POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR - PPGBAIP
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POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR - PPGBAIP
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR HUMANO DE VITAMINA D (VDR) E SUA RELAÇÃO NA EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO PELO Helicobacter pylori NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA DINELMA DE JESUS MARTINS Belém-Pará 2015 DINELMA DE JESUS MARTINS POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR HUMANO DE VITAMINA D (VDR) E SUA RELAÇÃO NA EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO PELO Helicobacter pylori NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA Dissertação apresentada ao Programa PósGraduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientadora: Profa. Dra. Tereza Cristina de Oliveira Corvelo. Belém-Pará 2015 DINELMA DE JESUS MARTINS POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR HUMANO DE VITAMINA D (VDR) E SUA RELAÇÃO NA EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO PELO Helicobacter pylori NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Profa. Dra. Tereza Cristina de Oliveira Corvelo Instituto de Ciências Biológicas/UFPA Banca Examinadora: Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves (Avaliador) Instituto de Ciências Biológicas/UFPA Profa. Dra. Delia Cristina Figueira Aguiar (Avaliadora) Instituto de Ciências Biológicas/UFPA Prof. Dra. Hilma Lúcia Tavares Dias, UFPA (Suplente) Núcleo de Ciências Agrárias e Desenvolvimento Rural/UFPA Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto (Suplente) Instituto de Ciências Biológicas/UFPA Belém, 31 de Agosto de 2015 “Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor, mas, lutamos para que o melhor fosse feito. Não somos o que deveríamos ser, não somos o que iremos ser; mas, graças a Deus, já não somos mais o que éramos”. (Martin Luther King) DEDICATÓRIA A minha mãe, Adelvina França, por seu amor incondicional, dedicação e exemplo. Ao meu irmão, Daniel de Jesus Martins, por acreditar no meu sucesso. A minha avó, Maria Tereza França, que cuidou de mim durante uma boa parte de minha infância. Seus ensinamentos contribuíram muito para a formação do meu caráter. AGRADECIMENTOS A Deus, o único digno de louvor e adoração, aquele que é a própria expressão do amor, cujo sentimento se reflete na vida de suas criaturas. Através dele, encontrei esperança. Por seu amor, encontrei a vida eterna e nos momentos de aflição recebi o milagre da cura. A minha mãe, Adelvina Maria França de Jesus, pois a luz divina revestiu-se na figura materna como expressão do amor celestial. Esse amor que não mede esforços, que ultrapassa barreiras, que luta a qualquer custo pela felicidade de sua prole. Um sentimento sublime, que mesmo diante das agruras da vida, não desiste. A vitória do seu rebento é fruto de seu amor abnegado, que doa o seu tempo, que é capaz de lançar mão de seus sonhos para viver o maior deles, o dom de ser mãe. Ao meu irmão, Daniel de Jesus Martins, pelo companheirismo e momentos de alegria. À Professora Dra. Tereza Corvelo, pela orientação deste trabalho. Seu empenho, conselhos, paciência e profissionalismo foram essenciais para o desenvolvimento e conclusão desta dissertação. Obrigada pelos ensinamentos que contribuíram para o meu crescimento profissional e que me auxiliaram a divisar novos horizontes no campo do saber. A Gisely Matos, que não mediu esforços em repassar seus conhecimentos acadêmicos, estando presente em cada etapa deste trabalho. A Rosane Loyola, pelas orientações e conselhos. Aos amigos do Laboratório de Imunogenética da UFPA, Rafael Carvalho, Isabella Oliveira, Camille Sena, Eny Valente, Andreza Oliveira, Marcelo Vieira e Lenor Mandu pela amizade e por fazerem parte da minha trajetória acadêmica. Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação de Biologia em Agentes Infecciosos e Parasitários, pela competência e ensinamentos valiosos. Sumário LISTA DE TABELAS E QUADROS......................................................................................... 7 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ........................................................ 8 RESUMO ...................................................................................................................................... 10 ABSTRACT ................................................................................................................................. 11 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 12 1.1. Helicobacter pylori ............................................................................................................ 12 1.1.2. Características gerais................................................................................................ 12 1.1.3. Epidemiologia da infecção pela Helicobacter pylori............................................14 1.1.4. Rotas de transmissão ................................................................................................ 15 1.1.5. Patogenia da Helicobacter pylori ............................................................................. 17 1.2 VITAMINA D ..................................................................................................................... 19 1.2.1. Definição química e metabólitos ............................................................................. 19 1.2.2. Metabolismo da vitamina D..................................................................................... 20 1.2.3. Níveis séricos da vitamina D e fatores determinantes ......................................... 21 1.2.4 Receptor de vitamina D (VDR) ................................................................................ 21 1.2.5. Aspectos imunológicos da vitamina D.................................................................... 22 1.2.6. Gene VDR ................................................................................................................... 23 1.2.7. Polimorfismo do gene VDR ..................................................................................... 24 1.2.8. Variação étnica dos polimorfismos do gene VDR ................................................ 26 1.3. VITAMINA D e Helicobacter. pylori .............................................................................. 28 2.OBJETIVOS ............................................................................................................................. 30 2.1 OBJETIVO GERAL: .......................................................................................................... 30 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 30 3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 31 3.1. CASUÍSTICA .................................................................................................................... 31 3.2. CARACTERÍSTICAS DAS AMOSTRAS ...................................................................... 31 3.3. INQUÉRITO EPIDEMIOLÓGICO.................................................................................. 32 3.4. ASPECTOS ÉTICOS ........................................................................................................ 32 3.5. DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS .................................................... 32 3.5.1. Extração do DNA bacteriano e humano ................................................................ 32 3.5.2 Detecção da Helicobacter pylori por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ................................................................................................................................................ 32 3.5.3. Amplificação e detecção dos polimorfismos do gene do receptor humano de vitamina D (VDR) por RFLP-PCR ................................................................................... 33 3.5.4. Análise estatística dos dados .................................................................................... 34 4. RESULTADOS ........................................................................................................................ 36 5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 45 6. CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 53 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................... 54 APÊNDICE .................................................................................................................................. 73 LISTA DE TABELAS E QUADROS Tabela 1- Características demográficas e epidemiológicas dos grupos investigados. ............. 36 Tabela 2- Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos do gene VDR em grupo de infectados e não infectados pela H. pylori na região metropolitana de Belém-PA................... 38 Tabela 3- Distribuição genotípica do polimorfismo BsmI do gene VDR em relação com a fraca intensidade de atividade neutrofílica no grupo de infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-PA. ..................................................................................................................................... 40 Tabela 4- Distribuição das frequências haplotípicas (FokI, BsmI, ApaI e TaqI) do gene VDR nos grupos de indivíduos infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-PA. ................... 41 Tabela 5- Testes do desequilíbrio de ligação entre os 4 SNPs no gene VDR nos grupos estudados. Belém-PA. ................................................................................................................... 43 Tabela 6- Comparação entre as distribuições de frequências dos SNPs genotipados e dos haplótipos (BsmI-ApaI-TaqI) nos grupos estudados entre diferentes populações.................... 43 Tabela 7- Os valores do teste de diferenciação entre pares de população (Fst) na comparação de frequências locus a locus de amostras brasileiras e referências étnicas do HAPMAP. ....... 44 Quadro 1- Distribuição das frequências alélicas dos polimorfimos no gene VDR provenientes de grupos étnicos do projeto Hapmap. ......................................................................................... 27 Quadro 2- Identificação dos oligonucleotídeos iniciadores (primer), temperaturas (anelamento) e seus respectivos produtos utilizados para a genotipagem dos polimorfismos do gene VDR. Adaptado de Pani et al. (2000). ................................................................................ 33 Quadro 3 - Identificação das endonucleases de restrição, temperaturas de incubação (digestão enzimática) e seus respectivos produtos utilizados para a genotipagem dos polimorfismos do gene VDR. Adaptado de Pani et al. (2000). ................................................................................ 34 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS µL Microlitro Bab A Proteína de adesão aos antígenos de grupos sanguíneos cagA Gene codificante da citoxina CagA cagA Proteína de adesão aos antígenos e grupos sanguíneos cagPAI Região da ilha de patogenicidade do cromossoma da bactéria dupA Gene promotor de úlcera duodenal DNA Ácido desoxirribonucleico ELISA Ensaio imunoenzimático GM-CFS Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos H. pylori Helicobacter pylori IgG Imunoglobulina de cadeia pesada ϒ (gama) IL Interleucina IFN Interferon Leb Antígeno Lewis b de grupo sanguíneo NADPH Coenzima doadora de hidrogênio em sínteses redutoras e em reações para proteção contra compostos oxidantes OMP Famílias de proteínas da membrana externa OipA Proteína inflamatória A da membrana externa RFLP Polimorfismo do Comprimento do Fragmento de Restrição rRNA Ácido ribonucleico ribossomal mRNA Ácido ribonucleico mensageiro SabA Adesina ligante ao ácido siálico SNP Polimorfismos de nucleotídeo único TNF Fator de necrose tumoral UVB Radiação ultravioleta B VDR Receptor nuclear de vitamina D humano vacA Gene codificante da toxina VacA VacA Citocina vacuolizante RESUMO O Helicobacter pylori é um importante patógeno no contexto da saúde pública, pois está relacionado a etiopatogênese de muitas desordens gástricas. Os fatores genéticos do hospedeiro, aliado às características do ambiente e diversidade das estirpes bacterianas contribuem de forma significativa no estabelecimento, progressão e no desdobramento clínico da infecção. A vitamina D pode influenciar nesse processo, haja vista que ela é considerada um potente modulador do sistema imune inato e adaptativo. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo investigar a associação dos polimorfismos do gene receptor de vitamina D humano (VDR) com a presença da infecção causada pelo Helicobacter pylori. Para tanto, foi realizado um estudo transversal, analítico-descritivo, incluindo 208 indivíduos adultos com sintomatologias gástricas residentes na região metropolitana de Belém. A presença da infecção foi determinada a partir de análises histopatológicas e amplificação de DNA bacteriano por reação em cadeia de polimerase (PCR). Para genotipagem dos polimorfismos do gene VDR, a saber: BsmI (rs15444101), TaqI (rs731236), ApaI (rs7975232) e FokI (rs228570) foi empregada a técnica de PCR-RFLP, seguida da digestão com endonucleases específicas. Assim, a infecção pela H. pylori foi detectada em 56,25% dos pacientes pesquisados. Na análise das proporções genotípicas e alélicas dos polimorfismos FokI, ApaI e TaqI, verificou-se que não existiu diferenças na distribuição dessas proporções entre as amostras positivas e negativas para H. pylori, sendo que estas frequências amostrais estão compatíveis com o modelo de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em relação ao polimorfismo BsmI, foi observado um desvio significativo das frequências genotípicas observadas em relação as esperadas pelo teste de Hardy-Weinberg, ocorrendo um aumento do genótipo bb entre indivíduos com H. pylori positivo quando comparados com aqueles sem a infecção, 63,25% versus 50,55%, respectivamente. E ainda foi notado um aumento de 20,7% na frequência de heterozigotos Bb no grupo com H. pylori negativo em relação ao grupo de infectados, 37,36% versus 17,09%, respectivamente. Desse modo, os resultados apresentados neste estudo apontam para uma possível associação do polimorfismo BsmI com a infecção pela H. pylori. Entretanto, como ainda não foram descritas evidências consistentes de uma alteração funcional do receptor VDR com este SNP, se faz necessário efetuar abordagens mais extensas a nível molecular e que considere os níveis séricos da vitamina D nos pacientes com desordens gástricas, a fim de esclarecer melhor a relação destes polimorfismos no receptor VDR com a etiopatogênese da infecção pela H. pylori. Palavras-chave: Helicobacter pylori, Vitamina D, Polimorfismo, Gene VDR ABSTRACT The Helicobacter pylori is an important pathogen in public health context due its relation to the etiopathogenesis of many gastric disorders. The host genetic factors, environmental characteristics and the bacterial strain diversity contribute significantly to establishment, progression and clinical development of the H. pylori infection. The vitamin D may influence in this process because it is considered a strong modulator of innate and humoral immunities. In this context, this study aims to investigate the association between the human vitamin D receptor gene (VDR) and the Helicobacter pylori infection. Thus, a cross-sectional, descriptive and analytical study was conducted on 208 adult patients with upper gastrointestinal symptoms living in the Metropolitan Region of Belem. The presence of H. pylori in gastric biopsies sample was investigated by histopathological analysis and bacterial DNA amplification through Polymerase Chain Reaction (PCR).Patients were genotyped for VDR gene polymorphisms BsmI (rs15444101), TaqI (rs731236), ApaI (rs7975232) and FokI (rs2228570) by PCR-RFLP assays followed by specific endonucleases digestion. This way, the H. pylori infection was detected in 56.25% of patients. In allele and genotypic proportions, analysis of FokI, ApaI and TaqI polymorphisms did not show distribution differences of H. pylori positive and negative samples proportions and theses samples frequencies were compatible with HardyWeinberg equilibrium model. The genotype distribution observed for polymorphism BsmI deviated significantly from the expected by Hardy-Weinberg test, there was a bb genotype increase among H. pylori positive individuals when compared to those without infection, 63,25% versus 50,55% respectively. In addition, was also noticed a 20,7% increase into Bb heterozygous frequencies in H. pylori negative group against infected group, 37,36% versus 17,09% respectively. Thereby, the obtained results indicate a possible association between BsmI polymorphism and H. pylori infection. However, the conclusive evidence for functional alteration in VDR receptor has not yet been found for this SNP, it is necessary to make more extent approaches at molecular level which consider Vitamin D serum levels on patients who have gastric disorders, with the aim to clarify the relation between those VDR receptor polymorphisms and etiopathogenesis of H. pylori infection. Keywords: Helicobacter pylori, Vitamin D, Polymorphism, VDR gene. 12 1. INTRODUÇÃO 1.1. Helicobacter pylori A Helicobacter pylori foi descrita pela primeira vez pelos pesquisadores Warren e Marshall, em 1983, a partir de fragmentos de biópsias gástricas de pacientes com gastrite crônica e úlcera péptica (Marshall & Warren, 1983). A princípio, este microrganismo foi classificado no gênero Campylobacter, mas após análises da sua estrutura gênica e de outros parâmetros bioquímicos, verificou-se, em 1989, que esta bactéria não pertencia ao gênero descrito inicialmente e, portanto, foi reconhecido um novo gênero, denominado de Helicobacter (Blaser, 1996; Velázquez & Feirtag, 1999). De acordo com o sítio eletrônico “List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature”, o gênero Helicobacter é constituído de 34 espécies classificadas conforme a análise do gene rRNA 16S, ácidos graxos e filamentos flagelares. Das espécies que podem ser encontradas em associação com os processos infecciosos no homem, a H. pylori é particularmente importante no contexto da saúde pública, pois este microrganismo está relacionado à etiopatogênese de muitas desordens gástricas (Alcântara-Hernandez et al., 2014; Huang & Chiou, 2014; Prabhu & Shivani, 2014) e existem evidências que a infecção pela H. pylori esteja presente em 75% dos casos de adenocarcinoma gástrico (Greenfield & Jones, 2013), sendo classificada pela International Agency for Research on Cancer como carcinógeno do tipo I (Bouvard et al., 2009). Em 2012, as neoplasias malignas configuraram-se entre as principais causas de morte no mundo, sendo responsável por 8,2 milhões de óbito. Deste total, o câncer de estômago foi o terceiro mais frequente, com 723.000 casos fatais (WHO, 2012). No Brasil, a incidência câncer gástrico prevista para 2014 foi de 12.870 caso novos em homens e 7.520 casos novos em mulheres, o que corresponde a um risco estimado de 13,19 casos novos a cada 100 mil homens e 7,41 casos novos a cada 100 mil mulheres. Sem considerar os tumores de pele e melanoma, este tipo de câncer é o segundo mais frequente em homens (11,10/100.000) e o terceiro em mulheres (5,91/100.000) na região Norte (Ministério da Saúde, 2014). 1.1.2. Características gerais A H. pylori é uma bactéria Gram-negativa, não esporulada, microaerofílica, que coloniza a mucosa gástrica humana (Marshall & Warren, 1983). Ela é constituída de quatro a seis flagelos helicoidais do tipo unipolar, sendo que cada componente flagelar apresenta 13 dimensões de aproximadamente 30 μm de comprimento e 2,5 nm de espessura (Blaser, 1996). Em condições viáveis de crescimento, esta bactéria é caracterizada principalmente pela sua morfologia bacilar espiralada ou encurvada, mas pode exibir a forma cocóide quando exposta em situações ambientais adversas, conforme observado na figura 1 (Owen, 1998; Azevedo et al., 2007). Figura 1- Imagem em microscopia eletrônica da Helicobacter pylori (Fonte: Owen, 1998). A H. pylori apresenta condições ótimas de crescimento em uma atmosfera úmida (96% a 100%), enriquecido com gás carbônico (7% a 10%), com níveis reduzidos de oxigênio (5% a 15%) e com temperaturas que variam na faixa de 30°C a 37ºC (Siqueira et al., 2007). Os microrganismos pertencentes a esta espécie são catalase, oxidase e urease positivas e a presença de ferro, níquel, cobalto e cobre são essenciais para o seu metabolismo energético, manutenção da pressão osmótica e desenvolvimento (Kusters et al., 2006). A estrutura genômica da cepa ACTC 26695 da H. pylori é formada por um cromossoma circular contendo 1590 genes com quase 1,7 milhões de pares de base (Tomb et al., 1997). Existem descritas na literatura cerca de 40 diferentes tipos da bactéria, classificadas de acordo a análise do genoma bacteriano. Estas variações no genoma conferem às estirpes bacterianas distintos fatores de virulência e que determinam a sua colonização e as características das lesões no hospedeiro (Ladeira et al., 2003). 14 1.1.3. Epidemiologia da infecção pela Helicobacter pylori A frequência da infecção pela H. pylori apresenta uma distribuição variada nas diferentes regiões geográficas, com uma estimativa de casos que pode atingir mais da metade da população mundial. A configuração epidemiológica da infecção está diretamente relacionada com fatores ambientais, predisposição genética do hospedeiro e heterogeneidade das estirpes bacterianas (Malaty, 2007; Correa & Piazuelo, 2008). Na maioria dos países em desenvolvimento a prevalência da infecção pela H. pylori tem se mantido elevada no decorrer dos anos, com uma proporção de casos que varia de 45% a 95% (Carter et al., 2011; Cogo et al., 2011 Muhsen et al., 2012; Dorji et al., 2013; Coelho & Coelho, 2014; Zhang et al., 2014). Em contrapartida, na maior parte dos países desenvolvidos, a prevalência da infecção está declinando, podendo alcançar valores menores que 40%, como pode ser visto em estudos realizados na Austrália (Moujaber et al., 2008), Estados Unidos (Everhart et al., 2000; Patterson et al., 2012) e Japão (Ueda et al., 2014). No entanto, em Portugal, a prevalência estimada da infecção alcançou 84,2% da população adulta residente na cidade do Porto (Bastos et al., 2013). Dados epidemiológicos obtidos em seis países da América Latina (Chile, Colômbia, Costa Rica, Honduras, México e Nicarágua), mostraram que a infecção estava presente em 79,4% dos indivíduos adultos (Porras et al., 2013). No Brasil, a proporção de adultos infectados pela H. pylori é quase sempre próximo ou superior a 50% (Zaterka et al., 2007; Fialho et al., 2010; Cogo et al., 2011; Rasmussen et al., 2012), podendo atingir níveis acima de 80% em populações das regiões Norte e Nordeste (Rodrigues et al., 2005; Cartágenes et al., 2009). A taxa de aquisição da infecção pode ser bem expressiva na infância, principalmente nos primeiros cinco anos de vida. Desse modo, o aumento na curva de prevalência reflete o efeito cumulativo desta taxa ao longo do tempo, atingindo um equilíbrio ou apresentando uma leve tendência de declínio em faixas etárias superiores a 60 anos. Este declínio observado na população idosa pode ser explicado pela história natural da gastrite oriunda da infecção pela H. pylori, em que a atrofia da mucosa gástrica resulta na perda do nicho ecológico deste patógeno no estomago (Kodaira et al., 2002). Estudos sobre a prevalência da infecção pela H. pylori em crianças brasileiras, apontam frequências que oscilam entre 28,7% a 53,7% e os diferentes resultados apresentados estão relacionados com uma ou mais variáveis contextuais, tais como a falta de saneamento adequado, higiene básica, nível socioeconômico e superpopulação (Rodrigues et al.,2005; Rodrigues et al., 2007; Dattoli et al., 2010; Fialho et al., 2010; Miranda et al., 2010). 15 Em Fortaleza, Queiroz et al. (2012) avaliaram a prevalência da infecção em 353 crianças provenientes de uma comunidade pobre no ano de 2000. Desse total, 37,7% foram acompanhadas por um período de oito anos. Ao final do estudo, foi observado que a frequência de casos existentes aumentou de 53,7% para 64,7%. A porcentagem de crianças que permaneceram infectadas foi de 47,7%. Em Porto Velho, Rondônia, Rodrigues et al. (2007), concluíram que a soroprevalência variou significativamente em crianças na faixa etária de 2 a 13 anos, de acordo com o nível socioeconômico. Do total de crianças soropositivas para a infecção, 51% estavam em condições socioeconômicas desfavoráveis e 24% estavam categorizados no grupo de indivíduos de classe média alta. Em Belém, Pará, uma pesquisa realizada por Barile et al. (2009), apontou uma prevalência global da infecção de 67,5% no público infantil e o aumento de risco de transmissão esteve correlacionado com as precárias condições de higiene e saneamento e com a presença da infecção no ambiente intrafamiliar. Além dos fatores de risco mencionados acima, que estão relacionados com a prevalência da infecção pela H. pylori, deve-se levar em consideração que os aspectos associados ao estilo de vida do indivíduo contribuem de forma significativa na persistência e evolução clínica da infecção (Correa & Piazuelo, 2008). Neste sentido, estudos epidemiológicos evidenciam que fatores ligados a dieta, como o consumo frequente de alimentos com elevado teor de sal podem atuar como um dos elementos importantes para o desenvolvimento de câncer gástrico (Tsugane et al., 2007; Bertuccio et al., 2013; Gaddy et al., 2013). As agressões contínuas da mucosa gástrica também podem ser exacerbadas pelo hábito tabágico e consumo de bebidas alcoólicas (Bonequi et al., 2013). 1.1.4. Rotas de transmissão A mucosa gástrica humana é o principal reservatório da H. pylori (Kusters et al., 2006; Yang et al., 2013). Esta bactéria pode ser transmitida diretamente de pessoa para pessoa pelas vias fecal-oral, oral-oral e gastro-oral. O aumento do risco de contágio está correlacionado com as precárias condições higiênico-sanitárias e socioeconômicas, o que favorece a disseminação do parasita em água e alimentos contaminados (Ahmed et al., 2007; Zhu et al., 2014). A nível marginal, a propagação do microrganismo entre doentes também pode acontecer pelos efeitos iatrogênicos dos procedimentos endoscópicos gastrointestinais (Van Duynhoven & Jonge, 2001). 16 1.1.4.1. Rota de transmissão fecal-oral A hipótese da transmissão fecal-oral da H. pylori foi levantada inicialmente através dos estudos de Thomas et al. (1992). Estes autores isolaram a H. pylori a partir de amostras fecais de crianças provenientes de comunidades carentes do Oeste Africano. Estes resultados levaram os pesquisadores deste estudo a sugerirem que a elevada prevalência da infecção neste grupo populacional seria em decorrência da propagação da infecção pela via fecal-oral, sobretudo, por se tratar de uma comunidade com péssimas condições de higiene e saneamento. Para eles, esta via de transmissão poderia ser uma das explicações prováveis para a diferença na prevalência da infecção em países em desenvolvimento e desenvolvidos. Com base nesta evidência foi proposto que a disseminação do patógeno poderia ocorrer em água e alimentos contaminados com produtos fecais (Hopkins et al., 1993). A relação da fonte hídrica como possível reservatório da H. pylori foi analisada por Hulten et al. (1996), através da detecção deste agente infecioso em águas advindas do sistema de abastecimento público de comunidades de baixo poder aquisitivo, situadas próximo a capital peruana. Na avaliação de amostras de águas coletadas em regiões costeiras do Porto Rico, Trinidad e Geórgia, as quantidades detectadas de H. pylori nestas amostras foram consideradas baixa em relação a dose mínima infectante sugerida para este microrganismo, apesar de não existir um consenso quanto ao padrão microbiológico necessário para estimar os possíveis riscos à saúde pública (Holman et al., 2014). 