Identificação fenotípica de Dientamoeba fragilis e Blastocystis

Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133
Artículo de Original
Identificação fenotípica de Dientamoeba fragilis
e Blastocystis hominis em pacientes atendidos no
ambulatório do Hospital Universitário de Brasília:
Caracterização molecular preliminar de isolados
diagnosticados
MINUZZI T. T. C. S.1 e CUBA CUBA C. A.1
1
Laboratório de Parasitologia Médica e Biologia de Vetores, Área de Patologia Faculdade de Medicina - UnBrasilia
Brasil.
ABSTRACT
PHENOTYPIC IDENTIFICATION OF DIENTAMOEBA FRAGILIS AND BLASTOCYSTIS
HOMINIS IN PATIENTS ASSISTED AT THE UNIVERSITY HOSPITAL OF BRASÍLIA:
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF PRIMARY SAMPLES ISOLATES
A high prevalence of Dientamoeba fragilis and Blastocystis hominis are reported on faecal samples
collected from patients attending the ambulatory service of the University of Brasilia teaching hospital
in Brasilia, Federal District, Brazil. Samples were collected directly into sodium acetate–acetic acid–
formalin (SAF) and also as unfixed specimens. During a period of may 2008 and january 2009 a D. fragilis
frequency of 31.5% (n = 89) among positive parasites samples and B. hominis 49.4% (n = 89), respectively,
was recorded. From 46 individuals an association of D. fragilis and B. hominis were identified in 8 patients.
Attempts of molecular identification were done and succesful results only achieved with the PCR/DNA of
B. hominis. These results confirm a high frequency of both intestinal protozoa among a selected outpatient
population. Of note, the higher presence of D. fragilis infections recorded is probably related to the
diagnostic methods used, which are rarely followed in laboratories for the diagnosis of intestinal parasites.
Clinical information was only available for a few of the patients with D. fragilis. For further work on its
pathogenic role and prevalence among patients with gastrointestinal symptoms, immediate collection of
fixed and unfixed specimens followed by staining routine procedures should be the mandatory procedures
into diagnostic laboratories. The authors emphasize also the importance and need of Ferric haematoxylin
staining assays on smears of faecal samples, on the basis of previous good direct microscopic observations
Recibido: 5 de Diciembre de 2009. Aceptado: 30 de Abril de 2010.
Correspondência: Thaís Tâmara Castro e Souza Minuzzi.
Campus Universitário Darcy Ribeiro, Laboratório de Parasitologia Médica e Biologia de Vetores,
Área de Patologia, Faculdade de Medicina - Universidade de Brasília - UnB. Brasília - DF. CEP
70.910-900.
E-mail: [email protected].
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DIENTAMOEBA FRAGILIS E BLASTOCYSTIS HOMINIS EM BRASÍLIA
of faecal specimens, for correct and accurate diagnosis of intestinal infections of these protozoan.
Key words: Dientamoeba fragilis, Blastocystis hominis, Survey, Brazil.
RESUMO
Dientamoeba fragilis e Blastocystis hominis são parasitas do trato gastrointestinal de humanos
que podem estar associados a infecções intestinais e diarréias, porém são negligenciados nos testes de
diagnóstico hospitalar. Amostras fecais foram coletadas de pacientes atendidos no ambulatório do Hospital
Universitário de Brasília (HUB), durante o período de maio de 2008 a janeiro de 2009, com objetivo
de identificar a presença de protozoários parasitas com ênfases em D. fragilis e B. hominis. Exames
coprológicos, auxiliados com técnicas de concentração, de preparação de lâminas permanentes coradas
com Hematoxilina Férrica e biometria de trofozoítos de D. fragilis e cistos e trofozoítos de B. hominis,
foram realizados para sua caracterização fenotípica. A técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction) foi
utilizada com primers específicos e otimizada com sucesso somente para B. hominis. Das 158 amostras
fecais coletadas, 69% foram do sexo feminino e 31% do sexo masculino. Destas, 56,3% das amostras
(n = 89) foram positivas para algum parasita intestinal, sendo que 28 amostras foram positivas para D.
fragilis e 44 para B. hominis. Ainda, 51,7% das amostras apresentaram mais de um parasita, verificando-se
associação entre D. fragilis e B. hominis em 8 amostras. Estudos moleculares confirmaram a presença de
B. hominis em 6 das 8 amostras positivas em microscopia de luz e em 2 das 5 amostras negativas. Estes
resultados evidenciam o que a literatura especializada relata: Um desconhecimento real da prevalência
destes protozoários, tanto pela falta do uso de técnicas adequadas de coloração, quanto pela não utilização
de ferramentas moleculares complementares.
