naiana da rosa a suplementação de ácido graxo

Transcrição

NAIANA DA ROSA
A SUPLEMENTAÇÃO DE ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO ÔMEGA-3 E OS
EFEITOS SOBRE A ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA EM UM MODELO
EXPERIMENTAL DE AUTISMO
TUBARÃO
2015
NAIANA DA ROSA
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde como requisito para obtenção
do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Jucélia Jeremias Fortunato, Dra.
TUBARÃO
2015
NAIANA DA ROSA
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde como requisito para obtenção
do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Tubarão, 01 de outubro de 2015.
_______________________________________________________
Orientadora: Profa Jucélia Jeremias Fortunato, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina
_______________________________________________________
Profa. Gislaine Tezza Rezin, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina
_______________________________________________________
Prof. Fabricio Pagani Possamai, Dr.
Faculdades Esucri
Dedico este trabalho, especialmente a
minha mãe in memoriam, pelo exemplo
de pessoa e por me incentivar sempre.
Estaremos sempre juntas, mesmo não
estando perto, te amo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me acompanhar nessa jornada, iluminar meus
caminhos e ser meu refúgio e fortaleza nos momentos mais difíceis.
À Profa. Dra. Jucélia Jeremias Fortunato, pela orientação, ensinamentos,
pela dedicação e acima de tudo, pela pessoa magnifica que és, que nos faz ter amor
pela pesquisa, muito obrigada pelo carinho, amizade e poder me deixar participar da
sua vida e fazer com que eu me tornasse uma pessoa melhor.
À Profa. Dra. Patrícia Alves Reis e ao Laboratório de Imunofarmacologia IOC - Fundação Oswaldo (FIOCRUZ), pela realização das análises neuroquímicas.
Aos Professores do PPGCS da UNISUL, em especial à Prof.ª Dr.ª
Gislaine Tezza Rezin pela amizade, auxílio e pelos conhecimentos repassados.
Aos professores que atuaram como membros das bancas em que o
projeto de pesquisa foi apresentado e qualificado, pelas boas arguições e pelos
direcionamentos propostos.
As colaboradoras da UNISUL, responsáveis pela secretária do PPGCS
Silvane e Francieli, pela atenção com os alunos, dedicação, pelo carinho, amizade.
Aos meus colegas e parceiros de experimentos por toda a colaboração e
dedicação, em especial a Ana Olívia Martins, Marina Goulart e Camila Michalak,
vocês foram uns anjos, e contribuíram para que meu sonho se tornar-se realidade,
vocês tem um futuro brilhante pela frente. E ao mestre Evandro Cittadin, por dedicar
um pouco do seu tempo para nos ensinar práticas no laboratório.
A minha turma do mestrado em especial a minha grande amiga Lidiane
Borges Pinto que o mestrado me proporcionou, muito obrigada pela sua amizade.
A minha família que sempre me apoiou em todas as minhas decisões, que
me deram carinho, amor e sempre acreditou em mim, amo vocês.
A todas as pessoas não mencionadas, mais que, direta ou indiretamente,
contribuíram para a realização deste trabalho.
E por fim, a uma pessoa muito importante em minha vida, Daniel Arent
Wensing, que cuida de mim e me faz muito feliz, o meu eterno namorado, muito
obrigada por partilhar comigo os grandes momentos de nossas vidas.
A todos vocês...
Muito Obrigada!
Já experimentou acreditar em você?
Tente...
Você não faz ideia do que você é capaz.
(Rogério Stankevicz)
RESUMO
O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um distúrbio neurocomportamental
complexo desenvolvido na infância precoce, caracterizado por vários graus de
deficiência, incluindo prejuízo nas áreas do desenvolvimento pertinentes à interação
social, comunicação, comportamento e interesse. O TEA apresenta uma prevalência
global estimada de 1 para cada 68 crianças, seu diagnóstico se concentra
basicamente nas avaliações comportamentais, não havendo até o momento
biomarcadores para identificá-lo. Tanto fatores genéticos quanto ambientais, vêm
sendo ligados diretamente ao TEA. A heterogeneidade de suas manifestações faz
com que os tratamentos tornam-se ineficazes. Novas alternativas terapêuticas têm
sido sugeridas para melhorar os sintomas, entre eles o ácido graxo poliinsaturado
(AGP) ômega 3 (ω-3), tem apresentado resultados positivos no tratamento de
doenças neurológicas e psiquiátricas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos
da suplementação de AGP ω-3, sobre os parâmetros comportamentais e
bioquímicos em um modelo experimental de autismo induzido por lipopolissacarídeo
(LPS) a partir da ativação imune materna. A suplementação AGP ω-3 ou solução
salina foi administrada na prole a partir do dia pós-natal (PND) 30, na dose de 0,8
g/kg, via oral. No PND 52 os animais realizaram testes comportamentais, após foram
eutanasiados e as estruturas do encéfalo dissecado e analisado em níveis de:
enolase específica do neurônio (NSE), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)
e fator de transformação do crescimento beta (TGF-β). Os resultados deste estudo
indicaram
que
a
ativação
imune
materna
causou
na
prole
alterações
comportamentais e neuroquímicas condizentes com o TEA, e a suplementação com
o AGP ω-3 apresentou resultados positivos, tanto comportamentais como
neuroquímicos.
Palavras-chave: Transtorno do Espectro Autista, Ômega-3, Enolase Específica do
Neurônio, Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro, Fator de Transformação do
Crescimento Beta.
ABSTRACT
The Autism Spectrum Disorder (ASD) is a complex neurodevelopmental disorder
developed in early childhood, characterized by several degrees of deficiency,
including deficits in the areas of the development relevant to social interaction,
communication, behavior and interest. The ASD has an estimated global prevalence
of 1 per 68 children , its diagnosis focuses basically on behavioral assessments, and
there is no biomarkers to identify it so far. Both genetic and environmental factors,
have been linked directly to the ASD. The heterogeneity of its manifestations causes
the treatments to become ineffective. New therapeutic approaches have been
suggested to improve symptoms, including polyunsaturated fatty acid (PUFA)
omega-3 (ω-3), has shown positive results in the treatment of neurological and
psychiatric diseases. The objective of this study was to evaluate the effects of PUFA
ω-3 supplementation on the behavioral and biochemical parameters in an
experimental model of autism induced by lipopolysaccharide (LPS) from the maternal
immune activation. The PUFA ω-3 supplementation or saline solution was
administered in offspring from postnatal day (PND) 30, at a dose of 0.8 g/kg, orally.
At PND 52, animals underwent behavioral tests, were euthanized after and the brain
structures dissected and analyzed for levels: neuron specific enolase (NSE) , brainderived neurotrophic factor (BDNF) and transforming growth factor beta (TGF-β). The
results of this study indicate that maternal immune activation caused behavioral and
neurochemical
changes
in
the
offspring
consistent
with
the
ASD,
and
supplementation with PUFA ω-3 showed positive results, both behavioral and
neurochemical.
Keywords: Autistic spectrum disorder , Omega-3 , Neuron Specific Enolase, Brain
Derived Neurotrophic Factor , Transforming Growth Factor Beta
LISTAS
Lista de Abreviaturas
ADDM – Monitoramento das deficiências do autismo e desenvolvimento (do inglês,
Autism and Developmental Disabilities Monitoring)
AGE – Ácido Graxo Essencial
AGP – Ácido Graxo Poliinsaturado
ALA – Alfa-Linolênico
AMPc – 3’5’ Monofosfato de Adenosina
APA – Associação Americana de Pediatria (do inglês, American Psychiatric
Association)
Bcl-2 – B-cell Lymphoma 2
BDNF – Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (do inglês, Brain Derived
Neurotrophic Factor)
CaMKII – Proteína Cinase Dependente de Cálcio/Calmudolina tipo 2 (do inglês,
Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II)
CDC – Centro de controle e prevenção de doenças (do inglês, Centers for Disease
Control and Prevention)
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
CID-10 – Classificação Estatística de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde 10ª Revisão
CREB – Proteína Ligante ao Elemento de Resposta ao AMPc (do inglês, cAMP
Response Element-Binding)
DG – Dia de Gestação
DHA – Ácido Docosaexaenóico
DSM – Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (do inglês,
Diagnostic and Statistical Manual)
ELISA – ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (do inglês, Enzime Linked
Immunosorbent Assay)
EPA – Ácido Eicosapentaenóico
IgG – Imunoglobulina G
IL – Interleucina
ip – Intraperitonial
IP3 – Trifosfato de Inositol (do inglês, Inositol Triphosphate)
LPS – Lipopolissacarídeo
MAPK – Proteína Cinase Ativada por Mitogênos (do inglês, Mitogen-Activated
Protein Kinase)
MCP-1 – Proteína Quimiotática de Monócitos-1
MEK – Proteína Cinase Ativada por Mitógeno / Proteína Cinase Regulada por Sinais
Extracelulares (do inglês, Mitogen-Activated Protein Kinase / Extracellular SignalRegulated Kinase)
MIA – Morte Indolor Assistida
NaCl – Cloreto de Sódio
NSE – Enolase Específica do Neurônio (do inglês, Neuron Specific Enolase)
OMS – Organização Mundial da Saúde
P75 (NTR) – Receptor de Neurotrofina p75 (do inglês, p75 Neurotrophin Receptor)
PI3K – Fosfatidilinositol 3-Cinase (do inglês, Phosphoinositide 3-Kinase)
PLC-γ – Fosfolipase\C-γ (do inglês, Phospholipase C, Gamma)
PND – Dia pós-natal
SNC – Sistema Nervoso Central
SNP – Sistema Nervoso Periférico
SPSS – Statistical Packege for the Sciences
TEA – Transtorno do Espectro Autista
TGF-β – Fator de Transformação do Crescimento Beta (do inglês, Transforming
Growth Factor Beta)
TID – Transtorno Invasivo do Desenvolvimento
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral Alfa (do inglês, Tumor Necrosis Factor - Alpha)
Trk – Tirosina Cinase
TrkB – Tirosina Cinase Tipo B
ω-3 – Ômega 3
Lista de figuras
Figura 1 – Biossíntese dos ácidos graxos ω-3 .......................................................... 18
Figura 2 – Tipos de receptores tirosina cinase (Trk) e suas distintas afinidades para
as neurotrofinas ......................................................................................................... 23
Figura 3 – Visão geral do BDNF a sinalização através de receptores de TrkB ......... 25
Figura 4 – Diagrama esquemático das etapas do delineamento experimental
proposto no estudo. ................................................................................................... 33
Figura 5 – Teste de interação social recíproca.......................................................... 35
Figura 6 – Número (Figura 6A) e tempo (Figura 6B) de episódios de movimentos
estereotipados (grooming) realizados pelos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3,
LPS + AGP ω-3 ......................................................................................................... 40
Figura 7 – Tempo (em segundos) da interação social apresentado pelos grupos:
Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-3. ................................................... 41
Figura 8 – Níveis proteicos de NSE nas estruturas encefálicas do hipocampo (Figura
8A) e cerebelo (Figura 8B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP
ω-3 ............................................................................................................................ 42
Figura 9 – Níveis proteicos de BDNF nas estruturas encefálicas do hipocampo
