CARLOS JORGE ROCHA OLIVEIRA Óxido Nítrico Estimula a Via de

Transcrição

CARLOS JORGE ROCHA OLIVEIRA
Óxido Nítrico Estimula a Via de Ras-MAP Quinase
Promovendo a Progressão do Ciclo Celular e
Proliferação em Células Endoteliais
de Aorta de Coelho
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo, Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Doutor em Ciências
São Paulo
2004
CARLOS JORGE ROCHA OLIVEIRA
Óxido Nítrico Estimula a Via de Ras-MAP Quinase
Promovendo a Progressão do Ciclo Celular e
Proliferação em Células Endoteliais
de Aorta de Coelho
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo, Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Doutor Ciências
Orientador: Prof. Dr. Hugo Pequeno Monteiro.
São Paulo
2001
ROCHA OLIVEIRA, Carlos Jorge.
Óxido Nítrico Estimula a Via de Ras-MAP Quinase Promovendo a Progressão do Ciclo
Celular e Proliferação em Células Endoteliais de Aorta de Coelho. São Paulo, 2004. 121 p.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina.
1. Óxido Nítrico. 2. Transdução de Sinal. 3. MAP Quinase
4..Ciclo Celular 5. Ciclinas, quinase dependentes Ciclinas. 6. Proliferação.
Minha dedicatória à...
Professor Dr. Hugo Pequeno Monteiro, pelo
incentivo
e
espírito
de
companheirismo
e
profissionalismo.
Aos meus pais Ascenção (Nena) e Jayme (in
memorium), pelo amor e sabedoria que sempre
refletiram sobre minha conduta pessoal...
Às minhas irmãs, Cleomar, Maria Luiza, Lucimar
e Fabiana por aprendermos juntos que obstáculos
existem para serem vencidos...
Aos meus filhos, Carlos (Nê), Juliano (Jú),
Gabriela (Gabi) e Carolina (Carol) que me dão
forças e a determinação de sempre recomeçar por
eles...
À Iara, Amiga, Companheira, Confidente, o meu
motivo maior para viver e sempre vencer...
Meus agradecimentos
O crescimento pessoal e profissional do ser humano é construído
através das pessoas que o cercam. O presente trabalho é fruto
do auxílio de várias pessoas que contribuíram direta e
indiretamente oferecendo seu apoio e contribuição,
agradeço a todas...
ABREVIAÇÕES
BSA
Albumina Bovina
Ca2+
Cálcio
cAMP
Adenosil monofosfato cíclico
CDK
Quinase dependente de ciclina
cGMP
Guanosina monofosfato ciclico
cNOS
NO sintetase constitutiva
DAG
Diacilglicerol
EGF
Fator de crescimento epidérmico
EGFR
Receptor do fator de crescimento epidérmico
ERN
Espécies reativas de nitrogênio
ERO
Espécies reativas de oxigênio
FAK
"Focal adhesion kinase"
GDP
Difosfato de guanosina
GSH
Tripeptídeo redutor glutationa
GTP
Trifosfato de guanosina
H 2O 2
Peróxido de nitrito
INO
NO sintetase induzível
IP3
Trifosfato inositol
L-NAME
Éster de N-metil-L-arginina
L-NMMA
Acetato de N-monometil-L-arginina
MAPK
Quinase proteíca ativada por mitógeno
MEK
Quinase protéica ativadora de MAPK
NO
Óxido nítrico
O2
Oxigênio
O 2-
Superóxido
OH-
Radical hidroxila
OONO-
Peroxinitrito
PDGF
Fator de crescimento derivado de plaquetas
PI
Fosfato inositol
PI-3K
Fosfatidilinositol 3 quinase
PI-3P
Fosfatidilinositol 3 fosfato
PKA
Proteína quinase dependentes de cAMP
PKC
Proteína quinase C
PKG
Proteína quinase dependente de cGMP
PLC
Fosfolipase C
PLCγ
Fosfolipase Cγ
PTK
Proteína tirosina quinase
PTP
Proteína tirosina fosfatase
RSNO
S-nitrosotiol
SBF
Soro bovino fetal
SH2
"src-homology type 2 domain"
SH3
"src-homology type 3 domain"
SNAP
S-nitroso-N-acetil-penicilamina
SNP
Nitroprussiato de sódio
Tyr
Tirosina
VEGF
Fator de crescimento do endotélio vascular
SUMÁRIO
1 - Introdução ..............................................................................................15
1.1 Proteínas tirosina quinases e tirosina fosfatases nas vias de sinalização
celular ...........................................................................................................16
1.2 Modulação das atividades de tirosina quinase e tirosina fosfatases por
sistemas redox..............................................................................................20
1.3 Células endoteliais ................................................................................22
1.4 Produção de NO e O2-
por células musculares lisas e por células
endoteliais ....................................................................................................23
1.5 Processos de sinalização dependente de óxido nítrico (NO) ................24
1.6 Efeitos do NO na proliferação de células endoteliais ............................28
1.7 Ciclo celular ............................................................................................29
1.8 Controle do ciclo celular em mamíferos ..................................................33
1.9 Transição G1-S e as quinases cdk 4,6 / ciclina D...................................33
1.10 NO e o ciclo celular ...............................................................................36
2 – Objetivos ..............................................................................................37
3 – Materiais e Métodos ............................................................................39
3.1 Materiais ...............................................................................................40
3.2 Métodos ................................................................................................43
3.3 Transfecção de DNA plasmidial em células endoteliais de aorta de coelho
......................................................................................................................................... 44
3.3.1 Transfecção e isolamento dos clones ................................................45
3.3.2 Caracterização dos clones de células endoteliais de aorta de coelho
transfectadas com o mutante negativo dominante de p21Ras ....................46
3.4 Western blot...........................................................................................47
3.5 Análise do ciclo celular ..........................................................................49
3.6 Ensaio de proliferação celular.................................................................49
3.7 Fracionamento citoplasmático e nuclear.................................................50
3.8 Análise estatística ...................................................................................51
3.9 Imunofluorescência Indireta (Imuno-Citoquímica)...................................51
4 – Resultados ............................................................................................53
4.1 Efeitos da inibição de p21Ras na fosforilação e ativação das MAP
quinases ERK 1 / ERK 2 em células endoteliais de aorta de coelho mediada
por óxido nítrico e soro bovino fetal ..............................................................54
4.2 Translocação das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo e
conseqüente fosforilação do fator de transcrição Elk-1 estimulada por óxido
nítrico, dá início a ativação do ciclo celular...................................................58
4.3 Fator de transcrição Elk-1 fosforilado aumenta e expressão da ciclina D1
e das quinases dependentes de cliclinas cdk4 e cdk 6.................................68
4.4 Associação catalítica da ciclina D1 com as proteínas quinases
dependentes de ciclinas Cdk4 e Cdk6 hiperfosforila a proteína retinoblastoma
(pRb) quando células endoteliais de aorta de coelho foram estimuladas com
doadores de NO e SBF.................................................................................73
4.5 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na progressão do ciclo
celular da fase G1 para a fase S em células endoteliais de aorta de coelho
......................................................................................................................76
4.6 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na passagem do ciclo celular
da fase G1 para a fase S, através do aumento da expressão da ciclina E...83
4.7 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na passagem do ciclo celular
da fase S para a fase G2/M, através do aumento da expressão da ciclina ..85
4.8 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na proliferação de células
endoteliais de aorta de coelho ......................................................................91
4.9 Inibição das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 e seus efeitos na proliferação de
células endoteliais de aorta de coelho induzida por óxido nítrico e SBF.................... 92
5 – Discussão .............................................................................................96
6 – Referências Bibliográficas ................................................................105
7 – Apêndice..............................................................................................118
RESUMO
As vias regulatórias do ciclo celular, como a cascata de proteínas
quinases dependentes de ciclina (CDKs), são moduladas por sinais
extracelulares,
principalmente
fatores
de
crescimento
e
hormônios.
Observações feitas no início da década de 90 (Ziche et al., 1994) que têm
sido corroboradas por vários grupos de pesquisa, apontam para a
participação do Óxido Nítrico (NO) na angiogênese, processo que envolve a
proliferação e a migração de células endoteliais (Folkman & Shing, 1992).
Deve-se entretanto ressaltar que o papel do NO na seqüência dos eventos
envolvendo a cascata de sinalização Ras-MAP quinases e suas conexões
com ciclinas e quinases dependentes de ciclinas, culminando com a
proliferação das células endoteliais não foi descrito. Nossa contribuição vem
no sentido de preencher esta lacuna. Levando em conta essas observações
e os resultados obtidos neste estudo, concluímos que o NO através da
cascata de sinalização por ele induzida (Rocha Oliveira, et al, 2003),
contribui para o entendimento do mecanismo que marca a participação deste
radical na proliferação de células endoteliais de aorta de coelho. Nossos
estudos demonstram a participação do NO na progressão do ciclo celular em
células endoteliais de aorta de coelho. Seus efeitos são exercidos
especificamente sobre a via p21Ras – MAP quinase. A seqüência de
eventos: fosforilação de Elk-1, síntese de ciclina D1, cdk4, cdk6, fosforilação
da pRb, transição do ciclo celular da fase G1 para a fase S, controlada pela
ciclina E, passagem da fase S para G2/M através do aumento da expressão
da ciclina A que culmina com a proliferação das células endoteliais de aorta
de coelho.
ABSTRACT
The cell cycle regulation pathways, like cyclin-dependent protein
kinase cascade (CDKs), are modulated by extracellular signals, including
growth factors and hormones. Investigations made since the 90´s (Ziche et
al., 1994) indicate that Nitric Oxide (NO) plays an important role in
angiogenesis, which is a process that involves the proliferation and migration
of endothelial cells (Folkman & Shing, 1992). However, the role of NO in
these events involving Ras-MAP Kinases signaling cascade and its
connections with cyclin and cyclin-dependent kinases, culminating with
endothelial cells proliferation has not been described. This study intends to fill
this gap. Based on the observations of Rocha Oliveira et al., 2003 and the
findings of this study we concluded that NO is a important component in the
proliferation mechanism and in the cell cycle progression of rabbit aortic
endothelial cells. NO acts on the p21Ras – MAP kinase pathway in the
following sequence: Elk-1 phosphorilation, cyclin D1, cdk4, cdk6 synthesis,
pRb phosphorilation, cycle cell transition from G1 to S phase, controlled by
cyclin E, passage from S phase to G2/M through an increase of cyclin A
expression concluding in the proliferation of the rabbit aortic endothelial cells.
Keywords – Nitric Oxide – Signal Transducer – MAP kinases – Cell Cycle –
Cyclins, cdk4 and cdk6 – Proliferation.
1 - INTRODUÇÃO
Introdução
16
1.1 Proteínas tirosina quinases e tirosina fosfatases nas vias de sinalização
celular.
Um dos mais importantes processos através do qual o ambiente
transmite informação para o interior das células é a ativação de receptores
PTK. A reação de fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas celulares
é o mecanismo de que fazem uso os fatores de crescimento polipeptídicos
(fator de crescimento epidérmico (EGF), insulina, fator de crescimento
insulina símile tipo 1 (IGF-1), PDGF, CSF, FGF, etc.), para regularem a
proliferação, diferenciação e o metabolismo das células (Schlessinger 2000;
Blume-Jensen & Hunter, 2001).
