Tese Doutorado

Transcrição

Tese Doutorado

Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Odontologia
Wilson Rosalem Junior
Efeito do tratamento periodontal não cirúrgico em pacientes com
periodontite crônica e agressiva: achados microbiológicos e imunológicos
Rio de Janeiro
2010
Efeito do tratamento periodontal não cirúrgico em pacientes com periodontite crônica e
agressiva: achados microbiológicos e imunológicos
Tese apresentada, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor, ao Programa de
Pós-Graduação
em
Odontologia,
da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área
de concentração: Periodontia.
Orientador: Prof. Carlos Marcelo da Silva Figueredo
Rio de Janeiro
2010
Efeito do tratamento periodontal não cirúrgico em pacientes com periodontite crônica e
agressiva: achados microbiológicos e imunológicos
Tese apresentada, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor, ao Programa de
Pós-Graduação
em
Odontologia,
da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área
de concentração: Periodontia.
Aprovada em 29 de Março de 2010.
Orientador:
_____________________________________________
Prof. Carlos Marcelo da Silva Figueredo
Faculdade de Odontologia da UERJ
Banca Examinadora:
_____________________________________________
Prof. Fábio Ramôa Pires
_____________________________________________
Prof. Jonas Capelli Junior
_____________________________________________
Prof. Milton de Uzeda
Departamento de Microbiologia Médica da UFRJ
_____________________________________________
Prof. Ricardo Guimarães Fischer
_____________________________________________
Prof. Ricardo Palmier Teles
Forsyth Institute –Boston – EUA
Rio de Janeiro
2010
DEDICATÓRIA
A minha esposa Mônica e meu filho Bernardo, com quem mais aprendo no
meu dia-a-dia, amo muito vocês.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela saúde e força de vontade para realizar tudo na minha vida.
Aos meus queridos pais, Catarina e Wilson (in memorium), e meus irmãos Marcos e
Viviane, pessoas que sempre estarão ao meu lado, e são a base do que sou hoje.
Ao professor Ricardo Teles, exemplo de pessoa e profissional, mestre desde minha
época de graduação, e hoje um grande amigo, a quem devo a escolha pela periodontia e
responsável em grande parte por tudo que tenho e conquistei na Odontologia, obrigado por
acreditar em mim.
Ao meu orientador, Professor Carlos Marcelo, pela sua lealdade e amizade; sua
dedicação e confiança, exemplos que enriqueceram minha formação.
Ao professor Ricardo Fischer, exemplo de profissional, pela oportunidade de
desenvolver minha pesquisa, e atenção prestada sempre que necessário, assim como por ter
aceitado o convite para fazer parte de minha banca examinadora.
Ao grande amigo e peça fundamental no decorrer do curso de doutorado Bruno
Rescala, incansável e sempre disposto a encarar desafios, valeu mesmo meu camarada,
continue assim .
A equipe de periodontia da Unesa, Bruno, Fábio, Rodrigo, Vivian e Antonieta, que
vestem a camisa e foram fundamentais nessa etapa da minha formação.
As equipes de clínica Odontológica II e IV da Unesa, por terem me apoiado e ajudado
quando mais precisei, muito obrigado.
Aos amigos Humberto, Renata, Andréia e Leonardo, sei que com vocês poderei contar
para sempre, muito obrigado por tudo que fizeram e fazem por mim até hoje.
Ao professor Milton Uzeda, pelo eterno apoio e incentivo desde os tempos de Escola
Técnica.
Ao professor Jonas Capelli, por fazer parte da minha formação e ter aceito o convite
para participar dessa banca examinadora.
Ao professor Fábio Ramoa, profissional extremamente competente por ter aceito o
convite para fazer parte dessa banca examinadora.
A amiga Cris Canavarro, parceira até os últimos minutos da confecção dessa tese.
Aos meus eternos amigos do peito, Chaurê, Machado e Gustavo por acreditarem em
mim e sempre me apoiarem.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para esse estudo.
A persistência é o caminho do êxito.
Charles Chaplin
RESUMO
ROSALEM Jr.,Wilson. Efeito do tratamento periodontal não cirúrgico em pacientes com
periodontite crônica e agressiva: achados microbiológicos e imunológicos. 2010. 62f. Tese
(Doutorado em Odontologia) - Faculdade de Odontologia, Universidade do Estado do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
O objetivo do presente estudo foi comparar a expressão de IL-1β, IL-4, IL-8,
interferon-γ, atividade de elastase e a composição do perfil microbiano subgengival antes e
depois do tratamento periodontal não cirúrgico em pacientes com doença peridontal crônica
generalizada (PC) e agressiva generalizada (PA). Vinte pacientes com PC e quatorze com PA
foram avaliados. Dados clínicos, fluido gengival e biofilme subgengival foram analisados na
visita inicial (VI) e 3 meses (3M) após o tratamento periodontal não cirúrgico. Amostras de
fluido gengival (FG) foram coletadas com tiras de papel e os níveis de: IL-1, IL-4, IL-8 e
INF- foram medidos, utilizando um tipo de imunoensaio multiplexado (Luminex). Atividade
da elastase foi avaliada por um ensaio enzimático. Amostras de placa subgengival foram
analisadas através do checkerboard DNA-DNA hybridization. Na avaliação de 3 meses após
terapia periodontal foi encontrado melhora significativa para todos os parâmetros clínicos em
ambos os grupos. Foram encontradas reduções significativas na atividade de elastase nos
sítios rasos e profundos dos pacientes do grupo PA e nos sítios profundos do grupo PC,
também foi achado um aumento significativo de INF-γ nos sítios rasos do grupo PA. Os
dados microbiológicos, mostraram reduções significativas para os níveis dos membros do
complexo vermelho (P. gingivalis, T. forsythia, T.denticola), e para as espécies E.nodatum e
P.micra no grupo PC. No grupo PA, ocorreram reduções significativas no níveis de P.
gingivalis, T. forsythia, Fusobacterium nucleatum ss polymorphum e Fusobacterium
periodonticum. Quando as respostas clínica e imunológica 3M após terapia foram comparadas
entre os grupos, apenas diferenças sutis foram observadas. Nenhuma diferença microbiológica
foi encontrada entre os grupos após a terapia. Em conclusão, os achados suportam nossa
hipótese de que as periodontites cronica e agressiva respondem de forma semelhante ao
tratamento periodontal nao cirúrgico.
Palavras-chave: Periodontite crônica. Periodontite agressiva. Fluido do sulco gengival.
Checkerboard DNA-DNA hybridization. Citocinas. Microbiota subgengival.
ABSTRACT
Our aim was to compare the expression of IL1β, IL-4, IL-8, INF-γ, elastase activity
and the composition of the subgingival microbiota profile before and after non-surgical
periodontal treatment in patients with untreated generalized chronic (GCP) and aggressive
periodontitis (GAgP). Twenty patients with GCP and 14 with GAgP were evaluated. Clinical
data, GCF and plaque were analyzed at baseline and 3 months after non-surgical periodontal
treatment. IL-1, IL-4, IL-8 and INFγ were analyzed in a luminex assay. Elastase activity was
assessed by an enzymatic assay. Subgingival plaque samples were analyzed using
checkerboard DNA-DNA hybridization. Three months after periodontal therapy significant
improvement for all clinical parameters in both groups were found. We have found significant
reductions in the elastase activity in shallow and deep sites from GAgP and in deep sites from
GCP group. A significant increase in INF-γ in the shallow sites from GAgP group were also
found. Microbiological data showed significant reductions in the levels of members of the red
complex (P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola), and for the species E.nodatum and P.micra
on GCP group. In the GAgP group, there were significant reductions in levels of P. gingivalis,
T. forsythia, Fusobacterium nucleatum and Fusobacterium polymorphum ss periodonticum.
When the clinical and immunological responses after therapy were compared between groups,
only slight differences were found. No microbiological difference was found between groups
after therapy. In conclusion, the findings support our hypothesis that the chronic and
aggressive periodontitis respond equally well to non-surgical periodontal treatment.
Keywords: Chronic periodontitis. Aggressive periodontitis. Gingival crevicular fluid.
Checkerboard DNA-DNA hybridization. Cytokines. Subgingival microbiota.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Gráfico 1 –
Gráfico 2 –
Gráfico 3 –
Gráfico 4 –
Figura 1 –
Diagrama de caixa para os níveis de IL-4, IL-8, INF-γ e IL-1β e
atividade da elastase nos sítios rasos do grupo periodontite crônica. A
caixa inclui os 50% dos dados centrais, a borda inferior corresponde ao
percentil 25, a borda superior ao percentil 75 e a linha dentro da caixa
a mediana (percentil 50). Os bigodes (“whiskers”) mostram os
percentis 10 e 90 e os circulos indicam valores dispersos (“outliers”)....
56
atividade da elastase nos sítios rasos do grupo periodontite agressiva.
A caixa inclui os 50% dos dados centrais, a borda inferior corresponde
ao percentil 25, a borda superior ao percentil 75 e a linha dentro da
caixa a mediana (percentil 50). Os bigodes (“whiskers”) mostram os
percentis 10 e 90 e os circulos indicam valores dispersos (“outliers”)....
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atividade da elastase nos sítios profundos do grupo periodontite
crônica. A caixa inclui os 50% dos dados centrais, a borda inferior
corresponde ao percentil 25, a borda superior ao percentil 75 e a linha
dentro da caixa a mediana (percentil 50). Os bigodes (“whiskers”)
mostram os percentis 10 e 90 e os circulos indicam valores dispersos
(“outliers”)................................................................................................
58
atividade da elastase nos sítios profundos do grupo periodontite
crônica. A caixa inclui os 50% dos dados centrais, a borda inferior
corresponde ao percentil 25, a borda superior ao percentil 75 e a linha
dentro da caixa a mediana (percentil 50). Os bigodes (“whiskers”)
mostram os percentis 10 e 90 e os circulos indicam valores dispersos
(“outliers”)................................................................................................
59
A média dos níveis de 40 espécies (x 105) testadas em 20 indivíduos
com periodontite crônica generalizada (PC) na visita inicial e 3 meses
após tratamento periodontal (painel esquerdo), bem como em 14
indivíduos com periodontite agressiva generalizada (PA, painel
direito). Contagens médias de cada espécie foram calculados em cada
indivíduo e, em seguida, a média para cada grupo, em cada visita,
calculada separadamente. Significância das diferenças entre a
avaliação inicial e 3 meses foi determinada utilizando o teste Wilcoxon
signed ranks, com * p <0,05 ** p <0,01. As espécies foram ordenados
e agrupados de acordo com os complexos descritos por Socransky et
al. (1998)..................................................................................................