(Figura 9A) e cerebelo (Figura 9B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS
+ AGP ω-3 ................................................................................................................. 43
Figura 10 – Níveis de TGF-β nas estruturas encefálicas do hipocampo (Figura 10A)
e cerebelo (Figura 10B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω3. ............................................................................................................................... 44
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 13
1.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA ........................................................ 14
1.1.1 Prevalência do TEA ........................................................................................ 15
1.1.2 Hipóteses Etiológicas .................................................................................... 16
1.2 ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADO ω-3 ....................................................... 18
1.2.1 AGP ω-3 e TEA ............................................................................................... 20
1.3 BIOMARCADORES............................................................................................. 20
1.3.1 Enolase Específica do Neurônio (NSE) ........................................................ 21
1.3.2 NSE e TEA ....................................................................................................... 22
1.4 FATORES NEUROTRÓFICOS ........................................................................... 22
1.4.1 Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) ........................................ 24
1.4.2 BDNF e TEA .................................................................................................... 25
1.5 FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF-β)............... 26
1.5.1 TGF-β e TEA.................................................................................................... 27
1.6 MODELO ANIMAL DE TEA ................................................................................. 27
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 29
2.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................. 29
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 29
3. MÉTODOS ............................................................................................................ 30
3.1 TIPO DE ESTUDO .............................................................................................. 30
3.2 ANIMAIS .............................................................................................................. 30
3.3 ACASALAMENTO ............................................................................................... 30
3.4 ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA ........................................................................... 31
3.5 PADRONIZAÇÃO DA NINHADA ......................................................................... 31
3.6 MEDIDAS DO PESO CORPORAL ...................................................................... 32
3.7 TESTES COMPORTAMENTAIS ......................................................................... 34
3.7.1 Comportamento Estereotipado ..................................................................... 34
3.7.2 Interação Social Recíproca ............................................................................ 34
3.8 ANÁLISES BIOQUÍMICAS .................................................................................. 35
3.8.1 Quantificação do BDNF por Western Blotting ............................................. 35
3.8.2 Quantificação da NSE por Western Blotting ................................................ 36
3.8.3 Quantificação do TGF-β por ELISA............................................................... 37
3.9 ANÁLISE DE DADOS.......................................................................................... 37
3.10 ASPECTOS ÉTICOS......................................................................................... 38
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 39
4.1 TESTES COMPORTAMENTAIS ......................................................................... 39
4.1.1 Comportamento Estereotipado ..................................................................... 39
4.1.2 Teste de interação social recíproca .............................................................. 40
4.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS .................................................................................. 41
4.2.1 Quantificação de NSE .................................................................................... 41
4.2.2 Quantificação de BDNF.................................................................................. 42
4.2.3 Quantificação de TGF-β ................................................................................. 43
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 45
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 50
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 51
ANEXO...................................................................................................................... 66
ANEXO A- Parecer Aprovação do Comitê de Ética .............................................. 66
13
1. INTRODUÇÃO
O Transtorno do Espectro Autista (TEA) compreende diferentes
síndromes de perturbação do desenvolvimento neurológico1 que pode se manifestar
em conjunto ou isoladamente 2. As características fundamentais da TEA incluem:
dificuldade de comunicação por deficiência no domínio da linguagem e no uso da
imaginação para lidar com situações e jogos simbólicos, dificuldade de socialização
e padrão de comportamento restritivo e repetitivo3.
O TEA apresenta uma etiologia bastante complexa e avanços científicos
sobre sua origem têm demonstrado que tanto fatores genéticos como ambientais
colaboram para a manifestação do transtorno4.
A heterogeneidade das manifestações clínicas faz com que os
tratamentos, na maioria das vezes, tornam-se ineficazes5. Novas alternativas
terapêuticas têm sido sugeridas para melhorar os sintomas nucleares deste
transtorno, entre elas, a mudança nos hábitos alimentares tem mostrado resultados
positivos e melhor qualidade de vida para indivíduos portadores do TEA6. Entre os
tratamentos, o ácido graxo poliinsaturado (AGP) ômega 3 (ω-3) tem apresentado
resultados positivos na terapêutica de doenças neurológicas7,8 e psiquiátricas9,10,
como componente restaurador de membranas celulares neuronais11 e ainda como
agente antioxidante10 e anti-inflamatório7.
Considerando que o TEA possa estar relacionado a uma alteração no
desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) decorrente de um processo
neuroinflamatório12, é possível que a administração contínua e prolongada de uma
dieta suplementada de AGP ω-3, possa reverter condições neuroquímicas e
comportamentais associadas a um modelo pré-clínico de autismo baseado em uma
infecção bacteriana pré-natal a partir da exposição ao lipopolissacarídeo (LPS).
Resultados positivos podem representar dessa uma nova abordagem terapêutica
nutracêutica que contribui para o progresso das condições clínicas apresentadas por
pacientes autistas e, consequentemente, a melhoria na qualidade de vida desses
pacientes e seus familiares.
14
1.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA
Foi em 1911, pelo psiquiatra suíço Bleuler, que o termo autismo foi
utilizado
pela
primeira
vez,
para
descrever
crianças
que
apresentavam
características diferentes das demais, essas não tinham contato com a realidade,
gerando assim inabilidade em se comunicar13,14. No entanto, o autismo ficou
conhecido somente a partir de 1943 quando Leo Kanner, após estudar um grupo de
onze crianças, identificou anormalidades na fala, isolamento social, respostas
impróprias para o ambiente físico e outras alterações comportamentais diferentes de
doenças já conhecidas15,16. Kanner acreditava que o autismo era provavelmente
raro, e o mesmo era confundido com debilidade mental ou esquizofrenia 15.
Somente entre os anos de 1950 e 1960 a causa biológica do autismo
começou a ser discutida17. Até então, acreditava-se que a doença era resultado da
falta de proximidade dos pais com seus filhos17. Essa compreensão contribuiu para o
surgimento do termo “mães-geladeira”, que expressava a falta de afeto e a frieza dos
pais17.
O autismo apareceu pela primeira vez somente na terceira edição do
Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-III-R), revisado em
198918. No ano de 1994, com a atualização do DSM, em sua quarta edição (DSMIV)19 e com a Classificação Estatística de Doenças e Problemas Relacionados à
Saúde - 10ª Revisão20, o autismo foi classificado como um Transtorno Invasivo do
Desenvolvimento (TID) cujo portador poderia atingir níveis severos no desempenho
de atividades como: redução do contato visual, restrição em mostrar, pegar ou
utilizar
objetos,
movimentação
atividades
ou
torção
repetitivas
de
mãos
e
comportamentos
e
dedos,
agitação
estereotipados,
corporal
ou
dificuldade/ausência de fala21,22.
Nessa mesma edição, o diagnóstico de TID foi baseado em um sistema
multicategórico, que incluía o Transtorno Autista, Transtorno de Asperger,
Transtorno Invasivo do Desenvolvimento sem outra especificação, Transtorno
Desintegrativo da Infância e o Transtorno de Rett 21,23.
Na quinta edição do DSM1, lançada em 2013, o autismo passou a ser
definido como um distúrbio neurocomportamental complexo, caracterizado por vários
graus de deficiência incluindo interação social, agilidade de pensamento, mudanças
peculiares de linguagem e/ou percepção atrasada, prejuízo na comunicação verbal e
15
não verbal e inabilidade em responder a certos estímulos apresentando um
comportamento restrito e repetitivo 12. A partir desta atualização, o DSM-V substituiu
o sistema multicategórico usado anteriormente por uma única dimensão do
diagnóstico – Transtorno do Espectro Autista1,24.
O diagnóstico no TEA ainda se concentra basicamente nas avaliações
comportamentais devido à ausência de marcadores biológicos para identificá-lo25,26.
Mesmo com os avanços recentes na capacidade de diagnosticar o transtorno
precocemente, na maioria dos casos esse diagnóstico acontece depois dos três
anos de idade27. A Associação Americana de Pediatria (APA) sugere realizar o
acompanhamento do desenvolvimento de todas as crianças até 24 meses, pois é a
partir do segundo ano de vida que os comportamentos característicos do TEA
surgem e esses são capazes de auxiliar no diagnóstico 28. Estudos sobre a base
neurológica do TEA antes dos três anos de idade é decisivo para o tratamento, pois
é nessa fase que ocorrem os cuidados primários da infância e é nesse período que
os resultados do tratamento podem ser melhores28.
1.1.1 Prevalência do TEA
O TEA tem aumentado consideravelmente sua prevalência nos últimos
29
anos . Pesquisas realizadas nos Estados Unidos pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC) e Autism and Developmental Disabilities Monitoring (ADDM)
nos anos de 2011-2012, estimou a prevalência global do TEA como sendo 1:68
crianças com até oito anos de idade, representando um aumento de 23% na
prevalência de TEA comparado ao período de 2006-200830. Nos Estados Unidos a
prevalência estimada pelos mesmos centros de pesquisa mostrou que 2% das
crianças entre 6 e 17 anos apresentam sintomas de TEA, isso representa 1 a cada
50 crianças americanas29-32.
