Projeto - Cirurgiaonline

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
UNIFESP – EPM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MEDICINA TRANSLACIONAL
Coordenador: Prof. Dr. José Alberto Neder Serafini
Projeto de Pesquisa – Doutorado
Lucas Pedroso Fernandes Ferreira Leal
Repercussões orgânicas da transposição ileal
em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta.
Orientador:
Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo
Co-Orientadores:
Profa. Dra. Valderez Bastos Valero Lapchick
Profa. Dra. Gui Mi Ko
Profa. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Prof. Dr. Sérgio Atala Dib
Prof. Dr. Antônio Ricardo de Toledo Gagliardi
SÃO PAULO
2011
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RESUMO
INTRODUÇÃO: O tratamento clínico do diabetes mellitus tipo 2 – é
sabidamente complexo e permanente, tendo a doença caráter progressivo.
Atualmente busca-se procedimento cirúrgico que seja eficaz em sua resolução,
inclusive em indivíduos não-obesos. A transposição ileal isolada teoricamente
pode constituir-se numa alternativa terapêutica efetiva. Essa intervenção não
foi até o momento realizada em humanos, e também não há relatos da sua
utilização em modelo experimental de dismetabolismo glicídico induzido por
dieta. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo é avaliar os efeitos orgânicos da
transposição ileal em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta,
considerando suas repercussões no metabolismo da glicose. MÉTODOS:
Utilizar-se-ão 40 ratos machos (Rattus norvegicus albinus), Wistar - 2BAW
Heterogêneos, com 12 semanas de vida, distribuídos em quatro grupos de 10
animais cada: Grupo Transposição Ileal (GT) com os animais sob dieta
hipercalórica-hiperlipídica; Grupo Sham (GS), submetidos à operação simulada
e utilizando a mesma dieta; Grupo Controle 1 (GC1),
não submetidos a
nenhuma intervenção cirúrgica e consumindo a dieta hipercalórica-hiperlipídica;
e Grupo Controle 2 (GC2) - não submetidos a nenhuma intervenção cirúrgica e
consumindo ração padrão. As intervenções cirúrgicas serão realizadas na 20ª
semana de vida. Coletas sangüíneas para os testes laboratoriais serão
realizadas na 12ª semana de vida dos animais, no dia da operação e na 08ª
semana de pós-operatório, após pesagem e sob anestesia prévia. Serão feitas
em todos os animais as determinações séricas de glicose e insulina, assim
como de glucagon-like peptide-1, peptídeo C e hemoglobina glicada. Também
serão realizados o teste de tolerância à insulina, com a utilização do software
PRISMA, e o cálculo da resistência insulínica, pelo teste indireto HOMA-IR.
Estudo biomolecular da expressão relativa de 252 genes de interesse será feito
com PCR em tempo real. Nos dias determinados, com 20 semanas de vida,
dois ratos serão separados e aleatoriamente distribuídos no GT e no GS.
Todos serão acompanhados até a 08ª semana de pós-operatório, quando
serão sacrificados e então coletados os depósitos de gordura periepididimal e
retroperitoneal para pesagem em balança de precisão, e o pâncreas e
segmentos de intestino para estudo anátomo-patológico e imunohistoquímico.
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RESUMO EXPANDIDO
INTRODUÇÃO: O tratamento clínico da síndrome metabólica principalmente o dismetabolismo glicídico traduzido por resistência insulínica e
diabetes mellitus tipo 2 - é sabidamente complexo e permanente, tendo a
doença caráter progressivo. A resistência insulínica e o diabetes mellitus são
condições
que estão correlacionadas mais comumente
à
obesidade.
Entretanto, ambos não acometem somente a população obesa, uma vez que
há uma incidência cada vez maior de DM2 entre indivíduos com índice de
massa corporal (IMC) na faixa da eutrofia e do sobrepeso. Sabe-se que a
resistência insulínica é que primordialmente causa a doença cardiovascular
nesses indivíduos.
Atualmente busca-se procedimento cirúrgico que seja
eficaz no tratamento da síndrome metabólica, principalmente em relação à
diabetes mellitus tipo 2, inclusive em indivíduos não-obesos. Em pacientes
obesos mórbidos, é consensual que a intervenção cirúrgica dita padrão-ouro
para o tratamento da obesidade mórbida é a gastroplastia vertical com anel de
contenção e derivação gastrojejunal em Y-de-Roux (operação de Fobi-Capella,
modificada) por atingir os objetivos de perda de peso e controle de
comorbidades, mantidos em longo prazo. Por outro lado, em pacientes com
dismetabolismo glicídico mas sem obesidade mórbida (com obesidade leve ou
apenas sobrepeso),
a tecnicamente mais simples e facilmente reversível
transposição ileal isolada teoricamente pode constituir-se numa alternativa
terapêutica efetiva. Essa intervenção não foi até o momento realizada de forma
isolada em humanos - a experiência relatada na Literatura diz respeito a
associação com a gastrectomia vertical -, e também não há relatos da sua
utilização em modelo experimental de síndrome diabetes mellitus induzida por
dieta. OBJETIVOS: O objetivo geral deste estudo é o de avaliar os efeitos
orgânicos da transposição ileal no diabetes mellitus tipo 2. Os objetivos
específicos são, em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta: (1)
investigar as alterações morfológicas e funcionais ocorridas nas células L
intestinais num segmento de íleo distal interposto ao jejuno proximal; (2)
estudar as modificações estruturais no intestino delgado de animal submetido à
transposição de um segmento de íleo distal para uma situação proximal no
tubo digestório; (3) avaliar o pâncreas endócrino após a transposição ileal; (4)
4
verificar as alterações do metabolismo glicídico e lipídico após a transposição
ileal; e (5) analisar os níveis de expressão relativa dos genes específicos de
interesse. MÉTODOS: Utilizar-se-ão 40 ratos machos (Rattus norvegicus
albinus), Wistar - 2BAW Heterogêneos, com 12 semanas de vida, distribuídos
em quatro grupos de 10 animais cada: Grupo Transposição Ileal (GT) com os
animais sob dieta hipercalórica-hiperlipídica; Grupo Sham (GS), submetidos à
operação simulada e utilizando a mesma dieta; Grupo Controle 1 (GC1), não
submetidos
a
nenhuma intervenção
cirúrgica e
consumindo a dieta
hipercalórica-hiperlipídica; e Grupo Controle 2 (GC2) - não submetidos a
nenhuma intervenção cirúrgica e consumindo ração padrão. As intervenções
cirúrgicas serão realizadas na 20ª semana de vida. Coletas sangüíneas para os
testes laboratoriais serão realizadas na 12ª semana de vida dos animais, no dia
da operação e na 08ª semana de pós-operatório, após pesagem e sob
anestesia prévia. Serão feitas em todos os animais as determinações séricas
de glicose, insulina, triglicérides, colesterol total e frações, assim como de
glucagon-like peptide-1, peptídeo C e hemoglobina glicada. Será realizado o
teste de tolerância à insulina, com a utilização do software PRISMA, e o cálculo
da resistência insulínica, pelo teste indireto HOMA-IR. Determinar-se-ão os
níveis de expressão relativa de 252 genes referentes a apoptose de células
beta pancreáticas, desenvolvimento de diabetes mellitus e diferenciação de
células-tronco mediante estudo biomolecular específico com PCR em tempo
real. Nos dias determinados, com 20 semanas de vida, dois ratos serão
aleatoriamente distribuídos no GT e no GS. Todos serão acompanhados até a
08ª semana de pós-operatório, quando serão sacrificados e então coletados os
depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal para pesagem em
balança de precisão, e o pâncreas, o fígado e segmentos de intestino para
estudo anatomopatológico e imunohistoquímico.
