efeito antinociceptivo das frações hexânica e clorofórmica de

Transcrição

LARISSA ALVES RIBEIRO DE OLIVEIRA MACÊDO
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DAS FRAÇÕES HEXÂNICA E
CLOROFÓRMICA DE Selaginella convoluta (SELAGINELLACEAE)
EM CAMUNDONGOS
Dissertação
apresentada
à
Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como parte
das exigências do Programa de Pós-Graduação
em Recursos Naturais do Semiárido, para
obtenção do título de Mestre em Recursos
Naturais.
Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto
Guedes da Silva Almeida
PETROLINA
2014
LARISSA ALVES RIBEIRO DE OLIVEIRA MACÊDO
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DAS FRAÇÕES HEXÂNICA E
CLOROFÓRMICA DE Selaginella convoluta (SELAGINELLACEAE)
EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como
parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Recursos Naturais do
Semiárido, para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais.
Aprovada em: 07/03/2014.
Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida - UNIVASF
(Orientador)
Prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior – UFS
(Examinador externo)
Prof. Dra. Xirley Pereira Nunes – UNIVASF
(Examinador interno)
Macêdo, Larissa Alves Ribeiro de Oliveira
M141e
Efeito antinociceptivo das frações hexânica e clorofórmica
de Selaginella convoluta (Selaginellaceae) em camundongos / Larissa
Alves Ribeiro de Oliveira Macêdo. – – Petrolina, 2014.
202f. : il. 29 cm.
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) –
Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina.
Petrolina-PE, 2014.
Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.
1. Selaginella convoluta (Selaginellaceae) - Química vegetal. 2.
Efeito antinociceptivo. 3. Matéria Médica Vegetal. 4. Plantas Medicinais.
I. Título II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 581.192
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF
Bibliotecário (a): Maria Betânia de Santana da Silva CRB4-1747.
Dedico esse trabalho aos meus amados
pais, Visêldo e Sônia, ao meu irmão, Hélio e
ao meu esposo, Carlos Henrique, pelo amor
incondicional,
incentivo
durante esta trajetória.
e
compreensão
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por toda proteção e saúde, por guiar os
meus passos e por me presentear com pessoas maravilhosas em minha vida.
Aos meus pais, Visêldo Ribeiro de Oliveira e Sônia Maria Alves Ribeiro de
Oliveira, pelo dom da vida e principalmente por todos os ensinamentos. Os grandes
espelhos da minha vida. Exemplos de sabedoria e honestidade. Obrigada por todo
amor, dedicação, incentivo e paciência em todas as horas. Ao meu irmão Hélio, que
apesar das brigas bobas, a gente sempre acaba se entendendo. Palavras sempre
serão muito pouco para demonstrar-lhes meus sinceros agradecimentos. Amo muito
vocês!
Ao amor da minha vida, Carlos Henrique Vieira Macêdo, quem lutou todos os
dias comigo, quem sempre esteve ao meu lado. Por sacrificar nossos finais de
semana e principalmente por ter muita paciência e me amar cada dia mais. Obrigada
por cada minuto. Hoje concretizo o meu sonho e a partir de agora vamos lutar pra
realizar o nosso. O seu amor me alimenta. Eu te amo muito!
À minha família que tanto me orgulho: primos, primas, tios, tias e minhas
vozinhas amadas que tanto rezam por mim! Muito obrigada pela presença em minha
vida. Pela confiança, amor, amizade, enfim, obrigada pela existência de cada um.
Ao meu sogro Aluísio e minha sogra Vânia por serem tão importantes e por
torcerem pelo meu sucesso.
Ao Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, por me aceitar como
orientanda, por buscar o melhor em mim. Obrigada pelo incentivo, por todos os
conhecimentos compartilhados, conselhos, confiança e essencial contribuição
durante este trabalho. A quem devo o sucesso dessa trajetória.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do
Semiárido, por todos os ensinamentos compartilhados. Em especial à Profa. Xirley
Pereira Nunes, por ser uma pessoa incrível, acreditar em mim e ser acima de tudo,
muito amiga. Os meus sinceros agradecimentos!
À Profa. Rosemairy Luciane Mendes, por ceder seu laboratório para
realização dos meus experimentos e principalmente por toda paciência, atenção e
ensinamentos durante meus períodos de aperreio.
Aos componentes da banca, Prof. Raimundo Palheta, por ser tão
compreensivo e dedicado e ao Prof. Lucindo Quintans-Júnior, pela aceitação e
principalmente por me ajudar com sugestões durante os encontros em congressos.
Ao Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME), grupo
que tenho maior orgulho de fazer parte e que se tornaram grandes companheiros do
dia a dia. Agradecimento especial para os meus amigos de laboratório, Ana Paula,
Amanda, Sarah Raquel, Juliane Cabral, Camila Araújo, Tâmara Diniz, Grasielly
Rocha, Raimundo Júnior, Suzana Rabêlo e Alessandra Pacheco. Cada um teve sua
importância e sua participação, obrigada a todos por terem tornado esse trabalho
possível.
Ao Professor Dr. Emiliano de Oliveira Barreto e todos do Laboratório de
Biologia Celular e Molecular, da Universidade Federal de Alagoas que com muita
hospitalidade me receberam e ofertaram seu tempo e material para a realização dos
testes de atividade anti-inflamatória, meu respeito e admiração! Aos amigos que lá
fiz, Fernanda Aquino, João Noé, Samário Lino, Almair Araújo, Laís Agra e Rafael
Vital. Agradeço-os pela amizade, auxílio nos experimentos, conhecimentos
compartilhados diariamente e momentos de descontração. Em especial, à minha
amiga de longas datas, Jamylle Ferro, pela colaboração extremamente importante
no desenvolvimento deste trabalho e, com certeza, de muitos que estão por vir.
Obrigada por tudo!
A Henrique Saraiva, Érica Lavor e Mariana Gama pela disposição e
principalmente, parceria na realização dos meus experimentos.
Ao pessoal do biotério Leonardo, Euda, Helenildo e Jean, pelo carinho de
sempre e por me receberem tão bem a cada visita.
Aos Técnicos: Silvio Alan, Roniere A. Oliveira e Fernando pela ajuda e
compreensão.
A todos os servidores da UNIVASF, em especial Francisca, João Paulo, Sr.
Cícero, Geralda, Juliana, Maria e Neide por toda atenção e momentos de
descontração nos intervalos dos experimentos.
Aos colegas de turma pelos momentos de estudo juntos e por toda amizade.
Em especial Anne, pelo carinho e por compartilhar momentos de aflição.
Aos órgãos de fomento, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco (FACEPE) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.
Por último, não menos importante, a todos os animais utilizados, por terem
dado a vida para a realização deste trabalho, dedico todo o meu respeito e
agradecimento.
Agradeço, dessa forma, a todos que de alguma forma contribuíram para a
realização deste trabalho, fazendo parte deste caminho de crescimento profissional
e pessoal. Muito obrigada!
“Que
os
vossos
esforços
desafiem
as
impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes
coisas do homem foram conquistadas do que
parecia impossível”.
(Charles Chaplin)
RESUMO
Larissa Alves Ribeiro de Oliveira Macêdo. Efeito antinociceptivo das frações
hexânica e clorofórmica de Selaginella convoluta (Selaginellaceae) em
camundongos. Petrolina, Pernambuco, 2014.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring (Selaginellaceae), é uma planta medicinal
conhecida na região Nordeste como “jericó” e utilizada na medicina popular como
antidepressivo, diurético, afrodisíaco, analgésico e anti-inflamatório. Este trabalho
teve como objetivo avaliar a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das frações
hexânica (Sc-Hex) e clorofórmica (Sc-CHCl3), obtidas por partição do extrato
etanólico bruto (Sc-EEB) de Selaginella convoluta em camundongos. Para tanto,
foram utilizados camundongos Swiss machos (n=6 por grupo, 25-35 g). Os animais
foram tratados 30 ou 60 minutos antes com as frações nas doses de 100, 200 e 400
mg/kg, via i.p, veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p) ou droga padrão
(i.p). Foram utilizados modelos murinos: teste de contorções abdominais induzidas
por ácido acético, teste da formalina e teste da placa quente, visando à avaliação da
atividade antinociceptiva. Além disso, foi realizado o teste do rota-rod para verificar
alguma interferência no desempenho motor. Os modelos de pleurisia induzida por
carragenina com quantificação de proteínas totais e edema de pata induzido por
carragenina foram utilizados para avaliar a atividade anti-inflamatória. A fim de
contribuir com a segurança do uso, foi realizado o estudo toxicológico conduzido
durante 14 dias, realizando administração única das frações nas doses de 400 e
2000 mg/kg, via intraperitoneal (i.p). Ao final do estudo, os animais foram
eutanasiados para avaliação de parâmetros bioquímicos, hematológicos e
histopatológicos. Foi realizado também o ensaio de viabilidade celular por MTT. No
teste de contorções abdominais, as frações induziram inibição significativa (p <
0,05). No teste da formalina, as duas frações foram ativas na fase inflamatória. Já no
teste da placa quente, nenhuma das frações aumentou de maneira estatisticamente
significativa o tempo de permanência do animal sobre a placa aquecida. Por outro
lado, no ensaio de pleurisia induzida por carragenina, somente os animais tratados
com Sc-CHCl3 apresentaram redução da migração celular bem como o
extravasamento de proteínas na cavidade pleural. Entretanto, o tratamento com as
frações não foi capaz de diminuir o edema de pata. Não houve interferência na
coordenação motora dos animais. Houve redução da viabilidade celular a partir da
dose de 250 µg/mL para Sc-Hex e 1 µg/mL para Sc-CHCl3. A administração das
frações no ensaio de toxicidade não provocou morte em nenhum dos grupos
tratados. Entretanto, alterações histopatológicas foram vistas nos rins e fígado dos
animais tratados com a maior dose. Conclui-se que Selaginella convoluta possui
atividade antinociceptiva, corroborando em parte seu uso na medicina popular.
Adicionalmente, outros estudos de toxicidade devem ser feitos com o intuito de
melhor caracterizar o perfil de segurança das frações.
Palavras-chave: Antinociceptivo, Anti-inflamatório, Plantas Medicinais, Selaginella
convoluta.
ABSTRACT
Larissa Alves Ribeiro de Oliveira Macedo. Antinociceptive effect of the hexane
and chloroform fractions of Selaginella convoluta (Selaginellaceae) in mice.
Petrolina, Pernambuco, 2014.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring (Selaginellaceae), is a medicinal plant known in
the Northeast of Brazil as ’jericó’ and it is used in folk medicine as an antidepressant,
diuretic, aphrodisiac, analgesic and anti-inflammatory agent. This study aimed to
evaluate the antinociceptive and anti-inflammatory activities of the hexane (Sc-Hex)
and chloroform (Sc-CHCl3) fractions, obtained from the crude ethanol extract (ScEEB) of Selaginella convoluta partition in mice. For this purpose, Swiss mice (n=6
per group, 25-35 g) were used. Animals were treated 30 or 60 minutes prior to the
fractions at the doses of 100, 200 and 400 mg/kg, ip, vehicle (0.9% saline solution +
0.2% Tween 80, ip) or standard drugs (i.p.). Murine models were used: writhinginduced by acetic acid, formalin and hot plate tests, in order to evaluate the
antinociceptive activity. In addition, the rota-rod test was performed to check for
interference with motor coordination. The model of carrageenan-induced pleurisy to
quantitation of total protein and paw edema induced by carrageenan, were used to
assess the anti-inflammatory activity. To contribute to the safety of the use, the
toxicological study conducted for 14 days, performing only fractions of administration
at doses of 400 and 2,000 mg/kg, intraperitoneally (ip) was performed. At the end of
the study, the animals were euthanized for evaluation of biochemical, hematological
and histopathological parameters. The cell viability assay by MTT was also
performed. In the writhing test the fractions induced a significant inhibition (p < 0.05).
In the formalin test, the two fractions were active in the inflammatory phase. Already
in the hot plate test, none of the fractions increased in a statistically significant way
the latency time of the animal on the hot plate. Moreover, in the the test of
carrageenan-induced pleurisy, the animals treated only with Sc-CHCl3 had reduced
cell migration and extravasation of protein in the pleural cavity. However, treatment
with the fractions was not able to reduce paw edema. There was no interference with
motor coordination of animals. There was a reduction in cell viability from the dose of
250 mg/mL for Sc-Hex and 1 mg/mL for Sc-CHCl3. The administration of the fractions
in the toxicity test did not cause death in any of the treated groups. However,
histopathological changes were seen in the kidneys and liver of animals treated with
the higher dose. We conclude that Selaginella convoluta has antinociceptive activity,
supporting in part its use in folk medicine. In addition, toxicity studies should be made
in order to better characterize the safety profile of the fractions.
Keywords:
convoluta.
Antinociceptive,
Anti-inflammatory,
Medicinal
plants,
Selaginella
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Transmissão do estímulo doloroso. ........................................................... 33
Figura 2. Processamento sensorial no corno dorsal da medula espinal. .................. 35
Figura 3. Ilustração dos 5 sinais da inflamação: calor, rubor, edema, dor e perda da
função. ...................................................................................................................... 36
Figura 4. Etapas do recrutamento de leucócitos para o sítio da inflamação.............38
Figura 5. Comportamento de Selaginella convoluta (Arn.) Spring (Selaginellaceae)
em período seco (A) e chuvoso (B). .......................................................................... 47
Figura 6. Tapete formado por Selaginella convoluta durante os primeiros dias de
chuva ........................................................................................................................ 47
Figura 7. Exsicata de Selaginella convoluta coletada em Petrolina-PE.. .................. 50
Figura 8. Material vegetal seco e pulverizado. ......................................................... 51
Figura 9. Processo de obtenção das frações de S. convoluta: A) Destilação do
solvente em evaporador rotativoà pressão reduzida B) Extrato etanólico bruto C)
Partição líquido-líquido. ............................................................................................. 52
Figura 10. Contorção abdominal induzida por ácido acético.. .................................. 54
Figura 11. Teste de nocicepção induzida por formalina ........................................... 55
Figura 12. Teste da placa quente ............................................................................. 56
Figura 13. Modelo de pleurisia induzida por carragenina ......................................... 57
Figura 14. Edema de pata induzido por carragenina ................................................ 58
Figura 15. Avaliação da coordenação motora no teste do rota-rod. ....................... ..59
Figura 16. Avaliação diária do peso corporal, consumo de alimento e água no teste
de toxicidade aguda. ............................................................................................... ..60
Figura 17. Efeito antinociceptivo da fração hexânica de Selaginella convoluta (ScHex 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg), no teste
de contorções abdominais em camundongos.. ......................................................... 66
Figura 18. Efeito antinociceptivo da fração clorofórmica de Selaginella convoluta
(Sc-CHCl3 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg), no
teste de contorções abdominais em camundongos .................................................. 67
Figura 19. Efeito antinociceptivo da fração hexânica de Selaginella convoluta (ScHex 100, 200 e 400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (150 mg/kg) e morfina (10 mg/kg)
na primeira e segunda fase do teste da formalina em camundongos.. ..................... 68
(Sc-CHCl3 100, 200 e 400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (150 mg/kg) e morfina (10
mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina em camundongos. .......... 68
Figura 21. Efeito antinociceptivo da fração hexânica de Selaginella convoluta (ScHex 100, 200 e 400 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em 30,
60, 90 e 120 minutos após sua administração em camundongos... .......................... 69
(Sc-CHCl3 100, 200 e 400 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em
30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração em camundongos.. ..................... 69
Figura 23. Efeito anti-inflamatório da fração hexânica de Selaginella convoluta (ScHex 100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no modelo de pleurisia
induzida por carragenina em camundongos.. ........................................................... 70
Figura 24. Efeito anti-inflamatório da fração clorofórmica de Selaginella convoluta
(Sc-CHCl3 100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no modelo de pleurisia
induzida por carragenina em camundongos.............................................................. 71
Figura 25. Efeito da fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 100, 200 e
400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) sobre o extravasamento de proteínas
plasmáticas no modelo de pleurisa induzida por carragenina em camundongos...... 72
Figura 26. Efeito da fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 100, 200
e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) sobre o extravasamento de proteínas
plasmáticas no modelo de pleurisa induzida por carragenina em camundongos...... 72
Figura 27.
Efeito anti-inflamatório das frações hexânica e clorofórmica de
Selaginella convoluta (Sc-Hex e Sc-CHCl3, 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10
mg/kg) no modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos. . 72
Figura 28. Efeito da fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex, 100, 200 e
400 mg/kg, i.p) e diazepam (2,5 mg/kg) no teste do rota-rod em camundongos ...... 74
Figura 29. Efeito da fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3, 100,
200 e 400 mg/kg, i.p) e diazepam (2,5 mg/kg) no teste do rota-rod em
camundongos.. .......................................................................................................... 74
Figura 30. Dados do consumo de água dos animais tratados com a fração hexânica
de Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante
14 dias (n= 12 por grupo). ......................................................................................... 76
Figura 31. Dados do consumo de ração dos animais tratados com a fração hexânica
de Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante
14 dias (n= 12 por grupo).. ........................................................................................ 76
Figura 32. Dados da variação de peso corporal dos animais tratados com a fração
hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9%
durante 14 dias (n= 12 por grupo). ............................................................................ 77
Figura 33. Dados do consumo de água dos animais tratados com a fração
clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina
0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ................................................................... 77
Figura 34. Dados do consumo de ração dos animais tratados com a fração
clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina
0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).. .................................................................. 78
clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc- CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina
0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ................................................................... 78
Figura 36. Fotomicrografias representativas do histopatológico hepático dos animais
tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração hexânica de
Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg, i.p), respectivamente. Coloração
Hematoxilina-Eosina (H.E).. ...................................................................................... 84
tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração clorofórmica de
Hematoxilina-Eosina (H.E). ....................................................................................... 84
Figura 38. Fotomicrografias representativas do histopatológico renal dos animais
tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração hexânica de
Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg, i.p), respectivamente. Coloração
Hematoxilina-Eosina(H.E). ........................................................................................ 84
tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração clorofórmica de
Hematoxilina-Eosina (H.E). ....................................................................................... 85
Figura 40. Efeito da fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 1, 100, 250 e
500µg/mL) sobre a viabilidade celular.. ..................................................................... 85
Figura 41. Efeito da fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 1, 100,
250 e 500µg/mL) sobre a viabilidade celular. . .......................................................... 86
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Constituintes químicos identificados nas fases de Selaginella convoluta
através de cromatografia em camada delgada. ........................................................ 65
Tabela 2. Parâmetros hematológicos do sangue de camundongos tratados com a
fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg, i.p) e solução
salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ........................................................ 79
Tabela 3. Parâmetros bioquímicos do sangue de camundongos tratados com a
salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).. ....................................................... 80
fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg, i.p) e
solução salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ........................................... 81
solução salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ........................................... 81
Tabela 6. Peso dos órgãos de camundongos tratados com a fração hexânica de
Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg, i.p) e solução salina 0,9% durante
14 dias (n= 12 por grupo). ......................................................................................... 83
Tabela 7. Peso dos órgãos de camundongos tratados com a fração clorofórmica de
Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg, i.p) e solução salina 0,9%
durante 14 dias (n= 12 por grupo). ............................................................................ 83
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aα: Fibras do tipo A - alfa
Aβ: Fibras do tipo A - beta
Aδ: Fibras do Tipo A - delta
AA: Ácido araquidônico
AAS: Ácido acetilsalicílico
ACTH: Corticotropina
AINES: Anti-inflamatórios não esteroidais
ALT: Alanina aminotransferase
AMPc: Adenosina monofosfato cíclico
ANOVA: Análise de variância
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASIC: Canais iônicos sensíveis ao ácido
AST: Aspartato aminotransferase
CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais
CHCM: Concentração de hemoglobina corpuscular média
COX: Ciclooxigenase
COX 1: Ciclooxigenase 1
C5a: Fator quimiotático 5a do sistema complemento
CRAD: Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga
DMSO: Dimetilsulfóxido
EDTA: Ácido Etilenodiaminotetraacético
EEB: Extrato Etanólico Bruto
EMA: European Medicines Agency
Enos: Óxido nítrico sintase endoltelial
E.P.M: Erro Padrão da Média
FDA: Food and Drugs Agency
HCM: Hemoglobina corpuscular média
H.E: Hematoxilina-Eosina
HVASF: Herbário Vale do São Francisco
IASP: Associação Internacional para o Estudo da Dor
IL: Interleucinas
IL 1: Interleucina 1
IL1β: Interleucina 1 beta
IL1Ra: Antagonista do receptor de Interleucina 1
INDO: Indometacina
iNOS: Óxido nítrico sintase induzível
i.p: Via intraperitoneal
i.t: Via intratorácica
LOX: Lipooxigenase
LT: Leucotrieno
LTB4: Receptor de leucotrieno B4
LTC4: Receptor de leucotrieno C4
LTD4: Receptor de leucotrieno D4
LTE4: Receptor de leucotrieno E4
MOR: Morfina
MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio
NEPLAME: Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais
NF-κB: Fator nuclear κB
NGF: Fator de crescimento do nervo
nNOS: Óxido nítrico sintase constitutiva
NO: Óxido Nítrico
NOS: Óxido Nítrico Sintase
OMS: Organização Mundial da Saúde
PAF: Fator de ativação plaquetária
PBS: Tampão fosfato salino
PG: Prostaglandina
PGD2: Prostaglandina D2
PGE2: Prostaglandina E2
PGI2: Prostaglandina I2
PGF2α: Prostaglandina F2α
PLA2: Fosfolipase A2
ROS: Espécies Reativas de Oxigênio
Sc-EEB: Extrato etanólico bruto de Selaginella convoluta
Sc-Hex: Fração hexânica de Selaginella convoluta
Sc-CHCl3: Fração clorofórmica de Selaginella convoluta
SNA: Sistema Nervoso Autônomo
SNC: Sistema Nervoso Central
SNP: Sistema nervoso Periférico
s.p: Via subplantar
SP: Substância P
TGO: Transaminase glutâmico oxalacética
TGP: Transaminase glutâmico pirúvica
TNF-α: Fator de Necrose Tumoral alfa
TRPV1: Receptor de Potencial Transitório Vaniloide 1
Tx; Tromboxano
TxA2: Tromboxano A2
UFS: Universidade Federal de Sergipe
UNIVASF: Universidade Federal do Vale do São Francisco
VCM: Volume corpuscular médio
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 24
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 28
2.1. Objetivo geral ..................................................................................................... 28
2.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 28
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................ 30
3.1. Considerações sobre dor ................................................................................... 30
3.1.1. Dor e nocicepção ............................................................................................ 30
3.1.2. Nociceptores e fibras nociceptivas .................................................................. 32
3. 2. Inflamação ......................................................................................................... 35
3.3. Produtos naturais ............................................................................................... 42
3.3.1. Considerações sobre a família Selaginellaceae e o gênero Selaginella ......... 44
3.3.2. Considerações sobre a espécie Selaginella convoluta ................................... 46
4. PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................... 50
4.1. Material vegetal .................................................................................................. 50
4.1.1. Coleta e obtenção das frações hexânica e clorofórmica de S. convoluta ....... 50
4.2. Triagem fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de Sc-Hex e Sc-CHCl3
................................................................................................................................... 52
4.3. Animais............................................................................................................... 52
4.4. Testes de atividade antinociceptiva .................................................................... 53
4.4.1. Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético......................... 53
4.4.2. Teste de nocicepção induzida por formalina ................................................... 54
4.4.3. Teste da placa quente ..................................................................................... 55
4.5. Testes de atividade anti-inflamatória .................................................................. 56
4.5.1. Modelo de pleurisia induzida por carragenina ................................................. 56
4.5.1.2. Quantificação de proteínas totais ................................................................. 57
4.5.2. Edema de pata induzido por carragenina ........................................................ 58
4.6. Avaliação da coordenação motora (teste do rota rod) ........................................ 59
4.7. Toxicidade aguda ............................................................................................... 60
4.7.1. Triagem farmacológica comportamental ......................................................... 60
4.7.2. Análise de parâmetros bioquímicos e hematológicos ..................................... 61
4.7.3. Análise histopatológica dos órgãos ................................................................. 61
4.8. Ensaio de viabilidade celular por MTT ................................................................ 62
4.9. Análise Estatística .............................................................................................. 62
5. RESULTADOS ...................................................................................................... 65
5.1. Triagem fitoquímica ............................................................................................ 65
5.2. Resultados da atividade farmacológica das frações obtidas de Selaginella
convoluta ................................................................................................................... 65
5.2.1. Atividade antinociceptiva das frações obtidas de Selaginella convoluta ......... 65
5.2.1.1.Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético ....................... 65
5.2.1.2. Teste de nocicepção induzida por formalina ................................................ 67
5.2.1.3. Teste da placa quente .................................................................................. 68
5.2.2. Atividade anti-inflamatória das frações obtidas de Selaginella convoluta........ 70
5.2.2.1. Modelo de pleurisia induzida por carragenina .............................................. 70
5.2.2.1.2. Quantificação de proteínas totais .............................................................. 71
5.2.2.2. Edema de pata induzido por carragenina ..................................................... 73
5.3. Avaliação da atividade motora no teste do rota-rod ........................................... 73
5.4. Toxicidade aguda das frações obtidas de Selaginella convoluta ....................... 74
5.4.1 Triagem farmacológica comportamental .......................................................... 75
5.4.2. Consumo de água, ração e variação do peso dos animais ............................. 75
5.4.3. Parâmetros hematológicos e bioquímicos ....................................................... 78
5.4.4. Análise macroscópica, histológica e peso dos órgãos .................................... 82
5.5 Ensaio de viabilidade celular por MTT ................................................................ 85
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 88
6.1. Triagem fitoquímica. ........................................................................................... 88
6.2. Atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das frações obtidas de Selaginella
convoluta. .................................................................................................................. 88
6.3. Toxicidade aguda. .............................................................................................. 94
7. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 98
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 100
APÊNDICE .............................................................................................................. 124
ANEXOS ................................................................................................................. 200
1. INTRODUÇÃO
MACÊDO, L. A. R. O. Efeito antinociceptivo das frações hexânica e clorofórmica de Selaginella
convoluta (Selaginellaceae) em camundongos.
24
1. INTRODUÇÃO
Durante o processo de seleção natural, o homem desenvolveu diversos
mecanismos fisiológicos que permitiram sua sobrevivência. A dor, certamente ocupa
um lugar de destaque, já que é um dos sintomas que faz com que o indivíduo tenha
consciência de que sua integridade está sendo ameaçada ou que há alguma
disfunção em seu organismo (CUNHA, 2009).
Entre as diversas fontes para o desenvolvimento de fármacos com potencial
analgésico e/ou anti-inflamatório, os produtos naturais são de particular importância.
O uso desses produtos está bem documentado ao longo da história humana e sua
contribuição na indústria farmacêutica vem sendo mostrada ao longo dos anos em
diversos trabalhos (BUTLER, 2008; HARVEY, 2008; NEWMAN; CRAGG, 2007).
Dessa forma, o uso de plantas medicinais para o tratamento da dor tem sido a opção
mais econômica para a população de baixa renda (LIMA-SARAIVA, 2012a).
O manejo da dor é um aspecto essencial da medicina moderna e para a
qualidade de vida, entretanto, existe a limitação apresentada pela indústria
farmacêutica dos fármacos disponíveis no mercado quanto aos efeitos colaterais e
sua eficácia (BOURINET et al., 2005; RIBEIRO; SCHMIDT; SCHMIDT., 2002). A
terapia farmacológica ainda é o recurso clínico mais eficaz no tratamento da dor.