No Brasil, um estudo transversal estimou uma frequência de 27,2 casos
de TEA a cada 10.000 habitantes33. No estado de Santa Catarina, a prevalência de
casos diagnosticados, de acordo com as bases de dados das Associações de Pais e
Amigos dos Excepcionais (APAE), da Associação de Amigos dos Autistas (AMA) e
da Fundação Catarinense de Educação Especial (FCEE), apresentou um indíce
menor em relação ao Brasil, indicando 1,31 casos para cada 10.000 habitantes, no
entanto, esse estudo realizado em Santa Catarina apresentou limitações, devido ao
16
fato dos dados serem secundários, retrospectivos e adquiridos via e-mail, ligação
telefônica e instituição, pois na obtenção dessas informações pode ter ocorrido subnotificação, uma vez que os dados não eram informatizados e não havia orgão ou
instituição responsável em armazenar essas informações, outra limitação encontrada
foi que a população-alvo constituiu somente pelos indivíduos com evidências
diagnósticas que frequentavam as instituições, porém nem todos os autistas estão
inseridos nestas instituições34,35.
Em relação ao sexo, estudos tem demonstrado que o sexo masculino
apresenta cerca de três a quatro vezes mais chances de ser afetado pelo TEA do
que indivíduos do sexo feminino36,37. No entanto, esse valor pode sofrer alterações
de acordo com o grau de desenvolvimento intelectual, sendo que quando avaliados
indivíduos autistas com deficiência intelectual as proporções chegaram a 6% mais
presentes no sexo feminino do que no sexo masculino 31. Ainda não existem estudos
conclusivos que esclareçam porque o sexo feminino apresenta menores incidências
de TEA sem deficiência intelectual 38. Contudo, alguns autores sugerem que possa
estar relacionado a uma condição genética ligada ao cromossomo X, com isso
tornando homens mais propensos ao desenvolvimento da síndrome38. Outra
hipótese sugere que o hormônio estradiol atue como um agente neuroprotetor,
reduzindo a expressão de várias citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, desta
forma atenuando os sintomas do TEA e diminuindo as manifestações clínicas no
sexo feminino39.
1.1.2 Hipóteses Etiológicas
A etiologia do TEA é bastante complexa e na maioria dos casos o
processo patológico é desconhecido5. Estudos mostram que o TEA está diretamente
ligado a fatores genéticos, condições ambientais, neurobiológicas, neuroanatômicas,
metabólicas e imunológicas37,40-43.
Atualmente o TEA é considerado um distúrbio do desenvolvimento
neurológico44 que pode estar associado a um processo de neuroinflamação45,46. A
neuroinflamação, neste caso, está relacionada à ativação da micróglia que aumenta
a liberação de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias no SNC, causando ativação
de moléculas do sistema imunológico que, por sua vez, quando ativadas,
atravessam a barreira hematoencefálica, originando um feedback positivo e
17
acarretando uma tempestade de citocinas no SNC41. Quando a ativação acontece
em período pré-natal, o desenvolvimento encefálico do feto é comprometido
podendo ser a causa dos déficits de comunicação e movimentos estereotipados que
caracterizam o TEA ou ainda contribuindo para a perda de sinapses e a morte
neuronal47,48. Alguns estudos mostram que indivíduos diagnosticados com TEA eram
filhos de mães que sofreram perturbações durante o período gestacional incluindo
infecções49, traumatismos50 ou exposição a toxinas ambientais51.
Alterações nos circuitos neurais de diversas áreas encefálicas têm sido
envolvidas na etiologia do TEA, incluindo o sistema límbico 42 e o cerebelo52. Por
isso, as pesquisas seguem o foco nas regiões encefálicas associadas às respostas
emocionais, entre elas, o córtex pré-frontal, córtex temporal, córtex cingulado
anterior, giro fusiforme e amígdala53. Além disso, estudos de neuroimagem indicam
um padrão anormal do desenvolvimento encefálico, com um crescimento acelerado
durante os primeiros anos de vida, seguindo pela desaceleração em algumas áreas
encefálicas, enquanto em outras áreas podem ocorrer parada no crescimento54.
A grande maioria dos tratamentos farmacológicos utilizados para o TEA
não são direcionados para os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na
fisiopatologia desse transtorno, isto porque eles ainda não estão totalmente
esclarecidos55. Além disso, um dos grandes problemas enfrentados pela terapia
farmacológica é o risco de baixa adesão dos pacientes aos medicamentos, devido
principalmente à demora da resposta terapêutica e aos efeitos colaterais 55. Neste
sentido, a busca por alternativas não-farmacológicas que sejam capazes de atrasar
o início e a progressão dos sintomas do TEA e de suas complicações são
prementes9.
Nos últimos anos a nutrição tem adquirido cada vez mais um papel
relevante, tanto no desenvolvimento, como na alteração do percurso de doenças
neurológicas e psiquiátricas56,57. O AGP ω-3 tem sido estudado nessas doenças,
devido seus efeitos: antioxidantes, anti-inflamatórios, atuação na formação da
bainha de mielina, no desempenho cognitivo da atividade encefálica e comunicação
entre as células neuronais, apresentando também ação vasodilatadora e por isso
aumenta o aporte de oxigênio e nutrientes para o SNC58-60. Estudos recentes
apontam que a suplementação de AGP ω-3 pode contribuir positivamente para o
desenvolvimento neurológico de crianças diagnosticadas com TEA 6,61-63.
18
1.2 ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADO ω-3
Os ácidos graxos essenciais (AGE), embora não sejam sintetizados
endogenamente, são essenciais para o desenvolvimento e funcionamento normal do
SNC e do sistema imunológico67. Entre os AGE está o AGP ω-3 que desempenha
um papel importante na patogênese de muitas doenças crônicas60. Os AGE
adquiridos da dieta, na maioria das vezes, se apresentam em suas formas primárias
como ácido α-linolênico (ALA) que pode sofrer uma dessaturação de enzimas e
sistema de alongamento de cadeias modicando-se em ácido eicosapentaenóico
(EPA) e ácido docosaexaenóico (DHA) originados do AGP ω-367 (Figura 1).
Figura 1 – Biossíntese dos ácidos graxos ω-3
(Levant, 2011)
65
Em fontes de origem vegetal como óleos extraídos de soja, de girassol, de
milho, linhaça, nozes e em alguns vegetais verdes, como brócolis, rúcula, couve,
espinafre, pode-se encontrar AGP ω-3 na forma de ALA 64 que pode ser
metabolizado em EPA e DHA pela ação de enzimas alongase e dessaturase 66.
Devido ao fato dessas enzimas serem influenciadas por inúmeros aspectos como
tabagismo, consumo de álcool, diabetes e envelhecimento, os seres humanos se
tornam relativamente ineficientes em realizar esta síntese (≤ 6% de conversão) a
19
partir do ALA, portanto, o ALA pode não ser bem convertido em algumas
pessoas67,68.
Em algumas espécies de peixes é possível encontrar AGP ω-3 na forma
de EPA e DHA69, entre as opções estão: anchovas, arenque atlântico, salmão, truta
e sardinha 70-73. O EPA e o DHA encontrados nesses alimentos são importantes para
a estrutura e função encefálica e têm sido defendidas para o tratamento de vários
distúrbios
neurológicos
e
psiquiátricos,
incluindo
transtornos
de
humor 9,
esquizofrenia74, Transtorno do Déficit de Atenção com Hiperatividade (TDAH)75 e
TEA60.
Os eicosanóides sintetizados a partir dos AGP ω-3 exibem propriedades
anti-inflamatórias, atuando diretamente na membrana celular 76. O DHA, em especial,
é o elemento de maior fluidificação em membranas celulares, neste sentido, é
essencial para desenvolvimento dos sistemas neurais sensoriais, perceptivos,
cognitivos e motores, durante esse período de maior crescimento do encéfalo que
compreende o último terço da vida fetal e os dois primeiros anos de vida 59,60. Além
disso, o DHA desempenha papel neuroprotetor contra o estresse oxidativo em
astrócitos, em oligodendrócitos, em células ganglionares da retina e em linfócitos
humanos74,77,78. O AGP ω-3 tem sido sugerido como um complemento eficaz para a
prevenção de doenças neurodegenerativas que estão associados com o estresse
oxidativo, este resultado está relacionado ao melhor desempenho cognitivo em
animais de laboratório que receberam dieta rica em AGP ω-3 por 12 semanas
consecutivas79.
O EPA está presente no colostro e leite materno e desempenha um papel
chave na regulação do sistema endócrino, imunitário, função cardiovascular
tem ação anti-inflamatórias
60,80
e
59,60,81
.
Considerando que vários estudos apontam dano oxidativo e processo
inflamatório associados a transtornos do neurodesenvolvimento, incluindo TEA,
resultados sugerem que as manifestações clínicas apresentadas por pacientes
autistas podem estar relacionadas, em parte, pela deficiência ou desequilíbrio de
AGP ω-3, e que a suplementação possa representar uma alternativa terapêutica
para a melhoria dos sintomas 64,82.
20
1.2.1 AGP ω-3 e TEA
O
uso
de
terapias
comportamentais
e
medicamentosas
têm-se
apresentado como insuficientes para o tratamento do TEA e doenças associadas83.
Estudos recomendam mudanças nos fatores nutricionais e ambientais como um
tratamento alternativo nestes casos83,84.
Atualmente sabe-se que o TEA não é uma doença única, na verdade se
trata de um distúrbio associado a diversas etiologias e a vários graus de severidade,
onde pode ser caracterizado por alterações comportamentais, de linguagem e de
cognição, com deficiência intelectual em 70% dos casos e crises epiléticas em
30%85. A associação entre o TEA e a epilepsia é bastante conhecida 85. Um estudo
realizado no ano de 2013 relatou que a epilepsia esteve presente em 58 dos 206
indivíduos avaliados, representando um total de 28,2% da amostra total,
apresentando um índice bem maior quando comparado com a prevalência da
epilepsia na população em geral que apresentou um indicativo de 0,5 à 1% da
população afetada85. Estudo realizado em modelos animais de epilepsia com
suplementação de EPA e DHA permitiu que as doses do tratamento farmacológico
fossem reduzidas na fase de manutenção da doença, atenuando as convulsões
hipocampais86. Considerando a proximidade entre epilepsia e TEA, a suplementação
de AGP ω-3 na dieta destes últimos pode conduzir a uma melhoria dos sintomas
desta síndrome58.
Organizações governamentais e de saúde em todo mundo, vem criando
recomendações à população em geral, sobre a importância do consumo de peixe ou
óleo de peixe, pelo menos duas vezes por semana em função dos grandes
benefícios previstos pelo AGP ω-3 relacionados às doenças crônicas87. No geral, os
níveis recomendados para prevenção de doenças são inferiores ao recomendado
para tratamentos particulares, contudo mais estudos clínicos são importantes para
determinar corretamente dosagens e fórmulas mais eficazes para doenças
específicas88.