Estudos realizados para elucidação das vias de sinalização mediadas
por EGF permitiram o estabelecimento de um modelo de via de transdução
de sinal mediada por fatores de crescimento polipeptídicos (Ullrich &
Schlessinger, 1990). Quando EGF se liga ao seu receptor ele estimula a
autofosforilação em resíduos de tirosina do domínio citoplasmático do
receptor. O sinal é transferido para a oncoproteína p21Ras, uma proteína
que se liga a GTP e desempenha um papel central nos processos de
transdução de sinal (Burgering & Bos, 1995). p21Ras alterna-se entre uma
forma associada a GDP e outra a GTP e este ciclo é regulado por fatores de
troca GDP-GTP e por proteínas que estimulam a atividade GTPase
intrínseca de p21Ras (Li et al., 1993). Duas proteínas adaptadoras Grb2 e
SoS conectam p21Ras ao receptor ativado. Grb2 através de seus domínios
SH3 (“src - homology type 3 domain" - domínios que apresentam afinidade
Introdução
17
por regiões ricas em Pro) recruta SoS, um fator que promove a troca GDPGTP, formando um complexo ternário p21Ras associado a GTP (Skolnik et
al., 1993). Exclusivamente nesta forma, p21Ras liga-se as moléculas
efetoras como a Raf quinase que sofre translocação do citoplasma para a
membrana plasmática (Avrunch et al., 1993). Nesta nova localização, Raf
quinase é completamente ativada por autofosforilação ou pela atividade de
serina/ treonina ou tirosina quinases (Avrunch et al., 1993). Neste ponto da
cascata, Raf quinase promove uma alteração nos meios de sinalização
passando de processos mediados pela ação de tirosina quinases para
processos mediados por serina/treonina quinases. Raf fosforila uma outra
quinase a “Mitogen Activated Protein Kinase Kinase” (MAPKK ou MEK)
(Dent at al., 1992). MEK por sua vez irá fosforilar uma família de serina /
treonina quinases conhecidas por MAP quinases (Gille et al., 1992). As MAP
quinases irão fosforilar fatores de transcrição e outras proteínas quinases e
até mesmo receptores PTK (Ex: EGF, PDGF) (Schlessinger, 2000),
conectando finalmente receptores de fatores de crescimento a fatores de
transcrição nucleares (Gille et al, 1992; Davis, 1993) . Importante salientar
que dentre as MAP quinases destacam-se dois subgrupos principais: as
quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs) e as quinases
reguladas por condições de stress (JNKs) (Davis, 1994). Ativação de
proteínas constituintes de cada um dos subgrupos parece obedecer a um
equilíbrio dinâmico entre ERKs ativadas por fatores de crescimento e JNKs
ativadas por stress, o que poderia determinar se uma célula irá sobreviver,
proliferar ou sofrer apoptose (Xie et al., 1995).
Introdução
Além de receptores
18
PTK, um
grupo
de
PTK
intracelulares
representados pela família Src (Src, Fyn, Yes, Yrk, Hck, Lyn, Lck, Fgr e Blk)
(Erpel & Courtneidge, 1995), também pode conectar as vias de transdução
de sinal tão diversas quanto aquelas que governam proliferação ou adesão
celulares. Receptores que possuem ou não atividade de tirosina quinase
interagem com os membros da família Src, que por sua vez funcionarão
como condutores do sinal inicial (Erpel & Courtneidge, 1995; Taniguchi,
1995).
Fosforilação em tirosina também pode mediar processos de adesão
celular dependentes de integrinas. Diversas PTK que podem ser ativadas
por integrinas estão intimamente associadas a processos de sinalização
integrina-dependentes (Yamada & Miyamoto, 1995). Uma delas a proteína
quinase de adesão focal (FAK) que é expressa em regiões especializadas
de aderência ao substrato, localizadas na membrana plasmática (Yamada &
Miyamoto, 1995), desempenha papel central em processos de sinalização
associada à adesão celular (Schaller et al., 1994). FAK é fosforilada em dois
resíduos de tirosina (Tyr 397 e Tyr 925) se tornando um sítio de
recrutamento para moléculas possuidoras de domínios SH2 tais como Grb2
e Src (Schaller et al., 1994). Essas associações integram FAK à via de
sinalização dependente de p21Ras - MAP quinase. Importante salientar que
fatores de crescimento também são capazes de interagir com integrinas, de
maneira sinérgica ou aditiva, resultando possivelmente em modulação de
fosforilação de FAK e outros constituintes da via de sinalização dependente
de integrinas (Arora et al., 1995).
Introdução
19
A fosforilação reversível em resíduos de tirosina é um mecanismo
fundamental de regulação celular (Lemman & Burnett, 1992). As PTPs,
responsáveis pela defosforilação de resíduos de tirosina fosforilados se
constituem em uma família de enzimas divididas em dois grupos principais
citoplasmáticas e do tipo receptor. Algumas PTPs citoplasmáticas foram
classificadas como fosfatases de dupla especificidade porque defosforilam
resíduos de tirosina e/ou serina/treonina fosforilados. As enzimas do tipo
receptor possuem um domínio extracelular e um ou dois domínios catalíticos
intracelulares. Recentemente demonstrou-se que as PTPs tipo receptor
participam em interações célula-célula não possuindo até o momento ligante
específicos
identificado
(Brady-Kalnay
&
Tonks,
1995).
As
PTPs
citoplasmáticas possuem um único sítio catalítico, e várias regiões de
regulação (Sun & Tonks, 1994). Essas enzimas podem se ligar a sítios
específicos pertencentes a domínios intracelulares de proteínas envolvidas
em sinalização (Erpel & Courtneidge, 1995). Todas as PTPs sem exceção
apresentam uma seqüência altamente conservada de 11 aminoácidos
(Ile/Val) - His-Cys-X-Ala-Gly-X-X-Arg-(Ser/Thr) e Gly em seu sítio catalítico.
A oxidação ou mutação sítio-dirigida de um resíduo essencial de cisteína
presente nesta seqüência torna qualquer PTP catalíticamente inativa
(Fischer et al., 1991). A Inibição das atividades de PTP pode resultar em
incrementos nos níveis intracelulares de proteínas fosforiladas em tirosina
indicando com isso a existência de uma relação dinâmica entre as vias de
fosforilação e defosforilação em tirosina.
Introdução
20
1.2 Modulação das atividades de tirosina quinase e tirosinas fosfatases por
sistemas redox.
Embora processos de sinalização ocorram essencialmente pela
associação de fatores de crescimento, hormônios e citocinas a seus
receptores específicos, várias evidências experimentais sugerem que o
estado
redox
intracelular
desempenha
um
papel
fundamental
nos
mecanismos de ação destes ligantes. O estado redox é controlado pelo
tripeptideo redutor glutationa (GSH), e reflete um balanço entre os níveis
celulares de sulfidrilas e disulfetos podendo ser alterado pela ação de
espécies reativas do oxigênio (ERO) e outros oxidantes (Meister &
Anderson, 1983). Assim, as atividades das enzimas sinalizadoras podem ser
modificadas por alterações no estado redox intracelular, que modulam estas
atividades de forma negativa ou positiva (Monteiro & Stern, 1996).
Apesar da especificidade da ligação entre fatores de crescimento e
seus respectivos receptores, sistemas oxidantes também podem modular as
atividades de PTK. Assim é que, espécies reativas do oxigênio (ERO)
produzidas através do processo de oxido-redução de naftoquinonas, são
capazes de estimular a fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas
constituintes da membrana plasmática de células hepáticas de rato (Chan, et
al., 1986). O peróxido de hidrogênio potencia a fosforilação em resíduos de
tirosina dependente de insulina de uma série de proteínas em células de
hepatoma de rato (Heffetz, & Zick, 1989). Conforme discutido anteriormente
nesta Introdução, os níveis intracelulares de fosforilação em resíduos de
Introdução
21
tirosina de proteínas são determinados a partir da ação conjunta das PTK e
das proteínas tirosina fosfatases (PTPs) (Dixon & Walton, 1993). Sabe-se
que a reação de defosforilação catalisada por essas enzimas depende
essencialmente de um resíduo de cisteina presente no seu sitio catalítico
(Tonks et al., 1988), fazendo dessas enzimas excelentes candidatas à
modulação
por
sistemas
oxidantes.
Conseqüentemente,
tem
se
demonstrado que a atividade das PTPs pode ser inibida por uma variedade
de sistemas oxidantes (Swarup et al., 1982; Monteiro et al., 1991; Monteiro
et al., 1993), o que poderia resultar em elevação dos níveis intracelulares de
fosforilação em tirosina. Destes sistemas o mais bem estudado tem sido o
vanadato. Este metal, através de um processo de oxido-redução intracelular
com produção de ERO e formação de intermediários mais reativos,
peroxovanadil, pervanadato (Liochev & Fridovich, 1990), e um potente
inibidor de atividades de PTP, promove elevação dos níveis intracelulares de
fosfotirosina e transformação celular (Klarlund, 1985). Monteiro et al., (1991),
demonstram que a diamida, um oxidante de grupos - SH inibi atividades de
PTP em células HER14 sem alterar as atividades de PTK nestas células.
Estes efeitos inibitórios eram revertidos por incubação das células com β mercaptoetanol e EGF (Monteiro et al., 1991). Os mesmos autores
mostraram também que o acido ascórbico em concentrações fisiológicas e
na presença de traços de ferro, inibe atividades de PTP nas mesmas
células. Pre-incubação das células com EGF revertia a inibição das
atividades de PTP causada pelo acido ascórbico (Monteiro et al., 1993).
Introdução
22
1.3 Células endoteliais.
As células endoteliais constituem a chamada camada íntima da
parede arterial. Durante muito tempo pensou-se no endotélio vascular
simplesmente como uma superfície por onde passava o fluxo sangüíneo.
Hoje, no entanto, sabe-se que as células endoteliais não somente se
constituem em uma barreira de permeabilidade seletiva entre os espaços
vascular e intersticial como também tem um papel muito importante na
regulação da homeostase vascular (Lemman & Burnett, 1992). Além disso,
de maneira similar às células musculares lisas, as células endoteliais são
participantes muito importantes de processos inflamatórios. Estas células,
sob estímulo físico, químico ou hormonal, produzem uma variedade de
fatores tais como: oxido nítrico (NO), o ânion superoxido (O2-), prostaciclina,
endotelina, fator ativador de plaquetas, fator de hiperpolarização derivado do
endotélio, interleucinas, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)
e fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) (Flavahan, 1992).
Por causa de suas funções variadas e sua localização, o endotélio
tem um papel bastante importante na iniciação e/ou progressão das doenças
cardiovasculares, incluindo-se ai a arteriosclerose. Por outro lado, as
funções do endotélio podem estar comprometidas em estados patológicos
como resultado dos efeitos do estresse oxidativo. Similar ao que foi
observado em células musculares lisas, o estresse oxidativo pode influenciar
a reatividade vascular através de alterações em processos de transdução de
sinal dependente de cálcio nas células endoteliais (Schilling & Elliot, 1992).
Introdução
1.4
23
Produção de NO e O2- por células musculares lisas e por células
endoteliais.
A ativação de células endoteliais e células musculares lisas pode
levá-las a secretar uma série de fatores reguladores da homeostase do
sistema vascular. Dentre estes fatores destacamos os radicais livres NO e
O2-. O O2- é produto de redução uni-életrônica do oxigênio molecular
produzido principalmente pelas cadeias de transporte eletrônico mitocôndrial
e do retículo endoplasmático (Halliwell & Gutteridge, 1989). Inicialmente
observou-se que o ionoforo de cálcio A23187 induzia contrações
dependentes do endotélio em artérias basilares de cães (Katusic, 1988).
Posteriormente, mostrou-se que estas contrações eram devidas ao O2produzido pelas células endoteliais estimuladas com o ionoforo de cálcio
(Katusic & Vanhoutte, 1989). Por sua vez, o NO é uma espécie
extremamente reativa, que pode mediar uma grande variedade de respostas
biológicas, tendo sido identificado como o fator de relaxamento dependente
do endotélio, é capaz de promover inibição de proliferação e contração das
células musculares lisas, inibição da agregação plaquetária e inibição da
adesão de monócitos e plaquetas a superfície endotelial, entre outros
fenômenos (Nathan, 1992; Moncada & Higgs, 1993).
O NO é gerado a partir do nitrogênio guanidino terminal do
aminoacido L-arginina, através da reação catalisada pela enzima NO
sintetase (NOS) que é encontrada em muitos tecidos e, existe basicamente
como três isoformas, uma NO sintetase induzível (i-NOS) e duas NO
Introdução
24
sintetases constitutivas (c-NOS). As c-NOS são dependentes de cálcio e
calmodulina e são encontradas em células endoteliais e, em tecido cerebral
(Kiechle et al., 1993). Substâncias que elevam a concentração de cálcio
intracelular como trombina, ADP, acetilcolina e o ionoforo de cálcio A23187
(Nathan, 1992; Moncada & Higgs, 1993), são capazes de ativar as c-NOS. A
c-NOS de células endoteliais possui sítios de ligação para calmodulina e
sofre modificações pos-tradução (miristilação, isoprenilação, fosforilação)
que podem regular sua atividade e determinar sua localização na célula
(Michel & Li, 1993). Por outro lado, a isoforma induzível que se encontra em
macrófagos e em células do tecido muscular liso é independente de cálcio e
podendo ser induzida por lipopolisacarideo de parede bacteriana (LPS),
interleucina 1β (IL-1β) ou interferon γ (Schlessinger & Ullrich, 1990). Marczin
et al, (1993), mostraram que a síntese de NO em células musculares lisas de
aorta de rato estimulada com LPS ou IL-1β é suprimida na presença de
inibidores de atividades de tirosina quinase. Estas observações sugerem o
envolvimento destas atividades, na indução de expressão da i-NOS nestas
células, tanto por LPS como por IL-1β.