Dentre os medicamentos mais utilizados, têm-se os opioides, anti-inflamatórios não
esteroidais (AINES), analgésicos periféricos, miorrelaxantes e os antidepressivos
(DIONNE, 1997). No entanto, cerca de 40 a 60% dos pacientes não respondem a
farmacoterapia, pois alguns tipos de dor podem ser resistentes à analgésicos
comuns (XU et al., 2012; CLAUW; ARNOLD; MCCARBERG., 2011). Por essa razão
que a descoberta de novas terapias para o tratamento da dor é necessária,
especialmente para tratar a proporção de pacientes que não respondem aos
analgésicos disponíveis.
O uso de plantas medicinais e fitoterápicos compõem uma fonte de
tratamento em expansão mundial. No ano de 2000, cerca de 25% de todas as
prescrições médicas nos Estados Unidos incluem substâncias naturais como
princípio ativo, obtidas de plantas de regiões temperadas e tropicais, o que
corresponde ao valor estimado de 900 milhões de dólares na circulação comercial
(BRAZ-FILHO, 2010). Do total de 19 medicamentos baseados em produtos naturais
aprovados pela Food and Drugs Agency (FDA) e European Medicines Agency
25
(EMA) entre os anos de 2005 a 2010, 7 correspondem a produtos naturais, 10 são
produtos naturais semi-sintéticos e 2 são drogas derivadas de produtos naturais, o
que remete a grande importância dos produtos naturais diante da farmacêutica
mundial (BRITO, 2013).
No Brasil, temos como exemplo recente o anti-inflamatório tópico Acheflan®,
do laboratório Aché, produto produzido totalmente em território nacional e originado
a partir do óleo essencial da espécie Cordia verbenácea, sendo registrado pela
Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA) em 2004 e lançado no mercado em 2005,
onde, desde então, passou a ser o anti-inflamatório tópico mais prescrito pela classe
médica brasileira, correspondendo a cerca de 44% das prescrições (CALIXTO;
SIQUEIRA JUNIOR, 2008).
O Brasil é detentor da maior biodiversidade mundial, abrigando cerca de 50
mil espécies de plantas, distribuídas em grandes biomas (Mata Atlântica, Amazônia ,
Cerrado, Caatinga, Pampas, Pantanal e Ambientes costeiros ) com características
distintas que confere uma riqueza e diversidade de vegetação (SKORUPA; VIEIRA,
2005; BIOMAS DO BRASIL, 2012). Desta forma, o Brasil é considerado um país
com uma enorme biodiversidade vegetal e com diversas plantas com alto valor
alimentício e medicinal (SOUZA; FELFILI, 2006).
Nesse contexto, a região Nordeste brasileira ocupa aproximadamente
1.600.000 Km2, o equivalente a cerca de 18% da superfície do Brasil, estando nesta
área, a região semiárida, que ocupa uma área que abriga 63% da população
nordestina, com cerca de 900 mil Km2, correspondendo a aproximadamente 70% da
região Nordeste e 13% do território brasileiro. A existência de um bioma único torna
essa região importante ecologicamente. Esse bioma, peculiar e exclusivo, recebeu
dos índios locais o nome de Caatinga, “a mata branca”, em virtude do aspecto da
vegetação na estação seca, quando as folhas caem, e apenas os troncos brancos e
brilhosos das árvores e arbustos permanecem (PRADO, 2003).
O bioma Caatinga é o principal ecossistema dessa região brasileira,
ocupando os estados da Bahia, Ceará, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte,
Paraíba, Sergipe, Alagoas e Minas Gerais (BRASIL, 2008). Algumas espécies
endêmicas desse bioma possuem atividade antinociceptiva, como Neoglaziovia
variegata (LIMA-SARAIVA et al., 2012b) e Amburana cearensis (OLIVEIRA et al.,
26
2009). Além disso, outras espécies coletadas na região Nordeste também possuem
efeito antinociceptivo e anti-inflamatório (ANDRADE et al., 2012; LIMA et al., 2012).
O bioma Caatinga é ainda a região menos estudada. Portanto, merece
destaque, por ser um bioma exclusivamente brasileiro e possuir uma proporção
expressiva de plantas endêmicas, que são rotineiramente utilizadas pela população
por suas propriedades terapêuticas (LEAL et al., 2005).
Considerando a biodiversidade da região semiárida e a sua ampla extensão
territorial contrastando com os baixos níveis de condições de vida da população,
principalmente no que se refere ao acesso a medicamentos da flora regional e de
baixo custo, a espécie escolhida para o estudo, Selaginella convoluta (Arn.) Spring,
pertencente à família Selaginellaceae, é encontrada na região do Vale do São
Francisco e mesmo existindo vários estudos com plantas do gênero (HIRAI; PRADO,
2000;
ANTHONY;
THOMAS,
2011;
NALLAIYAN;
DORAISWAMY,
2011;
SETYAWAN, 2011) pouco se conhece acerca de suas propriedades farmacológicas.
A fim de contribuir e dar continuidade ao trabalho realizado com o extrato etanólico
bruto de S. convoluta por Sá et al (2012a), o objetivo desse estudo foi avaliar a
atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das frações obtidas por partição de S.
convoluta, bem como o perfil de toxicidade da espécie, para assegurar seu uso e
servir de parâmetros para o desenvolvimento de futuros medicamentos.
2.OBJETIVOS
28
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Investigar a possível atividade antinociceptiva e/ou anti-inflamatória das
frações hexânica (Sc-Hex) e clorofórmica (Sc-CHCl3) obtidas por partição de
Selaginella convoluta (Arn.) Spring em camundongos.
2.2. Objetivos específicos
- Realizar a triagem fitoquímica nas frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 para a identificação
das principais classes de constituintes químicos;
- Avaliar o potencial antinociceptivo e anti-inflamatório das frações Sc-Hex e ScCHCl3;
- Verificar possível alteração motora induzida pela administração das frações Sc-Hex
e Sc-CHCl3;
- Avaliar o perfil de segurança das frações, através do estudo de toxicidade aguda;
- Verificar o efeito das frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 sobre a viabilidade celular por
MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio);
- Contribuir para o estudo farmacológico da família Selaginellaceae.
3. FUNDAMENTAÇÃO
TEÓRICA
30
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1. Considerações sobre a dor
3.1.1 Dor e nocicepção
O significado da palavra “dor”, na língua portuguesa, vem do latim: dolore,
que denota sofrimento; e “pain” na língua inglesa, do grego: poiné, punição (FEIN,
2011). O organismo humano possui diversos mecanismos e sinais responsáveis
pelo controle da homeostasia, dentre eles a dor desempenha papel fisiológico
importante, uma vez que ela é um dos principais sintomas clínicos de alerta para a
detecção de algo que ameace a integridade física do organismo (CHAPMAN;
GAVRIN, 1999; JULIUS; BASBAUM, 2001).
Esse mecanismo de proteção pode ser definido como sendo uma experiência
consciente influenciada por memórias emocionais, patológicas, genéticas e fatores
cognitivos (ROY et al., 2009; ALLAN et al., 2009; NOEL et al., 2012;). Assim, a dor é
um evento altamente subjetivo, como ilustrado pela definição dada pela Associação
Internacional para o Estudo da Dor (IASP): ''uma experiência sensorial e emocional
desagradável associada a dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de
tal dano'' (TRACEY; MANTYH, 2007).
Desta forma, a dor, além da experiência
emocional, está associada a um componente sensorial, denominado nocicepção, o
qual depende da ativação de receptores específicos e vias neuroanatômicas que
fazem a comunicação entre o Sistema Nervoso Periférico (SNP) e o Sistema
Nervoso Central (SNC) (RUSSO; BROSE, 1998; JULIUS; BASBAUM, 2001;
MENSE, 2009).
Sherrington (1906) denominou nocicepção, como sendo percepção de
estímulos nocivos, entretanto, isso não significa o mesmo que a sensação de dor.
Assim, enquanto a nocicepção refere-se às manifestações neurofisiológicas geradas
pelo estímulo nocivo, a dor é a desagradável experiência emocional que
normalmente acompanha nocicepção (LOESER; TREEDE, 2008). Sendo assim, os
animais não são capazes de verbalizar os componentes subjetivos da dor, neles não
se avalia dor, mas nocicepção. Logo, termos como dor e analgesia são empregados
para estudos em humanos, enquanto que nocicepção e antinocicepção são mais
31
utilizados para estudos pré-clínicos, envolvendo animais de laboratório (KANDEL;
SCHWARTZ; JESSEL, 2003).
A dor pode ser classificada de diversas maneiras, sendo a duração da
sensação dolorosa o critério mais utilizado. Dessa forma, a dor pode ser transitória,
aguda ou crônica (FUCHS; WANNMACHER; FERREIRA, 2006). Na dor do tipo
transitória, os nociceptores da pele ou de outros tecidos do corpo podem ser
ativados sem necessariamente ocorrer injúria tecidual, sendo sua função, proteger
o organismo de um possível dano. Segundo Loeser & Melzack (1999) a dor aguda é
caracterizada pela ativação dos nociceptores locais após injúria substancial de um
tecido (traumas, intervenções cirúrgicas e algumas doenças), estando associada à
estimulação direta de nociceptores, conexões nervosas no SNC e sistema nervoso
autônomo (SNA).
Apesar dos propósitos protetores, a dor pode tornar-se crônica e perpetuar
por meses ou anos (PARK; VASKO, 2005) sendo característica de situações em que
o organismo não é capaz de produzir resolução da lesão ou quando são
estabelecidos mecanismos adaptativos inadequados (D’MELLO; DICKENSON,
2008). Por isso, apresenta-se como um grande desafio na atualidade, ocasionando
reações emocionais negativas, debilitante, redução da qualidade e expectativa de
vida, custos socioeconômicos, além de estar associada com comorbidades como
distúrbios de sono e depressão (GRIFFIS; COMPTON, DOERING, 2006; TRACEY;
DICKENSON, 2012).
A dor pode ainda ser classificada quanto à sua fisiopatologia em neurogênica,
quando ocorre lesão do tecido neuronal; neuropática, quando ocorre a disfunção de
um nervo; psicogênica, que ocorre por fatores psicológicos; nociceptiva, quando
ocorre por estimulação excessiva dos nociceptores ou inflamatória, que resulta
basicamente da interação entre o tecido danificado e os neurônios sensoriais
nociceptivos periféricos, por meio da participação de mediadores inflamatórios que
induzem modificações funcionais na excitabilidade neuronal (MILLAN, 1999; RANG
et al., 2007; BESSON, 1999). Tais mediadores são liberados diretamente pelas
células danificadas pelo trauma tecidual ou pelo reconhecimento de um elemento
estranho ao organismo por células residentes, como, por exemplo, os macrófagos
(CUNHA, 2009).
32
Apesar dos avanços nas áreas de conhecimento relacionadas à dor, os
resultados dos tratamentos bem como a prevenção de queixas recorrentes ainda
não são satisfatórios. Assim, a analgesia efetiva para síndromes dolorosas ainda é
um desafio, e o entendimento da neuroanatomia das vias de condução, da
fisiopatologia da dor e da farmacologia é fundamental na busca de novas
alternativas terapêuticas (ROCHA et al., 2007; TEIXEIRA, 2006).
3.1.2 Nociceptores e fibras nociceptivas
O termo nociceptor é uma abreviatura de “nocirreceptor” e significa um
receptor para estímulo nociceptivo (RANG et al., 2012). Descrito por Sherrington
(1906), foi introduzido como sendo terminações livres de neurônios aferentes
primários, que podem ser despolarizados por estímulos mecânicos, térmicos ou
químicos (KRESS; ZEILHOFER, 1999). Inervam o sistema cutâneo, músculos,
vísceras e outros órgãos, e sua função é de transmitir informações aos neurônios de
ordem superior sobre a lesão tecidual ocasionada por estímulos nocivos (FEIN,
2011). Pois, esses neurônios são ativados apenas por estímulos nocivos que
excedem um limite considerado fisiológico,
sugerindo que eles possuem
propriedades biofísicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente a estímulos potencialmente lesivos. Quando ativados, os nociceptores
sofrem alterações na membrana, permitindo a deflagração de potenciais de ação
que serão transmitidos até o SNC através da medula espinal, o que pode ser
interpretado como sensação dolorosa no córtex cerebral (TRACEY; DICKENSON,
2012; MEYER et al., 2008).
São conhecidas quatro classes de nociceptores: mecânicos, térmicos,
polimodais e silenciosos. Os nociceptores mecânicos respondem à pressão intensa,
enquanto os nociceptores térmicos respondem às temperaturas extremas, quentes
(>45 °C) ou frias (<5 °C). A maioria dos nociceptores são polimodais, ou seja,
respondem aos diferentes tipos de estímulos mecânicos, térmicos ou químicos, e os
nociceptores silenciosos são ativados por estímulos químicos, mediadores
inflamatórios, respondendo a estímulos mecânicos e térmicos somente depois de
serem ativados (FEIN, 2011).
33
As fibras nociceptivas possuem duas extremidades: a primeira detecta
sensações e se projeta para regiões periféricas onde inerva pequenas porções de
tecido; já a segunda estende-se até o interior do corno da medular espinhal dorsal.
Entre esses dois segmentos ficam os corpos celulares dos nociceptores, localizados
em uma estrutura fora da medula espinal. A lesão tecidual e liberação de
mediadores químicos locais como substância P (SP), histamina, bradicinina e
prostaglandinas (PG), desencadeiam um processo de transmissão do estímulo
doloroso até níveis centrais, como ilustrado na Figura 1 (BASBAUM; JULIUS, 2006).
Figura 1. Transmissão do estímulo doloroso (Adaptado de Oaklander, 2011).
Os nociceptores estão associados a fibras aferentes de pequeno diâmetro,
que podem ser do tipo mielinizadas (fibras tipo A) ou amielinizadas (fibras tipo C).
34
Essas podem ser classificadas de acordo com sua estrutura, diâmetro e velocidade
de condução em três tipos: fibras C, fibras Aβ e fibras Aδ (RANG et al., 2012). Em
função da presença da bainha de mielina, as fibras Aδ e Aβ, transmitem o estímulo
doloroso de maneira rápida. Entretanto, as fibras Aδ de diâmetro médio, transmitem
a dor rápida e bem localizada, ou sinais de dor aguda pulsátil, enquanto as fibras de
maior diâmetro Aβ respondem a estímulos mecânicos inócuos como um leve toque.
Já as fibras C de pequeno diâmetro são responsáveis pela transmissão lenta da dor
(queimação) (ROCHA et al., 2007; CUELLAR et al, 2010).
Na última década, muitas moléculas de transdução da nocicepção têm sido
identificadas e o maior grupo de detectores de estímulos nocivos é a família dos
receptores de potencial transitório (TRP) (CHENG; JI, 2008; PATAPOUTIAN; TATE;
WOOLF, 2009). O receptor de potencial transitório vaniloide 1 (TRPV1),
originalmente chamado de receptor vaniloide 1 e comumente referido como receptor
da capsaicina, foi o primeiro descrito como receptor polimodal ativado por três
estímulos dolorosos; compostos vaniloides (capsaicina, resiniferatoxina), calor
nocivo (> 43 °C) e pH baixo (< 5,9) (CATERINA; JULIUS, 2001, TOMINAGA, 2007).
Outros receptores que participam da transdução da nocicepção são os canais
iônicos sensíveis ao ácido (ASICs), que são canais de cátions insensíveis à
voltagem (PETROFF et al., 2008). Os ASICs são ativados por prótons extracelulares
e alguns estudos demonstraram que a sua expressão é aumentada por mediadores
pró-inflamatórios, como fator de crescimento do nervo (NGF), serotonina,
interleucina 1 (IL-1) e bradicinina (MAMET et al., 2002; VOILLEY et al., 2001).
Diversos são os mediadores inflamatórios que, quando liberados por
macrófagos, mastócitos, células endoteliais ou nervos traumatizados, ativam as
fibras nervosas tipos Aδ e C, facilitando a transmissão dolorosa e as alterações
inflamatórias periféricas (KRAYCHETE; CALASANS; VALENTE, 2006). Dentre os
mediadores inflamatórios (também denominados algogênicos) incluídos neste grupo
estão a acetilcolina, bradicinina, histamina, serotonina, leucotrieno (LT), fator de
ativação plaquetário (PAF), íons potássio, PGs, tromboxanos (TBx), interleucinas
(ILs), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), NGF e recentemente serino proteases
(VERGNOLLE, 2008).
Esses neurotransmissores ativam neurônios de segunda ordem e o sinal
nociceptivo ascende para regiões do sistema límbico para o tálamo, pelo feixe
35
espinotalâmico. No tálamo ocorre a somatização do estímulo nocivo onde existe o
componente emocional que discrimina a dor (Figura 2). O tálamo e o córtex são
regiões finais das projeções das vias de nocicepção, o tálamo informa que existe
sensação nociceptiva e o córtex discrimina o tipo de sensação (ROY et al., 2009).
Em resposta à estimulação nociceptiva ascendente, ocorre ativação de algumas vias
descendentes de controle da nocicepção, culminando na liberação de substâncias
como noradrenalina, serotonina e encefalinas na região do corno dorsal medular,
modulando assim o sinal nociceptivo (BASBAUM et al., 2009).
Figura 2. Processamento sensorial no corno dorsal da medula espinal (Adaptado de
Oaklander, 2011).
3. 2. Inflamação
A inflamação é uma resposta do tecido vivo e vascularizado às agressões de
diversas naturezas (física, química ou biológica) que induz a liberação de uma gama
36
de mediadores exógenos e endógenos. A inflamação deve conter e isolar à lesão,
destruir os microrganismos invasores e as toxinas inativas e preparar o tecido para o
reparo. Essas respostas de defesa do hospedeiro são controladas ou moduladas por
um grande número de mediadores químicos, extravasamento de líquidos, migração
celular, lesão tecidual e reparação (VANE; BOTTING, 1996; RANG et al., 2007). A
inflamação só acaba quando o agente agressor for eliminado e os mediadores
secretados inativados (MITCHELL et al., 2006).
Uma resposta tecidual inflamatória aguda é caracterizada pelos famosos
sinais cardinais: rubor, calor, edema e dor, descritos por Cornelius Celsus, um
médico romano do século I d.C. Esses sinais, de fato, justificam o termo
“inflamação”, derivado do verbo latino inflammare, o que significa incendiar. Já a
perda da função, quinto sinal clínico da inflamação, foi adicionada posteriormente
por Rudolph Virchow em 1858 (ALLER et al., 2007; SERHAN; SAVIL, 2005). A
Figura 3 ilustra os cinco sinais característicos da inflamação.
Figura 3. Ilustração dos cinco sinais da inflamação: calor, rubor, edema, dor e perda
de função (Adaptado de Dunder, 2009).
37
A inflamação pode ser dividida em duas fases: aguda e crônica. A primeira,
de duração relativamente curta, podendo durar minutos, horas ou mesmo alguns
dias. Sua principal característica é a presença de exsudato rico em proteínas
plasmáticas e a migração de leucócitos, principalmente os neutrófilos. Já a
inflamação crônica tem duração maior e está relacionada com alterações
histológicas, como a presença de linfócitos e macrófagos, proliferação de vasos
sanguíneos, fibrose e necrose tecidual (COLLINS, 2000; RANG et al., 2007).
Na
reação
inflamatória
aguda
predominam
os
eventos
vasculares/exsudativos, que são fenômenos inespecíficos, isto é, constituem a fase
inicial de qualquer tipo de resposta inflamatória. São mediados principalmente por
Óxido Nítrico (NO) e PGs, e caracterizam a vasodilatação que envolve
primariamente as arteríolas, levando à abertura de novos capilares e aumento do
fluxo sanguíneo para a região, justificando os primeiros sinais cardinais: calor e
rubor (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; VERGNOLLE, 2008). De forma
simultânea, mediadores químicos como histamina, bradicinina, fator de agregação
plaquetária (PAF) e LTs provocam aumento da permeabilidade das vênulas, que
permitem a passagem de um fluido rico em proteínas plasmáticas (exsudato) para o
espaço extravascular, provocando um aumento da pressão oncótica e retenção de
água no interstício, justificando o edema. O exsudato formado facilita a liberação de
outros mediadores que amplificam a resposta inflamatória (GILROY et al., 2004). A
dor, outro sinal característico da inflamação, pode decorrer de diversos fatores:
aumento da pressão sobre tecidos e terminações nervosas, lesão das fibras
nervosas,
irritação
por
substâncias
produzidas
por
células
lesadas
ou
microorganismos e, também, pela ação de alguns mediadores inflamatórios que
intensificam a dor associada à inflamação (BHANDARI et al., 2005; ROTH et al.,
2009).
A função dos eventos vasculares descritos acima é a eliminação de
substâncias tóxicas geradas no local, a fim de facilitar a chegada de células
inflamatórias, que atraídas pelos mediadores quimiotáticos, fagocitam (neutrófilos e
macrófagos) e/ou liberam substâncias citotóxicas, presentes em grânulos,
contribuindo para a destruição do agente lesivo (SCHOR; BOIM; SANTOS, 2003).
Alinhado aos eventos vasculares, diferentes tipos de células participam do
processo inflamatório, desempenhando funções distintas, mas muitas vezes
38
sobrepostas. Na fase celular ocorre a transmigração de leucócitos ao longo de um
gradiente químico, esse evento celular é denominado de quimiotaxia (MEDZHITOV,
2008). Essa transmigração ocorre através da marginação (movimentação do
neutrófilo do centro para a periferia do vaso), rolamento (desaceleração do neutrófilo
através da ligação com moléculas de adesão chamadas selectinas), adesão e
diapedese (o neutrófilo atravessa o endotélio através de junções entre as células)
(Figura 4) (MARSHALL et al., 2003).
Quando os leucócitos atingem o sítio da lesão, tornam-se ativados e tentam
eliminar o patógeno liberando o conteúdo tóxico de seus grânulos, espécies reativas
de oxigênio e nitrogênio (ROS), proteinases, catepsinas, elastases, mieloperoxidase,
dentre outros (MEDZHITOV, 2008).
Tanto substâncias endógenas como exógenas podem agir como agentes
quimiotáticos. Dentre as substâncias endógenas estão os componentes do sistema
complemento como o C5a; produtos da via da lipoxigenase (LOX), em especial o
LTB4; PAF; e as citocinas, principalmente as da família das quimiocinas. Ou seja,
inúmeros mediadores químicos que se originam de proteínas plasmáticas ou de
células (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
Figura 4. Etapas do recrutamento de leucócitos para o sitio da inflamação (Disponível em:
http://www.gluegrant.org/chemotaxis.htm)
O tipo celular predominante nesta fase pode variar em função do tempo e do
tipo de lesão: nas primeiras 24 horas após o estímulo, há a predominância de
células
polimorfonucleares
(neutrófilos,
eosinófilos
e
basófilos),
que
são
39
progressivamente substituídos pelos monócitos nas próximas 24-48 horas.
Entretanto, os linfócitos podem ser as primeiras células a chegar, nas infecções
virais, e, em alguns tipos de reações de hipersensibilidade, os eosinófilos são desde
o início o principal tipo celular. Células endoteliais, macrófagos, mastócitos e
plaquetas também podem estar envolvidas (LAMANO, 2008; SCHMID-SCHONBEIN,
2006).
Essas células quando ativadas iniciam um processo de sinalização de vias
intracelulares, culminando na síntese de mediadores que participam diretamente do
processo inflamatório. Os mediadores inflamatórios são substâncias formadas e
liberadas, concomitante ou sequencialmente, no local da lesão. Atuam nos vasos
sanguíneos e células inflamatórias modulando os principais eventos relacionados à
inflamação: vasodilatação, opsonização, quimiotaxia para células inflamatórias,
obstrução tecidual e dor, como também febre e mal estar (SIQUEIRA; DANTAS,
2000). Além disso, podem, inclusive, estimular a liberação de outros mediadores
(MEDZHITOV, 2010; ZHOU et al., 2007). Dentre os mediadores mais descritos da
inflamação aguda, encontram-se histamina, bradicinina, metabólitos do ácido
araquidônico (PGs, TBxs e LTs), PAF, óxido nítrico (NO), neuropeptídeos e citocinas
(PASSOS et al., 2007).
Em resposta a estímulos mecânicos, químicos, físicos ou por meio de outros
mediadores, como a bradicinina, os fosfolipídios de membranas liberam o ácido
araquidônico, através da ativação da enzima fosfolipase A2 (PLA2). O ácido
araquidônico livre pode ser metabolizado por duas classes principais de enzimas:
cicloxigenases (COXs), sendo a isoforma COX-2 envolvida na inflamação, iniciando
a biossíntese de PGs e TBxs (prostanoides) e pelas LOXs, originando a biossíntese
de LTs (BOTTING, 2006).
Dentre as COXs, a COX-1 é constitutivamente expressa, ou seja, está
presente nas células em condições fisiológicas, principalmente nos vasos
sanguíneos, plaquetas, estômago e rins, sendo uma das responsáveis por manter as
condições de homeostase no organismo. A COX-2, por outro lado, é geralmente
ausente na maioria dos tecidos normais, mas pode ser induzida por inúmeros
estímulos, IL-1, TNF-α e demais mediadores inflamatórios. É ainda responsável pela
produção de concentrações elevadas de prostanoides durante a inflamação.
Entretanto, existe uma terceira isoforma de COX, a COX-3, que se encontra
40
distribuída principalmente no córtex cerebral, medula espinal e coração. Alguns
estudos sugerem que a inibição da COX-3 poderia representar o mecanismo central
primário pelo qual os fármacos analgésicos e antipiréticos, como os antiinflamatórios não esteroidais (AINEs), desenvolveriam suas atividades de redução
da dor e da febre (CHANDRASEKHARAN; DAI; ROOS, 2002; HIKIJI et al., 2008).
Os prostanoides mais importantes na inflamação são: PGE 2, PGD2, PGF2α,
PGI2 (prostaciclina) e a Tromboxano A2 (TBxA2). As prostaglandinas PGE2, PGD2 e
PGF2α também são vasodilatadoras, além de exacerbarem o edema. Além disso, as
PGs também estão envolvidas na patogenia da dor e da febre durante a inflamação,
como a PGE2, que torna a pele hipersensível a estímulos dolorosos. A prostaciclina
possui ação vasodilatadora, além de potencializar os efeitos quimiotáticos e
aumentar a permeabilidade de outros mediadores (PECCHI et al., 2009).
Os LTs, por sua vez, são substâncias produzidas a partir do ácido
araquidônico, por ação da enzima 5-LOX, encontrada preferencialmente nos
pulmões, plaquetas, células endoteliais, monócitos, mastócitos, eosinófilos e
linfócitos B (MONTUSHI et al., 2007). Dentre os LTs, o LTB4 exerce potente
atividade quimiotática para neutrófilos, eosinófilos e monócitos, promovendo a
migração destes tipos celulares para o local afetado. Uma vez no sítio, os LTs
ativam os leucócitos, promovendo a degranulação e a produção de superóxidos, que
contribuem para os danos teciduais característicos da inflamação. Alguns LTs como
LC4, LD4 e LE4 aumentam a permeabilidade vascular (COUTINHO; MUZITANO;
COSTA, 2009; WIENECKE et al., 2008).