1.3 BIOMARCADORES
Os biomarcadores são definidos como indicadores de processos
biológicos normais, patológicos ou resposta farmacológica a uma intervenção
21
terapêutica89.
Bioquimicamente,
são
moléculas sistêmicas que
podem ser
determinadas em laboratórios, como proteínas ou enzimas que representam, direta
ou indiretamente, um ou mais processos biológicos ou patológicos ativos de um
sistema definido ou um estado de doença 90. Essas moléculas têm sido utilizadas
como alvos potenciais de terapia na prevenção e tratamento de doenças
sistêmicas91 e do SNC92.
Um biomarcador ideal para avaliar uma lesão encefálica precisa ser
sensível e apresentar alta especificidade para o tecido encefálico, já que nem
sempre
o
líquor
é
disponível93.
Os
biomarcadores
encefálicos
utilizados
frequentemente são: adenilato cinase, creatina cinase, lactato, S100-β e Enolase
Específica Neurônio (NSE). Esta última proteína é considerada um dos mais
importantes marcadores de danos às células neuronais94,95. A avaliação dos níveis
de NSE pode contribuir e proporcionar a oportunidade de investigar a função ou
dano de estruturas neuronais em doenças psiquiátricas e neurológicas, incluindo o
TEA96.
1.3.1 Enolase Específica do Neurônio (NSE)
A NSE é utilizada como um marcador de soro específico para danos
97
neuronais , no entanto, um estudo post mortem com hipocampos de indivíduos com
Alzheimer, mostrou que níveis de NSE podem também ser mensurados em regiões
encefálicas distintas, pois foi identificado uma oxidação da NSE no encéfalo desses
indivíduos98.
A NSE é uma enzima glicolítica concentrada no citoplasma dos neurônios
e células com diferenciação neuroendócrina, existindo em quantidades desprezíveis
no sangue periférico99. A partir do momento em que a NSE não é excretada, ocorre
um aumento em suas concentrações no líquor ou sangue significando, desta forma,
uma associação com dano estrutural para células neuronais e, por isso, pode ser
considerado um importante biomarcador para acompanhar a progressão de doenças
neurológicas e/ou avaliar o grau de severidade de determinada doença97.
22
1.3.2 NSE e TEA
A NSE representa 1,5% das proteínas solúveis totais do encéfalo, nos
estágios de lesão
encefálica
elas podem ser
utilizadas para
sugerir
o
prognóstico100,101 a partir da quantificação do grau de lesão neuronal, ou seja, um
aumento na expressão de NSE antes dos sinais clínicos permite detectar danos
neuronais em estágios subclínicos e servir como referência para quantificar o grau
de neurodegeneração101,102.
Estudo realizado por Gelderblom e colaboradores101 com modelos
animais de doenças neurológicas agudas e crônicas pareados por idade e sexo,
mensurou níveis de NSE no plasma com o objetivo de avaliar a NSE como
biomarcador para estimar grau de lesão neuronal nos modelos animais, e identificou
aumento na expressão da NSE no modelo animal de doença neurológica aguda e
crônica. No modelo de doença neurológica aguda, foi observado três horas após a
lesão, um aumento nos níveis de NSE no plasma, sugerindo um dano neuronal
precoce e generalizada. E no modelo de doença neurológica crônica, assim como o
TEA, foi possível verificar no decorrer da doença níveis elevados de NSE no plasma,
sendo possível também de detectar o aumento dos níveis de NSE antes do início
dos sintomas clínicos, possibilitando estratégias de tratamentos neuroprotetores.
1.4 FATORES NEUROTRÓFICOS
As neurotrofinas são formadas por proteínas que exercem importantes
papéis na formação do SNC e do sistema nervoso periférico (SNP), atuando na
modulação da transmissão e plasticidade sináptica, sobrevivência, morfologia e
diferenciação neuronal 103-105. A família das neurotrofinas é constituída pelo fator de
crescimento neural (NGF, do inglês nerve growth factor), o fator neurotrófico
derivado do cérebro (BDNF, do inglês Brain Derived Neurotrophic Factor), e
neurotrofina-3 (NT-3), NT-4/5 e NT-6103-105. As sínteses dessas proteínas ocorrem no
retículo endoplasmático e, a partir daí, são clivadas em moléculas menores que
chegam até as vesículas secretoras. Há dois tipos diferentes de vias de secreção: a
via Ca²+ dependente e exocitose de grânulos de secreção106.
Os fatores neurotróficos intercedem em diversas funções celulares
através da ativação de receptores, compreendendo a expressão dos genes
23
inteiramente envolvidos na regulação da neuroplasticidade e saúde celular 107.
Grande parte dos papéis executados pelas neurotrofinas é compreendida pelo
receptor tirosina cinase (Trk), que tem como membros da família o receptor
neurotrófico tirosina cinase tipo A (TrkA) em conjunto com o receptor neurotrófico
tirosina cinase tipo B (TrkB) e o receptor neurotrófico tirosina cinase tipo C (TrkC)108.
As neurotrofinas ligam-se seletivamente a receptores específicos de Trk, ao passo
que todas as neurotrofinas se ligam a p75. Receptores Trk contém a imunoglobulina
G (IgG) para domínios extracelulares de ligação ao ligante e uma sequência de Trk
catalítico no domínio intracelular. Cada receptor, ativa várias vias de transdução de
sinal. A porção extracelular do p75 NTR (p75 (NTR), do inglês p75 neurotrophin
receptor) contém quatro repetições ricas em cisteína e a parte intracelular contém
um domínio de morte. A ligação ao receptor de neurotrofina p75 medeia à
sobrevivência, a migração celular e a mielinização através de várias vias de
sinalização. As interações entre os receptores Trk e p75 podem conduzir a
alterações na afinidade de ligação para as neurotrofinas106,108,109 (Figura 2).
Figura 2 – Tipos de receptores tirosina cinase (Trk) e suas distintas afinidades para
as neurotrofinas
(Chao, 2003)
109
O aumento das neurotrofinas tem como principal papel proteger os
neurônios da excitotoxicidade, desta forma, tem sido apresentadas como
moduladoras
da
plasticidade
sináptica,
com
função
na
neuroproteção
e
24
reorganização, operando como dispositivo de equilíbrio endógeno para originar
regeneração e reparação no SNC e SNP110.
1.4.1 Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF)
O BDNF é uma proteína da família das neurotrofinas que se apresenta em
grande quantidade e amplamente distribuída no SNC, exibe uma expressão
significativa no hipocampo e córtex cerebral de crianças e adultos jovens e está
envolvida nos processos de aprendizagem e memória 104,105. O BNDF tem uma
participação fundamental no ajuste da atividade sináptica e plasticidade, tanto por
meio de modificações funcionais como estruturais nos neurônios111,112.
As ações celulares do BDNF ocorrem através da mediação do TrkB e pelo
receptor de neurotrofina p75 (NTR) um membro da família do TNF 110. A transcrição
de exons é dirigida por promotores diferentes, sendo então regulada por um
conjunto de mecanismos de sinalização, incluindo Ca 2+, CREB (proteína ligante ao
elemento de resposta ao AMPc [3’ 5’ monofosfato de adenosina] do inglês, cAMP
response element-binding), MEK (proteína cinase ativada por mitógeno / proteína
cinase regulada por sinais extracelulares, do inglês mitogen activated protein kinase
/ extracellular signal-regulated kinase), MeCP2 (proteína de ligação a CpG metilado
2, do inglês, methyl-CpG-binding protein 2), CaMKII (proteína cinase dependente de
cálcio/calmudolina tipo 2, do inglês, Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II) e
hormônios112-114.
A ativação dos receptores estimula uma série de cascatas de transdução
de sinais, incluindo a proteína cinase ativada por mitogênos (MAPK, do inglês,
Mitogen-activated protein kinase), o fosfatidilinositol 3 cinase (PI3K, do inglês,
Phosphoinositide 3-kinase) e a via da fosfolipase\C-γ (PLC-γ, do inglês,
Phospholipase C, gamma), sendo também utilizada para acompanhar a liberação e
ativação do receptor neurotrófico112,114.
Após uma ligação do BDNF ao TrkB, ocorre uma dimerização e
autofosforilação, e assim que fosforilados estes resíduos formam locais específicos
de ligação para enzimas e proteínas “scaffolds”115,116, que são intermediários na
ativação dos domínios intracelulares de três cascatas de sinalização: (1) a ativação
intercedida por sch/Frs2 e Ras/Raf da via de MAPK que abrange MEK e ERK que
leva ao crescimento e diferenciação celular; (2) a ativação mediada por sch/Frs2 e
25
GAB1 da via PI3K, e a jusante via de Akt, levando à sobrevivência celular e, por fim,
a (3) última via de sinalização que é ativada diretamente pelo receptor PLCγ, que
origina IP3 (Inositol triphosphate) e DAG (diaglycerol) aumentando os níveis de
cálcio intracelular, originando em um aumento da atividade calmodulina cinase
(CaMK), levando a plasticidade sináptica 112,115-117. Todas as três vias convergem no
fator de transcrição CREB, sendo alvo posterior deste mecanismo, responsável pela
transcrição de certa quantidade de genes que proporcionam a resistência celular,
compreendendo a Bcl-2 (do inglês, B-cell lymphoma 2) que através da inibição da
liberação do citocromo C protege o efeito anti-apoptótico112,116,118 (Figura 3).
Figura 3 – Visão geral do BDNF a sinalização através de receptores de TrkB
(adaptado de Autry e Monteggia, 2012)
116
1.4.2 BDNF e TEA
No decorrer de diversas fases do desenvolvimento sináptico, plasticidade
sináptica, sobrevivência neuronal e migração celular, a via de sinalização
BDNF/TrkB está envolvida na transcrição e transdução de proteínas, por meio das
três vias biológicas ativas. Devido à função que exercem, os genes que codificam as
moléculas integrantes nestas três vias biológicas são possíveis candidatos na
etiologia do TEA119.