1.5 Processos de sinalização mediados por NO.
O NO é um radical livre gasoso relativamente estável, capaz de se
difundir através de membranas celulares e atingir alvos biológicos
específicos
(enzimas)
a
distâncias
relativamente
longas.
Estas
características fazem com que esta pequena molécula seja capaz de
Introdução
25
participar de um grande número de processos fisiológicos (Schini-Creth &
Vanhoutte, 1995).
Devido à suas características químicas, NO é capaz de estimular
processos de sinalização através de reações com grupos sulfidrila, ERO ou
metais redox. Em condições fisiológicas, NO reage com O2, com o ânion
superóxido, metais de transição e sulfidrilas, gerando óxidos de nitrogênio,
peroxinitrito, adutos metal-NO e S-nitrosotióis (Stamler, 1994).
Estudos têm demonstrado a existência de uma série de alvos
celulares do NO, e espécies redox deles derivadas. Dentro deste grupo de
proteínas e enzimas com propriedades sinalizadoras capazes de serem
ativadas e desativadas por NO, destaca-se a forma solúvel da enzima
guanilato ciclase (Wong & Garbers, 1992). A nitrosilação dependente de NO
do ferro heme da guanilato ciclase, pode elevar os níveis de guanilil mono
fosfato
cíclico
(cGMP)
intracelular,
ativando
proteínas
quinases
G
dependentes de cGMP (PKG) (Ignarro et al., 1990). Conseqüentemente,
tem sido sugerido que a fosforilação de proteínas, é um mecanismo através
do qual, a ativação da guanilato ciclase solúvel pelo NO poderia mediar a
sinalização celular dependente de PKG. Além da modulação das PKG,
outras quinases também podem ter sua atividade modulada pelo radical.
Lander et al. (1993), inicialmente mostraram que o transporte de glicose em
linfócitos era estimulado por doadores de NO, nitroprussiato de sódio (SNP)
ou S-nitroso-acitil-penicilamina (SNAP). Esta ativação de linfócitos é
mediada por vias de sinalização dependentes de PTK e PTP. PTP do tipo
receptor são ativadas em linfócitos humanos tratados com os doadores de
Introdução
26
NO. Ativação da PTK intracelular Lck, membro da família Src, também foi
observada nestas células quando as mesmas foram submetidas ao
tratamento com SNP ou SNAP. Nenhum dos efeitos acima descritos podia
ser mimetizado por 8 BrcGMP, um análogo estável e permeável de cGMP.
Trabalhos desenvolvidos na metade dos anos 90 pelo nosso grupo de
investigação mostraram que o nível intracelular de proteínas fosforiladas em
tirosina era incrementado em fibroblastos de camundongo HER14, quando
estes eram incubados com SNP ou SNAP. Um grupo de proteínas com
pesos moleculares aparentes de 126, 56 e 43 kDa eram fosforiladas em
tirosina após estimulo com os doadores de NO. A pré-incubação de células
com oxihemoglobina ou azul de metileno inibia o incremento de fosforilação.
A inibição pelo azul de metileno sugere a participação de cGMP no
processo. Esta hipótese foi confirmada quando da utilização do 8 BrcGMP,
um análogo estável da cGMP, que estimulou a fosforilação do mesmo grupo
de proteínas, fosforiladas sob ação dos doadores de NO (Peranovich et al.,
1995; .Chiu, et al, 1996; Monteiro et al., 1997)
Em trabalho recentemente publicado pelo grupo, as 3 proteínas foram
identificadas como sendo as PTKs citoplasmática FAK e SrC quinase, 126 e
56 kDa respectivamente, e a proteína 43 kDa foi identificada como sendo
uma das ERKs MAP quinases (Monteiro et al., 2000).
Além de uma ação sobre a fosforilação na época pouco caracterizada,
demonstramos que o NO é capaz de estimular atividade de PTK dependente
de EGF (Monteiro et al., 1994; Peranovich, et al., 1995). Estímulo de
fosforilação em tirosina do mesmo grupo de proteínas fosforiladas por ação
Introdução
27
direta do doador de NO, ocorre quando as células são incubadas
simultaneamente com SNP e EGF.
Contrastando com a ativação de PTPs pela ação dos doadores de NO
em linfócitos, em células HER14 observamos inibição destas atividades.
Analisados em conjunto, estes resultados mostram a diversidade dos
processos de sinalização dependentes
de
fosforilação
em
tirosina
modulados por NO. Tais processos aparentemente operam de acordo com o
tipo celular.
Lander et al. (1995), mostraram que p21Ras (Ras) pode ser ativado
por ação direta do NO, resultando em níveis mais elevados de Ras - GTP.
Esta ativação é reversível e ocorre através de S-nitrosilação de um resíduo
de cisteina essencial, Cys 118, localizado no domínio da proteína onde
ocorre
a
associação
de
nucleotídeos
GTP-GDP.
Ras
atua
como
intermediário central do fluxo de informações gerado a partir de PTKs que se
fosforilam, ativando uma cascata de reações catalisadas por outras
proteínas quinases.
Em trabalho que concluímos durante o desenvolvimento desta Tese
de Doutorado (ver Apêndice 2), mostramos inequivocamente que em células
endoteliais de aorta de coelho, NO/cGMP ativavam a rota de sinalização
Ras-ERK1/2 MAP Kinases e que através desta rota observava-se estimulo
da atividade do receptor de EGF e da fosforilação de proteinas em residuos
de tirosina. Nossos resultados também sugeriram que o NO ofertado através
de doadores exógenos poderia estar estimulando a proliferação de células
endoteliais (Rocha Oliveira et al, 2003).
Introdução
28
1.6 Efeitos do NO na proliferação de células endoteliais.
No caso específico de células do sistema vascular, observou-se que
NO é capaz de promover síntese de DNA em células endoteliais (Ziche et
al., 1994), estimulando a proliferação destas células. Ao contrário do
observado para células endoteliais, doadores de NO inibiam a mitogênese e
a proliferação de células musculares lisas do tecido vascular (Garg & Hassid,
1989). Por outro lado, a geração endógena de NO em células musculares
lisas irá estimular a mitogênese em um processo que irá depender do estado
de confluência das células (Barbosa de Oliveira et. Al., 2001). Além do tipo
celular, as concentrações locais de NO também são um fator importante na
determinação dos efeitos que este radical livre irá exercer sobre o
metabolismo das células. Utilizando um outro modelo experimental, Jenkins
et al. (1995), mostraram que células tumorais humanas de adenocarcinoma
de colon transfectadas com a forma induzível do NO sintetase e produzindo
quantidades de NO variando entre 9 e 14,5 µM. proliferavam mais
lentamente que as mesmas células não transfectadas. Entretanto a
implantação
camundongos
subcutânea
“nude”
destas
produziam
células
tumores
tumorais
mais
transfectadas
em
vascularizados
que
proliferavam mais rapidamente do que os tumores originários das células
parentais. Uma vez mais se concluiu que o papel dual do NO na proliferação
dos tumores poderia estar relacionado às concentrações locais deste radical
livre. Como conclusão geral poderia ser dito que tipo celular e concentrações
Introdução
29
locais de NO são variáveis importantes na determinação dos efeitos que
este radical irá exercer sobre o metabolismo das células.
Estudos têm demonstrado que a angiogênese é um processo
complexo e se caracteriza pela ativação do crescimento de células
endoteliais, pela proliferação e migração fenotípica. Desta forma, fatores de
crescimento como bFGF e VEGF são também potentes estimuladores da
proliferação e migração (Ziche,1997). Citamos ainda que, a administração
sistêmica do NO e inibidor de síntese N-nitro-L-arginine metil ester (L-name)
em coelhos que são submetidos a implante córneo do tecido endotelial
vascular com fator de crescimento (VEGF), mais não fator básico de
crescimento (bFGF), são induzidos a angiogênese. Deste modo podemos
concluir que o NO é importante para ativação do (VEGF), mas não induziu o
(bFGF) para a angiogênese. Ziche et al, 1994 propõem que, a NO sintetase
(NOS) e a guanilato ciclase são controladores em potencial da angiogênese
tumoral em resposta a (VEGF).
1.7 Ciclo celular.
O ciclo celular é um conjunto de processos altamente ordenados que
compreende o período entre duas divisões celulares (Lewin, 1997). Nos
organismos eucariotos, esses processos são regulados de tal maneira que
as células, em condições normais, nunca iniciam uma etapa do ciclo sem
que a etapa anterior tenha sido completamente finalizada (Nasmyth, 1996).
Introdução
30
Os primeiros estudos do ciclo celular foram realizados sob
microscopia óptica em tecidos somáticos. Naquela época era bem conhecido
o fato que, durante a divisão celular ou mitose (M), os cromossomos eram
condensados e alinhados no equador do fuso mitótico e as cromátides
migravam para pólos opostos da célula. Entretanto, sabia-se muito pouco
sobre o intervalo entre duas mitoses sucessivas, também chamadas de
interfase, exceto que nessa fase as células cresciam em volume. Somente
mais tarde, após o reconhecimento de que a molécula de DNA representava
o material genético, é que foi demonstrada, nessa fase, a duplicação
cromossômica. Tal achado permitiu dividir didaticamente a interfase em três
intervalos: G1, que compreende ao gap entre mitose e duplicação do DNA;
S, que é o período da síntese do DNA; e G2, entre a fase S e a mitose
seguinte (Nasmyth, 1996). Um outro intervalo foi ainda definido (G0) porque
alguns tipos celulares permaneciam por um longo período em um estado
quiescente sem que ocorresse a duplicação de seu DNA (Pardee, 1989).
As atividades regulatórias responsáveis pela transição de um estágio
para outro do ciclo foram principalmente investigadas através de
experimentos de fusão de células, um processo obtido com a utilização de
agentes químicos ou virais que causam a ligação de membranas
plasmáticas, gerando uma célula híbrida com dois ou mais núcleos em um
citoplasma comum. Foi observado então que, após a fusão de uma célula na
fase S com outra em G1, ambos os núcleos duplicavam seu DNA, indicando
que o citoplasma da primeira deveria conter um ativador de duplicação do
DNA. Por outro lado, quando uma célula na fase S era fundida com uma em
Introdução
31
G2, o seu núcleo continuava a duplicação, mas o núcleo em G2 não se
duplicava e atrasava sua entrada na mitose até que o primeiro terminasse o
seu processo; então ambos os núcleos entravam sincronicamente em
mitose. Isso sugeriu que algum regulador, possivelmente o próprio ativador
da fase S, inibisse o início da mitose. Os experimentos de fusão de células
também demonstraram a presença de um promotor da fase M em células
que estão em divisão, uma vez que essas células quando fundidas com
outras em qualquer estágio da interfase induziam, nessas últimas, uma
pseudomitose caracterizada pela condensação prematura de cromossomos.
A presença desse indutor, do mesmo modo que o de fase S, parecia
transitória, já que heterocárions com núcleo em G1 e G2 não exibiam
duplicação de DNA ou mitose (Lewin, 1997).
Mais recentemente, os resultados de estudos realizados em
leveduras, anfíbios e células de mamíferos demonstram que os ativadores
de fase S e M constituem uma classe especial de enzimas. Essas enzimas
são quinases que representam uma subunidade catalítica ativa somente
após sua fosforilação e interação com uma subunidade regulatória instável
denominada ciclina, cujo nível, como seu próprio nome indica, oscila nas
várias fases do ciclo celular (Murray e Kirschner, 1991; Nasmyth, 1996).
A subunidade catalítica é uma fosfoproteína e seu estado de
fosforilação é um determinante de sua atividade. Assim para tornar-se ativa,
grupos fosfatos precisam estar ausentes em algumas posições e presentes
em outras. Como a quinase é autocatalítica, a fosforilação de uma pequena
quantidade de enzima é suficiente para a ativação das demais moléculas
Introdução
32
(Lewin, 1997). As unidades catalíticas mostram uma homologia de
seqüência superior a 40% enquanto essa homologia em ciclinas está
freqüentemente
limitada
a
um
domínio
de
aproximadamente
100
aminoácidos, responsável pela ligação e ativação das quinases (Morgan,
1995).
A passagem das células de um estágio para o outro do ciclo celular é
regulada, então, por fatores que atuam sobre a transcrição dos genes das
ciclinas e a degradação dessas proteínas e sobre a modificação por
fosforilação da subunidade catalítica da enzima (Nurse, 1990). Esse controle
atua na manutenção da ordem dos eventos e possuem pontos de checagem
ou checkpoints, responsáveis por assegurar que etapas críticas como
duplicação e segregação cromossômicas sejam finalizadas com grande
fidelidade. Além disso, tal controle responde através de bloqueio de
proliferação quando a integridade do genoma está comprometida (Hartwell &
Weinert, 1989).
