Kit de Clonagem Flex-C

Rev. 01 – Jan/2014
Kit de Clonagem Flex-C
Instruções de Uso
DESCRIÇÃO
O Kit de Clonagem Flex-C é altamente eficiente, rápido e de fácil uso para clonagem
por PCR. A enzima Flex-C permite a clonagem direta de qualquer fragmento de PCR em
qualquer vetor de expressão linearizado, em qualquer local e em uma única reação de 20
minutos.
A aplicação do protocolo é simples. Os fragmentos de PCR podem ser gerados por
polimerases de PCR (por exemplo, DNA Taq Polimerase) com primers que foram projetados
para ter, pelo menos, 10 bases homólogas com as extremidades lineares dos vetores. Não é
necessário tratamento adicional para o fragmento de PCR (como digestão de restrição, ligação,
fosforilação, ou polimento das extremidades cegas). O vetor linearizado pode ser gerado pela
PCR ou enzimas de restrição (simples ou dupla digestão). As enzimas do Flex-C unem
precisamente e eficientemente os fragmentos de PCR aos vetores linearizados reconhecendo a
sobreposição de 10bp (pares de bases) em suas extremidades.
Este método permite a clonagem de múltiplos fragmentos em um único vetor em uma única
reação, não necessitando subclonagem para criar a fusão de proteínas, para apagar e repor as
sequências de DNA ou para inserir pontos de mutações. O Kit de Clonagem Flex-C é altamente
eficiente, com taxa de inserção de 95%. O Kit de Clonagem Flex-C também contém a Taq DNA
Polimerase e tampões de reação, bem como dNTPs para posterior rastreamento de clones de PCR.
CARACTERTÍSTICAS PRINCIPAIS
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Clona qualquer inserção, em qualquer local e vetor
Enzimas de restrição, fosfatase e sistema de ligase livre
Junção de múltiplos fragmentos de uma só vez
Amplo tamanho de PCRde até 10kb
Bom para extremidades 5’, extremidades 3’, extremidades cegas
Inserção precisa na orientação desejada
Altamente eficiente, com >95% de clones positivos
Aplicações múltiplas:
o Adição de adaptador, vinculador e marcador antes ou depois da inserção
o Geração de mutação
o Síntese de gene
Aplicação de alto rendimento
Componentes
MEPL01
MEPL01-S
Enzima de Clonagem Flex-C
20 app (40μl)
5app (10μl)
Taq DNA Polimerase
500u
50u
Tampão Vi A 10X
2ml
1ml
Tampão Vi S 10X
1ml
1ml
MgCl2 50nM
1ml
1ml
dNTPs mix 10nM
0,25ml
0,025ml
Água livre de nuclease
1ml
1ml
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Armazenamento: armazenar a -20°C
Armazenamento do Tampão Taq DNA polimerase: 20mM Tris-HCl (pH8.0 a 22°C),
100mM KCl, 0,5% TweenTM20, 0,5% Nonidet-P40, EDTA0,1mM EDTA, 1mM DTT e 50%
glicerol.
Tampão Vi A 10X:500mM KCL, 100mM Tris-HCl (pH9,2 a 20°C) e 0,1% TritonTMX-100.
Tampão Vi S 10X: (NH4)2SO4160mM (NH4)2SO4, 500mM Tris-HCl (pH9,2 a 22°C),
17,5mM MgCl2 e 0,1% TritonTM X-100.
Itens adicionais (não fornecidos com o kit):
Primers de genes específicos com 10bp homólogas às extremidades do vetor.
Vetor linearizado.
Células competentes.
Placas LB contendo antibiótico apropriado.
VISÃO GERAL DO PROTOCOLO
PREPARO DO VETOR LINEARIZADO
Um vetor linearizado pode ser gerado por PCR ou pela digestão da enzima de restrição
(digestão única ou dupla). A digestão completa de um vetor é essencial para conseguir alta
eficiência de clonagem. É recomendada a purificação do vetor linearizado pelo método de
recuperação de DNA em gel.
Devido às diferenças na eficiência das digestões, diferentes enzimas de restrição irão
gerar diferentes montantes de impurezas. É recomendado que o usuário realize dupla digestão
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para reduzir a oportunidade de autoligação do vetor. O usuário pode aumentar o tempo de
incubação (para 4 horas ou da noite para o dia, dependendo das propriedades das enzimas)
para uma reação de digestão mais completa.
O usuário pode testar a impureza, transformando 10-50ng de vetor purificado e
linearizado em células competentes. Se a impureza for alta, realizar a digestão usando mais
enzimas de restrição ou prolongando o período de incubação.