26
A via biológica PI3K atua nas funções de regulação do ciclo celular,
sobrevivência, diferenciação e proliferação celular, a via Akt desempenha função na
regulação de proteínas apoptóticas e fatores de transcrição. Associado ao TEA
sindrómico (esclerose tuberosa, neurofibromatose e macrocefalia) é possível
encontrar descrito na literatura mutações nos genes TSC1, TSC2, NF1 e PTEN, que
participam na via biológica PI3K-Akt120,121. As vias de sinalização de MAPK assim
como a via PI3K apresenta uma função essencial na síntese, tradução e/ou
transporte de proteínas com funções sinápticas, a via de sinalização PLCγ regula o
cálcio intracelular que conduz o processo de transcrição através de AMP cíclico e
proteínas cinase C119.
Modificações nos níveis de BDNF vêm sendo associadas à etiologia de
doenças neuropsiquiátricas como esquizofrenia, depressão e doença bipolar
122,123
.
Portanto, considerando a hipótese de que modificações ao nível da ligação
BDNF/TrkB e/ou ao nível das três vias biológicas MAPK/MEK/ERK, PI3K-Akt e
PLCγ, são capazes de ocasionar à disfunção dos mecanismos de desenvolvimento
sináptico, é possível que uma alteração nestes níveis podem colaborar com fatores
de sensibilidade na etiologia do TEA119,120.
1.5 FATOR DE TRANSFORMAÇÃO DO CRESCIMENTO BETA (TGF-β)
O fator de transformação do crescimento (TGF-β, do inglês, transforming
growth factor beta) é uma proteína que controla a proliferação, diferenciação celular,
motilidade celular e apoptose celular, apresenta um importante papel como
reguladores imunológicos, podendo de fato coordenar diversos aspectos da resposta
imune124. O TGF-β exerce importante função em doenças autoimunes, como:
esclerose múltipla, miastenia gravis relacionada oftalmoparesia e diabetes
autoimune 125-128.
Estudos têm sugerido que o TGF-β pode ser um regulador importante no
processo de neurogênese e, desta forma, alterações nos níveis desta proteína
podem estar relacionadas às doenças que comprometem o desenvolvimento do
SNC, incluindo o TEA125,129-131.
27
1.5.1 TGF-β e TEA
O controle inadequado da resposta imunitária em crianças autistas tem
sido relacionada com baixos níveis plasmáticos de TGF-β125. Um estudo realizado
por Ashwood e colaboradores125, sugere que existe uma correlação significativa
entre os escores clínicos e níveis inferiores de TGF-β e esta condição pode estar
associada com a diminuição nos comportamentos adaptativos observados nestas
crianças. Devido à redução dos níveis de TGF-β, as respostas imunes em indivíduos
com TEA pode ser inadequada e mudança no sistema imunológico pode predispor
indivíduos para o desenvolvimento de possíveis respostas autoimunes e/ou
interações adversas neuroimunes durante a fase de desenvolvimento do SNC125,131.
A ativação imune materna em período pré-natal tem sido apontada como
fator importante para o desenvolvimento de comportamento autista na prole 132.
Níveis diminuídos de TGF-β no hipocampo de ratos, apresentados pelos estudos de
Patterson132 e de Graciarena e colaboradores133, podem estar relacionadas com
alterações no processo de diferenciação e migração de neurônios e, por isso, o
TGF-β representa um papel importante na fisiopatologia de doenças neurológicas
como TEA e esquizofrenia134.
1.6 MODELO ANIMAL DE TEA
Entre
diversas
doenças
humanas
estudadas,
a
produção
e
a
personalização de modelos animais é uma conexão importante entre o entendimento
das propriedades moleculares da doença e o desenvolvimento de agentes
terapêuticos135,136.
Considerando a natureza complexa do TEA, especialmente devido a sua
heterogeneidade e ampla sobreposição de manifestações clínicas, além da
diversidade etiológica, realizar estudos utilizando unicamente modelos humanos
para TEA é um fator limitante. Desta forma, a utilização de modelos animais de
autismo permitem investigações controladas e prospectivas, assim como a utilização
de intervenções e desdobramentos dos mecanismos envolvidos.
Entre os modelos animais reproduzidos para mimetizar características
comportamentais, neurais, imunes e genéticas encontrados no TEA, estão aqueles
que utilizam agentes teratogênicos como ácido valpróico137 que afetam a migração
28
de diferenciação de neurônios serotoninérgicos, quando administrado em períodos
críticos da embriogênese de roedores137.
Evidências clínicas137,138 e experimentais132,139 têm apontado que as
infecções pré-natais podem interferir no ambiente intra-uterino, promovendo
anormalidades comportamentais com similaridades ao autismo137,140, inclusive com a
ativação inadequada de citocinas pró-inflamatórias137,138,140 e alterações na resposta
imune137,140,141. Neste sentido, um dos modelos experimentais de TEA estudados
extensivamente nos últimos anos mostra que a ativação imune materna a partir da
adiministração de LPS no 9,5 dia gestacional (9 dias e 12 horas), período antes do
fechamento do tubo neural 142 é capaz de promover anormalidades comportamentais
semelhantes aquelas encontradas em indivíduos autistas.
A ativação imume materna permite caracterizar a exposição ao LPS como
modelo adequado para o estudo do autismo, uma vez que os animais submetidos
sistematicamente a esta endotoxina, conseguiram estabelecer as três características
principais de um modelo animal de doença: (a) validade de face (sintomas
semelhantes)132,143; (b) validade de constructo (causa semelhante)132,143 e (c)
validade preditiva (resposta análoga a tratamentos para prevenir ou reverter os
sintomas)132,143.
29
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos da suplementação de AGP ω-3, sobre os parâmetros
comportamentais e bioquímicos em um modelo experimental de autismo.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar os efeitos da suplementação de AGP ω-3 sobre parâmetros de
comportamento estereotipado e interação social recíproca na prole de ratos
machos em PND 52;

Verificar o efeito da suplementação de AGP ω-3 nos níveis de NSE no
cerebelo e hipocampo;

Analisar o efeito da suplementação de AGP ω-3 nos níveis de BDNF no
cerebelo e hipocampo;

Avaliar o efeito da suplementação de AGP ω-3 nos níveis de TGF-β no
cerebelo e hipocampo.
30
3. MÉTODOS
3.1 TIPO DE ESTUDO
Estudo experimental utilizando o modelo da doença.
3.2 ANIMAIS
Para realização do estudo foram utilizadas 12 ratos Wistar (Rattus
norvegicus) fêmeas, virgens, pesando entre 250 e 300g, provenientes do biotério da
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul – PUC/RS, acasaladas com 6
machos da mesma linhagem e peso. Durante todo o experimento, os animais
permaneceram em padrão sanitário controlado, onde foram mantidos em gaiolas de
polipropileno (46 x 31 x 21cm) forradas com cama de maravalha. Os animais ficaram
em temperatura controlada (22ºC+1ºC) e períodos de luz artificial (12 horas
claro/escuro). Durante todo o período experimental os animais receberam ração
comercial padronizada e água ad libitum.
3.3 ACASALAMENTO
Para a efetivação do acasalamento, as fêmeas foram colocadas ao final
do ciclo de luz (19 horas) nas gaiolas dos machos, sendo sempre introduzidas duas
fêmeas para cada macho. No horário das 7 horas da manhã do dia seguinte, período
inicial do ciclo de luz, foi verificado se ocorreu a prenhez, através do processo do
lavado vaginal. Este procedimento seguiu as descrições de Held e colaboradores144
e consistiu na introdução de NaCl por meio de uma pipeta plástica na vagina da
fêmea, onde foi coletado a secreção para análise em microscópio óptico e
investigada a presença de espermatozoides junto ao material biológico do animal.
Nas fêmeas que foram identificadas com a presença de espermatozoides
considerou-se o dia gestacional zero (DG 0)145. Estas fêmeas, agora denominadas
de matrizes, foram separadas aleatoriamente e colocadas em gaiolas moradias
individualmente, permanecendo nas mesmas, durante todo o período de prenhez.
31
3.4 ATIVAÇÃO IMUNE MATERNA
Para a caracterização do modelo animal de autismo a partir da ativação
imune materna, as matrizes foram divididas aleatoriamente e dois grupos. Um dos
grupos recebeu a administração intraperitoneal (ip) de uma única injeção de LPS
adquirido por extração fenólica a partir de Escherichia coli, sorotipo 0127:B8
(Sigma®), na dose de 100 µg/Kg no DG 9.5, diluída em 50 µg/Kg de solução aquosa
de NaCl 0,9% estéril 142,146, caracterizando o grupo experimental (LPS-tratados). O
segundo grupo recebeu apenas solução NaCl 0,9% estéril ip no volume equivalente
ao grupo experimental, caracterizando o grupo controle (Salina-tratados). A
administração das substâncias ocorreu sempre no período vespertino (entre 15 – 17
horas).
3.5 PADRONIZAÇÃO DA NINHADA
A realização dos partos aconteceu de forma natural e no dia pós-natal
(PND) 1 e PND 2 não foi realizada nenhuma manipulação nos animais para evitar a
possibilidade de rejeição da mãe em relação a prole. No PND 3 as ninhadas foram
ajustadas em 4 fêmeas e 4 machos, totalizando 8 animais por ninhada. A distinção
entre os gêneros foi obtida através da identificação da diferença visual relacionada à
distância ano-genital, sendo maior em machos. Em PND 8-15 foi possível confirmar
a distinção entre os gêneros a partir da presença de testículos nos machos e de
mamas nas fêmeas147.
Os filhotes foram distribuídos em dois grupos:
Grupo Salina (n= 20): formado por ratos machos, procedentes de mães
do grupo controle (Salina-tratados).
Grupo LPS (n= 20): formado por ratos machos, procedentes de mães do
grupo experimental (LPS-tratados).
Todos os animais permaneceram com suas mães até PND 21, período
final de aleitamento, onde foi realizado o desmame e tanto as mães quanto a prole
de fêmeas foram submetidas ao procedimento de morte indolor assistida (MIA), que
foi realizada pelo responsável técnico do biotério da UNISUL. A prole de machos
permaneceu no biotério até o final dos procedimentos experimentais.