1.1.4.2 Rota de transmissão gastro-oral O mecanismo de transmissão pela via gastro-oral foi proposto a partir do isolamento da H. pylori em amostras de secreções da mucosa gástrica, podendo ser este um veículo que facilitaria a passagem deste organismo na forma viável para a boca. A regurgitação e o vômito estão entre os sinais clínicos característicos na fase aguda ou inicial da infecção em crianças. Em adultos, a liberação destas secreções é comum em episódios de refluxo gastresofágico, especialmente na fase aguda da infecção (Deltenre & Koster, 2000; Parsonnet et al., 2000). 1.1.4.3. Rota de transmissão oral-oral A presença da H. pylori na cavidade oral foi documentada pela primeira vez em 1989, por meio do cultivo da bactéria em amostras extraídas da placa dental de pacientes com doenças gástricas associadas a este agente infeccioso (Krajden et al., 1989). Este patógeno também tem sido identificado na saliva (Ferguson et al., 1993; Medina et al., 2010; Yee et al., 2013) e sua distribuição na microbiota bucal pode envolver regiões das placas supragengivais (AVCU et 17 al., 2001), placas subgengivais (Riggio & Lennon, 1999; Gebara et al., 2004) e dorso da língua (Oshowo et al., 1998; Dowsett, 1999). 1.1.5. Patogenia da Helicobacter pylori A colonização da H. pylori se processa no antro e no corpo gástrico, e envolve diversos mecanismos e fatores de virulência específicos que afetam as propriedades da mucosa gástrica e determinam a adesão e sobrevivência do microrganismo no ambiente ácido do estomago (Yang et al., 2013). A habilidade do microrganismo de atravessar o lúmen gástrico e atingir a camada de mucina é observado pela motilidade de suas estruturas flagelares e pela sua capacidade de síntese da enzima urease (figura 2). Esta enzima é essencial para que a H. pylori obtenha amônia através da hidrólise da uréia, viabilizando a formação de um microambiente com pH neutro ao redor da bactéria (Kusters et al., 2006; Yang et al, 2013). Figura 2- Patogênese da infecção pela Helicobacter pylori e resposta imune do hospedeiro. Adaptado de Cadamuro et al. (2014) O passo seguinte é a aderência do patógeno a superfície do epitélio gástrico por múltiplas proteínas expressas em sua membrana externa (OMP), como SabA, BabA, AlpA. Destas proteínas, a BabA foi caracterizada como uma estrutura que se liga ao antígeno do grupo sanguíneo do tipo Lewis (Le b) presentes nas células gástricas, facilitando a colonização e induzindo a expressão de IL-8, a infiltração granulocítica, assim como a progressão da infecção, 18 os quais estão relacionadas com a formação de lesões pré-oncogênicas (Rad et al., 2002; Dossumbekova et al., 2012; Ishijima et al., 2011). A ilha de patogenicidade cag PAI engloba um conjunto de genes que produzem um dos fatores mais importantes de virulência da H. pylori. A região tem aproximadamente 40 Kb e permite que a bactéria module as vias do metabolismo celular da célula hospedeira. Entre os produtos gênicos dessa região, tem-se destaque para a proteína citotóxica associada ao gene A (CagA), a qual está envolvida na patogênese da gastrite e da ulceração gastroduodenal (Censini et al., 1996; Odenbreit et al., 2006). O complexo sistema de genes cag PAI interage conjuntamente através de um sistema de secreção T4SS do tipo IV, que funciona como uma “seringa” molecular capaz de injetar o fator de virulência CagA na superfície das células epiteliais gástricas e promover a transcrição do fator NF-kβ, e, consequentemente, a secreção das quimiocinas IL-8 e IL-1β (Kim et al., 2013; Cadamuro et al., 2014). A maioria das cepas cagA positivas também apresentam a proteína pró-inflamatória A da membrana externa (OipA), o que causa maiores danos à mucosa, uma vez que a OipA é considerada um intensificador da resposta inflamatória pela produção de IL-8 e está associada a um risco maior de desenvolvimento de doenças ulcerosas e câncer gástrico (Tabassam et al., 2008; Torres & Backert, 2008; Yamaoka et al., 2006). O efeito citotóxico deste bacilo é reforçado pela produção de toxinas vacuolizantes a partir do gene vacA, presente em todas as cepas de H. pylori. As variações polimórficas do gene vacA são identificadas dentro de duas principais regiões e que determinam o grau de citotoxicidade das diversas estirpes bacterianas: uma região indutora de sinal peptídico (região s) e uma porção medial (região m). As diferentes cepas podem ser classificadas de acordo com os tipos de alelos identificados neste gene (Dundon et al., 2001; Suzuki et al., 2012). Assim, a região indutora de sinal peptídico pode apresentar dois alelos, s1 e s2, enquanto a estrutura medial pode ser subdividida nos alelos m1 e m2. A toxina VacA afeta diversos tipos de células, incluindo as células epiteliais e células T. As diferentes atividades induzidas por esta substância podem causar diversas respostas, tais como a indução de apoptose celular (via mitocondrial) e a inibição da proliferação das células T (Boquet & Ricci, 2012; Palframan et al., 2012). Outro fator de virulência importante que foi descrito em 2005, refere-se ao gene promotor de úlcera gástrica dupA (Lu et al., 2005). O mecanismo de patogenicidade do dupA parece estar relacionado com a indução de altos níveis de IL-8 e com o aumento da infiltração de células inflamatórias na mucosa gástrica (Wang et al., 2015). Neste sentido, a presença de cepas de H. pylori positivas para o gene dupA representam um risco aumentado para o 19 desenvolvimento da úlcera duodenal e carcinoma gástrico, podendo ser considerado um marcador específico para estas doenças (Douraghi et al., 2008; Zhang et al., 2008). 1.2 VITAMINA D 1.2.1. Definição química e metabólitos O termo vitamina D é designado para um grupo de substâncias lipossolúveis classificadas como secoesteróides, os quais atuam como nutrientes importantes para a saúde humana (Chiellini et al., 2011) A principal forma nutricional deste composto é o colecalciferol (vitamina D3 ), sintetizado na pele através da absorção da radiação ultravioleta (UV) pelo 7desidrocolesterol. Além da produção endógena, quantidades significativas da vitamina D 3 também podem ser encontradas naturalmente em peixes de água salgada (salmão, atum e cavala) e em doses pequenas no fígado bovino e ovos (Holick et al., 2011; Schmid & Walther, 2013). Outra fonte da vitamina D é o ergocalciferol (vitamina D 2), que pode ser produzido sinteticamente a partir da exposição UVB do ergosterol presente em leveduras e fungos (Stephensen et al., 2012; Krings et al., 2014). Tanto o colecalciferol quanto o ergocalciferol são produzidos comercialmente para o uso em suplementos vitamínicos e na fortificação de alimentos (Wacker & Holick, 2013). Figura 3- Estrutura química do ergocalciferol (vitamina D2) e do colecalciferol (vitamina D3). Figura adaptada de Jovicic et al. (2012). 20 Como observado na figura 3, a vitamina D2 se diferencia estruturalmente da D3 pela dupla ligação entre o carbono 22 e 23 e pela adição de um grupo metil no carbono 24 (Jovicic et al., 2013). Ainda existe discordância se esses dois compostos atuam de forma diferente no organismo humano, mas análises epidemiológicas atuais sugerem que a suplementação diária com o colecalciferol é mais efetiva na melhora dos níveis séricos da vitamina D3 quando comparado com o uso da vitamina D2 (Tripkovic et al., 2012; Lehmann et al., 2013; Logan et al., 2013). Através de um ensaio clínico randomizado com 33 adultos saudáveis foi postulado que a vitamina D3 produz um efeito substancialmente maior do que a D 2 , aumentando os níveis de armazenamento de vitamina D de 2 a 3 vezes mais que seu equivalente químico (Heaney et al., 2011). 1.2.2. Metabolismo da vitamina D A ativação da vitamina D proveniente da síntese endógena ou da ingestão alimentar é caracterizada por uma sequência de hidroxilações que se processam no fígado e nos rins. Na síntese endógena, a formação do colecalciferol (vitamina D 3 ) ocorre através da exposição do tecido cutâneo à radiação ultravioleta B (UVB) com um comprimento de onda de 290 a 320 nm. A ação fotoquímica induz a conversão do 7-desidrocolesterol em previtamina D3 (Fuse et al., 2012). Nessa etapa, a previtamina D 3 sofre um processo de isomerização que resulta na formação do colecalciferol, o qual, posteriormente, liga-se principalmente à proteína transportadora de vitamina D (DBP, vitamin D binding protein) presente na corrente sanguínea para ser armazenado no fígado (Chun, 2012). Na forma exógena, a vitamina D é absorvida nas células intestinais por difusão passiva, incorporadas aos quilomícrons e armazenadas no tecido hepático (Gonçalves et al., 2013). Parte dessa vitamina também é estocada no tecido adiposo e muscular (Garg et al., 2012). Ao serem armazenados no fígado, os metabólitos secoesteróides da vitamina D são catalisados por diversas enzimas, incluindo a enzima mitocondrial CYP27A1 e a enzima microssomal CYP2R1 (Chanakul et al., 2013). O produto desta reação enzimática é caracterizado pela hidroxilação da vitamina D na posição do carbono 25, produzindo a 25hidroxivitamina D (calcidiol: 25 [OH] D3; ercalcidiol: 25[OH] D2); sendo considerada a principal forma circulante no plasma (Henry et al., 2012). A etapa final da bioativação é a conversão da 25-hidroxivitamina D em 1,25dihidroxivitamina D (calcitriol: 1,25[OH]2D3; ercalcitriol: 1,25[OH]2D2), mediada pela enzima CYP27B1(1-α-hidroxilase). O mecanismo primário desta reação ocorre principalmente nos 21 rins, porém, outros tipos de células tais como os queratinócitos, macrófagos e osteoblastos também podem contribuir para a síntese da 1,25-dihidroxivitamina D (Haussler et al., 2012). 1.2.3. Níveis séricos da vitamina D e fatores determinantes O status da vitamina D é determinado principalmente pela dosagem dos níveis séricos da 25-hidroxivitamina D3 (Personne et al., 2013). A meia vida da 25-hidroxivitamina D3 é de aproximadamente de 15 dias na corrente sanguínea, com uma concentração que varia de 25 a 200 nmol/L, enquanto que, a meia vida da 1,25(OH)2D3 no plasma é de no máximo 15 horas (Jones, 2008). De acordo com os critérios estabelecidos por Grant & Holick (2005) para estimar as concentrações plasmáticas adequadas de 25-hidroxivitamina D3 (25[OH] D3 ), foi proposto que os valores séricos ótimos estão acima de 80 nmol/L, enquanto que concentrações abaixo de 50 nmol/L indicam a deficiência da vitamina D. Os níveis séricos da vitamina D são influenciados por diversos fatores, incluindo aspectos ambientais, fisiológicos e estilo de vida (Hossein-Nezhad & Holick, 2013). A exposição inadequada à luz solar constitui um elemento importante para a definição das causas da deficiência da vitamina D. Os indivíduos com maior grau de pigmentação da pele produzem uma quantidade menor de colecalciferol pela via cutânea, uma vez que a melanina compete com o 7-desidrocolsterol pelos fótons UVB (Libon et al., 2013). A quantidade e a qualidade da exposição solar também podem ser reduzidas pelas condições do ambiente, como a poluição do ar e as variações sazonais (Tsiaras & Weinstock, 2011). 1.2.4 Receptor de vitamina D (VDR) O VDR é membro da superfamília dos receptores nucleares e atua como um fator de transcrição ligante-dependente (Zhang et al., 2011). Ele tem sido detectado em vários tecidos e células do corpo humano, estando presente nos ossos (osteoblastos e condrócitos), epitélio intestinal, túbulos renais, tecido pancreático, sistema imune (monócitos, macrófagos e linfócitos T), glândulas (paratireoides, pituitárias, mamárias e próstata) e brônquios (Wang et al., 2012). O receptor VDR apresenta 4 regiões distintas e estruturalmente bem definidas. Duas dessas regiões são constituídas por segmentos relativamente constantes: o domínio de ligação do ligante (LBD) e o domínio de ligação do DNA (DBD). Estas duas estruturas se conectam por uma curta sequência de aminoácidos flexíveis denominada de região de dobradiça. O 22 domínio aminoterminal é a porção mais variável do receptor tanto no comprimento quanto na sequência, contendo apenas 24 aminoácidos em sua estrutura (Helsen & Claessens, 2014). Quando a 1,25-dihidroxivitamina D interage com o domínio LBD ela ocupa de 55 a 57% do sítio de ligação do ligante (Wu et al., 2013). A ligação de uma substância agonista na região C-terminal do LBD induz uma reorientação das estruturas α-hélices presente neste receptor. Essa mudança conformacional permite o recrutamento de coativadores peptídeos envolvidos no processo de transcrição gênica. A interação com o DNA ocorre através do domínio DBD, em uma porção do gene denominada de elemento de resposta hormonal (VDREs), o que favorece a regulação da transcrição de genes específicos (Helsen & Claessens, 2013). 1.2.5. Aspectos imunológicos da vitamina D A vitamina D promove um amplo espectro de interações fisiológicas que contribuem para a mineralização da matriz óssea e manutenção da homeostase do cálcio e fosfato (Carlberg & Campbell, 2013; Prietl et al., 2013). Além de seus efeitos clássicos no sistema endócrino, tem sido demonstrado que a vitamina D age de forma autócrina e parácrina na modulação dos sistemas imune inato e adaptativo (Kamen et al., 2010). Neste sentido, os níveis séricos da vitamina D pode desempenhar um papel importante na resistência do hospedeiro aos agentes infecciosos, como pode ser observado em diversos estudos conduzidos com Mycobacterium tuberculosis (Areeshi et al., 2014; Joshi et al., 2014; Hong et al., 2014), o vírus da imunodeficiência humana (Eckard et al., 2013; GuzmanFulgencio et al., 2014;) e da hepatite C (Villar et al., 2013). As análises moleculares sobre os efeitos dessa vitamina no sistema imune inato revelam que a sua forma ativa, a 1,25 dihidroxivitamina D3, modula a expressão de genes envolvidos na síntese de peptídeos antimicrobianos (Wang et al., 2004; Liu et al., 2006) e exerce diferentes efeitos na diferenciação de monócitos, macrófagos (Di Rosa et al., 2012), células dendríticas (Sommer & Fabri, 2015) e neutrófilos (Youssef et al., 2011). Em um modelo experimental realizado em pacientes com tuberculose, verificou -se que a síntese de 1,25(OH)2D3 em células monocíticas constitui um fator importante na montagem da resposta imune inata para esta infecção microbiana. A ativação dos receptores TLR/2 em isolados de macrófagos, através da interação com o Mycobacterium tuberculosis, induz a expressão de genes que codificam o receptor VDR e a enzima CYP27B1. Esta enzima estimula a conversão da 25 hidroxivitamina D 3 em 1,25(OH)2D3 a nível celular. A sinalização mediada 23 pelo complexo formado pela 1,25(OH)2D3 e o receptor VDR contribui para a melhora da expressão de catelicidinas antimicrobianas nos macrófagos e reforça os efeitos do sistema imune inato a fim de eliminar o patógeno (Liu et al., 2006). A ação da 1,25(OH)2D3 na imunidade adaptativa pode ser observada em linhagens de células linfocíticas tanto do tipo T quanto do tipo B. Esse metabólito inibe a produção de IFNƴ e de interleucinas IL-2 e IL-5 pelas células T auxiliares e atua como agente indutor da diferenciação e aumentando a síntese de interleucina IL-4 (Boonstra et al., 2001; Mahon et al., 2003). É provável que a expressão do receptor VDR seja importante na regulação da proliferação das células naïve T CD8 + em doenças inflamatórias do trato gastrointestinal (Chen et al., 2014). Em um trabalho experimental foi demonstrado que a 1,25(OH)2D3 interage na modulação de linfócitos B, inibindo a sua diferenciação celular e a secreção de imunoglobulinas IgG (Chen et al., 2007). 