Outro mediador importante na vasodilatação é o NO, que é um gás solúvel
derivado do metabolismo da L-arginina por da ação da enzima óxido nítrico sintase
(NOS), que pode ser encontrada em três isoformas:, endotelial (eNOS) e neuronal
(nNOS), que são constitutivamente expressas, e a forma induzida (iNOS), que é
produzida em condições inflamatórias (VALLANCE; CHAN, 2001). O NO está
envolvido no relaxamento vascular, na inibição da agregação plaquetária e adesão
leucocitária, na neurotransmissão e nas atividades antimicrobiana e antitumoral dos
macrófagos (ZOCCALI, 2007).
A histamina, mediador armazenado e liberado por mastócitos e basófilos,
exerce ação sobre células musculares lisas e células endoteliais, provocando
vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular. É encontrado em vários
41
tecidos, destacando-se os pulmões, pele e trato gastrointestinal. Na pele, a
histamina acarreta uma resposta tripla, ocasionando vermelhidão, edema e dilatação
associada à vasodilatação indireta via estimulação por reflexos axonais. Já no trato
gastrointestinal a histamina é essencial para a secreção ácida (THURMOND;
GELFAND; DUNFORD, 2008).
A bradicinina, outro mediador importante no processo inflamatório, é um
peptídeo vasoativo que provoca vasodilatação e aumento da permeabilidade
vascular. Entretanto, exerce outros efeitos, como a indução da liberação de
mediadores inflamatórios como os prostanoides, a partir de diversos tipos celulares,
citocinas (IL-1 e TNF-α) de macrófagos, além do NO liberado das células endoteliais
vasculares (ELIIS; FOZARD, 2002). Trata-se, também, de um potente mediador
álgico, ação que é potencializada pelas PGs (LEEB-LUNDBERG et al., 2005).
As citocinas são liberadas por uma variedade de células envolvidas na
resposta inflamatória, incluindo macrófagos, neutrófilos e células endoteliais,
possuindo diferentes efeitos dependentes do tipo de citocina liberada e da célula
envolvida. De um modo geral, as citocinas influenciam a ativação, divisão, apoptose
e quimiotaxia celular (PECCHI et al., 2009; HANADA; YOSHIMURA, 2002). As
citocinas são classificadas em subgrupos, como: ILs, fatores de crescimento,
quimiocinas, interferons e fatores estimuladores de colônia, ou ainda, podem ser
classificadas conforme sua atividade biológica como, por exemplo: pró-inflamatórias
(IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-1Ra, IL-4 e IL-10) (WONG; FISH,
2003).
Alguns exemplos importantes de citocinas incluem a IL-8, que atua como fator
quimiotático em atrair o neutrófilo e outras células para a o local da inflamação.
Estão também envolvidas nesse processo, as quimiocinas, que são fundamentais
para os leucócitos, pois atuam em seu crescimento, diferenciação e ativação,
imprescindíveis para que ocorra quimiotaxia (TOWNSEND; MCKENZIE, 2000).
Outro fator bastante importante é o TNF-α, que inibe a apoptose do neutrófilo,
elevando sua sobrevida no sítio de ação. Adicionalmente, citocinas pró-inflamatórias,
como TNF-α e IL-1β, são importantes no processo da dor por aumentarem a
excitabilidade neuronal e a força sináptica (STELLWAGEN; MALENKA, 2006).
Considerando a complexa relação existente entre a lesão e o aparecimento
da dor, não é surpreendente que o controle farmacológico efetivo ainda seja um
42
desafio para a comunidade médico-científica, uma vez que esta síndrome mostra-se
resistente a uma série de fármacos com propriedades analgésicas marcadas em
quadros de dor aguda (ATTAL et al., 2010).
Diversas pesquisas vêm sendo realizadas ao longo dos últimos anos para o
estudo dos mecanismos e dos mediadores envolvidos na inflamação e dor
(NAPIMOGA et al., 2007; TRACEY; MANTYH, 2007; BITENCOURT et al., 2008;
BASBAUM et al., 2009; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2013; BRITO et al., 2012;
ALENCAR et al., 2010; GRIS et al., 2010; HUA; CABOT, 2010; MEDZHITOV, 2010;
MELO et al., 2010; ALMEIDA et al., 2013).
Embora existam diversos produtos, de origem natural ou sintética, utilizados
para o tratamento desses processos, até o momento, não foi identificado ainda o
anti-inflamatório ou analgésico ideal, devido à limitação de sua eficácia ou até
mesmo pela amplitude dos seus efeitos adversos (GRIS et al., 2010). Assim,
diversos modelos in vivo têm sido utilizados na pesquisa de compostos com
atividade anti-inflamatória/antinociceptiva (VERGNOLLE, 2008). Dessa forma, a
pesquisa de substâncias que possam intervir na complexidade das injúrias citadas, é
de grande valor, uma vez que essas são oriundas de produtos naturais que são de
fácil acesso e baixo custo.
3.3. Produtos naturais
Ao longo dos anos, o homem buscou na natureza meios para atender suas
necessidades básicas, muitos dos quais serviram de remédio para o tratamento de
várias doenças. Os primeiros registros documentam o uso de aproximadamente
1000 preparações derivadas de plantas na Mesopotâmia. No Egito, o Papiro de
Ebers, datado de 1500 a.C., documenta mais de 700 medicamentos, a maioria
oriunda de plantas. Existem evidências que praticamente todos os povos utilizavam
preparados à base de plantas para assegurar sua sobrevivência (LORENZI;
MATOS, 2002; NEWMAN; CRAGG; KINGSTON, 2008).
Durante a Idade Média, a propriedade terapêutica das plantas era atribuída à
existência de substâncias presentes nelas. Com o desenvolvimento e o avanço da
química orgânica, houve a possibilidade de isolamento e purificação, a partir de
extratos brutos, da(s) substância(s) responsável (eis) pelo(s) efeito(s) biológico(s)
43
predominante(s). Esse grupo de substâncias, derivado do metabolismo secundário,
denominou-se “princípios ativos” (LORENZI; MATOS, 2002; NORTON, 2005;
ITOKAWA et al., 2008). Dessa forma, os estudos dessas substâncias auxiliam
principalmente na compreensão da fisiologia das plantas, da quimiotaxonomia e na
investigação de protótipos para novos fármacos (GABIUS et al., 2002)
Por ser ainda o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos
étnicos, as plantas medicinais são encontradas em feiras livres, mercados populares
e em quintais residenciais nas regiões mais pobres do país e até mesmo nas
grandes cidades brasileiras (MACIEL et al., 2002). Muitas destas plantas são usadas
baseadas apenas no conhecimento popular e repassado de uma geração para outra
(CUNHA et al., 2003). Esse conhecimento popular deu origem aos fitoterápicos, que
foi posteriormente definido pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e em
documento publicado recentemente pela ANVISA como sendo medicamentos
obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia e
segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de
utilização,
documentações
técnico-científicas
ou
evidências
clínicas.
São
caracterizados pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como
pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade (CALIXTO, 2003; BRASIL,
2010). Assim, a OMS estipula que devido à pobreza e a falta de acesso a
medicamentos industrializados, cerca de 80% da população mundial dependem da
atividade terapêutica das plantas no que se refere à atenção primária à saúde, e
85% dessa parcela utiliza plantas ou preparações à base de vegetais. Ressalte-se
ainda que 67% das espécies vegetais medicinais do mundo são originadas dos
países em desenvolvimento (BRASIL, 2006).
Os medicamentos apresentam, em sua quase totalidade, um único princípio
ativo que é responsável pelo seu efeito farmacológico, já os extratos vegetais são
constituídos por misturas multicomponentes de substâncias ativas, parcialmente
ativas e inativas, que, muitas vezes, atuam em alvos farmacológicos diferentes
(FERREIRA; PINTO, 2010; ULRICH-MERZENICH et al., 2010). Os extratos vegetais
servem ainda como ponto de partida para a obtenção de compostos sintéticos ou
biossintéticos. Existem aqueles que exibem uma atividade biológica maior ou
diferente de seus componentes isolados (VILLAS-BÔAS; GADELHA, 2007).
44
É importante mencionar que
a disponibilidade de princípios ativos
quimicamente puros, aliada aos avanços obtidos na fisiologia experimental no século
XIX, possibilitou a descoberta e investigação de várias substâncias que ainda hoje
são utilizadas na prática clínica, bem como a descrição de seus mecanismos de
ação. Por exemplo, a atropina, princípio ativo isolado da planta Atropa belladona,
que contribuiu para a fundamentação da neurotransmissão colinérgica e para a
teoria dos receptores farmacológicos; a reserpina, princípio ativo extraído da planta
Rauwolfia serpentina, que propiciou o embasamento da neurotransmissão
adrenérgica, serotoninérgica e dopaminérgica. Outros princípios ativos que seguem
a linha da atropina e reserpina são: o curare (isolado de Chondodendron
tomentosum), nicotina (espécies de Nicotiana), ergotamina (espécies do Ergot),
cocaína (espécies de Erythroxylum), morfina (Papaver somniferum), glicosídeos
cardíacos (espécies de Digitalis), efedrina (Ephedra sinica); além de uma
diversidade de outros princípios ativos isolados de plantas (FARNSWORTH, 1966;
GILANI; RAHMAN, 2005; NEWMAN; CRAGG; KINGSTON, 2008).
O Brasil, detentor da maior floresta tropical equatorial e tropical úmida do
planeta, constituído de uma grandeza de seu litoral e de sua flora, não pode abdicar
de sua vocação para os produtos naturais (PINTO et al., 2002).
3.3.1 Considerações sobre a família Selaginellaceae e o gênero Selaginella
A família Selaginellaceae Willk é uma família distinta, incluindo um único
gênero, Selaginella. São conhecidas cerca de 750 espécies (TRYON; TRYON, 1984;
JUDD et al., 1999), mas com distribuição mundial. Espécies do gênero estão
amplamente distribuídas nas Américas, África e Europa, a leste até o estreito de
Bering, Kamchatka e Japão na Ásia, Nova Guiné e Austrália na Oceania. Ocorrem
também no leste do Pacífico até as ilhas do Havaí, Marquesas, Tahiti e Rapa. Nas
Américas, os limites de distribuição são, ao norte, o Alasca, a leste a Groenlândia e
ao sul Mendonza e Buenos Aires na Argentina, e também na Ilha Cocos da Costa
Rica. Certamente estão mais bem representadas na bacia Amazônica com 31
espécies (TRYON; TRYON, 1984).
No Brasil, poucos trabalhos envolvem a família Selaginellaceae. O primeiro
deles foi realizado por Spring (1840) e está incluído na “Flora Brasiliensis”. As 23
45
espécies descritas pelo autor são tratadas em duas seções, sendo Homoeophyllae
com folhas monomorfas dispostas em várias fileiras, com uma única espécie
Selaginella rupestris (L.) Spring e Heterophyllae com folhas dimorfas dispostas em
quatro fileiras, compreendendo as demais espécies (HIRAI; PRADO, 2000).
Os membros da família Selaginellaceae são principalmente terrestres, plantas
herbáceas e perenes e variam muito em tamanho. Algumas pequenas espécies têm
hastes de aproximadamente 3 cm de comprimento, enquanto as espécies maiores
têm hastes de 50 cm a cerca de 1 m de comprimento, mas com menos de 2 cm de
altura (TRYON; TRYON, 1984; JUDD et al., 1999).
Estas plantas geralmente crescem em ambientes mesófilos de florestas
sombreadas, são terrestres, mas também podem ser encontradas sobre rochas
úmidas, próximas de rios ou cachoeiras, ou sobre penhascos úmidos e sombreados.
Algumas espécies crescem em turfeiras no ártico alpino, rochas de desertos ou
arbustos de ambientes xerófilos; outras crescem ainda em matas de bosques secos,
locais pantanosos ou florestas secundárias (TRYON; TRYON 1984).
Segundo Anthony & Thomas (2011) várias espécies do gênero Selaginella
são utilizadas como alimento (vegetais crus), plantas ornamentais e materiais para
artesanato. Entretanto, a utilização de Selaginella como planta medicinal é muito
limitada em comparação com o número de espécies e os benefícios potenciais da
medicina, por isso exige mais pesquisas etnobotânicas e fitoquímicas.
Os metabólitos secundários de Selaginella podem variar a depender de
fatores climáticos, localização e solo, bem como a colheita e procedimento de
extração (NAHRSTEDT; BUTTERWECK, 1997). Estudos anteriores envolvendo
algumas espécies de Selaginella revelou que este gênero é uma rica fonte de
esteroides, biflavonoides, alcaloides, secolignanas, neo-lignanas e derivados cafeoil.
Outros compostos, tais como alcaloides glicosídeos, fenilpropanonas e lignanas,
também foram relatados em algumas espécies do gênero (SÁ et al., 2012b).
Diferentes atividades de preparações obtidas de Selaginella spp. têm sido
relatadas: anti- inflamatória (HAN et al., 1972), antiespasmódica (ITOKAWA et al,
1983), atividade antimutagênica (MENG et al., 1990), atividade citotóxica, imunoestimulante e agente inibidor da RNA transcriptase reversa (ONO et al., 1989; LIN et
al., 1994), potente atividade antiviral (MA et al., 2001), atividade anti-hemorrágica
(WINTER; JANSEN, 2003); atividade antioxidade (SAH et al., 2005). Ainda em 2005,
46
Dai e colaboradores observaram a diminuição da expressão de histamina após
indução alérgica em animais tratados com S. tamariscina. E, mais recentemente, um
estudo publicado por nosso grupo, demonstrou efeito antinociceptivo do extrato
etanólico bruto (EEB) de Selaginella convoluta (SÁ et al., 2012a) em camundongos.
Várias espécies de Selaginella são utilizadas de forma tradicional em vários
países para o tratamento de uma variedade de doenças como o câncer, problemas
cardiovasculares (LIN et al., 1994), diabetes (DARIAS et al., 1989), gastrite (HAN;
LEE; LEE,1984), hepatite (LIN; KAN, 1990) , doenças da pele (MACFOY; SAMA,
1983) e infecções do trato urinário (WINKELMAN, 1986).
No entanto, apenas alguns estudos sobre os componentes bioativos de
espécies deste gênero foram realizados. Setyawan (2011), em trabalho recente,
estudou a diversidade de compostos de Selaginella, especialmente biflavonoides e
compostos de trealose.
3.3.2 Considerações sobre a espécie Selaginella convoluta
Selaginella convoluta (Arn.) Spring é popularmente conhecida na região do
Vale do São Francisco como "jericó", e em outras localidades do Nordeste brasileiro
como “mão-fechada” ou “mão-de-papagaio” (SÁ et al., 2012b). Citada em alguns
trabalhos ao longo das décadas (RAWITSCHER et al., 1952; BARROS; SILVA;
SILVA, 1989; AMBRÓSIO; DE MELO, 2001) S. convoluta é sempre destacada como
uma das plantas mais bem adaptadas ao clima semiárido da região da Caatinga,
especialmente pela sua capacidade evidente de padrão sazonal poiquilohídrico,
sendo facilmente reconhecida pelo seu hábito em roseta, enrolando suas folhas no
período seco e assim protegendo-se da dessecação (Figura 5A) e nos primeiros
sinais de chuva reaparece verde entre as demais plantas da Caatinga (Figura 5B).
Dessa forma, se torna a pteridófita mais representativa do cenário nordestino
(XAVIER, 2007).
47
A
B
Figura 5. Comportamento de Selaginella convoluta (Arn) Spring Selaginellaceae em
período seco (A) e chuvoso (B).
Porembski (2007) descreveu que, ao contrário de outras espécies da família
Selaginellaceae, S. convoluta é, geralmente, rupícola, crescendo sobre uma fina
camada de solo nas encostas de morros e paredões rochosos, formando “tapetes”
(Figura 6).
Figura 6. Tapete formado por S. convoluta durante os primeiros dias de chuva.
(Disponível
em:
http://fatosefotosdacaatinga.blogspot.com.br/2011/11/o-verde-do-
jerico-na-caatinga-seca.html).
Um estudo realizado por Agra e colaboradores (2007a, 2007b) sobre
informações etnomedicinais de plantas do Cariri Paraibano revelou que S. convoluta
48
é utilizada na forma de chá através do decocto ou macerado da planta inteira como
afrodisíaco, distúrbios da amenorreia e também como diurético, três vezes ao dia. Já
Roque e colaboradores (2010) afirmam que, na comunidade de Laginha, no
município de Caicó, no Rio Grande do Norte é feito o chá das folhas por infusão para
tratamento de icterícia.
A fim de contribuir com a descoberta de fármacos, a busca contínua do nosso
grupo com plantas da Caatinga já rendeu bons resultados, como a comprovação dos
efeitos
antinociceptivos
do
extrato
etanólico
de
Amburana
cearensis
em
camundongos (OLIVEIRA et al., 2009), atividade antinociceptiva de Neoglaziovia
variegata (LIMA-SARAIVA et al., 2012b), atividade antiulcerogênica do extrato
etanólico de Encholirium spectabile em roedores (CARVALHO et al., 2010),
atividade antinociceptiva do extrato etanólico de S. convoluta (SÁ et al., 2012a) e
mais recentemente, atividade antinociceptiva e anti-inflamatória de Annona
vepretorum (SILVA, 2013).
.
2. PARTE
EXPERIMENTAL
50
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1.
Material vegetal
4.1.1. Coleta e obtenção das frações hexânica e clorofórmica de S. convoluta
O material vegetal foi coletado e identificado pelo Engenheiro Florestal Dr.
Visêldo Ribeiro de Oliveira em março de 2012 (período seco) no Campo
Experimental da Embrapa Semiárido, município de Petrolina (09º 03’ 54.2” S, 40º 19’
11.7” W), Estado de Pernambuco, Brasil. Uma exsicata da espécie foi codificada sob
o número #19203 (Figura 7) e depositada no Herbário Vale do São Francisco
(HVASF) no Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD)
na UNIVASF.
Figura 7. Exsicata de S. convoluta coletada em Petrolina-PE. Foto: Larissa A. R de
Oliveira Macêdo.
51
Após coleta e identificação, o material vegetal foi lavado e separado de outras
espécies. Em seguida, foi dessecado em estufa com circulação e renovação de ar à
temperatura média de 40 °C durante três dias. Após a secagem, o material vegetal
foi pulverizado (Figura 8).
Figura 8. Material vegetal seco e pulverizado. Foto: Larissa A. R de Oliveira
Macêdo.
O material vegetal seco e pulverizado (1935 g) foi submetido à maceração
exaustiva com etanol 95% em um recipiente de aço inoxidável. Foram feitas várias
extrações num intervalo de 72 horas entre cada extração até esgotamento da droga.
A solução extrativa obtida passou por um processo de destilação do solvente em
evaporador rotativo à pressão reduzida a uma temperatura não superior a 50 °C
(Figura 9A).
Após este processo de evaporação do solvente, obteve-se o Extrato Etanólico
Bruto (EEB- Figura 9B). E a partir desse, foi feita uma partição líquido-líquido (Figura
9C) com solventes em gradientes de polaridade crescente (hexano e clorofórmio)
para obtenção das respectivas fases Sc-Hex (21,2591g) e Sc-CHCl3 (15,142g), as
quais
foram
utilizadas
para
estudo
das
atividades farmacológicas.
Estes
procedimentos de preparação e obtenção das frações foram realizados no Núcleo
de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME).
52
A
B
C
Figura 9. Processo de obtenção das frações de S. convoluta: A) destilação do
solvente em evaporador rotativo à pressão reduzida, B) Extrato etanólico bruto e C)
Partição líquido-líquido. Fotos: Larissa A. R de Oliveira Macêdo.
4.2. Triagem fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de Sc-Hex e Sc-CHCl3
A triagem fitoquímica procura rastrear os principais grupos de constituintes
químicos que compõem um extrato vegetal. É um exame rápido e superficial através
de reagentes de coloração ou precipitação que irão revelar ou não a presença de
metabólitos secundários em um extrato. A triagem fitoquímica preliminar, com vistas
ao estabelecimento da possível natureza química dos compostos existentes foi
realizada com as fases obtidas através do particionamento do EEB. As frações
foram avaliadas em placas cromatográficas de sílica gel com suporte de alumínio,
aplicados com micropipeta e eluídos em diferentes sistemas de solventes segundo
metodologia descrita por Wagner & Bladt (1996).
Os testes foram realizados de acordo com as classes de metabólitos
secundários compreendidas pelo gênero (alcaloides, antocianinas, cumarinas,
derivados antracênicos, flavonoides, lignanas, mono/diterpenos, naftoquininas,
saponinas e triterpenos/esteroides).
4.3. Animais
Foram usados camundongos Swiss, machos (25-35 g), provenientes do
Biotério Setorial da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF). Os
animais foram mantidos em grupos de seis, em gaiolas de polipropileno, à
53
temperatura ambiente controlada (22 ± 2 ºC) com comida e água ad libitum,
acondicionadas em estantes isoladoras. Os animais foram transferidos e
aclimatizados 48 horas antes do início dos experimentos para o laboratório
experimental de Fisiologia da mesma Universidade. Durante este período, os
animais foram manipulados apenas para limpeza das caixas. Quando necessário, os
animais foram privados de alimento 12 horas antes dos experimentos.
Todos os experimentos foram realizados às 6 h da manhã. Os protocolos
experimentais e procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de
Animais (CEUA) da UNIVASF sob o protocolo de n° 0003/17072012. Os
experimentos foram conduzidos de acordo com as normas internacionais para
estudo com animais de laboratório (ZIMMERMANN, 1983).
4.4 Testes de atividade antinociceptiva
4.4.1 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético
O protocolo experimental utilizado nesse ensaio foi semelhante ao proposto
originalmente por Collier e colaboradores (1968), com pequenas modificações.
Nesse método, a nocicepção foi induzida por ácido acético 0,9% via intraperitoneal
(i.p) em um volume de 0,1 mL/10 g. A resposta do animal ao estímulo é
representada por uma sequência de contrações da musculatura abdominal
juntamente com a extensão dos membros inferiores (Figura 10).
Os animais (n = 6 por grupo) foram tratados com as frações Sc-Hex ou ScCHCl3 (100, 200 e 400 mg/kg), ou com veículo (salina + tween 80) administrados
via i.p 30 minutos antes do estímulo álgico.
Indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) foram usadas como drogas
padrões, sendo administradas por via i.p 30 minutos antes do agente indutor da dor.
Cinco minutos após a administração do agente álgico foi registrado o número de
contorções abdominais produzidas pelo animal durante 10 min.
54
Figura 10. Contorção abdominal induzida por ácido acético. Fotos: Larissa A. R. de
Oliveira Macêdo.
4.4.2 Teste de nocicepção induzida por formalina
O protocolo experimental utilizado nesse ensaio foi semelhante ao proposto
originalmente por Hunskaar & Hole (1987). Para isso, os camundongos receberam
uma injeção subplantar (s.p) de 20 µL de formalina - formaldeído diluído em solução
salina (2,5%) na face dorsal da pata direita traseira. Esse ensaio é considerado um
modelo de dor persistente e caracterizado por duas fases distintas: uma fase
neurogênica (1ª fase) e outra inflamatória (2ª fase).
Os animais (n = 6 por grupo) foram tratados com as frações Sc-Hex ou ScCHCl3 (100, 200 e 400 mg/kg), ou com veículo (salina + tween 80) administrados via
i.p 1 hora antes do estímulo álgico. Ácido acetilsalicílico (150 mg/kg) e morfina (10
mg/kg) foram usados como drogas padrões, sendo administradas por via i.p 30
minutos antes do agente indutor da dor.
55
Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho
montado em três lados para permitir a visão das patas, e o tempo (em segundos)
gasto lambendo e mordendo a pata injetada foi medido como um indicador de dor
(Figura 11). Esta resposta foi mensurada durante 5 minutos (primeira fase, dor
neurogênica) e entre 15 - 30 minutos após a injeção da formalina (segunda fase, dor
inflamatória) (ALMEIDA et al., 2011).
Figura 11. Teste de nocicepção induzida por formalina. Fotos: Larissa A. R. de
Oliveira Macêdo.
4.4.3 Teste da placa quente
A atividade antinociceptiva central das frações foi avaliada utilizando o modelo
da placa quente, descrito por Kuraishi e colaboradores (1983). Os animais (n = 6 por
grupo) foram pré-selecionados no aparelho de placa quente (Insight®, Brasil), na
56
temperatura de 55 ± 0,5 °C. Animais que apresentaram um tempo de reação
(definido como latência para levantar ou lamber as patas) maior que vinte segundos
foram excluídos para proteger o tecido da pata e também por indicar completa
analgesia. Os animais selecionados foram pré-tratados com Sc-Hex ou Sc-CHCl3
(100, 200 e 400 mg/kg, i.p), veículo (salina + tween 80) ou morfina (10 mg/kg, i.p).
Cada animal foi colocado sobre a placa quente mantida a 55 ºC (Figura 12) e
a latência foi medida nos tempos de 30, 60, 90 e 120 min após a administração das
frações, veículo ou morfina (ALMEIDA et al., 2011).
Figura 12. Teste da placa quente. Fotos: Larissa A. R. de Oliveira Macêdo.
4.5 Testes de atividade anti-inflamatória
4.5.1. Modelo de pleurisia induzida por carragenina
O protocolo experimental utilizado foi semelhante ao proposto originalmente
por Moore (2003), com pequenas modificações. Os animais (n = 6 em cada grupo)
foram pré-tratados por via intraperitoneal (ip) com Sc-Hex ou Sc-CHCl3 (100, 200 e
400 mg/kg) 30 minutos antes da indução da pleurisia. A inflamação foi induzida pela
injeção intrapleural (i.t) de 100 µL de uma solução de carragenina a 1%. Uma agulha
especialmente adaptada de 13x5 mm foi introduzida no lado direito da cavidade
57
torácica dos camundongos para injetar a solução de carragenina (Figura 12) e um
volume igual de solução salina estéril, foi injetado nos controles. Às 4 h após o
estímulo, os animais foram sacrificados numa câmara de gás de CO 2 e a cavidade
torácica foi aberta e lavada com 1 mL de PBS contendo EDTA (10 mM). As amostras
da lavagem pleural foram diluídas em fluido Turk (ácido acético a 2%) para a
contagem total de leucócitos, utilizando câmara de Neubauer. Indometacina (10
mg/kg) foi utilizada como droga de referência.
Figura 13. Modelo de pleurisia induzida por carragenina. Fotos: Fotos: Larissa A. R.
de Oliveira Macêdo.
4.5.1.2 Quantificação de proteínas totais
Os fluidos recuperados a partir da cavidade pleural dos animais tratados com
Sc-Hex e Sc-CHCl3 (100, 200 e 400 mg/kg) foram centrifugados durante 10 min a
1500 x g, e o teor total de proteína foi quantificado no sobrenadante, em 640 nm,
utilizando a técnica de Folin-Lowry (STAUFFER, 1975).
58
4.5.2. Edema de pata induzido por carragenina
A atividade anti-inflamatória das frações foi avaliada através do modelo de
edema de pata induzido por carragenina 1% (Figura 14), administrada no volume de
0,1 mL na região subplantar (s.p) da pata de cada animal (n = 6 por grupo)
(WINTER; RISLEY; NUSS, 1962). A inflamação foi mensurada medindo o volume da
pata imergindo-a até a altura do tornozelo, utilizando o aparelho pletismômetro
(PanLab, Itália) 4 horas após a indução do edema. Os extratos de Sc-Hex e ScCHCl3 (200 e 400 mg/kg), dexametasona (DEXA 1 mg/kg) e o controle (solução
salina) foram administrados via i.p 30 minutos antes do estímulo. Os resultados
foram expressos através da porcentagem de inibição do edema, sendo determinada
pra cada grupo experimental.