Um dos checkpoints mais importantes é o START, que ocorre em G1
e é também conhecido, em células de mamíferos, como ponto de restrição.
Nesse ponto, a célula deve decidir se progride para outro ciclo de duplicação
de DNA em função dos estímulos externos e de sua massa molecular.
Outros checkpoints também agem na mitose, impedindo que a célula se
divida antes que todo o DNA tenha sido duplicado e reparado, e outros
atuam na Fase S prevenindo a duplicação de DNA lesado (Hunter & Pines,
1994).
Introdução
33
1.8 Controle do ciclo celular em mamíferos.
As células de mamíferos estão sujeitas a um grande número de
diferentes
estímulos
extracelulares,
como
fatores
de
crescimento,
antagonistas de mitose e indutores de diferenciação, aos quais respondem
com progressão ou bloqueio de seu ciclo até atingirem a fase G1 tardia. Do
mesmo modo que em leveduras, os principais reguladores destas respostas
incluem quinases. Entretanto, enquanto uma única subunidade catalítica
(cdc2 em S. pombe e CDC28 em S. cerevisiae) é responsável pela transição
do ciclo de leveduras, as células de mamíferos sintetizam, além da quinase
dependente de ciclina cdc2 tambem conhecida como cdk2, as quinases cdk4
e cdk6. As quinases cdk4 e cdk6 formam complexos com as ciclinas D e
atuam nas etapas iniciais do ciclo celular, em resposta a fatores de
crescimento e são essenciais para a duplicação do DNA (Hartwell & Kastan,
1994; Graña & Reddy, 1995).
1.9
Transição G1-S e as quinases cdk 4,6 / ciclina D.
A primeira quinase a ser ativada em mamíferos após as células serem
liberadas do estado quiescente é composta pelas várias ciclinas D e por
cdk4 e ou cdk6, dependendo do tipo celular. Suas atividades catalíticas são
primeiramente observadas no meio da fase G1, com um pico máximo
próximo à transição G1-S, e podem
persistir através dos
ciclos
subseqüentes se os estímulos mitogênicos continuarem presentes, uma vez
Introdução
34
que a expressão de ciclina D é ativada por fatores de crescimento.
Entretanto, se esses fatores forem removidos, o nível de ciclina D abaixa
imediatamente, independente do estágio do ciclo celular (Graña e Reddy,
1995; Sherr, 1996).
Existem três tipos de ciclinas D (D1, D2 e D3), que são em parte
específicas para cada tipo celular, com a maioria das células expressando
D3 juntamente com D1 ou D2. A ciclina D1 é codificada pelo gene CCND1
localizado na banda cromossômica 11q13, que tem sido identificado como o
protooncogene PRAD1. A expressão aumentada da ciclina D1 é observada
em diferentes tumores e está associada com translocações, inversões,
inserções virais e amplificações da região 11q13 (Sherr, 1993).
Um melhor entendimento do controle do ciclo celular em G1 tem sido
obtido do estudo de genes supressores de tumor, cujos produtos interagem
com complexos cdks/ciclinas. O produto do gene RB, por exemplo, que está
ausente ou inativo em retinoblastomas e em outros tipos de câncer, são um
substrato para os complexos cdk/ciclina D (Lewin, 1997).
Em células quiescentes ou durante o início de G1, a proteína pRb, na
sua forma hipofosforilada, liga-se ao fator de transcrição E2F, que ativam
positivamente a transcrição de genes responsáveis pela transcrição para a
fase S, incluindo aqueles das ciclinas A e E. Esse “seqüestro” de E2F pela
pRb garante que as células não iniciem a duplicação do DNA. Várias outras
proteínas semelhantes a pRb, incluindo a p107 e p130 em mamíferos e a
RBF em Drosophila, também regulam os fatores E2F e são capazes de inibir
a entrada na fase S (Levine, 1997; Wang, 1977). No ponto de restrição, ou
Introdução
35
próximo a ele, a pRb é fosforilada pelas quinases cdk4,6/ciclina D. Essa
fosforilação causa então, a liberação de E2F e, conseqüentemente, a
transcrição dos genes requeridos para a duplicação do DNA (Nevins, 1992).
Algumas oncoproteínas virais tais como o antígeno T do vírus SV40, a
proteína E1A do adenovírus e a E7 do vírus papiloma humano, facilitam a
progressão do ciclo celular, em parte pela sua ligação a pRb e liberação de
E2F (Jansen-Dür, 1996). É interessante que essas proteínas virais contêm
seqüências semelhantes à seqüência do terminal amino das ciclinas D,
sugerindo que estes resíduos devem ser responsáveis pelas ligações com a
pRb. Realmente, mutações em ponto no terminal amino das ciclinas
impedem que essa ligação ocorra (Dowdy et al., 1993).
Na regulação da transcrição G1-S, a próxima quinase a ser ativada
consiste na cdk2/ciclina E. Ao contrário das ciclinas D, a expressão da
ciclina E oscila periodicamente e atinge um nível máximo no estágio G1-S e
é degradada em S (Dulic et al., 1992; Koff et al., 1992). O complexo também
fosforila a pRb, o que resulta num controle retroativo positivo, uma vez que o
gene da ciclina E é regulado pelo E2F. A progressão do ciclo, que estava
sob a dependência de mitógenos atuando sobre a expressão da ciclina D,
passa a ser independente de estímulos externos e dirigidos pela ciclina E
(Sherr, 1996).
É possível que os fatores E2F também regulem o gene da ciclina A,
que forma complexos com a cdk2. Sua síntese é iniciada na fase final de
G1-S e é importante para a transição de G1-S, pois sua inibição em cultura
pode impedir a duplicação do DNA (Girard et al., 1991; Sherr, 1996).
Introdução
1.10
36
NO e o ciclo celular.
Em comunicação, Tanner et. al, 2000, propõe que o óxido nítrico inibi a
proliferação de células musculares lisas de aorta humana, mudando a
expressão e atividade das proteínas regulatórias do ciclo celular. Outros
achados sugerem que o doador de óxido nítrico (SNAP) inibi a transição da
fase G1/S por inibição da quinase dependente de ciclina Cdk2 que impede a
hiperfosforilação da proteína do retinoblastoma (pRb) e induz a ativação da
proteína p21
Sdi1/Cip/Waf1
(Ishida et. Al, 1997). Em contraste quando o doador
de óxido nítrico (SNAP) é retirado, a proliferação é recuperada (Ishida et. Al,
1997). Em estudos realizados por Pervin et. al, 2001, os autores sugerem
que o efeito do óxido nítrico inibi a síntese de ciclina D1 e pode ser relevante
em linhagens celulares que expressão essa proteína.
2 - OBJETIVOS
Objetivos
38
Este trabalho teve como objetivo fornecer as bases moleculares para
o entendimento do papel que o Óxido Nítrico (NO) desempenha em Células
endoteliais de aorta de coelho, atuando como modulador positivo de
progressão através do ciclo celular e da proliferação celular.
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
40
3.1 Materiais
Anticorpos
Anti ERK 1,2 total (New England Biolabs)
Anti ERK 1,2 fosforilada (New England Biolabs)
Anti Elk 1 (Cell Signaling)
Anti Elk 1 fosforilada (Cell Signaling)
Anti cdc 2 (Cell Signaling)
Anti-cdk 4 (Cell Signaling)
Anti cdk 6 (Cell Signaling)
Ciclina D1, E, A (Oncogene)
Anti pRb total (Cell Signaling)
Anti pRb fosforilada (Cell Signaling)
Anti-Mouse IgG, h&L Chain Specific (Goat) Rhodamine Conjugate
(Calbiochem).
Anti IgG de camundongo e anti IgG de coelho conjugados com peroxidase
(Amersham Pharmacia)
Drogas e antibióticos
S-Nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), (Calbiochem)
Ampicilina (Gibco)
Estreptomicina (Gibco)
41
Geneticina (Gibco)
Penicilina (Gibco)
IPTG (USB)
Inibidor de MEK 1 (PD98059), (Calbiochem)
lipofectina (Gibco/BRL).
Higromicina (Gibco/BRL).
Pancreatina (Gibco/BRL).
Inibidor da farnesil transferase FPT II (Calbiochem)
Meio de cultura e soro
Meio F12 (Gibco)
Meio LB - 0,1% triptona, 0,5% extrato de levedura, 0,5% NaCl, 0,1% NaOH
1N.
Meio LB em placa - 0,1% triptona, 0,5% extrato de levedura, 0,5% NaCl,
0,1% NaOH 1N, 1,5% ágar , pH 7.0
SBF (soro bovino fetal) (Gibco) – inativado a 55ºC durante 1 hora.
Meio 2YT - 1,6% triptona, 1% extrato de levedura, 0,5% NaCl
Soluções
Solução de congelamento - 50% FBS, 20% DMSO, 30% F12.
Tampão RIPA pH8.0 - 20mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 1%NP40, 10% glicerol,
10µg/ml aprotinina, 10µg/ml leupeptina, 1mM PMSF, 200µM ortovanadato de
sodio.
42
Tampão de lise pH7.5 - 20mM Hepes, 150mM NaCl, 10% glicerol, 1% Triton
X, 1mM EGTA, 1.5mM MgCl2, 1µg/ml aprotinina, 1µg/ml leupeptina, 1mM
PMSF, 1mM ortovanadato de sódio, 100mM pirofosfato de sódio e 500mM
fluoreto de sódio.
Tampão de lavagem - 50mM Tris pH7.5, 0,5% Triton X 100, 150mM NaCl,
5mM MgCl2, 1mM DTT, 1µg/ml aprotinina, 1µg/ml leupeptina.
Tampão de corrida - 500mM glicina, 50mM Tris-base pH 8.3, 1% SDS.
Tampão de transferência - 48mM Tris-base, 39mM glicina, 0,037% SDS,
20% metanol.
TBST - 10mM Tris-base pH7.6, 150mM NaCl, 0,1% Tween.
PBS - 7,78mM Na2HPO4, 2,20mM KH2PO4, 140Mm NaCl, 2,73mM KCl.
Tampão Hepes - 10mM Hepes/NaOH pH7.4, 140mM NaCl, 5mM CaCl2.
Tampão TE - 100mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA.
Tris - solução estoque 1.5M pH8.8.
Tris - solução estoque 1.0M pH6.8.
SDS - solução estoque 10%.
Persulfato de amônio - solução estoque 10%.
Solução stripping - Tris-HCl pH6.7, 2-mercaptoetanol .
Tampão de amostra 4x - 50mM Tris-HCl pH6.8, 5% 2-mercaptoetanol, 2%
SDS, 0,05% bromofenol, 10% glicerol.
43
Corante Ponceau S - 5% TCA, 0,5% Ponceau.
Reagente de Bradford (Bio Rad).
Gel de poliacrilamida 10% - 9,9ml H2O, 10ml solução de poliacrilamida 30%,
7,5ml Tris 1,5M pH8.8, 300µl SDS 10%, 300µL persulfato de amônia, 10µl
TEMED.
Gel stacking - 6,8ml H2O, 1,7ml solução de poliacrilamida 30%, 1,25ml Tris
1,0M pH6.8, 100µl SDS 10%, 100µL persulfato de amônia, 10µl TEMED.
Tampão de extração citoplasmática 1 – 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM NaCl, 3
mM MgCl2, 0,5% Nonidete p40, 0,5 mM PMSF, 50 mMNaF, 1 mM NaVO3, 10
µg/ml Leupeptina, 10µg/ml Aprotinina.
Buffer 2 para extração nuclear – 1 M de Sacarose.
Tampão de extração nuclear 3 – 200 mM Nacl, 100 mM Hepes pH 7.9, 1,5
mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 5% Glicerol, 0,5 mM PMSF, 50 mM NaF, 1 mM
NaVO3, 10µg/ml Leupeptina, 10µg/ml Aprotinina.
Kits
ECL (Amershan).
CycleTEST PLUS™ DNA Reagent Kit (Becton Dickinson).
3.2 Métodos
Culturas celulares
44
Células endoteliais de aorta de coelho foram gentilmente cedidas pela
Dra. Helena Bonciani Nader, professora titular da disciplina de Biologia
Molecular (Escola Paulista de Medicina). As células são cultivadas em meio
F12. O meio de cultura é suplementado com 10% de soro bovino fetal. As
células são mantidas a uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2 a 37°C.