Palavras chaves: Dientamoeba fragilis, Blastocystis hominis, Brasil.
INTRODUÇÃO
Dientamoeba fragilis é um parasita trichomonadideo do trato gastrointestinal de humanos que
pode estar associado a infecções intestinais e diarréias (Stark et al., 2005, 2008), além de ser um
agente causador de enterite severa em pessoas imunossuprimidas (especialmente em pacientes HIV
positivos) ( Lainson e Silva 1999).
O diagnóstico de D. fragilis pode ser feito por
meio da análise de fezes frescas ou fezes conservadas
(Peek et al., 2004). Para um diagnóstico definitivo
torna-se necessária a fixação e preparação de lâminas
permanentes. A identificação deste parasita não é
tarefa das mais fáceis, em razão de sua semelhança
com outros protozoários patogênicos ou não( Stark
et al., 2006), como, por exemplo, o Endolimax
nana, Blastocystis hominis e Trichomonas hominis
(Yang e Scholten 1977). Ademais, sua dificuldade
de sobrevivência no meio ambiente ou em meios
de cultura por tempo prolongado é outro fator que
dificulta sua identificação (Menghi et al., 2006).
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No Brasil há estudos que comprovam a ocorrência do parasita D. fragilis em portadores do
vírus HIV/AIDS3 e em populações indígenas (Lawrence 1983). Em Fortaleza (CE), há um único estudo relatando a presença do D. fragilis com outras
enteroparasitoses (Ridel et al., 1987). No DF não
foi encontrado na literatura revista nenhum estudo
sobre este parasita.
O outro objeto deste estudo é o enteroparasita
denominado B. hominis.
B. hominis é provavelmente o protozoário mais
comum encontrado no intestino humano (Clark
1997). Tal parasita também pode ser encontrado em
uma gama de animais como porcos, aves e anfíbios
(Abe et al., 2002, Stensvold et al., 2006).
Não existe consenso sobre o potencial patogênico deste organismo. Atualmente, assim como acontece com o D. fragilis, considera-se mais prudente considerá-lo como patogênico (Zaman e Howe
1995, Stenzel e Boreham 1996). Ademais, os sintomas da infecção por B. hominis são semelhantes
àqueles causados pelo D. fragilis.
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T. T. CASTRO e C. A. CUBA
No Brasil, alguns estudos de frequência e prevalência foram realizados em São Paulo, Bahia e
Paraná (Brites et al., 1997, Santos 2004, Nascimento e Montinho 2005, Martins et al., 2007). Nenhum
estudo, porém, foi encontrado no DF.
De fato, a falta de informação e de pesquisas
relacionadas com o diagnóstico laboratorial de D.
fragilis e B. hominis contribuem para a ocorrência
de inexplicáveis casos de diarréia crônica, dor abdominal, fadiga, flatulência, e tantos outros sintomas.
Justifica-se, nesse ponto, o objetivo principal
deste trabalho, qual seja, estabeler no Laboratório de
Parasitologia da UnB a capacidade de diagnóstico
fenotípico e molecular de ambos os protozoários.
MATERIAL E MÉTODOS
158 amostras fecais foram obtidas no Hospital
Universitário de Brasília (HUB), na seção de parasitologia, durante o período maio de 2008 a janeiro
de 2009. As fezes ainda frescas foram levadas para
o Laboratório de Parasitologia da Universidade de
Brasília (UnB) onde foram analisadas.
Aproximadamente, 2 g de fezes, de cada paciente, foram fixadas em SAF (acetato de sódio,
ácido acético e formol) e guardadas em temperatura ambiente para posterior técnica de sedimentação
espontânea de Hoffman, Pons e Jenner, ligeiramente modificada.
Os sedimentos de fezes, fixadas em SAF, foram
utilizadas para preparação de lâminas permanentes
coradas com Hematoxilina Férrica, com o intuito de
proceder a identificação de D. fragilis, B. hominis
e outros protozoários, por meio da visualização
por microscópio binocular óptico com lentes de
1.000X.