32
Cada um dos grupos experimentais foi subdivido em outros 2 grupos de
acordo com o tratamento recebido:
Grupo Salina + dieta padrão de laboratório + administração de salina (n=10)
Grupo LPS + dieta padrão de laboratório + administração de salina (n=10)
Grupo Salina + dieta padrão de laboratório + suplementação de AGP ω-3 (n=10)
Grupo LPS + dieta padrão de laboratório + suplementação de AGP ω-3 (n=10)
O AGP ω-3 foi administrado na dose de 0,8 g/kg, via oral*, uma vez ao
dia, sempre no mesmo horário (às 12 horas), durante 21 dias consecutivos. A
solução salina foi administrada no mesmo volume e mesma via. Os animais
receberam suplementação de AGP ω-3 ou solução salina, de acordo com o grupo
experimental, a partir de PND 30. A escolha da dose, horário de administração,
tempo de tratamento e idade dos animais seguiu a descrição de Zugno e
colaboradores74, que mostrou efeitos positivos do AGP ω-3 em respostas
comportamentais de ratos em um modelo experimental de doença neurológica.
As cápsulas de AGP ω-3 continham 1000mg de óleo de peixe, destas
10% eram de AGP EPA e 50% de AGP DHA. Foram escolhidas as cápsulas com
uma maior porcentagem de DHA, devido sua ação na sinaptogênese148 e na
fluidificação das membranas encefálicas59. O DHA interfere na atividade de
proteínas da membrana (canais iônicos, receptores, transportadores, enzimas),
modulando
sistemas
de
neurotransmissores150.
Estudos
mostram sistemas
dopaminérgicos78 e serotoninérgicos140 afetados pela deficiência de AGP ω-3. A
suplementação de DHA até os 24 meses de idade, vem mostrando efeitos benéficos
no desenvolvimento do encéfalo59,148,149.
3.6 MEDIDAS DO PESO CORPORAL
O peso corporal foi avaliado em PND 30 para ajustar o volume das
dosagens de AGP ω-3 indicada para cada animal. No decorrer do período de
suplementação as medidas de peso corporal foram realizadas duas vezes por
*
Para a administração via oral foram utilizadas agulhas de gavagem para camundongos no início do
tratamento (PND 30-PND 40) e substituídas por agulhas de gavagem para ratos a partir PND 41. A
escolha das agulhas respeitou o tamanho e o peso dos animais nas diferentes idades, já que o
tratamento iniciou-se com animais jovens seguindo até a idade adulta.
33
semana, para adequação da dose, de acordo com a descrição de Cysneiros e
colaboradores151.
A síntese das etapas do delineamento experimental está descritas na
Figura 4.
Figura 4 – Diagrama esquemático das etapas do delineamento experimental
proposto no estudo.
34
3.7 TESTES COMPORTAMENTAIS
Os testes comportamentais foram realizados 24 horas após a última
administração de AGP ω-3, entre o período das 9:00 às 13:00 horas, em baixa
iluminação e monitorados com câmera de vídeo. O pesquisador não permaneceu na
sala
de
experimentação
para
evitar
qualquer
interferência
na
resposta
comportamental dos animais. Antes de qualquer um dos procedimentos de avaliação
comportamental os animais eram levados em suas gaiolas-moradia à sala de
experimentação com 1 hora de antecedência – representando o período de
habituação. Todos os equipamentos foram limpos com álcool 70% após o teste de
cada animal, impedindo a permanência de odores.
3.7.1 Comportamento Estereotipado
O teste de estereotipia foi realizado em ratos adultos (PND 52) e seguiu
as descrições de Battisti e colaboradores152. A estereotipia foi considerado como a
permanência do animal em posição estacionária exibindo movimentos rápidos e
repetidos da cabeça e membros dianteiros, além disso, foi observado o
comportamento de subidas e/ou descidas, conforme os vários graus de estereotipia.
Os animais foram retirados de suas gaiolas-moradias, demarcados na
cauda com caneta apropriada e colocados em um aparato de campo aberto (60 x 60
x 30 cm), com três paredes de madeira e uma parede de vidro transparente. O piso
sólido foi dividido em 12 quadrantes iguais. Os animais foram acomodados no
quadrante superior esquerdo do campo aberto, de modo que ficassem de costas
para o centro do campo, onde foram avaliados durante 5 minutos. As imagens do
comportamento do animal foram capturadas por uma webcam 2.0 megapixels fixada
em um tripé e acoplada em um notebook e armazenadas para posterior análise dos
vídeos. Após o termino de cada teste, os animais eram retirados do aparato de
campo aberto e devolvidos à gaiola-moradia.
3.7.2 Interação Social Recíproca
De Acordo com Schneider e Przewłocki 153, o teste para analisar a
interação social nos animais foi baseado na tendência natural dos roedores em
35
investigar com maior dedicação um indivíduo intruso que lhe foi apresentado pela
primeira vez. Neste teste os animais foram submetidos individualmente a interagir
com outro animal desconhecido do mesmo sexo e mesma faixa etária, durante 10
minutos, em um aparato de campo aberto com as mesmas características descritas
no teste de estereotipia. O teste de interação social foi conduzido posteriormente ao
teste de estereotipia e o registro das imagens foi realizado da mesma forma descrita
acima. Os parâmetros usados para avaliar o comportamento de interação social
recíproca seguiu as descrições de Moreira154 e quantificou os tempos de grooming,
de cheirar, de seguir, de chutar, de socar, de montar ou de permitir a monta pelo
outro animal (Figura 5).
Figura 5 – Teste de interação social recíproca entre dois ratos de mesmo sexo e
idade, que não tiveram contato inicial
(Pasciuto et al., 2015)
155
3.8 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
Após os testes comportamentais, os animais foram mortos, o encéfalo foi
removido rapidamente e as áreas de interesse foram dissecadas (hipocampo e
cerebelo) sobre superfície congelada e armazenados em freezer -80ºC para as
análises bioquímicas, conforme descrito a seguir:
3.8.1 Quantificação do BDNF por Western Blotting
Os tecidos encefálicos (hipocampo e cerebelo) obtidos dos animais foram
armazenados a -80°C até a utilização; posteriormente foram homogeneizados com
400 ml de tampão RIPA [Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, , 1% de Triton X-100,
36
0,5% de deoxicolato de sódio, 0,1% de SDS e inibidores de protease (Roche)]
durante 30 min em banho de gelo. O homogeneizado dos tecidos foram então
recolhidos, sonicados por 10 min, centrifugados a 13000 rpm por 10 min e
preparados para transferência Western Blotting.
As amostras foram sujeitos à eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida a
15% e, posteriormente, transferidas para membrana de difluoreto de polivinilideno
(PVDF) (Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas de PVDF foram bloqueadas
saturadas e em solução salina tamponada com Tris Tween-20 (TTBS) contendo
solução albumina bovina a 5%156, as membranas de PVDF bloqueadas foram então
incubadas durante a noite com anticorpo de coelho anti-coelho a 4°C (1:1000, Cell
Signalling, USA). Depois disso, as membranas de PVDF foram lavadas três vezes
em TTBS e incubadas com IgG anti-rato conjugado com fluoróforo infravermelho
(1:10000 Cell Signalling, USA), a 37°C durante 30 min. Na sequência, a membrana
foi submetida a scan em fotodocumentador (Odyssey LI-COR Biosciences) e a
densidometria realizada pelo programa Image Studio (LI-COR Biosciences). Os
níveis de expressão da proteína foram normalizados para beta- actina (anti-rato,
1:1000, Cell Signalling, USA). O valor de densidade integrada (IDV) foi usado para
representar o nível de proteínas.
3.8.2 Quantificação da NSE por Western Blotting
As amostras dos tecidos encefálicos (hipocampo e cerebelo) dos animais
foram preparadas e submetidas à eletroforese em dodecil-sulfato de sódio em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) e análise Western Blotting, conforme descrito por Fatemi
e colaboradores157-160. Para NSE, foram utilizados 10% de resolução de géis. Após
SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose
durante 2 horas a 300 mA. As transferências de Western Blotting foram bloqueadas
durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por incubação durante a noite em
anticorpos primários a 4°C. Os anticorpos primários utilizados foram anti-NSE (1:
2,000; Abcam Inc.) e anti-β-actina (1: 5000; Sigma-Aldrich). As membranas foram
incubadas em anticorpos primários durante a noite a 4°C. Após uma lavagem de 30
minutos em solução salina tamponada com fosfato suplementada com 0,003% de
Tween 20 (PBST), as manchas foram incubadas em anticorpos secundários durante
60 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos secundários utilizados foram
37
A9169 (anti-coelho de cabra de imunoglobulina G (IgG), 1: 80.000; Sigma-Aldrich) e
A9044 (IgG anti-rato de coelho, 1: 80.000; Sigma-Aldrich). As manchas foram
lavadas duas vezes em PBST, e as bandas visualizadas usando o sistema de
detecção
ECL
Western
Blotting
Plus
(GE
Healthcare,
Little
Chalfont,
Buckinghamshire, Reino Unido) e expostas a CL-XPosure Filme (Thermo Scientific,
Rockford, IL, EUA). Bandas imunorreativas foram quantificadas usando subtração do
fundo com um densitômetro de Bio-Rad e software multi-analista de Bio-Rad (BioRad, Hercules, CA, EUA) com o peso molecular aproximado de 46 kDa para NSE e
42 kDa para β-actina. Os resultados foram obtidos com base em pelo menos duas
experiências independentes.
3.8.3 Quantificação do TGF-β por ELISA
A quantificação de TGF-β foi realizada de acordo com método descrito por
Zanirati e colaboradores161. O tecido encefálico foi usado para análise de TGF-β pelo
ensaio adsorvente ligado a enzima (ELISA) utilizando duo set kit (R & D Systems,
Minneapolis, MN, EUA). Os encéfalos foram homogeneizados em tampão PBS
contendo triton 0,1% e inibidor de protéase (50mM - Roche AG, Basileia, Suíça) e,
em seguida, centrifugados (13000 rpm a 4ºC durante 20 minutos). O sobrenadante
foi recolhido e foi realizada quantificação de proteína pelo kit de ensaio de proteína
BCA (Thermo Scientific, EUA). O ensaio de ELISA foi realizado de acordo com o as
instruções do fabricante e a leitura foi realizada em 450 nm na leitora de microplacas
(SPECTRAMAX,
Molecular
Devices,
USA).
Os
níveis
de
proteína
foram
apresentados em pg/mg de proteína total.
