de analisar as sequências únicas do banco LBM.
Do total de sequências não redundantes, 34,09% são sequências específicas de um
dos bancos e 65,91% são sequências comuns entre os três bancos.
As 574 sequências que foram identificadas como únicas para o banco LBM foram
submetidas a um BLAST contra o banco de dados do NCBI através do programa BLASTcl3.
28
Apenas as 119 sequências (Figura 12B) que obtiveram resultados diretos como fatores de
transcrição foram considerados como tal. Neste teste, muitas sequências obtiveram
resultados apenas com proteínas hipotéticas, putativas ou desconhecidas e elas foram
desconsideradas como fatores de transcrição e, portanto, muitos fatores podem ter sido
descartados neste teste subestimando o banco. Dentre as principais contaminações estão
proteínas de aquoporinas, celulases e beta tubulinas, que podem conter regiões com função
de fatores de transcrição em sua sequência, mas isso só poderia ser visualizado
experimentalmente.
Para a criação do banco consenso (SoyLBM), foram somadas todas as sequências, sem
redundância, criando um banco com 7202 sequências, 7,46% a mais de sequências do que
o banco SoyDB (Wang et al., 2010) e 30,09% a mais que o banco SoybeanTFDB (Mochida
et al., 2009).
5.4. Busca de fatores de transcrição responsivos à ferrugem asiática
Na busca textual utilizando o NCBI, oito proteínas se destacaram como ligadas à
defesa contra patógenos ou à ferrugem. Estas oito proteínas estão classificadas em cinco
famílias de fatores de transcrição e pertencem a cinco organismos diferentes (Quadro 02).
A proteína TaMBF1a, da família MBF1 de Triticum aestivum L. é super expresso
quando a planta é infectada com Puccinia striiformis f. sp.tritici (Zhang et al., 2009); StWhy1,
da família Whirly de Solanum tuberosum está ligado a resistência ao patógeno Phytophthora
infestans (Desveaux et al., 2004); membros específicos da família WRKY mostram maior
expressão e ligação ao DNA após a indução por patógenos, sinais de defesa e ferimento
(Singh et al., 2002); G/HBF-1, da família bZIP de Glycine max está ligado a resistência a
Pseudomonas syringae pv. Glycinea (Dröge-Laser et al., 1997).
29
Quadro 2 – Resultado da busca textual no NCBI, mostrando os genes ligados na resposta à ferrugem e a defesa
contra patógenos e as famílias que eles pertencem.
Nome
Família
Função
Espécie
Referência
G/HBF-1
bZIP
Defesa contra patógenos
Glycine max
Dröge-Laser et al. (1997)
TabZIP
bZIP
Defesa contra ferrugem
Triticum aestivum
Não publicado (GenBank: GQ266689.1) (2009)
TaMBF1
MBF1
Defesa contra ferrugem
Triticum aestivum
Zhang et al. (2009)
AtWhy1
Whirly
Defesa
Arabidopsis
Desveaux et at. (2005)
PBF-2
Whirly
Defesa contra patógenos
Solanum tuberosum
Desveaux et at. (2005)
WRKY4
WRKY
Defesa contra patógenos
Arabidopsis
Lai et al. (2008)
HvWRKY3
WRKY
Defesa contra patógenos
Hordeum vulgare
Mangelsen et al. (2008)
TaZF1
ZF-HD
Defesa contra ferrugem
Triticum aestivum
Não publicado (GenBank: HM037188.1) (2010)
Durante a busca textual, não foi identificado nenhum trabalho que estude a interação
dos fatores de transcrição em resposta à ferrugem na soja o que torna o presente trabalho
muito importante para o entendimento do controle da expressão gênica durante o
estabelecimento da infecção pelo fungo P. pachyrhizi.
5.5. Cladogramas e identificação de possíveis genes responsivos à ferrugem
Cladogramas para cada família foram criados e mostraram uma alta correlação entre
a maioria das sequências, evidenciada pelos altos valores de bootstraps dando suporte aos
clados (Figura 13).
A
30
B
C
D
E
Figura 13 – Partes dos cladogramas mostrando as sequências que se agruparam mais próximas às proteínas
comprovadamente ligadas à defesa contra patógenos. (A) Família bZIP (B) Família ZF-HD (C) Família Whirly (D)
Família MBF1 (E) Família WRKY. Em destaque, as proteínas do banco consenso selecionadas como possíveis
candidatos.
31
Os genes candidatos foram escolhidos por estarem no mesmo clado onde está o
gene minerado na busca textual e uma ou mais sequências de clados vizinhos. Assim,
dezesseis genes candidatos (Figura 14) foram escolhidos para a validação por RT-qPCR.
Figura 14 – Localização dos dezesseis genes candidatos dentro dos bancos de dados.