1.2.6. Gene VDR O gene responsável pela expressão do receptor de vitamina D humano (VDR) está localizado no cromossomo 12q13.11 (Taymans et al., 1999). A sua estrutura gênica abrange uma região de aproximadamente 70,49 Kb (National Center for Biotechnology Information), sendo que a extremidade 5’ do gene contém uma região promotora heterogênea (figura 4), constituída por sequencias exônicas (1A,1B,1C,1D,1E,1F) não codificantes e que por intermédio de um processamento alternativo, geram sequências diferenciadas na região promotora, onde interage os fatores de transcrição. Para este gene, também foram descritos 8 exons (exons de 2 a 9) responsáveis pela expressão das proteínas estruturais do receptor VDR. Posteriormente a esta região, existe uma larga sequência de aproximadamente de 3,2 Kb que compõe a extremidade 3’ não codificante, responsável pela regulação gênica (Miyamoto et al., 1997; Crofts et al., 1998). 70,49 Kb Figura. 4- Estrutura básica do gene do receptor VDR. Adaptada de Uitterlinden et al. (2004). 24 Assim, o início da codificação do produto gênico ocorre a partir do exon 2 com a síntese do domínio regulador N-terminal. A transcrição do domínio de ligação ao DNA se processa no exon 2 e termina no exon 3, enquanto que os exons 4 e 5 codificam o domínio de ligação do ligante e o exon 6 a região de dobradiça. Os exons de 7 a 9 participam da transcrição da região C-terminal do receptor VDR. (Whitfield et al., 2001). O gene contém áreas com baixo e alto desequilíbrio de ligação e a análise de 15 blocos haplotípicos para 37 SNPs apontam diferenças quanto ao padrão de distribuição dessas estruturas nos diferentes grupos étnicos. Em populações de Africano-Americanas o mapa de desequilíbrio de ligação é muito fragmentado e substancialmente diferente em relação ao grupo de Asiáticos e Caucasoides (Fang et al., 2005). 1.2.7. Polimorfismo do gene VDR Dos 62 polimorfismos que foram descritos até o presente momento no gene VDR, 57 são nucleotídeos de polimorfismo único (SNP) e 5 do tipo VNTR (número variável de repetição em tandem), dos quais 15% estão presentes nas regiões não codificantes do gene (Fang et al., 2005). Os principais SNP utilizados atualmente no gene VDR em estudos de associação genética (Oh et al., 2013; Liu et al., 2013; Maalmi et al., 2013, Mao et al.,2014) incluem os marcadores de fragmentos de restrição (RFLP) FokI (Gross et al.,1998), BsmI (Morrison et al.,1992), ApaI (Faraco et al., 1989) e TaqI (Morrison et al., 1994). O FokI está situado no exon 2, próximo a região central do gene, enquanto os demais polimorfismos citados estão localizados na extremidade 3’ UTR, cuja variação alélica é observada no intron 8 para o BsmI, intron 9 para o ApaI e no exon 9 para o TaqI (Whitfield et al., 2001). A variante polimórfica FokI é caracterizada pela transição de timina por citosina (ATG para ACG). Essa mudança de nucleotídeo muda o quadro de leitura de tradução gênica para a próxima trinca ATG, o que resulta na síntese de uma proteína estruturalmente mais curta (figura 5). Deste modo, a proteína predita de 427 aminoácidos é resultado da localização da metionina no primeiro códon ATG, na presença do alelo T (designado como alelo f), ao passo que a metionina transcrita no ATG seguinte pela presença do alelo C (designado como alelo F) produz uma estrutura protéica de 424 aminoácidos (Arai et al., 1997; Jurutka et al., 2000). 25 Um estudo in vitro foi realizado com o objetivo de esclarecer o significado funcional dessa mutação. Assim, foi relatado que o SNP FokI-f promove uma atividade transcricional reduzida do fator TFIIB em relação ao SNP FokI-F (Jurutka et al., 2000). Além disso, tem-se especulado que a isoforma protéica contendo 424 aminoácidos apresenta uma atividade mais responsiva para 1,25(OH)2D3 (Colin et al., 2000). Figura 5- Representação esquemática da mutação que ocorre na posição 30.920 no gene VDR. Diferentemente do que acontece com a variante alélica do exon 2, as mutações situadas na extremidade 3’ estão em desequilíbrio de ligação (Ingles et al.,1997; Oh et al., 2014) e a extensão desse desequilíbrio é diferente nos diversos grupos étnicos (Fang et al., 2005). Conforme disponível no banco de dados de polimorfimos de nucleotídeo único do NCBI (National Center for Biotechnology Information), os polimorfismos observados em regiões intrônicas para os marcadores BsmI (rs1544410) e ApaI (rs7975232) estão localizados nas posições 63.980 e 64.978 do gene VDR, respectivamente. Estas mutações são definidas pela transição de guanina (GCG) por adenina (GCA) para o marcador BsmI e pela transversão de citosina (GCC) por adenina (GCA) para o marcador ApaI. Para o polimorfismo detectado pela enzima de restrição TaqI (rs731236), observa-se uma substituição de timina (ATT) por citosina (ATC) na posição 65.058 no exon 9 do gene VDR, porém, a troca de bases nitrogenadas não altera o aminoácido isoleucina para este códon (National Center for Biotechnology Information). Para Morrison et al. (1994) as variações polimórficas presentes na região 3’ não traduzida podem interferir em sua estabilidade molecular, e assim alterar os níveis de expressão 26 do RNA mensageiro. No entanto, os resultados apresentados por Durrin et al (1999) levaram estes autores a concluírem que os polimorfismos da porção 3’ do gene VDR não alteram a estabilidade do RNA mensageiro. Segundo eles, tem-se conjecturado de que as variantes do gene VDR estejam em desequilíbrio de ligação com outros polimorfismos verdadeiramente funcionais presentes em genes adjacentes. Outra hipótese sustentada é que sequências próximas ao gene VDR interagem na transcrição, tradução e processamento do mRNA. 1.2.8. Variação étnica dos polimorfismos do gene VDR Em uma análise desenvolvida por Uitterlinden et al. (2004), foi observado diferenças substanciais nos padrões de distribuição das frequências alélicas associadas aos polimorfismos do gene VDR em três grupos étnicos. O estudo mostrou que o alelo “f” do SNP FokI, ocorreu com menor frequência em africanos, quando comparados com europeus e asiáticos. Para o alelo B do SNP BsmI, a distribuição é muito mais baixa na população asiática em relação ao grupo de europeus e africanos. Um padrão similar é identificado para o alelo T do marcador TaqI, com uma frequência menor em asiáticos (figura 6). 100% 74% 80% 60% 51% 44% 42% 40% 36% 34% 43% 31% 31% 24% 20% 8% 7% 0% FokI (alelo f) BsmI (alelo B) Europeu Africano ApaI (alelo A) TaqI (alelo T) Asiático Figura 6- Comparação das frequências alélicas do gene VDR entre os grupos de origem européia, africana e asiática. Adaptado de Uitterlinden et al. (2004). A determinação da frequência alélica para estas variantes nas populações advindas do Projeto Internacional HapMap (Internacional HapMap Project), ressaltam as diferenças observadas em grupos provenientes da Ásia, África e Europa. O alelo “f” do SNP BsmI apresentou uma distribuição relativamente inferior na população de ascendência africana 27 (YRI). No conjunto de indivíduos de origem asiática (CHB), a frequência do alelo “t” para o SNP TaqI foi expressivamente menor em relação aos demais grupos (quadro 1). Quadro 1- Distribuição das frequências alélicas dos polimorfimos no gene VDR provenientes de grupos étnicos do projeto Hapmap. Alelos rs1035810(Fok I) C (F) T (f) rs1544410 (BsmI) A (B) G (b) rs7975232(ApaI) A (A) C (a) rs731236 (TaqI) T (T) C (t) Frequência dos polimorfismos *Europeu **Africano ***Asiático 0,558 0,442 0,805 0,195 0,588 0,412 0,036 0,964 0,272 0,728 0,438 0,562 0,270 0,730 0,600 0,400 0,571 0,429 0,971 0,029 0,718 0,282 0,562 0,438 *População residente em Utah com ascendência do norte e oeste europeu (CEU); **Grupo étnico africano iorubá de Ibadan, Nigéria (YRI); *** Chineses Han de Pequim, China (CHB). A distribuição destes polimorfismos na população brasileira, baseado na declaração da cor da pele, foram comparadas com os resultados obtidos na base de dados do projeto HapMap (The Internacional HapMap Project) por Rezende et al. (2007) para os grupos de brancos e negros. Estes autores observaram que no grupo de indivíduos categorizados como negros, foi observado uma diferença significativa na frequência dos genótipos para o polimorfismo ApaI em relação ao grupo de brancos do projeto HapMap. O mesmo ocorreu para as frequências genotípicas e alélicas do marcador FokI. Os genótipos BsmI, ApaI e FokI não apresentaram desvios significativos quanto ao teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Por se tratar de uma população com um alto grau de miscigenação e heterogeneidade genética, originários de Europeus, ameríndios e Africanos, há de se considerar que o padrão de distribuição destes polimorfismos pode variar nas diferentes regiões brasileiras. Com base nesta premissa, Lins e et al. (2011) analisaram as frequências alélicas dos polimorfismos do gene VDR na população brasileira (figura 7), e identificaram que, nas cincos regiões geopolíticas do território brasileiro, a frequência dos alelos do gene VDR não apresentou diferença estatística entre as amostras regionais e consequentemente para a população brasileira como um todo. Ao se comparar as amostras brasileiras com os grupos étnicos do 28 projeto HapMap, os autores deste estudo observaram que a população brasileira foi geneticamente mais distante da população de africanos em relação ao grupo de europeus. Figura 7- Distribuição dos polimorfismos do gene VDR na população brasileira. Adaptado de Lins et al. (2011). T TaqI t 63% ApaI 37% A a 54% 46% b B 40% BsmI 61% F FokI f 67% 0% 10% 20% 30% 33% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1.3. VITAMINA D e Helicobacter. pylori Com o objetivo de elucidar o papel do receptor de vitamina D (VDR) e de seus genes alvos na mucosa gástrica de pacientes infectados com Helicobacter pylori, Guo et al. (2014) encontraram uma correlação positiva entre a expressão de RNA mensageiros (mRNA) do VDR e a infecção por este patógeno. Os resultados desse trabalho também apontaram uma associação significativa para o score de inflamação no epitélio gástrico, níveis de catelicidinas antimicrobianas e interleucinas (IL-6 e IL-8/CXCL8). No trato gastrointestinal, as catelicidinas humanas LL-37 são ativamente produzidas por células epiteliais do estomago, principalmente durante a infecção e inflamação (Wong et al., 2011). A interação desse peptídeo antimicrobiano na infecção por H. pylori ainda não está completamente esclarecida, mas um trabalho preliminar realizado com camundongos mostrou que ablação do gene responsável pela síntese de catelicidinas aumentou significativamente a suscetibilidade de colonização pela H. pylori associada com gastrite, quando comparada com o controle, uma linhagem de camundongos do tipo selvagem (Zhang et al., 2013). Neste aspecto, os efeitos da vitamina D, no sentido de limitar a atividade bacteriana, podem ser essenciais para evitar um potencial dano inflamatório que surge a partir de uma resposta inata. A ativação da 1α,25(OH)2D3 tem-se mostrado importante em subpopulações de células linfocitárias, atuando na modulação dos receptores de células T (TCR) e diminuindo a proliferação de linfócitos auxiliares do tipo T CD4+, especialmente as subpopulações Th1 e 29 Th17 e de imunoglobulinas G (IgG), além de inibir a diferenciação de células dendríticas (Lang et al., 2012). Em contraste, a elevada expressão de linfócitos Th1 e Th17 em decorrência da colonização pela H. pylori contribuem para a patogênese persistente da infecção e para o desenvolvimento e manutenção da inflamação crônica da mucosa gástrica (Shi et al., 2010). Esses achados podem indicar que as análises sobre a variação do status da vitamina D sejam importantes na avaliação da suscetibilidade da infecção causada pela H. pylori. Assim, a investigação das variantes alélicas presente no gene VDR humano é uma outra abordagem que tem sido extensivamente explorada nos últimos anos (Oh et al.,2014; Wang et al.,2013; Wang et al.,2012; Li et al.,2013; Torres et al.,2010; Serrano et al., 2013) e que pode estar relacionado com a epidemiologia da infecção pela H. pylori e com os fatores indutores da resposta inflamatória para este patógeno. 30 2.OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL: Investigar a associação dos SNPs de RFLP do gene receptor de vitamina D humano (VDR) com a presença de infecção pela Helicobacter pylori em pacientes atendidos na seção de endoscopia do Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB) /UFPA, em Belém-PA. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS -Estimar as frequências genotípicas e haplotípicas das variantes polimórficas TaqI (rs731236), ApaI (rs7975232), BsmI (rs15444101) e FokI (rs228570) presentes no gene do receptor de vitamina D (VDR) na população de estudo. - Verificar a associação da distribuição de frequências dos polimorfismos de RFLP estudados em indivíduos infectados e não infectados com cepas virulentas de H. pylori. -Correlacionar as variantes dos polimorfimos RFLP no gene VDR com as alterações histopatológicas na mucosa gástrica. - Comparar a distribuição das frequências alélicas e haplotípicas dos SNPs de RFLP no gene VDR entre indivíduos não infectados e infectados com a H. pylori e destes com as frequências já descritas para outras populações brasileiras e de diferentes grupos étnicos provenientes do Projeto Internacional HapMap. 