Para definir os tamanhos aproximados das
formas coradas de D. fragilis e B. hominis, foram
realizadas medições em microns (µm) do maior
e menor diâmetro utilizando-se um microscópio
calibrado (Leitz binocular) com uma ocular
micrométrica. Análises estatísticas foram realizadas
por intermédio do programa SPSS, versão 17.
Outros 2 g de fezes, dos mesmos indivíduos, foram diretamente sedimentadas utilizando-se a técnica modificada de Hoffman, Pons e Jenner e congeladas a - 20oC em tubos de eppenddorf 1,5 mL,
com 400 µl de fezes sedimentada sem re-suspender.
126
Este material foi utilizado para os ensaios moleculares.
Das 158 amostras, 8 positivas e 5 negativas para
D. fragilis e B. hominis, congeladas a - 20oC, foram
escolhidas para extração do DNA utilizando-se o kit
de extração de DNA em fezes da INVETEK (PSP
Spin Stool DNA Kit - Invetek - USA). A extração
de DNA seguiu o protocolo do kit e cada amostra
extraída obteve um volume final de 150 µl.
Após a extração de DNA, o material foi amplificado por PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando-se a enzima Taq polimerase (Invitrogen),
conforme instruções do fabricante.
A PCR, utilizada para confirmar a presença de
D. fragilis, foi amplificada utilizando-se primers
desenhados especificamente para ampliar somente
a região de genes trichomonadidae do rRNA
subunidade 16S. Estes primers foram chamados
de TRD3 e TRD5 (Johnson e Clark 2000). O
fragmento resultante deveria apresentar tamanho
em torno de 1.700 pares de bases.
Uma segunda ronda de PCR foi realizada utilizando com os primers DF3 e DF5 (Menghi et al.,
2005). O resultado, desta segunda ronda, deveria
apresentar tamanho em torno de 412 pares de bases.
O DNA de D. fragilis usado como controle
positivo foi gentilmente cedido pelo Dr. C. Graham
Clark (London School of Hygiene & Tropical
Medicine, Londres, Inglaterra).
O ciclo de amplificação da PCR para os primers
TRD3/TRD5 apresentou a seguinte reação: uma
desnaturação e ativação da enzima à 95ºC por 5
minutos, 40 ciclos com 95ºC por 1 minuto, 52ºC por
40 segundos e 72ºC por 1,5 minutos e finalmente,
com uma extensão de 72ºC por 7 minutos.
E a PCR para os primers DF3/DF5 apresentou
a seguinte reação: uma desnaturação e ativação da
enzima à 95ºC por 5 minutos, 40 ciclos com 95ºC
por 1 minuto, 54ºC por 40 segundos e 72ºC por 1,5
minutos e finalizando com uma extensão de 72ºC
por 5 minutos.
Na PCR que foi utilizada para confirmar a presença de B. hominis, utilizou-se os primers desenhados especificamente para ampliar a região de
genes do rRNA subunidade (SSU) 16S do gene de
Blastocystis. Estes primers foram chamados de F1
(Bohm-Gloning et al., 1997) e BHCRseq3 (Girginkardesler et al., 2003). O fragmento resultante
deveria apresentar tamanho em torno de 550 - 590
pares de bases.
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DIENTAMOEBA FRAGILIS E BLASTOCYSTIS HOMINIS EM BRASÍLIA
O ciclo de amplificação da PCR para os primers
F1/BHCRseq3 apresentou a seguinte reação: uma
desnaturação da enzima e ativação da enzima
à 95ºC por 5 minutos, 40 ciclos com 95ºC por 1
minuto, 54ºC por 40 segundos e 72ºC por 1,5
minutos e finalizando com uma extensão de 72ºC
por 7 minutos.
Os fragmentos amplificados resultantes foram
analisados em eletroforese com gel de agarose 1%,
0,5 X Tampão TBE (Tris Borato EDTA) e Brometo
de Etídeo.
Este trabalho foi submetido e aprovado pelo
Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da
Universidade de Brasília (UnB).
RESULTADOS
Caracterização do parasitismo: Das 158
amostras fecais coletadas, 109 foram do sexo feminino (69%) e 49 foram do sexo masculino (31%).