Figura 14. Edema de pata induzido por carragenina. Fotos: Larissa A. R. de Oliveira
Macêdo.
59
4.6 Avaliação da coordenação motora (teste do rota-rod)
O protocolo experimental foi semelhante ao proposto originalmente por
Dunham & Miya (1957), com algumas modificações. O aparelho do rota-rod
(Insight®, Brasil) é constituído de uma barra, subdividida em quatro compartimentos.
Esse teste permite avaliar se os tratamentos promovem incoordenação motora nos
animais por sedação e/ou relaxamento muscular (LAPA et al., 2003).
Os animais (n = 6 por grupo) foram pré-selecionados antes do teste (24
horas) e foram escolhidos aqueles que permaneceram na barra por 60 segundos em
pelo menos uma de três tentativas (Figura 10) (ALMEIDA et al., 2006). Grupos de 6
animais receberam veículo (salina), diazepam (2,5 mg/Kg) e as frações Sc-Hex e ScCHCl3 nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg em relação ao peso corporal dos animais.
Os extratos foram administrados por via i.p assim como a droga de referência 30
minutos antes da observação. Após a administração, os animais foram colocados
individualmente na barra giratória (sentido contrário ao movimento da barra) e foi
registrado o tempo de permanência do animal na barra (SANTOS-JUNIOR et al.,
2005). Os animais foram observados em diferentes intervalos de tempo (30, 60 e
120 minutos) após a administração.
Figura 15. Avaliação da coordenação motora no teste do rota-rod. Fotos: Larissa A.
R. de Oliveira Macêdo.
60
4.7. Toxicidade aguda
Na investigação da toxicidade aguda, os camundongos foram divididos em três
grupos de 6 machos e 6 fêmeas (n = 12). O grupo controle recebeu veículo (salina +
tween 80). Os demais receberam o pré-tratamento em dose única de 400 mg/kg e
2000 mg/kg por via intraperitoneal de ambas as frações, SC-Hex e Sc-CHCl3. Em
seguida, os animais foram observados durante 14 dias para avaliar a presença de
morte e sinais de toxicidade. Outros parâmetros tais como: peso corporal, consumo
de alimento e água foram avaliados diariamente, durante todo o estudo.
Figura 16. Avaliação diária do peso corporal, consumo de alimento e água no teste
de toxicidade aguda. Fotos: Larissa A. R. de Oliveira Macêdo.
4.7.1. Triagem farmacológica comportamental
A triagem comportamental (Anexo B) dos camundongos foi realizada
seguindo o protocolo descrito por Almeida et al. (1999). Foram analisados alguns
parâmetros específicos, como, piloereção, ptose palpebral, contorções abdominais,
convulsões, catatonia, tremores, paralisia das patas dianteiras, sedação, ambulação
aumentada, resposta ao toque diminuída, movimentação intensa das vibrissas,
agressividade, estereotipia e analgesia, após a administração em dose única de 400
61
mg/kg e 2000 mg/kg por via via intraperitoneal de ambas as frações. O grupo
controle recebeu veículo (salina + tween 80). No primeiro dia, tais parâmetros foram
avaliados nos tempos de 30, 60, 120, 180 e 240 minutos após o pré-tratamento. A
avaliação comportamental foi feita diariamente até o último dia da toxicidade aguda.
4.7.2. Análise de parâmetros hematológicos e bioquímicos
Para a avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos do sangue, foi
utilizada a metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2007) e Araújo et al. (2008)
com modificações. O sangue foi retirado através do plexo braquial para análise
laboratorial dos parâmetros hematológicos: contagem de eritrócitos (106/mm3),
hemoglobina (g/dL), hematócrito (%), volume corpuscular médio (VCM, μ 3),
hemoglobina
corpuscular
média
(HCM,
g),
concentração
de
hemoglobina
corpuscular média (CHCM, %), leucócitos (103/mm3), linfócitos (%), monócitos (%) e
plaquetas (103/mm3). Os parâmetros bioquímicos analisados em amostras de soro
foram glicose (mg/dL), colesterol (mg/dL), triglicérides (mg/dL), AST/TGO (U/L),
ALT/TGP (U/L) e creatinina (mg/dL). Para a determinação dos parâmetros
hematológicos foi utilizado analisador de hematologia (Horiba, ABXPentra 60), já
para os parâmetros bioquímicos foi utilizado um analisador semiautomático Bioplus
(BIO-200).
4.7.3 Análise histopatológica dos órgãos
Após a coleta do sangue, com os animais ainda em anestesia profunda, foram
feitas análises macroscópicas (forma, tamanho, coloração e consistência) dos
seguintes órgãos: pulmão, coração, rim, baço, fígado, pâncreas e estômago e
comparados aos órgãos do grupo controle. Logo após, foram lavados em solução
fisiológica e mergulhados em solução de formol a 10%, (tampão fosfato, 0,1 M, pH
7,2) por 18 horas. Decorrido esse tempo, os fragmentos foram lavados em água
corrente e em seguida imersos em álcool a 70% e transportados para o Laboratório
de Imunologia da UNIVASF. Posteriormente, os órgãos foram desidratados em
ordem crescente de álcool (80, 90, 95 e 100%,) seguida de diafanização em xilol,
62
impregnação e inclusão em parafina para a formação dos blocos histológicos. Cada
bloco foi submetido à microtomia e as secções tissulares de 5 µm de espessura
foram estiradas em banho histológico e em seguida montadas em lâminas de vidro.
Foram analisadas as alterações histopatológicas somente nos fígados e rins dos
camundongos sob tratamento agudo com as frações. Assim, as lâminas foram coradas
com Hematoxilina e Eosina (H.E) e examinados em microscópico óptico (Olympus®,
Modelo BX41, Japão).
4.8. Ensaio de viabilidade celular por MTT
Para verificar o efeito das frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 sobre a viabilidade
celular, foi utilizado o ensaio de viabilidade in vitro por MTT (brometo de 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) utilizando macrófagos peritoneais (MOSMANN,
1983).
Macrófagos
peritoneais foram
coletados
com
PBS/EDTA
10
mM,
centrifugados em centrifuga refrigerada (Herolab®, Modelo Unicer MR, Alemanha) e
ressuspensos em 1 mL de meio RPMI/SFB 10%. Em seguida, as células viáveis
(verificadas utilizando-se o método de exclusão por azul de Tripan, que cora em azul
as células não viáveis) foram plaqueadas na densidade de 2,5 x 105 células/poço,
em placas de 96 poços e incubadas em estufa de dióxido de carbono (CO2) por 37
°C por 2 horas para adesão dos macrófagos. As frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 foram
incubadas em diversas concentrações (1, 100, 250 e 500 µg/mL) por 24 h. Como
grupos controles, foram utilizados apenas células e meio de cultura ou células
tratadas com Tween (0,2%). Decorridas as 24, horas as células foram incubadas
com MTT por 4 horas. Após a incubação, os poços foram lavados e adicionou-se
150 µl de DMSO (Dimetilsulfóxido) por 15 minutos, e foi realizada a leitura em
espectrofotômetro (Thermo Plate, Modelo RS 232) no comprimento de onda de 540
nm.
4.9. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m),
conforme indicado nas legendas das tabelas e figuras e as diferenças estatísticas
entre os grupos experimentais e controle foram verificadas por Análise de Variância
63
(ANOVA) seguida pelo teste de Dunnet ou teste t, conforme exigência do protocolo
experimental. Os valores foram considerados significativos quando *p < 0,05. As
análises foram realizadas no tutorial GraphPad Prism® versão 5.0.
3. RESULTADOS
65
5. RESULTADOS
5.1. Triagem fitoquímica
A análise fitoquímica preliminar (Tabela 1) demonstrou reação positiva para a
presença
de
derivados
antracênicos,
flavonoides,
naftoquinonas
e
triterpenos/esteroides.
Tabela 1. Constituintes químicos identificados nas fases de Selaginella convoluta
através de cromatografia em camada delgada.
Constituintes químicos
Sc-Hex
Sc-CHCl3
Alcaloides
-
-
Antocianinas
-
-
Cumarinas
-
-
Derivados antracênicos
+
+
Flavonoides
++
++
Lignanas
-
-
Mono/Diterpenos
-
-
Naftoquinonas
+
+
Saponinas
-
-
Triterpenos/Esteroides
++
+++
(-): ausência do constituinte, (+) leve presença do constituinte, (++): moderada
presença do constituinte, (+++): intensa presença do constituinte.
5.2 Resultados da atividade farmacológica das frações obtidas de S. convoluta
5.2.1 Atividade antinociceptiva das frações obtidas de S. convoluta
5.2.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
66
No modelo de nocicepção induzida por ácido acético, ambas as frações
estudadas de S. convoluta (Sc-Hex e Sc-CHCl3), administradas nas doses de 100,
200 e 400 mg/kg, via i.p induziram redução significativa no número de contorções
abdominais (* p < 0,05). O grupo controle de Sc-Hex, tratado apenas com o veículo,
apresentou 25,67 ± 3,31 contorções abdominais e 20,33 ± 3,42 para Sc-CHCl3,
enquanto os grupos tratados apresentaram 9,00 ± 1,46 (64,94%); 5,66 ± 1,99
(77,95%) e 0,16 ± 0,16 (99,38%) para 100, 200 e 400 mg/kg de Sc-Hex com as
respectivas porcentagens de inibição. Aqueles tratados com Sc-CHCL3 nas mesmas
doses reduziram em 2,00 ± 1,12 (90,16%); 2,00 ± 0,51 (90,16%) e 0,83 ± 0,40
(95,92%) o número de contorções abdominais.
A indometacina (INDO), reduziu o número de contorções com porcentagem
de inibição de 90,92% para Sc-Hex e 88,54% para Sc-CHCl3, enquanto os animais
tratados com morfina (MOR) houve redução de 100% quando comparado ao
No de contorções abdominais
controle. Estes resultados são mostrados nas Figuras 17 e 18.
40
30
20
10
*
*
*
*
0
Controle 100
200
400
*
INDO
MOR
Sc-Hex (mg/kg)
Figura 17 - Efeito antinociceptivo da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100,
200 e 400 mg/kg), indometacina (INDO, 20 mg/kg) e morfina (MOR, 10 mg/kg), no
teste de contorções abdominais em camundongos. Valores são expressos em média
± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo
controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
No de contorções abdominais
67
25
20
15
10
5
*
*
*
*
0
Controle 100
200
400
*
INDO
MOR
Sc-CHCl3 (mg/kg)
Figura 18 - Efeito antinociceptivo da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3
100, 200 e 400 mg/kg), indometacina (INDO, 20 mg/kg) e morfina (MOR, 10 mg/kg),
no teste de contorções abdominais em camundongos. Valores são expressos em
média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo
5.2.1.2 Teste de nocicepção induzida por formalina
O tratamento com as frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 nas doses de 100, 200 e
400 mg/kg (i.p) produziu uma atividade antinociceptiva significante comparada ao
grupo controle na segunda fase deste teste (p<0,05). Sc-Hex (100, 200 e 400
mg/kg.) reduziu em 64,51; 67,79 e 73,90%, respectivamente, o tempo de lambida de
pata dos animais (Figura 19).
Houve redução desse tempo na primeira fase, com porcentagem de inibição
de 35,46% apenas na dose de 100 mg/kg dos animais tratados com Sc-CHCl3
(Figura 20). Já na segunda fase esses percentuais foram 82,06, 74,96 e 92,77%. A
droga de referência utilizada nesse teste foi o ácido acetilsalicílico (AAS) que reduziu
somente na segunda fase do teste, enquanto a morfina inibe ambas as fases de
estímulo da dor (p<0,05).
68
Primeira Fase
Segunda Fase
150
40
20
*
Tempo de lambida (s)
60
0
100
50
*
*
*
*
*
0
Controle 100
200
400
AAS
MOR
Controle 100
Sc-Hex (mg/kg)
200
400
AAS
MOR
Sc-Hex (mg/kg)
Figura 19. Efeito antinociceptivo da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100,
200 e 400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS,150 mg/kg) e morfina (MOR,10 mg/kg)
na primeira e segunda fase do teste da formalina em camundongos. Valores são
expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente
diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
Primeira Fase
Segunda Fase
150
40
*
20
*
0
Controle 100
200
400
AAS
Sc-CHCl3 (mg/kg)
MOR
60
100
50
*
*
*
*
400
AAS
*
0
Controle 100
200
MOR
Sc-CHCl3 (mg/kg)
Figura 20. Efeito antinociceptivo da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3
100, 200 e 400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS, 150 mg/kg) e morfina (MOR, 10
mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina em camundongos. Valores
são expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05
significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de
Dunnet).
5.2.1.3 Teste da placa quente
No teste da placa quente o tratamento com as frações de S. convoluta, nas
doses de 100, 200 e 400 mg/kg via i.p, não aumentou o tempo de permanência do
69
animal sobre a placa quente (Figura 20 e 21). Entretanto, a morfina (10 mg/kg),
utilizada como fármaco padrão, foi ativa de maneira significativa (p < 0,05) no
tempos de 60, 90 e 120 minutos.
Tempo de Latência (s)
20
*
*
15
*
10
Controle
Sc-Hex 100 mg/kg
Sc-Hex 200 mg/kg
Sc-Hex 400 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
5
0
30
60
90
120
Tempo (min)
Figura 21. Efeito antinociceptivo da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100,
200 e 400 mg/kg), morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120
minutos após sua administração em camundongos. Valores são expressos em
média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do grupo
Tempo de Latência (s)
20
*
*
15
*
10
Controle
Sc-CHCl3 100 mg/kg
Sc-CHCl3 200 mg/kg
Sc-CHCl3 400 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
5
0
30
60
90
120
Tempo (min)
Figura 22. Efeito antinociceptivo da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-Hex
100, 200 e 400 mg/kg), morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e
120 minutos após sua administração em camundongos. Valores são expressos em
média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do grupo
70
5.2.2 Atividade anti-inflamatória das frações obtidas de S. convoluta
5.2.2.1 Modelo de pleurisia induzida por carragenina
No modelo de pleurisia, somente os animais tratados com Sc-CHCl3 na dose
de 200 mg/kg (i.p) apresentaram redução significativa na inibição da migração
celular induzida por carragenina (*p < 0,05). Os animais estimulados com
carragenina apresentaram um aumento no influxo de leucócitos para a cavidade
inflamada de 6,53 ± 1,45 x 106 células. Apenas o pré-tratamento na dose de 200
mg/kg com a Sc-CHCl3 foi capaz de reduzir esse infiltrado para 1,19 ± 0,25 x 106
células (81,78% de inibição – Figura 23). A indometacina, utilizada como fármaco
padrão, inibiu em 89,89% a migração celular para a cavidade pleural.
Leucócitos totais
(106 células/cavidade)
15
Controle
Carragenina (Cg)
Sc-Hex (mg/kg)
Indometacina (mg/kg)
10
5
*
0
-
Cg
100
200
400
10
Carragenina 1% (300 g/cavidade)
Figura 23. Efeito anti-inflamatório da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100,
200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no modelo de pleurisia induzida por
carragenina em camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão da
média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA
seguido pelo teste de Dunnet).
71
Leucócitos totais
(106 células/cavidade)
10
Controle
Carragenina(Cg)
Sc-CHCl3 (mg/kg)
8
6
4
2
*
*
0
-
Cg
100
200
400
10
Figura 24. Efeito anti-inflamatório da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3
100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no modelo de pleurisia induzida
por carragenina em camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão
da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA
5.2.2.1.2 Quantificação de proteínas totais
A quantificação de proteínas totais confirma os dados no modelo anterior,
onde somente os animais tratados com Sc-CHCl3 na dose de 200 mg/kg (i.p)
apresentaram redução significativa do extravasamento de proteínas para a cavidade
pleural (p < 0,05). Os animais estimulados apresentaram 1,22 ± 0,18 μg/mL
enquanto o pré-tratamento reduziu esse valor para 0,32 ± 0,06 μg/mL (73,77%)
(Figura 25) assim como o fármaco dexametasona com porcentagem de inibição de
86,88%.
72
Proteínas totais (g/mL)
1.5
Controle
Carragenina (Cg)
Sc-Hex (mg/kg)
1.0
0.5
*
0.0
-
Cg
100
200
400
10
Figura 25. Efeito da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100, 200 e 400 mg/kg)
e indometacina (10 mg/kg) sobre o extravasamento de proteínas plasmáticas no
modelo de pleurisa induzida por carragenina. Valores são expressos em média ±
erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle
(ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
Proteínas totais (g/mL)
10
8
Controle
Carragenina (Cg)
Sc-CHCl3 (mg/kg)
6
4
2
*
*
0
-
Cg
100
200
400
10
Figura 26. Efeito da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3 100, 200 e 400
mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) sobre o extravasamento de proteínas plasmáticas
no modelo de pleurisa induzida por carragenina. Valores são expressos em média ±
erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle
(ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
73
5.2.2.2 Edema de pata induzido por carragenina
No modelo de edema de pata induzido por carragenina, o tratamento com as
frações de S. convoluta (Sc-Hex e Sc-CHCl3), nas doses testadas 100, 200 e 400
mg/kg via i.p, não foi capaz de diminuir de maneira significativa o exsudato formado
após o estímulo álgico. Entretanto, a indometacina (10 mg/kg), utilizada como
fármaco padrão, foi ativa de maneira significativa (p < 0,05) após 4 horas da sua
administração, reduzindo o edema em 74,45%. A figura 27 expõe os dados na forma
de % de inibição do volume da pata, sendo o volume do edema da pata dos animais
tratados com carragenina (controle) aqueles que exibiram 100% de edema.
% Inibição do volume ( L)
150
Carragenina (Cg)
Sc-Hex (mg/kg)
Sc-CHCl3 (mg/kg)
100
50
0
1%
10
200
400
200
Tratamento (mg/kg)
400
Figura 27. Efeito anti-inflamatório das frações hexânica e clorofórmica de S.
convoluta (Sc-Hex ou Sc-CHCl3; 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no
modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos. Valores são
expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente
diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).
5.3. Avaliação da atividade motora no teste de rota-rod
No teste do rota-rod, os animais tratados com as frações Sc-Hex e Sc-CHCl3
não apresentaram alteração significativa no desempenho motor nas doses de 100,
200 e 400 mg/kg. Entretanto, como já esperado, o diazepam, fármaco depressor do
SNC, reduziu o tempo em que os animais permaneceram no rota-rod quando
comparado ao grupo controle (Figuras 28 e 29).
74
Tempo (s) no rota-rod
200
150
*
*
*
100
Controle
Sc-Hex 100 mg/kg
Sc-Hex 200 mg/kg
Sc-Hex 400 mg/kg
Diazepam 2,5 mg/kg
50
0
1h
0.5 h
2h
Figura 28. Efeito da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex, 100, 200 e 400
mg/kg, i.p) e diazepam (2,5 mg/kg) no teste do rota-rod. Valores são expressos em
Tempo no rota-rod (s)
200
150
*
*
100
*
Controle
Sc-CHCl3 100 mg/kg
Sc-CHCl3 200 mg/kg
Sc-CHCl3 400 mg/kg
Diazepam 2,5 mg/kg
50
0
0.5 h
1h
2h
Figura 29. Efeito da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3, 100, 200 e 400
mg/kg, i.p) e diazepam (2,5 mg/kg) no teste do rota-rod. Valores são expressos em
5.4. Toxicidade aguda das frações obtidas de S. convoluta
A administração das frações de S. convoluta nas doses de 400 e 2000 mg/kg,
por via intraperitoneal em dose única não ocasionou mortes, indicando baixa
toxicidade do extrato. Em relação ao peso corporal, consumo de água e ração,
75
houve diferença estatística quando comparados com o grupo controle. Neste
experimento foi observado que, tanto Sc-Hex quanto Sc-CHCl3 têm DL50 > 2000
mg/kg quando administrado por via intraperitoneal.
5.4.1. Triagem farmacológica comportamental
A triagem comportamental dos camundongos foi realizada nos tempos de 30,
60,120, 180 e 240 minutos após a administração via intraperitoneal das frações ScHex e Sc-CHCl3 nas doses de 400 e 2000 mg/kg. Os animais demonstraram
aumento no número de grooming (comportamento característico de auto limpeza) e
contorções abdominais.
5.4.2. Consumo de água, ração e variação do peso dos animais
O consumo de água pelos camundongos tratados com as fração Sc-Hex nas
doses de 400 e 2000 mg/kg não mostrou alterações significativas, assim como no
consumo de ração por esses animais. Ao final do experimento, o consumo de água
foi de 61,43 ± 1,07 mL para o grupo controle de Sc-Hex, enquanto os animais
tratados com 400 mg/kg foi de 71,21 ± 1,14 mL e 67,71 ± 1,92 g para aqueles
tratados com 2000 mg/kg. O consumo de alimento para os mesmos grupos foi de
54,79 ± 1,62 g, 54,36 ± 1,02 g e 57,50 ± 0,87g, respectivamente. Já em relação ao
ganho de peso dos animais, apenas aqueles tratados com a maior dose
demonstraram menor ganho de peso, mas não o suficiente para detectar diferenças
significativas quando comparados ao grupo controle. No final do experimento, a
média do grupo controle foi de 34,77 ± 0,13 g, enquanto para os animais tratados
com a dose de 400 mg/kg foi de 35,10 ± 0,20 g e 33,89 ± 0,19 g para os animais
tratados com a maior dose. O consumo de água e ração pelos animais tratados com
Sc-CHCl3 mostrou alterações significativas (p < 0,05), principalmente nos 5 primeiros
dias daqueles tratados com a dose de 2000 mg/kg. Assim, ao final do experimento, a
quantidade de água consumida pelos animais do grupo controle de Sc-CHCl3 foi de
68,14 ± 0,97 mL de água e os animais tratados com 400 mg/kg 61,00 ± 2,39 mL e
49,43 ± 2,51 mL para aqueles tratados com 2000 mg/kg. O consumo de alimento
para os mesmos grupos foi de 50,57 ± 1,20 g, 48,43 ± 2,44 g e 42,29 ± 3,00 g,
respectivamente. Entretanto, essas diferenças não afetaram no ganho de peso dos
76
animais, não sendo possível observar diferenças significativas. A média de peso do
grupo controle foi de 33,33 ± 0,15 g, 31,79 ± 0,22 g para os animais tratados com
400 mg/kg e 31,01 ± 0,18 g para os animais tratados com 2000 mg/kg.
Consumo de água (mL)
125
Controle
Sc-Hex 400 mg/kg i.p.
100
75
50
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias
Figura 30. Dados do consumo de água dos animais tratados com a fração hexânica
de S. convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante 14 dias
(n= 12 por grupo).
Consumo de ração (g)
70
Controle
60
50
40
30
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias
Figura 31. Dados do consumo de ração dos animais tratados com a fração hexânica
de S. convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante 14 dias
(n= 12 por grupo).
77
Peso corporal (g)
37.5
Controle
Sc-Hex 400 mg/kg i.p
Sc-Hex 2000 mg/kg i.p
35.0
32.5
30.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
Dias
hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante
14 dias (n= 12 por grupo).
Consumo de água(mL)
125
Controle
Sc-CHCl3 400 mg/kg i.p.
Sc-CHCl3 2000mg/kg i.p.
100
75
50
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias
Figura 33. Dados do consumo de água dos animais tratados com a fração
clorofórmica de S. convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9%
durante 14 dias (n= 12 por grupo).
78
Consumo de ração (g)
60
Controle
Sc-CHCL3 2000 mg/kg i.p.
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias
Figura 34. Dados do consumo de ração dos animais tratados com a fração
clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9%
Peso corporal (g)
37.5
Controle
Sc-CHCL3 2000 mg/kg i.p.
35.0
32.5
30.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
Dias
clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9%
5.4.3 Parâmetros hematológicos e bioquímicos
É possível observar que os resultados dos parâmetros hematológicos
(eritrócitos,
hemoglobina,
hematócrito,
volume
corpuscular
médio
(VCM),
hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração de hemoglobina corpuscular
média (CHCM), leucócitos, linfócitos, eosinófilos e plaquetas) após a administração
79
de 400 mg/kg e 2000 mg/kg i.p, de Sc-Hex e Sc-CHCl3 não apresentaram diferenças
significativas. Os resultados estão expressos nas Tabelas 2 e 3.
Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados mostraram um
aumento em todos os parâmetros do grupo tratado com Sc-Hex, entretanto essas
diferenças
não
foram
consideradas
estatisticamente
significativas
quando
comparadas com o grupo controle. Da mesma forma, os animais tratados com ScCHCl3 apresentaram um aumento nos mesmos parâmetros, mas sem diferenças
significativas quando comparadas ao grupo controle, exceto o parâmetro
transaminase glutâmico oxalacética AST/TGO.
salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).
Parâmetros
Sc-Hex
Sc-Hex
400 mg/kg
2000 mg/kg
Controle
Hemácias (mm3)
8,31 ± 0,2
8,75 ± 0,18
8,37 ± 0,34
Hemoglobina (g/dL)
13,89 ± 89
15,13 ± 0,22
14,08 ± 0,50
Hematócrito (%)
40,73 ± 1,25
43,32 ± 0,72
41,16 ±1,50
VCM (fL)
48,91 ± 0,8
49,64 ± 0,88
49,17 ± 0,79
HCM (pg)
16,78 ± 0,26
17,35 ± 0,32
17,08 ± 0,25
CHCM (g/dL)
34,25 ± 0,27
34,94 ± 0,17
34,76 ± 0,22
Leucócitos totais (mm3)
8,77 ± 1,41
11,85 ± 0,73
10,79 ± 0,86
Linfócitos (%)
92,25 ± 0,65
93,33 ± 0,52
92,38 ± 0,53
Eosinófilos (%)
0.06 ± 0,02
0,07 ± 0,04
0,08 ± 0,04
685,00 ± 76,90
665,00 ± 58,29
672,40 ± 66,41
Plaquetas (mm3)
Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student *p<
0,05, comparado ao controle.
80
solução salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).
Parâmetros
Sc-CHCl3
Sc-CHCl3
400 mg/kg
2000 mg/kg
Controle
Hemácias (mm3)
8,47 ± 0,16
8,32 ± 0,14
7,96 ± 0,17
Hemoglobina (g/dL)
13,89 ± 0,59
13,82 ± 0,33
13,99 ± 0,34
Hematócrito (%)
40,77 ± 1,59
39,39 ± 1,59
39,57 ± 1,51
VCM (fL)
49,91 ± 0,64
48,73 ± 0,64
50,40 ± 0,37
HCM (pg)
17,04 ± 0,22
16,90 ± 0,22
17,39 ± 0,23
CHCM (g/dL)
34,07 ± 0,28
34,60 ± 0,19
34,69 ± 0,20
Leucócitos totais (mm3)
9,87 ± 1,11
9,87 ± 0,89
9,78 ± 1,28
Linfócitos (%)
92,08 ± 0,91
92,33 ± 0,76
91,41 ± 0,97
Eosinófilos (%)
0.18 ± 0,07
0,12 ± 0,05
0,14 ± 0,06
742,30 ± 74,27
752,50 ± 66,15
769,60 ± 84,16
Plaquetas (mm3)
81
salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).