60
Figura 2 –
Gráfico de torta demonstrando o percentual médio dos complexo
definidos por Socransky et al. 1998 nos grupos periodontite crônica
(PC) e periodontite agressiva (PA) na visita inicial (VI) e 3 meses (3M)
após a terapia. Mudanças ao longo do tempo foram comparadas
usando o teste Wilcoxon signed rank, *p<0.05; **p<0.01 ajustando
para comparações múltiplas. O tamanho das tortas reflete a média da
quantidade total de DNA nos dois grupos antes e depois da terapia e os
valores de p a comparação entre essas médias usando o teste Wilcoxon
signed rank ..............................................................................................
61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 –
Tabela 2 –
Tabela 3 –
Tabela 4 –
Tabela 5 –
Tabela 6 –
Média (± DP) dos parâmetros clínicos e demográficos para os indivíduos
com periodontite crônica e agressiva .........................................................
52
Média (± DP) dos parâmetros clínicos para o grupo periodontite crônica
na visita inicial e 3 meses após terapia......................................................
52
Média (±DP) dos parâmetros clínicos para o grupo periodontite agressiva
na visita inicial e 3 meses após terapia.......................................
52
Média (± DP) dos parâmetros clínicos para os sítios rasos e profundos de
onde as amostras de fluido gengival foram coletadas nos grupos
periodontite crônica e periodontite agressiva na visita inicial e 3 meses
após terapia ................................................................................................
53
Mediana e intervalo interquartílico dos parâmetros bioquímicos medidos
no fluido gengival de sítios rasos e profundos nos grupos periodontite
crônica e periodontite agressiva na visita inicial e 3 meses após
terapia...........................................................................................................
54
Mediana e intervalo interquartílico das diferenças nos parâmetros
clínicos e bioquímicos entre a visita inicial e 3 meses após terapia nos
sítios rasos e profundos nos grupos periodontite crônica e periodontite
agressiva......................................................................................................
55
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAP –
Academia Americana de Periodontologia
Abs –
Absorbância
et al –
e outros
FG –
Fluido gengival
IG –
Índice Gengival
INFγ –
Interferon γ
IL-1β –
Interleucina 1β
IL-2 –
Interleucina 2
IL-3 –
Interleucina 3
IL-4 –
Interleucina 4
IL-8 –
Interleucina 8
mAbs –
Miliabsorbância
ml –
Mililitro
mm –
Milímetros
mM –
Milimolar
ng –
Nanograma
NIC –
Nível de inserção clínico
PA –
Periodontite agressiva generalizada
PBS –
Profundidade de bolsa à sondagem
PC –
Periodontite crônica generalizada
pg –
Picograma
SS –
Sangramento à sondagem
Th1 –
Célula “T helper”auxiliar 1
Th2 -
Célula “T helper”auxiliar 2
TNF- α –
Fator de necrose tumoral
µl –
Microlitro
VI –
Visita inicial
3M –
3 meses
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO.............................................................................................
14
1
REVISÃO DA LITERATURA.....................................................................
16
1.1
Características das doenças periodontais crônica e agressiva...................
16
1.2
Microbiologia da periodontites crônica e agressiva....................................
17
1.3
Mediadores inflamatórios e a terapia periodontal não cirúrgica..............
21
2
PROPOSIÇÃO...............................................................................................
26
3
MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................
27
3.1
Seleção de pacientes e exame clínico.............................................................
27
3.2
Coleta de fluido gengival...............................................................................
28
3.2.1
Quantificação dos mediadores pelo método Luminex...................................
29
3.2.2
Atividade de elastase......................................................................................
29
3.3
Coleta Microbiológica....................................................................................
30
3.3.1
Checkerboard DNA-DNA hybridization........................................................
30
3.4
Análise Estatística…………..………………………………………………
32
4
RESULTADOS...............................................................................................
34
4.1
Parâmetros Clínicos.......................................................................................
34
4.2
Parâmetros Imunológicos..............................................................................
34
4.3
Achados Microbiológicos...............................................................................
35
5
DISCUSSÃO....................................................................................................
36
6
CONCLUSÕES...............................................................................................
39
REFERÊNCIAS.............................................................................................
40
ANEXO A - Comitê de ética em pesquisa.......................................................
62
14
INTRODUÇÃO
As doenças periodontais são o resultado da resposta inflamatória a microrganismos
localizados no biofilme subgengival. A resposta pode ser confinada aos tecidos gengivais ou
pode progredir, levando a uma perda de inserção de suporte periodontal. Tem sido sugerido
que a progressão da doença é o resultado de uma combinação de fatores, incluindo a presença
de bactérias periodontopatogêncas e altos níveis de citocinas pró-inflamatórias (GEMMELL ;
SEYMOUR, 2004) . Pacientes com periodontite agressiva são caracterizados por uma rápida
progressão e avançada destruição periodontal, principalmente em indivíduos mais jovens
(MENG et al., 2007), enquanto que a periodontite crônica, forma mais comum da doença, é
caracterizada por uma baixa e lenta taxa de progressão (SCHATZLE et al., 2009). No entanto,
ambas formas podem alcançar uma forma grave e levar à perda dentária e ao edentulismo.
Várias citocinas pró-inflamatórias têm sido associadas com as formas avançadas da
doença periodontal crônica e agressiva, como a IL-1β (FIGUEREDO et al., 1999;
GIANNOPOULOU; KAMMA ; MOMBELLI, 2003; TOKER; POYRAZ ; EREN, 2008), IL2 (REICHERT et al., 2009; THUNELL et al., 2009), IL-8 (GIANNOPOULOU; KAMMA ;
MOMBELLI, 2003), e INF-γ (LESTER et al., 2007; DUTZAN et al., 2009; THUNELL et
al., 2009). Entretanto, a literatura carece e diverge em alguns estudos que comparam
periodontite crônica e agressiva em relação aos efeitos do tratamento periodontal na redução
de tais citocinas. Em um deles, os autores mostraram que após terapia periodontal a
quantidade total de IL-1β foi reduzida, enquanto que a concentração aumentou gradualmente
(GOUTOUDI; DIZA ; ARVANITIDOU, 2004). Em outro trabalho, apesar da melhora dos
parâmetros clínicos após a terapia periodontal a quantidade de IL-1β aumentou ligeiramente
no fluido gengival (YOSHINARI et al., 2004). A citocina anti-inflamatória IL-4 tem sido
associada com a remissão ou melhora da doença periodontal (PRADEEP; ROOPA ; SWATI,
2008) . Sendo assim, o desequilíbrio entre citocinas pró e anti-inflamatórias pode ser crucial
para a progressão e avanço da doença periodontal.
Simultaneamente grandes quantidades de elastase de neutrófilos ativados são liberadas
no periodonto inflamado. A elastase neutrofílica pode contribuir para iniciação e progressão
da destruição tecidual na periodontite (UJIIE et al., 2007; UJIIE et al., 2008). Vários estudos
têm mostrado aumentos na quantidade e atividade de elastase no fluido gengival de sítios com
periodontite crônica (GUSTAFSSON; ASMAN ; BERGSTROM, 1994; INGMAN et al.,
1996; FIGUEREDO ; GUSTAFSSON, 1998a). Em um estudo anterior, foi demonstrado que
15
mais elastase permanece ativa no fluido gengival de sítios com bolsas profundas e maiores
perdas de inserção (FIGUEREDO ; GUSTAFSSON, 1998a). Alguns autores sugeriram que o
tratamento eficaz da doença periodontal pode ser medido com o uso de marcadores
bioquímicos de atividade de neutrófilos, tanto na periodontite agressiva como na crônica
(BUCHMANN et al., 2002).
Foi demonstrado em um trabalho prévio que o controle
mecânico de infecção pode reduzir a atividade de neutrófilos na periodontite crônica
generalizada (FIGUEREDO et al., 2004).
O controle mecânico da infecção tem se mostrado eficiente em estabilizar a progressão
da periodontite, mesmo nos casos mais avançados (BADERSTEN; NILVEUS ; EGELBERG,
1984a). Remoção mecânica do biofilme subgengival é importante para controlar a expressão
de marcadores inflamatórios e bactérias periodontopatogênicas (SBORDONE et al., 1990). A
presença de Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas
gingivalis são importantes para o estabelecimento e progressão da destruição periodontal,
tanto na periodontite crônica como na agressiva (XIMENEZ-FYVIE; HAFFAJEE ;
SOCRANSKY, 2000; TELES et al., 2008; FAVERI et al., 2009) . Diversos estudos têm
mostrado que o tratamento periodontal pode reduzir a carga bacteriana nas áreas com bolsas
(CARVALHO et al., 2005; HAFFAJEE; PATEL ; SOCRANSKY, 2008; SWIERKOT et al.,
2009). No entanto, para alcançar sucesso clínico, as alterações microbiológicas devem ocorrer
em conjunto com a redução da inflamação.
Os dados existentes na literatura relacionando mudanças nos níveis de citocinas,
especialmente em fluido gengival, em conjunto com alterações/reduções microbiológicas
também são limitados. Adicionalmente, estes dados são ainda mais escassos quando
comparamos indivíduos com periodontite crônica e agressiva submetidos à terapia
periodontal.
Nossa hipótese principal é que as formas avançadas de doença periodontal crônica e
agressiva são similares clinicamente, microbiologicamente e imunologicamente e, portanto
devem responder de forma semelhante ao controle mecânico da infecção. Para testar essa
hipótese, o presente estudo teve como objetivo comparar a expressão de IL-1 β, IL-4 , IL-8,
INF-γ e elastase no fluido gengival em diferentes categorias de sítios e a composição da
microbiota subgengival antes e depois do tratamento não-cirurgico de pacientes com formas
generalizadas de periodontite crônica e agressiva.
16
1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Características das doenças periodontais crônica e agressiva
As doenças periodontais estão entre as doenças crônicas mais comuns do ser humano,
afetando de 5 a 30% da população adulta na faixa etária de 25 a 75 anos. Tais patologias estão
entre as mais importantes causas de dor, desconforto e perda dos dentes em adultos (ROSE;
STEINBERG ; MINSK, 2000).