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ABSTRACT
INTRODUCTION: The clinical treatment of metabolic syndrome, principally that
of glucose dysmetabolism (which is characterized by insulin resistance and type
2 diabetes mellitus), is known to be complex and lifelong, which is due to the
progressive nature of the disease. Insulin resistance and diabetes mellitus are
more commonly associated with obesity. However, the two conditions are not
exclusive to the obese population, as evidenced by an increasingly higher
incidence of type 2 diabetes mellitus among normal weight and overweight
individuals. Insulin resistance is known to be the primary cause of
cardiovascular disease in these individuals. There is currently a search for a
surgical procedure that can effectively treat individuals (including non-obese
individuals) with metabolic syndrome (principally type 2 diabetes mellitus). The
gold standard for the treatment of morbid obesity is vertical banded gastric
bypass, since this procedure achieves long-term weight loss and comorbidity
control. However, in patients with glucose dysmetabolism without morbid
obesity (i.e., mildly obese or overweight), ileal transposition-a technically
simpler and more easily reversible procedure-can theoretically be an effective
therapeutic alternative. There are reports in the literature regarding the use of
ileal transposition in combination with sleeve gastrectomy. However, to date,
ileal transposition has not been performed in isolation in humans. There are no
reports of the use of ileal transposition in experimental models of diet-induced
metabolic syndrome. OBJECTIVES: The overall objective of the present study
is to evaluate the clinical effects of ileal transposition on metabolic syndrome.
The specific objectives of the study, which will investigate rats with diet-induced
obesity, are as follows: 1) to study the morphological and functional changes in
L cells in a segment of the distal ileum that will be interposed with the proximal
jejunum; 2) to study the structural changes in the small intestines of animals
submitted to transposition of a segment of the distal ileum to a proximal position
in the digestive tract; 3) to evaluate the endocrine pancreas after ileal
transposition; and 4) to analyze changes in glucose and lipid metabolism after
ileal transposition. METHODS: Forty 12-week-old male Wistar rats (Rattus
norvegicus albinus) of the WAB strain (heterogeneous) will be used. The rats
will be divided into four groups of 10 animals: ileal transposition group,
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comprising animals on a high-calorie, high-fat diet; sham group, comprising
sham-operated animals on a high-calorie, high-fat diet; control group 1,
comprising animals that will be fed a high-calorie, high-fat diet and will not be
submitted to surgical intervention; and control group 2, comprising animals that
will be fed standard chow and will not be submitted to surgical intervention. The
surgical procedures will be performed when animals are 20 weeks of age. The
animals will be weighed, and blood samples will be collected under anesthesia
when animals are aged 12 weeks, 20 weeks, and 28 weeks (postoperative
week 8). In all animals, serum levels of glucose, insulin, triglycerides, total
cholesterol, low-density lipoprotein, high-density lipoprotein, glucagon-like
peptide-1, C-peptide, and glycosylated hemoglobin will be determined. The
insulin tolerance test will be performed using the PRISMA software, and insulin
resistance will be calculated using the homeostasis model assessment of
insulin resistance. When rats are aged 20 weeks, two animals will be randomly
distributed into the ileal transposition group and the sham group. All animals will
be monitored for 8 postoperative weeks, after which they will be sacrificed.
Epididymal and retroperitoneal fat pads will be collected and weighed on a
precision balance, and the pancreas, the liver, and intestinal segments will be
analyzed (anatomic pathology and immunohistochemistry).
7
1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas a população mundial vem experimentando um
significativo aumento na prevalência da obesidade1. Na transição do milênio,
aproximadamente dois terços dos adultos dos países desenvolvidos eram
obesos, e quase 5% deles eram portadores de obesidade mórbida.2 Esse
cenário é deletério, uma vez que a obesidade mórbida predispõe os pacientes
a comorbidades que afetam quase todos os sistemas orgânicos.3 Quando a
obesidade está associada à resistência insulínica (RI), hipertensão arterial
sistêmica (HAS), dislipidemia e diabetes mellitus do tipo 2 (DM2), constitui-se a
Síndrome Metabólica (SM), a qual representa importante fator de risco para o
desenvolvimento de doenças cardiovasculares.4 Em 1998, a Organização
Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu que a SM é caracterizada pela
associação de RI ou DM2 a dois ou mais dos seguintes critérios: (1) pressão
arterial (PA) maior ou igual a 160/90 mmHg; (2) hiperlipemia, definida com
níveis de triglicerídeos acima de 150 mg/dL e/ou HDL-colesterol abaixo de 35
mg/dL em homens e abaixo de 39 mg/dL em mulheres; (3) obesidade central
com relação cintura/quadril maior que 0,9 em homens e maior que 0,85 em
mulheres e/ou IMC maior que 30 kg/m2 e (4) microalbuminúria de pelo menos
20mg/min ou relação albumina/creatinina maior que 20mg/g4. Ademais, esses
indivíduos frequentemente apresentam doença cardiovascular, síndrome de
hipoventilação, asma, apneia do sono, acidente vascular cerebral, pseudotumor
cerebral, artropatias, diversos tipos de câncer, incontinência urinária,
colecistopatias, doença do refluxo gastroesofágico e depressão.4-6
A obesidade encurta a expectativa de vida.7 Essa redução no obeso
mórbido é de aproximadamente 12 anos, quando comparado a um indivíduo de
peso normal. Isso ocorre de forma diretamente proporcional ao aumento do
índice de massa corporal8 (IMC). Em um futuro próximo, a obesidade mórbida
deverá ultrapassar o hábito de fumar na liderança das causas de morte em
países desenvolvidos.9 Atualmente, só nos Estados Unidos há mais de nove
milhões de obesos mórbidos que necessitam de ajuda.2 Contudo, o tratamento
conservador da obesidade mórbida, com dieta, exercícios físicos, modificação
de hábitos de vida e uso de medicações, apenas muito raramente consegue
determinar perda de peso em níveis adequados e de forma duradoura.10 De
8
fato, quatro estudos a longo prazo sobre tratamento conservador da
obesidade11-14 mostraram uma média de perda de peso de apenas 4%.