3.3 Transfecção de DNA plasmidial em células endoteliais de aorta de coelho
Linhagens bacterianas, plasmídeos: amplificação e caracterização dos
plasmídeos bacterianos. Foi utilizado o plasmídeo pUC 19 obtido
comercialmente, e que contém 2686 pares de base e origem de replicação
para E. coli, possuindo como marcador o gene que confere resistência a
ampicilina e um sítio múltiplo de clonagem pREP4 que possui a marca de
resistência para higromicina. Para obtenção das células expressando o
mutante negativo dominante de p21ras, foi utilizado o plasmídeo pMMrasDN
obtido através do Dr. Ed. Skolnik do Departamento de Farmacologia do
Centro Médico da Universidade de Nova York. O plasmídeo contém 4900
pares de base de origem de replicação para E. coli. A linhagem bacteriana
de E. coli DH5-· (supE44· alc U 169 · 80 lac Z·M 15) hsd R17 rec Al end gyra
96 thi-l (rel Al), obtida da American Type Culture Collection (ATCC/EUA), foi
utilizada para obtenção dos plasmídeos em larga escala. As bactérias foram
cultivadas em Meio LB (Tris 10 mM. pH 7,4, MgSO4 , 1 mM. Triptona 1,0%,
Extrato de levedura 0,5%, NaCl 0,5%) e Meio SOC (NaCl 10 mM. KCL 2,5
mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, Glicose 20 nM, Triptona 2,0%, Extrato
45
de levedura 0,5%). As bactérias foram transformadas com os plasmídeos
acima descritos, pelo método do cloreto de cálcio descrito por Mandel &
Higa, (1970) e Cohen et al. (1973). Após obtenção do DNA plasmidial, a
concentração do mesmo foi determinada por espectrofotometria, medindo-se
a absorbância a 260 nm, conforme descrito por Sambrook et al. (1989). Os
plasmídeos assim obtidos foram digeridos com as enzimas de restrição Pst I,
e Bam HI para confirmar sua estrutura. A análise das digestões foi feita
através de eletroforese em gel de agarose. A eletroforese foi realizada sob
uma corrente de 50 mA durante 90 minutos. O gel é corado com brometo de
etídeo (10 µg/ml) e visualizado em trans-iluminador de luz ultravioleta.
3.3.1 Transfecção e isolamento dos clones
Células endoteliais de aorta de coelho a uma confluência de 50% (500.000
células/garrafas de cultivo de área igual a 25 cm2) foram transfectadas
utilizando-se o método da lipofectina (Gibco/BRL). Foi separada uma mistura
de DNA a 100 µl de meio de cultura F12, sem soro e sem antibióticos para a
transfecção, conforme esquematizado abaixo:
1) Controle negativo pUC 19 (9 µg)
2) Controle positivo pUC 19 (9 µg) e pREP4 (1 µg)
3) pE1a (9 µg) e pREP4 (1 µg)
4) pHR5 (9 µg) e pREP4 (1 µg).
Uma solução é preparada pela mistura de 10 µl de lipofectina com 90 µl de
meio F12, sem soro e sem antibióticos e adicionada às misturas de DNA,
seguindo-se de incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos para
46
obtenção do complexo DNA-lipofectina. O complexo foi diluído em meio F12
sem soro e sem antibióticos, e as células em monocamadas foram
incubadas neste meio de transfecção durante 4 horas, a 37°C em atmosfera
de 95% de ar e 5% de CO2. Decorrido este período, o meio utilizado para
transfecção é substituído por meio de cultivo, F12 suplementado com 10%
de soro bovino fetal, e as células permaneceram neste meio por 48 horas.
Após este período, as monocamadas celulares são tripsnizadas e
subcultivadas em meio F12 suplementado com soro bovino fetal e
higromicina na concentração de 100 µg/ml em placas de 24 poços
aglomerados durante 18 dias em atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2. A
cada intervalo de 3 dias, o meio de cultivo suplementado com o antibiótico
de seleção será substituído por meio fresco. As colônias formadas (clones)
são coletadas por incubação com pancreatina após isolamento em anéis
estéreis. Estes clones foram expandidos e posteriormente caracterizados.
3.3.2 Caracterização dos clones de células endoteliais de aorta de coelhos
transfectadas com o mutante negativo dominante de p21Ras. Os clones
foram caracterizados por “Southern blotting” e “Northern blotting”, para
verificação
da
integração
do
DNA
plasmidial
e
sua
expressão.
Respectivamente DNA e RNA são extraídos de aproximadamente 5 x 106
células mantidas em garrafas de cultura de 75 cm2 de área. DNA das células
é extraído, digerido por enzimas de restrição e separado em gel de agarose
conforme procedimento descrito acima utilizando para isolar DNAs
plasmidianos. Procedemos então à transferência desse DNA do gel para
47
membrana de Nylon Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech) pelo método
de capilaridade e fixação por irradiação com luz UV. Para extração do RNA,
as células são lavadas com PBS e lisadas em solução A (fenol saturado com
água, tiociato de guanidina 4 M, citrato de sódio 25 mM, pH 7.0, acetato de
sódio 2M, pH 4.0, na proporção 1:1) de acordo com Xie et al., (1995). Ao
lisado celular adicionar-se-á igual volume da mistura de clorofórmio álcool
isoamilico e após vigorosa agitação, incubação por 30 minutos e
centrifugação a 12000 x g., o sedimento é lavado com etanol 70%. O RNA
precipitado é dissolvido em água e mantido a -20°C. sendo todas as
soluções e materiais, tratados previamente para a eliminação de RNAse. O
RNA é então fracionado em gel de agarose contendo formaldeido,
transferido para membrana de Nylon Hybond-N e fixado de forma similar ao
DNA, conforme descrito por Sambrook et al., (1989). Sondas radioativas são
preparadas utilizando-se α[32P] dCTP para marcar o plasmídeo pMMRasDN
pelo método “Random Priming” utilizando-se o kit “Random Primers DNA
Labeling System” (Gibco/BRL) conforme protocolo do fabricante. As
membranas são hibridizadas “overnigth” a 42°C seguindo-se o protocolo
convencional, sendo as lavagens finais em condições de alta estrigência. As
membranas então são expostas a filmes autoradiográficos pelo tempo
necessário para obtenção do sinal. Após caracterização, obtivemos os
clones, C1A, C2A e C3A que apresentou a maior expressão negativa
dominante, e foi, portanto, utilizado nos experimentos.
3.4 Western blot
48
Nestes experimentos, células foram lisadas em tampão A (Hepes 20
nM. pH 7.5, 150 nM, glicerol 10%, triton X-100 a 1%, MgCl2 1.5 mM, EDTA 1
mM; aprotinina 1 µg/ml; leupeptina 1 µg/ml e PMSF 1 mM) acrescido dos
inibidores de proteínas fosfatases, ortovanadato de sódio 2 mM, fluoreto de
sódio 50 mM e pirofosfato de sódio 10 mM. A concentração de proteínas nos
lisados foi determinada pelo método de Bradford (Bradford, M.M.,1976).
Quantidades iguais de proteínas dos lisados foram misturadas com 50 µl de
tampão de amostra 4 vezes concentrado (Tris-HCl 150 mM, pH 6.8, βmercaptoetanol 15%, SDS 6%, azul de bromofenol 0,3%), fervidas por 5 min
e separadas eletroforéticamente em gel de poliacrilamida e SDS 10%. As
reações de Western-blotting foram realizadas em gel de poliacrilamida 10%
para ERK, Elk 1, Ciclina D1, E,A, cdk 4, cdk 6 e proteína Rb. As proteínas
foram submetidas à eletroforese em tampão de corrida a 250V e 8mA
durante toda à noite. A transferência foi realizada em papel de nitrocelulose
aplicando-se uma de corrente de 200mA a 250V por 2 horas em cuba de
transferência (BioRad). A confirmação da transferência foi realizada rinsando
a membrana com Ponceau S; em seguida, a membrana foi lavada com
TBST e bloqueada em solução 5% leite para ERK 1 / 2, Elk 1, Ciclina D1,
cdc 2, cdk 4, cdk 6 e proteína Rb por 2 horas sob agitação em temperatura
ambiente. Após o período a membrana foi lavada 3 vezes por 15 minutos
com TBST sob agitação e adicionado o anticorpo primário diluído; ERK
(1:2000), Elk 1 (1:2000), Ciclina D1, E, A (1/1000), cdk 4 (1/500) cdk 6
(1/500), Proteína Rb (1/1000) cdc 2 (1/1000) em 5% BSA durante toda a
noite, sob agitação a 4ºC. Após a incubação a membrana foi novamente
49
lavada 3 vezes de 15 minutos a temperatura ambiente. O anticorpo
secundário anti-IgG de camundongo produzido em cabra; anti-IgG de coelho
produzido em suino ou anti-IgG de cabra produzido em coelho foi diluído em
TBST 0,1%; ERK (1:3000), Elk 1 (1:3000), Ciclina D1, E, A (1/2000), cdk 4
(1/1000) cdk 6 (1/1000), Proteína Rb (1/2000) cdc 2 (1/2000) e incubado
durante 1 hora a temperatura ambiente sob agitação. A membrana foi lavada
1 vez por 15 minutos e 2 vezes por 5 minutos com TBST. A revelação foi
realizada utilizando-se kit ECL de quimioluminescência.
3.5 Análise do Ciclo Celular
Para a análise do ciclo celular, 104 células/ml foram plaqueadas em
placas de 6 poços aglomerados. Após 24 horas as células foram contadas e
tratadas com 0,1mM de SNAP e 10% de SBF durante 120 minutos e 300
minutos em atmosfera 5% de CO2 à 37ºC. Para o controle, as células foram
mantidas em meio F12 suplementado com 0,5% de SBF. Após o período de
incubação as células foram lavadas duas vezes em PBS. Utilizamos o
protocolo do “CycleTEST PLUS™ DNA Reagent Kit” da empresa Becton
Dickinson para o tratamento das células e sua aquisição. A aquisição das
células foi feita por citometria de fluxo, através do software ModFit LT V 2.0 e
a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton Dickinson).
3.6 Ensaio de proliferação celular
50
Células endoteliais de aorta de coelho foram semeadas em placas de
6 poços aglomerados a uma densidade de 5 x 104 células por poço em meio
F12 suplementado com 0,5% de soro bovino fetal. As células foram
mantidas nestas condições durante 24 horas a uma atmosfera com 5% de
CO2 à 37ºC. Após este período, o doador de NO (SNAP) na concentração
de 0,1 mM e soro bovino fetal a 10%, foram adicionados ao meio de cultura
e deixados por 300 minutos. Em seguida o meio de cultura foi trocado por
meio F12 com suplementação de 0,5% de soro bovino fetal e as células
foram incubadas por mais 24 horas. Após este período as células foram
contadas em 48 horas para comparações de resultados dos estímulos.
Células endoteliais de aorta de coelho nas condições acima, mas sem
estímulos foram utilizadas como controles de proliferação basal. Quando do
uso do inibidor de MEK 1 (PD98059), as células endoteliais de aorta de
coelhos foram incubadas inicialmente por 30 minutos com este inibidor e
posteriormente estimuladas com doadores de NO e SBF. De maneira
análoga foi o procedimento para as células transfectadas com Ras negativo
dominante N17Ras (C3A) e para as transfectadas com plasmídeo vazio
pcDNA. Os ensaios de proliferação foram realizados em triplicatas e seus
resultados determinados como a média aritmética (±) o desvio padrão. Os
resultados finais foram expressos em numero de células contadas (N x 104),
obtida em culturas estimuladas, e o basal obtido em culturas não
estimuladas (média aritmética (±) o desvio padrão).
3.7 Fracionamento citoplasmático e nuclear
51
Lisar as células em tampão de extração citoplasmática 1 (descrito em
material e método) por 20 minutos a 4ºC. Carregar o lisado com 1 ml do
buffer 2 (descrito em material e método) em tubo eppendorf. Centrifugar 10
minutos a 4ºC/1.600g. Centrifugar sobrenadante por 10 minutos a
4ºC/13.000g. Sobrenadante contem a fração citoplasmática. Lavar o pellet
da primeira centrifugação em tampão de extração nuclear (descrito em
material e método). Resuspender o pellet em 100µl de tampão de extração
nuclear e incubar por 30 minutos a 4ºC em agitação constante (vortex).
Centrifugar o lisado por 10 minutos a 4ºC por 10 minutos/13.000g.
Sobrenadante contem fração nuclear.