Segundo o Workshop da academia americana de periodontia, as principais doenças
periodontais são classificadas em doenças gengivais (gengivites) e periodontites. As primeiras
são caracterizadas por uma inflamação gengival sem perdas de estruturas de suporte (inserção
clínica) e sem evidências radiográficas de perda óssea alveolar. Já as periodontites são
classificadas em crônica e agressiva, com diversos níveis de destruição tecidual (leve,
moderado e avançado) e localização (localizadas e generalizadas), se caracterizando não só
pela inflamação gengival, como pela destruição de fibras colágenas (ligamento periodontal) e
osso alveolar (ARMITAGE, 1999).
A periodontite crônica é a forma de doença periodontal destrutiva mais comum em
indivíduos adultos, embora também possa acometer jovens. Suas características clínicas
incluem inflamação gengival (alterações de cor e textura), sangramento à sondagem de áreas
com bolsa periodontal, perda clínica de inserção e osso alveolar. A doença é iniciada com
uma gengivite, mas sintomas como perda de inserção e perda óssea só são evidenciados anos
mais tarde. A patologia, na grande maioria das vezes, progride lentamente com surtos de
exacerbação. A quantidade de destruição periodontal está diretamente relacionada com a
presença de fatores irritantes locais, tais como grau de higiene oral do paciente, quantidade de
biofilme e cálculo dental (biofilme dental mineralizado), bem como a presença de fatores de
risco associados a uma maior suscetibilidade do hospedeiro. A composição da microbiota é
complexa é varia bastante entre os pacientes, porém a presença de cálculo subgengival é um
achado comum (ARMITAGE, 1999) .
As periodontites agressivas compreendem um grupo raro (aproximadamente 1% da
população), muitas vezes avançado, de uma doença de progressão rápida, geralmente
caracterizada pela pouca idade (jovens) dos pacientes e tendência a agregação familiar (PAGE
et al., 1983) . De acordo com a classificação da academia americana de periodontia, a
17
periodontite agressiva não está relacionada a nenhuma condição sistêmica, a quantidade de
depósitos microbianos não está diretamente relacionada com a avançada destruição dos
tecidos periodontais, e as espécies A. actinomycetemcomitans e P. gingivalis são geralmente
encontradas (ARMITAGE, 1999). Contudo, por ser uma doença multifatorial, não somente a
resposta inflamatória e os aspectos microbiológicos estão envolvidos, mas também condições
ambientais e fatores genéticos mostram forte associação com a doença periodontal agressiva.
Como uma condição singular, alguns relatos têm enfatizado a atividade dos leucócitos
polimorfonucleares e os achados microbiológicos, indicando um relevante papel dessas
células e microrganismos específicos na patogênese da periodontite agressiva (COLOMBO et
al., 1998; TINOCO; SIVAKUMAR ; PREUS, 1998; TREVILATTO et al., 2002).
Uma característica clínica importante para o diagnóstico das doenças periodontais é a
formação da bolsa periodontal, que se dá em função de um aprofundamento patológico do
sulco gengival, resultante da resposta inflamatória ao acúmulo prolongado de biofilme e
cálculo, com a migração apical do epitélio juncional ao longo da raiz do dente, destruição de
fibras conjuntivas e reabsorção do osso alveolar. Essas bolsas periodontais profundas servem
como reservatórios para bactérias periodontopatogênicas, as quais podem futuramente
colonizar outros sítios periodontais (SOCRANSKY et al., 1998).
1.2 Microbiologia das periodontites crônica e agressiva
Durante a busca pelos agentes etiológicos da doença periodontal, vários patógenos,
assim como espécies associadas à saúde periodontal foram identificadas
(DZINK;
SOCRANSKY ; HAFFAJEE, 1988; CHRISTERSSON et al., 1992; MOORE ; MOORE,
1994).
O diagnóstico microbiano preciso de uma doença infecciosa é um passo crítico afim
de estabelecer estratégias terapêuticas eficazes. No caso das infecções periodontais, esta não é
uma tarefa simples, porque o início e a progressão da doença não está relacionada apenas com
a presença de um microrganismo específico, mas sim com o desequilíbrio entre níveis e
proporções de patógenos periodontais e as espécies benéficas em diferentes sítios da boca
(SOCRANSKY ; HAFFAJEE, 2005).
O desenvolvimento de novas técnicas moleculares que permitiram identificação e
quantificação de um grande número de microorganismos e amostras foi muito importante no
18
estabelecimento de perfis microbianos específicos associados a saúde ou doença periodontal
(SOCRANSKY et al., 1994; PASTER et al., 2001). O conceito de especificidade microbiana
na etiologia da doença periodontal, não é recente e foi fortalecido com as pesquisas
relacionando o A. actinomycetemcomitans com a periodontite juvenil localizada e a P.
gingivalis como um importante patógeno na periodontite crônica
(NEWMAN et al., 1976;
SLOTS, 1976; NEWMAN ; SOCRANSKY, 1977; SLOTS, 1977). Posteriormente, outras
espécies bacterianas como, T. forsythia, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens,
Fusobacterium nucleatum e espécies de Treponema foram sugeridas como possíveis
patógenos periodontais, porém seu verdadeiro papel na etiologia destas doenças não está
totalmente definido (SOCRANSKY ; HAFFAJEE, 1992).
No final da década de 90, um grupo de pesquisadores realizaram um trabalho que se
tornaria um marco para a microbiologia das doenças periodontais. Os autores utilizaram
sondas genômicas de DNA para detectar a presença de 40 espécies bacterianas no biofilme
dental subgengival de indivíduos com doença periodontal e verificar como essas comunidades
microbianas se organizavam dentro deste biofilme. Os mesmos observaram a formação de
seis grandes complexos microbianos, compostos por determinadas espécies bacterianas que
estavam presentes simultaneamente com maior freqüência. Além disso, essas comunidades
colonizavam as bolsas periodontais (biofilme subgengival) de forma bastante ordenada, tanto
em relação ao tempo de colonização quanto à disposição espacial. Esse estudo também
correlacionou a presença das bactérias que faziam parte do complexo denominado de
“vermelho” (T. forsythia, P. gingivalis e Treponema denticola) e complexo “laranja”
(Fusobacterium spp., Capnocytophaga spp., Prevotella spp.) com sinais clínicos de doença
periodontal crônica, caracterizando-as como espécies patogênicas. Por outro lado, espécies de
estreptococos, actinomicetos e Veillonella parvula foram associadas a sítios com saúde
periodontal (SOCRANSKY et al., 1998).
Resultados de investigações com estes métodos de diagnóstico têm melhorado muito
o nosso conhecimento da microbiologia de determinadas condições periodontais, tais como a
periodontite crônica (SOCRANSKY et al., 1998; COLOMBO et al., 2002; HAFFAJEE et al.,
2004; LOPEZ et al., 2004; XIMENEZ-FYVIE et al., 2006; FRITSCHI; ALBERT-KISZELY ;
PERSSON, 2008) e foram cruciais para definição de parâmetros microbianos para a terapia.
Avaliações microbiológicas da periodontite crônica têm sido realizadas em estudos
transversais e longitudinais; estes últimos foram conduzidos com e sem tratamento. Estes
estudos apóiam o conceito de que a periodontite crônica está associada a agentes bacterianos
específicos. Na periodontite crônica as bactérias encontradas e cultivadas com maior
19
freqüência em altos níveis incluem as que são membros do complexo vermelho e ainda
P.intermedia, C. rectus, E. corrodens, F. nucleatum, A. actinomycetemcomitans, Parvimonas
micra e Eubacterium (LOESCHE, 1968; SLOTS, 1979; TANNER et al., 1979; LAI et al.,
1987; SOCRANSKY ; HAFFAJEE, 1991; 1992; MOORE ; MOORE, 1994; KREMER et al.,
2000; WARA-ASWAPATI et al., 2009). Quando sítios periodontalmente ativos (com perda
de inserção recente) foram examinados, em comparação a sítios inativos (sem perda de
inserção recente), C.rectus, P.gingivalis, F.nucleatum e T.forsythia foram encontrados em
quantidades elevadas no locais ativos (DZINK; SOCRANSKY ; HAFFAJEE, 1988). Além
disso, níveis detectáveis de P.gingivalis, P.intermedia, T.forsythia, C.rectus e A.
actinomycetemcomitans estão associados à progressão da doença, e sua eliminação através do
tratamento está associada a uma melhor resposta clínica (WENNSTROM et al., 1987;
DZINK;
SOCRANSKY
;
HAFFAJEE,
1988;
SLOTS
;
LISTGARTEN,
1988;
CHRISTERSSON; ZAMBON ; GENCO, 1991; HAFFAJEE et al., 1997a) .
Estudos de microrganismos predominantemente cultiváveis em periodontite agressiva
localizada mostraram que a composição microbiana dos sítios saudáveis diferem
significativamente da dos sítios doentes, que foram fortemente colonizados por bastones gram
negativos capnofílicos, principlamente o A. actinomycetemcomitans (NEWMAN et al., 1976;
SLOTS, 1976; NEWMAN ; SOCRANSKY, 1977). Posteriormente, várias investigações
realizadas nas décadas de 80 e 90 incidiram principalmente na detecção de A.
actinomycetemcomitans mostrando sua estreita associação com a etiologia de periodontite
agressiva localizada (LOESCHE ; GROSSMAN, 2001) . Esta espécie bacteriana
foi encontrada em maiores proporções e prevalência na microbiota subgengival de indivíduos
com periodontite agressiva localizada em comparação com aqueles com periodontite crônica
ou sem doença periodontal
(SLOTS; REYNOLDS ; GENCO, 1980; MANDELL ;
SOCRANSKY, 1981; ZAMBON; SLOTS ; GENCO, 1983; BUENO; MAYER ; DIRIENZO,
1998). Recentes estudos utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) confirmaram
estes resultados (HARASZTHY et al., 2000; MULLALLY et al., 2000; HAUBEK et al.,
2002; YANG et al., 2004; FINE et al., 2007; HAUBEK et al., 2008). Em contraste, outros
autores não foram capazes de detectar maior prevalência ou proporções de A.
actinomycetemcomitans em periodontite agressiva localizada em comparação com indivíduos
com periodontite crônica (MOORE et al., 1985; HAN et al., 1991; LOPEZ; MELLADO ;
LEIGHTON, 1996; DOGAN et al., 2003; TAKEUCHI et al., 2003; GAJARDO et al., 2005).