3.9 ANÁLISE DE DADOS
Para os ensaios bioquímicos e comportamentais, os resultados foram
apresentados como média ± desvio padrão da média (E.P.M., 95%). A análise dos
dados bioquímicos entre os grupos foi realizada por meio de análise de variância
(ANOVA) de uma ou duas vias, seguido de post hoc de Newman-Keuls. Para os
testes comportamentais referentes à validação do modelo experimental foi utilizado o
teste T-Student. A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05.
38
As análises foram realizadas utilizando o programa Statistical Package for the Social
Sciences 20.0 (SPSS).
3.10 ASPECTOS ÉTICOS
Este estudo foi submetido à avaliação do Comitê de Ética no Uso de
Animais (CEUA) da Universidade do Sul de Santa Catarina e aprovado sob número
de protocolo 14.003.2.01.IV. A utilização dos animais seguiu a Diretriz Brasileira para
Cuidado e a Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos – DBCA do
CONCEA (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal, Resolução
Normativa nº 12, de 20 de setembro de 2013, publicado no Diário Oficial da União –
Secão 1)162.
Para que fosse minimizado o sofrimento dos animais, foi utilizado o
tamanho de amostra mínimo e adequado para a realização da análise estatística. O
número de animais em cada grupo foi baseado no estudo de Graciarena e
colaboradores133 que avaliou parâmetros bioquímicos em um modelo animal de
autismo através da administração subcutânea de LPS.
39
4 RESULTADOS
Os resultados obtidos a partir das avaliações comportamentais e
bioquímicas foram ordenados da seguinte maneira:
4.1 TESTES COMPORTAMENTAIS
4.1.1 Comportamento Estereotipado
Uma das características do TEA é a presença de comportamento
repetitivo e estereotipado e a avaliação da atividade de grooming (movimento de
autolimpeza) têm sido amplamente utilizada como um índice de comportamento
repetitivo em estudos pré-clínicos do TEA155,163.
Os resultados deste estudo mostraram que a exposição pré-natal ao LPS
foi capaz de aumentar significativamente o número (Figura 6A) e tempo (Figura 6B)
de episódios de movimentos estereotipados (grooming) quando comparados aos
animais do grupo Salina-tratados [(F = 4,830; P= 0,041); (F = 2,681; P= 0,009),
respectivamente] (Figura 6). Considerando o parâmetro de grooming como
referência como um dos critérios utilizados para a validação do modelo experimental
proposto, os resultados mostraram que a suplementação de AGP ω-3 reverteu este
parâmetro avaliado entre os animais LPS + AGP ω-3 comparados aos animais do
grupo Salina+ AGP ω-3 [(F = 4,857; P= 0,005)]. O teste de estereotipia foi
mensurado durante 5 minutos, os dados foram expressos em média ± desvio
padrão, cada grupo apresentou um n= 10.
40
Figura 6 – Número (Figura 6A) e tempo (Figura 6B) de episódios de movimentos
estereotipados (grooming) realizados pelos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3,
LPS + AGP ω-3.*Diferença significativa no número de grooming (nº de episódios) entre os grupos
Salina e LPS. # Diferença significativa no tempo (segundos) entre os grupos LPS e LPS + AGP ω-3.
P<0,05 (T. Student).
4.1.2 Teste de interação social recíproca
A interação social é uma das características mais proeminentes do TEA,
podendo se manifestar através do isolamento ou comportamento social anormal,
incapacidade em participar de atividades em grupo, marasmo afetivo ou
manifestações inadequadas de se relacionar e dificuldade em transmitir emoções ao
outro2,155. O teste de interação social recíproca conduzido neste estudo foi avaliado
por tempo (em segundos), mensurado durante 10 minutos, os resultados mostraram
diferenças significativas nos parâmetros de cheirar, de seguir e de montar (Figura 7).
O grupo LPS-tratados diminuiu significativamente o parâmetro de cheirar quando
comparado ao grupo Salina-tratados [(F= 2,453; P= 0,001)] e reverteu esta condição
após suplementação de AGP ω-3 [(F= 7,217; P= 0,013)]. Embora os valores não
apresentaram-se significativos, foi possível observar uma tendência a menor tempo
de interação social recíproca no parâmetro seguir entre os animais expostos ao LPS
em período pré-natal, no entanto, quando comparados ao animais LPS e LPS+ AGP
ω-3, os resultados mostraram que a suplementação de AGP ω-3 foi capaz de
provocar alterações significativas neste parâmetro. O parâmetro de montar também
foi significativamente menor entre os ratos LPS-tratados [(F= 13,957; P= 0,002)], no
entanto, a suplementação de AGP ω-3 não apresentou resultados significativos para
este parâmetro. Os dados do teste de interação social foram expressos em média ±
desvio padrão, cada grupo foi composto por um n= 10.
41
Figura 7 – Tempo (em segundos) da interação social apresentado pelos grupos:
Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-3. *Diferença significativa entre os grupos
Salina e LPS. # Diferença significativa entre os grupos LPS e LPS + AGP ω-3. P<0,05 (T. Student).
4.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
4.2.1 Quantificação de NSE
A Figura (8) apresenta o resultado da densidometria da NSE de
hipocampo e cerebelo. Os resultados demonstraram um aumento dos níveis
proteicos da NSE significativamente maiores no hipocampo de animais LPStratados, quando comparados aos Salina-tratados e esta condição foi revertida pela
suplementação de AGP ω-3, significativamente comparando os grupos LPS x LPS +
AGP ω-3. Ao contrário do hipocampo, o cerebelo não apresentou diferença
significativa para este marcador de dano neuronal. Os dados da quantificação de
NSE foram expressos em média ± desvio padrão, cada grupo foi composto por um
n= 6.
42
Figura 8 – Níveis proteicos de NSE nas estruturas encefálicas do hipocampo (Figura
8A) e cerebelo (Figura 8B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP
ω-3.*Diferença significativa entre os grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-3.
P<0,05 (Newman-Keuls).
4.2.2 Quantificação de BDNF
Apesar de os níveis proteicos de BDNF das estruturas encefálicas
estudadas não apresentarem diferenças significativas em nenhum dos grupos
experimentais, os resultados mostraram uma tendência ao aumento deste fator
neurotrófico associado à suplementação de AGP ω-3 (Figura 9). Os dados da
quantificação de BDNF foram expressos em média ± desvio padrão, cada grupo
apresentou n= 6.
43
Figura 9 – Níveis proteicos de BDNF nas estruturas encefálicas do hipocampo
(Figura 9A) e cerebelo (Figura 9B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS
+ AGP ω-3.
4.2.3 Quantificação de TGF-β
A expressão do TGF-β foi quantificada no hipocampo e cerebelo dos
animais. A exposição pré-natal de LPS foi capaz de diminuir significativamente os
níveis de TGF-β no hipocampo e esta condição foi revertida pela suplementação de
AGP ω-3 (Figura 10). No cerebelo, embora os valores não tenham se mostrado
significativos, foi possível observar uma tendência ao aumento na expressão de
TGF-β após a suplementação de AGP ω-3. Os dados da quantificação de TGF-β
foram expressos em média ± desvio padrão, cada grupo analisado apresentou um
n= 6.
44
Figura 10 – Níveis de TGF-β nas estruturas encefálicas do hipocampo (Figura 10A)
e cerebelo (Figura 10B) nos grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω3.*Diferença significativa entre os grupos: Salina, LPS, Salina + AGP ω-3 e LPS + AGP ω-3. P<0,05
(Newman-Keuls).
45
5 DISCUSSÃO
Os prejuízos persistentes na comunicação social recíproca, interação
social, padrões restritos e repetitivos de comportamento, atividades e/ou interesses
são evidenciados no TEA1. Sintomas assim estão presentes desde a infância, e se
perpetuam no decorrer do desenvolvimento, acarretando numa limitação e/ou
prejudicando
as
atividades
do
cotidiano155.
Considerando
o
espectro
de
apresentações, normalmente as manifestações da síndrome variam bastante,
dependendo da gravidade, do nível de desenvolvimento e da idade cronológica do
paciente1.
A etiologia e as características clínicas do TEA são complexas e
extremamente heterogêneas. Diversos fatores de risco potenciais como influências
genéticas164, epigenéticas165, ambientais e/ou fatores imunológicos 140,166, têm sido
apontados como fatores causais para o desenvolvimento do TEA, considerando
assim um transtorno multifatorial 167.
Experiências vivenciadas durante o período pré-natal são determinantes
para a saúde do feto132. A ocorrência de infecções maternas e a consequente
ativação do sistema imune da mãe ocasionam uma série de alterações estruturais e
funcionais no sistema nervoso da prole, podendo predispor o indivíduo a doenças
neurológicas na vida pós-natal, incluindo o TEA132.
Spencer e colaboradores146, em um estudo pré-clínico de TEA, mostraram
que a administração intraperitoneal de LPS no período pré-natal induziu a um
processo inflamatório no SNC dos fetos através do aumento da liberação de
citocinas pró-inflamatórias que, por sua vez, após atravessarem a barreira
hematoencefálica, conseguiram modular a atividade dos neurônios causando
alteração
na
neurotransmissão
e,
consequentemente,
desenvolvendo
comportamentos semelhantes ao TEA em ratos Wistar. Os comportamentos atípicos
associados à exposição pré-natal de LPS podem se manifestar em períodos de curto
ou longo prazo168.
A manifestação de comportamentos estereotipados apresentados pelos
animais experimentais expostos ao LPS em período pré-natal e avaliados neste
estudo foi semelhante aos resultados de Spencer e colaboradores146 e replicados
por Kirsten e colaboradores142. Da mesma forma, os interesses limitados e prejuízo
46
na interação social recíproca foram confirmados neste estudo, especialmente, nos
parâmetros cheirar e montar. Considerando que estes representam comportamento
natural de roedores, uma alteração nas respostas dos testes de estereotipia e
interação social recíproca permite caracterizar este como um modelo adequado com
validade de face e de constructo, pelo menos.
A etiologia do TEA é julgada complexa 5, tornando assim os tratamentos
farmacológicos clássicos insuficientes ou inadequados e a busca por terapias
complementares tem sido considerada uma alternativa interessante 84. Suplementos
alimentares tem sido apontados como reguladores estruturais e funcionais do SNC e
eficazes no tratamento de doenças neurológicas e psiquiátricas 9,10,59. O AGP ω-3,
em especial, é capaz de proporcionar atividades neurobiológicas através da
modulação da neuroplasticidade e formação da bainha de mielina, atuando no
desenvolvimento dos sistemas neurais sensoriais, perceptivos, motores e cognitivos
como aprendizagem e memória60. Além disso, apresenta ação anti-inflamatória59,64 e
antioxidante10.