Recente estudo prospectivo e controlado demonstrou que o tratamento
conservador ao longo de dez anos resultou em aumento do peso corporal da
ordem de 1,6%, comparado com 13,2% de perda de peso com a banda
gástrica ajustável e 35% com a gastroplastia redutora e derivação
gastrojejunal.15
Desde o advento da cirurgia minimamente invasiva tem havido um
incremento considerável nos procedimentos gastrointestinais que determinam
perda de peso significativa e duradoura, com taxas de complicações muito
baixas.16-18 Ao contrário da abordagem conservadora19, a cirurgia bariátrica
condiciona melhora ou resolução das doenças associadas à obesidade em
70% a 100% dos pacientes.18 Pode-se observar, ainda, que as taxas de
mortalidade em pacientes obesos mórbidos são diminuídas de forma
importante após operação bariátrica, quando comparadas com as oriundas de
grupos de pacientes obesos tratados clinicamente.20,21 Nessa ordem de ideias,
torna-se óbvio que a cirurgia bariátrica é, na atualidade, o tratamento mais
efetivo para a obesidade mórbida, promovendo emagrecimento significativo e
sustentado, melhorando ou resolvendo definitivamente as comorbidades
associadas e prolongando a expectativa de vida dos pacientes acometidos.22
É consensual23 que a intervenção cirúrgica dita padrão-ouro para o
tratamento da obesidade mórbida é a gastroplastia vertical com anel de
contenção e derivação gastrojejunal em Y-de-Roux (operação de Fobi24Capella,25, modificada) por atingir os objetivos de perda de peso e controle de
comorbidades, mantidos em longo prazo.16 O emagrecimento é usualmente
atribuído a uma combinação da diminuição acentuada do volume do
reservatório gástrico aliada à má-absorção intestinal. Por sua vez, o controle
das comorbidades após a derivação gastroduodenal em Y-de-Roux –
principalmente aquelas decorrentes dos distúrbios do metabolismo da glicose –
é geralmente atribuído à própria diminuição da massa corporal. Não obstante,
foi demonstrado efeito endócrino potencialmente controlador da glicemia e
promotor de saciedade precoce após operação de Fobi-Capella, antes mesmo
de qualquer perda de peso importante.26
9
Adicionalmente, observou-se que estavam aumentadas no sangue
periférico – após derivação gastroduodenal – substâncias secretadas pelo
intestino diretamente na corrente sanguínea, tais como glucagon-like peptide 1
(GLP-1) e peptide YY (PYY), providas da capacidade de estimular a produção
de insulina pelas células beta do pâncreas, de facilitar a ação desse hormônio
no transporte da glicose para o interior das células e de agir no hipotálamo,
induzindo sensação de saciedade alimentar.27 Ademais, operação de FobiCapella reduz drasticamente os níveis do hormônio orexígeno grelina, o que
contribui decisivamente para o efeito de redução de peso corporal inerente a
esse procedimento operatório.28 A grelina diminui porque as zonas gástricas
produtoras desse hormônio (fundo gástrico e grande curvatura) não recebem o
estímulo alimentar porquanto são excluídas do trânsito digestivo.28 O GLP-1 e o
PYY aumentam porque a derivação gastrojejunal em Y-de-Roux propicia o
estímulo das células L, produtoras desses hormônios, por alimentos que
chegam rapidamente e mal digeridos às porções mais distais do intestino
delgado.29 Destarte, a gastroplastia vertical redutora com anel e derivação
gastrojejunal em Y-de-Roux (operação de Fobi-Capella) constitui-se numa
intervenção eminentemente metabólica.
Outrossim,
tem
sido
preconizada
a
construção
de
outras
configurações cirúrgicas do tubo digestório visando provocar resposta
metabólica adequada frente ao desafio de tratar mediante cirurgia a doença da
obesidade. Dessa forma, diversas técnicas operatórias estão sendo avaliadas
no presente momento. Pesquisas estão voltadas também para a correção mediante cirurgia - das comorbidades que o excesso de tecido adiposo no
organismo pode acarretar. O tema é relevante porque a obesidade é uma
condição de crescentes incidência e prevalência30, de distribuição universal31,
sem discriminação de faixas etárias e etnias, a qual acarreta consequências
graves na saúde de seus portadores devido à sua associação com numerosas
comorbidades32 e que implica importantes repercussões financeiras na
economia mundial.33
Constata-se, ainda, que a obesidade também é uma questão
candente junto às crianças e aos adolescentes. A crescente pandemia de
10
obesidade cada vez mais os tem afetado, e pode tomar até 20 anos de suas
vidas.34
A resistência insulínica e o diabetes mellitus são condições que
estão correlacionadas mais comumente à obesidade. Entretanto, ambos não
acometem somente a população obesa, uma vez que há uma incidência cada
vez maior de DM2 entre indivíduos com índice de massa corporal (IMC) na
faixa da eutrofia e do sobrepeso.35,36 Sabe-se que a resistência insulínica é que
primordialmente causa a doença cardiovascular nesses indivíduos.37
A etiologia da resistência insulínica na obesidade pode decorrer de
fatores genéticos. Postula-se que a Seleção Natural teria elegido como
sobreviventes os indivíduos portadores do gene “econômico” de energia, já que
essas pessoas são dotadas de uma maior habilidade em estocar calorias no
tecido gorduroso, daí advindo nítida vantagem de sobrevivência durante os
períodos
de
escassez
alimentar,
principalmente
em
nosso
ambiente
ancestral.38-41 Não obstante, apesar de indivíduos modernos serem dotados de
programação genética adequada à sobrevivência sob eventual restrição
calórica, alguns possuem mais desses genes econômicos poupadores de
energia que outros, destarte apresentando maior probabilidade de desenvolver
obesidade quando expostos ao regime de alimentação com teor calórico
elevado. A superalimentação, aliada ao sedentarismo que a vida moderna
impõe, condiciona os predispostos geneticamente a acumular gordura em
depósitos centrais no corpo. Tal gordura, dita visceral, está diretamente
relacionada com o desenvolvimento de resistência insulínica e, eventualmente,
diabetes mellitus.42
A qualidade da dieta também tem importante influência no
desenvolvimento da resistência insulínica43. Sob esses fatores, ocorrem
alterações nos receptores da insulina ou nas suas vias de sinalização, há
aumento da produção de citocinas produzidas pelo tecido adiposo e
modificações na produção dos enterohormônios do trato gastrointestinal
relacionados à dicotomia fome/saciedade e ao metabolismo de carboidratos.4446
Também têm sido propostos como causas primárias de resistência insulínica
a disfunção mitocondrial47,48 e o acúmulo intracelular de gordura.49
11
Contudo, longe de ser apenas setor de armazenamento, o tecido
adiposo é também considerado atualmente um órgão endócrino, o qual secreta
moléculas protetoras contra a ocorrência de diabetes mellitus tipo 2, como a
adiponectina.50 Adipócitos produzem, ainda, fatores que desencadeiam
fenômenos inflamatórios responsáveis por grande número de doenças
associadas à obesidade e à própria resistência insulínica.51-54
No âmbito dessa gama multifacetada e intensamente imbricada de
fatores que intervêm na gênese da obesidade e de suas doenças associadas –
principalmente na mais importante delas, a que diz respeito aos distúrbios do
metabolismo da glicose – sobressaem-se os hormônios produzidos pelo tubo
digestório e, mais especificamente, o produzido pelas células L, localizadas no
intestino delgado e grosso, e mais densamente concentradas no íleo terminal,
isto é, o glucagon-like peptide-1 (GLP-1).55 O GLP-1 é secretado pelas células
neuroendócrinas L intestinais em resposta ao estímulo direto gerado por
nutrientes dotados de efeito incretínico.56
As incretinas são hormônios secretados no trato gastrointestinal para
a circulação sanguínea em resposta à ingestão de certos nutrientes, com o
resultante aumento na produção de insulina e, com isso, da captação de
glicose. O GLP-1 exerce algumas funções bem definidas, como o estímulo de
secreção glicose-dependente da insulina; o aumento da transcrição do gene da
insulina, com incremento da biossíntese desse hormônio; a indução da
neogênese e da proliferação das células beta das ilhotas de Langerhans; a
inibição da apoptose das células beta; o aumento da expressão fenotípica de
células betas diferenciadas; o estímulo da produção de somatostatina e a
redução da produção de glucagon.57,58
O diabetes mellitus tipo 2 é um problema epidêmico que afeta mais
de 150 milhões de pessoas em todo o mundo. Este número deve dobrar nas
primeiras décadas do terceiro milênio.59 A abordagem terapêutica do DM2 e da
resistência insulínica inclui uma ampla variedade de opções, como o
tratamento clínico multidisciplinar com o objetivo de perda ponderal, opções
farmacológicas e técnicas operatórias bariátricas e metabólicas. É bem sabido
que essas intervenções cirúrgicas podem controlar a DM2, mesmo em longo
prazo.60 Curioso é constatar que também no diabetes mellitus tipo 1 as
12
intervenções bariátricas têm se mostrado eficazes na melhora do controle
terapêutico da glicemia61.