Não houve diferença estatística significativa em relação ao sexo na amostra estudada (c2 = 0,890 p >
0,005).
Das 89 amostras positivas para algum parasita
intestinal, 44 amostras foram positivas para B.
hominis, sendo que 30 foram do sexo feminino e 14
do sexo masculino. Já para D. fragilis, 28 amostras
foram positivas. Destas, 19 do sexo feminino e 9
do sexo masculino. Ademais, foram encontrados
outros protozoários parasitas intestinais além do D.
fragilis e B. hominis (Figura. 1).
Das 89 amostras positivas, verificou-se a ocorrência de poliparasitismo em 46 amostras (51,7%).
Destas amostras, 8 apresentaram associação entre
D. fragilis e B. hominis (Tabela 1).
Das 158 amostras coletadas, apenas 109
informaram a idade (57 pacientes positivos e 52
pacientes negativos indicaram a idade) (Figura 2).
Tendo por base o teste estatístico ANOVA, relacionando a idade x resultados positivos (monoparasitismo e poliparasitismo) e negativos, verificou-se
a ocorrência de resultado não significativo de 0,713
(p > 0,005).
Conclui-se, portanto, que não há relação direta
entre a idade do paciente e a positividade (entre
monoparasitismo e poliparasitismo) das amostras
analisadas.
Caracterização morfológica de D. fragilis:
A análise morfológica de D. fragilis evidenciou a
existência de diferenças relativas às formas e ao tamanho deste parasita. Assim, verificou-se variações
de tamanho que vão de 3 µm do menor diâmetro e
3 µm do maior diâmetro (3 x 3) a 10 µm do menor
diâmetro ao 17 µm do maior diâmetro (10 x 17).
O tamanho mais frequente foi de 5 µm do menor
diâmetro e 6 µm do maior diâmetro (5 x 6).
Figura 1. Gráfico relacionando as protozooses encontradas nas amostras fecais e sua frequência.
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T. T. CASTRO e C. A. CUBA
Figura 2. Gráfico relacionando a frequência das idades dos 89 pacientes positivos com as
protozooses encontradas, D. fragilis e B. hominis.
Tabela 1. Associações de parasitismo nas 46 amostras em que ocorreu mais de um protozoário
Poliparasitismo
Quantidade
Blastocystis hominis e Dientamoeba fragilis
8
Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis e Entamoeba coli
2
Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis e Iodamoeba bütschilii
4
Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Entamoeba coli e Giardia lamblia
1
Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Endolimax nana e Iodamoeba bütschilii
2
Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Giardia lamblia e Iodamoeba bütschilii
2
Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Endolimax nana, Entamoeba coli e Iodamoeba bütschilii
3
Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Chilomastix, Endolimax nana, Entamoeba coli e Iodamoeba bütschilii 1
Blastocystis hominis e Endolimax nana
3
Blastocystis hominis e Iodamoeba bütschilli
3
Blastocystis hominis, Endolimax nana e Entamoeba coli
1
Blastocystis hominis, Endolimax nana, Iodamoeba bütschilii
4
Blastocystis hominis, Entamoeba coli e Iodamoeba bütschilii
1
Dientamoeba fragilis e Endolimax nana
3
Dientamoeba fragili, Endolimax nana e Iodamoeba bütschilii
1
Endolimax nana e Iodamoeba bütschilli
3
Endolimax nana e Entamoeba coli
3
Entamoeba coli e Iodamoeba büstichilii
1
Total
46
Também foram encontradas formas mais arredondadas e ovaladas, além de formas com apenas
um núcleo (3 das 28 amostras) e com dois núcleos
(25 das 28 amostras) (Figura 3).
Caracterização morfológica de B. hominis:
Já com relação ao B. hominis, ocorreram variações
de tamanho de 3 µm do menor diâmetro e 4 µm do
maior diâmetro (3 x 4) até 12 µm do menor diâmetro
128
e 12 µm do maior diâmetro (12 x 12). O tamanho
mais frequente foi de 5 µm do menor diâmetro e
5 µm do maior diâmetro (5 x 5). Nestas amostras,
também, foram observadas formas diferentes para
B. hominis, como a forma vacuolar e multivacuolar.
A forma vacuolar foi a mais frequente, estando presente em todas as amostras positivas. Já a forma
multivacuolar foi encontrada em apenas uma amostra (Figura 4).