A
suplementação
de
AGP
ω-3
durante
as
fases
iniciais
do
desenvolvimento do SNC, conduzidas neste estudo, foi capaz de reverter à resposta
comportamental de ratos expostos ao LPS em período pré-natal, exercendo, desta
forma, efeito positivo para as manifestações clínicas típicas do TEA. Em uma metaanálise realizada por Lee e colaboradores e publicada em 201464, sugeriu que uma
melhor fluidificação da membrana encefálica proporcionado pela administração de
DHA na suplementação tenha uma participação importante na melhora no
comportamento de estereotipia e interação social de animais. Embora não se tenha,
até o momento, estudo conclusivo que apresente alteração em determinada via de
neurotransmissão
associada
à
fisiopatologia
do
TEA,
é
possível
que
o
reestabelecimento de níveis de dopamina78 ou ainda a melhora na transmissão
sináptica glutamatérgica169 proporcionados pela suplementação de AGP ω-3,
tenham favorecido o desenvolvimento neuronal e auxiliado a redução dos sintomas
autistas neste modelo experimental. Resultados semelhantes foram encontrados por
Theije e colaboradores170 em um modelo de alergia alimentar.
A segunda etapa deste estudo teve objetivo de avaliar a expressão de
biomarcadores associados a alterações neurológicas. Os biomarcadores são
indicadores de processos biológicos normais, patológicos ou de resposta
farmacológica de uma intervenção terapêutica89. Embora não se tenha, até o
47
momento, um marcador biológico específico ou exame complementar para auxiliar o
diagnóstico do TEA, alguns estudos têm apontado alteração em níveis de
marcadores de danos às células neuronais como a NSE 96, de fatores neurotróficos
como o BDNF171, além de alterações em fatores de crescimento como o TGF-β131.
A NSE é um importante marcador de danos às células neuronais95 e, por
ser uma enzima glicolítica, sua atividade metabólica pode refletir nos neurônios91.
Estudos têm mostrado que a análise da sua expressão pode contribuir para a
investigação de doenças neurológicas, como o TEA172. O aumento na expressão da
NSE no hipocampo de animais LPS-tratados em período pré-natal, quantificado
neste estudo, foi semelhante aos resultados encontrados por Ogundele e
colaboradores173 em um modelo de neuroinflamação a partir da intoxicação por
cianeto (20mg/kg). De modo geral, infecções maternas são capazes de provocar, na
prole, ativação da micróglia, metabolismo neuronal anormal e estresse oxidativo
durante o processo de neurogênese. É possível que uma ativação na micróglia e
aumento de dano oxidativo47, parâmetros frequentemente apresentados em modelos
pré-clínicos de TEA, estejam relacionados a um dano encefálico que trouxe como
consequência o aumento na expressão da NSE no hipocampo com consequentes
alterações neurológicas.
A suplementação de AGP ω-3 foi capaz de reverter os níveis diminuídos
de NSE no hipocampo. A deficiência de AGP ω-3 na alimentação, faz com que
ocorra uma redução nas concentrações de DHA no encéfalo, associado aos
menores índices de desenvolvimento neuronal 174. Estudos in vitro169 e in vivo169
mostraram que a suplementação de AGP ω-3, especialmente como maior teor de
DHA, exerceu papel importante no neurodesenvolvimento, promovendo crescimento
neuronal no hipocampo, sinaptogênese, diferenciação celular e ações antiapoptótica169.
O BDNF é uma proteína que se apresenta naturalmente no SNC,
colaborando para o desenvolvimento do encéfalo pré e pós-natal e está relacionado
com os processos de aprendizagem e memória 104,105,116, participando nos ajustes
das atividades sinápticas e na plasticidade neuronal 112,119. Apesar de os valores de
expressão de BDNF não mostrarem-se significativos neste estudo, foi possível
observar uma tendência à diminuição desta proteína no hipocampo e cerebelo dos
animais expostos ao LPS em período pré-natal. Um estudo clínico conduzido por
Abdallah e colaboradores175, mostrou que pacientes autistas apresentam alteração
48
nos níveis de BDNF e sugeriu que níveis diminuídos estejam relacionados com
anormalidades na proliferação, migração e sobrevivência celular durante o
desenvolvimento do SNC, acarretando em alterações neurológicas descritas no
TEA, entre elas, comprometimento no processo de neuroplasticidade176. Estes
dados fortalecem a relação entre fatores ambientais que provocam diminuição dos
níveis de BDNF (nestes casos, ativação imune materna) e etiologia do TEA48,124,177.
Além disso, níveis diminuídos de BDNF podem estar relacionados à
regulação negativa de Akt cinase que regula, por sua vez, a Bcl2. Desta forma, a
alteração na atividade da via de sinalização anti-apoptótica BDNF-Akt-Bcl2 pode
representar um mecanismo implícito parcialmente responsável pela etiologia do
TEA178. É possível que um aumento no tamanho da amostra possa atingir a
significância estatística para este fator neurotrófico, em especial para o modelo
experimental de escolha deste estudo.
Um estudo de revisão conduzido por Das171 em 2013, mostrou que um
processo de neuroinflamação durante o período intra-uterino pode levar a alterações
no metabolismo de AGP e seus metabólitos. Os AGP ω-3 são conhecidos por elevar
os níveis de BDNF no encéfalo, e tanto o AGP ω-3 quanto o BDNF apresentam
papéis importantes no desenvolvimento do SNC e na função cognitiva171,179,180. Os
resultados deste estudo mostraram que a suplementação de AGP ω-3 aumentou,
embora com valores não significativos, a expressão dos níveis de BDNF no
hipocampo e no cerebelo de animais expostos ao LPS em período pré-natal. Esses
dados podem estar relacionados com capacidade dos metabólitos de AGP em
aumentar os níveis dos receptores de BDNF171. Neste sentido, sugere-se que
distúrbios neurocomportamentais na prole possam estar relacionados com a
deficiência de AGP ω-3.
O TGF-β é uma citocina que pode ser expressa no encéfalo e representa
um regulador essencial das respostas à lesão e inflamação de estruturas do
SNC181,182. O TGF-β é considerado uma citocina multifuncional e imunossupressora,
crítica para a homeostase imune e que desempenha um papel importante no
desenvolvimento em todo o processo de embriogênese175.
A redução nos níveis de TGF-β no hipocampo de animais LPS-tratados
em período pré-natal, apresentados neste estudo, foi semelhante aos resultados
encontrados por Ashwood e colaboradores125 e, mais recentemente por Gohary e
colaboradores183, quando demonstraram níveis diminuídos de TGF-β plasmático em
49
indivíduos autistas. A diminuição nos níveis de TGF-β pode estar relacionada com
uma alteração no processo de migração celular, apoptose ou ainda, regulação do
sistema imunitário do SNC. Além disso, o TGF-β, no hipocampo, desempenha uma
função
importante
na
programação
e
modulação
da
interação
social
e
comportamento repetitivo131,133. Shen e colaboradores182, em um estudo utilizando
modelo experimental de Alzheimer, mostraram que o TGF-β exerce um papel
importante na manutenção da integridade neuronal e a sobrevivência dos neurônios
do SNC, evidenciando envolvimento no desenvolvimento e plasticidade neuronal 182.
Somando-se a isto, o TGF-β é capaz de controlar o processo inflamatório e exercer
efeito neuroprotetor a partir de ações anti-inflamatórias e anti-apoptóticas184 e, por
isso, pode representar um fator de crescimento com potencial atuação na etiologia
do TEA185.
A suplementação de AGP ω-3 foi capaz de aumentar os níveis de TGF-β
no hipocampo. Esta condição pode estar relacionada à atenuação da ativação da
micróglia, principalmente devido a maior proporção da suplementação de DHA que
está envolvida na modulação de respostas inflamatórias186,187. O AGP ω-3, quando
utilizado em período prolongado por pacientes com doenças neurológicas ou
psiquiátricas, favorece a homeostasia e auxilia na redução das manifestações
clínicas apresentadas por estes pacientes10,174,188.
Por fim, em conjunto à crescente evidência de que a ativação imune
materna é um dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento do TEA (modelo
animal e humanos), este estudo é a primeira evidência de que a suplementação de
AGP ω-3 está associada a melhora no comportamento de estereotipia e interação
social recíproca, além de diminuir os níveis de NSE e aumentar os de níveis de
expressão de BDNF e TGF-β. Em conclusão, os resultados obtidos neste estudo
auxiliam a compreensão do mecanismo neuroprotetor do AGP ω-3 e de seu
potencial papel na terapia não-farmacológica para tratamento do TEA.
50
6 CONCLUSÃO
Tomados em conjunto, os resultados do presente estudo indicam que a
ativação imune materna provocada pela administração de LPS no DG 9,5 causou na
prole adulta alterações comportamentais e neuroquímicas condizentes com o TEA,
sendo elas:
- Aumento de movimentos estereotipados e redução no comportamento
social recíproco;
- Aumento nos níveis de marcador de dano neuronal (NSE) e diminuição
da expressão de TGF- β no hipocampo de ratos LPS-tratados.
A suplementação de AGP ω-3 apresentou reversão do comportamento
autista e exerceu efeito neuroprotetor, especificamente:
- Diminuição de movimentos estereotipados e aumento no comportamento
social recíproco;
- Diminuição nos níveis de marcador de dano neuronal (NSE) e aumento
da expressão de TGF- β no hipocampo de ratos LPS-tratados.
Embora o AGP ω-3 tenha apresentado resultados positivos, tanto
comportamentais como neuroquímicos, no modelo experimental de TEA, novos
estudos são necessários para avaliar os efeitos da suplementação com este AGP
em outras fases do desenvolvimento e em doses de administração diferentes para
confirmar sua potencial ação como alternativa terapêutica para o tratamento do TEA.
E, a partir desses resultados, propor estudos com uma abordagem clínica.
51
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66
ANEXO
ANEXO A- Parecer Aprovação do Comitê de Ética

naiana da rosa a suplementação de ácido graxo

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