31 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. CASUÍSTICA A linha de investigação da pesquisa tem como base o estudo transversal, analíticodescritivo, que incluiu dados epidemiológicos e amostras de DNA genômico obtidos de pacientes atendidos no Hospital Universitário João de Barros Barreto da Universidade Federal do Pará (HUJBB-UFPA), coletadas no período compreendido entre abril de 2011 a março de 2012. 3.2. CARACTERÍSTICAS DAS AMOSTRAS A população de estudo foi composta por 208 indivíduos residentes na região metropolitana de Belém, de ambos os sexos, com idade igual ou superior a 18 anos. Os sujeitos da pesquisa foram avaliados previamente quanto aos sinais e sintomatologias gástricas através da aplicação de um questionário semi-estruturado, sendo incluídos na pesquisa os indivíduos que referiram queixas referentes ao aparelho digestivo superior, que não fizeram tratamento regular específico para infecção pela H. pylori nos últimos seis meses e os que declararam não utilizar inibidor de bomba de prótons como subcitrato de bismuto, citrato de ranitidina bismuto e/ou antibióticos nos últimos 30 dias. Aqueles que apresentaram histórico de ga strectomia parcial ou total ou risco de sangramento gastrointestinal foram excluídos da pesquisa. Os pacientes foram admitidos na seção de Endoscopia Digestiva do HUJBB e daqueles sintomáticos, coletou-se seis fragmentos de biópsias da região do estomago (antro e corpo gástrico) para a detecção da infecção pelo Helicobacter pylori e determinação dos polimorfismos FokI, BsmI, ApaI e TaqI do gene VDR humano, através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os fragmentos de biópsia gástrica foram estocados em solução de formalina a 10%, e, posteriormente, corados na técnica de coloração Hematoxilina- Eosina (HE). Para a classificação histológica da mucosa gástrica, empregou-se os critérios adotados pelo Sistema de Sydney (Dixon et al., 1996), atribuindo uma escala de graduação de 0 a 3 (normal, leve, moderada e acentuada, respectivamente). Para a detecção de cepas de H. pylori nas lâminas histológicas foi utilizado o método de coloração Gram modificado com auxílio de microscopia óptica convencional, tendo como critério diagnóstico, as características deste microrganismo, ou seja, a forma espiralada e encurvada e a presença da coloração azul intensa. 32 3.3. INQUÉRITO EPIDEMIOLÓGICO Para o levantamento das informações epidemiológicas foi utilizado um questionário semi-estruturado, contendo questões referentes ao perfil sócio-demográfico e estilo de vida dos participantes. Na avaliação sobre o consumo de cigarro foi adotado o Questionário de Tolerância de Fagerström (Heatherton et al., 1991), que apresenta perguntas relacionadas ao hábito tabágico e nível de dependência de nicotina através das quantidades de cigarros consumidos e tempo de tabagismo. A investigação quanto ao etilismo foi delineada a partir de um questionário de frequência quanto ao uso de bebidas alcoólicas, conforme informações relatadas pelo público alvo. 3.4. ASPECTOS ÉTICOS As amostras biológicas do presente estudo foram colhidas com permissão do sujeito da pesquisa para serem utilizadas e armazenadas a posteriori em outros estudos científicos relacionados com a infecção pela H. pylori, conforme foi submetido à avaliação e aprovação pelo Comitê de Ética de Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Universitário João de Barros Barreto (Parecer nº 1820/2010). Todos os participantes envolvidos na pesquisa concordaram em assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, assegurando-lhes a preservação do anonimato e sigilo no tratamento dos dados. 3.5. DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS 3.5.1. Extração do DNA bacteriano e humano A extração do DNA das amostras foi realizada através da técnica do fenol-clorofórmio descrita por Miller et al. (1988). Após a coleta do material biológico, amostras de sangue total e de biopsias gástricas foram submetidas ao tratamento com proteinase K e etapas subsequentes de centrifugação e sedimentação, para retirada do DNA do sobrenadante por precipitação em etanol à 99,5%. As alíquotas de DNA foram devidamente estocadas de acordo com as normas de biosseguranças e mantidas sobre temperatura de congelamento (-20ºC) no Laboratório de Imunogenética do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará. 3.5.2 Detecção da Helicobacter pylori por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) As análises das biópsias gástricas de antro e corpo para o diagnostico clinicolaboratorial referente à infecção pelo Helicobacter pylori foram baseadas a partir de ensaios 33 histopatológicos e amplificação de DNA bacteriano pela técnica PCR, usando os iniciadores P1 e P2 para determinar a sequência de 298 pares de bases presentes em todas as cepas de Helicobacter pylori (Hammar et al., 1992). As amostras positivas para H. pylori foram identificadas quanto a presença dos marcadores de virulência do tipo cagA e vacA s1m1 através da técnica molecular de PCR Multiplex, cujo protocolo foi adaptado de Chattopadhay et al. (2004). 3.5.3. Amplificação e detecção dos polimorfismos do gene do receptor humano de vitamina D (VDR) por RFLP-PCR A genotipagem dos polimorfismos TaqI (rs731236), ApaI (rs7975232), BsmI (rs15444101) e FokI (rs228570) foi conduzida utilizando oligonucleotídeos iniciadores (direto e reverso) específicos para cada marcador gênico (quadro 2). Assim, as alíquotas de DNA foram amplificadas por reação em cadeia de polimerase (PCR) e o produto obtido foi submetido à digestão com endonucleases de restrição. As concentrações dos reagentes e as condições de tempo e temperatura para cada etapa das PCRs foram determinadas conforme informações extraídas de Pani et al. (2000). Quadro 2- Identificação dos oligonucleotídeos iniciadores (primer), temperaturas (anelamento) e seus respectivos produtos utilizados para a genotipagem dos polimorfismos do gene VDR. Adaptado de Pani et al. (2000). Produtos SNP Sequência (5’ -3’) Anelamento (PCR) F: AGCTGGCCCTGGCACTGA 65.6ºC FokI (265pb) rs2228570 R: ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC rs1544410 F:CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA R:AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG 64ºC BsmI (825pb) rs7975232 F:CAGAGCATGGACAGGGAGCAA R:GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC 68º C ApaI (740 pb) rs731236 F:CAGAGCATGGACAGGGAGCAA R:GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC 68º C TaqI (740 pb) Para a amplificação de 1µL de DNA genômico em uma mistura contendo um volume final de 25 µL foram empregadas 0,5 µL da enzima Taq DNA polimerase (2,5 U/ µL), 2,5 µL de tampão 10 X (200 mM Tris-HCl 500 mM KCl, pH de 8,4), 2,5 mM de cada DNTP, 1,5 mM de MgCl2 . Os oligonucleotídeos iniciadores foram utilizados na concentração de 2,4 µM.A ciclagem da reação foi conduzida a uma temperatura inicial de desnaturação de 95ºC por 5 minutos, seguida de 30 ciclos contendo as seguintes especificações para cada etapa: 94ºC por 30s, temperatura de anelamento por 45s, 72º C por 1 minuto e extensão final por 7 minutos. 34 Os produtos da PCR foram monitorados por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio e visualizados sobre luz ultravioleta. Os fragmentos amplificados foram diluídos em tampão apropriado e digeridos com aproximadamente 5U de enzima (quadro 3). As soluções enzimáticas foram armazenadas em tubos de microcentrífuga e incubadas em banho maria para que ocorra a digestão enzimática de acordo com período estipulado pelo fabricante. Após essa etapa, o produto digerido foi visualizado por eletroforese em gel de agarose a 2 Quadro 3 - Identificação das endonucleases de restrição, temperaturas de incubação (digestão enzimática) e seus respectivos produtos utilizados para a genotipagem dos polimorfismos do gene VDR. Adaptado de Pani et al. (2000). Endonucleases de restrição Temperatura de incubação Sítio de restrição Produtos RFLP (pb) FokI 37ºC 5’-GGATG N9 -3’ 3’-CCTAC N13 -3’ BsmI 65ºC 5’- GAATGCN -3’ 3’- CTTAC GN-5’ TaqI 65ºC 5’- T CG A-3’ 3’- A GC T-5’ FF: 265 Ff:265,196 e 69 ff:196 e 69 BB: 825 Bb:825,650 e175 bb:650 e175 TT:245 e 495 Tt:495,290,245 e 205 tt:290,245 e 205 37ºC 5’- G GGCC C-3’ 3’- C CCGG G-5’ AA:740 Aa:740,530 e 210 aa:530 e 210 ApaI A representação genotípica e alélica das variantes polimórficas do gene VDR foi baseada de acordo com a presença (letra minúscula) ou ausência (letra maiúscula) do sítio de restrição enzimático (quadro 3). Para o FokI, os genótipos CC, CT e TT, corresponde a FF, Ff e ff, respectivamente. Os genótipos AA, AG e GG do BsmI foi representado por BB, Bb e bb, respectivamente. As variantes AA, AC e CC do ApaI foi identificado por AA, Aa e aa, respectivamente. As formas genotípicas TT, TC e CC do TaqI é simbolizado pelas letras TT, Tt e tt, respectivamente. 3.5.4. Análise estatística dos dados Os dados da pesquisa foram tabulados através do programa Microsoft Excel® 2013 e para aplicação dos testes estatísticos foi adotado o nível de significância de 5% (p-valor < 0,005). 35 Os parâmetros epidemiológicos e demográficos foram analisados quanto ao possível risco de infecção pela H. pylori usando a função Odds Ratio (OR), assumindo um limite de intervalo de confiança de 95%. As frequências alélicas e genotípicas foram comparadas entre os grupos de infectados e não infectados pela H. pylori através do teste χ2 de Mantel-Haenszel, com o Odds Ratio ajustado para as covariáveis sexo e idade, sendo que estas distribuições de frequências ainda foram avaliadas quanto ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Aplicou-se o teste binomial nas comparações efetuadas entre as proporções genotípicas do marcador BsmI do gene VDR com os diferentes grupos de estudo e também para as análises desse marcador quanto aos aspectos histológicos da mucosa gástrica. Os cálculos estatísticos foram realizados com o auxílio do programa Bioestat ® versão 5.0 (Ayres et al., 2007). O padrão do desequilíbrio de ligação par-a-par entre os marcadores do gene VDR da população estudada foi inferido pelo programa Haploview® 4.2 (Barret et al., 2005), tendo como parâmetro estatístico o coeficiente de desvio padronizado (D’) de Lewontin (1988) e o quadrado do coeficiente de correlação (r2). Desse modo, o desequilíbrio de ligação dos blocos haplotípicos foi analisado de acordo com os critérios estabelecidos por Gabriel et al. (2002), os quais consideram um par de SNP em forte desequilíbrio de ligação com um valor de D’ dentro de um intervalo de confiança de 95%, limite inferior maior que 0,70 e limite superior acima de 0,98 e valor de r2≥ 0,8, sendo excluído da análise marcadores que apresentaram menor frequência alélica (MAF) inferior a 5%. A distribuição e análise estatística das frequências haplotípicas foram determinadas pelo programa SHEsis ® (Shi et al., 2005) para os blocos formados com os polimorfimos FokI, BsmI, ApaI e TaqI e para os haplótipos da região 3’UTR do gene VDR (BsmI, ApaI e TaqI). As frequências alélicas e haplotípicas da população investigada foram comparadas com os grupos populacionais estudados pelo Consórcio Internacional de Mapa de Haplótipos (The Internacional HapMap Project). Assim, para representar a população de origem asiática foram incluídas em um único grupo as amostras provenientes de chineses Han da cidade de Pequim (CHB) e de japoneses da cidade de Tóquio (JPT), categorizados pela sigla ASN. Para as populações de origem européia e africana, foram escolhidos os grupos amostrais de residentes em Utah, nos Estados Unidos, com ancestralidade do norte e oeste da Europa (CEU) e do grupo étnico africano Yoruba de Ibadan, Nigéria (YRI). As estimativas de distância genética entre os polimorfismos do gene VDR foram calculadas pela estatística Fst de Wright através do programa Alerquin® versão 3.01 (Excoffer et al., 2005). 