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DIENTAMOEBA FRAGILIS E BLASTOCYSTIS HOMINIS EM BRASÍLIA
Figura 3. Caracterização morfológica de D. fragilis
em lâminas, com coloração de Hematoxilina férrica,
visualizadas em microscópio óptico em aumento
1000X. Em A: Formas arredondadas e alongadas com
dois núcleos; B: Forma arredondada com dois núcleos
permitindo observar os grânulos nucleares; C: Forma
arredondada com apenas um núcleo; D: Forma alongada
e ameboíde com dois núcleos bem corados.
Figura 5. Gel de agarose 1% das 8 amostras positivas
em lâminas coradas com Hematoxilina Férrica para D.
fragilis. M: Marcador molecular (Kb+); 1-7 e 9: amostras
positivas em lâminas; 8: Controle Positivo cedido pelo C.
Graham Clark; 10: Controle negativo.
Caracterização molecular de D. fragilis: Não
foi possível amplificar as amostras fecais positivas
para D. fragilis identificadas em microscopia de
luz, não obstante as várias tentativas realizadas com
o objetivo de confirmar a presença deste parasita
por intermédio da PCR.
Numerosos ensaios de PCR foram realizados
modificando-se as temperaturas de anelamento,
porém, não foram obtidos resultados satisfatórios
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Figura 4. Caracterização morfológica de B. hominis
em lâminas, com coloração de Hematoxilina férrica,
visualizadas em microscópio óptico com aumento 1000X.
Em A: Forma vacuolar com dois núcleos e vacúolo sem
granuações; B: Forma multivacular com dois núcleos e
vacúolo com granulações; C: Forma vacuolar com dois
núcleos e vacúolo sem granulações; D: Forma vacuolar
com quatro núcleos e vacúolo sem granulações.
Figura 6. Gel de agarose 1 % das 8 amostras positivas
em lâminas para B. hominis. M: Marcador molecular
(Kb+); 1-7: amostra positivas em lâminas; 9: Controle
negativo.
e apenas houve a amplificação do controle positivo
cedido pelo C. Graham Clark (Figura 5).
Além disso, foram realizados procedimentos de
sedimentação com isopropanol, conforme citado
por MENGHI et al., (2006)7, para ajudar na amplificação do DNA, porém com resultado negativo.
Caracterização molecular de B. hominis: A
caracterização molecular de B. hominis demonstra
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T. T. CASTRO e C. A. CUBA
Figura 7. Caracterização molecular das 5 amostras
negativas em lâminas corada com Hematoxilina Férrica
para B. hominis. M: Marcador molecular (Kb+); 1-5:
amostras negativas em lâminas; 6: Controle negativo.
que das 8 amostras positivas em lâminas, 6 foram
confirmadas com a PCR (Figura 6). No gel de
agorose 1% verificou-se a ocorrência de uma banda
de 550 - 590 pb diagnóstica de B.hominis. Ainda,
das 5 amostras negativas em lâminas, duas foram
positivas para B. hominis (Figura 7).
DISCUSSÃO
Embora a amostragem estudada neste trabalho
não seja representativa da população em geral
do Distrito Federal, a frequência de D. fragilis
encontrada neste estudo, 31,5% das amostras, foi
considerada elevada.
O resultado encontrado é compatível com o
citado por Johnson et al., (2004) que variou entre
0% a 52%, dependendo da localidade pesquisada.
No Brasil, existem outros estudos que se enquadram nos referidos valores podendo-se citar o
de Lainson e Silva (1999), realizado com pacientes
HIV/AIDS positivos que apresentou uma frequência de 3%.
Em outros países, como na Austrália, observouse a prevalência de 0,9% de D. fragilis. Já na
Venezuela foi encontrada a prevalência de 0,5%
(Valle et al., 2006). Resultado diverso foi obtido
em estudo com crianças, em que foi reportada a
presença de D. fragilis em 82% dos casos (Preiss et
al., 1991).