Dados de um recente trabalho que comparou a microbiota subgengival de pacientes
com periodontite agressiva localizada, periodontite agressiva generalizada, periodontite
20
crônica e pacientes com periodonto saudável mostraram uma maior quantidade do A.
actinomycetemcomitans em pacientes com doença agressiva localizada quando comparado
com as demais. Ainda dentro desse mesmo grupo a quantidade do microrganismo era maior
em sítios rasos e moderados. Baseado em seus achados e comparando-os com os existentes na
literatura , o autor sugeriu uma associação entre o A. actinomycetemcomitans , sendo um dos
primeiros a colonizar os sítios, e o aparecimento da doença periodontal agressiva localizada, e
a presença de outras bactérias como P. gingivalis, T. forsythia, T.denticola, C. gracilis, E. e
nodatum e P. intermedia, desempenhando um papel importante na progressão da doença.
(FAVERI et al., 2009) . Em conjunto, estes dados suportam a noção que A.
actinomycetemcomitans está implicado no início da doença, no entanto, o aprofundamento
das bolsas periodontais e os aumento resultante no ambiente anaeróbio podem favorecer o
crescimento de outros agentes patogénicos, tais como as espécies de anaeróbios estritos do
complexo vermelho. Poderia também se especular que, por o A. actinomycetemcomitans não
ser particularmente resistente à concorrência bacteriana (TEUGHELS et al., 2007), a presença
de mais uma microbiota complexa pode levar a uma redução em suas proporções com o
aprofundamento das bolsas.
O papel de outras espécies bacterianas, como como P. gingivalis, T. forsythia, espécies
de Prevotella e C. rectus na etiologia das periodontite agressiva localizada também foi
sugerido. Entretanto, na maioria destes estudos, foram avaliados apenas poucas amostras e /
ou espécies de bactérias por PCR (MULLALLY et al., 2000; LEE et al., 2003; TAKEUCHI et
al., 2003; GAJARDO et al., 2005; THIHA et al., 2007), técnicas de cultura (MOORE et al.,
1985; HAN et al., 1991; LOPEZ et al., 1995; NONNENMACHER; MUTTERS ; DE
JACOBY, 2001) ou sondas de DNA (LOPEZ; MELLADO ; LEIGHTON, 1996; LEE et al.,
2003).
Os critérios microbiológicos não foram mencionados na atual classificação das
doenças periodontais como características primárias que diferenciam a periodontite crônica da
periodontite agressiva. No entanto, uma elevada proporção de A. actinomycetemcomitans, e
em algumas populações, de P. gingivalis foi reconhecido como uma das características
secundárias que são em geral, mas não universalmente presente em paciente com periodontite
agressiva.
Vários estudos têm indicado que proporções elevadas e/ou prevalência de
microrganismos subgengivais específicos como o A. actinomycetemcomitans podem
distinguir indivíduos com periodontite agressiva localizada de outros com formas
generalizadas de doença periodontal crônica e agressiva
(ZAMBON; CHRISTERSSON ;
21
SLOTS, 1983; TANNER, 1992; MULLER; LANGE ; MULLER, 1993; LOPEZ; MELLADO
; LEIGHTON, 1996; TINOCO et al., 1997). No entanto, se os perfis microbianos podem ou
não distinguir indivíduos com periodontite crônica generalizada de agressiva generalizada, é
uma questão ainda a ser respondida. Enquanto uma série de estudos têm sugerido uma
significativa diferença microbiana entre indivíduos com periodontite crônica e agressiva
(DOGAN et al., 2003; DARBY et al., 2005; SCHACHER et al., 2007), outros relataram
apenas
variações
discretas
no
perfil
microbiano
de
ambos
grupos
de
periodontite.(MOMBELLI; CASAGNI ; MADIANOS, 2002; LEE et al., 2003; XIMENEZFYVIE et al., 2006). Tal informação pode nos sugerir que tanto fatores ambientais como a
resposta do hospedeiro expliquem as diferenças na taxa de destruição tecidual observada entre
as periodontites crônicas e agressivas (CHAMPAGNE et al., 2003; MENG et al., 2007).
1.3 Mediadores inflamatórios e a terapia periodontal não cirúrgica
As bactérias contribuem na destruição dos tecidos moles e duros através da produção
de enzimas proteolíticas bem como na indução direta de proteinases do hospedeiro (DING et
al., 1996; DING et al., 1997). Além disso, os mediadores inflamatórios produzidos pelo
hospedeiro estimulam a liberação de metaloproteinases e iniciam a reabsorção óssea. Esses
mediadores, muitos dos quais podem ser detectados no fluido gengival, desempenham um
papel importante na progressão da doença periodontal. Dentre eles incluem as citocinas da
resposta imune T-helper 1 (Th1) e T-helper 2 (Th2), citocinas proinflamatórias, quimiocinas,
e reguladores da atividade de células T e células natural killer (NK) (ROBERTS;
RICHARDSON ; MICHALEK, 1997; YOSHIMURA et al., 1997; GARLET et al., 2003).
Inflamação induzida por infecção, como na doença periodontal ativa, está claramente
associada a perturbação da homeostasia tecidual e destruição óssea
(BAKER; ODDIS ;
MEDSGER, 1987; GRAVALLESE, 2002; KINDLE et al., 2006), onde os níveis aumentados
de diversas citocinas proinflamatórias tem sido associados com periodontites crônica e
agressiva (FIGUEREDO et al., 1999; JIN et al., 2002; GOUTOUDI; DIZA ;
ARVANITIDOU, 2004; KAMMA et al., 2004; TOKER; POYRAZ ; EREN, 2008; TELES et
al., 2009) . Por outro lado, o bloqueio do desenvolvimento e/ ou atividade dos osteoclastos
interrompe em grande parte a perda óssea induzida pela inflamação (TENG et al., 2000; DEN
HAAN ; BEVAN, 2002; GRAVALLESE, 2002).
22
Diversos pesquisadores na década de oitenta apresentaram um método alternativo para
o tratamento da periodontite agressiva localizada. Os mesmos, através de tratamento
periodontal cirúrgico e administração sistêmica de tetraciclina tentavam reduzir ou erradicar
substancialmente as contagens de A. actinomycetemcomitans em bolsas rasas e profundas
(SLOTS ; ROSLING, 1983; CHRISTERSSON et al., 1985).
O reconhecimento da especificidade do biofilme subgengival, da resposta do
hospedeiro frente ao desafio microbiano e de diferentes formas de doenças periodontais tem
levado pesquisadores e clínicos a um melhor entendimento desse processo patológico e,
eventualmente, à elaboração de uma terapia periodontal direcionada à supressão dos
microrganismos que as causam, e subseqüente recolonização por microrganismos compatíveis
com a saúde (SOCRANSKY ; HAFFAJEE, 1992). Sendo assim, diversos protocolos
terapêuticos, incluindo o uso de antimicrobianos têm sido empregados de forma menos
empírica e mais focada às diferentes infecções periodontais. Além disto, o acompanhamento
microbiológico e imunológico de pacientes, antes e após o tratamento, tem possibilitado uma
melhor avaliação da eficácia da terapia periodontal instituída. Normalmente, as doenças
periodontais são tratadas através do desbridamento mecânico, ou seja, raspagem e alisamento
radicular (supra e subgengivalmente), para a remoção e desorganização do biofilme e cálculo
das superfícies dentárias. Diversos são os trabalhos logitudinais que demonstram que a terapia
periodontal de suporte, em conjunto com a fase de manutenção periodontal, são efetivas,
levando a um baixo índice de perda dentária (≤ 0.1 dente perdido / ano) (BADERSTEN;
NILVEUS ; EGELBERG, 1984b; a; LINDHE ; NYMAN, 1984; NABERS et al., 1988).
Do ponto de vista microbiológico e imunológico, o objetivo ideal da terapia
periodontal é o de se reduzir os níveis de patógenos para os existentes antes da instalação da
doença, por períodos prolongados de tempo (TELES; HAFFAJEE ; SOCRANSKY, 2006), tal
proposta visa simultaneamente reduzir os níveis de mediadores inflamatórios levando a uma
melhora clínica do quadro.
Diversos são os biomarcadores descritos na literatura que mostram essa correlação, as
células Th1 secretam IL-2 e INF-γ que são críticos para a erradicação de patógenos
intracelulares, enquanto células Th2 produzem IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que são
essenciais para a produção de anticorpos e na eliminação de microrganismos extracelulares
(ABBAS; MURPHY ; SHER, 1996) . O INF-γ tem múltiplos efeitos imunorregulatórios,
medeia a defesa do hospedeiro contra a infecção e é um potente ativador de fagócitos
mononucleares (BILLIAU ; DIJKMANS, 1990). O INF-γ liberado durante as fases precoce e
tardia da resposta imune pelas células natural killer (NK) e células T ativadas,
23
respectivamente, regula vários aspectos na resposta imune (BOEHM et al., 1997). Dados
sugerem que células apresentadoras de antígeno, incluindo células dendríticas e macrófagos,
também produzam grandes quantidades de INF-γ (FRUCHT et al., 2001). Trabalhos na
literatura relataram que a concentração de INF-γ foi significativamente maior nas amostras de
soro e de biópsias de tecido gengival de pacientes com periodontite do que de controles
saudáveis, assim como também nas amostras de fluido gengival em pacientes com
periodontite crônica (GORSKA et al., 2003; DUTZAN et al., 2009).
No que diz respeito a IL-8, essa é uma citocina quimiotática produzida por uma grande
variedades de células (leucócitos polimorfonucleares, monócitos, macrófagos e fibroblastos) e
desempenha um papel fundamental no acúmulo de leucócitos nos locais de inflamação
(BAGGIOLINI ; CLARK-LEWIS, 1992; BICKEL, 1993) . Ela é responsável pela
quimiotaxia seletiva de neutrófilos no sulco gengival. Esta quimiocina foi detectada no fluido
gengival em níveis mais elevados tanto em pacientes com periodontite em comparação com
indivíduos saudáveis, como em sítios ativos comparados com sitios estáveis em paciente com
periodontite (GAMONAL et al., 2000; GIANNOPOULOU; KAMMA ; MOMBELLI, 2003).
Além disso, o nível de IL-8 no fluido também tendeu a diminuir após a terapia periodontal
(JIN et al., 2002).