5.6. Comparação dos genes candidatos com a biblioteca subtrativa
Os dezesseis genes candidatos foram comparados com a biblioteca subtrativa –
biblioteca que contém os genes diferencialmente expressos quando a planta é infectada –
do GENOSOJA e quatro deles deram resultados significativos.
Quadro 3 – Resultado do BLAST
Gene
Nome
Resultado
e value
Glyma03g40730.1
bZIPB
SJ23-E2-002-L11-F02-ES.F
0.0
Glyma20g36750.2
bZIPC
SJ23-E2-002-L11-F02-ES.F
e-103
Glyma01g06550.1 WRKYC SJ23-E2-023-L10-H12-ES.F
e-126
Glyma08g40850.4
2e-43
WhyB
SJ23-E2-010-L11-B04-ES.F
O gene bZIPB obteve um resultado com e value de zero, indicando que,
provavelmente, este é o gene que está catalogado na biblioteca subtrativa do consórcio
como SJ23-E2-002-L11-F02-ES.F e, portanto, é responsivo à ferrugem, por ser
diferencialmente expresso quando a planta está infectada.
32
5.7. RT-qPCR
5.7.1. Eficiência da reação e seleção de oligonucleotídeos
Um dos dezoito genes testados não teve expressão (ZF-HDA), três tiveram baixa
expressão (bZIPD, GAPDH1 e WRKYD) e um obteve dois picos na curva de melting
(MBF1A), indicando dois amplicons, ou seja, o oligonucleotídeo não foi específico (Anexo I).
A análise destes cinco genes foi inicialmente descartada e serão desenhados novos
oligonucleotídeos para posteriores análises. Foram então selecionados para análise os
genes mais próximos do gene comprovadamente ligado na resposta à defesa de cada uma
das cinco famílias. E o gene bZIPB foi mantido devido a este gene já ter sido identificado
anteriormente pelo grupo GENOSOJA por ser induzido durante a infecção por P. pachyrhizi.
Portanto, os genes bZIPA, bZIPC, WhyA, WRKYB, WRKYE e ZF-HDB foram separados
para posterior análise. Os outros sete genes foram utilizados para análise de expressão, os
valores de eficiência e slope dos oligonucleotídeos destes genes estão representados no
Quadro 04 (as curvas padrão estão no Anexo II).
Quadro 4 – Valores de eficiência e slope dos oligonucleotídeos
Nome
Eficiência (%) Slope
Actina
90.52
-3.572
bZIPB
99.639
-3.313
bZIPE
92.38
-3.152
MBF1B
79.597
-2.214
WhyB
94.263
-3.192
WRKYA
93.772
-3.181
WRKYC
98.274
-3.364
5.7.2. Análises de expressão
A expressão dos genes foi avaliada em cultivares de soja resistente e suscetível após a
infecção pelo fungo P. pachyrhizi. O cultivar resistente não possui imunidade à doença, e
sim a infecção demora mais tempo para conseguir se estabelecer nesses cultivares.
Dois dos genes analisados (WhyB e bZIPE) apresentaram dois picos na curva de melting
(Anexo IV) apesar de terem apresentado um pico único no experimento de eficiência (Anexo
III). O que pode ser explicado pelo aumento da concentração de cDNA nesse experimento
ter sido ser quatro vezes maior (400ng) em relação ao experimento de eficiência da reação.
A maior quantidade de cDNA pode ter favorecido a amplificação de amplicons menores e
33
inespecíficos, inviabilizando a utilização dos resultados para a análise de expressão. Novos
oligonucleotídeos estão sendo desenhados para posterior análise destes genes.
As análises de expressão dos genes – bZIPB, WRKYA e WRKYC – mostram uma
indução tardia nos cultivares resistentes em comparação com a cultivar suscetível. Como o
estabelecimento da infecção ocorre tardiamente nos cultivares resistentes, os genes podem
estar sendo induzidos após o estabelecimento da infecção (Figura 16).
A
B
34
C
D
Figura 15 – Gráficos mostrando análise de expressão relativa dos genes (A) MBF1B, (B) bZIPB, (C) WRKYA e
(D) WRKYC. *A quantificação é relativa ao nível de expressão da actina.
Assim como o aumento da expressão dos genes da família WRKY após 24h (nos
cultivares suscetíveis) e 48h (nos cultivares resistentes) (Figura 16C e D), estudos
demonstram o aumento da expressão do gene Hvwrky3 de cevada após 20h de tratamento
com o patógeno Blumeria graminis (Mangelsen et al., 2008) e do gene Atwrky4 de
Arabidopsis após 48h da infecção,
com o patógeno Botrytis cinerea (Lai et al., 2008),
sugerindo que estes genes são condidatos a estudos mais avançados para determinar seus
papéis no estabelecimento da infecção pelo fungo P. pachyrhizi.