36 4. RESULTADOS Dos 208 pacientes incluídos no estudo, a média geral de idade foi de 53,04 ± 15,20 anos, sendo de 51,38 ± 15,22 anos para o grupo diagnosticado com H. pylori positivo e de 55,18 ± 14,98 anos para os indivíduos com resultado negativo para este patógeno. D esse total de amostras, 60,58% (126/208) pertenciam ao sexo feminino e 90,86% (189/208) foram categorizados quanto à cor da pele como negróides. A infecção pela H. pylori foi detectada em 56,25% (117/208) dos pacientes pesquisados. Em relação aos aspectos demográficos e epidemiológicos, que podem ser considerados fatores de risco ao desenvolvimento da infecção pela H. pylori, não foram observadas diferenças significativas entre as amostras positivas e negativas para H. pylori quanto as variáveis: sexo, faixa etária e estilo de vida (tabagismo, elitismo e consumo de frutas). No grupo de indivíduos infectados pela H. pylori, 66,67% eram mulheres e entre os não infectados o percentual para este gênero correspondeu a 52,75% (tabela 1). Tabela 1- Características demográficas e epidemiológicas dos grupos investigados. Variáveis Infecção pela H. pylori Positivo Negativo N=117 (%) N=91(%) Gênero Feminino 78 (66,67) 48 (52,75) Masculino 39 (33,33) 43 (47,25) Faixa etária < 45 anos 39 (33,33) 21 (23,08) ≥ 45 anos 78 (66,67) 70 (76,92) Cor da pele Caucasóides 16 (13,68) 3 (3,30) Negróides 101 (86,32) 88 (96,70) Tabagismo Fumante 18 (15,38) 9 (9,89) Não fumante 99 (84,62) 82 (90,11) Elitismo Elitista 54 (46,15) 29 (31,87) Não elitista 63 (53,85) 62 (68,13) Consumo de frutas Ocasionalmente 93 (79,49) 62 (68,13) Diariamente 24 (20,51) 29 (31,87) Ancestralidade Europeu 49 (41,88) 37 (40,66) Indígena 41 (35,04) 34 (37,36) Africano 27 (23,08) 20 (21,98) *1,00: Grupos de referência utilizados na análise. OR (IC 95%) P-valor 1,79 (1,02-3,15) *1,00 0,0581 1,67 (0,89-3,10) *1,00 0,1428 4,65 (1,31-16,48) *1,00 0,0196 1,66 (0,70-3,88) *1,00 0,3362 1,83 (1,03-3,24) *1,00 0,0518 1,81 (0,97-3,40) *1,00 0,0884 0,98 (0,48-2,01) 0,89 (0,43-1,86) *1,00 0,8958 0,9096 37 Quanto à faixa etária dos grupos estudados, verificou-se um predomínio de indivíduos com 45 anos ou mais de idade (67% no grupo de infectados versus 77% nos não infectados). Entre os hábitos de vida, como tabagismo e consumo de frutas não foi observado diferenças entre os grupos estudados, sendo que 85% no grupo de infectados e 90% no grupo de não infectados eram fumantes e apenas 20% e 30% dos indivíduos de cada um destes grupos estudados, respectivamente, declararam o consumo diário de frutas. Contudo, o elitismo mostrou uma tendência a diferir na proporção de indivíduos elitistas no grupo de pacientes infectados comparado aos não infectados (46% infectados e 32% não infectados). Em relação à cor da pele, aproximadamente 86% e 96% dos indivíduos foram categorizados como negróides, incluindo aqueles de cor parda e negra, nos grupos de pacientes infectados e não infectados pela H. pylori, respectivamente. Para esta variável, constatou-se que entre os caucasoides a probabilidade de infecção pela H. pylori foi de 4,6 vezes superior à dos negróides, sendo esta diferença estatisticamente significativa. A estimativa da proporção de ancestralidade genética de origem africana, europeia e de indígenas nativos mostrou-se similar entre o grupo de infectados e não infectados pela H. pylori, levando em consideração a autodeclaração dos pacientes relativo ao seu histórico familiar de etnicidade. Neste aspecto, nota-se uma contribuição expressiva das diferentes etnias na composição das amostras analisadas, sobretudo das etnias europeias e indígenas (tabela1). Esta análise demonstrou que algumas variáveis como gênero, idade, cor da pele, elitismo e consumo de frutas (considerando p ≤ 0,20) são diferentes entre os dois grupos de infectados e não infectados, indicando necessidade de empregá-las como fatores de confundimento (interferência) nas análises de associação entre os marcadores genéticos investigados no risco de desenvolver infecção pela H. pylori. Quando se considera a distribuição dos polimorfismos do gene VDR (tabela 2), verifica-se que as frequências alélicas e genotípicas observadas para as variantes FokI, ApaI e TaqI não apresentaram diferenças significativas entre as amostras positivas e negativas. Entretanto, em relação ao SNP BsmI, foi detectada uma prevalência aumentada do genótipo bb entre indivíduos com H. pylori comparados com aqueles sem a infecção (63,25% versus 50,55%, respectivamente) e a frequência do genótipo heterozigoto Bb estava aumentada no grupo H. pylori negativo se comparado com o grupo de infectados (37,26% versus 17,09%, respectivamente). 38 Tabela 2- Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos do gene VDR em grupo de infectados e não infectados pela H. pylori na região metropolitana de Belém-PA. VDR/SNPs Infecção pela H. pylori Positivo Negativo n=117 (%) n=91 (%) χ2 (p-valor) OR (IC 95%) * OR (IC 95%) FokI Genótipos FF Ff Ff Alelos F F BsmI Genótipos BB Bb Bb Alelos B b ApaI Genótipos AA Aa Aa Alelos A A 56 (47,86) 45 (38,46) 16 (13,68) 41 (45,05) 36 (39,56) 14 (15,38) 157 (67,09) 77 (32,91) 118 (64,84) 64 (35,16) 23 (19,66) 20 (17,09) 74 (63,25) 11 (12,09) 34 (37,36) 46 (50,55) 66 (28,21) 168 (71,79) 56 (30,77) 126 (69,23) 47 (40,17) 48 (41,03) 22 (18,80) 37 (40,66) 40 (43,96) 14 (15,38) 142 (60,68) 92 (39,32) 114 (62,64) 68 (37,36) 0,2061 (0,9021) 0,2331 (0,6292) 11,325 (0,0034) 0,3247 (0,5687) 0,4525 (0,7974) 0,1650 (0,2331) TaqI Genótipos TT 70 (59,83) 53 (58,24) 0,0766 (0,9624) Tt 39 (33,33) 32 (35,16) Tt 8 (6,84) 6 (6,59) Alelos T 179 (76,50) 138 (75,82) 0,0254 (0,8732) T 55 (23,50) 44 (24,18) *Odds Ratio ajustado para as covariáveis sexo e idade; **1,00= análise. **1,00 **1,00 0,92 (0,50-1,66) 0,81 (0,44-1,52) 0,18(0,37-1,90) 1,04 (0,44-2,42) **1,00 0,90(0,60-1,36) **1,00 **1,00 0,28 (0,11-0,70) 0,2 (0,11-0,72) 0,77 (0,34-1,72) 0,70 (0,31-1,59) **1,00 1,13(0,74-1,73) **1,00 0,94 (0,52-1,72) 1,24 (0,56-2,74) **1,00 0,91(0,49-1,68) 1,23(0,53-2,83) **1,00 1,09 (0,73-1,62) **1,00 **1,00 0,92 (0,51-1,66) 0,95 (0,52-1,73) 1,01 (0,33-3,09) 1,00 (0,52-1,73) 1,00 0,96 (0,61-1,52) grupos de referência utilizados na Deste modo, foi verificada a existência de associação entre a infecção pela H. pylori e cada um dos polimorfismos de RFLP do gene VDR (FokI, BsmI, ApaI e TaqI), mediante a obtenção das estimativas de Odds Ratio (OR), além do valor da estatística 2 de MantelHaenszel, conforme os resultados dispostos na tabela 2, sendo que com relação às frequências 39 genotípicas do BsmI entre infectados e não infectados, confirmou-se o efeito de Odds Ratio (0,28), indicativo de proteção para o heterozigoto Bb. Adicionalmente, fez-se o teste de homogeneidade dos grupos, e ao comparar as frequências gênicas destas amostras a fim de verificar se elas diferem significativamente ou não entre si, pode-se concluir que estas duas amostras estudadas de indivíduos infectados e não infectados pela H. pylori não diferem significativamente entre si (χ2yates= 0,3247, GL=1, p=0,5687) quanto às frequências dos alelos B e b do BsmI e podem ser consideradas homogêneas, isto é, como extraídas de uma única população. Então, uma análise estratificada foi utilizada na obtenção da estimativa do Odds Ratio ajustado para os polimorfismos averiguados, controlando-se o efeito das variáveis idade e sexo. Os resultados desta análise encontram-se dispostos na tabela 2. A avaliação da amostra global para as proporções genotípicas observadas no estudo, comparada de acordo com o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), apontou valores concordantes com este teste para os polimorfismos FokI (χ 2=3,5688, p=0,0589), ApaI (χ2=2,3481, p=0,1254) e TaqI (χ 2=0,7205, p=0,3960). Entretanto, para o marcador BsmI (χ2=29.048, p < 0,001), as proporções genotípicas observadas diferiram significativamente das esperadas, revelando-se em desequilíbrio de Hardy-Weinberg. Do mesmo modo, quando a amostra foi subestratificada no grupo de infectados pela H. pylori, os polimorfismos FokI (χ2= 1,9458, p=0,1630), ApaI (χ 2= 2,3008, p=0, 1254) e TaqI (χ2=0,6240, p=0,4296) também apresentaram distribuições genotípicas compatíveis com o modelo de equilíbrio de Hardy- Weinberg, o que não ocorreu para as frequências genotípicas observadas para o marcador BsmI (χ 2=39,0777, p < 0,0001). No grupo de indivíduos não infectados pela H. pylori, não foram observados desvios estatisticamente significativos das frequências genotípicas observadas em relação às esperadas em nenhum destes polimorfismos do gene VDR. Neste sentido, os resultados mostrados na figura 8 evidenciam diferenças altamente significativas em relação à distribuição de frequências genotípicas entre os indivíduos não infectados e aqueles infectados com cepas virulentas e não virulentas da H. pylori. Entre estes grupos, percebe-se nitidamente que entre os H. pylori negativo e H. pylori positivo não virulento, a proporção de indivíduos com o genótipo BB é menor no grupo não infectado. Entretanto, quando se compara as proporções genotípicas dos não infectados com os infectados com cepas virulentas, constata-se uma maior proporção do genótipo bb no grupo de positivos virulentos e do genótipo Bb nos indivíduos H. pylori negativos. Por outro lado, quando se compara este grupo de positivos virulentos, estas diferenças observadas nas proporções 40 genotípicas se mantem idênticas quando relacionadas ao grupo de indivíduos infectados com cepas não virulentas, ou seja, também ocorre uma maior proporção do tipo Bb no grupo de positivo não virulento e do genótipo bb no grupo de indivíduos positivos virulentos. Figura 8 – Frequência (%) genotípica do polimorfismo BsmI do gene VDR nos grupos de infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-PA. BB Bb bb Considerando que a distribuição genotípica do RFLP BsmI apresentou uma associação significativa com grupo de pacientes infectados pela H. pylori, foi realizado um teste binomial na comparação entre os indivíduos dos genótipos do tipo bb versus BB/Bb, a fim de avaliar a relação de dependência entre estes genótipos com o grau de intensidade do infiltrado neutrofílico na mucosa gástrica destes indivíduos. Tabela 3- Distribuição genotípica do polimorfismo BsmI do gene VDR em relação com a fraca intensidade de atividade neutrofílica no grupo de infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-PA. Mucosa gástrica Infecção pela Genótipos Fraca atividade neutrofílica p-valor Z-valor H. pylori N % Bb 33/60 55,00 Cepas virulentas 0,0552 1,5964 BB+Bb 9/25 36,00 Cepas não virulentas Bb BB+Bb 8/14 13/18 57,14 77,22 Negativo bb BB+Bb 43/46 40/45 93,48 88,89 0,1865 0,8909 0,2198 0,7730 E como demonstrado na tabela 3, a proporção de indivíduos infectados pelas cepas virulentas da H. pylori, que apresentavam uma intensidade fraca de atividade neutrofílica, foi maior nos indivíduos portadores do genótipo bb em relação aos genótipos BB/Bb, enquanto que 41 não foi observada diferença entre a proporção de indivíduos com os genótipos bb ou BB/Bb e os níveis de atividade neutrofílica na mucosa gástrica dos infectados com cepas não virulentas, e ainda, ocorreu um efeito similar, sem diferenças significativas, entre os grupos genotipados bb ou BB/Bb nas amostras dos não infectados pela H. pylori. Após a avaliação dos genótipos isolados, foram também calculadas as frequências dos blocos haplotípicos para os quatros polimorfismos (FokI, BsmI, ApaI e TaqI) analisados no gene VDR como descritas na tabela 4. De forma geral, observou-se que o padrão dos blocos haplotípicos gerados para estes marcadores nas amostras positivas foi equivalente às proporções encontradas naqueles diagnosticados sem a infecção. Os haplótipos “FbAT” (21,22% nos casos positivos versus 23,32% para os negativos) e “FbaT” (19,55% nos casos positivos versus 18,61% para os negativos) foram os mais frequentes em ambos os grupos estudados. Os padrões haplotípicos “fBat” e “fbat” não foram detectados nas amostras de infectados. Tabela 4- Distribuição das frequências haplotípicas (FokI, BsmI, ApaI e TaqI) do gene VDR nos grupos de indivíduos infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-PA. χ2 p-valor OR (IC 95%) FBAt (CAAC) Infecção pela H. pylori Positivo Negativo N=234 (%) N=182 (%) 23,14 (9,89) 20,11 (11,05) 0,262 0,6087 0,85 (0,45-1,60) FBAT (CAAT) 15,40 (6,58) 14,36 (7,89) 0,381 0,5372 0,79 (0,37-1,67) Fbat (CACC) 4,57 (1,95) 3,16 (1,74) - - - FbaT (CACT) 1,36 (0,58) 0,01 (0,01) - - - FBAt (CGAC) 9,63 (4,12) 2,75 (1,51) 2,218 0,1364 2,69 (0,70-10,44) FbAT (CGAT) 49,66 (21,22) 42,44 (23,32) 0,507 0,4763 0,84 (0,53-1,35) Fbat (CGCC) 7,50 (3,21) 1,30 (0,71) 2,903 0,0884 4,45 (0,68-28,94) FbaT (CGCT) 45,74 (19,55) 33,87 (18,61) 0,004 0,9480 1,02 (0,62-1,67) fBAt (TAAC) 10,13 (4,33) 9,14 (5,02) 0,171 0,6792 0,82 (0,33-2,06) fBAT (TAAT) 9,27 (3,96) 5,83 (3,20) 0,116 0,7339 1,20 (0,42-3,45) fBat (TACC) 0,00 (0,00) 1,60 (0,88) - - - fBaT (TACT) 2,12 (0,91) 1,80 (0,99) - - - fbAt (TGAC) 0,03 (0,01) 3,82 (2,10) - - - fbAT (TGAT) 24,75 (10,58) 15,54 (8,54) 0,337 0,5617 1,22 (0,62-2,38) Fbat (TGCC) 0,00 (0,00) 2,12 (1,16) - - - fbaT (TGCT) 30,70 (13,12) 24,15 (13,27) 0,035 0,8510 0,95 (0,53-1,68) Haplótipo FokI-BsmI-ApaI-TaqI 42 Na determinação da distribuição haplotípica no conjunto de indivíduos positivos e negativos para H. pylori, referente apenas aos polimorfismos (BsmI, ApaI e TaqI) presentes na região 3’ não traduzida (3’UTR) do gene VDR (figura 8), percebeu-se que, em termos percentuais, não houve diferenças nas frequências haplotípicas observadas entre estes conjuntos, sendo que os haplótipos bAT e baT apresentaram as maiores proporções nas amostras de indivíduos infectados e não infectados pela H. pylori. Os haplótipos BAt e BAT não foram tão frequentes quanto aos haplótipos previamente mencionados, porém, estavam presentes em ambos os grupos (14% e 10,7% nos infectados versus 16% e 11,3% nos não infectados, respectivamente). A frequência dos quatros haplótipos remanescentes (Bat, BaT,bat,bat) foi menor do que 5%. Figura 8 - Frequência (%) estimada de haplótipos (BsmI-ApaI-TaqI) no gene VDR nos grupos de infectados e não infectados pela H. pylori, BelémPA. Frequência haplotípica 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% BAt BAT Bat BaT bAt Haplótipo Positivo bAT bat baT Negativo A partir dos coeficientes de desvio padronizado (D’) e de determinação (r 2) foi estimada a extensão do desequilíbrio de ligação entre os alelos de pares de locus analisados no presente estudo, conforme expresso na tabela 5. Assim, a avaliação destes resultados indica que as relações observadas para os pares formados com o polimorfismo FokI estão em equilíbrio de ligação tanto na amostra global, quanto nas amostras de indivíduos positivos e negativos para H. pylori. Por sua vez, para as combinações de pares entre os marcadores da região 3’UTR (BsmI, ApaI e TaqI), nota-se que apesar destes SNPs exibirem uma proximidade física entre eles no gene VDR, não foi evidenciado um significante desequilíbrio de ligação entre os pares 43 haplotípicos observados para estes marcadores nos grupos amostrais estudados. As correlações mais baixas foram identificadas para os pares formados entre o ApaI e TaqI, variando de 0,037 a 0,049; enquanto que as combinações entre o BsmI e TaqI apresentaram os valores mais altos de correlação, porém, sem atingir uma significância estatística. Tabela 5- Testes do desequilíbrio de ligação entre os 4 SNPs no gene VDR nos grupos estudados. Belém-PA. VDR SNPs Distância (Kb) FokI-BsmI FokI- ApaI FokI-TaqI BsmI-ApaI BsmI-TaqI ApaI-TaqI 33,0 34,0 34,1 0,9 1,0 0,0 Geral D' r2 0,012 0,000 0,099 0,008 0,084 0,001 0,691 0,124 0,608 0,278 0,475 0,044 H. pylori D' positivo r2 0,008 0,000 0,049 0,002 0,311 0,015 0,688 0,120 0,565 0,250 0,495 0,049 H. pylori negativo D' r2 0,058 0,001 0,154 0,022 0,097 0,005 0,696 0,128 0,667 0,319 0,440 0,037 A tabela 6 exibe as frequências alélicas e haplotípicas dos RFLP FokI, BsmI, ApaI e TaqI do gene VDR nos grupos de indivíduos infectados e não infectados por H. pylori e também quando estes grupos foram combinados formando um único grupo da população de Belém. E para fins comparativos foram usados dados da literatura referentes a uma população brasileira publicada por Lins et al. (2011) e de grupos populacionais do projeto HapMap (Internacional HapMap Project) derivados de diferentes etnias como europeia, africana e asiática. Os achados revelaram que a distribuição alélica de FokI estimadas no presente estudo diferiu das populações usadas como referência de origens européia e africana. De fato, constatou-se que a frequência do alelo F para o polimorfismo FokI foi mais comum entre africanos do que entre os grupos estudados da população de Belém. Tabela 6- Comparação entre as distribuições de frequências dos SNPs genotipados e dos haplótipos (BsmI-ApaI-TaqI) nos grupos estudados entre diferentes populações. População Hp+ Hp Belém Brasil CEU YRI ASN FokI (F) 0,671 0,648 0,661 0,674 0,525 0,833 0,646 SNP (Alelos) BsmI ApaI (b) (a) 0,718 0,393 0,692 0,374 0,707 0,385 0,605 0,460 0,525 0,424 0,712 0,375 0,921 0,645 TaqI (T) 0,765 0,758 0,762 0,627 0,526 0,750 0,933 Haplótipos (BsmI- ApaI-TaqI) baT Bat bAT BAT (GCT) (AAC) (GAT) (AAT) H* 0,326 0,140 0,319 0,107 0,108 0,320 0,160 0,317 0,113 0,090 0,323 0,148 0,318 0,110 0,101 0,418 0,332 0,175 0,022 0,053 0,429 0,438 0,133 0,000 0,000 0,397 0,249 0,307 0,018 0,028 0,660 0,062 0,258 0,020 0,000 Hp+: H. pylori positivo; Hp-: H.pylori negativo; Belém: total de pacientes pesquisados; Brasil: população brasileira de Lins et al. (2011) CEU: população residente em Utah com ascendência do norte e oeste europeu; YRI: grupo étnico africano iorubá de Ibadan, Nigéria; ASN: população asiática proveniente da China e Japão; H*: somatório dos haplótipos < 5%. 