Sc-Hex
Sc-Hex
400 mg/kg
2000 mg/kg
89,73 ± 8,89
94,10 ± 10,37
89,75 ± 6,33
Colesterol (mg/dL)
130,00 ± 13,51
132,5 ± 14,79
126,70 ± 11,81
Triglicerídeos (mg/dL)
203,80 ± 38,43
210,00 ± 18,03
222,50 ± 19,42
AST/TGO (U/L)
139,90 ± 9,13
145,30 ± 9,04
147,00 ± 11,55
ALT/TGP (U/L)
42,63 ± 5,04
45,20 ± 10,21
47,68 ± 8,43
Creatinina (mg/dL)
0,83 ± 0,09
1,01 ± 0,18
0,85 ± 0,13
Parâmetros
Glicose (mg/dL)
Controle
solução salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).
Sc-CHCl3
Sc-CHCl3
400 mg/kg
2000 mg/kg
93,22 ± 7,13
85,91 ± 4,06
92,11 ± 5,94
Colesterol (mg/dL)
130,00 ± 14,14
179,00 ± 10,89
135,00 ± 11,55
Triglicerídeos (mg/dL)
195,80 ± 9,95
198,3 ± 15,90
192,00 ± 27,41
AST/TGO (U/L)
154,40 ± 9,19
155,70 ± 19,08
162,50 ± 23,75*
ALT/TGP (U/L)
48,00 ± 8,39
31,01 ± 6,21
47,64 ± 7,39
Creatinina (mg/dL)
0,87 ± 0,12
1,05 ± 0,13
0,98 ± 0,09
Parâmetros
Glicose (mg/dL)
Controle
82
5.4.4 Análise macroscópica, histológica e peso dos órgãos
Não foram identificadas alterações macroscópicas ou histológicas nos grupos
tratados com o veículo (controle) em ambos os sexos e frações de S. convoluta. A
avaliação hepática revelou estrutura e coloração lobular preservadas e nos rins,
arquitetura normal com corpúsculo renal e túbulos contorcidos distais e proximais
regularmente distribuidos. O córtex apresentou glomérulos regularmente distribuídos
(Figuras 36A e 38A). Entretanto, para os animais tratados com Sc-Hex na dose de
400 mg/kg, os fígados apresentaram processo inflamatório difuso. Normalmente, os
infiltrados apresentaram maior densidade celular próxima às veias centro-lobulares,
mas não houve destruição do parênquima hepático. Já aqueles tratados com a
maior dose (2000 mg/kg) apresentaram hepatócitos com múltiplas vesículas no
citoplasma, sugestiva de esteatose além de um aumento no número de células
inflamatórias (Figuras 36B e 36C).
Nos animais tratados com Sc-CHCl3, na dose de 400 mg/kg os fígados
apresentaram pequenos focos inflamatórios e vasos hiperêmicos (Figura 38B) .
Entretanto, na maior dose, foram observadas extensas áreas de fibrose e discretas
regiões de necrose (Figura 38C). Em relação à avaliação renal, não houve
alterações dignas de nota, nos animais tratados com Sc-Hex (Figura 37B e 37C)..
Aqueles animais tratados com a maior dose de Sc-CHCl3 apresentaram um
pequenoprocesso inflamatório ao redor dos túbulos contorcidos (Figura 39C). Na
análise macroscópica, não houve observação quanto à coloração ou consistência
dos órgãos dos animais tratados com a fração hexânica (Sc-Hex) nas doses de 400
e 2000mg/kg via i.p. Entretanto, aqueles tratados com a fração clorofórmica na maior
dose (Sc-CHCl3, 2000mg, i.p), apresentaram fígado com lóbulos fundidos,
consistência alterada com pontos.
Em relação ao peso dos órgãos, não foram constatadas alterações
significativas entre os grupos tratados com Sc-Hex quando comparados ao controle
(Tabela 6), somente nos animais que receberam a maior dose de Sc-CHCl3
apresentaram aumento significativo no tamanho do baço e diminuição no tamanho
do estômago dos animais tratados com as duas doses em relação ao grupo controle
(Tabela 7).
83
Tabela 6. Peso dos órgãos de camundongos tratados com a fração hexânica de
Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2.000 mg/kg, i.p) e solução salina 0,9% durante
14 dias (n= 12 por grupo).
Parâmetros
Controle
Sc-Hex
Sc-Hex
400 mg/kg
2000 mg/kg
Pulmão (g)
0,22 ± 0,01
0,24 ± 0,00
0,24 ± 0,02
Coração (g)
0,15 ± 0,01
0,17 ± 0,01
0,17 ± 0,01
Rim (g)
0,21 ± 0,01
0,21 ± 0,02
0,21 ± 0,01
Baço (g)
0,14 ± 0,03
0,14 ± 0,01
0,16 ± 0,02
Fígado (g)
1,63 ± 0,11
1,59 ± 0,12
1,53 ± 0,09
Pâncreas (g)
0,13 ± 0,02
0,21 ± 0,02
0,21 ± 0,01
Estômago (g)
0,41 ±0,03
0,40 ± 0,02
0,42 ± 0,02
Tabela 7. Peso dos órgãos de camundongos tratados com a fração clorofórmica de
Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2.000 mg/kg, i.p) e solução salina 0,9%
Parâmetros
Controle
Sc-CHCl3
Sc-CHCl3
400 mg/kg
2000 mg/kg
Pulmão (g)
0,25 ± 0,01
0,23 ± 0,00
0,23 ± 0,02
Coração (g)
0,16 ± 0,01
0,15 ± 0,00
0,16 ± 0,00
Rim (g)
0,19 ± 0,02
0,18 ± 0,01
0,18 ± 0,01
Baço (g)
0,13 ± 0,00
0,14 ± 0,01
0,17 ± 0,02*
Fígado (g)
1,47 ± 0,09
1,45 ± 0,08
1,41 ± 0,07
Pâncreas (g)
0,24 ± 0,02
0,21 ± 0,01
0,25 ± 0,02
Estômago (g)
0,45 ±0,03
0,37 ± 0,01*
0,35 ± 0,02*
84
B
A
C
tratados com veículo (salina+ tween 80) e extratos da fração hexânica de S.
convoluta
(Sc-Hex
400
e
2000
mg/kg,
i.p),
respectivamente.
Coloração
Hematoxilina-Eosina (H.E),
C
B
A
tratados com veículo (salina+ tween 80) e extratos da fração hexânica de S.
convoluta
(Sc-Hex
400
e
2000
mg/kg,
i.p),
respectivamente.
Coloração
Hematoxilina-Eosina (H.E), Aumento 200x.
A
C
B
tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração clorofórmica de S.
convoluta
(Sc-CHCl3
400
Hematoxilina-Eosina (H.E).
e
2000mg/kg,
i.p),
respectivamente.
Coloração
85
A
B
C
Figura
39. Fotomicrografias representativas
do histopatológico
renal dos animais
tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração clorofórmica de S.
convoluta
(Sc-CHCl3
400
e
2000mg/kg,
i.p),
respectivamente.
Coloração
Hematoxilina-Eosina (H.E).
5.5. Ensaio de viabilidade celular por MTT
Após a incubação dos macrófagos com Sc-Hex, houve uma redução
significativa da viabilidade das células a partir da concentração de 250 μg/mL para
27,07 ± 0,9%. Já a incubação com Sc-CHCl3 provocou uma redução de 74,32 ±
4,2% já na concentração de 1 μg/mL. Entretanto, o uso do diluente reduziu por si só
a viabilidade das células. Já as células tratadas apenas com salina se mantiveram
viáveis (100%).
% Células viáveis
150
Controle
Sc- Hex + Tween 0,2%
100
50
*
*
0
-
1
100
250
500
Sc-Hex (g/mL)
Figura 40. Efeito fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 1, 100, 250 e
500 µg/mL) sobre a viabilidade celular. Valores são expressos em média ± erro
padrão da média, * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA
86
% Células viáveis
150
Controle
Sc-CHCl3 + tween 0,2%
100
*
*
50
*
*
250
500
0
-
1
100
Sc-CHCl3 (g/mL)
Figura 41. Efeito fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 1, 100, 250
e 500 µg/mL) sobre a viabilidade celular. Valores são expressos em média ± erro
padrão da média, * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA
4. DISCUSSÃO
88
6. DISCUSSÃO
6.1. Triagem fitoquímica preliminar das frações obtidas de Selaginella convoluta.
Os dados reportados nesse estudo indicam, pela primeira vez, que as frações
obtidas de Selaginella convoluta, apresentam perfil de resposta antinociceptiva
frente a diferentes modelos que utilizam estímulos químicos e térmicos. Esse padrão
de atividade provavelmente está relacionado com a presença de constituintes
químicos que foram identificados na análise fitoquímica preliminar (Tabela 1, página
63).
Dentre os produtos de origem vegetal, os terpenos, quinonas, catequinas,
alcaloides e flavonoides destacam-se por apresentarem potencial farmacológico no
tratamento de inflamações (KHANNA et al., 2007).
Os flavonoides são compostos da família dos polifenóis abundantes no reino
vegetal e estão presentes em vários alimentos. Em relação às suas propriedades
anti-inflamatórias, os flavonoides atuam na inibição da enzima 5-lipoxigenase,
conversora do ácido araquidônico em leucotrienos, que são mediadores da asma,
alergias e inflamação, bem como causam a inibição da via da COX. Adicionalmente,
estudos têm mostrado que flavonoides exercem um efeito inibitório na exsudação de
proteínas e na migração de leucócitos para o sítio inflamatório, bem como sua ação
na liberação de ácido araquidônico dos fosfolipídeos, presentes nas membranas
celulares, por ação da PLA2 (LANDOLFI; MOWER; STEINER, 1984). Além do
potencial
anti-inflamatório,
os
flavonoides
também
apresentam
atividade
gastroprotetora (CARVALHO, 2004).
6.2. Atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das frações obtidas de Selaginella
convoluta.
Diversos modelos de nocicepção e inflamação são utilizados em animais de
laboratório para avaliar a possível atividade analgésica e anti-inflamatória de
extratos e compostos obtidos de fontes naturais (BASBAUM; JULIUS, 2006).
Embora mensurar o nível de dor em animais não seja fácil, quando submetidos a um
estímulo nociceptivo os animais são capazes de exibir respostas comportamentais
89
motoras e fisiológicas semelhantes às observadas em humanos. Assim, essas
respostas
quando
estudadas
e
comparadas
na
presença
de
fármacos
reconhecidamente analgésicos que interferem no processo fisiológico da dor,
permitem inferir que o animal está experimentando uma resposta álgica (LAPA et al.,
2003; PERAZA et al., 2007).
Para avaliação da atividade antinociceptiva, foram utilizados modelos
clássicos de nocicepção: contorções abdominais induzidas por ácido acético
(COLLIER et al, 1968) e nocicepção induzida por formalina (HUNSKAAR; HOLE,
1987), bem como por estímulo térmico como o teste da placa quente (KURAISHI et
al., 1983). Esses métodos foram selecionados com base em sua capacidade de
avaliar a resposta analgésica tanto em nível central como periférico.
O modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético é descrito
como um modelo de nocicepção simples, pouco específico, mas com boa
sensibilidade, permitindo avaliar a atividade de várias substâncias que atuam tanto
em nível central como periférico (IKEDA et al., 2001; PARVEEN et al., 2007). Nesse
modelo, a administração de um agente irritante, como o ácido acético, quando
injetado por via intraperitoneal induz nocicepção característica de espasmos,
redução e incoordenação da atividade motora que são traduzidos em contorções
(LAPA et al., 2003; CUNHA et al., 2003; MIRANDA et al., 2008). Estes movimentos
são considerados reflexos e evidenciam a dor inflamatória visceral (LE BARS;
GOZARIUM; CADDEN, 2001). Isso ocorre porque o ácido acético atua de forma
indireta, causando a liberação de mediadores endógenos que estimulam neurônios
nociceptivos sensíveis tantos a anti-inflamatórios não esteroidais como analgésicos
opioides (FISCHER et al., 2008). A sensibilização de nociceptores ocorre por
liberação e/ou produção de mediadores como histamina, serotonina, bradicinina,
citocinas, NO e, principalmente, prostaglandinas. Nesse modelo há também indução
da liberação de TNF-α, IL-1β e IL-8, por macrófagos e basófilos residentes na
cavidade peritoneal (VERRI et al., 2006). Além de ser influenciada por esses
mediadores inflamatórios, a nocicepção promovida pelo ácido acético também pode
ser mediada pela dissociação dos prótons presentes nesse agente, que estimulam
os canais TRPV1 e ASICs localizados nos neurônios aferentes primários (JULIUS;
BASBAUM, 2001).
90
Entretanto, as PGs são os principais mediadores inflamatórios causadores da
algesia, por tornar as fibras aferentes nociceptivas potencialmente sensível aos
diversos mediadores, resultando em contorções abdominais nos animais (SANTOS;
VEDANA; FREITAS, 1998). Dessa forma, esse modelo está associado à liberação
de prostanoides de maneia geral, ao aumento dos níveis de PGE2 e PGF2α nos
fluidos peritoneais, assim como, produtos da via das lipoxigenases (PARVEEN et al.,
2007), podendo relacionar a atividade nesse modelo a uma maior inibição da COX
periférica, como demonstrado por diversos autores (BALLOU et al., 2000).
Dessa forma, a estimulação dos nociceptores periféricos e neurônios
sensitivos, por esses mediadores, possibilitam a deflagração do potencial de ação,
caracterizando a sensação dolorosa (LE BARS; GOZARIUM; CADDEN, 2001).
Os resultados obtidos nesse teste mostraram que as frações Sc-Hex e ScCHCl3 (100, 200 e 400 mg/kg, i.p), apresentam atividade antinociceptiva no teste de
contorção abdominal induzida por ácido acético em camundongos. Os resultados
apresentados nas Figuras 17 e 18 demonstram que o grupo controle apresentou
25,67 ± 3,31 contorções 10 minutos após a aplicação do ácido acético. Quando os
animais foram tratados com 100, 200 e 400 mg/kg de Sc-Hex, o número de
contorções abdominais foi reduzido de maneira estatisticamente significante (p <
0,05), cujos
percentuais de
inibição foram
de
64,93,
77,91
e
99,35%,
respectivamente. De maneira similar os animais tratados com Sc-CHCl3 (100, 200 e
400 mg/kg) o grupo controle apresentou 20,33 ± 3,42, as porcentagens de inibição
foram 90,16, 90,16, e 95,92%, sugerindo que Sc-Hex e Sc-CHCl3 provavelmente
apresentem em sua constituição substâncias com propriedades antinociceptivas.
Após a primeira triagem para saber se as frações possuíam ou não atividade,
foi realizado o teste de nocicepção induzida por formalina para distinguir entre ação
periférica ou central. O teste de nocicepção induzida por formalina é um modelo
químico de nocicepção que fornece uma resposta mais específica quando
comparado ao modelo de contorção abdominal induzida por ácido acético
(SHIBATA, 1989). A formalina administrada pela via sub plantar produz dor intensa,
revelada por respostas motoras bem caracterizadas (vigorosas lambidas, mordidas e
batidas na pata), cuja quantificação permite que se avalie a intensidade da resposta
nociceptiva (DUBUISSON; DENNIS, 1997; TJØLSEN et al. 1992).
91
A vantagem desse método em relação aos outros é a possibilidade de avaliar
dois tipos diferentes de dor ao longo de um período prolongado de tempo e, assim,
permite avaliar agentes antinociceptivos com diferentes mecanismos de ação (LE
BARS; GOZARIUM; CADDEN, 2001; RANDOLPH; PETERS, 1997). Esse teste
possui uma característica marcante por possuir duas fases distintas. A primeira é
chamada de fase neurogênica, a qual se inicia imediatamente após a injeção de
formalina, dura cerca de 5 min e, provavelmente, resulta do efeito irritante direto
sobre os nociceptores, ativando as fibras aferentes primárias (principalmente C),
acarretando na liberação de neuropeptídeos como a substância P (SP) entre outros
em terminais centrais e mediadores periféricos como a bradicinina em terminações
periféricas (GONÇALVES et al., 2008, MURNO, 2009). Após a primeira fase, há um
período de 5 a 10 min no qual os animais apresentam um reduzido comportamento
sugestivo de nocicepção, devido à ativação da via inibitória descendente
(SWEITZER et al., 2004). A segunda fase, dita inflamatória, é iniciada
aproximadamente 15 min após a injeção de formalina e dura cerca de 15 min. Nessa
fase tardia, são formados os mediadores inflamatórios nos tecidos periféricos,
induzindo mudanças funcionais nos neurônios do corno dorsal que, ao longo do
tempo, promovem sensibilização da transmissão em nível espinal (OLIVEIRA;
SOUZA; ALMEIDA, 2008).
Nesse teste, Sc-Hex não foi ativo na fase neurogênica, enquanto Sc-CHCl3
teve resultado significativo apenas na dose de 100 mg/kg com percentual de inibição
de 35,46%. Por outro lado, tanto Sc-Hex, quanto Sc-CHCl3 reduziram o tempo de
lambida da pata na fase inflamatória do teste. Sc-Hex nas doses de 100, 200 e 400
mg/kg inibiram em 64,51, 67,79, e 73,90%, respectivamente, enquanto Sc-CHCl3
nas mesmas doses inibiu 82,06, 74,96 e 92,77% esse tempo. Assim, é possível
sugerir que o efeito das frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 na fase inflamatória pode estar
relacionado à inibição de COX e/ou da produção de serotonina, de citocinas
inflamatórias ou outros mediadores inflamatórios.
Para proceder com a avaliação do efeito antinociceptivo, o teste da placa
quente foi realizado. O modelo experimental foi descrito inicialmente por Woolfe &
Macdonald (1944) como modelo específico para a detecção de substâncias
analgésicas de efeito central. Um dos principais motivos para essa busca é o
objetivo de se chegar a um fármaco com propriedades terapêuticas semelhantes às
92
da morfina, mas sem os efeitos adversos indesejáveis que limitam seu uso na
terapêutica, como a tolerância e a dependência (GRIS et al., 2010; WILLIAMS et al.,
2004). O ensaio de placa quente é usado para avaliação de dor em nível
supraespinal (MARCHIORO et al., 2005). A reposta produzida pelo estímulo nocivo
é rápida, sendo mediada pela ativação dos nociceptores, o impulso é conduzido ao
corno dorsal da medula espinal e posteriormente para os centros corticais, da
mesma forma agem os agentes opioides que exercem efeitos analgésicos via
receptores espinal e supra espinal (NEMIROVSKY et al., 2001). A resposta
observada neste ensaio resulta da ativação direta de nociceptores térmicos
cutâneos que transmitem informação nociceptiva aguda a regiões específicas no
SNC. A integração do estímulo ocorre devido à estimulação de fibras C não
mielinizadas de condução lenta, produzindo uma resposta nociceptiva organizada.
No ensaio de placa quente, o estímulo térmico induz dois tipos de comportamento
no camundongo: retirada ou lambida da pata. Ambos são resultantes da ativação
direta dos nociceptores pelo calor, que irão conduzir o estímulo doloroso ao corno
dorsal da medula espinal e posteriormente aos centros corticais (LE BARS;
GOZARIUM; CADDEN, 2001).
Nesse teste nenhuma das frações foi capaz de aumentar de forma
estatisticamente significativa o tempo de permanência do animal sobre a placa
quando comparado ao grupo controle, tratado apenas com veículo, ao contrário da
morfina (10 mg/kg, i.p), utilizado como fármaco padrão que causou um aumento
significativo nos tempos de 60, 90 e 120 minutos, como já era de esperar se tratando
de um analgésico opioide.
A fim de avaliar se o efeito analgésico das frações de S. convoluta provocam
sedação e/ou incoordenação motora, foi realizado o teste do rota-rod. Os testes de
coordenação motora são métodos utilizados na triagem de fármacos com possível
atividade miorrelante/neurotóxica, pois são testes adaptados para detectar o efeito
relaxante muscular e incoordenação motora de agentes com propriedades
farmacológicas (PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006). Nesse teste foi verificado que
o tratamento dos animais com as frações não alterou a coordenação motora,
eliminando-se assim, a possibilidade de existência de um efeito relaxante muscular
inesperado (BRITO, 2012).
93
Uma vez que as frações de Selaginella convoluta apresentaram atividade
significativa na fase inflamatória do modelo de nocicepção induzida por formalina foi
investigada também a atividade anti-inflamatória dos mesmos utilizando o modelo de
pleurisia induzida por carragenina. Esse é um modelo experimental de inflamação
aguda, bem caracterizado pela presença de exsudato rico em proteínas e infiltração
de leucócitos polimorfonucleares na cavidade pleural (MIKAMI; MIYASAKA, 1983). A
carragenina é uma mistura de polissacarídeos extraída de algas marinhas do gênero
Rhodophyceae que, quando injetada na cavidade pleura,l induz uma resposta
inflamatória caracterizada por intensa exsudação plasmática e migração de células,
particularmente de neutrófilos. Essa migração é decorrente da grande estimulação e
liberação de mediadores inflamatórios como as prostaglandinas, histamina,
bradicinina, neuropeptídeos e NO (DI ROSA, 1972; PAULINO et al., 2008).
Nesse experimento, os animais estimulados com carragenina apresentaram
um aumento no influxo de leucócitos para a cavidade inflamada de 6,53 ± 1,45 x 10 6
células e apenas o pré-tratamento na dose de 200 mg/kg com Sc-CHCl3 foi capaz de
reduzir esse infiltrado para 1,19 ± 0,25 x 106 células (78,56% de inibição). Assim,
procedeu-se a avaliação das frações sobre o extravasamento de plasma para a
cavidade estimulada através da quantificação de proteínas totais. Verificamos que,
de maneira semelhante ao recrutamento de células, apenas a dose de 200 mg/kg de
Sc-CHCl3 foi capaz de reduzir esse extravasamento de 1,22 ± 0,18 para 0,32 ± 0,06
μg/mL, quando comparado ao grupo controle. Entretanto, esse resultado não é
suficiente para afirmar uma atividade anti-inflamatória das frações obtidas de S.
convoluta.
Outro modelo utilizado foi o edema de pata induzido por carragenina. Éste é
um modelo experimental amplamente utilizado para triagem de substâncias ou
extratos vegetais de caráter anti-inflamatório e tem sido frequentemente utilizado
para avaliar o efeito antiedematogênico de produtos naturais, como plantas
medicinais, exibindo um elevado grau de reprodutibilidade (THOMAZZI et al., 2010).
A injeção subcutânea de carragenina na pata de camundongos provoca um aumento
agudo e progressivo do volume da pata injetada. Este edema é proporcional à
intensidade da resposta inflamatória, sendo um parâmetro útil na avaliação da
atividade anti-inflamatória de novos compostos (SILVA, 2013). O edema produzido a
partir da administração intraplantar da carragenina é um evento bifásico, que é
avaliado durante 1-5 horas. A primeira fase (1 ou 1,5 horas) é predominantemente
94
caracterizada pela formação de um edema não fagocítico, enquanto que a segunda
fase (2-5 horas) é caracterizada por um aumento da formação do edema, que
permanece por até 5 horas (KHAN et al., 2009). Entretanto, após o tratamento dos
animais com as frações não houve diferenças significativas da diminuição do edema
formado após o estímulo com carragenina. Portanto, nesse modelo nenhuma das
frações foram ativas. Esse resultado corrobora com os anteriores obtidos no modelo
de pleurisia, indicando a ausência de efeito anti-inflamatório das frações obtidas de
S. convoluta.
6.3. Toxicidade aguda
A fim de avaliar o perfil de segurança, a toxicidade aguda das frações Sc-Hex
e Sc-CHCl3 foi avaliada durante 14 dias após a administração em dose única nas
doses de 400 e 2000 mg/kg.
Embora seja amplo o uso de plantas medicinais para o tratamento de várias
doenças, pouco é conhecido sobre a toxicidade e segurança (JOTHY et al., 2011).
Assim, para determinar a segurança dos medicamentos e dos produtos vegetais
para uso humano, a avaliação toxicológica é realizada em vários modelos
experimentais para prever a toxicidade e fornecer diretrizes para a seleção de uma
dose segura (OLSON et al., 2000).
Durante a fase pré-clínica em modelos com animais de experimentação, a
toxicidade pode ser avaliada através da realização de estudos histopatológicos, para
determinação de lesões celulares e teciduais. Esse estudo é de fundamental
importância, pois caracteriza os efeitos deletérios decorrentes da administração em
concentração capaz de provocar efeitos tóxicos (EATON; KLAASSEN, 1996). Nos
estudos com finalidade farmacotoxicológica, o fígado e os rins são órgãos
constantemente avaliados, pois além de serem vitais, são órgãos envolvidos na
metabolização
e
excreção
da
maioria
dos
compostos
experimentalmente
administrados, sendo assim, alvos de toxicidade induzida por xenobióticos. Os
modelos animais são necessários para identificar as possíveis lesões provocadas
pela ação direta ou de produtos gerados por biotransformação após administração
dessas substâncias (FOLGUEIRA; BRENTANI, 2004). Além disso, esses estudos
toxicológicos têm a finalidade de avaliar a ideia errônea de que produtos de origem
95
natural, como os fitoterápicos, são isentos de efeitos tóxicos ou adversos (LAPA,
1999; LAPA et al., 2001; CRAVEIRO et al., 2008; MARLIÉRE et al., 2008).
O presente estudo mostra que a administração em dose única das frações
Sc-Hex e Sc-CHCl3 administrado por via intraperitoneal provocou alguns sinais de
toxicidade, como contorções e aumento no grooming até 4 horas depois da
administração. Entretanto, ambas as frações não ocasionaram mortes durante os 14
dias de tratamento.
Uma vez que as alterações no peso corporal têm sido utilizadas como um
indicador de efeitos adversos de fármacos e produtos químicos (TOFOVIC,
JACKSON, 1999; RAZA et al., 2002, TEO et al., 2002), todos os dias foi feita a
análise do peso corporal, não havendo diferença estatística quando comparados
com o grupo controle. Entretanto, houve alterações significativas no consumo de
água e ração nos grupos tratados com Sc-CHCl3 quando comparados ao controle
principalmente nos primeiros dias após o tratamento.
O sistema hematopoiético é um dos sistemas mais sensíveis para avaliar a
toxicidade das drogas em seres humanos e animais (RAHMAN; SIDDIQUI; JAMIL,
2001). É possível observar que os resultados dos parâmetros hematológicos
(eritrócitos, hemoglobina, hematócritos, HCM, CHCM, VCM, eosinófilos, leucócitos,
linfócitos, e plaquetas) após a administração das frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 não
apresentaram variação significativa.
Em relação aos parâmetros bioquímicos, somente os animais tratados com a
maior dose de Sc-CHCl3 mostraram diferenças significativas nos níveis de AST/TGO
em relação ao grupo controle. A avaliação desses parâmetros é indispensável, uma
vez que resultados elevados de ALT/TGP e AST/TGO no sangue indicam alterações
nas funções hepáticas, sendo o primeiro sinal de lesões no fígado, a concentração
de ALT aumentada no soro (HILALY; ISRAILI; LYOUSS, 2004). As enzimas AST e
ALT podem indicar dano celular em curto ou longo prazo. ALT, uma enzima
citoplasmática, é mais prevalente na fase aguda e é liberada principalmente em
situações de lesão hepatocelular leve (LIMA et al., 1985; GELLA,1994; KEW, 2000).
Por outro lado, a AST, que está predominantemente localizada na mitocôndria
(KEW, 2000), prevalece na fase crônica tóxica e a sua liberação é provocada por um
dano grave, elevando a relação de AST/ ALT (LIMA et al., 1985).