Verifica-se que, não obstante a frequência da
infecção por D. fragilis encontrada por nosso estudo
(31,5%), referente aos pacientes atendidos no HUB
130
(DF), ser superior aos resultados encontrados,
como por exemplo, na Austrália, na Venezuela e
até mesmo em outros estudos realizados no Brasil,
ainda assim, ela está dentro dos limites citados
acima.
Os fatores que podem ter influenciado no resultado encontrado por este estudo, estão relacionados, principalmente, ao emprego de técnicas de
diagnóstico coprológicas apropriadas na coleta e
processamento das amostras e à falta de bons hábitos de higiene da população pesquisada, falta de
saneamento básico e ao desconhecimento de técnicas adequadas de manuseios de alimentos dos indivíduos parasitados.
O resultado obtido neste trabalho não é compatível com a realidade encontrada na maioria dos
laboratórios de análises clínicas do Brasil. Verificase que muitos destes laboratórios possuem técnicos
sem familiaridade com a morfologia do D. fragilis, outros não possuem infra-estrutura laboratorial
para manter o organismo vivo (in vitro) ou, simplesmente, não realizam uma identificação adequada do D. fragilis (Lainson e Silva 1999).
É importante ressaltar que a coloração de Hematoxilina Férrica é a mais indicada para realização
de lâminas permanentes para o parasita D. fragilis,
já que a membrana nuclear deste protozoário é delicada e não apresenta cromatina periférica( Stark et
al., 2006b) e, portanto, alguns autores consideram
seu uso obrigatório (Girginkardesler et al., 2003).
Outro ponto importante observado por este estudo, diz respeito à frequência de D. fragilis levando-se em conta o sexo dos pacientes contaminados.
Das 28 amostras positivas para D. fragilis,
19 foram do sexo feminino (67,9%) e 9 do sexo
masculino (32,1%). De acordo com Yang e Scholten
(1977), a infecção é maior em representantes do
sexo feminino do que no sexo masculino, isso
também foi observado neste estudo.
A totalidade dos casos positivos para D. fragilis
foram encontrados na faixa etária de 1 a 65 anos,
sendo que a de maior frequência foi entre a faixa
de 6 a 10 anos, corroborando os dados encontrados
da literatura (Yang e Scholten 1977, Norberg et al.,
2003, Girginkardesler et al., 2008).
Os resultados foram variados no que se refere à
forma e ao tamanho de D. fragilis. Em relação ao
tamanho, o menor diâmetro encontrado foi entre 3
µm a 10 µm e o maior diâmetro foi de 3 µm a 17
µm. Considera-se o tamanho de D. fragilis entre a
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faixa de 3,5 (Johnson et al., 2004) a 20 µm, sendo
típicos entre 5-15 µm (Stark et al., 2006b).
Em relação ao número de núcleos, verificou-se
que os trozofoítos de D. fragilis são, geralmente,
binucleares. Todavia, de 30 a 40% são mononucleados (Menghi et al., 2005). Nas séries observadas foram identificadas 3 amostras com trofozoítos
com apenas 1 núcleo.
A frequência de B. hominis neste estudo foi de
49,4% das amostras fecais positivas. Em estudos
realizados no Brasil, foram observadas frequências
mais baixas entre 15,1% e 16,7% (Nascimento e
Montinho 2005, Martins et al., 2007). Na Venezuela,
em estudo sobre predomínio de B. hominis, foi de
47% (Valle et al., 2006). Outro estudo revelou que
a prevalência de B. hominis é superior a 50% nos
países em desenvolvimento (Stenzel e Boreham
1996).
A totalidade dos casos positivos para B. hominis
está dentro da faixa etária de 1 a 81 anos, sendo
que a faixa de idade mais frequente foi a de 51 a 55
anos. Alguns autores reportaram as faixas etárias de
0 a 6 (Martins et al., 2007) e a de 30 a 40 (Doyle et
al., 1990) anos como as mais freqüentes.
Em B. hominis, a forma vacuolar foi frequente
em todas as amostras positivas. O tamanho observado variou de 3 µm a 12 µm do menor diâmetro
e 4 µm a 12 µm do maior diâmetro, sendo que o
tamanho mais frequente foi 5 µm do menor diâmetro e 5 µm do maior diâmetro. O tamanho da forma
vacuolar pode variar significamente entre 2 a 200
µm em diâmetro, com médias de 4 a 15 µm de diâmetro) Stenzel e Boreham 1996).