Em contrapartida, a manutenção do controle glicêmico nos pacientes
obesos diabéticos por medidas conservadoras é um desafio. As dietas que
impõem grande restrição calórica e os programas clínicos multidisciplinares
para perda ponderal raramente têm demonstrado benefícios em médio e em
longo prazos. Somam-se a isso os efeitos colaterais e as limitações dos
fármacos antidiabéticos e da eficácia em longo prazo da insulinoterapia no
DM2.62,63 Nessa ordem de ideias, a cirurgia bariátrica e metabólica apresentase como uma alternativa válida para o tratamento da obesidade e de suas
comorbidades, inclusive o diabetes tipo 2.64,65
Com a evolução dos estudos de motilidade do tubo digestório e a
descrição de neurohormônios – neurogastroenterologia –, houve um melhor
entendimento de aspectos da fisiologia gastrointestinal e, assim, as modalidades
de intervenções cirúrgicas bariátricas foram evoluindo até o conceito atual de
procedimentos mistos que contemplam, ao lado dos aspectos de restrição e
disabsorção, também e principalmente os fatores neurohormonais e metabólicos
desses procedimentos, sendo que os termos cirurgia baroendócrina e cirurgia
metabólica são cada vez mais utilizados, em especial para o tratamento do
diabetes mellitus tipo 2.66,67
As modalidades de cirurgias bariátricas ditas mistas representam, na
atualidade, o tratamento com maior eficácia para pacientes com obesidade
mórbida, com maior segurança e perda ponderal sustentada em longo prazo,
além de melhora significativa das comorbidades associadas.68 Há uma série de
estudos revelando que, após a realização de um bypass gástrico em Y-deRoux, ocorre uma maior liberação de GLP-1 e um maior controle glicêmico,
antes mesmo que advenha uma perda significativa de peso. Isto demonstra
que o controle do diabetes mellitus pode estar relacionado a efeitos hormonais
secundários à técnica operatória realizada.69,70
Apesar de proporcionarem maiores perdas ponderais, as quais se
sustentam por períodos mais prolongados, as técnicas mistas, como a operação
de Fobi-Capella apresentam desvantagens, notadamente em longo prazo, como
13
síndrome de dumping71, hérnias internas72, estenose de anastomoses73, fístulas
gastrogástricas
e
enteroentéricas74,75,
úlceras
pépticas76,
diarreia,
hipoproteinemia, hipocalcemia e dificuldade do acesso endoscópico às áreas
excluídas do tubo digestório77-79.
Buscando-se evitar as intercorrências próprias da operação de FobiCapella surgiu a gastrectomia vertical, realizada de forma isolada –
previamente parte primeira de operação mista mais complexa denominada
“duodenal switch”80 –, com remoção da curvatura maior e do fundo gástricos, e
consequente redução da produção de grelina81-82. Trata-se de procedimento
bariátrico emergente83,84, restritivo, causador de saciedade, podendo ser
utilizado como etapa inicial de operação em dois tempos para doentes de alto
risco cirúrgico85-87, ou como operação isolada e definitiva88.
A gastrectomia vertical isolada vem demonstrando bons resultados
de perda ponderal89, controle glicêmico90 e saciedade precoce, mesmo na
avaliação em longo prazo91. O controle glicêmico obtido em seu pós-operatório
pode ser devido à chegada de alimentos não totalmente digeridos ao íleo distal,
em função da velocidade de esvaziamento gástrico aumentada após essa
operação, com consequente incremento da secreção de GLP1 pelas células
L92,93.
Recentes estudos demonstram que a gastrectomia vertical como
procedimento bariátrico isolado e definitivo é tão eficaz quanto a operação de
Fobi-Capella no controle das comorbidades, além de ser potencialmente capaz
de evitar algumas das suas complicações.94-97 Apesar de ser uma modalidade
cirúrgica mais simples, pesquisas realizadas em seres humanos submetidos a
gastrectomia vertical isolada demonstram a existência de limitações98 e
complicações.99,100
Estudos continuam sendo realizados com vistas ao desenvolvimento
de terapêuticas cirúrgicas mais simples e efetivas para as doenças metabólicas
associadas ao sobrepeso e à obesidade, principalmente o DM2. Nesse cenário,
postula-se que pode haver fatores anti-incretínicos secretados no intestino
delgado proximal, os quais deixariam de ser produzidos se esse segmento
fosse excluído do trânsito alimentar. A ausência das supostas “anti-incretinas”
14
na circulação potencializaria a ação das incretinas e destarte melhoraria o
DM2.101-105
Diversos autores afirmam ter demonstrado que a derivação do
trânsito digestório de modo a excluir um curto segmento de intestino delgado
proximal produz uma melhora do diabetes mellitus tipo 2 de per si,
independentemente dos efeitos de restrição da ingesta alimentar, da perda de
peso corporal, de eventual má absorção dos alimentos ou da chegada de
alimentos pouco digeridos ao intestino delgado distal. Baseados nos resultados
de seus trabalhos, preconizam a intervenção cirúrgica com exclusão duodenal
como uma alternativa válida para o tratamento do diabetes mellitus tipo 2.
Ademais, alegam que deve haver substâncias ou fatores outros secretados
pelo intestino proximal e ainda não descobertos que possam contribuir na
etiopatogenia do diabetes mellitus tipo 2.101-105
Mais recentemente foram publicados resultados promissores em
humanos de técnicas que associam a gastrectomia vertical à interposição de
segmento de íleo distal no trajeto do jejuno proximal. Esse tipo de
procedimento operatório pode induzir saciedade precoce associada a
benefícios no metabolismo glicídico e causar perda ponderal, em curto e em
médio prazos. Em pacientes diabéticos não-obesos essa técnica operatória
demonstrou eficácia no controle do diabetes mellitus tipo 2106-111.