PROJETO DO PRIMER
O projeto do primer é crucial para o sucesso da reação de clonagem. O usuário pode
clonar dois ou mais fragmentos em qualquer vetor linearizado, contanto que compartilhem 10
bases homólogas em cada extremidade. Os primers devem ser projetados de acordo com o
seguinte:
1. A extremidade 5’ do primer DEVE conter 10 bases homólogas para 10 bases na
extremidade do fragmento de DNA ao qual ele irá se juntar (não incluindo o sítio de
restrição). Isso pode ser o vetor ou outra inserção.
2. A extremidade 3’ do primer DEVE conter a sequência específica do gene. Pode ser
projetado para usar de 18-20 bases com conteúdo GC 40-60%
3. A temperatura de fusão é calculada com base na sequência 3’ gene específica do
primer ao invés da sequência inteira do primer.
4. Evitar sequências complementares dentro e entre os primers.
Ter como referência os desenhos abaixo para projetar os primers.
1. Vetor linearizado com a extremidade 5’
Figura 1: Projeto de primer com sítio de enzimas de restrição gerando extremidades 5’.
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2. Vetor linearizado com a extremidade 3’
Figura 2: Projeto de primer com sítio de enzimas de restrição gerando extremidades 3’.
3. Vetor linearizado com extremidades cegas
Figura 3: Projeto de primer com sítio de restrição das enzimas de restrição gerando extremidades cegas.
Os primers acima são projetados com um sítio de restrição das enzimas de restrição
gerando extremidades 5’ (figura1), extremidades 3’ (figura2) e extremidades cegas (figura 3).
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Os sítios de restrição estão destacados em vermelho e ‘X’ representa as bases correspondentes
às sequências de genes específicas. As 10 bases homólogas referem-se à sequência de vetores
que são adjacentes aos sítios de restrição.
CONSIDERAÇÕES SOBRE O PRODUTO DA PCR
1. Recomendamos autilização da Taq DNA Polimerase ou de polimerase com alta
fidelidade semelhante para a amplificação do gene de interesse.
2. Purificar o produto da PCR pelo método de recuperação de DNA em gel para remover
bandas indesejadas.
PROCEDIMENTO DE CLONAGEM
1. Preparar a mistura de reação como segue:
Vetorlinearizado (50-200ng)
Produto de PCR purificado (20-200ng)
Mix de enzimaFlex-C
Agua livre de nuclease
Volume total
2µl
µl*
2µl
Completaraté 10µl
10µl
*A Razão molar recomendada para o vetor é de 1:3. Em geral, 1:5 para 3:1 da relação vetor e
insertoproduz bons resultados.
2. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos e depois no gelo por 10 minutos.
3. Proceder para a transformação. Recomenda-se o uso de células competentes
comerciais.
4. Plaquear as células em placas LB contendo antibióticos apropriados para a clonagem do
vetor, incubando todas as placas durante a noite a 37°C
5. Realizar o rastreamento por PCR ou com enzima de restrição para determinar a
presença da inserção.
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SOLUÇÃO DE PROBLEMAS
Problema
Causa possível
Baixa qualidade das células
competentes.
Sequência incorreta do primer.
Poucas ou nenhuma
colônia obtida pela
transformação.
Antibióticos errados foram
usados, ou excesso dos
antibióticos.
Baixa qualidade de produto da
PCR.
Contaminantes inibidores do
produto da PCR ou do vetor
linearizado.
Transformação com excesso de
mistura de reação.
Linearização do vetor
incompleta.
Colônias não possuem
inserções.
Contaminação de outros
plasmídios com a mesma
resistência ao antibiótico.
Colônias que contêm
inserções incorretas.
A inserção contém sequências
inespecíficas.
Solução
Testar a eficiência da
transformação usando um
plasmídio de DNA superenrolado.
Verificaras sequências de primers
que incluam 10 bases homólogas
nas extremidades do vetor.
Usar placas com a quantidade
apropriada de antibióticos.
Usar diferentes métodos de
purificação.
Ambos o produto da PCR e o vetor
linearizado devem ser purificados.
Não adicionar mais de que 10µl de
uma reação de mistura para 50µl
de células competentes. Mistura
de reação em excesso inibe a
transformação.
Certificar-se de que o vetor está
completamente digerido e
purificado pelo método de
recuperação de DNA em gel.
Refazer o processo, se necessário.
Se a inserção foi amplificada de
um plasmídio, pode ter sido
carregado o DNA circular através
da purificação,contaminando a
reação de clonagem. É
recomendado purificar o produto
da PCR ou DNA molde linearizado
por gel.
Se o produto da PCR não for uma
banda única, purifique a inserção
correta por gel.
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Tel.: +6 03 8025 1603
Fax: +6 03 8025 1637/1354
RESPONSÁVEL TÉCNICA
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira
CRQ/PR: 09302336
Aprovação:
21/01/2014
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Renata Morishita
Laboratório
Assinado por: Renata Morishita
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