3.8 Análise Estatística
Resultados representam a média do valor de três experimentos. Os
resultados são expressos como média aritmética ± S.D. Foram feitas
comparações estatísticas com o teste Student's t. Utilizamos também o t
Dunnet
ANOVA. Foram consideradas estatisticamente significantes as
diferenças *P < 0,05.
3.9 Imunofluorescencia Indireta (Imuno-Citoquímica)
Células endoteliais de aorta de coelho e células transfectadas com
mutante negativo dominante para p21Ras N17Ras (C3A) foram tratadas
com doadores de NO (SNAP = 0,1mM) e Soro Bovino Fetal (10%) em tempo
de 15 e 30 minutos. Para controle foram utilizadas células mantidas em meio
52
F12 mais suplementação com SBF a 0,5%. Após estímulos as células foram
lavadas 3 vezes com PBS e em seguida fixadas com PFA 4% por dez
minutos a 4ºC. Após o período, foram lavadas 3 vezes com PBS e
permeabilizadas em PBS nonidet P40 0,1% por 30 minutos a 37ºC. Em
seguida mais três lavagens com PBS e bloqueadas com PBS Albumina 1%
por 30 minutos a 37ºC. Após o bloqueio, as células foram lavadas uma vez
com PBS. O anticorpo primário anti-fosfo ERK 1 / ERK 2 e o anticorpo
secundário utilizado foram diluídos em albumina 1% e incubados a 37ºC por
uma hora para o anticorpo primário e 24 horas para o anticorpo secundário.
Os anticorpos encontram-se descritos no item “anticorpos” acima. Após o
período as células foram lavadas com PBS quatro vezes por 7 minutos cada
sob agitação. A leitura foi feita em microscópio confocal com objetiva de
100 X e ocular de 10 X, com aumento final de 1.000 X.
4 - RESULTADOS
Resultados
54
4.1 Efeitos da inibição de p21Ras na fosforilação e ativação das
MAP quinases ERK 1 / ERK 2 em células endoteliais de aorta de coelho
mediada por óxido nítrico e soro bovino fetal.
Confirmando observações feitas anteriormente (Rocha Oliveira et. Al.,
2003), na figura 1 mostramos que doadores de NO e SBF promovem a
fosforilação e conseqüente ativação das MAP quinases ERK 1 / ERK 2, e
que este processo dependia da ativação de p21Ras. Observamos que a
adição do inibidor da farnesil transferase FPT II inibiu a fosforilação das MAP
quinases ERK 1 / ERK 2 após estímulos.
Densitometry
(arbitrary units)
8
6
*
*
4
2
0
Figura 1. Células endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas e préincubadas com FPT II na concentração de 25 µM por mais 24 horas. Depois deste período
foram feitas as incubações na presença do doador SNAP (0,1 mM) e SBF (10%), por 30
minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de proteína utilizada do
lisado foi de 75µg. Utilizamos SDS/PAGE (10% gel) e transferência para membranas de
nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK1 / ERK 2 anticorpos e anti-phospho
ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita através de ECL. O autoradiograma é o representativo
de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína
observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi
fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.
Resultados
55
O mesmo efeito foi observado quando utilizamos as células
endoteliais de aorta de coelho transfectadas com N17Ras (C3A) que são
negativas dominantes para p21Ras, Figura 2A.
Densitometry
(arbitrary units)
15
*
10
5
0
Figura 2A. Células C3A foram incubadas com doador SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) por 30
minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de proteína utilizada do
lisado foi de 75µg. Utilizamos SDS/PAGE (10% gel) e transferência para membranas de
nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 / ERK 2 anticorpos e anti-phospho
ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita através de ECL. O autoradiograma é o representativo
Resultados
56
O controle para verificação de efeitos inequívocos da transfecção foi
feito utilizando-se células transfectadas com vetor vazio pcDNA. Foram
obtidos resultados semelhantes àqueles obtidos para células parentais,
Figura 2B.
Densitometry
(arbitrary units)
15
10
*
*
5
0
Figura 2B. Células com vetor vazio (pcDNA) foram incubadas com doador SNAP (0,1 mM)
e SBF (10%) por 30 minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de
proteína utilizada do lisado foi de 75µg. Utilizamos SDS/PAGE (10% gel) e transferência
para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 / ERK 2
anticorpos e anti-phospho
ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita através de ECL. O
autoradiograma é o representativo de três experimentos independentes. O nível de
fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por
densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não
tratado.
Resultados
57
Ainda confirmando observações anteriores, o inibidor de MEK
PD98059 não permite a fosforilação e a ativação de ERK 1 / ERK 2,
caracterizando a participação da via Ras / MEK / ERK 1 / 2 nos eventos de
sinalização iniciados por NO, Figura 3.
Densitometry
(arbitrary units)
8
6
*
*
4
2
0
Figura 3. Células endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas e préincubadas com inibidor de MEK PD98059 na concentração de 20 µM por 30 minutos.
Depois deste período foi feita a incubação na presença do doador SNAP (0,1 mM) e SBF
(10%) por 30 minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de proteína
utilizada do lisado foi de 75µg. Utilizamos SDS/PAGE (10% gel) e transferência para
membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 / ERK 2 anticorpos
e anti-phospho ERK 1 e ERK 2. A revelação foi feita através de ECL. O autoradiograma é o
representativo de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa
de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A
significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.
Resultados
58
A cascata de sinalização das MAP kinases ERK 1 / 2 é essencial para
regulação da expressão gênica em resposta a sua grande variedade de
sinais extracelulares e intracelulares. Entretanto, os eventos que ocorrem
após a ativação destas proteínas quinases ainda não são totalmente
conhecidas.
As MAP Kinases ERK 1 / 2 podem ser funcionalmente redundantes ou
não. Chuang & Ng, 1994, mostram que p44 ERK 1 ativa especificamente o
fator de transcrição ELK 1, enquanto p42 ERK 2 ativa o gene de resposta
imediata C-Myc.
Nós fracionamos as células após estímulo com doador de NO ou com
soro e estudamos a distribuição celular das formas ativas das MAP quinases
ERK 1 / ERK 2.
4.2 Translocação das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo e
conseqüente fosforilação do fator de transcrição Elk-1 estimulada por
óxido nítrico, dá início a ativação do ciclo celular.
A utilização do extrato nuclear serviu para demonstrar a translocação
das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo da célula. Células
endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas e estimuladas
com doador de óxido nítrico SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) por 30 minutos.
Após o período as células foram lisadas e submetidas à análise por
“immunobloting” utilizando anticorpos específicos para reconhecimento da
Resultados
59
forma ativada de ERK 1 / ERK 2 conforme descrito em material e métodos.
No extrato nuclear a MAP quinase ERK 1 predominava e se encontrava
fosforilada após estímulo com doador de No e SBF, Figura 4A.
Densitometry
(arbitrary units)
15
10
*
*
5
0
Figura 4A. Células endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas. Após
este período foram incubadas na presença de SNAP e SBF em doses previamente
descritas. Após 30 min. de incubação as células foram lisadas. A quantidade de proteínas
utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e
transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 /
ERK 2 anticorpos e anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita por ECL. O
autoradiograma é representativo de três experimentos independentes. O nível de
tratado.
Nas células que expressam a forma negativa dominante de Ras
(C3A), apenas o estímulo com soro promoveu a fosforilação da MAP
Resultados
60
quinase p44 ERK 1. Células transfectadas com vetor vazio se comportaram
como as células parentais. Figura 4B.
Densitometry
(arbitrary units)
15
*
10
5
0
Densitometry
(arbitrary units)
15
10
*
*
5
0
Figura 4B. Células C3A e pcDNA foram carenciadas por 24 horas. Após este período
foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) em doses previamente
descritas. Após 30 min. de incubação as células foram lisadas. A quantidade de proteínas
transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 /
ERK 2 anticorpos e anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita por ECL. O
autoradiograma é representativo de três experimentos independentes. O nível de
tratado.
Resultados
61
Quando utilizamos o inibidor de MEK 1 (PD98059), não verificamos a
fosforilação das MAP quinases ERK 1 e ERK 2, no extrato nuclear de células
endoteliais de aorta de coelho submetidas aos dois estímulos (dados não
demonstrados).
Utilizamos
imunofluorescência
indireta
com
o
objetivo
de
confirmarmos a migração para o núcleo das formas fosforiladas das ERKs,
após estímulo com soro e com doador de NO.
Estimulo com 10% de soro bovino fetal induziram a migração das
formas fosforiladas MAP quinases ERKs para o núcleo celular, no curso do
tempo inicial. Os dados foram obtidos através da imunofluorescência indireta
com leitura em microscopia confocal, Figura 4C.
1
2
3
Figura 4C. Soro bovino fetal (SBF) ativa a translocação das MAP quinases ERK 1 e ERK 2
para o núcleo em células Endoteliais de aorta de coelho. Células foram carenciadas por 24
horas e estimuladas com SBF 10% por 15 minutos e 30 minutos. 1- corresponde a célula
controle sem estímulo; 2 – corresponde ao tempo 15 minutos com estimulo de SBF; 3 –
corresponde ao tempo 30 minutos com estimulo de SBF. A imunofluorescencia indireta foi
elaborada com a utilização de anticorpos anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A leitura foi feita em
microscópio confocal com objetiva de 100 X e ocular de 10 X, aumento final de 1.000 X.
Resultados
62
Semelhante resultado foi observado com a utilização de SNAP 0,1
mM, Figura 4D
1
2
3
Figura 4D. Óxido Nítrico ativa a migração das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo
de células endoteliais de aorta de coelho. Células foram carenciadas por 24 horas e
estimuladas com doador de NO (SNAP=0,1mM) por 15 minutos e 30 minutos. 1corresponde a célula controle sem estímulo; 2 – corresponde ao tempo 15 minutos com
estímulo de SNAP; 3 – corresponde ao tempo 30 minutos com estímulo de SNAP. A
imunofluorescencia indireta foi elaborada com a utilização de anticorpos anti-phospho ERK
1 / ERK 2. A leitura foi feita em microscópio confocal com objetiva de 100 X e ocular de 10
X, aumento final de 1.000 X.
Inibidor de MEK 1 PD 98059 inibe a translocação das ERKs para o
núcleo da célula em RAEC diante de estimulo com SNAP 0,1 mM. Figura
4E.
1
2
3
Figura 4E. Inibidor de MEK 1 PD 98059 inibe a migração das Map quinases ERK 1 e ERK
2 para o núcleo de células endoteliais de aorta de coelho. Células foram carenciadas por 24
horas e pré-incubadas com inibidor de MEK PD98059 na concentração de 20 µM por 30
minutos. Depois deste período foi feita a incubação na presença do doador SNAP (0,1 mM)
por 15 e 30 minutos. 1- corresponde a célula controle sem estímulo; 2 – corresponde ao
tempo 15 minutos com SNAP; 3 – corresponde ao tempo 30 minutos com SNAP . A
imunofluorescencia indireta foi elaborada com a autilização de anticorpos anti-phospho ERK
1 / ERK 2. A leitura foi feita em microscópio confocal com objetiva de 100 X e ocular de
10 X, aumento final de 1.000 X.
Resultados
63
Resultados semelhantes foram obtidos com a utilização do inibidor de
MEK 1 PD 98059 e com estimulo de soto fetal bovino a 10% (dados não
apresentados).
Como esperado em células C3A, a ausência da forma funcional de
Ras não permitiu a translocação nuclear das ERK 1 / 2 após estímulo com
NO. Ao contrário, quando estimuladas com soro, as células responderam cm
a ocorrência do fenômeno, Figura 4F e 4G.
Figura 4F. Células C3A estimuladas com SNAP 0,1 mM.
1
2
3
Figura 4F. Óxido Nítrico não estimula a migração das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o
núcleo de células endoteliais de aorta de coelho transfectadas com mutante negativo
N17Ras, C3A. Células foram carenciadas por 24 horas e estimuladas com doador de NO
(SNAP=0,1mM) por 30 minutos. 1- corresponde a célula controle sem estímulo; 2 –
corresponde ao tempo 15 minutos com estímulo de SNAP; 3 – corresponde ao tempo 30
minutos com estímulo de SNAP. A imunofluorescencia indireta foi elaborada com a
utilização de anticorpos anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A leitura foi feita em microscópio
confocal com objetiva de 100 X e ocular de 10 X, aumento final de 1.000 X.
Resultados
64
Figura 4G. Células C3A estimuladas com soro bovino fetal 10%.
1
2
3
Figura 4G. Soro bovino fetal estimula a migração das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o
núcleo de células endoteliais de aorta de coelho transfectadas com mutante negativo
N17Ras, C3A. Células foram carenciadas por 24 horas e estimuladas com SBF 10% por 15
e 30 minutos. 1- corresponde a célula controle sem estímulo; 2 – corresponde ao tempo 15
minutos com estímulo de SBF; 3 – corresponde ao tempo 30 minutos com estímulo de SBF.