É
interessante
observar
que
nas
intervenções
cirúrgicas
antidiabéticas propostas por essa equipe106-111, um dos tempos operatórios
constantes em todas as suas versões, é a gastrectomia vertical. Note-se que a
gastrectomia vertical é um procedimento restritivo (pela acentuada redução da
capacidade reservatória gástrica) e metabólico (pela diminuição dos níveis
circulantes do hormônio orexígeno grelina, produzido pelo fundo e grande
curvatura gástricos82,91), o qual visa, primordialmente, a perda de peso. Nesse
cenário, surge a questão: qual a finalidade da realização dessa etapa
operatória – a gastrectomia vertical – em pacientes que não necessitam da
perda ponderal? Pode-se inferir, portanto, que os benefícios metabólicos
obtidos mediante esses procedimentos devem-se quase que exclusivamente à
interposição ileal. Note-se que o aumento da velocidade do trânsito intestinal
que a gastrectomia vertical determina92,93 pode contribuir para a chegada mais
15
rápida de alimentos ainda não digeridos na região onde o segmento ileal foi
interposto e assim contribuir para a produção de GLP-1 pelas células L ileais.
Não obstante, a interposição ileal isolada já se mostrou eficaz na correção do
dismetabolismo
experimentação
em
diversas
pesquisas
envolvendo
animais
de
112,113
.
Ressalte-se que a avaliação de modalidade operatória, no âmbito da
cirurgia bariátrica e metabólica, envolvendo apenas a transposição ileal não foi
ainda realizada em humanos. Entretanto, foi demonstrado, em animais de
experimentação, que a interposição de um segmento de íleo distal no jejuno
proximal acarreta maiores liberação e síntese de GLP-1114. Isso pode ser
atribuído a um maior estímulo sobre as células L localizadas no segmento do
íleo
interposto,
provocado
por
uma
quantidade
maior
de
nutrientes
parcialmente digeridos que, quando atinge mais precocemente essa porção
distal do intestino delgado, ocasiona a liberação de GLP-1 que, por sua vez,
estimula uma maior produção de insulina, com efeitos diretos no metabolismo
glicídico115. O GLP-1 se eleva no plasma em resposta ao estímulo alimentar e
tem efeito sacietógeno no sistema nervoso central116, diminui a absorção de
gorduras pelo trato gastrointestinal117 e diminui as motilidades gástrica118 e
intestinal119. Finalmente, o efeito mais notório do GLP-1 é o de promover
diminuição da resistência insulínica periférica, redução da apoptose das células βpancreáticas, aumento da diferenciação das células primitivas dos canalículos
pancreáticos para células beta adultas e incremento da proliferação destas120,121, o
que se conhece como “síndrome do íleo vazio”122-124.
O GLP-1 é o hormônio incretínico mais associado aos efeitos
antidiabéticos da cirurgia bariátrica. Estimular as células L ileais a clivar o
proglucagon e liberar o GLP-1 parece ser o meio mais eficaz de se obter o
efeito incretínico nos pacientes diabéticos submetidos à cirurgia bariátrica.
Várias são as técnicas que podem alcançar este efeito, todas elas baseadas na
hipótese do intestino posterior, conhecida como teoria “hindgut”. Esta tem sua
base racional no fato de que o íleo, ao ser colocado em contato com alimentos
ainda não totalmente digeridos, corrige os efeitos deletérios da “síndrome do
intestino distal vazio” que é ocasionada pela falta de estimulação das células L
produtoras de GLP-1.
16
O estímulo do íleo por alimentos pouco digeridos libera hormônios
intestinais, cujas ações interferem positivamente no controle da obesidade e
em seus distúrbios metabólicos associados, sobretudo na resistência periférica
à insulina. A simples interposição de um segmento de íleo nos segmentos mais
proximais do intestino delgado é o procedimento cujos resultados mais
enfatizam essa hipótese. Estudo da interposição de segmento de íleo terminal
em jejuno proximal em animais de experimentação submetidos a um modelo de
obesidade induzida por dieta demonstrou aumento significante dos níveis de
GLP-1125. Do mesmo modo, estudo clínico cuja técnica operatória coloca um
segmento de íleo 50 cm distalmente ao ângulo de Treitz demonstrou esse
mesmo estímulo endócrino, com melhora do quadro diabético111, 126.
Pesquisas que demonstram a capacidade da estimulação alimentar
ileal em liberar GLP-1 e provocar o efeito incretínico são atuais e abundantes
na literatura. Entretanto, estudos histológicos que investigam as células L são
antigos e anteriores ao conhecimento científico atual. Limitam-se a identificar a
localização dessas células e marcá-las como capazes de clivar o proglucagon
e liberar seus produtos (GLP-1 e GLP-2)127-129. Hoje em dia, confere-se a essas
células um papel mais relevante no tratamento cirúrgico do DM2, uma vez que
se busca a possibilidade de se instituirem medidas terapêuticas ao DM2 com
base no efeito incretínico. Logo, conhecer a reação das células L quando
estimuladas a esse efeito parece ser uma etapa importante nesse
conhecimento130.
Há um grande número de pesquisas e informações produzidas a
partir de observações dos resultados em seres humanos na literatura
biomédica. Porém, em comparação com os estudos clínicos, escassos são os
trabalhos que envolvem animais de experimentação em cirurgia bariátrica e
metabólica. Os animais de experimentação, sobretudos ratos, quando
utilizados em modelos de obesidade e síndrome metabólica parecem dar mais
credibilidade às conclusões que aquelas obtidas em animais sadios. Com isso,
vários modelos experimentais têm sido utilizados102,131-134.
O modelo animal de obtenção da obesidade por meio de alterações
provocadas na dieta – obesidade induzida por dieta – é o que parece melhor
mimetizar a condição da obesidade humana. Na maioria dos casos, embora
17
não haja um padrão bem definido, obtém-se obesidade mórbida aumentando a
quantidade relativa de gorduras na dieta135-138. Pesquisas experimentais em
animais, embora não possam ter suas conclusões diretamente extrapoladas
aos seres humanos, são relevantes ao permitirem eutanásia e análise postmortem do animal, especialmente da histopatologia do tubo digestório operado.
Embora se conheça o perfil dos enterohormônios após a cirurgia bariátrica com
efeito incretínico em humanos, ainda não foi feita uma correlação direta com a
reação das células L intestinais nessas situações.
Além do “freio ileal” – expressão utilizada para caracterizar a reação
de redução da motilidade do trânsito gastrointestinal proximal relacionada à
produção de enterohormônios139-142 secundária à cirurgia de interposição ileal –
estudos demonstram os efeitos benéficos dessa técnica operatória na estrutura
do pâncreas, em especial em animais de experimentação diabéticos e não
obesos113,
115
. Observou-se, também, que em ratos euglicêmicos, a
interposição ileal melhorou a tolerância à glicose, sem que, no entanto, a
avaliação morfológica do pâncreas destes animais fosse realizada143.
O diabetes mellitus tipo 2 é uma doença metabólica heterogênea
progressiva,
cujos
mecanismos
fisiopatológicos
envolvem
dois
efeitos
principais: resistência insulínica periférica e disfunção gradual de células beta
pancreáticas144,
145
, surgindo invariavelmente quando as ilhotas pancreáticas
não são mais capazes de manter a hiperinsulinemia em um nível suficiente
para sobrepor a resistência tissular periférica. Assim, o tratamento é dirigido,
inicialmente, para reduzir o peso do paciente e, em conseqüência, a resistência
insulínica, melhorando a tolerância à glicose.