A avaliação histopatológica evidenciou alterações morfológicas em maior grau
nos animais tratados com a maior dose experimental (2000 mg/kg). Essa dose
96
corresponde a 5 vezes a maior dose terapêutica do estudo de Sá et al. (2012a). Tal
fato aponta para um significado clínico que pode ser compreendido mais como
resultado de uma sobrecarga dos órgãos que como consequência de uma ação
tóxica significativa do extrato. Dessa forma, as frações de S. convoluta podem ser
utilizados em doses inferiores a 400 mg/kg devido ao menor grau e extensão das
lesões em fígado e rins. Ainda assim, ressalta-se a importância de estudos
toxicológicos de longa duração com as frações de S.convoluta para melhor
caracterizar o perfil de segurança dessa espécie.
Em relação ao peso dos órgãos, só foram evidenciadas alterações nos
animais tratados com Sc-CHCl3. Houve diminuição do estômago dos dois grupos
tratados quando comparados ao controle, esse dado pode ser explicado pelo
consumo de comida que foi menor para os mesmos grupos, entretanto, isso não
ocasionou alteração no ganho de peso dos animais. Outra alteração foi o aumento
do baço (esplenomegalia) dos animais tratados com a maior dose.
A esplenomegalia geralmente é secundária a uma doença sistêmica, mas
poder ser um dado isolado, sem causa conhecida. O baço tem quatro funções
principais: filtração dos elementos indesejados contidos no sangue, resposta
imunitária, produção de células linfo-hematopoéticas e reservatório sanguíneo. A
filtração do sangue é a mais importante função do órgão, eliminando substâncias
estranhas da corrente circulatória, incluindo células do sangue obsoletas e
lesionadas,
materiais
particulados
como
bactérias,
restos
celulares
e
macromoléculas provenientes de erros inatos do organismo. Também participa da
resposta imune contra antígenos provenientes do sangue. É um importante
reservatório de células fagocíticas na polpa vermelha e da série linfoide na polpa
branca (SOARES; VASSALO; PAES, 2006). Esse dado ainda está sendo
investigado, pois não houve relação com os parâmetros hematológicos.
Adicionalmente, foi realizado o ensaio de viabilidade celular por MTT, que
consiste na verificação da atividade e integridade mitocondrial, interpretada como
uma medida de viabilidade celular (MOSMANN, 1983). Assim, esse ensaio avalia o
potencial citotóxico in vitro, onde os macrófagos peritoneais dos animais normais
têm contato direto com as frações. Nesse ensaio, foi verificado que as células
peritoneais são sensíveis ao potencial das frações testadas, sendo que a
sensibilidade varia com a concentração das amostras, demonstrando um caráter
mais tóxico para a fração Sc-CHCl3.
97
O mais importante axioma da toxicologia é “a dose faz o veneno”, ou seja,
qualquer substância química pode ser tóxica se a dose ou exposição se tornar
suficientemente altas, de modo que as alterações observadas foram atribuídas às
altas doses utilizadas (SIPES; DART, 1997; DINIZ, 2000).
Em resumo, nossos resultados mostram que as frações obtidas por partição
de Selaginella convoluta possuem atividade antinociceptiva e não afetam os eventos
da inflamação aguda, justificando, em parte, o uso dessa espécie pela medicina
popular no tratamento da dor.
7. CONCLUSÃO
7. CONCLUSÃO
convoluta (Selaginellaceae) em camundogos.
99
7. CONCLUSÃO
É possível concluir que os resultados obtidos no presente trabalho
demonstram que as frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 de Selaginella convoluta
apresentam atividade antinociceptiva periférica. Tais atividades podem ser mediadas
por inibição da COX periférica e/ou inibição direta de mediadores inflamatórios. É
possível atribuir essas atividades à presença de metabólitos secundários presentes
nesses extratos, que possivelmente estão atuando de forma sinérgica. Algumas
classes desses metabólitos já foram identificadas e algumas de suas atividades
biológicas já foram descritas, como visto anteriormente. Entretanto, nos modelos de
inflamação as frações obtidas de Selaginella convoluta não foram efetivas
significativamente.
Adicionalmente, foi verificado que as frações, nas doses
testadas, não provocam incoordenação motora nos animais.
Em relação ao perfil de segurança de S. convoluta, dados obtidos na
investigação de toxicidade aguda, demonstraram que nos camundongos Swiss, as
doses
máximas
evidenciaram
exigidas
alterações,
nos
experimentos,
principalmente
não
induziram
histopatológicas,
mortes,
mas
provavelmente
decorrentes da administração de doses suficientemente altas para tal (5 vezes
maior). O resultado da viabilidade celular por MTT revelou um maior potencial
citotóxico da fração Sc-CHCl3. Ainda assim, ressalta-se a importância de estudos
toxicológicos de longa duração com as frações de S. convoluta para melhor
caracterizar o perfil de segurança das frações. Essa espécie pode ser considerada,
a priori, de baixa toxicidade, o que respalda a continuidade de estudos
farmacológicos, toxicológicos e fitoquímicos.
Todos os resultados apresentados nesse trabalho são inéditos para a espécie
em estudo, destacando-se a contribuição do mesmo para o estudo farmacológico e
toxicológico de plantas do bioma Caatinga, em especial às espécies da família
Selaginellaceae. Além disso, os resultados apresentados nesse estudo corroboram,
em parte, a utilização da espécie na medicina popular, no entanto, outros estudos
são necessários para identificar os mecanismos de ação desses extratos.
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123
APÊNDICE
124
APÊNDICE A – Artigo 1
Artigo 1:
PHYTOCHEMISTRY
OF
THE
GENUS
(SELAGINELLACEAE)
Publicação: Journal of Medicinal Plants Research
Fator de impacto: 0,820
SELAGINELLA
125
RESUMO
The Selaginellaceae family includes the single genus Selaginella, which is found
worldwide and comprises approximately 700-750 species. A number of species have
been traditionally used for medicinal purposes in the whole world, and the
phytochemistry of some has been investigated. For this review, the search was
carried out using Web of Sciences, Chemical Abstracts and the data bank
NAPRALERT (acronym for NAtural PRoducts ALERT), updated to October 2012.
The references found in the search were then studied in detail. This review refers to
32 species and 130 compounds isolated from plants of the genus Selaginella, which
are classified in appropriate chemical groups. The compounds isolated have been
identified belonging to the classes of alkaloids, benzenoids, carbohydrates,
chromones, coumarins, flavonoids, lignans, oxygen heterocycle, phenylpropanoids,
pigments, quinoids and steroids. Some aspects of bioactivity of the secondary
metabolites produced are discussed. For this purpose 75 references were consulted.
Keywords: Selaginellaceae, Selaginella, phytochemistry, review.
126
INTRODUCTION
The family Selaginellaceae Willk. is a distinctive family including the single genus
Selaginella. Selaginella is a nearly worldwide genus of about 700 species (Tryon and
Tryon, 1982) or 750 species (Judd et al., 1999), with about 270 of them in America.
This genus is widely distributed in America, Africa and Europe, east to the Bering
Straits, to Kamchatka, Japan, and to New Guinea and Australia also in the Pacific
east to the Hawaiian Islands, the Marquesas, Tahiti and Rapa. In America,
Selaginella occurs from northern Alaska east to Greenland, and south to Mendoza
and Buenos Aires in Argentina. It is certainly better represented in the Amazon basin,
for 31 species are known from that region (Tryon and Tryon, 1982).
Members of the Selaginellaceae occurs mostly terrestrial, herbaceous and
perennial plants under 2 cm tall. Roots dichotomously branching; rhizophores usually
produced from the stem, dichotomously branching. Stems erect or creeping. Leaves
about 0.5-1 cm long, spirally arranged and often 4-ranked on the secondary and
ultimate branches. Distribution of these plants is mainly tropical regions, with a few
species extending into arctic regions of both hemispheres, occupying a wide range of
habitats. The family has a nearly cosmopolitan distribution, but is not significant
economically (Judd et al., 1999). Plants of Selaginella vary greatly in size. Some
small species have stems about 3 cm long, while larger ones have stems 50 cm to
ca. 1 m long (Tryon and Tryon, 1982).
Several Selaginella species are used in traditional medicine in various
countries to treat a variety of diseases such as cancer, cardiovascular problems (Lin
et al., 1994), diabetes (Darias et al., 1989), gastritis (Han et al., 1984), hepatitis (Lin
and Kan, 1990), skin diseases (McFoy and Sama, 1983) and urinary tract infections
(Winkelman, 1986). Extracts from some Selaginella species have shown activity as
127
antinociceptive (Sá et al., 2012), anti-inflammatory (Han et al., 1972), antimutagenic
(Meng et al., 1990), antispasmodic (Itokawa et al., 1983), cytotoxic, imunnostimulant
and RNA reverse transcriptase inhibitory agents (Ono et al., 1989).
Previous studies involving some species of Selaginella revealed that this
genus is a rich source of steroids, biflavonoids, alkaloids, secolignans, neo-lignans
and caffeoyl derivatives. Other compounds, such as alkaloidal glycosides,
phenylpropanones and lignans, were also reported in some Selaginella species (Sá
et al., 2012). However, only a few studies on the bioactive components of species in
this genus have been performed. In a recent work, Setyawan (2011) studied the
diversity of natural products from Selaginella, especially biflavonoid and trehalose
compounds; and biological activity of Selaginella’s biflavonoid in modern medication.
The present study is a compilation of recent literature reports on
phytochemistry and pharmacological importance of plants of the Selaginellaceae
family.
MATERIALS AND METHODS
With the objective of contributing to these studies, a literature search on the natural
products from the genus Selaginella was carried out. The keywords used for the
literature search for this review were Selaginella, Selaginellaceae, natural products,
phytochemistry and medicinal plants. The search was carried out using Web of
Sciences, Chemical Abstracts, and the data bank of the University of Illinois in
Chicago NAPRALERT (acronym for NAtural PRoducts ALERT), updated to October
2012. The references found in the search were then studied in detail.
RESULTS AND DISCUSSION
128
Consultation of various literature sources resulted in the elaboration of a list of
natural products that have been grouped into appropriate chemical classes, as well
as a list of species where these compounds were isolated (Table 1). It should be
noted that most of the references cited are not first-hand observations, but
compilations copied from other sources. For details, the original references should be
consulted.
In this review is reported the study of 32 species of the genus Selaginella. We
founded 130 chemically defined natural products reported in the literature from
species of this genus. The compounds isolated have been identified belonging to the
classes of alkaloids (14), benzenoids (4), carbohydrates (3), chromones (3),
coumarins
(3),
flavonoids
(60),
lignans
(13),
oxygen
heterocycle
(1),
phenylpropanoids (8), pigments (9), quinoids (4) and steroids (8).
Phytochemistry of the genus Selaginella
The extensive use of species in this genus to treat a variety of diseases in traditional
medicine in several countries, coupled with the fact that only limited literature
information on the pharmacological activity of its constituents was available, had
suggested the phytochemical investigation of species of this family (Silva et al.,
1995).
Bioactivity of metabolites
In this section, the biological activities of the metabolites from species of the
Selaginellaceae are considered. The intention is to compare these properties
attributed to the medicinal plants to determine the degree of correspondence and,
possibly, provide leads for biological testing, on the one hand, and to individuate
129
species whose phytochemistry could be investigated further, on the other. Chemical
structures of some bioactive compounds are shown in Figure 1.
Chromones
Uncinoside A (1) and B (2) showed potent antiviral activities against respiratory
syncytial virus (RSV) with IC50 value of 6.9 and 1.3 μg/ml, moderate antiviral activities
against parainfluenza type 3 virus (PIV 3) with value of 13.8 and 20.8 μg/ml,
respectively (Ma et al., 2003).
Lignans
A previous investigation on S. doederleinii demonstrated that its cytotoxic activity
against L929 murine carcinoma cells was correlated to its lignan constituents (Lin et
al., 1994), although several biflavones also isolated from this species were found to
be inactive in this same assay. Thus, the folkloric use of many of these species to
treat cancer may not be entirely explained by the presence of lignans, since such
compounds have been isolated thus far from only the above-mentioned Selaginella
species.
Flavonoids
Selaginellaceae is a family rich in biflavonoids, these compounds shows potent
activity such as antimalarial, anti-inflammatory, antibacterial, antioxidant and antiviral.
The biflavonoids isolated from S. delicatula were tested against a panel of human
cancer cell lines according to established protocols. With the exception of
compounds 4’-methylether-robustaflavone (3) and 2”,3”-dihydro-4’,7-dimethyletherrobustaflavone (4), no inhibitory activity on tumor cells whose IC50 values higher than
130
100 μM. Both the compounds significantly inhibited Raji and Calu-1 cell growth in a
concentration-dependent manner. By contrast, the compounds had no supressory
activity on K562, HeLa, Vero and Wish tumor cell lines. These results show that S.
delicatula biflavonoids possess mainly the C-3’-C-6” interflavonoid linkage instead of
the C-3’-C-8” interflavonoid linkage, which is common for most of the biflavonoids in
the genus of Selaginella. S. delicatula, similar to other Selaginella species, contained
biflavonoid substances that exhibited the cytotoxic activities against cancer cells in
cultures (Sun et al., 1997; Silva et al., 1995).
Among the active and inactive biflavonoids obtained from Selaginella
willdenowii was the novel compound 2”,3”-dihydro-isocryptomerin (5), the cytotoxic
biflavones 4’,7”-di-O-methyl-amentoflavone (6) and isocryptomerin (7), bilobetin (8),
7”-O-methyl-robustaflavone (9), amentoflavone (10), robustaflavone (11). All of the
isolated biflavonoids were tested against a panel of human cancer cell lines
according
to
established
protocols.
Although
the
biflavonoid
2”,3”-dihydro-
isocryptomerin was inactive, the parent molecule, isocryptomerin (7), displayed
significant activity against the HT-1080 and Lu1 cell lines. Among the remaining
biflavone isolates, amentoflavone was found to be inactive, consistent with previous
assay data, and bilobetin displayed only marginal activity against the HT-1080 cell
line (Silva et al., 1995). However, the presence of two methoxyl groups, as in 4’,7”-diO-methylamentoflavone was observed to enhance the cytotoxicity of the compound,
as in case of the Col2 and U373 cell lines. Although there was a tendency to
increase the activity with increasing numbers of methoxyl groups in the molecule,
7,7”-di-O-methylamentoflavone (12) and 7,4’,7”,4’”-tetra-O-methyl-amentoflavone
(13) have been found by others to be inactive against L929 murine cells (Lin et al.,
1994). Only two compounds of the robustaflavone series were isolated and tested.
131
Consistent with earlier literature (Lin et al., 1989), robustaflavone showed a lack
significant cytotoxicity, but its monomethyl derivative, 7”-O-methylrobustaflavone was
found to be a potent cytotoxic agent against the HT-8080, Lu1 and U373 cell lines. Its
in vitro potency is comparable to that of calycopterone, a new type of biflavonoid
isolated by Wall et al. (1994).
Amentoflavone is a dimmer of apigenin, has several known pharmacological
activities which includes anti-inflammatory (Kim et al., 1994) and antioxidative effects
(Huguet et al., 1990). Amentoflavone also inhibits phospholipase C1 (Lee et al.,
1996) and cAMP-dependent phosphodiesterase (Saponara and Bosisio, 1998),
which could be associated with its diverse physiological activities. Amentoflavone
inhibited the production of nitric oxide in a concentration-dependent manner and also
blocked the lipopolysaccharide (LPS)-induced expression of inducible nitric oxide
synthase (iNOS). These findings suggest that the inhibition of LPS-induced NO
formation by amentoflavone is due to its inhibition of NF-κB by blocking I-κBα
degradation, which may be the mechanistic basis of the anti-inflammatory effects of
amentoflavone (Woo et al., 2005).
Bioassay-directed fractionation of an ethanolic extract of S. moellendorfii has
led to the isolation of a known biflavone, ginkgetin (14). A dose-dependent inhibition
was observed on the growth of OVCAR-3 (human ovarian adenocarcinoma) cells
with 50% inhibition occurring at 1.8 μg/ml. Nonbioactive fractions yielded four
additional known biflavones, 7,4’,7”,4’”-tetramethylether-amentoflavone, kayaflavone,
podocarpusflavone A and amentoflavone (Sun et al., 1997).
An ethyl acetate-soluble extract of S. tamariscina was found to exhibit
distinctive vasorelaxant activity. Further purifications of the extract as guided by in
vitro
vasorelaxant
assay
afforded
an
active
biflavonoid,
amentoflavone.
132
Amentoflavone induced concentration-dependent relaxation of the phenylephrineprecontracted aorta, which disappeared by removal of functional endothelium.
Amentoflavone-induced relaxations were also markedly attenuated by addition of
tetraethylammonium
(TEA)
or
verapamil.
However,
the
relaxant
effect
of
amentoflavone was not blocked by pretreatment with indomethacin, glibenclamide,
atropine, or propranolol. Incubation of endothelium-intact aortic rings with
amentoflavone increased the production of cGMP, but this effect was blocked by
endothelium-denudation or pretreatment with L-NAME or ODQ. These results
suggest that amentoflavone relaxes vascular smooth muscle via endotheliumdependent nitric oxide-cGMP signaling, with possible involvement of non-specific K+
and Ca2+ channels (Kang et al., 2004).
CONCLUSION
The present work shows that species of the genus Selaginella are a rich source of
bioactive compounds. The flavonoids are the major compounds isolated from these
species. In particular, the chemical constituents belonging to class of biflavonoids,
such as amentoflavone, ginkgetin, isocryptomerin and robustaflavone presented
several biological activities in experimental models. More research is needed to
further explore the actions of these compounds. Selaginella research exhaustively
needs to be conducted to explore all natural products constituents and their
bioactivities (Setyavan, 2011).
133
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors wish to express their sincere thanks to the College of Pharmacy, The
University of Illinois at Chicago, Chicago, Illinois 60612-7231, U.S.A., for helping with
the computer-aided NAPRALERT search and Brazilian agencies CNPq and FACEPE
for financial support.
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Table 1. Chemical constituents isolated from species of the genus Selaginella.
Chemical Compounds
Class
Species
References
Hordenine
Alkaloid
S. doederleinii
Chao et al., 1987
Alkaloid
S. doederleinii
Chao et al., 1990
Alkaloid
S. doederleinii
Chao et al., 1987
Hordenine-O-α-L-rhamnopyranoside
Alkaloid
S. doederleinii
Chao et al., 1987
N-methyltyramine-O-α-L-rhamnoside
Alkaloid
S. doederleinii
Chao et al., 1987
Selaginellic acid
Alkaloid
S. moellendorfii
Wang et al., 2009
5-Hydroxyselaginellic acid
Alkaloid
S. moellendorfii
Wang et al., 2009
5-Hydroxy-N8,N8-dimethylpseudophrynaminol
Alkaloid
S. moellendorfii
Wang et al., 2009
N-Selaginelloyl-L-phenylalanine
Alkaloid
S. moellendorfii
Wang et al., 2009
N-(5-Hydroxyselaginelloyl)-L-phenylalanine
Alkaloid
S. moellendorfii
Wang et al., 2009
Neoselaginellic acid
Alkaloid
S. moellendorfii
Wang et al., 2009
N-(5-Hydroxyneoselaginelloyl)-L-phenylalanine
Alkaloid
S. moellendorfii
Wang et al., 2009
Hordenine-[6-O-(4-hydroxy-cinnamoyl)-β-D-glucosyl]-(1,3)α-L-rhamnoside
Hordenine-O-(6”-O-trans-cinnamoyl)-4’-O-β-Dglucopyranosyl-α-L-rhamnopyranoside
Table 1 - continues
143
Table 1 - continued
Adenosine
Alkaloid
S. tamariscina
Zheng et al., 2004b
Guanosine
Alkaloid
S. tamariscina
Zheng et al., 2004b
Arbutin
Benzenoid
S. tamariscina
Zheng et al., 2004
4-Hydroxy-benzoic acid
Benzenoid
S. pulvinata
Zheng et al., 2001
Vanillic acid
Benzenoid
S. tamariscina
Bi et al., 2004
Syringic acid
Benzenoid
S. tamariscina
Bi et al., 2004
Selaginose
Carbohydrate
S. adunca
Fischer and Kandler, 1975
S. asperula
S. epirrhizos
S. galeotti
S. geniculata
S. kraussiana
S. marginata
S. parkeri
S. plumosa
Table 1 - continues
144
Table 1 - continued
S. sanguinolenta
S. stellata
S. sulcata
2-Carboxy-arabinitol
Carbohydrate
S. mertensii
Moore et al., 1993
Mycose
Carbohydrate
S. pulvinata
Zheng et al., 2001
8-Methyl-eugenitol
Chromone
S. uncinata
Ma et al., 2002 ; Ma et al., 2003
Uncinoside A
Chromone
S. uncinata
Ma et al., 2002 ; Ma et al., 2003
Uncinoside B
Chromone
S. uncinata
Ma et al., 2002 ; Ma et al., 2003
Isopimpinellin
Coumarin
S. doederleinii
Chen et al., 1995
S. moellendorfii
Che and Yu, 1986
Umbelliferone
Coumarin
S. tamariscina
Bi et al., 2004
3-(4-Hydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy coumarin
Coumarin
S. tamariscina
Liu et al., 2010
Amentoflavone
Flavonoid
S. braunii
Ma et al., 2001
S. davidii
Ma et al., 2001
S. delicatula
Lin et al., 2000a
Table 1 - continues
145
Table 1 - continued
S. denticulata
Lopez-Saez et al., 1994a
S. kraussiana
Qasim et al., 1985
S. moellendorfii
Sun et al., 1997
S. pulvinata
Ma et al., 2001
S. rupestris
Chanravarthy et al., 1981
S. sanguinolenta
Huneck and Khaidav, 1985
S. selaginoides
Lopez-Saez et al., 1994b
S. sinensis
Ma et al., 2001
S. stauntoniana
Ma et al., 2001
S. tamariscina
Lee et al., 1992
S. uncinata
Ma et al., 2003
S. willdenowii
Silva et al., 1995
2,3-Dihydroamentoflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
2”,3”-Dihydroamentoflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
Table 1 - continues
146
Table 1 - continued
Tetrahydro-amentoflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
Amentoflavone-7,4,7,4-tetramethylether
Flavonoid
S. moellendorfii
Cao et al., 2010a
4’,7”-Di-O-methyl-amentoflavone
Flavonoid
S. sinensis
Ma et al., 2001
S. willdenowii
Silva et al., 1995
7,7”-Di-O-methyl-amentoflavone
Flavonoid
S. doederleinii
Lin et al., 1994
4’,4”’,7,7”-Tetra-O-methyl-amentoflavone
Flavonoid
S. doederleinii
Lin et al., 1994
S. moellendorfiii
Sun et al., 1995
7,4’,7”,4”-tetramethylether-amentoflavone
Flavonoid
S. moellendorfii
Sun et al., 1997
Apigenin
Flavonoid
S. doederleinii
Chen et al., 1995
Apigenin-7-O-β-neohesperidoside
Flavonoid
S. moellendorfii
Feng et al., 2011
Apigenin-8-C- β-D-glucopyranoside
Flavonoid
S. moellendorfii
Feng et al., 2011
6,8-Di-C-β-D-glucopyranosyl-apigenin
Flavonoid
S. moellendorfii
Zhu et al., 2008
6-C-β-D-Glucopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranosyl-apigenin
Flavonoid
S. moellendorfii
Zhu et al., 2008
6-C-β-D-Xylopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranosyl-apigenin
Flavonoid
S. moellendorfii
Zhu et al., 2008
6-(2-Hydroxy-5-acetylphenyl)-apigenin
Flavonoid
S. tamariscina
Liu et al., 2009; Liu et al., 2010
Table 1 - continues
147
Table 1 - continued
6-(5-Carboxyl-2-methoxyphenyl)-apigenin
Flavonoid
S. uncinata
Zheng et al., 2008
2’,8”-Biapigenin
Flavonoid
S. tamariscina
Lee et al., 2008
2”,3”-Dihydro-3’,3”’-biapigenin
Flavonoid
S. labordei
Xu et al., 2009
Bilobetin
Flavonoid
S. willdenowii
Silva et al., 1995
Chamaecyparin
Flavonoid
S. difusa
Meurer-Grimes et al., 1999
S. jungermannioides
S. stellata
Chrysoeriol
Flavonoid
S. moellendorfii
Cao et al., 2010a
Cryptomerin B
Flavonoid
S. denticulata
S. tamariscina
Shin and Kim, 1991
Delicaflavone
Flavonoid
S. delicatula
Lin and Chou, 2000b
Genistin
Flavonoid
S. sinensis
Dai et al., 2001
Ginkgetin
Flavonoid
S. moellendorfii
Sun et al., 1997
S. sinensis
Dai et al., 2001
S. doederleinii
Lin et al., 1994
Heveaflavone
Flavonoid
Table 1 - continues
148
Table 1 - continued
Hinokiflavone
Flavonoid
S. lepidophylla
Qasim et al., 1985
S. denticulata
Lopez-Saez et al., 1995
S. kraussiana
Qasim et al., 1985
S. selaginoides
S. uncinata
Ma et al., 2003
2,3-Dihydrohinokiflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
2”,3”-Dihydrohinokiflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
Tetrahydro-hinokiflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
Tetra-O-methyl-hinokiflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
Isocryptomerin
Flavonoid
S. denticulata
S. tamariscina
Shin and Kim, 1991
S. willdenowii
Silva et al., 1995
2,3-Dihydro-isocryptomerin
Flavonoid
S. delicatula
Lin and Chou, 2000b
2”,3”-Dihydro-isocryptomerin
Flavonoid
S. willdenowii
Silva et al., 1995
Table 1 - continues
149
Table 1 - continued
Kayaflavone
Flavonoid
S. moellendorfii
Sun et al., 1997
Sun et al., 1995
Lanaroflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
Podocarpusflavone A
Flavonoid
S. moellendorfii
Sun et al., 1995
Sun et al., 1997
Robustaflavone
Flavonoid
S. delicatula
Lin et al., 2000
S. denticulata
S. lepidophylla
Qasim et al., 1985
S. selaginoides
S. sinensis
Ma et al., 2001
S. willdenowii
Silva et al., 1995
2,3-Dihydro-robustaflavone
Flavonoid
S. lepidophylla
Aguilar et al., 2008
2,3-Dihydro-5-methylether-robustaflavone
Flavonoid
S. lepidophylla
Aguilar et al., 2008
2”,3”-Dihydro-4’,7,7”-trimethylether-robustaflavone
Flavonoid
S. delicatula
Lin et al., 2000
Table 1 - continues
150
Table 1 - continued
2,3-Dihydro-4’,7,7”-trimethylether-robustaflavone
Flavonoid
S. delicatula
Lin and Chou, 2000b
2”,3”-Dihydro-4’,7,-dimethylether-robustaflavone
Flavonoid
S. delicatula
Lin et al., 2000
4’,7-Dimethylether-robustaflavone
Flavonoid
S. delicatula
Lin et al., 2000
4’-Methylether-robustaflavone
Flavonoid
S. delicatula
Lin et al., 2000
S. doederleinii
Lee et al., 2008
S. sinensis
Ma et al., 2001
S. willdenowii
Silva et al., 1995
7’’-O-Methyl-robustaflavone
Flavonoid
2,2'',3,3''-Tetrahydro-4',7,7''-trimethylether-robustaflavone
Flavonoid
S. doederleinii
Lee et al., 2008
4,7,7''-Trimethylether-robustaflavone
Flavonoid
S. doederleinii
Lee et al., 2008
Sciadopitysin
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
Sequoiaflavone
Flavonoid
S. bryopteris
Kunert et al., 2008
Sotetsuflavone
Flavonoid
S. denticulata
Sumaflavone
Flavonoid
S. tamariscina
Yang et al., 2006
Flavonoid
S. labordei
Xu et al., 2009
2,3-Dihydro-5,5”,7,7”,4’-pentahydroxy-6,6”-dimethyl-[3’-O4”’]-biflavone
Table 1 - continues
151
Table 1 - continued
2”,3”-Dihydroochnaflavone
Flavonoid
S. labordei
Xu et al., 2009
Flavonoid
S. moellendorfii
Zhu et al., 2008
Taiwaniaflavone
Flavonoid
S. tamariscina
Lee et al., 2008
5-Carboxymethyl-4′,7-dihydroxyflavone
Flavonoid
S. moellendorfii
Cao et al., 2010a
Flavonoid
S. moellendorfii
Cao et al., 2010a
Flavonoid
S. moellendorfii
Cao et al., 2010a
Lignan
S. tamariscina
Zheng et al., 2004b
(-)-Lirioresinol A
Lignan
S. doederleinii
Lin et al., 1994
(-)-Lirioresinol B
Lignan
S. doederleinii
Lin et al., 1994
(+)-Matairesinol
Lignan
S. doederleinii
Lin et al., 1994
Moellenoside A
Lignan
S. moellendorfii
Zheng et al., 2008
5-Carboxymethyl-4’-hydroxyflavone-7-O-β-Dglucopyranoside
[7-Hydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-4-oxo-4H-chromen-5yl]-acetic acid ethyl ester
[7-Hydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-4-oxo-4H-chromen-5yl]-acetic acid butyl ester
5-Acethyl-dihydro-2-(3’,5’-dimethoxy-4’-hydroxy-phenyl)-7methoxybenzofuran
Table 1 - continues
152
Table 1 - continued
Moellenoside B
Lignan
S. moellendorfii
Feng et al., 2011
(-)-Nortracheloside
Lignan
S. doederleinii
Lin et al., 1994
Pinoresinol diglucoside
Lignan
S. sinensis
Dai et al., 2001
Sinesiol A
Lignan
S. sinensis
Wang et al., 2007
Syringaresinol
Lignan
S. tamariscina
Bi et al., 2004
Tamariscinoside B
Lignan
S. tamariscina
Zheng et al., 2004b
Tamariscinoside C
Lignan
S. tamariscina
Zheng et al., 2004b
(+)-Wilkstromol
Lignan
S. doederleinii
Lin et al., 1994
2,4-Dihydroxy-3-methylenehydroxy-5-methoxy-
Oxygen
S. lepidophylla
Perez et al., 1994
tetrahydrofuran
heterocycle
Caffeic acid
Phenylpropanoid
S. tamariscina
Bi et al., 2004
Ferulic acid
Phenylpropanoid
S. tamariscina
Bi et al., 2004
Isochlorogenic acid A
Phenylpropanoid
S. delicatula
Lin et al., 2000
Isochlorogenic acid B
Phenylpropanoid
S. delicatula
Lin et al., 2000
Isochlorogenic acid C
Phenylpropanoid
S. delicatula
Lin et al., 2000
Table 1 - continues
153
Table 1 - continued
3-Hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-propan-1-one
Phenylpropanoid
S. doederleinii
Lin et al., 1994
3-Hydroxy-1-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-propan-1-one
Phenylpropanoid
S. doederleinii
Lin et al., 1994
Tamariscine ester A
Phenylpropanoid
S. tamariscina
Bi et al., 2004
Selaginellin
Pigments
S. sinensis
Zhang et al., 2007
Selaginellin A
Pigments
S. tamariscina
Cheng et al., 2008
Selaginellin B
Pigments
S. tamariscina
Cheng et al., 2008
Selaginellin C
Pigments
S. pulvinata
Tan et al., 2009
Selaginellin D
Pigments
S. pulvinata
Cao et al., 2010b
Selaginellin E
Pigments
S. pulvinata
Cao et al., 2010b
Selaginellin F
Pigments
S. pulvinata
Cao et al., 2010b
Selaginellin G
Pigments
S. pulvinata
Cao et al., 2010c
Selaginellin H
Pigments
S. pulvinata
Cao et al., 2010c
Chrysophanic acid
Quinoid
S. stauntoniana
Liu et al., 2004
Emodin
Quinoid
S. stauntoniana
Liu et al., 2004
1-Methoxy-3-methylanthraquinone
Quinoid
S. tamariscina
Liu et al., 2010
Table 1 - continues
154
Table 1 - continued
Physcion
Quinoid
Cholesterol
Steroid
S. stauntoniana
Liu et al., 2004
S. delicatula
Chiu et al., 1988
S. doederleinii
S. delicatula
22-Dehydrocampesterol
Steroid
Chiu et al., 1988
S. doederleinii
3β-16α-Dihydroxy-(5α)-cholestan-21-oic acid
Steroid
24α-Ethyl-cholest-5-en-3β-ol
Steroid
S. pulvinata
Zheng et al., 2007
S. delicatula
Chiu et al., 1988
S. doederleinii
S. delicatula
24α-Methyl-cholest-5-en-3β-ol
Steroid
Chiu et al., 1988
S. doederleinii
S. delicatula
24β-Methyl-cholest-5-en-3β-ol
Steroid
Chiu et al., 1988
S. doederleinii
S. delicatula
24α-Ethyl-cholesta-5,22-dien-3β-ol
Steroid
Chiu et al., 1988
S. doederleinii
β-Sitosterol
Steroid
S. doederleinii
Chen et al., 1995
Table 1 - continues
155
Table 1 - continued
S. moellendorfii
Che and Yu, 1986
S. pulvinata
Zheng et al., 2001
156
CH3
R2O
O
H3C
OR1
O
(1) R1= H; R2= Glc
(2) R1= Ac; R2=Glc
OR3
4'
R2O
O
OR4
2
O
5''
7
3''
3
5
OR1
R5O
O
7''
O
2''
4'''
OR6
(3) R1= H; R2= H; R3= CH3; R4= H; R5= H; R6= H
(9) R1= H; R2= H; R3= H; R4= H; R5= CH3; R6= H
(11) R1= H; R2= H; R3= H; R4= H; R5= H; R6= H
OCH3
4'
H3CO
O
OH
2
5''
7
3''
3
5
OH
O
7''
HO
O
2''
O
4'''
OH
(4)
OH
4'''
H3CO
O
2''
7''
4'
HO
O
2
O
OH
1'
7
3
4
5
OH
O
(5)
3''
5''
O
1'''
157
4'
R2O
O
2
OR3
OR6
1'
4'''
7
R5O
3
OR1
O
2''
7''
4
5
O
1'''
3''
5''
OR4
O
(6) R1= H; R2= H; R3= CH3; R4= H; R5= CH3; R6= H
(10) R1= H; R2= H; R3= H; R4= H; R5= H; R6= H
(12) R1= H; R2= CH3; R3= H; R4= H; R5= CH3; R6= H
(13) R1= H; R2= CH3; R3= CH3; R4= H; R5= CH3; R6= CH3
(14) R1= H; R2= CH3; R3= CH3; R4= H; R5= H; R6= H
OH
4'''
H3CO
O
2''
7''
4'
HO
O
2
O
3''
5''
OH
1'
1'''
O
7
3
4
5
OH
O
(7)
4'
HO
O
2
OCH3
OH
1'
4'''
7
3
4
5
OH
HO
O
2''
7''
O
1'''
3''
5''
O
(8)
Figure 1. Chemical structures of some bioactive compounds in Selaginella.