Assim como as citocinas proinflamatórias, as proteinases do hospedeiro são induzidas
e liberadas frente ao desafio microbiano. Dentre as diversas enzimas proteolíticas que agem
sobre os tecido periodontais, podemos destacar a ação da elastase. Tal enzima é produzida por
neutrófilos e é capaz de degradar uma grande variedade de moléculas, incluindo a elastina, o
colágeno e a fibronectina (JANOFF, 1985). Os inibidores endógenos de elastase são
encontrados no plasma e no fluido gengival (HERRERA; ROLDAN ; SANZ, 2000). Vários
estudos têm demonstrado um aumento na atividade da elastase contra substratos específicos
de baixo peso molecular na periodontite (GUSTAFSSON; ASMAN ; BERGSTROM, 1994;
INGMAN et al., 1994) e aumento dos níveis da atividade elastase também têm sido sugeridos
como um preditor da progressão da doença (PALCANIS et al., 1992; ARMITAGE et al.,
1994). O papel dessa enzima na patogênese provavelmente, depende do equilíbrio entre a
enzima e seus inibidores no tecido local. Níveis elevados de elastase ativa no fluido gengival
estão associados à perda de inserção periodontal, assim como a ocorrência de redução da
mesma após a terapia periodontal não cirúrgica está associada com a melhora clínca
(FIGUEREDO ; GUSTAFSSON, 1998a; b; FIGUEREDO et al., 2004).
A ausência localizada de IL-4, em tecidos periodontais doentes vem sendo associada
com a atividade e progressão da doença periodontal (SHAPIRA; VAN DYKE ; HART, 1992;
24
KABASHIMA et al., 1996). A ação imunosupressora das citocinas IL-4 e IL-10 tem sido
associada com a remissão ou a melhoria pós tratamento de ambas as formas de periodontite
crônica e agressiva (GIANNOPOULOU; KAMMA ; MOMBELLI, 2003; GOUTOUDI;
DIZA ; ARVANITIDOU, 2004; PRADEEP; ROOPA ; SWATI, 2008; BASTOS et al., 2009).
Outros estudos demonstraram que baixos níveis de IL-4 em tecidos periodontais doentes estão
associados a atividade e progressão de doença (SHAPIRA; VAN DYKE ; HART, 1992;
GIANNOPOULOU; KAMMA ; MOMBELLI, 2003; TSAI et al., 2007). A IL-4 inibe a
produção IL-1β e IN-γF pelos monócitos, sendo assim, com baixos níveis de IL-4 os
monócitos secretam altos níveis de mediadores pró-inflamatórios (TE VELDE et al., 1990;
LEE; RHOADES ; ECONOMOU, 1995).
Muitas investigações nessa área concentraram-se na citocina IL-1β, devido à sua
participação na iniciação e desenvolvimento da periodontite. A IL-1β é uma glicoproteína de
17 KDa a qual é estruturalmente relacionada com a IL-1α, a outra forma de IL-1 que foi
identificada (DINARELLO, 1991). Ambas as formas possuem propriedades proinflamatórias,
porém a IL-1β é a que apresenta propriedades mais potentes (TATAKIS, 1993) . Além disso,
a IL-1β é geralmente produzida de 10-50 vezes mais do que IL-1α (TATAKIS, 1993). Sua
produção ocorre predominantemente por monócitos e macrófagos, mas também pode ser
produzida por fibroblastos e células ósseas, sendo ainda induzida por microorganismos,
produtos microbianos, agentes inflamatórios e antígenos
(MATSUKI; YAMAMOTO ;
HARA, 1991; 1992; HOROWITZ, 1993). Alguns de seus efeitos biológicos incluem a
estimulação dos linfócitos T e produção de linfocinas (MIZEL, 1982),
proliferação de
linfócitos B e produção de anticorpos (CHIPLUNKAR; LANGHORNE ; KAUFMANN,
1986), proliferação de fibroblastos, estimulação de prostaglandina (PGE2) liberada por
monócitos e fibroblastos, e a liberação de metaloproteinases que degradam as proteínas da
matriz extracelular (DEWHIRST et al., 1985). A IL-1β também induz a formação de
osteoclastos e reabsorção óssea (GOWEN ; MUNDY, 1986), e afeta a quimiotaxia e ativação
de neutrófilos assim como a função das células endoteliais (SAUDER et al., 1984;
WESTMACOTT; WADSWORTH ; BLOXHAM, 1987) .
Em pacientes com periodontite, níveis aumentados de IL-1β têm sido relatado tanto no
fluido gengival como nos tecidos periodontais (MASADA et al., 1990; REINHARDT et al.,
1993; TOKORO; YAMAMOTO ; HARA, 1996; FIGUEREDO et al., 1999) . As quantidades
de IL-1β foram estreitamente associadas com a severidade da doença periodontal, podendo
servir como um marcador de destruição dos tecidos periodontais
(MASADA et al., 1990;
ISHIHARA et al., 1997). Diversos trabalhos têm correlacionado a redução dos níveis totais
25
de IL-1β com a melhora clínica após terapia periodontal, tanto em paciente com periodontite
crônica (TUTER; KURTIS ; SERDAR, 2001; GOUTOUDI; DIZA ; ARVANITIDOU, 2004;
THUNELL et al., 2009) como com periodontite agressiva (TOKER; POYRAZ ; EREN,
2008). No entanto, até o presente momento ainda são poucos e controversos alguns resultados
dos trabalhos existentes na literatura que comparam periodontite crônica com agressiva em
relação aos efeitos do tratamento periodontal na redução de tais citocinas, pois existem
trabalhos onde apesar da melhora dos parâmetros clínicos, a quantidade de IL-1β assim como
de outras citocinas se mantiveram inalterada após a terapia periodontal (FOKKEMA et al.,
2003) e ainda em outro trabalho, apesar da melhora dos parâmetros clínicos a quantidade de
IL-1β aumentou ligeiramente no fluido gengival (YOSHINARI et al., 2004). Já em um
estudo realizado com indivíduos brasileiros, duas modalidades terapêuticas foram realizadas,
e apenas em uma delas a quantidade total de IL-1β diminuiu, enquanto o INF-γ aumentou
após a terapia periodontal (DEL PELOSO RIBEIRO et al., 2008).
26
2 PROPOSIÇÃO
O presente estudo teve como objetivo comparar a expressão de IL-1 β, IL-4 , IL-8,
INF-γ e elastase no fluido gengival, e a composição da microbiota subgengival em diferentes
categorias de sítios antes e depois do tratamento periodontal não-cirurgico de pacientes com
formas generalizadas de periodontite crônica e agressiva.
27
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Seleção de pacientes e exame clínico
Foram selecionados para o grupo teste 20 pacientes portadores de periodontite crônica
generalizada (PC) (48 ± 8 anos, 50% homens e 25% de fumantes), 14 pacientes com
periodontite agressiva generalizada (PA) (29.0 ± 7 anos, 29% homens e nenhum fumante)
classificados de acordo com a Academia Americana de Periodontia (AAP) de 1999
(ARMITAGE, 1999). Os pacientes passaram por uma prévia e criteriosa avaliação clínica
periodontal e radiográfica, deveriam possuir no mínimo 20 dentes e ter pelo menos 6 sítios
com profundidade de bolsa igual ou maior a 5 mm e perda de insercao igual ou maior que 3
mm. Nenhum dos participantes havia recebido tratamento periodontal prévio.
Os pacientes foram selecionados na Faculdade de Odontologia da UERJ. Os critérios
de exclusão foram: presença de patologia sistêmica que possa interferir com a progressão da
doença periodontal como diabetes e AIDS; doenças auto-imunes; gravidez; lactação;
utilização de medicamentos de uso prolongado nos seis meses anteriores ao início do estudo
(antibióticos, anti-histamínicos, cortisona, hormônios, nifedipina) e outros que possam
interferir com o processo inflamatório ou que possam ter efeitos adversos direto no
periodonto.
As medidas clínicas foram realizadas em 6 sítios por dente (mesio-vestibular, médiovestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, médio-lingual e disto-lingual) de cada dente
presente, exceto terceiros molares, com uma sonda periodontal da Carolina do Norte (UNC15
- Hu-Friedy Co., Chicago, EUA) por dois examinadores calibrados. Os parâmetros clínicos
avaliados foram índice de placa visível (IP), índice gengival (IG), porcentagem de
sangramento à sondagem (SS), profundidade de bolsa a sondagem (PBS) e nível clínico de
inserção (NIC). Houve uma concordância de 94,5% dentro de ± 1 milímetro para medições de
PBS e de NIC entre os 2 examinadores.
O objetivo do estudo foi explicado verbalmente, um termo de consentimento foi
assinado pelos pacientes selecionados e uma copia do protocolo resumido do projeto e do
termo de consentimento entregues aos pacientes. O protocolo do estudo foi aprovado pelo
Comitê de Ética e Pesquisa da UERJ.
28
Os pacientes receberam tratamento periodontal não cirúrgico, o qual consistiu em
instruções de higiene oral e raspagem supra e subgengival. O tratamento foi realizado em
média, em 4 sessões de 40 minutos. As raspagens e alisamentos radiculares foram realizados
com instrumentos manuais (curetas Gracey e McCall, HU-Friedy ) por um único operador.
Os instrumentos eram afiados antes de cada sessão e sempre que fosse necessário duramnte a
raspagem. A reavaliação foi feita 3 meses após o termino do tratamento periodontal não
cirúrgico.
3.2 Coleta de fluido gengival
Nos grupos PC e PA foram coletadas amostras de fluido gengival (FG) de 5 sítios
inflamados com PBS ≥ 5 mm e 5 sítios rasos inflamados com PBS ≤ 3 mm. Sítios inflamados
foram definidos como sítios apresentando sinais clínicos de vermelhidão, inchaço e/ou
sangramento à sondagem. Amostras de FG dos sítios selecionados foram coletadas após o
diagnóstico de periodontite tanto na visita inicial quanto 3 meses após o tratamento.
Os sítios coletados foram isolados com rolos de algodão, secos com ar e a placa
supragengival foi cuidadosamente removida. Uma tira de papel absorvente padrão
(Periopaper, IDE Interstate, Amityville, NY) foi introduzida no sulco ou bolsa periodontal, até
certa resistência ser sentida e foi deixada em posição por 30 segundos. O volume do fluido
gengival foi imediatamente determinado através da utilização do medidor de fluido gengival
previamente calibrado (Periotron 8000, IDE Interstate, Amityville, NY). As tiras de papel que
estavam com manchas de sangue foram descartadas. Para cada indivíduo, as tiras de cada
categoria de sítio foram agrupados em tubos Eppendorf contendo 0,5 ml de solução tampão
fosfato-salino. Após eluição por 40 minutos em temperatura ambiente, as tiras foram
removidos e as amostras foram centrifugadas a 3000 g por 5 minutos. O sobrenadante foi
coletado e congelado a -20 ° C até análise.
As amostras foram agrupadas em cada categoria de sítio em cada paciente
individualmente. Assim, o número final foi de: 20 amostras para sítios rasos e 20 para sítios
profundos no grupo PC, 14 amostras para sítios rasos e 14 para sítios profundos no grupo PA
antes do tratamento e o mesmo número de amostras para os 3 meses após o tratamento.