Com o decorrer dos anos, o diabetes passa por fases intermediárias,
em que ambos os efeitos podem coexistir, indicando-se, então, associar-se às
drogas sensibilizadoras da ação insulínica, drogas secretagogas de insulina. À
medida que a deficiência se acentua, inevitavelmente, as combinações
terapêuticas de agentes orais podem não mais serem eficazes em controlar a
hiperglicemia e a administração de insulina se impõe, para otimização do
tratamento144, 146-148.
18
É fundamental que se caracterize, em determinado paciente, o seu
grau de resistência insulínica, de acordo com a circunstância clínica
encontrada, uma vez que disso dependerá a orientação terapêutica. Ocorre
que nenhuma das terapêuticas atuais tem um impacto significante na
progressão da doença149.
Nos indivíduos diabéticos tipo 2, nos quais obesidade e resistência
insulínica estão presentes em mais de 80% dos casos, o tratamento deve,
inicialmente, se basear em uma mudança substancial do estilo de vida. É
dirigido fundamentalmente para a adequação dietética, com dieta hipocalórica,
e implementação de atividade física regular150, embora com tendência a
desmoronar. No entanto, quando essas medidas comportamentais não são
suficientes para atingir ou manter a glicemia nos padrões adequados, com a
perda de peso – e isso acontece com a maioria dos pacientes, em virtude,
principalmente, da falta de condescendência com essas alterações no estilo de
vida e a evolução da doença – os agentes antidiabéticos orais devem ser
associados151.
Atualmente, existem diferentes classes de fármacos com diferentes
mecanismos de ação, os quais podem ser utilizados isoladamente ou em
combinações terapêuticas diversas150. Isso porque muitos pacientes não têm
controle glicêmico adequado com o uso de uma única droga, necessitando, em
longo prazo, de combinações entre dois ou mais agentes orais151-153, às vezes
como prelúdio da insulinoterapia.
Nos últimos anos, com o objetivo de melhorar a adesão do paciente
às combinações medicamentosas, têm surgido no mercado preparações com
dois componentes num mesmo comprimido. Contudo, com o decorrer dos
anos, o tratamento tradicional com agentes orais passa a não mais ser eficaz e,
em conseqüência, os níveis glicêmicos aumentam, não sendo mais possível
manter o controle metabólico. Assim, consoante a evolução da afecção, os
indivíduos vêm a necessitar do uso de insulina148.
Ocorre que o esquema combinado de insulina com agentes orais
também pode, com o passar do tempo, não mais ser suficiente, o que é
comprovado
pelo
aumento
dos
valores
glicêmicos
obtidos
pela
19
automonitoração e pelo aumento progressivo dos níveis de hemoglobina
glicada. Passam a ser, então, necessárias maiores e mais doses diárias de
insulina. Finalmente, quando não há mais possibilidade do uso de esquemas
combinados de agentes orais e insulina, indica-se a insulinização plena. Não
obstante, a insulina se mantém como única alternativa terapêutica efetiva,
quando as medidas conservadoras e os agentes antidiabéticos orais não são
mais suficientes para o controle metabólico144,146,154.
A intensificação da insulinoterapia no tratamento do diabetes tipo 2 é
a forma mais apropriada para se buscar atingir a normoglicemia e reduzir as
complicações da afecção, com controle glicêmico precoce, rigoroso, persistente
e efetivo144,155-157. Pacientes submetidos ao tratamento intensivo, apesar de
não conseguirem a normalização completa da hemoglobina glicada, mostram
substancial redução no risco de eclosão ou na progressão das complicações
crônicas e tardias do diabetes – micro e macrovasculares – , as quais
constituem importante causa de morbimortalidade na população acometida144,
155, 156
.
Pode-se, assim, constatar que o diabetes tipo 2 é uma afecção
multifacetada, que necessita de uma abordagem integrada e individualizada
nos cuidados de cada paciente150, a qual pode ser desafiadora158. Os pacientes
freqüentemente se apresentam com pequeno controle glicêmico apesar das
medidas terapêuticas instituídas149, 158.
Considera-se ótimo o controle glicêmico de um indivíduo com
diabetes tipo 2 quando os valores de sua glicemia são o mais próximo possível
dos níveis de um indivíduo sem diabetes159 com vistas à prevenção de suas
complicações144. Percebe-se, portanto, que atingir níveis ótimos de controle
glicêmico ainda continua sendo um dos maiores desafios na prática clínica,
com apenas uma pequena parcela da população com diabetes alcançando as
metas terapêuticas157,159.
Limitações da maioria das medidas terapêuticas disponíveis tem
impedido conquistar esse objetivo159. Algumas das razões incluem baixa
adesão a dietas, também pouco efetivas, e iniciativas insuficientes para
controle de peso, somadas à limitada eficácia de agentes terapêuticos ou
20
associação com eventos adversos excessivos, ao atraso no início da
insulinoterapia e à pobre aceitação de um regime diário de múltiplas injeções
pelo próprio paciente157, 160.
É bem sabido que a maioria dos indivíduos não sustentará um nível
adequado de controle glicêmico valendo-se de medidas comportamentais ou
de monoterapia oral151. E, mesmo que as terapias orais tradicionais sejam
usualmente efetivas na diminuição da hiperglicemia, não previnem nem
impedem a progressão da doença, fazendo com que, assim, muitos pacientes
requeiram insulina148. Outros indivíduos podem, ainda, ter alergia ou contraindicações às medicações, não aderir ou ser resistentes à continuidade do
tratamento quando se defrontam com efeitos colaterais indesejáveis, como
ganho de peso e hipoglicemia, associado a muitas das terapias convencionais,
além
de
reações
dermatológicas,
distúrbios
gastrointestinais,
reações
hematológicas, eventos coronarianos agudos, alterações visuais e metabólicas,
limitando seu uso147-149, 152, 158, 161.
A maioria das medicações anti-diabéticas, incluindo sulfoniuréias,
tiazolidinadionas, e insulina, melhora o controle glicêmico mas nem sempre
corrige as disfunções metabólicas associadas, e se associa a aumento do peso
corporal, como ocorre também com a insulina, por estimulação do apetite, o
que gera preocupação147,
161, 162
. Note-se que foi demonstrado que as
sulfoniuréias aceleram a apoptose de células beta, agravando o declínio linear
de suas funções, com a diminuição de sua massa no pâncreas humano145. No
caso das tiazolidinadionas, o ganho de peso é promovido por expansão
volêmica e edema, o qual pode se manifestar com insuficiência cardíaca em
indivíduos susceptíveis ou agravar a pré-existente, podendo, assim, causar ou
exacerbar a insuficiência cardíaca congestiva e mesmo eventos cardíacos
isquêmicos, mitigando os riscos associados ao incremento da gordura
corporal151,152,161. Dados recentes sugerem, também, que tiazolidinadionas
podem reduzir a densidade mineral óssea151. Assim, na escolha terapêutica
deve-se considerar, além do decréscimo da hemoglobina glicada, a
tolerabilidade, os efeitos não-glicêmicos dos agentes anti-diabéticos, os efeitos
sobre as comorbidades associadas e o próprio custo151, 154.