158
APÊNDICE A – Artigo 2
Artigo 2:
SELAGINELLA CONVOLUTA (SELAGINELLACEAE) ATTENUATES THE
NOCICEPTIVE BEHAVIOR BUT NOT THE ACUTE INFLAMMATORY
EVENTS IN MICE
Submissão: BMC Complementary & Alternative Medicine
Fator de impacto: 2.08
159
Selaginella convoluta (Selaginellaceae) attenuates the nociceptive behavior but
not the acute inflammatory events in mice
Larissa Alves Ribeiro de Oliveira Macêdo1, Alessandra Gomes Marques Pacheco2,
Sarah Raquel Gomes de Lima-Saraiva3, Juliane Cabral Silva1, Raimundo Gonçalves
de Oliveira-Júnior1, Grasielly Rocha Souza1, Jamylle Nunes Souza Ferro4, Emiliano
Barreto4, Visêldo Ribeiro de Oliveira5, Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida1,*
1
Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME), Universidade
Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.
2
Laboratório de Fitoquímica, Universidade Estadual de Feira de Santana, 44.036900, Feira de Santana, Bahia, Brazil.
3
Laboratório de Produtos Naturais, Universidade Federal de Pernambuco, 50.740521, Recife, Pernambuco, Brazil.
160
4
Laboratório de Biologia Celular, Universidade Federal de Alagoas, 57.072-970,
Maceió, Alagoas, Brazil.
5
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), 56.302-970, Petrolina,
Pernambuco, Brazil.
*Correspondence: [email protected]
1
Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do
Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.
Tel/Fax + 55-87-21016863
Full list of author information is available at the end of the article.
Abstract
Background: Selaginella convoluta is a medicinal plant popularly known in
Northeastern Brazil as “jericó”, and is used in folk medicine as analgesic and antiinflammatory. This study aimed to investigate the antinociceptive and antiinflammatory activities of the fractions obtained by partition of crude ethanol extract
from S. convoluta in mice using experimental models of pain and inflammation.
Methods: The hexane (Sc-Hex) and chloroform (Sc-CHCl3) fractions from S.
convoluta were used at doses of 100, 200 and 400 mg/kg. Antinociceptive activity
was evaluated by writhing, hot-plate and formalin tests. Anti-inflammatory activity was
evaluated using carrageenan-induced pleurisy in mice. Additionally, the rota-rod test
was used to evaluate motor coordination.
161
Results: Inhibition of writhing was observed for fractions tested. The Sc-Hex at all
doses tested was effective in reducing the nociceptive behavior produced by formalin
only in the second phase. However, the Sc-CHCl3 decreased the paw licking time in
the first and second phases of this test. In the hot plate no significant effect was
observed for any fraction. Using the rota-rod test, mice treated did not demonstrate
any significant motor performance changes, while diazepam significantly increased
the number of falls. In carrageenan-induced pleurisy, both fractions did were not able
to reduced cell migration to the pleural cavity.
Conclusion: These results reveal the antinociceptive properties of S. convoluta,
which support, in part, its traditional use, since the fractions did not presented
significant activity in the inflammatory response profile. We further verify that this
antinociceptive effect showed linked with activation of nociceptive peripheral
pathway.
Keywords: Selaginella convoluta; Selaginellaceae, pain, inflammation, nociception
Background
Pain and inflammation is a body defense reaction, in order to eliminate or limit the
spread of injurious organisms, toxic chemical substances, and physical injuries from
living mammalian tissues [1, 2]. Narcotic drugs, non-steroidal anti-inflammatory drugs
(NSAIDs), steroidal and immunosuppressant drugs have been usually used in the
relief of pain and inflammatory diseases by the people of the world for a long time [3].
Furthermore, these drugs may have various and severe adverse side effects, such
as gastric lesions caused by NSAIDs, tolerance and dependence induced by opiates,
use of these drugs as anti-inflammatory and analgesic agents have not been
successful in all cases [4-6].
162
Medicinal plants have been used since ancient times as medicines for the
treatment of diseases and still play a key role in world health [7]. According to
Kumara (2001), plant based drugs in traditional medicine are being paid much
attention because of their minimal side effects, cheapness and also the fact that 80%
of the world population still rely on them [8]. The chemical diversity of plants has
made them one of the main sources for the isolation of bioactive organic compounds
[7]. Brazil is privileged because it ranks first among the richest countries in
biodiversity in the world, accounting for 22% of the higher plant species on the planet
[9].
The family Selaginellaceae Willk. is a distinctive family including the single
genus Selaginella which is a nearly worldwide genus of about 700 species [10] to
750 species [11], with about 270 of them in America. Members of the
Selaginellaceae occurs mostly terrestrial, herbaceous and perennial plants. Vary
greatly in size, some small species have stems about 3 cm long, while larger ones
have stems 50 cm to aproximatelly 1 m long, under 2 cm tall [11].
Pharmacological and phytochemical studies on genus Selaginella led to
identification of numerous bioactive molecules, including alkaloids, phenols
(flavonoids, tannins, saponins),
and terpenoids (triterpenes and steroids) [12, 13], with broad biological activities,
including antivirus, antifungal, antibacterial, cytotoxic, anticancer, antioxidant,
antiplasmodial, leishmanicidal and anti-inflammatory properties [14-25].
Selaginella convoluta is a medicinal plant found in Northeastern Brazil
commonly know as “jericó”, “mão-de-sapo” and “mão-fechada” and it is used in folk
medicine as antidepressant [26, 27], aphrodisiac, diuretic, against amenorrhea [28],
163
cough, bleeding, increases female fertility [29] as well as analgesic and antiinflammatory [30].
In our continuing search of the pharmacological properties of S. convoluta, in
the present paper we demonstrate the antinociceptive and anti-inflammatory effects
of the fractions obtained by partition of the crude ethanol extract of S. convoluta in
experimental models in mice. Previous study carried out by our research group
demonstrated the antinociceptive effect of ethanolic extract in mice [31].
Methods
Plant material
Selaginella convoluta was collected in the city of Petrolina (Coordinates: S 09º03’54”;
W 40º19’12”) State of Pernambuco, Brazil, in March of 2012. A sample was identified
by Viseldo Ribeiro de Oliveira, a researcher from Embrapa Semiárido. A voucher
specimen (19203) was deposited at the Herbarium Vale do São Francisco (HVASF)
of the Federal University of San Francisco Valley (UNIVASF).
Preparation of plant extract
The dried and pulverized plant (1935 g) was macerated with ethanol 95% at room
temperature for 72 h. The extractive solution was filtered and concentrated under
reduced pressure in a rotatory evaporator at 50 °C, producing 146.55 g of crude
ethanol extract (Sc-EEB). The Sc-EEB was suspended in a mixture of MeOH: H2O
(3:7) and extracted successively with hexane and chloroform in crescent order of
polarity to obtain the fractions Sc-Hex (21.26 g) and Sc-CHCl3 (15.14 g), respectively.
164
Animals
Male adult albino Swiss mice (25-35 g) were used in this study. The animals were
randomly housed in appropriate cages at 22  2 oC on a 12 h light/ dark cycle with
free access to food and water. When necessary, animals were deprived of food 12 h
prior to the experiments. They were used in groups of six animals each, according to
the experiments realized. Experiments were performed during the light phase of the
cycle. All tests were carried out by the same visual observer. Experimental protocols
and procedures were approved by the Universidade Federal do Vale do São
Francisco Animal Care and Use Committee by number 0003/17072012.
Pharmacological tests
Acetic acid-induced writhing test
This test was done using the method described by Koster et al. [32]. Mice (25-35 g)
were divided into six groups of six mice each. Acetic acid (0.9% v/v) was
administered i.p. in a volume of 0.1 ml/10 g. Vehicle (saline), morphine (MOR, 10
mg/kg), Indomethacin (INDO, 20 mg/kg) and fractions (100, 200 and 400 mg/kg),
were administered i.p. 30 min before acetic acid injection. The number of abdominal
constrictions produced in each group for the succeeding 10 min was counted and
compared to the response in the control group. Antinociceptive activity was
calculated as the percentage inhibition of abdominal constriction.
Formalin test
The method used was similar to the described by Hunskaar and Hole [33] and
Vianna et al. [34]. 20 µl of 2.5% formalin (in 0.9% saline, subplantar) was injected
subcutaneously into the right hind paw of mice. The time (in seconds) spent in licking
165
and biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain response.
Responses were measured for 5 min after formalin injection (first phase, neurogenic)
and 15-30 min after formalin injection (second phase, inflammatory). Vehicle (saline),
morphine (MOR, 10 mg/kg), acetylsalicylic acid (ASA, 150 mg/kg) and fractions (100,
200 and 400 mg/kg), were administered i.p. 60 min before formalin injection. Mice
were observed in the chambers with a mirror mounted on three sides to allow view of
the paws. Antinociceptive activity was calculated as the percentage inhibition of
licking time.
Hot plate test
Mice were divided into five groups of six mice each. Mice were pre-selected on the
hot plate at 55 ± 0.5 oC. Licks on the rear paws were the parameters of observation.
Animals showing a reaction time (latency for licking the hind feet or jumping) greater
than 20 s were discarded. The animals were then treated with vehicle (saline, 0.1
ml/10 g), morphine (MOR, 10 mg/kg) and fractions (100, 200 and 400 mg/kg) via i.p.
Latency time (in seconds) for each mice was determined on the hot plate during the
maximum period of 20 s, at intervals of 30, 60, 90 and 120 min after the
administration of the vehicle, extract and morphine [35].
Carrageenan-induced pleurisy
The animals (n=6 in each group) were pre-treated by intraperitoneal route (i.p.) with
fractions (100, 200 and 400 mg/kg) 30 min prior to the induction of pleurisy. Pleurisy
was induced by the intrapleural injection (i.t.) of 100 μl of a 1% (v/v) carrageenan
solution. A specially adapted 13×5 syringe was introduced into the right side of the
thoracic cavity of mice to inject the carrageenan solution, and an equal volume of
sterile saline was injected into the controls. At 4 h after the i.t. injection, the animals
166
were sacrificed in a CO2 gas chamber and the thoracic cavity was opened and
washed with 1 ml PBS containing EDTA (10 mM). These pleural washes were
recovered and their volume measured. Pleural wash samples were diluted in Turk
fluid (2% acetic acid) for total leukocyte counts using Neubauer chambers.
Indomethacin was used as reference drug. Thus, parallel groups of animals were
pre-treated (30 min before pleurisy induction) with indomethacin (10 mg/kg, i.p.) and
4 h later the same inflammatory parameters were evaluated [36]
Measurement of total protein content
The fluids recovered from the pleural cavity of the animals treated with the fractions
Sc-Hex and Sc-CHCl3 at 100, 200 and 400 mg/kg were centrifuged for 10 min at
1,500 × g, and the total protein content was quantified in the supernatant, at 640 nm,
using the Folin-Lowry technique [37].
Motor coordination test (rota-rod test)
A rota-rod treadmill device (Insight, Brazil) was used for the evaluation of motor
coordination [38]. Initially, 24 h before the test, mice capable of remaining on the
rota-rod apparatus longer than 180 s (7 rpm) were selected. Thirty minutes after the
administration of fractions (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.), vehicle (saline, 0.1 ml/10
g); control group) or diazepam (2.5 mg/kg, i.p.), each animal was tested on the rotarod apparatus at 30 min, 1 and 2 h post-treatment, and the time(s) the mice were
able to remain on top of the bar was (were) recorded for up to 180 s.
Statistical analysis
The data were expressed as mean ± S.E.M. and the statistical significance was
determined using an analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test.
167
Values were considered significantly different at p < 0.05. All analysis was performed
using by GraphPad Prism 4.0 program.
Results
Acetic acid-induced writhing test
The intraperitoneal administration of Sc-Hex (100, 200 and 400 mg/kg) showed
dose-dependent antinociceptive effect and decreased significantly (p < 0.05) the
number of writhing movements induced by the i.p. administration of the acetic acid
compared with the control group. The percentages of inhibition were 64.93, 77.91
and 99.33 %, respectively (Figure 1). The Sc-CHCl3 produced inhibition of the
abdominal writhing response by 90.16, 90.16 and 95.92% (Figure 2). Indomethacin
caused a 90.92 and 88.53% reduction in writhing movements for animals treated
with Sc-Hex and Sc-CHCl3, respectively. Morphine abolished all of the nociceptive
responses in all treated groups.
INSERT FIGURE 1
INSERT FIGURE 2
Formalin test
The results of the formalin test are shown in Figures 3 and 4. Sc-CHCl3 showed a
significant antinociceptive effect to inhibit the licking time in both phases (neurogenic
and inflammatory pain) of the test, but the result was most significative in the second
168
phase. Sc-CHCl3 (100 mg/kg, i.p.) decreased by 35.46%, the paw licking time in the
first phase, as well as 82.06, 74.96 and 92.77%, respectively, in the second phase of
the formalin test. However, the Sc-Hex decreased the paw licking time only the
second phase by 64.51, 67.80 and 73.90%. The reference drug acetylsalicylic acid
was effective only in the second phase for both fractions (87.63% - Sc-Hex and
88.89% - Sc-CHCl3). Morphine decreased the licking time during the two phases.
INSERT FIGURE 3
INSERT FIGURE 4
Hot plate test
In this test, no significant effect was observed for any fraction. The effect of morphine
(10 mg/kg) was significantly higher. Figures 5 and 6 show these results.
INSERT FIGURE 5
INSERT FIGURE 6
Carrageenan-induced pleurisy
Treatment with the Sc-CHCl3 only at dose of 200 mg/kg (i.p), caused a significant
decrease the volume of the exudates to 1.19 ± 0.25 x 106 cells ml/cavity compared
with the control group (6.53 ± 1.40 x 106 cells ml/cavity) and in total protein
extravasations when it was administrated 30 min before carrageenan (Fig. 7 and 8).
As expected, the reference drug, indomethacin caused a significant inhibition of
volume of the exudates to 0.66 ± 0.14 ml/cavity.
169
INSERT FIGURE 7
INSERT FIGURE 8
Motor coordination test (rota-rod test)
In this test, the fractions did not impair motor coordination at 0.5, 1 and 2 h post
administration. Diazepam (2.5 mg/kg) caused a significant decrease in time that the
animals remained on the rota-rod apparatus, compared to the control group (Fig. 9
and 10).
INSERT FIGURE 9
INSERT FIGURE 10
Discussion
The present study reported for the first time the evaluation of antinociceptive and
anti-inflammatory effects of S. convoluta it different extractive fractions employing
various experimental models. Although the plant is widely used in the folk medicine in
the semi-arid region of Brazil, no report about this activity is recorded in the literature.
Furthermore, current treatments used to fight pain and inflammation are usually
insufficient for having severe side effects and limited effectiveness [39]. Therefore,
the continuous search for new molecules that are more effective with reduced side
adverse is needed.
The antinociceptive activities of fractions, all given intraperitoneally at the
doses of 100, 200 and 400 mg/kg, were evaluated using chemical (acetic acid and
formalin) and thermal (hot plate test) stimuli. The writhing test has long been used as
a screening tool for assessing the analgesic properties of new substances [40].
Intraperitoneal administration of acetic acid induce abdominal writhing and involves
170
the increase in cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LOX), prostaglandins (PGs),
histamine, serotonin, bradykinin, substance P, IL-1β, IL-8, TNF-α in the peritoneal
cavity [41]. These agents provoke a very stereotyped behavior in the mice which is
characterized by abdominal contractions, movements of the body as a whole and
twisting of dorso-abdominal muscles. However, it is a non-specific method for
evaluation of pain [42].
Sc-Hex and Sc-CHCl3 significantly reduced the acetic acid-induced writhing in
mice. The results support the hypothesis that the extracts have antinociceptive effect
on the abdominal constrictions. Additionally, different flavonoids have been found to
be antinociceptive and anti-inflammatory agents due to their ability to inhibit the
arachidonic acid metabolism [43-45]. The presence of flavonoids in the fractions of S.
convoluta (data of preliminary phytochemical screening not shown) may be
responsible for the antinociceptive effect.
In order to extend the studies on the antinociceptive and anti-inflammatory
effects, we used the model of nociception induced by formalin. The formalin-induced
paw linking test is a model comprising two distinct phases. The first phase
(neurogenic pain) occurs about 3 min after the injection, and then after a quiescent
period, a second phase (inflammatory pain) between 20 and 30 minutes [46]. The
first phase results essentially from chemical stimulation of nociceptive afferent fibers,
particularly C-fibers, which can be suppressed by opiates like morphine [47].
However, the involvement of substance P and bradykinin has also been reported.
The second phase (inflammatory pain) is induced due to action of inflammatory
mediators such as prostaglandins, serotonin and bradykinin in peripheral tissues and
functional changes in the dorsal horn of the spinal cord [48, 49]. The Sc-Hex
demonstrated that the number of paw licking was significantly reduced only in second
171
phase (p < 0.05) in a dose-dependent manner. However, the Sc-CHCl3 showed
significant effect in both neurogenic and inflammatory pain phases (p < 0.05).
In this experiment, Sc-CHCl3 decreased the licking time in both phases, but
the effect was more significant in the second phase. The inhibition in both phases is
characteristic of drugs that act centrally, and indicates a possible interaction with
opioid receptors. Opioid analgesics seem to be antinociceptive for both phases,
although the first is more sensitive to these substances. In contrast, non-steroidal
anti-inflammatory drugs such as indomethacin and acetylsalicylic acid seem to
suppress only the second phase [33].
In order to confirm the antinociceptive activity and to investigate the
involvement of the central mechanisms of the effects of the fractions, the hot plate
test was used. In this test, the intraperitoneal administration of fractions didn´t affect
mice´s reactivity at the thermal stimulus, demonstrating that the antinociceptive effect
in the abdominal constriction (writhing) test do not involve central mechanisms.
To evaluate the anti-inflammatory effect of the fractions, the model of
carrageenan-induced pleurisy in mice was used. The pleurisy induced by phlogistic
agents is a widely accepted model for the evaluation of the anti-inflammatory effect of
compounds from plants.
Inflammation is a protective process that is essential for the preservation of the
integrity of the organism in the event of chemical, physical and infectious damage.
Often, the inflammatory response to severe lesions erroneously damages normal
tissue [36].
Recruitment of cells to inflammatory sites is dependent on the release of
vasoactive and chemotactic factors that increase the local blood flow and
172
microvascular permeability and promote the migration of leukocytes from the
intravascular space into the tissues [36]. In this study, intrapleural injection of
carrageenan induced an acute inflammatory reaction, characterized by marked
accumulation of exudates rich in protein and intense migration of polymorphonuclear
in the pleural cavities. Treatment of the animals with 200 mg/kg of Sc-CHCl3
attenuated the number of total leukocytes and total protein concentration in the
exudate after carrageenan stimulus [50]. However, this result is not sufficient to affirm
that the plant has anti-inflammatory activity, because this effect was observed only in
one dose of fractions.
Finally, to assess whether fractions produces a loss of motor coordination in
animals, the rota-rod test was performed. The result revealed that the extract did not
produce changes in motor coordination of treated animals.
Conclusion
In conclusion, this study indicates that the hexane and chloroform fractions of
Selaginella convoluta exhibit antinociceptive activity. Our results support previous
claims of its traditional use. The mechanism of action these fractions showed linked
with activation of nociceptive peripheral pathway. In addition, we have demonstrated
that the fractions from S. convoluta have not any anti-inflammatory effect in the
pleurisy model induced by carrageenan. Further studies are necessary to identify the
biologically active constituents and to define the underlying of molecular mechanisms
of the inhibitory effects of these fractions.
173
Acknowledgements
The authors are grateful to Brazilian agencies CNPq, FAPEAL and FACEPE for
financial support.
Author details
1
Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do
Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil. 2Laboratório de
Fitoquímica, Universidade Estadual de Feira de Santana, 44.036-900, Feira de
Santana, Bahia, Brazil. 3Laboratório de Produtos Naturais, Universidade Federal de
Pernambuco, 50.740-521, Recife, Pernambuco, Brazil.
4
Laboratório de Biologia
Celular, Universidade Federal de Alagoas, 57.072-970, Maceió, Alagoas, Brazil.
5
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), 56.302-970, Petrolina,
Pernambuco, Brazil.