44 Paralelamente, comparações similares em relação às distribuições de frequências alélicas dos outros SNPs genotipados (BsmI/ApaI/TaqI) do gene VDR também indicaram diferenças nos grupos estudados da população de Belém, sendo geneticamente mais distante das populações de grupos étnicos de origem européia e asiática e também se diferenciando da outra população brasileira em relação as frequências alélicas inerentes apenas ao SNP TaqI. Adicionalmente, esta diferenciação também pode ser observada considerando as frequências haplotípicas nos grupos avaliados da população de Belém comparadas com as de populações étnicas ancestrais. Assim, na tabela 7 estão detalhados os achados desta análise comparativa entre pares interpopulacionais, englobando as frequências dos quatro SNPs no gene VDR, estimadas no presente estudo e daquelas disponíveis na literatura para populações como referenciadas acima. No geral, os valores do teste Fst que foram significativamente diferentes, indicam o nível de diferenciação genética resultante desta comparação entre os pares testados das populações, evidenciando não apenas as influências étnicas no processo de miscigenação da população estudada, como poderia também potencialmente ser reflexo das diferenças seletivas detectadas em decorrência da infecção pela H. pylori. Tabela 7- Os valores do teste de diferenciação entre pares de população (Fst) na comparação de frequências locus a locus de amostras brasileiras e referências étnicas do HAPMAP. Pares de população FokI Fst p BsmI Fst p ApaI Fst p TaqI Fst p BsmI/ApaI/TaqI Fst p Hp+/ Hp- -0,009 0,782 -0,008 0,709 -0,009 0,754 -0,009 0,718 -0,009 1,000 Hp+/BRZ -0,007 0,909 0,021 0,045 0,002 0,218 0,040 0,009 0,046 0,000 Hp+/CEU 0,039 0,009 0,070 0,000 -0,007 0,754 0,118 0,000 0,097 0,000 Hp+/YRI 0,062 0,000 0,008 1,000 -0,007 0,800 -0,006 0,636 0,015 0,027 Hp+/ASN -0,006 0,545 0,125 0,000 0,112 0,000 0,096 0,000 0,088 0,000 Hp-/BRZ -0,007 0,645 -0,008 0,182 0,007 0,264 0,031 0,018 0,038 0,000 Hp-/CEU 0,026 0,045 0,049 0,018 -0,004 0,527 0,103 0,000 0,086 0,000 Hp-/YRI 0,078 0,000 -0,008 0,709 -0,009 1,000 -0,009 0,836 0,008 0,082 Hp-/ASN -0,009 0,727 0,158 0,000 0,129 0,000 0,112 0,000 0,092 0,000 Hp+: H. pylori positivo; Hp-: H.pylori negativo; Belém: total de pacientes pesquisados; Brasil: população brasileira de Lins et al. (2011); CEU: população residente em Utah com ascendência do norte e oeste europeu; YRI: grupo étnico africano iorubá de Ibadan, Nigéria; ASN: população asiática proveniente da China e Japão. 45 5. DISCUSSÃO A infecção pela H. pylori envolve complexos mecanismos de interação entre o ambiente, o sistema imunológico do hospedeiro e a diversidade genética das estirpes bacterianas, os quais têm importantes implicações clínicas e epidemiológicas e que determinam à permanência deste patógeno na mucosa gástrica (Cadamuro et al., 2014). Neste contexto, a análise efetuada neste estudo buscou avaliar a relação dos polimorfismos do gene VDR humano na infecção pela H. pylori, tendo como base os aspectos epidemiológicos da infecção, as alterações histológicas da mucosa gástrica e estilo de vida da população estudada. Assim, em nossas análises não foi encontrada nenhuma correlação dos polimorfismos de RFLP FokI, ApaI e TaqI do gene VDR com a infecção pela H. pylori. Contudo, foi observada uma diferença significativa na distribuição genotípica do SNP BsmI entre as amostras positivas e negativas para H. pylori. Esta diferença foi notada principalmente para o heterozigoto Bb, cuja frequência foi cerca de 20,7% maior nas amostras negativas em relação as amostras positivas. Da mesma forma, o genótipo bb apresentou uma frequência de 12,7% a mais nas amostras positivas. No entanto, apesar de ser observada essa diferença nas proporções genotípicas, o mesmo não ocorreu para as frequências alélicas. E basicamente, estes achados mostram um desvio significativo das frequências genotípicas do SNP BsmI do gene VDR, determinado por uma baixa frequência do genótipo Bb no grupo de pacientes com positividade para a H. pylori e colonizado por cepas virulentas do tipo CagA/VacA s 1m1. Em contrapartida, a frequência do genótipo variante bb estava elevada neste grupo de pacientes, sugerindo ser este mais um fator aditivo na interação com cepas virulentas da H. pylori, em favorecer o desenvolvimento e a persistência bacteriana na mucosa gástrica, a ponto de modular uma intensidade mais fraca de atividade neutrofílica em relação àquela observada em pacientes portadores de outros genótipos (BB/Bb). É um fato que, as propriedades imunomoduladoras da forma ativa de vitamina D são mediadas pelo menos em parte pelo VDR (Deluca & Cantorna, 2001; White , 2013; Vojinovic, 2014), estando os metabólitos da vitamina D envolvidos tanto na indução da atividade antimicrobiana como tem efeitos anti-inflamatórios. O mecanismo identificado pelo qual a 1α,25(OH)2D3 provavelmente atua no controle inato de uma infecção microbiana envolve a indução de óxido nítrico, oxidases dependentes de NADPH e fusão do fagolisossoma (Rockett et al., 1998 ; Sly et al., 2001; Hmama et al., 2004), que após suas ativações levam a produção de grande quantidade de espécies reativas de oxigênio em resposta dos fagócitos ao estimulo 46 infeccioso (Geiszt et al., 2003). E do mesmo modo, também está associada com a indução de expressão do complexo antimicrobiano peptídeo-catelicidina (CAMP) (Martineau et al., 2007), o produto do qual é enzimaticamente clivado para produzir o agente antimicrobiano ativo catelicidina (LL-37) (Sorensen et al., 2001). Sendo que tem sido detectado que estes peptídeos são mais abundantes em neutrófilos e células epiteliais (Risso, 2000; van Wetering et al., 2005). E ainda o estudo de Sorensen et al. (2001) mostrou que proteinase 3, a qual é requerida para a clivagem da catelicidina e do peptídeo é predominantemente expressa em neutrófilos. Esta atividade bactericida da catelicidina é mediada pela sua habilidade para ligarse a monocamada de fosfatidilglicerol e assim romper a parede celular bacteriana (Neville et al., 2006). Por outro lado, os efeitos anti-inflamatórios da vitamina D ainda não estão completamente esclarecidos. Acredita-se ser decorrente de sua própria intensificada atividade antimicrobiana e pela indução da expressão de um mediador fundamental, a interleucina 37 (IL-37), que é um inibidor natural da ativação de células fagocitárias infectadas com o bacilo Mycobacterium tuberculosis, com amplos efeitos anti-inflamatórios (Coussens et al., 2014). Em geral, o receptor da vitamina D (VDR) é encontrado em muitos tipos de células do sistema imune, como células T, células B, monócitos, macrófagos, células dendríticas e células natural killer (NK). E nesses tipos de células, os complexos 1,25(OH)2D3 –VDR regulam a inibição da expressão de citocinas como IL-2, TNF- α, IFN-γ e GM-CFS nas células neutrofílicas (Muller & Bendtzen, 1996; D'Ambrosio et al., 1998; Hewison, 2011). De modo geral, a vitamina D parece favorecer a diferenciação de clones de células Th2 em detrimento de Th1 (Rigby et al., 1987; Bikle, 2008), e com intensificada expressão da citocina antiinflamatória IL-10 (Piemonti et al., 2000). Além disso, o VDR atua também na supressão da produção de imunoglobulinas (Ig) e da proliferação de linfócitos B (Macdonalds et al., 1994), bem como desempenha um importante papel tanto no desenvolvimento e diferenciação quanto na função efetora de células T (Canning et al., 2001). Assim sendo, é importante tentar determinar se os SNPs de RFLP (FokI, BsmI, ApaI e TaqI) do gene VDR estão associados à infecção pela H. pylori. Porém, é possível que os efeitos genotípicos sejam somente evidenciados em determinadas condições ambientais. O estudo de Levin et al. (2012) mostrou que a combinação de baixos níveis circulantes de 25hidroxivitamina D3 e alguns genótipos aumentam o risco de doenças. Sendo bem documentado que os polimorfimos do gene VDR estão associados com o risco de fratura de quadril, diabete mellitus, artrite reumatoide, infarto do miocárdio e alguns tipos de câncer (Revisado em Berlanga-Taylor & Knight, 2014). 47 No presente estudo o achado mais importante refere-se ao polimorfismo RFLP BsmI no gene VDR no grupo de indivíduos infectados com cepas virulentas tipo 1 da H. pylori. Nestes casos, foi observado que as distribuições genotípicas BB/Bb/bb entre não infectados e infectados com cepas virulentas e não virulentas apresentaram uma inesperada associação, pois os genótipos BB/Bb estão em baixa percentagem nos infectados com cepas tipo 1 da H. pylori, enquanto inversamente o genótipo bb representa a maior proporção dos predispostos com esta infecção, sugerindo que variações genotípicas dos polimorfismos VDR pode ser um dos fatores de risco a influenciar na patogênese desta infecção. Similarmente, entre os diferentes genótipos foi detectado variações na intensidade de atividade neutrofílica, com uma tendência estatística de uma elevada proporção entre os portadores do genótipo bb de expressarem fraca intensidade de atividade neutrofílica, em relação aos demais genótipos, na presença de infecção com cepas virulentas da H. pylori e até mesmo entre aqueles infectados com cepas não virulentas. Deste modo, estes achados nos levam a supor que esta variante genotípica bb poderia atuar na redução da expressão de VDR, e, consequentemente, em suas funções imunes na defesa do hospedeiro contra esta infecção. Logo, constatou-se que os escores de atividade neutrofílica apresentam uma relação de dependência com as variações genotípicas no gene VDR, deduzindo-se como verdadeira a afirmação de que deve existir também uma atividade diferencial de proteínas VDR, o que confirmaria o estudo prévio de Guo et al. (2014), que observou uma correlação positiva entre os escores de inflamação crônica e a expressão de mRNA do VDR e catelicidina na mucosa gástrica de pacientes infectados com a H. pylori. Portanto, a regulação positiva da expressão do mRNA do VDR na infecção pela H. pylori, conforme descrito por Guo et al. (2014), também pode ser um ponto de partida importante para análises mais profundas sobre os possíveis efeitos dos polimorfismos do gene VDR na patogênese da H. pylori. No que tange a literatura relata-se discordâncias entre os estudos de associação referentes aos polimorfismos presentes no gene VDR, que podem ser atribuídas às variações no padrão do desequilíbrio de ligação destes marcadores entre os diversos grupos étnicos (Fang et al., 2005).Adicionalmente, tem sido hipotetizado que as interações do gene VDR com outros genes, assim como as interações gênicas com os fatores ambientais, atuem de maneira importante na determinação dos níveis de expressão do receptor VDR nos diferentes grupos populacionais (Uitterlinder et al., 2004). Neste aspecto, vale mencionar que no presente estudo a infecção pela H. pylori diagnosticada pelo método da biologia molecular (PCR) apresentou uma prevalência de 58% nos pacientes com gastrite crônica. Outros estudos (Martins et al., 2005; Vinagre et al., 2011; 48 da Silva et al., 2013) na mesma população também obtiveram resultados similares com esse método. Estudos prévios desenvolvidos no Brasil em adultos com sintomatologias gástricas também apontaram uma prevalência elevada da infecção pela H. pylori, identificando uma positividade de 78% em São Paulo (Menoni et al., 2013), 76% no Rio Grande do Sul (Muller et al., 2007) e de 51,9% no Paraná (Cogo et al., 2011). Em geral, nos países em desenvolvimento a prevalência de infecção pela H. pylori pode alcançar proporções acima de 50% em algumas populações, como observado em estudos conduzidos na Índia (Adlekha et al., 2013; Pandey et al., 2014), Etiópia (Mathewos et al., 2013), Geórgia (Tarkhashvili et al., 2012) e Venezuela (Contreras et al., 2015). Em contraste, em outros trabalhos realizados em populações provenientes de países desenvolvidos, tais como Canadá (Sethi et al.,2013), Estados Unidos (Patterson et al., 2012), Itália (Dore et al., 2015), Austrália (Moujaber et al.,2008) e Japão (Ueda et al., 2014), é possível notar uma tendência de declínio mais expressiva das taxas de infecção pela H. pylori nos indivíduos adultos, apresentando frequências que oscilam próximo ou abaixo de 40%. Estes estudos acima mencionados e relacionados com diferentes características socioeconômicas sugerem que a transmissão da infecção pela H. pylori pode ser facilitada pelas precárias condições de higiene e saneamento, com evidências de um maior risco para infecção intrafamiliar, mediante os contatos pessoa-pessoa (Barile et al., 2009). Em nossas análises os testes moleculares utilizados para verificar a presença de cepas virulentas (CagA+/VacAs1m1) mostrou um predomínio dessas cepas entre os pacientes, atingindo uma proporção de 50% nos infectados. Nesta mesma população dados similares também foram relatados por Vinagre et al. (2013), que encontraram uma prevalência de infecção de 85% nos pacientes com gastrite, sendo que em 59% dos casos positivos foram detectadas cepas virulentas de H. pylori. Neste trabalho foi também observado que a distribuição da infecção pela H. pylori quanto aos aspectos epidemiológicos e demográficos investigados não atingiu uma significância estatística para a maioria das variáveis estudadas, mostrando que a infecção independe do sexo, idade, hábito tabágico, comorbidade e consumo de frutas. E apesar de não ter sido detectada uma relação da infecção com o elitismo nas amostras estudadas, houve uma tendência estatística de uma maior proporção de infectados no grupo de elitista. No entanto, as análises referentes sobre o consumo de álcool como possível fator de risco para o aumento das taxas de infecção pela H. pylori não são conclusivas, sendo que alguns estudos relataram não encontrar nenhuma associação do elitismo com a infecção pela H. pylori (Santos et al., 2005; Zaterka et al., 2007). 