21
O inadequado controle glicêmico é, além da natureza progressiva da
própria doença, também devido aos atrasos no início do tratamento com antidiabéticos orais e da introdução da insulina, e à falha da intensificação mais
precocemente da insulinoterapia em pacientes que não atingem os objetivos
glicêmicos148, 155.
Existem verdadeiras barreiras, tanto para pacientes quanto para
médicos, que comprometem a iniciação e intensificação da insulinoterapia, as
quais se correlacionam com a pequena motivação individual, a falta de
familiaridade com o ato de aplicação, a necessidade de injeções freqüentes de
insulina, medo que serão dolorosas e difíceis de serem administradas, além de
preocupações quanto a hipoglicemia e ganho de peso155,
160, 163
atraso
inapropriadamente,
na
inicialização
precoce
da
insulinoterapia,
. Destarte, o
considerando-se a evolução do diabetes, não permite que se atinjam os níveis
recomendados de glicemia, nem que se mantenha um controle glicêmico mais
adequado146, 154, 160.
É necessário, para que se tenha sucesso com a insulinoterapia, que
o paciente esteja motivado e adequadamente informado,
merecendo
participação e apoio de uma equipe multidisciplinar. Existe, atualmente, grande
número de preparações insulínicas disponíveis para o tratamento do diabetes,
incluindo várias pré-misturas e apresentações em cartuchos utilizadas em
canetas injetoras, que podem tornar o tratamento do diabetes potencialmente
mais complexo. O paciente deve, assim, ser orientado quanto às diferentes
apresentações,
formas,
vias
e
locais
de
aplicação
e
cuidados
de
armazenamento da insulina, assim como quanto às formas e à importância da
monitoração glicêmica. Ademais, deve ser enfatizada a necessidade da
manutenção das outras medidas de modificação do estilo de vida - regime
alimentar adequado e da atividade física. Os riscos do desenvolvimento de
hipoglicemia também devem ser explicados ao paciente e aos seus familiares,
assim como os mesmos devem ser esclarecidos quando às medidas
necessárias para evitá-la e revertê-la.
Percebe-se, com isso, que o esquema de tratamento intensivo com
insulina exige melhores níveis sócio-econômico e cultural do paciente, além de
alto grau de adesão e capacidade de aprendizado, pois será ele mesmo a
22
monitorar o tratamento e a decidir sobre as doses de insulina, a presença de
hipoglicemia e a prevenção de complicações agudas. Há que se adquirir
conhecimento bastante grande, com discernimento, e disponibilidade de
recursos para sua exeqüibilidade, sendo necessário estímulo constante, tanto
da parte do paciente quanto de toda a equipe médica multiprofissional.
Logo, vê-se que existe uma clara necessidade de novas opções
terapêuticas anti-diabéticas, mais agressivas, as quais podem ser combinadas
com agentes farmacológicos existentes, focadas para se preservar a função
das células beta e interromper a progressão do diabetes mellitus tipo 2147.
Nenhuma das terapêuticas disponíveis para o diabetes mellitus mencionadas
demonstrou preservar a função das células beta pancreáticas no decorrer do
tempo. As limitações desse tratamento mais antigo tornam imperativa a
obtenção de novos meios que ofereçam maiores eficácia, durabilidade,
conveniência,
segurança e tolerabilidade,
a
fim de
se
atingir
mais
precocemente os objetivos de um controle glicêmico adequado e de se evitar
ou retardar a necessidade de medidas adicionais145. Tornam-se, assim,
necessárias opções mais agressivas, baseadas na etiopatogenia da afecção, e
que incluam maior controle tanto da glicemia de jejum quanto da glicemia pósprandial154.
As terapias baseadas nas incretinas, como os agonistas dos
receptores de GLP-1, adminstrados via subcutânea, e os inibidores da DPP-4
(dipeptidyl peptidase-4), administrados via oral, oferecem uma nova abordagem
no manejo do diabetes tipo 2, mais atual e interessante, havendo ainda novos
agentes em desenvolvimento145,
149
. Esses dois grupos já disponíveis na
atualidade demonstraram-se seguros e efetivos na diminuição dos níveis
glicêmicos, promovendo também efeitos favoráveis em relação ao peso, isto é,
redução ou manutenção do mesmo, respectivamente148,
151, 161, 162
. Alguns
estudos demonstraram efeitos benéficos dessas drogas promissoras também
sobre o perfil lipídico e a pressão arterial dos pacientes145.
Tanto os agonistas dos receptores de GLP-1 quanto os inibidores da
DPP-4 levam à secreção de insulina e à supressão de glucagon glicosedependente, com conseqüente baixo risco de hipoglicemia quando utilizados
isoladamente ou em terapia combinada, exceto se concomitantes com
23
sulfoniuréias. Ademais, estudos experimentais demonstraram que prolongam a
sobrevida das células beta pancreáticas, atrasando sua disfunção e
promovendo sua regeneração, permitindo, teoricamente, a possibilidade de se
diminuir a progressão do diabetes mellitus tipo 2. Não foram verificados, até o
momento, esses resultados em estudos clínicos145, 148, 149.
Contudo, apesar das atraentes características desses novos
agentes, seu alto custo em relação às drogas orais de primeira linha e a
indisponibilidade de dados de pesquisas em longo prazo quanto à suas
segurança e resultados clínicos, devem ser levados em consideração. Há
relatos de náuseas, cefaléia, casos de pancreatite aguda, infecção de vias
aéreas superiores, depressão, hipoglicemia severa e reações alérgicas
dermatológicas, por seu uso; alguns indivíduos apresentam, ainda, modesta
redução dos seus níveis de hemoglobina glicada (HbA1C), de cerca de 1,0%,
em comparação com a que ocorre com a utilização de insulina e agentes mais
antigos. O desenvolvimento de carcinomas em cobaias, pela sua utilização,
ainda não foi confirmado em humanos145, 152,153.
Além
de
novas
classes
de
medicações
antidiabéticas,
o
desenvolvimento de análogos da insulina e de outras alternativas não-invasivas
para a utilização da insulina são promissoras opções para o manejo do
diabetes mellitus tipo 2146,
163
. Podem auxiliar no vencimento de alguns
desafios, visando atingir um melhor controle glicêmico, apesar das dificuldades
pela progressão natural da própria doença e pela perda da eficácia em longo
prazo dos agentes orais159.
Novos análogos da insulina basal, incluindo pré-misturas, como
lispro, aspart e glargina, permitem uma reposição mais fisiológica, com mais
liberdade, flexibilidade e conveniência na adminstração e em relação ao
conteúdo da alimentação, se comparados às formulações da insulina regular,
propiciando melhor qualidade de vida144, 146, 163. Formulações inovadoras, sem
a necessidade de injeções subcutâneas, podem suplantar algumas das
limitações da insulinoterapia usual e, assim, facilitar a utilização precoce da
insulina, permitindo se alcançar e manter em longo prazo um melhor controle
glicêmico, aumentando a qualidade de vida dos indivíduos157. Há, por outro
lado, clara necessidade de se somar apropriado aconselhamento, com
24
educação individual, também às modernas terapias disponíveis no tratamento
clínico do diabetes tipo 2, as quais tentam transpor as conhecidas barreiras da
insulinoterapia154.