29
3.2.1 Quantificação dos mediadores pelo método Luminex
Os níveis das citocinas foram determinados utilizando um imunoensaio multiplexado
com microesferas. Cinqüenta microlitros das amostras de fluido gengival foram analisada
para IL-1, IL-4, IL-8 e INFγ usando um kit disponível comercialmente (Lincoplex,
Millipore, Missouri, USA) em um analisador Luminex (Luminex®, MiraiBio, Alameda, CA)
de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, placas de 96-poços com filtro
foram pré-umedecidos com tampão de lavagem e a solução foi aspirada dos poços usando
uma sucção à vácuo (Millipore Corporation, Billerica, MA). Micro-esferas revestidas com
anticorpos monoclonais contra os 4 alvos diferentes analisados foram adicionados aos poços.
Amostras e padrões (variando de 0,13 a 2.000 pg / ml para cada mediador) foram pipetados
nos poços e incubados durante a noite a 4oC. Os poços foram lavados e aspirados e uma
mistura de anticorpos secundários biotinilados foi adicionada. Após a incubação por 1 hora,
estreptavidina conjugada com a proteína fluorescente, R-ficoeritrina (estreptavidina-RPE) foi
adicionada às microesferas e incubadas por 30 minutos. Após a lavagem para remoção dos
reagentes não aderidos, as microesferas (mínimo de 100 por análise)foram adicionado aos
poços em uma solução tampão sheath fluid (Luminex®, MiraiBio, Alameda, CA) para serem
analisadas no analisador de microesferas (Luminex 100™, Luminex®, MiraiBio, Alameda,
CA). As concentrações das amostras desconhecidas (antígenos nas amostras de FG) foram
estimados a partir da curva padrão, utilizando o Bio-Plex Manager Software (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA), e os níveis de citocinas expressos como quantidade total (pg)
por sítio.
3.2.2 Atividade de elastase
A atividade de elastase total foi medida com um substrato específico, l-pyroglutamylL-propil-L-valina-p-nitroanilina (S-2484, Haemochrom Diagnostica, Mo¨lndal, Sweden).
Cem microlitros de amostra não diluída foi misturada com 65 μl de substrato em uma placa
de microtitulação com 96 poços (Nunc Maxisorp, Nunc, Roskilde, Denmark). A mistura foi
agitada por 5 minutos e, a absorbância a 405 nm foi lida em um espectrofotômetro (Millenia
30
Kinetic Analyzer, Diagnostic Product, Los Angeles, CA.). Após 2 horas de incubação a 37
°C, a absorbância foi lida uma segunda vez. A diferença entre as 2-horas de acompanhamento
e os dados iniciais foi considerada a atividade total de elastase e expressada em absorbância
(Abs).
3.3 Coleta Microbiológica
O perfil microbiológico subgengival para cada indivíduo foi defenido como uma
amostra representativa da boca coletada da face mesial de cada dente de dois quadrantes
selecionados aleatoriamente (ate 14 sitios por paciente). Depósitos de biofilme supragengival
foram removidos previamente com gaze estéril e as amostras de biofilme subgengival
coletadas com curetas Gracey estéreis na visita inicial e 3 meses após a terapia periodontal.
Para cada amostra, uma extremidade estéril da cureta foi utilizada.
3.3.1 Checkerboard DNA-DNA Hybridization
Cada amostra de placa subgengival foi colocada separadamente em tubos de
Eppendorf contendo 0,15 ml de TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7,6). 0,15 ml de 0,5 M
NaOH foi adicionado a cada tubo e as amostras estocadas a -20oC ate envio para o Forsyth
Institute para processamento. Amostras foram fervidas em banho maria por 5 minutos. Após
fervura, as suspensões foram neutralizadas com a adição de 0,8 ml de 5M de acetato de
amônia. Com isso, as células bacterianas foram lisadas e o DNA suspenso na solução. Na
primeira fase de montagem do “checkerboard”, o “Minislot 30” (Immunetics, Cambridge,
MA, USA) foi colocado sobre uma membrana de nylon (15 x 15 cm) com carga positiva
(Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, USA) e o conjunto aparafusado sobre uma base de
acrílico. Cada suspensão de biofilme contendo DNA livre foi depositada nas fendas do
“Minislot” e o DNA concentrado na membrana de nylon. A membrana era removida do
aparato e o DNA fixado na mesma através da exposição à luz ultravioleta (Stratalinker, USA).
Cada “Minislot” permite a deposição de até 30 amostras. Em cada membrana foram
depositadas 24 amostras e as duas últimas canaletas do “Minislot” foram reservadas para
31
colocação dos padrões, contendo uma mistura de DNA das espécies bacterianas investigadas
correspondendo a duas concentrações: 105 e 106 células.
Após fixação do DNA nas membranas, essas foram pré-hibridizadas a 42oC por 1 hora
em uma solução de 50% formamida, 5 X SSC, 1% caseína, 5 X reagente de Denhardt, 25mM
de fosfato de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/ml de RNA de levedura. Em seguida cada membrana
era colocada sob a placa acrílica do “Miniblotter 45” (Immunetics, Cambridge, MA, USA),
com a linha contendo o DNA fixado perpendicular às canaletas do “Miniblotter”.
As sondas de DNA foram confeccionadas usando o kit “random primer digoxigenin
labelling” [Boehringer Mannheim, USA]). Anteriormente ao seu uso, as sondas foram
testadas com uma mistura controle contendo as espécies investigadas, numa concentração de
104 células bacterianas e tiveram sua concentração ajustada de tal modo que as intensidades
dos sinais de todas as sondas fossem semelhantes. Cada canaleta do “Miniblotter 45” foi
preenchida com 130 l de uma determinada sonda, contida numa solução de hibridização
(45% formamida, 5 X SSC, 1 X reagente de Denhardt, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6.5),
0,2 mg/ml de RNA de levedura, 10% de sulfato de dextrano, 1% caseína e 20 ng/ml de DNA).
As sondas foram hibridizadas perpendicularmente às linhas contendo o DNA bacteriano,
propiciando um formato de xadrez com as linhas de DNA horizontais e as sondas verticais. O
aparato contendo as membranas foi colocado dentro de um saco plástico para evitar a
desidratação das mesmas. A hibridização das membranas com as sondas ocorreram a 42oC,
durante 20 horas. As 40 cepas utilizadas para a confecção de sondas e padrões foram obtidas
da American Type Culture Collection (ATCC) (ver lista abaixo).
Após hibridização com as sondas, as membranas foram removidas do “Miniblotter”
e lavadas por 5 minutos em temperatura ambiente, seguido de duas lavagens de 20 minutos
cada a 65oC em uma solução adstringente (0,1 X SSC, 0,1% SDS), a fim de remover sondas
que não hibridizaram completamente. Em seguida, as membranas foram imersas por 1 hora
em uma solução contendo 0,1M de ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20,
0,5% caseína, pH 8,0 e 30 minutos na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina
conjugado à fosfatase alcalina (Boehringer Mannheim), em uma diluição de 1/25000. As
membranas foram então lavadas com uma solução de 0,1 M ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M
NaOH, 0,3% Tween 20, pH 8,0; 4 vezes por 10 minutos e uma vez por 5 minutos em 0,1 M
Tris HCl, 0,1 NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5. Após as lavagens, as membranas foram incubadas
em uma solução contendo uma substância fluorescente (Atto – Phos) para futura leitura e
quantificação da reação em um scanner (Imagequant/Storm 840, USA). Os sinais
32
fluorescentes capturados pelo “Storm” foram convertidos a contagens (níveis x 105) por
comparação com os valores dos padrões usando regressão linear.
Lista das 40 sondas utilizadas no "checkerboard DNA-DNA hybridization"
Actinomyces gerencseriae
Fusobacterium nucleatum ss nucleatum
Actinomyces israelii
Fusobacterium nucleatum ss polymorphum
Actinomyces naeslundii
Fusobacterium nucleatum ss vincentii
Actinomyces oris
Fusobacterium periodonticum
Actinomyces odontolyticus
Parvimonas micra
Veillonella parvula
Prevotella intermedia
Streptococcus gordonii
Prevotella nigrescens
Streptococcus intermedius
Streptococcus constellatus
Streptococcus mitis
Tannerella forsythia
Streptococcus oralis
Porphyromonas gingivalis
Streptococcus sanguinis
Treponema denticola
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Eubacterium saburreum
Capnocytophaga gingivalis
Gemella morbillorum
Capnocytophaga ochracea
Leptotrichia buccalis
Capnocytophaga sputigena
Neisseria mucosa
Eikenella corrodens
Propionobacterium acnes
Campylobacter gracilis
Prevotella melaninogenica
Campylobacter rectus
Streptococcus anginosus
Campylobacter showae
Selenomonas noxia
Eubacterium nodatum
Treponema socranskii
3.4 Análise Estatística
Dados clínicos foram obtidos de 6 sítios por dente em cada indivíduo na visita inicial
(VI) e 3 meses (3M) após o término da terapia periodontal. A média desses dados foi
calculada para cada indivíduo e para cada grupo nos tempos visita inicial e em 3 meses
separadamente. A significância das mudancas nos dados clínicos ao longo do tempo foi
determinada usando o teste “Wilcoxon signed rank” em cada grupo clínico separadamente.
Como descrito acima, os mediadores bioquímicos do FG foram medidos em amostras
agrupadas em duas categorias de sítios: sítios rasos e sítios profundos. As médias dos valores
para as citocinas e atividade de elastase foram calculadas para cada categoria de sítio nos dois
grupos clínicos para os dois tempos avaliados separadamente. A significância das mudanças
nos parâmetros bioquímicos do FG ao longo do tempo foi determinada usando o teste
“Wilcoxon signed rank” para cada categoria de sítio em cada grupo separadamente.
Os níveis das 40 especies testadas foi determinado em até 14 sítios por indivíduo (dois
quadrantes aleatórios) na visita inicial e 3 meses após a terapia. Esses dados foram utilizados
para calcular o nível médio de cada espécie por indivíduo e a média dentro de cada grupo nos
33
dois tempos.
O percentual que cada espécie contribuia para o DNA total também foi
computado para dar uma idéia da proporção de cada espécie no biofilme subgengival. As
médias das proporções de cada espécie foram calculadas de forma semelhante a média dos
níveis das espécies. As proporções médias das espécies que compõem os 6 complexos
subgengivais e as espécies que não formam complexos (outros) foram adicionadas para gerar
a proporção média de cada complexo.