A forma multivacuolar foi encontrada em apenas
uma amostra, seu diâmetro foi de 5 µm do menor
diâmetro e 5 µm do maior diâmetro. Geralmente
esta forma apresenta seu tamanho entre 5 a 8 µm
(Abe et al., 2002).
O poliparasitismo ocorreu em 46 amostras
(51,7%). Desta amostras, 17,4% apresentaram associação entre D. fragilis e B. hominis. Associações
entre D. fragilis e B. hominis também foram encontradas em outros estudos (Ayadi y Barri 1999,
Sheehan et al., 1986, Girginkardesler et al., 2008).
Pode-se, portanto, inferir que a co-infecção entre
D. fragilis e B. hominis é comum.
A caracterização molecular de D. fragilis
foi mal sucedida. Apenas o controle positivo foi
amplificado, mostrando a correspondente banda
diagnóstica de 412 pb.
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Várias hipóteses podem ser levantadas para
justificar este resultado:
1) A obtenção do resultado negativo pode estar associado à existência de grupos de D. fragilis geneticamente distintos, conforme estudo de análise baseado na sequência de genes do rRNA,
pequena subunidade (16-S), no qual verificouse a existência de grupos geneticamente distintos de D. fragilis (Johnson e Clark 2000).
Assim, as amostras estudas podem ser geneticamente diferentes de outras regiões. De modo
que os primers desenhados por Johnson e Cark
(2000) e empregados também por Menghi et
al., (2005) podem não ter funcionado para as
amostras deste estudo;
2) Outra justificativa decorre do fato de que, apesar
de as amostras serem positivas em microscopia
óptica, poucos protozoários de D. fragilis foram
encontrados em cada uma delas, o que pode ter
influenciado na quantidade de DNA extraído de
cada amostra, não sendo possível, em razão da
pouca quantidade, sua amplificação via PCR;
3) O insucesso da ferramenta molecular, pode ter
relação com o fato de as amostras fecais não
terem sido fixadas. Assim, por não apresentar
cisto, mas apenas trofozoíto, pode ter ocorrido
uma rápida degeneração do DNA do protozoário;
4) Pode-se, também, considerar a presença de inibidores de DNA nas amostras analisadas, mesmo com a utilização de BSA como bloqueador
na PCR.
A caracterização molecular de B. hominis demonstrou que das 8 amostras positivas em lâminas,
6 foram confirmadas com a PCR.
A diferença entre o resultado de lâmina e molecular pode ter acontecido pelo fato de B. hominis apresentar uma extensiva diversidade genética
(Stensvold et al., 2007). Em análises moleculares
baseadas na sequência de genes do rRNA (SSU),
pequena subunidade (16-S), isolados de humanos,
são geneticamente diversificados em 9 subgrupos
(Ozyurt et al., 2008).
Portanto, os primers desenhados para identificação de B. hominis podem não ter funcionado nas
2 amostras positivas em lâminas, pois há a possibilidade de estas amostras serem geneticamente diferente das outras 6 amostras positivas.
Das 5 amostras negativas em lâminas, duas fo-
131
T. T. CASTRO e C. A. CUBA
ram positivas para B. hominis, fato que confirma a
maior sensibilidade da ferramenta molecular. Outra
justificativa encontrada pode estar relacionada com
o fato de este parasito apresentar seis formas diferentes, o que dificulta sua identificação em lâmina
(Abe et al., 2002).
Vale ressaltar que algumas formas de B. hominis
podem ser facilmente confundidas com trofozoítos
de D. fragilis levando a erros de sua real prevalência
nos inquéritos coprológicos.
Concluí-se que B. hominis e D. fragilis são
parasitas intestinais de grande importância para a
saúde pública e este estudo revela que estes parasitas estão sendo negligenciados, pois sua freqüência
é elevada e há escassez de estudos detalhados no
Brasil.
Além disso, a maioria dos laboratórios de diagnóstico clínico não sabem identificar ou não utilizam técnicas adequadas de coloração e de lâminas
permanentes para diagnosticar estes parasitas.
Por fim, cabe esclarecer que estudos moleculares
com D. fragilis continuam a ser realizados em
nosso laboratório, para um melhor diagnóstico e
caracterização deste parasita.
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