49 Durante a infecção, a H. pylori pode persistir na mucosa gástrica por longos períodos de tempo, pois ela é capaz de neutralizar a acidez gástrica pela forte atividade de sua enzima urease que hidrolisa a uréia com produção de grande quantidade de amônia e dióxido de carbono, elevando o pH intragástrico (Hazell & Lee, 1986) e ainda possui a enzima ɣglutamiltranspeptidase, importante para o seu crescimento e sobrevivência na mucosa gástrica (Chevalier et al., 1999). Assim, tem sido observado que estes dois mecanismos podem ser inibidos pela administração da vitamina D (Kawaura et al., 2006). Outro aspecto relevante é que cepas virulentas de H. pylori são capazes de induzir um grau maior de inflamação da mucosa gástrica. Estudos prévios têm demonstrado que elas aumentam a secreção de citocinas pró-inflamatórias, quimiotáticas para neutrófilos e células mononucleares, gerando a formação de um intenso infiltrado. E, portanto, elas estão relacionadas com a ocorrência de patologias mais severas, como úlcera e câncer gástrico (Montecucco et al., 1999; Nogueira et al., 2001; Rieder et al., 2005). Entre os mecanismos de patogênese destaca-se a exacerbação de estresse oxidativo pelo neutrófilo, que é ainda maior na presença de cagA como demonstrado em estudos in vitro (Zhang et al., 1996) e in vivo (Suzuki et al., 1998; Danese et al., 2001), reforçando a função carcinogênica da H. pylori. A exposição ao CagA resulta na elevação do nível de estresse oxidativo, que é representativo de um severo dano ao DNA, e pode ser neutralizado pela ação de enzimas antioxidantes produzidas pelas células epiteliais gástricas a fim de manter um balanço entre os fatores oxidantes e antioxidantes (Papa et al., 2002). Neste sentido, a possível interação molecular da vitamina D 3 com este microrganismo foi inicialmente abordado a partir de um estudo realizado com mulheres idosas, no qual foi observada uma maior redução das taxas de infecção pela H. pylori no grupo de mulheres que tinha sido suplementado com vitamina D por prolongados períodos de tempo, quando comparadas com aquelas que não receberam tratamento para este composto. Contudo, ainda não foi confirmado se a suplementação de vitamina em longo prazo pode prevenir ou erradicar a infecção pela H. pylori (Kawaura et al., 2006). A atividade antibacteriana da vitamina D 3 e de seus metabólitos foi investigada recentemente em culturas de H. pylori. Neste experimento, os autores identificaram que as formas intactas da 25-hidroxivitamina D 3 e a 1,25-di-hidroxivitamina D3 inibiram significativamente a proliferação bacteriana in vitro da H. pylori (Hosoda et al., 2015). Estes autores sugerem que os baixos níveis séricos da 25-hidroxivitamina D 3 poderiam estar correlacionados com a incidência da infecção pela H. pylori na infância, no qual são evidenciadas as maiores taxas de aquisição da infecção. 50 Em outro estudo experimental desenvolvido em mulheres brasileiras idosas foi demonstrado que a suplementação como doses elevadas de vitamina D3 produziu um efeito positivo nas concentrações séricas da 25-hidroxivitamina D3 e na capacidade total de antioxidante, além de reduzir os níveis dos marcadores inflamatórios. Particularmente, estes efeitos foram significativos apenas para o grupo de pacientes que exibiam o genótipo BB/Bb para o polimorfismo BsmI (Cavalcante et al., 2015). Da mesma forma dados provenientes de estudos de meta-análise, levando em consideração o polimorfismo BsmI, apontaram uma possível redução do risco de câncer associado aos genótipos “BB” e “Bb” quando comparado com o homozigoto “bb”. (Raimondi et al., 2014; Xu et al., 2014). Diferentemente destes trabalhos, uma meta-análise realizada por Chen et al. (2013) sugeriu que o homozigoto “BB” esteja relacionado com um aumento de risco de tuberculose em populações de origem européia, embora este resultado não pode ser comprovado com outras populações. Outro estudo in vitro conduzido por Torres et al. (2010) relatou que o homozigoto “BB” contribuiu significativamente para o aumento da suscetibilidade à infecção pelo HIV. Além disso, o presente estudo testou se as frequências haplotípicas das variantes do gene VDR com a infecção pela H. pylori. Assim, quando se considerou as análises dos blocos haplotípicos gerados para o grupo de infectados e não infectados para H. pylori, verificou-se que as proporções encontradas não diferiram significativamente entre estes grupos amostrais em nenhum dos modelos haplotípicos analisados, sendo encontrado um predomínio do haplótipo “FbAT” nas amostras positivas e negativas para H. pylori, seguido dos haplótipos “FbaT” e “fbaT”. Entre as estimativas do padrão de desequilíbrio de ligação foi observado que o FokI não estava associado com nenhum dos polimorfismos analisados para o gene VDR. Esse resultado é compatível com outras investigações efetuadas em populações da Índia (Alagarasu et al.,2012), Arábia Saudita (Al-Daghri et al., 2014) e Alemanha (Heine et al., 2012). E em uma abordagem mais ampla da estrutura do gene VDR, o marcador FokI mostrou-se independente de qualquer SNP ou bloco haplotípico, definido para os grupos étnicos de origem caucasóide, asiática e afro-americana (Fang et al., 2005), estando localizado em uma área do gene considerada como um ponto quente de recombinação (Nejentsev et al., 2004). Paralelamente, na análise dos blocos da região 3’UTR do gene VDR verificou-se uma diversidade de haplótipos na população estudada, com uma maior contribuição dos blocos baT, bAT e BAt. Similarmente, o estudo realizado por Thakkinstian et al (2004) descreve o haplótipo baT como o mais comum em caucasianos, seguido do bloco BAt e bAT. Assim 51 como, Uitterlinden et al. (2004) também identificou o haplótipo baT como o mais prevalente em caucasianos, enquanto que em populações de origem africana, o haplótipo bAT foi o mais frequente. No que diz respeito aos pares haplotípicos formados apenas com os polimorfismos da região 3’UTR, a análise comparativa desses haplótipos revelou baixos valores de correlação entre eles. Sendo que, esta análise é essencial frente às evidências (Morrison et al., 1994; Carling et al., 1998) de que todos os conhecidos polimorfismos VDR interagiriam entre si, como resultado de combinações haplotípicas particulares, modulando a expressão e a atividade do VDR (Whitfield et al., 2001; Uitterlinden et al., 2004). E de acordo com os polimorfismos desta região 3’UTR ainda tem sido reconhecido efeito tipo célula-específica quanto a uma estabilidade diferenciada do mRNA do VDR, a ponto de existir uma tendência do haplótipo BAt exibir de alguma forma, níveis totais mais elevados do mRNA VDR do que o haplótipo baT, apesar destes achados não terem sido comprovados em outros trabalhos experimentais (Gross et al., 1997; Durrin et al., 1999; Whitfield et al., 2001). Outra hipótese sustentada por Durrin et al. (1999) é que as variantes do gene VDR estejam em desequilíbrio de ligação com outros polimorfismos em genes adjacentes verdadeiramente funcionais. Estas divergências reforçam a necessidade de caracterizar o perfil imunogenético de pacientes com um conjunto de variantes que poderia influenciar na predisposição da doença investigada. Portanto, em particular pela origem miscigenada da população de Belém e pela sua elevada prevalência para a infecção pela H. pylori, é oportuno avaliar as variações genotípicas dos polimorfismos do gene VDR em relação a distribuição de suas frequências nos diferentes grupos étnicos. Neste aspecto, os valores de Fst revelaram diferenças significativas entre as frequências alélicas dos SNPs VDR da população estudada com aquelas disponíveis na literatura (Internacional HapMap Project) para os grupos étnicos ancestrais europeus, africanos e asiáticos. Deste modo, estas distâncias podem ser um resultado do processo de miscigenação, dado que a população de Belém é altamente distinta em termos genéticos das populações das quais ela derivou (Guerreiro & Chautard-Freire-Maia, 1988; Santos et al., 2009). Por outro lado, deve ser ressaltado que doenças infecciosas, a exemplo da infecção pela H. pylori resultam da interação entre gene e ambiente e fatores sociais, os quais são cruciais para os processos evolutivos e comportamento genético da população, o que provavelmente contribui junto com as influências étnicas para uma diferenciação das frequências alélicas nos grupos amostrais da população investigada. 52 Neste contexto, os resultados globais apresentados neste estudo ainda precisam de uma melhor compreensão, em razão de limitações inerentes aos possíveis efeitos da subestrutura da população entre ambos os grupos amostrados, que pode levar a resultados de associação falsos positivos, devido a diferenças nas frequências alélicas de grupos parentais que contribuem diferencialmente nas subpopulações investigadas, visto que a etnicidade foi definida com base na autodeclaração da história familiar de ancestralidade dos pacientes. Outro ponto crítico é o moderado tamanho amostral, que interfere no poder dos testes estatísticos, e que dificultou analisar a interação entre os polimorfismos gênicos (haplótipos). Além disso, como o material biológico disponível já havia sido previamente colhido e estava mantido em estoque, inviabilizou as análises referentes aos níveis séricos de vitamina D, bem como a quantificação da expressão de mRNA do VDR nos pacientes pesquisados. E também deve ser salientado que dados contraditórios nos estudos de associação podem ainda ser resultados de diferentes padrões de exposição aos fatores de riscos ambientais e de uma combinação diversa de variantes de suscetibilidade, como anteriormente já abordado no estudo de Batar et al. (2008). Assim, a partir de tais limitações, estes achados merecem uma abordagem cautelosa, esperando que investigações mais extensivas a nível molecular possam melhor esclarecer a relação dos polimorfismos do gene VDR com a etiopatogênese da infecção pela H. pylori, principalmente porque existe uma carência de dados na literatura sobre este assunto, impossibilitando, assim, efetivar análises comparativas com este estudo. Além do que são desejáveis estudos de replicação independentes para validar a relação genótipo/fenótipo, buscando ampliar em especial o entendimento das funções imunes do VDR na defesa contra a infecção pela H. pylori. 53 6. CONCLUSÃO A distribuição das frequências genotípicas e alélicas para os polimorfimos FokI, ApaI e TaqI no gene VDR estão de acordo com o modelo de equilíbrio de Hardy- Weinberg na população de estudo, sendo que estas frequências não diferiram entre os que apresentavam ou não a infecção pela H. pylori. Enquanto que, para o polimorfismo BsmI foi verificado um desvio significativo do equilíbrio de Hardy-Weinberg no grupo de positivos para a H. pylori O padrão de distribuição haplotípica dos polimorfimos presente no gene VDR foram similares entre o conjunto de infectados e não infectados para a H. pylori para os grupos formados com os marcadores FokI, BsmI, ApaI e TaqI e para os polimorfimos da região 3’UTR (BsmI, ApaI e TaqI). As frequências genotípicas do polimorfismo BsmI diferiram entre os grupos de infectados e não infectados pela H. pylori, com uma maior proporção de heterozigotos no grupo dos não infectados e do homozigoto bb para o grupo de infectados, particularmente naqueles positivos para cepas virulentas de H. pylori. Em relação ao grupo de positivos virulentos, observou-se uma tendência estatística de níveis mais fracos de atividade neutrofílica na mucosa gástrica entre os indivíduos com o genótipo bb do polimorfismo BsmI quando comparados com os outros genótipos (Bb+BB). De um modo geral, as frequências das variantes polimórficas estudadas no gene VDR apresentaram uma distribuição diferenciada para a população de Belém em relação aos grupos étnicos de origem europeia, africana e asiática do projeto HapMap. Similarmente, apenas com o marcador TaqI detectou-se uma distância genética entre esta população estudada e a outra população brasileira utilizada como referência. 54 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AHMED, K.S., KHAN, A.A., AHMED, I., TIWARI, S.K., HABEEB, A., AHI, J.D., ABID, Z., AHMED, N., HABIBULLAH, C.M. Impact of household hygiene and water source on the prevalence and transmission of Helicobacter pylori: a South Indian perspective .Singapore Med J 48 (6) : 543,2007. ALCANTARA-HERNANDEZ, M., TORRES-ZARATE, C., PEREZ-MONTESINOS, G., JURADO-SANTA-CRUZ, F., DOMINGUEZ-GOMEZ, M. A., PENICHECASTELLANOS, A., FERAT-OSORIO, E., Neri, N., NAMBO, M. J., ALVARADOCABRERO, I., MORENO-LAFONT, M., HUERTA-YEPEZ, S., BONIFAZ, L. C. 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