Author’s contributions
VRO were responsible for collection and botanical identification of the species.
LAROM were responsible for preparation of the extract. LAROM, AGMP, SRGLS,
JCS, RGOJ and GRS were responsible for antinociceptive study of the fractions.
LAROM, JNSF, JRGSA and EB conducted the anti-inflammatory activity assays,
analyze and interpretation of data, and drafted the manuscript. All authors read and
approved the final manuscript.
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
174
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of
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extract
from
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suaveolens Ledeb. Inflammation 2007, 30: 213–223.
Number of writhings
40
30
20
*
10
*
*
0
Control
100
200
400
*
*
INDO
MOR
Sc-Hex (mg/kg)
Figure 1. Antinociceptive effect of the hexane fraction from Selaginella convoluta (ScHex), indomethacin (INDO, 20 mg/kg) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on acetic acid-
181
induced writhing in mice. Values are mean ± S.E.M, n = 6, *p < 0.05 significantly different
from control (ANOVA followed by Dunnett´s test).
Number of writhings
25
20
15
10
5
*
*
0
Control 100
200
*
*
400
*
INDO
MOR
Sc-CHCl3 (mg/kg)
Figure 2. Antinociceptive effect of the chloroform fraction from Selaginella convoluta
(Sc-CHCl3), indomethacin (INDO, 20 mg/kg) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on acetic
acid-induced writhing in mice. Values are mean ± S.E.M, n = 6, *p < 0.05 significantly
different from control (ANOVA followed by Dunnett´s test).
182
First phase
Licking time (s)
60
40
20
*
0
Control
100
200
400
ASA
MOR
Sc-Hex (mg/kg)
Second phase
Licking time (s)
150
100
*
50
*
*
*
*
0
Control
100
200
400
ASA
MOR
Sc-Hex (mg/kg)
Figure 3. Antinociceptive effect of the hexane fraction of Selaginella convoluta (Sc-Hex),
acetylsalicylic acid (ASA, 150 mg/kg) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on formalin (first
and second phase) in mice. Values are mean ± S.E.M, n = 6, *p < 0. 05 significantly
different from control (ANOVA followed by Dunnett´s test).
183
First phase
Licking time (s)
60
40
*
20
*
0
Control
100
200
400
ASA
MOR
Sc-CHCl3 (mg/kg)
Second phase
Licking time (s)
150
100
50
*
*
*
*
400
ASA
*
0
Control
100
200
MOR
Sc-CHCl3 (mg/kg)
Figure 4. Antinociceptive effect of the chloroform fraction of Selaginella convoluta (ScCHCl3), acetylsalicylic acid (ASA, 150 mg/kg) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on
formalin (first and second phase) in mice. Values are mean ± S.E.M, n = 6, *p < 0.05
significantly different from control (ANOVA followed by Dunnett´s test).
184
Latency time (s)
20
*
*
15
*
10
Control
Sc-Hex 100mg/kg
Sc-Hex 200mg/kg
Sc-Hex 400mg/kg
Morphine 10 mg/kg
5
0
30
60
90
120
Time (min)
Figure 5. Antinociceptive effect of the hexane fraction of Selaginella convoluta (Sc-Hex)
and morphine (MOR, 10 mg/kg) on hot plate test in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p <
0.05, significantly different from control (ANOVA followed by Dunnett’s test).
Latency time (s)
20
*
*
15
*
10
Control
Sc-CHCl3 100 mg/kg
Sc-CHCl3 200 mg/kg
Sc-CHCl3 400 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
5
0
30
60
90
120
Time (min)
Figure 6. Antinociceptive effect of the chloroform fraction of Selaginella convoluta (ScCHCl3) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on hot plate test in mice. Values are mean ±
S.E.M.; *p < 0.05, significantly different from control (ANOVA followed by Dunnett’s test).
185
Total leukocytes
(x106 cells/cavity)
A
15
Control
Sc-Hex (mg/kg)
Carrageenan (Cg)
Indomethacin (mg/kg)
10
5
*
0
-
Cg
100
200
400
10
Carrageenan 1% (300 g/cavity)
B
Total protein (g/ml)
1.5
Control
Carrageenan (Cg)
Sc-Hex (mg/kg)
1.0
0.5
*
0.0
-
Cg
100
200
400
10
Figure 7. Effect of the hexane fraction of Selaginella convoluta (Sc-Hex) and
indomethacin (10 mg/kg) on total leukocyte (A) and protein extravasation (B) on
pleurisy-induced by carrageenan in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05,
significantly different from control (ANOVA followed by Dunnett’s test).
186
C
Total leukocytes
(x106 cells/cavity)
10
Control
Carrageenan (Cg)
Sc-CHCl3 (mg/kg)
8
6
4
2
*
*
0
-
Cg
100
200
400
10
D
Total protein (g/ml)
10
8
Control
Carrageenan (Cg)
Sc-CHCl3 (mg/kg)
6
4
2
*
*
0
-
Cg
100
200
400
10
Figure 8. Effect of the chloroform fraction of Selaginella convoluta (Sc-CHCl3) and
indomethacin (10 mg/kg) on total leukocyte (C) and protein extravasation (D) on
pleurisy-induced by carrageenan in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05,
187
Time (s) on Rota-rod
200
150
*
*
*
100
Control
Sc-Hex 100 mg/kg
Sc-Hex 200 mg/kg
Sc-Hex 400 mg/kg
Diazepam 2,5 mg/kg
50
0
1h
0.5 h
2h
Figure 9. Effect of the hexane fraction of Selaginella convoluta (Sc-Hex) and diazepam
(2.5 mg/kg) on rota-rod test in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, significantly
different from control (ANOVA followed by Dunnett’s test).
Time (s) on Rota-rod
200
150
*
*
100
*
Control
Sc-CHCl3 100 mg/kg
Sc-CHCl3 200 mg/kg
Sc-CHCl3 400 mg/kg
Diazepam 2,5 mg/kg
50
0
0.5 h
1h
2h
Figure 10. Effect of the chloroform fraction of Selaginella convoluta (Sc-CHCl3) and
diazepam (2.5 mg/kg) on rota-rod test in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05,
188
APENDICE C – Certificado
189
APENDICE D – Certificado
190
APENDICE E– Certificado
191
APENDICE F – Certificado
192
APENDICE G – Certificado
193
APENDICE H – Resumo
INFLUÊNCIA DA VIA DE ADMINISTRAÇÃO NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE
Selaginella convoluta (SELAGINELLACEAE)
Macêdo LARO1, Barreto VNS1, Gomes LMA1, Sá PGS1, Oliveira-Junior RG1, Silva JC1,
Souza GR1, Lima-Saraiva SRG2, Lima JT1, Almeida JRGS1.
1: Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina-PE, Brasil.
2: Universidade Federal de Pernambuco, 50.740-521, Recife-PE, Brasil.
Introdução: Selaginella convoluta (Selaginellaceae) é uma planta medicinal encontrada no
Nordeste do Brasil, popularmente conhecida como "jericó”, sendo utilizada na medicina
popular como antidepressivo, diurético, afrodisíaco, analgésico e anti-inflamatório.
Investigações anteriores de algumas espécies de Selaginella revelaram que este gênero é
uma rica fonte de esteroides, biflavonoides e alcaloides. O objetivo deste trabalho foi avaliar
o efeito antinociceptivo do Extrato Etanólico Bruto (EEB-Sc) e das fases obtidas por
partição, hexano (Sc-Hex), clorofórmio (Sc-CHCl3) e acetato de etila (Sc-AcOEt), no teste
das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos, através de duas
diferentes vias de administração. Método: Foram utilizados grupos de camundongos (n=6)
Swiss, machos, pesando entre 30 e 40 gramas. A atividade antinociceptiva do EEB e das
fases (100; 200 e 400 mg/kg v.o e i.p) foi avaliada através do teste das contorções
abdominais induzidas por ácido acético [1]. Indometacina (20 mg/kg i.p.), morfina (10 mg/kg
i.p.) foram utilizadas como drogas padrão. Os grupos controle receberam solução salina.
Resultados e Discussões: Após a administração por via i.p dos EEB-Sc, bem como de suas
frações, Sc-Hex, Sc-CHCl3 e Sc-AcOEt diminuíram significativamente (p<0,001) o número
de contorções abdominais em relação ao grupo controle. Os efeitos foram maiores nas
doses de 400 mg/kg (82,23% de inibição), 400 mg/kg (99,4% de inibição), 400 mg/kg
(95,17% de inibição) e 200 mg/kg (84,47% de inibição), respectivamente. Com relação à
administração v.o, os melhores resultados foram obtidos nas doses de 200 mg/kg (56,56%
de inibição), 100 mg/kg (48,08% de inibição), 400 mg/kg (36,68% de inibição) e 400 mg/kg
(50,82% de inibição), respectivamente. Conclusão: Os resultados obtidos esclarecem que,
houve variação na resposta antinociceptiva de acordo com a mudança da via de
administração. A diminuição no percentual de inibição pela via oral poderá ser devido a não
absorção efetiva do extrato pelo trato gastrintestinal, ou ainda, pela metabolização de seus
princípios ativos por vias alternativas do metabolismo. Sendo assim, é necessário que
outros estudos sejam feitos para avaliar a possível atividade antinociceptiva do extrato e das
fases de Selaginella convoluta quando administrado por via oral ou intraperitoneal [2].
Agradecimentos: CNPq / FACEPE
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Sessão Científica: Etnofarmacologia, Farmacologia e Toxicologia.
194
APENDICE I – Resumo
AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DE SELAGINELLA CONVOLUTA
(SELAGINELLACEAE)
LARISSA ALVES RIBEIRO DE OLIVEIRA MACÊDO1; JAMYLLE NUNES SOUZA FERRO2;
SAMÁRIO LINO DOS SANTOS2; JOÃO PAULO NOÉ DA SILVA2; EMILIANO DE OLIVEIRA
BARRETO2; JACKSON ROBERTO GUEDES DA SILVA ALMEIDA1
1
NEPLAME, Universidade Federal do Vale do São Francisco.
2
Universidade Federal de Alagoas
Introdução: Selaginella convoluta (Selaginellaceae) é uma planta medicinal encontrada no
Nordeste do Brasil utilizada na medicina popular como antidepressivo, analgésico e antiinflamatório. Objetivos: Avaliar o efeito anti-inflamatório das fases hexânica (FH) e
clorofórmica (FC) de S. convoluta. Métodos: Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas
(n= 6, 25-35 g). Para verificar o efeito das fases FH e FC (100; 200 e 400 mg/kg i.p) sobre o
recrutamento de células foi utilizado o modelo de pleurisia induzida por carragenina. O efeito
sobre a formação do edema foi avaliado no modelo do edema de pata induzido por
carragenina. Adicionalmente, macrófagos peritoneais foram incubados por 24h com as FH e
FC (1, 100, 250 e 500 μg/mL) para avaliar a viabilidade celular pelo método do MTT.
Resultados: Os animais estimulados com carragenina apresentaram um aumento no influxo
de leucócitos para a cavidade inflamada, 6,53 ± 1,45 x 106 células. No entanto, somente o prétratamento com a FC na dose de 200 mg/kg foi capaz de reduzir esse infiltrado para 1,92 ±
0,25 x 106 células. No modelo do edema de pata induzido por carragenina, no entanto,
observamos que o pré-tratamento com FH e FC nas doses de 400 mg/kg não foram capazes de
reduzir a formação do edema (80,02 ± 8,21 e 83,88 ± 13,21 μL, respectivamente), quando
comparado ao grupo controle (88,88 ± 7,03 μL) 4 h após o estímulo. No ensaio de viabilidade
celular, FH provocou uma redução significativa da viabilidade das células a partir da
concentração de 250 μg/mL (27,07 ± 0,9%), já FC provocou uma redução na concentração de
1 μg/mL (74,32 ± 4,2%), apresentando uma redução de 21,11 ± 0,33% na viabilidade das
células na concentração de 250 μg/mL. Conclusões: A fase clorofórmica (FC) obtida de S.
convoluta apresentou atividade anti-inflamatória no modelo de pleurisia induzida por
carragenina. Sob condições agudas de exposição à FH e FC, os animais apresentaram sinais
de toxicidade, dependendo da dose administrada. Dessa forma, mais estudos são necessários
para identificar os mecanismos responsáveis pelos efeitos observados.
Palavras-chave: Efeito anti-inflamatório; Selaginella convoluta, pleurisia.
Apoio Financeiro: CNPq/FACEPE
195
APENDICE J – Resumo
ENCONTRO BRASILEIRO
II
para
3º Encontro Brasileiro para Inovação Terapêutica
INOVAÇÃO TERAPÊUTIC
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DAS FASES OBTIDAS POR PARTIÇÃO DE
SELAGINELLA
CONVOLUTA
I Jornada
para (SELAGINELLACEAE)
o Desenvolvimento da Economia da Saúd
21 a 25 de novembro de 2011
UFPE Recife1& Mar Hotel
L.A.R.O. MACÊDO, 1J.C. SILVA, 1R.G.O.OLIVEIRAJÚNIOR, 1L.M.A. GOMES,
Realização
Patrocínio
1
2
3
1
Inscrições 1eG.R.
Contatos
SOUZA, T.C. DINIZ , S.R.G. LIMA-SARAIVA, A.G.M.PACHECO, J.R.G.S.
Mi
Site: http://www.wix.com/segundoebit/ufpe
Programa de Pós-Graduação
ALMEIDAem Inovação Terapêutica
E-mail: [email protected]
1
Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do Vale do São
Francisco (UNIVASF); [email protected]
2
Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal de Pernambuco;
3
Laboratório de Fitoquímica, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).
Introdução: Selaginella convoluta, popularmente conhecida como “jericó”, é utilizada na
medicina popular como analgésico e anti-inflamatório. O objetivo do trabalho foi avaliar a
atividade antinociceptiva das fases obtidas de S.convoluta, hexano (FH) e clorofórmica (FC).
Métodos: Foram realizados os testes de contorções abdominais induzidas por ácido acético
(0,9%), formalina (2,5%) e placa quente. Os animais foram tratados com FH e FC (100, 200 e
400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (200 mg/kg) e a morfina (10 mg/kg). Utilizou-se
camundongos Swiss (n=6, 25-35 g). Adicionalmente foi avaliada atividade motora dos
animais. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética sob o número 0003/17072012.
Resultados: No teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético, as fases
reduziram o número de contorções em todas as doses. No teste da formalina, os animais
tratados com FH e FC apresentaram resultados significativos na segunda fase. Entretanto, na
dose de 100 mg/kg de FC houve redução do tempo de lambida da pata na primeira fase. Em
relação a placa quente, os animais tratados com FH e FC não apresentaram, em todas as
doses, aumento no tempo de latência. No teste de rota rod não houve interferência motora.
Conclusão: As fases demonstraram atividade antinociceptiva em todos os ensaios
experimentais. Contudo, novos estudos são necessários para melhor elucidação do mecanismo
de ação pelos quais os constituintes químicos presentes nas fases exercem a atividade
antinociceptiva.
Apoio: CNPq, FACEPE.
Palavras-chave: Atividade antinociceptiva, Selaginella convoluta, Selaginellaceae.
196
APENDICE K – Resumo
ENCONTRO BRASILEIRO
II
para
3º Encontro Brasileiro para Inovação Terapêutica
INOVAÇÃO TERAPÊUTIC
AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES
HISTOPATOLÓGICAS
EM CAMUNDONGOS
I Jornada
para o Desenvolvimento
da Economia da Saúd
TRATADOS
COM
AS
FASES
OBTIDAS
POR
PARTIÇÃO
DE
Selaginella
convoluta
21 a 25 de novembro de 2011
UFPE Recife & Mar Hotel
1
L.A.R.O. MACÊDO, 1E.M. LAVOR, 1M.G. Realização
SILVA, 1R.L. MENDES, 1J.C. SILVA,
Patrocínio
1
2
3
Inscrições H.C.C.
e Contatos
SARAIVA, S.R.G. LIMA-SARAIVA, A.G.M. PACHECO, 4F.L.T. AQUINO, 4
Mi
1 de Pós-Graduação
Site: http://www.wix.com/segundoebit/ufpe
Programa
J.N.S. FERRO, 4E.O. BARRETO,
J.R.G.S. ALMEIDA
E-mail: [email protected]
em Inovação Terapêutica
1
Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do Vale do São Francisco.
[email protected]
2
Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de
Pernambuco.
3
Laboratório de Fitoquímica, Universidade Estadual de Feira de Santana.
4
Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Universidade Federal de Alagoas.
RESUMO
Foram analisadas as alterações histopatológicas nos fígados e rins dos camundongos
sob tratamento agudo com as Frações Hexânica (FH) e Clorofórmica (FC), obtidas por
partição de Selaginella convoluta. Foram utilizados 36 camundongos Swiss, para cada fração,
subdivididos em 3 grupos, nos quais se administrou por via intraperitoneal (i.p), soro
fisiológico à 0,9%, e os extratos nas doses de 400 mg/kg e 2.000 mg/kg. Após 14 dias, os
animais foram eutanasiados e os órgãos foram seccionados e processados conforme os
métodos habituais. Foram observadas alterações hepáticas e renais caracterizadas por resposta
inflamatória e fibrose tissular nos animais tratados. Estes resultados ressaltam a importância
de estudos toxicológicos de longa duração com os extratos obtidos da espécie.
INTRODUÇÃO
Os produtos naturais de origem vegetal são importantes fontes de substâncias
potencialmente ativas. Nesse contexto, Selaginella convoluta (Selaginellaceae) é uma planta
medicinal encontrada no Nordeste do Brasil, popularmente conhecida como "jericó", sendo
utilizada na medicina popular como antidepressivo, diurético, afrodisíaco, analgésico e antiinflamatório. Entretanto, não há estudos que comprovem a segurança de seu uso (ALMEIDA
et al, 2013).
Durante a fase pré-clínica em modelos com animais de experimentação, a toxicidade
pode ser avaliada através da realização de estudos histopatológicos, para determinação de
lesões celulares e teciduais. Esse estudo é de fundamental importância pois caracteriza os
efeitos deletérios decorrentes da administração em concentração capaz de provocar efeitos
tóxicos (EATON; KLAASSEN, 1996).
197
Nos estudos com finalidade farmacotoxicológica, o fígado e os rins são órgãos
constantemente avaliados, pois além de serem vitais, são órgãos envolvidos na metabolização
e excreção da maioria dos compostos, experimentalmente administrados, sendo assim alvos
de toxicidade induzida por xenobióticos. Os modelos animais são necessários para identificar
as possíveis lesões provocadas pela ação direta ou de produtos gerados por biotransformação
após administração dessas substâncias (FOLGUEIRA; BRENTANI, 2004)
OBJETIVOS
Com o intuito de conhecer uma eventual toxicidade e contribuir com o perfil de
segurança da espécie, o objetivo do estudo foi avaliar histopatologicamente o efeito da
administração aguda das frações obtidas por partição (FH e FC) de S.convoluta sobre fígado e
rim de camundongos albinos Swiss.
MATERIAIS E MÉTODOS
O material vegetal foi coletado em março de 2012 (09º 03’ 54.2”S, 40º 19’ 11.7”W)
no Campo Experimental da Embrapa Semiárido, município de Petrolina-PE. Uma exsicata da
espécie foi codificada (19203) e depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) no
Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD) na UNIVASF. O
processamento do material vegetal foi feito através de metodologia habitual (OLIVEIRA
JUNIOR et al, 2012)para obtenção do Extrato Etanólico Bruto e a partir deste foi feita a
partição com solventes em gradientes de polaridade crescente (hexano e clorofórmio).
Os animais foram fornecidos pelo Biotério Setorial da Univasf, mantidos sob
condições ambientais padronizadas (22 ± 2° C e ciclo claro/escuro de 12 horas) e alimentados
com ração e água potável à vontade. Os protocolos experimentais obedeceram aos atuais
preceitos éticos e técnicos tendo sido aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA) mediante certidão № 0003/17072012.
Foram utilizados 72 camundongos (n=36 para cada fração) subdivididos em 3 grupos
(n=6, para cada sexo, 25-35g), nos quais se administrou via intraperitoneal, soro fisiológico à
0,9%, e (FH ou FC) nas doses de 400 mg e 2.000 mg/kg, em dose única, sendo observados
durante 14 dias. A coleta das vísceras (fígado e rins) ocorreu no décimo quinto dia após o
tratamento e foi feita pela eutanásia de dois dos animais sobreviventes de cada grupo. As
secções teciduais foram fixadas em formalina tamponada e após 24 horas, resseccionadas para
processamento histopatológico: desidratação com séries crescentes de álcool (70 a 100%)
seguida de diafanização em xilol, impregnação e inclusão em parafina. Em micrótomo, os
fragmentos tissulares foram seccionados a uma espessura de 5m com subsequente coloração
por hematoxilina-eosina para exame microscópico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não foram identificadas alterações histológicas nos grupos tratados com o veículo em
ambos os sexos e fases de S. convoluta. A avaliação hepática revelou estrutura e coloração
lobular preservadas e nos rins, arquitetura normal com pirâmides medulares recobertas por
198
tecido cortical. O córtex apresentou glomérulos regularmente distribuídos. Nos animais
tratados com FH na dosagem de 400 mg/kg, os fígados apresentaram processo inflamatório
difuso e com discretas regiões necróticas. Normalmente, os infiltrados apresentam maior
densidade celular próximas as veias centro-lobulares, mas não houve destruição do
parênquima hepático. Já aqueles tratados com a maior dose (2.000 mg/kg) apresentaram
hepatócitos com múltiplas vesículas no citoplasma, sugestiva de esteatose além de um
aumento no número de células inflamatórias. Nos animais tratados com FC, na dose de 400
mg/Kg os fígados apresentaram pequenos focos inflamatórios e vasos hiperêmicos.
Entretanto, na maior dose, foram observadas extensas áreas de fibrose e discretas regiões de
necrose. Em relação a avaliação renal, não houve alterações dignas de nota, nos animais
tratados com FH. Aqueles tratados com FC apresentaram processo inflamatório e pequena
região de destruição tecidual com infiltrado inflamatório cortical bem como presença de
microvesículas no citoplasma das células ao redor dos túbulos contorcidos.
A
B
Figura1: Fotomicrografias representativas do histopatológico de rim e fígado de animais tratados com extratos
na dose de 2.000 mg/ Kg. A seta indica um discreto infiltrado inflamatório em corte de rim (A) e fígado (B).
CONCLUSÕES
A avaliação histopatológica evidenciou alterações morfológicas em maior grau nos
animais tratados com a maior dose experimental (2.000 mg/kg). Essa dose corresponde a 5
vezes a maior dose terapêutica do estudo de Sa et al. (2012). Tal fato aponta para um
significado clínico que pode ser compreendido mais como resultado de uma sobrecarga dos
órgãos que como consequência de uma ação tóxica significativa do extrato. Dessa forma,
extratos de S. convoluta podem ser utilizados em dosagens inferiores a 400 mg/Kg devido ao
menor grau e extensão das lesões em fígado e rins Ainda assim, ressalta-se a importância de
estudos toxicológicos de longa duração com as fases de S.convoluta para melhor caracterizar
o perfil de segurança dessa espécie.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi financiado pelas agências de fomento CNPq e FACEPE. Os autores
desejam expressar seus agradecimentos ao Centro de Referência e Recuperação de Áreas
Degradadas (CRAD/UNIVASF) e a Embrapa Semiárido pela coleta e identificação da planta.
199
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALMEIDA, J. R. G. S. ; SA, P. G. S. ; MACEDO, L. A. R. O. ; SIQUEIRA FILHO, J. A. ;
OLIVEIRA, V. R. ; BARBOSA FILHO, J. M. . Phytochemistry of the genus Selaginella
(Selaginellaceae). Journal of Medicinal Plant Research, v. 7, p. 1858-1868, 2013.
EATON, D.L.; KLAASSEN, C.D. Principles of toxicology. In: Klaassen, C.D.; Amdur,
M.O.; Doull, J. (eds.). Cesarett and Doull’s Toxicology. The basic science of poisons. 5.ed.
New York: McGraw-Hill, 1996, p.13-34, 1996.
FOLGUEIRA, M. A. A. K; BRENTANI, M. M. Câncer de mama. In: FERREIRA, C. G.;
ROCHA, J. C. Oncologia molecular. Editora Atheneu, São Paulo, p. 135-144, 2004.
MIDDENDORF, P.J.; WILLIAMS, P.L. Nephrotoxicity: Toxic Responses of the Kidney. In:
WILLIAMS, P.L.; JAMES, R.C.; ROBERTS, S. M. Principles of toxicology:
environmental and industrial applications. A Wiley-Interscience
Publication, Second Edition. New York, cap. 5, p. 120- 25, 2000.
OLIVEIRA JUNIOR, R. G. ; ARAÚJO, C. S. ; SANTANA, C. R. R. ; SOUZA, G. R. ;
LIMA-SARAIVA, S. R. G. ; GUIMARAES, A. L. ; OLIVEIRA, A. P. ; SIQUEIRA FILHO,
J. A. ; PACHECO, A. G. M. ; ALMEIDA, JACKSON ROBERTO GUEDES DA SILVA .
Phytochemical screening, antioxidant and antibacterial activity of extracts from the flowers of
Neoglaziovia variegata (Bromeliaceae). Journal of Chemical and Pharmaceutical
Research, v. 4, p. 4489-4494, 2012
SA, P. G. S. ; NUNES, X. P. ; LIMA, J. T. ; SIQUEIRA FILHO, J. A. ; FONTANA, A. P. ;
QUINTANS, J. S. S. ; QUINTANS-JUNIOR, L. J. ; DAMASCENO, P. K. F. ; BRANCO, C.
R. C. ;BRANCO, A. ; ALMEIDA, J. R. G. S. . Antinociceptive effect of ethanolic extract of
Selaginella convoluta in mice. BMC Complementary and Alternative Medicine, v. 12, p.
1-7, 2012.
200
ANEXOS
ANEXO A – Folha de aprovação do Comitê de Ética
201
ANEXO A – Folha de aprovação do Comitê de Ética
202
ANEXO B – Tabela de triagem comportamental
Triagem Farmacológica
(Modelo retirado de Almeida et al., 1999)
PLANTA UTILIZADA:_______________________ DOSES:_____________DATA:____/_____/_____
VIA DE ADMINISTRAÇÃO:_____________________ANIMAIS:______________________________
RESPONSÁVEL TÉCN.:_______________________________ GRUPOS:________________________
ATIVIDADE FARMACOLÓGICA
Quantificação dos efeitos
(0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso
até 30`
1h
2h
3h
4h
1 - SNC
a - Estimulante
Hiperatividade
Irritabilidade
Agressividade
Tremores
Convulsões
Piloereção
Movimento intenso das vibrissas
Outras_____________________
b - Depressora
Hipnose
Ptose
Sedação
Anestesia
Ataxia
Reflexo do endireitamento
Catatonia
Analgesia
Resposta ao toque diminuído
Perda do reflexo corneal
Perda do reflexo auricular
c - Outros comportamentos
Ambulação
Bocejo excessivo
Groming
Rearing
Escalar
Vocalizar
Sacudir a cabeça
Contorções abdominais
Abdução das patas do trem posterior
Pedalar
Estereotipia
2 - SN AUTÔNOMO
Diarréia
Constirpação
Defecação aumentada
Respiração forçada
Lacrimejamento
Micção
Salivação
Cianose
Tono muscular
Força para agarrar
3 - MORTE
obs.:_________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ___________

efeito antinociceptivo das frações hexânica e clorofórmica de

Transcrição

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