A imunofluorescencia indireta foi elaborada com a utilização de anticorpos anti-phospho
ERK 1 / ERK 2. A leitura foi feita em microscópio confocal com objetiva de 100 X e ocular de
10 X, aumento final de 1.000 X.
Nós também observamos a migração das MAP quinases ERK 1 e
ERK 2 para o núcleo em células transfectadas com plasmídeo vazio
(pcDNA), (dados não apresentados).
Após a caracterização da translocação para o núcleo das MAP
quinases ERK 1 e ERK 2 verificamos a fosforilação do fator de transcrição
Elk-1 após 60 minutos de incubação com doador de NO (SNAP 0,1mM) e
SBF (10%). A determinação do tempo foi estabelecida através de uma curva
de tempo em células estimuladas com SNAP 0,1 mM, figura 4H. Resultado
semelhante foi observado com estimulo de SBF 10% (dados não
apresentados).
Resultados
65
Densitometry
(arbitrary units)
Figura 4 H.
350
300
250
200
150
100
50
0
*
0 min
15 min
30 min
*
*
45 min
60 min
Figura 4H. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas. Após
este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF (10%). Os lisados de
extrato nuclear foram obtidos nos tempos 15 min/ 30 min/ 45 mim e 60 min. A quantidade de
proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE
(10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com
anti Elk-1 anticorpos e anti-phospho Elk-1. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma
é resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de
proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A
Com a fosforilação de Ekl -1 em células endoteliais de aorta de coelho
através de estimulo com SNAP e SBF por 60 minutos, fomos observar os
eventos em células transfectadas C3A e pcDNA, nas mesmas condições
descritas para células endoteliais de aorta de coelho, como demonstrado na
figura 4 I.
Resultados
66
Densitometry
(arbitrary units)
15
*
10
5
0
Densitometry
(arbitrary units)
15
10
*
*
5
0
Figura 4I. Células C3A e pcDNA foram carenciadas por 24 horas. Após este período
foram incubadas na presença de SNAP e SBF em doses previamente descritas. Os lisados
de extrato nuclear foi obtido no tempo 60 min. A quantidade de proteínas utilizada do lisado
nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para
membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti Elk-1 anticorpos e antiphospho Elk-1. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três
experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado
no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p <
0.05 em relação ao controle não tratado.
A confirmação da participação da via de p21Ras – MAP quinases
ERK 1 e ERK 2 no processo de fosforilação de Elk – 1, foi feita utilizando-se
o inibidor de MEK PD 98059 e as células C3A, deficientes em Ras.
Resultados
67
Nós observamos que, quando utilizamos o inibidor de MEK 1,
PD98059 em células endoteliais de aorta de coelho, a fosforilação de Elk-1
não ocorreu, figura 4J. O mesmo efeito foi observado quando da utilização
de células C3A estimuladas com SBF, (dados não apresentados).
Figura 4J.
Densitometry
(arbitrary units)
8
6
*
*
4
2
0
Figura 4J. Células endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas e préincubadas com inibidor de MEK PD98059 na concentração de 20 µM por 30 minutos.
Depois deste período foi feita a incubação na presença do doador SNAP (0,1 mM) e SBF
(10%) por 30 minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de
anti Elk-1 anticorpos e anti-phospho Elk-1. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma
é resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de
Resultados
68
4.3 Fator de transcrição Elk-1 fosforilado aumenta e expressão da
ciclina D1 e das quinases dependentes de cliclinas cdk4 e cdk 6.
Como demonstrado acima, a fosforilação das MAP quinases ERK 1 /
2 e a sua conseqüente translocação para o núcleo, fosforila o fator de
transcrição Elk-1. Para a progressão do ciclo celular a fosforilação de ELK-1
promove o recrutamento da ciclina D1, cdk4 e cdk 6. Este complexo ternário
é necessário para a progressão do ciclo celular. Em células de mamíferos, a
ciclina D1, é uma importante ferramenta no controle da transição da fase G1
para fase S (Sherr, 1994 e Hunter, 1994). A ciclina D1 ativa as proteínas
dependentes de quinase Cdk4 e Cdk6 (Weinberg, 1995).
Em nosso estudo, observamos que o estimulo com doador SNAP (0,1
mM) e SBF (10%) elevam a expressão da ciclina D1 e das quinases
dependente de ciclinas cdk 4 e cdk 6 em células endoteliais de aorta de
coelho, e em células transfectadas com vetor vazio pcDNA, figura 5A e 5B.
Figura 5A.
Densitometry
(arbitrary units)
15
10
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0
*
*
Resultados
69
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(arbitrary units)
15
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(arbitrary units)
15
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5
0
Figura 5A. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas. Após
extrato nuclear foram obtidos após 60 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado
membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina D1,
anticorpo anti cdk4 e cdk 6. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação
foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três experimentos independentes. O
nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi
determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao
controle não tratado.
Resultados
70
Densitometry
(arbitrary units)
Figura 5B
15
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*
*
5
0
Densitometry
(arbitrary units)
15
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*
*
5
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(arbitrary units)
0
15
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*
*
5
0
Figura 5B. Células transfectadas com plasmídeo vazio pcDNA foram carenciadas por 24
horas. Após este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF(10%).
Os lisados de extrato nuclear foram obtidos após 60 minutos. A quantidade de proteínas
transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti
ciclina D1, anticorpo anti cdk4 e cdk 6. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2.
A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três experimentos
independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no
autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em
*p < 0.05 em relação ao controle não tratado.
Resultados
71
Utilizamos a expressão da proteína quinase p34cdc2 ou cdc2 como
normalizadora na avaliação das alterações de expressão da ciclina D1 e das
quinases dependentes de ciclinas cdk4 e cdk6, uma vez que a expressão
desta proteína quinase é importante para a transição dos estágios G1-S e
G2-M e permanece inalterada ao longo do ciclo celular, (Sherr, 1994).
Quando utilizarmos as células Ras negativa dominante, C3A, não
verificamos o aumento da expressão da ciclina D1, bem como das quinases
dependentes de ciclinas cdk4 e cdk6, quando estas células eram
estimuladas com doador de NO (SNAP 0,1mM) por 60 minutos. Ao contrário,
quando as células C3A eram estimuladas com soro bovino fetal (10%), como
Densitometry
(arbitrary units)
demonstrado na figura 5C.
Densitometry
(arbitrary units)
15
10
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0
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5
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*
Resultados
72
Densitometry
(arbitrary units)
15
10
*
5
0
Figura 5C. Células Ras dominante negativa, C3A, foram carenciadas por 24 horas. Após
este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF(10%) em doses
previamente descritas. Os lisados de extrato nuclear foram obtidos após 60 minutos. A
quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através
de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting”
foi fixado com anticorpo anti ciclina D1, anticorpo anti cdk4 e cdk 6. Para normalizador foi
utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado
Como esperado o bloqueio da via Ras – MAP quinase em ERK 1 / 2
através do uso de seu inibidor farmacológico PD 98059, inibiu a expressão
da ciclina D1, estimulada pelo doador de NO ou por soro, figura 5D.
Resultados
73
Densitometry
(arbitrary units)
8
6
*
*
4
2
0
Figura 5D. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas e pré
incubadas com inibidor de MEK PD98059 na concentração de 20µM por 30 minutos. Após
extrato nuclear foram obtidos após 60 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado
membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina D1,
anticorpo anti cdk4 e cdk 6. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação
foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três experimentos independentes. O
nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi
determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao
controle não tratado.
4.4 Associação catalítica da ciclina D1 com as proteínas quinases
dependentes de ciclinas Cdk4 e Cdk6 hiperfosforila a proteína
retinoblastoma (pRb) quando células endoteliais de aorta de coelho
foram estimuladas com doadores de NO e SBF.
A associação catalítica da ciclina D1 com cdk 4 e cdk 6 é essencial
para a fosforilação da proteína Rb. Esta associação catalítica hiperfosforila
a proteína do retinoblastoma (pRb) no final da fase G1 (Weinberg, 1995).
Nós verificamos que o aumento da expressão de ciclina D1 e das
Resultados
74
ciclinas dependentes de quinase cdk 4 e cdk 6, fosforilam a proteína Rb,
quando células endoteliais de aorta de coelho foram estimuladas com
doador de NO (SNAP 0,1 mM) ou com SBF (10%) por 60 minutos, figura 6A.
Densitometry
(arbitrary units)
15
10
*
*
5
0
extrato nuclear foram obtidos nos tempos 15 min/ 30 min/ 45 mim e 60 min. A quantidade de
anticorpo anti pRb e anti-phospho pRb. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é
resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de
Com a fosforilação da proteína Rb em células endoteliais de aorta de
coelho através de estimulo com SNAP e SBF por 60 minutos, fomos
observar os eventos em células transfectadas C3A e pcDNA, nas mesmas
condições descritas para células endoteliais de aorta de coelho, como
demonstrado na figura 6B.
Resultados
75
Densitometry
(arbitrary units)
Densitometry
(arbitrary units)
15
*
10
5
0
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*
*
5
0
Figura 6B. Células C3A e pcDNA foram carenciadas por 24 horas. Após este período
foram incubadas na presença de SNAP e SBF em doses previamente descritas. Os lisados
de extrato nuclear foi obtido no tempo 60 min. A quantidade de proteínas utilizada do lisado
membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti pRb e antiphospho pRb. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três
experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado
no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p <
0.05 em relação ao controle não tratado.
O inibidor de MEK PD98059 bloqueou a fosforilação da proteína Rb
mediada tanto por NO quanto por soro (dados não apresentados).
Resultados
76
4.5. Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na progressão do
ciclo celular da fase G1 para a fase S em células endoteliais de aorta de
coelho.
Aquisição de células por citometria de fluxo foi elaborada para
associar a fosforilação da proteína Rb com a transição do ciclo celular da
fase G1 para a fase S. Nós examinamos a participação do doador de NO
(SNAP) e SBF no processo com células endoteliais de aorta de coelho.
Utilizamos também o inibidor de MEK 1, PD98059 com incubação prévia de
30 minutos e em seguida os estímulos para verificarmos a participação das
MAP quinases ERK 1 e ERK 2 na cascata de sinalização celular. 104
células/ml foram plaqueadas em placas de 6 poços aglomerados. Após 24
horas as células foram tratadas com 0,1mM de SNAP e 10% de SBF durante
120 minutos em atmosfera 5% de CO2 à 37ºC. Para o controle, as células
foram mantidas com meio F12 suplementado com 0,5% de SBF. Utilizamos
o protocolo do “CycleTEST PLUS™ DNA Reagent Kit” da empresa Becton
Dickinson para o tratamento das células para aquisição. A aquisição das
células foi feita por citometria de fluxo, através do software ModFit LT V 2.0 e
a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton Dickinson),
Figura 7A. O tempo foi determinado através do acompanhamento das
alterações tempo-dependente, (dados não apresentados).
Resultados
77
1
2
Resultados
78
3
4
Resultados
79
5
Figura 7A. Para controle células endoteliais de aorta de coelho foram mantidas em meio
F12 com suplementação de 0,5% de SBF (Histograma 1). Células endoteliais de aorta de
coelho foram tratadas com doador de NO (SNAP 0,1 mM) , SBF (10%) por 120 minutos
(Histograma 2 e 3). Utilizamos também o inibidor de MEK 1 PD98059 (20 µM) por 30
minutos e em seguida estimulo com doador de NO (SNAP 0,1mM) e SBF (10%) por 120
minutos (Histograma 4 e 5). A aquisição das células foi feita por citometria de fluxo, através
do software ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton
Dickinson). A significância foi fixada em *p < 0.05. Os dados tabulados são representativos
de três experimentos independentes.
Com o objetivo de oferecermos suporte experimental adicional para
elucidarmos o papel de p21Ras no processo da ativação do ciclo celular
mediado pelo NO, utilizamos células negativas dominantes para p21Ras,
C3A. Procedemos de maneira análoga às células parentais, figura 7B.
Resultados
80
Resultados
81
Figura 7B. Células C3A foram tratadas com doador de NO (SNAP 0,1 mM) , SBF (10%)
por 120 minutos. As células controles foram mantidas em meio F12 com suplementação de
SBF 0,5% de SBF. A aquisição das células foi feita por citometria de fluxo, através do
software ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton
Dickinson). A significância foi fixada em *p < 0.05. Os dados tabulados são representativos
de três experimentos independentes.