Sabe-se que o gene G/HBF1 de soja é estimulado após inoculação com
Pseudomonas syringae pv. glycinea (Dröge-Laser et al., 1997), esses dados são
consistentes com o aumento da expressão do gene da família bZIP após 24h de inoculação
35
no cultivar suscetível e 48h no cultivar resistente. Dados não publicados do consórcio do
GENOSOJA, cedidos pela Doutora Francismar Correa Marcelino, mostram que o gene
bZIPB tem aumento significativo da expressão em 48h de infecção no cultivar resistente
(PI561356), nas mesmas condições.
Os dados sugerem que os genes das famílias bZIP e WRKY selecionados por
similiaridade de sequência, podem possuir função de defesa similar aos genes pertencentes
as mesmas famílias de outros organismos.
Por causa dos eventos de duplicação do genoma, os níveis de expressão analisados
podem estar superestimados. Se os genes possuem parálogos de mesma função, regulados
pelo mesmo promotor, os niveis de expressão obtidos no experimento podem ser
representativos de dois ou mais genes. Uma análise mais acurada dos genes e dos seus
parálogos é necessária para o correto exame dos valores obtidos.
Na família MBF1, estudos demonstraram a indução do gene TaMBf1a de trigo tanto
nas interações compatíveis quanto incompatíveis com o patógeno Puccinia striiformis f.
sp.tritici (Zhang et al., 2009). O nível de expressão aumenta nas interações incompatíveis
após 18h de infecção e nas compatíveis, após 12h, mas o nível de expressão máxima nas
duas interações é estatisticamente igual. A família MBF1 demonstrou o mesmo
comportamento em relação aos cultivares resistentes e suscetíveis, o nível de expressão
não foi diferente (Figura 16A). O gene pode estar ligado a uma resposta mais geral à
infecções no vegetal, não necessariamente a esta infecção espcífica.
Os dados demonstram que os genes bZIPB, WRKYA e WRKYC são responsivos a
infecção e os cultivares resistentes possuem uma resposta tardia provavelmente porque a
infecção demora mais a se estabelecer.
36
6. CONCLUSÃO
Com o desenvolvimento deste trabalho foi possível:
•
a criação de dois softwares para facilitar a análise e organização dos dados;
•
o desenvolvimento de um banco de dados de fatores de transcrição (LBM);
•
a comparação entre o banco LBM e os existentes;
•
a criação de um banco consenso (SoyLBM);
•
a identificação na literatura de fatores de transcrição de outras espécies
comprovadamente ligados na defesa contra patógenos/ferrugem;
•
a criação de cladogramas para seleção de genes do banco consenso que
possivelmente são responsivos à ferrugem;
•
a validação de quatro genes por RT-qPCR.
Os dados demonstram que o gene MBF1B pode estar ligado a uma resposta mais
geral a infecções por não possuir diferença de expressão entre os dois cultivares. Mas as
diferenças de expressão dos genes bZIPB, WRKYA e WRKYC demonstram que eles são
responsivos a infecção quando esta já está estabelecida e são candidatos a estudos
funcionais mais aprofundados, como obtenção de plantas transgênicas super-expressando
ou nocaute para o estudo destes genes na resposta a infecção pelo fungo P. pachyrhizi.
37
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Characterization of a MBF1 Transcriptional Coactivator Factor in Wheat Induced by
Stripe Rust Pathogen. ACTA Agronomica Sinica, v.35:1, p.11-17 – 2009.
42
Anexos
ANEXO I
Curvas de amplificação do experimento de eficiência da reação
(A) Curva de amplificação mostrando a não expressão do gene ZF-HDA.
(B) Curvas de amplificação mostrando a baixa expressão dos genes bZIPD,
GAPDH1 e WRKYD respectivamente.
43
Anexos
(C) Curva de melting evidenciando os dois picos do gene MBF1A.
(D) Exemplo da uma curva de amplificação do gene bZIPB utilizado no trabalho.
44
Anexos
ANEXO II
Curva padrão da eficiência dos oligonucleotídeos no RT-qPCR
Actina
bZIPB
bZIPE
MBF1B
WhyB
WRKYA
45
Anexos
WRKYC
46
Anexos
ANEXO III
Curvas de melting dos experimentos de eficiência (A) bZIPE e (B) WhyB
A
B
*Valores de Tm: (A) 79,34oC e (B) 74,13oC.
47
Anexos
ANEXO IV
Curva de melting dos oligonucleotídeos (A) bZIPE e (B) WhyB
A
B
*Valores de Tm: (A) 79,47 oC e (B) 78,87oC.
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