Novamente, a significância das mudanças nos
parâmetros microbiológicos ao longo do tempo foi determinada usando o teste “Wilcoxon
signed rank” em cada grupo separadamente. A análise estatística microbiológica foi ajustada
para comparações múltiplas das 40 espécies bacterianas analisadas.
As mudanças nos
parâmetros clínicos, imunológicos e microbiológicos (dados não mostrados) foram calculadas
para os dois grupos clínicos separadamente e comparadas utilizando o teste Mann-Whitney.
34
4 RESULTADOS
4.1 Parâmetros clínicos
As médias dos parâmetros clínicos e demográficos para os 02 grupos clínicos são
apresentados na Tabela 1. As Tabelas 2 e 3 mostram redução significativa nos parâmetros
clínicos obtidos com a terapia periodontal nos grupos PC e PA respectivamente.
A Tabela 4 apresenta a média dos parâmetros clínicos para sítios rasos e profundos de
onde as amostras de FG foram coletadas nos grupos PC e PA na VI e 3M após terapia
periodontal. Houve melhora significativa de todos os parâmetros clínicos analisados em
ambos os grupos para as duas categorias de sítios, exceto para o volume de FG nos sítios
rasos do grupo PA.
4.2 Parâmetros imunológicos
Os valores de mediana (intervalo interquartílico) para quantidade total (pg/sítio) de IL1β, IL-4, IL-8, INF-γ e atividade de elastase medidos no FG dos sítios rasos e profundos dos
grupos PC e PA na VI e 3M foram apresentados na Tabela 5. Foram encontradas apenas
reduções significativas na atividade de elastase dos sítios rasos e profundos dos pacientes do
grupo PA e nos sítios profundos do grupo PC e também foi achado um aumento significativo
de INF-γ nos sítios rasos do grupo PA. Os Gráficos 1, 2, 3 e 4 ilustram a distribuição desses
valores sob a forma de diagrama de caixa (boxplot).
As comparações entre as respostas ao tratamento periodontal, clínicas e imunológicas
(bioquímicas) após 3M entre os grupos PC e PA em ambas categorias de sítios estão
apresentadas na Tabela 6. A única diferença significativa clínica encontrada entre os grupos,
foi na porcentagem de sítios
profundos com SS, indicando uma maior redução na
porcentagem de SS nos sítios profundos do grupo PC. Em relação aos mediadores
inflamatórios foi encontrada apenas uma diferença significante entre os grupos no INF-γ para
os sítios rasos.
35
4.3 Achados Microbiológicos
Os dados microbiológicos apresentados na Figura 1, mostram reduções significativas
3M após terapia periodontal, para os níveis dos membros do complexo vermelho (P.
gingivalis, T. forsythia, T.denticola), e para as espécies E.nodatum e P.micra do complexo
laranja no grupo PC. No grupo PA, ocorreram reduções significativas no níveis de P.
gingivalis e T. forsythia do complexo vermelho e Fusobacterium nucleatum ss polymorphum
e Fusobacterium periodonticum do complexo laranja.
A Figura 2, apresenta os gráficos de “torta” demonstrando o percentual médio dos
complexo microbianos nos grupos PC e PA na VI e 3M após a terapia periodontal. É possível
verificarmos uma redução significativa nos perfis vermelho e laranja, assim como um
aumento significativo no perfil azul para ambos os grupo. Também encontramos um aumento
significativo no perfil verde para o grupo PC. O tamanho das “tortas” reflete a média da
quantidade total de DNA nos dois grupos antes e depois da terapia. A redução significativa no
tamanho das “tortas” reflete a redução na quantidade total de DNA das amostras 3M após
terapia.
Foram também realizadas comparações entre a resposta ao tratamento periodontal nos
níveis microbiológicos após 3M entre os grupos PC e PA em ambas categorias de sítios (teste
Mann-Whitney). Os resultados dessa análise não mostraram diferenças significativas (dados
não mostrados).
36
5 DISCUSSÃO
No presente estudo, foi demonstrado que o tratamento periodontal não cirúrgico nos
grupo PC e PA, foi eficaz na redução de todos os parâmetros clínicos analisados após 3
meses. Isto foi confirmado pela redução significativa na porcentagem de SS, PBS e NIC. Tal
fato está de acordo com vários outros trabalhos que têm claramente demonstrado que, em
geral a periodontite pode ser controlada sem medicação adicional (BADERSTEN; NILVEUS
; EGELBERG, 1984a; b; CLAFFEY ; EGELBERG, 1994; FIGUEREDO; FISCHER ;
GUSTAFSSON, 2005).
Estudos clássicos têm demonstrado que o fluido gengival está fortemente
correlacionado com a inflamação clínica (GOLUB ; KLEINBERG, 1976; LAMSTER;
OSHRAIN ; GORDON, 1986; LAMSTER et al., 1988). Esses achados corroboram com
nossos resultados que mostraram uma redução significativa no volume de FG após tratamento
periodotal. Portanto, o volume do fluido gengival pode ser utilizado como marcador de
inflamação subclínica.
No presente estudo, dos diversos biomarcadores analisados, a elastase foi o único que
teve sua atividade reduzida significativamente 3 meses após terapia periodontal nos sítios
profundos dos grupos PC e PA. Outros trabalhos têm demonstrado que a atividade da elastase
encontra-se elevada em periodontite agressiva (LIU ; CAO, 1999) e em lesões de periodontite
crônica (FIGUEREDO; FISCHER ; GUSTAFSSON, 2005), e sua redução pode ser alcançada
após o tratamento periodontal (BUCHMANN et al., 2002; FIGUEREDO et al., 2004).
Muitos estudos têm reportado níveis elevados de IL-1β no FG em todas as formas de
periodontite quando comparados com pacientes com gengivite e saudáveis (TSAI; HO ;
CHEN, 1995; ISHIHARA et al., 1997; GONZALES et al., 2001). Consequentemente, a
diminuição dos nívies de IL-1β foi encontrada em diversos trabalhos onde a terapia
periodontal foi analisada em conjunto com os aspectos imunológicos (TUTER; KURTIS ;
SERDAR, 2001; TOKER; POYRAZ ; EREN, 2008; THUNELL et al., 2009). Nossos achados
não mostraram essa redução encontrada na literatura, porém achados semelhantes aos nossos
também são relatados por alguns pesquisadores (FOKKEMA et al., 2003; YOSHINARI et al.,
2004) , o que sugere que existem ainda questões a serem esclarecidas. No presente estudo o
intervalo entre os exames clínicos e periodontais, na VI e após a terapia periodontal não
cirúrgica foi de 3 meses. Talvez, em uma lesão periodontal estabelecida, o provável é que seja
37
requerido mais tempo para se observar uma maior mudança nesses parâmetros inflamatórios e
recuperação das estruturas periodontais, sugerindo que ainda possa haver alguma inflamação
subclínica em tais sítios (YOSHINARI et al., 2004). Vale ressaltar que esse fato também
pode ser o responsável pela não alteração dos demais mediadores inflamatórios, porém uma
maior quantidade de estudos com grupos de pacientes maiores se fazem necessário para
confirmar tais achados.
No que diz respeito ao INF-γ, membro da resposta imune Th1, pouco é relatado e se
sabe sobre o real papel desta citocina na patogênese das periodontites, mas parece que sua
presença em grandes quantidades aumentam o risco de progressão da doença (ALPAGOT;
FONT ; LEE, 2003). A desejada redução após a terapia periodontal não foi observada no
presente estudo. Ao contrário disso, um aumento ocorreu nos sítios rasos dos pacientes do
grupo PA. Nossos achados são semelhantes aos achados de um estudo feito com brasileiros
em um grupo de periodontite crônica avançada (DEL PELOSO RIBEIRO et al., 2008). Uma
possível explicação para essa observação é a baixa freqüência de detecção dessa citocina nas
regiões coletadas.
Alguns pesquisadores investigaram alterações microbiológicas pós terapia periodotal
em pacientes com periodontite crônica, foi relatado que os efeitos clínicos e microbiológicos
da raspagem e do alisamento radicular levaram a uma redução significativa dos membros do
complexo vermelho e apenas uma ligeira redução nos demais microrganismos analisados. Foi
visto que as principais melhoras clínicas e microbiológicas ocorreram nos primeiros 3 meses
após a terapia, se mantendo por até 12 meses (SOCRANSKY et al., 1991; HAFFAJEE et al.,
1997b; BADER ; BOYD, 1999; DARBY et al., 2005). No que diz respeito a periodontite
agressiva diversos autores reforçam a importância do papel do A. actinomycetemcomitans
como um colonizador primário ou um iniciador da periodontite agressiva localizada, uma vez
que o mesmo é encontrado em maior quantidade em sítios rasos e moderados em pacientes
com doença localizada tendo sua prevalência diminuida com o avanço da idade em pacientes
com periodontite avançada (RODENBURG et al., 1990). Aliado a esse fato, tal
microrganismo pode não ser resistente a uma concorrência bacteriana complexa, o que
justificaria sua baixa prevalência em bolsas periodontais profundas, onde a presença de
bactérias do complexo vermelho encontram-se em maiores níveis (RODENBURG et al.,
1990; FINE et al., 2007; TEUGHELS et al., 2007; FAVERI et al., 2009). Analisando nosso
dados microbiológicos, verificamos que além da baixa detecção do níveis de
A.actinomycetemcomitans em ambos os grupos, há uma maior quantidade nos níveis dos
periodontiopatógenos do complexo vermelho. É bem provável que grande parte de nossa
38
amostra apresente uma doença onde a importância da presença do A.actinomycetemcomitans
seja pequena e reduções significativas em membros do complexo vermelho três meses após a
terapia justifique em grande parte a melhora clínica observadas em nossos grupos com a
terapia periodontal não cirúrgica. Outro aspecto importante é o fato do grupo estudado no
presente trabalho apresentar a forma generalizada da periodontite agressiva, provavelmente
nestes
indivíduos
já
existe
um
biofilme
mais
“maduro”
e
o
papel
do
A.actinomycetemcomitans não seja mais tão relevante para progressão da doença. Do ponto de
vista microbiológico e imunológico, o objetivo ideal da terapia periodontal é o de se reduzir
os níveis de patógenos para os existentes antes da instalação da doença, por períodos
prolongados de tempo (TELES; HAFFAJEE ; SOCRANSKY, 2006), tal proposta visa
simultaneamente reduzir os níveis de mediadores inflamatórios levando a uma melhora clínica
do quadro.