A utilização do inibidor de MEK 1, PD 98059 bloqueou a progressão
do ciclo celular da fase G1 para a fase S, quando células C3A foram
estimuladas com soro bovino fetal 10%, (dados não apresentados).
Com as células transfectadas com o vetor vazio procedemos de
maneira análoga às células parentais, figura 7C.
Resultados
82
Resultados
83
Figura 7C. Células pcDNA foram tratadas com doador de NO (SNAP 0,1 mM) , SBF (10%)
por 120 minutos. A aquisição das células foi feita por citometria de fluxo, através do software
ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton Dickinson).
A significância foi fixada em *p < 0.05. Os dados tabulados são representativos de três
experimentos independentes.
A utilização do inibidor de MEK 1, PD 98059 bloqueou a progressão
do ciclo celular da fase G1 para a fase S, quando células pcDNA foram
estimuladas com doador de NO (SNAP 0,1 mM) e soro bovino fetal (10%),
(dados não apresentados).
4.6 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na passagem do ciclo
celular da fase G1 para a fase S, através do aumento da expressão da
ciclina E.
Resultados
84
A caracterização dos dados demonstrados nos histogramas, através
da passagem do ciclo celular da fase G1 para a fase S, pode ser confirmada
com a análise do aumento da expressão da ciclina E, uma vez que a
expressão do gene codificador da ciclina E é regulado pelo E2F (Sherr,
1996) como demonstrado na figura 8. Ativação da Ciclina E pode ser
observada após 180 minutos de estímulo com doador de NO SNAP=0,1mM
e SBF a 10%. O tempo de 180 minutos foi determinado através de uma
Desnsitometry arbitrary units
cinética de tempo, (dados não apresentados). Figura 8.
100
80
*
*
*
*
*
60
40
20
0
Figura 8. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas. Após
este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF(10%). Também foram
utilizadas células C3A e PcDNA nas mesmas condições. Os lisados de extrato nuclear
foram obtidos após 180 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de
150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de
nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina E. Para normalizador foi
utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é
representativo de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa e
Resultados
85
4.7 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na passagem do ciclo
celular da fase S para a fase G2/M, através do aumento da expressão da
ciclina A
Para caracterizar a progressão do ciclo celular através da passagem
da fase S para a Fase G2/M, determinamos o aumento da expressão da
ciclina A. Ativação da Ciclina A após 300 minutos de estímulo com doador
de NO SNAP=0,1mM e BFS a 10%. O tempo de 300 minutos foi
determinado através de uma cinética de tempo, (dados não demonstrados).
Desnsitometry arbitrary units
Figura 9A.
100
80
*
*
*
*
*
60
40
20
0
este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF(10%). Também foram
utilizadas células C3A e PcDNA nas mesmas condições. Os lisados de extrato nuclear
foram obtidos após 300 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de
150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de
nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina A. Para normalizador foi
utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é
representativo de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa
de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A
Resultados
86
Aquisição de células por citometria de fluxo foi elaborada para
associar o aumento da expressão da ciclina A com a transição do ciclo
celular da fase S para a fase G2/M. Foram utilizadas células endoteliais de
aorta de coelho, células C3A e células pcDNA. 104 células/ml foram
plaqueadas em placas de 6 poços aglomerados. Após 24 horas as células
foram tratadas com 0,1mM de SNAP e 10% de SBF durante 300 minutos em
atmosfera 5% de CO2 à 37ºC. Utilizamos o protocolo do “CycleTEST
PLUS™ DNA Reagent Kit” da empresa Becton Dickinson para o tratamento
das células e aquisição. A aquisição das células foi feita por citometria de
fluxo, através do software ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo
software Cell Quest (Becton Dickinson), Figura 9B. O tempo foi determinado
através de uma cinética de tempo, dados não apresentados.
Resultados
87
Resultados
88
Resultados
89
Resultados
90
Figura 9B. Células RAEC (EC), C3A e PcDNA foram tratadas com doador de NO (SNAP
0,1 mM) , SBF (10%) por 300 minutos. A aquisição das células foi feita por citometria de
fluxo, através do software ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo software Cell
Quest (Becton Dickinson). A significância foi fixada em *p < 0.05. Os dados tabulados são
representativos de três experimentos independentes.
Resultados
91
Como esperado, quando utilizamos o inibidor de MEK PD98059 e em
seguida estímulos com SNAP e SBF em células endoteliais de aorta de
coelho, C3A, e pcDNA não observamos a transição do ciclo celular da fase S
para a fase G2/M, dados não demonstrados.
4.8 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na proliferação de células
endoteliais de aorta de coelho.
Uma vez demonstrada a progressão da fase G2/M do ciclo celular,
mediada por NO, passamos ao estudo da proliferação sob estímulo de
doador de NO. O estímulo dado pelo SBF (10%) foi utilizado como controle
positivo. Células endoteliais de aorta de coelho foram estimuladas com
doadores de NO e soro bovino fetal nas concentrações: SNAP (0,1 mM) e
SBF (10%). Células endoteliais de aorta de coelho em meio de cultura F12
com suplementação de 0,5% de soro bovino fetal foram contadas e
semeadas inicialmente a 5X104 células / poço. Novas contagens foram feitas
após o intervalo de 24 horas. Estímulo com doadores de NO e com soro
bovino fetal foi feito no tempo 24 horas por 300 minutos. A contagem final
para comparação entre as diferentes situações foi feita no tempo de 48
horas. Os resultados obtidos demonstram que células endoteliais de aorta
de coelho estimuladas com NO e SBF tiveram incrementos na proliferação
celular em comparação com células que não receberam estimulo, Figura 10.
Resultados
92
Curva de Crescimento Celular Raec
28,52
40
Número de Células
35
15,28
30
8,08
25
20
15
5
10
*
29,9
*
EC
*
EC/SNAP
*
EC/SBF
*
5
0
Inicial
24 h
48 h
Tem po
48 h
48 h
Figura 10. Células endoteliais de aorta de coelho foram mantidas em meio F12 mais 0,5%
de SBF. Contagem após 24 horas. Estímulos com doadores de NO e SBF no tempo 24
horas por 300 minutos. Verificação do efeito dos estímulos na proliferação no tempo 48
horas. Células contadas inicialmente, 5X104 por poço. Resultados são dados de três
experimentos independentes e todas as contagens foram feitas em triplicatas. *P < 0,05.
Controle vs. SNAP e SBF.
4.9 Inibição das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 e seus efeitos na proliferação
de células endoteliais de aorta de coelho induzida por óxido nítrico e SBF.
Células endoteliais de aorta de coelho em meio de cultura F12 mais
suplementação de 0,5% de SBF foram semeadas inicialmente a 5X104
células / poço. Novas contagens foram feitas no tempo 24 horas. A inibição
das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 foi feita com o inibidor PD98059 na
concentração de 20 µM no tempo de 24 horas por 30 minutos. Estímulos
com SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) foram dados por 300 minutos neste
tempo. Contagem final no tempo 48 horas foi feita para comparação dos
efeitos proliferativos. Os resultados observados mostram que o uso do
Resultados
93
inibidor PD98059 afeta diretamente a proliferação de Raec em condições
basais e de estímulo por NO e SBF. Figura 11.
Número de Células
Curva de Crescimento Celular Raec Tratadas com PD
40
35
30
25
20
15
10
5
0
28,41
30,05
*
*
CTL
CTL
15,5
8,15
5
*
CTL
8,17
8,19
8,18
**
CTL/PD
SNAP
SNAP/PD
SBF
Inicial
24 h
48 h
48 h
48 h
48 h
48 h
48 h
SBF/PD
Tempo
Figura 11. Células endoteliais de aorta de coelho foram contadas no período de 24 horas.
Em seguida a Inibição das MAP quinases por PD 98059 no tempo 24 horas e após,
estímulo com doadores de NO e SBF por 30 minutos. Verificação do efeito dos estímulos na
proliferação no tempo 48 horas Numero de células iniciais de 5X104 por poço. Resultados
são dados de três experimentos independentes e todas as contagens foram feitas em
triplicatas. *P < 0,05. Controle vs. SNAP e SBF.
Ficou demonstrado o papel de p21Ras na modificação mediada por
NO quando utilizamos as células C3A. Procedemos de maneira análoga as
células parentais. Estímulos com SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) foi feito no
tempo 24 horas por 300 minutos e a contagem final no tempo 48 horas para
comparação dos efeitos em relação às células controles
mantidas sem
estímulos.
O uso do inibidor de MEK 1 PD98059 foi utilizado para verificar seu
efeito na proliferação de células C3A quando estimuladas com soro bovino
fetal. Células contadas inicialmente, 5X104 por poço. Demonstramos assim
Resultados
94
que a proliferação de células C3A estimulada por SBF era independente de
Ras, porém dependente de ERK 1 e ERK 2. Figura 12.
C3A - Curva de Crescimento Celular
24,5
Número de Células
30
25
7,11
20
15
10
C3A/CTL
*
5
*
C3A/CTL
10,8
*
7,12
7,12
C3ACTL
SNAP
SBF
SBF/PD
5
0
Inicial
24 h
48 h
48 h
48 h
48 h
Tempo
Figura 12. Células C3A em meio F12 mais 0,5% de SBF. Contagem após 24 horas.
Estímulos nas doses indicadas no tempo 24 horas. Para a inibição das MAP quinases
utilizamos o inibidor de MEK 1 PD 98059 30 minutos antes dos estímulos. Verificação do
efeito dos estímulos na proliferação no tempo 48 horas. Células contadas inicialmente,
5X104 por poço. Resultados são dados de três experimentos independentes e todas as
contagens foram feitas em triplicatas. *P < 0,05. Controle vs. SNAP e SBF.
Também foi elaborada uma curva de crescimento para
células pcDNA. Os procedimentos foram estabelecidos de maneira análoga
aos das células parentais. Figura 13.
Resultados
95
Número de Células
Curva de Crescimento Celular ECpcDNA
28,97
28,3
35
30
15,26
25
8,13
20
15
5
10
*
*
ECpcDNA
ECpcDNA
*
ECpcDNA
*
*
EC/SNAP
EC/SBF
5
0
Inicial
24 h
48 h
48 h
48 h
Tempo
Figura 13. Células pcDNA em meio F12 mais 0,5% de SBF. Contagem no tempo 24
horas. Estímulos nas doses indicadas no tempo 24 horas. Verificação do efeito dos
estímulos na proliferação no tempo 48 horas. Células contadas inicialmente, 5X104 por
poço. Resultados são dados de três experimentos independentes e todas as contagens
foram feitas em triplicatas. *P < 0,05. Controle vs. SNAP e SBF.
Resultados da curva de crescimento com células pcDNA tratadas com
inibidor de MEK, PD 98059 e em seguidas estimuladas com doador de NO,
SNAP e SBF, mostrou inibição na proliferação, dados não apresentados.
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas
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Nitric oxide promotes proliferation and plasminogen activator
production by coronary venular endothelium through endogenous bFGF.
Circ. Res., 80: 845-852, 1997.
20
7 – APÊNDICE
Apêndice
121
1 - Barbosa De Oliveira, L.C.; Rocha Oliveira, C.J.; Stern A.; Monteiro, H.P.
Effects of lypopolysaccharide
On low - and high-density cultured rabbit
vascular smooth muscle Cells: differential modulation of nitric oxid relaese,
ERK 1 / ERK 2 Map Kinases activity, protein tyrosine phosphatase activity,
And DNA synthesis. Brazillian J. Med. Biol. Res., 35:181-190, 2002.
2 - Rocha Oliveira, C.J.; Schindler, F.; Ventura, A, M.; Moraes, M.S.; Arai, R.
J.; Debbas, V.; Stern, A.; Monteiro, H. P. Nitric Oxide and cGMP Activate the
Ras-MAP Kinase Pathway-Stimulating Protein Tyrosine Phosphorylation in
Rabbit Aortic Endothelial Cells. Free Radic. Biol. Med. 35:381-396:2003.
3 – Hugo P. Monteiro; Marli F. Cursio; Carlos J. Rocha Oliveira. Vias de
Transdução de Sinais em Células Endoteliais: Implicações na
Angiogênese. Editor: Protásio Lemos da Luz - Co-Editores: Francisco
Rafael Martins Laurindo e Antonio Carlos Palandri - Editora Atheneu, São
Paulo, Brasil – Endotélio e Doenças Cardiovasculares (2003); 83-95.

CARLOS JORGE ROCHA OLIVEIRA Óxido Nítrico Estimula a Via de

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