39
6 CONCLUSÕES
Dentro dos limites deste estudo, os resultados apóiam nossa hipótese de que a
periodontite crônica e agressiva respondem igualmente bem ao tratamento periodontal nãocirúrgico. Foram observados melhoras significativas de todos os parâmetros clínicos, com
redução dos principais patógenos periodontais e uma diminuição significativa de atividade de
elastase nos sítios profundos. Quando as respostas clínica e imunológica após terapia foram
comparadas entre os grupos, apenas diferenças sutis foram encontradas.
40
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52
Tabela 1 - Média (± DP) dos parâmetros clínicos e demográficos para os indivíduos
com periodontite crônica (PC) e agressiva (PA)
Parâmetro
PC (n = 20)
PA (n = 14)
Idade (anos)*
% homens
48 ± 8
50
29 ± 7
29
% fumantes**
% sítios com sangramento à sondagem
Profundidade de bolda à sondagem (mm)
25
64 ± 20
3.52 ± 0.70
0
64 ± 16
3.51 ± 0.51
Nível clínico de inserção (mm)
4.07 ± 0.99
3.65 ± 0.64
*p<0,001 teste de Mann-Whitney
**p<0,05 teste exato de Fisher
Tabela 2 - Média (± DP) dos parâmetros clínicos para o grupo periodontite crônica
(PC) na visita inicial (VI) e 3 meses (3M) após terapia
Parâmetro
VI (n = 20)
3M (n = 20)
% sítios com sangramento à sondagem***
Profundidade de bolda à sondagem (mm)**
64 ± 20
3.52 ± 0.70
29 ± 17
2.79 ± 0.33
4.07 ± 0.99
3.65 ± 0.64
Nível clínico de inserção (mm)**
**p<0,01 teste Wilcoxon
***p<0,001 teste Wilcoxon
Tabela 3 - Média (± DP) dos parâmetros clínicos para o grupo periodontite agressiva (PA) na
visita inicial (VI) e 3 meses (3M) após terapia
Parâmetro
% sítios com sangramento à sondagem**
Profundidade de bolda à sondagem (mm)**
Nível clínico de inserção (mm)**
**p<0,01 teste Wilcoxon
VI (n = 14)
3M (n = 14)
64 ± 16
3.51 ± 0.51
3.65 ± 0.64
23 ± 14
2.82 ± 0.41
3.04 ± 0.62
53
Tabela 4 - Média (± DP) dos parâmetros clínicos para os sítios rasos e profundos de onde as amostras de fluido gengival (FG) foram coletadas nos grupos
periodontite crônica e periodontite agressiva na visita inicial (VI) e 3 meses (3M) após terapia
Periodontite crônica generalizada (n = 20)
Parâmetro
Periodontite agressiva generalizada (n =14)
Sítios rasos
Sítios profundos
Sítios rasos
Sítios profundos
valores de
valores de
valores de
valores de
VI
3M
p
VI
3M
p
VI
3M
p
VI
3M
p
% sítios com SS
100 ± 0
10 ± 20
100 ± 0
20 ± 30
100 ± 0
20 ± 0
100 ± 0
50 ± 40
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
PBS (mm)
2.8 ± 0.4
2.2 ± 0.6
5.8 ± 1.1
3.7 ± 1.0
2.8 ± 0.4
2.5 ± 0.4
5.9 ± 1.4
3.7 ± 1.0
<0.001
<0.001
0,01
<0.001
NIC (mm)
1.0 ± 0.2
0.6 ± 0.7
6.1 ± 1.8
4.4 ± 2.3
0.9 ± 0.4
0.5 ± 0.4
5.9 ± 2.0
3.9 ± 2.6
<0.05
<0.001
0,01
<0.001
Volume de FG (μl) 1.18 ± 2.10 0.61 ± 0.94
3.37± 2.65 1.10± 1.33
1.45 ± 2.17 0.53 ± 0.69
0,18
3.51 ± 2.83 0.95 ± 0.97
<0.01
<0.001
<0.001
Sangramento à sondagem (SS)
Profundidade de bolda à sondagem (PBS)
Nível clínico de inserção (NIC)
Valores de p usando teste "Wilcoxon signed rank"
53
54
Tabela 5 - Mediana e intervalo interquartílico dos parâmetros bioquímicos medidos no fluido gengival (FG) de sítios rasos e profundos nos grupos
periodontite crônica e periodontite agressiva na visita inicial (VI) e 3 meses (3M) após terapia.
Periodontite crônica generalizada (n = 20)
Parâmetro
VI
Elastase (Abs) 0.84 (1.49)
IL-1β (pg/sítio) 1.31 (1.77)
IL-4 (pg/sítio) 0.08 (0.11)
IL-8 (pg/sítio) 61.9 (88.5)
Sítios rasos
3M
0.56 (0.73)
1.96 (3.19)
0.08 (0.10)
65.6 (50.5)
INF-γ (pg/sítio) 0.00 (0.12) 0.02 (0.08)
Periodontite agressiva generalizada (n =14)
Sítios profundos
valores de
valores de
p
VI
3M
p
0,82
2.19 (1.89) 1.34 (1.20)
<0.05
0,26
4.80 (6.91) 4.93 (13.7)
0,82
1,00
0.10 (0.12) 0.08 (0.12)
0,82
0,50
59.4 (69.2) 75.2 (34.2)
0,82
0,79
0.07 (0.30) 0.08 (0.18)
0,10
Sítios rasos
VI
1.26 (1.81)
3.85 (6.31)
0.10 (0.18)
83.1 (57.1)
3M
0.42 (1.15)
1.46 (3.24)
0.15 (0.38)
67.5 (62.8)
0.0 (0.01)
0.18 (0.37)
Sítios profundos
valores de
valores de
p
VI
3M
p
3.12 (1.51) 0.72 (1.27)
<0.05
<0.01
0,79
14.0 (14.3) 3.53 (2.12)
0,18
0,55
0.12 (0.23) 0.12 (0.26)
0,79
0,18
82.9 (49.3) 76.2 (61.9)
0,39
<0.01
0.04 (0.32) 0.01 (0.15)
0,18
Valores de p usando teste "Wilcoxon signed rank"
54
55
Tabela 6 - Mediana e intervalo interquartílico das diferenças nos parâmetros clínicos e bioquímicos
entre visita inicial (VI) e 3 meses (3M) após terapia nos sítios rasos e profundos nos grupos
periodontite crônica (PC) e periodontite agressiva (PA).
Diferenças entre VI e 3M
Parâmetro
% sítios com SS
PBS (mm)
NIC (mm)
Volume de FG
(μl)
Elastase (Abs)
IL-1β (pg/sítio)
IL-4 (pg/sítio)
IL-8 (pg/sítio)
INF-γ (pg/sítio)
Sítios rasos
Sítios profundos
PC
-80 (20)
-0.5 (0.4)
-0.2 (0.5)
PA
-80 (00)
-0.2 (0.2)
-0.2 (0.2)
valores de
p
0,24
0,26
0,35
-0.79 (1.20)
-0.05 (0.93)
-0.30 (4.16)
0.01 (0.12)
31.5 (69.3)
0.0 (0.16)
-0.72 (2.72)
-0.82 (1.38)
-0.98 (3.65)
0.01 (0.20)
-21.0 (80.4)
0.18 (0.29)
1,00
0,09
0,11
0,51
0,06
0,01
PC
-80 (30)
-2.1 (1.1)
-1.6 (0.8)
PA
-50 (40)
-2.0 (0.6)
-2.0 (0.6)
valores de
p
0,04
0,98
0,11
-0.91 (2.97)
-0.59 (1.14)
0.34 (14.8)
-0.04 (0.16)
4.53 (76.4)
0.34 (14.8)
-2.77 (3.37)
-1.44 (1.23)
-8.22 (17.1)
0.0 (0.21)
-7.94 (47.8)
-0.01 (0.26)
0,13
0,08
0,07
0,45
0,46
0,61
Sangramento à sondagem (SS)
Profundidade de bolda à sondagem (PBS)
Nível clínico de inserção (NIC)
Valores de p usando o teste de Mann-Whitney
55
56
PERIODONTITE CRÔNICA – SÍTIOS RASOS
Gráfico 1 - Diagrama de caixa para os níveis de IL-4, IL-8, INF-γ e IL-1β e atividade da
elastase nos sítios rasos do grupo periodontite crônica. A caixa inclui os 50% dos dados
centrais, a borda inferior corresponde ao percentil 25, a borda superior ao percentil 75 e a
linha dentro da caixa a mediana (percentil 50). Os bigodes (“whiskers”) mostram os percentis
10 e 90 e os circulos indicam valores dispersos (“outliers”).
57
PERIODONTITE AGRESSIVA – SÍTIOS RASOS
elastase nos sítios rasos do grupo periodontite agressiva. A caixa inclui os 50% dos dados
58
PERIODONTITE CRÔNICA – SÍTIOS PROFUNDOS
elastase nos sítios profundos do grupo periodontite crônica. A caixa inclui os 50% dos dados
59
PERIODONTITE AGRESSIVA – SÍTIOS PROFUNDOS
elastase nos sítios profundos do grupo periodontite crônica. A caixa inclui os 50% dos dados
60
Figura 1 - A média dos níveis de 40 espécies (x 105) testadas em 20 indivíduos com
periodontite crônica generalizada (PC) na visita inicial e 3 meses após tratamento periodontal
(painel esquerdo), bem como em 14 indivíduos com periodontite agressiva generalizada (PA,
painel direito). Contagens médias de cada espécie foram calculados em cada indivíduo e, em
seguida, a média para cada grupo, em cada visita, calculada separadamente. Significância das
diferenças entre a avaliação inicial e 3 meses foi determinada utilizando o teste Wilcoxon
signed ranks, com * p <0,05 ** p <0,01. As espécies foram ordenados e agrupados de acordo
com os complexos descritos por Socransky et al. (1998).
61
Figura 2 - Gráfico de torta demonstrando o percentual médio dos complexo definidos por
Socransky et al. 1998 nos grupos periodontite crônica (PC) e periodontite agressiva (PA) na
visita inicial (VI) e 3 meses (3M) após a terapia. Mudanças ao longo do tempo foram
comparadas usando o teste Wilcoxon signed rank, *p<0.05; **p<0.01 ajustando para
comparações múltiplas. O tamanho das tortas reflete a média da quantidade total de DNA nos
dois grupos antes e depois da terapia e os valores de p a comparação entre essas médias
usando o teste Wilcoxon signed rank .
62
ANEXO A

Tese Doutorado

Transcrição

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