Os objetivos do tratamento do diabetes mellitus tipo 2 resumem-se à
melhora da qualidade de vida e à prevenção da mortalidade precoce dos
indivíduos acometidos através de um intensivo controle glicêmico, minimizando
o risco de seus efeitos microvasculares, ainda que não se tenham demonstrado
benefícios substanciais quanto às suas implicações macrovasculares62, 164-167.
Entretanto, a manutenção de um adequado controle glicêmico em
pacientes obesos com diabetes tipo 2 por meios conservadores é um
verdadeiro desafio. As dietas que impõem grande restrição calórica e os
programas clínicos multidisciplinares para perda ponderal raramente têm
demonstrado benefícios consideráveis em médio e em longo prazos, além das
próprias limitações e dos efeitos colaterais dos fármacos antidiabéticos e da
insulinoterapia. Até o presente, mesmo regimes de intensificação do controle
glicêmico,
mediante
combinação
e instituição
otimizada
dos
agentes
tradicionais, falharam na conquista dessas metas terapêuticas. Mesmo os
novos agentes orais e os análogos da insulina, os quais necessitam de maiores
estudos para sua validação, consideram as necessidades individuais e o estilo
de vida de cada paciente. Assim, não é necessário apenas um ótimo controle
glicêmico, mas também intervenções sobre o estilo de vida de indivíduos
diabéticos, combatendo obesidade, hipertensão arterial, dislipidemia e
tabagismo, para que se conquistem os resultados desejados no tratamento do
diabetes tipo 262, 145, 154, 168.
Na abordagem terapêutica do DM2 e da resistência insulínica, além
de uma ampla variedade de opções no tratamento clínico multidisciplinar, com
o objetivo de perda ponderal e controle da glicêmica com opções
farmacológicas, podem, portanto, ser incluídas técnicas operatórias bariátricas
e metabólicas. É bem sabido que essas intervenções cirúrgicas podem
controlar a DM2, mesmo em longo prazo169. O tratamento cirúrgico de
pacientes portadores de diabetes mellitus do tipo 2, obesos ou não, deve ser
visto atualmente como uma alternativa válida para a abordagem dessa
enfermidade.
25
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar os efeitos orgânicos da transposição ileal no diabetes
mellitus tipo 2.
2.2 Específicos
2.2.1. Investigar as alterações morfológicas e funcionais ocorridas
nas células L intestinais num segmento de íleo distal interposto ao jejuno
proximal em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta;
2.2.2. Estudar as modificações estruturais no intestino delgado de
animal submetido à transposição de um segmento de íleo distal para uma
situação proximal no tubo digestório em ratos com dismetabolismo glicídico
induzido por dieta;
2.2.3. Analisar a morfologia e quantificar as células do pâncreas
endócrino após a transposição ileal em ratos com dismetabolismo glicídico
induzido por dieta;
2.2.4.
Verificar
as
alterações
bioquímicas
em
ratos
com
dismetabolismo glicídico induzido por dieta, submetidos à transposição ileal.
2.2.5. Avaliar os níveis de expressão relativa dos genes relacionados
à apoptose celular, diabetes mellitus e diferenciação de células-tronco em ratos
com dismetabolismo glicídico induzido por dieta, submetidos à transposição
ileal.
26
3. JUSTIFICATIVA
A intervenção cirúrgica a ser estudada nesta pesquisa - interposição
de segmento ileal na continuidade do jejuno proximal - pode vir a constituir-se
em abordagem terapêutica válida para o controle do diabetes mellitus tipo 2,
inclusive em indivíduos não-obesos, uma vez que não produz nenhum distúrbio
da absorção dos nutrientes. A cirurgia avaliada é de simples execução, de
baixo custo, pode ser facilmente revertida e não requer nenhuma remoção de
segmento de tubo disgestório nem condiciona desvio de trânsito alimentar de
nenhuma ordem, destarte evitando a incidência de desnutrição e outras
complicações.
Entretanto, há que se investigar a possibilidade de, com o tempo e
com a exposição constante a altos teores dos sucos digestivos oriundos do
estômago, pâncreas e fígado, e também com o contato constante entre a
mucosa do ileo transposto e alimentos não completamente digeridos, haverá
de "jejunizar-se" a mucosa do íleo interposto, isto é, seu fenótipo passar a
apresentar características histológicas das células e estruturas da membrana
de absorção e de secreção exócrina e endócrina semelhantes ao padrão
jejunal. Essa possível jejunização do íleo interposto pode interessar apenas
aos componentes exócrinos e absortivos (o que não constituirá problema
algum), ou também modificar o padrão endócrino do ileo (alta densidade de
células L produtoras de GLP-1) no sentido da adoção do padrão jejunal (baixa
densidade dessas células). Esta última circunstância invalidará a eficiência da
proposição técnica, em longo prazo. Vale dizer: caso seja afastada, mediante a
presente pesquisa, a possibilidade teórica de o epitélio da membrana mucosa
do segmento ileal interposto no jejuno proximal adquirir o fenótipo do jejuno inclusive e principalmente adquirindo a configuração de baixa densidade de
células L, típica do jejuno proximal - , estaria elidido o único óbice teórico à
consecução da interposição ileal em indivíduos diabéticos. Assim, caso o íleo
interposto venha a se manter com alta densidade de células L, estará garantida
a ação em longo prazo dos efeitos tróficos benéficos já bem estudados do
GLP-1, principalmente para o lado do pâncreas endócrino.
27
Uma vez estudada tal intervenção no âmbito da medicina
translacional em animais de experimentação, cujas características biológicas
são muito semelhantes às dos humanos, no que diz respeito ao metabolismo
glicídico e à nutrição em geral, os resultados poderão ser extrapolados para a
clínica. A relevância da presente pesquisa reside nos benefícios que a
intervenção cirúrgica estuda possa promover para uma imensa população de
indivíduos diabéticos, ainda que não-obesos, promovendo o controle
substancial e até mesmo a remissão da disglicidemia.
28
4. RESULTADOS ESPERADOS
Espera-se que a imunohistoquímica no tecido intestinal venha a
demonstrar a preservação da alta densidade de células L no íleo interposto,
apesar de ser esperada a transformação do padrão ileal para o padrão jejunal
do epitélio mucoso de secreção exócrina e de absorção. Isto porque a
diferenciação das células troncos das criptas no sentido das células L não
sofrem influências epigenéticas. É esperado que as células tronco do fundo das
criptas continuem a se diferenciar em ritmo normal em células L. Sabe-se que
esses estímulos induzem à transformação do padrão epitelial secretório
exócrino e absortivo do íleo em padrão mucoso jejunal, mas ignora-se se essa
"jejunização" também envolve a transformação do padrão de alta densidade de
células L do íleo normal, antes da transposição, em baixa densidade dessas
células no íleo transposto. A imunohistoquímica no tecido pancreático deve
demonstrar a preservação das ilhotas de Langerhans, de células produtoras de
insulina e de células em proliferação. A intolerância à glicose e a resistência
insulínica deverão atenuar-se ou desaparecer no grupo submetido à
transposição ileal. Alguma redução no peso dos animais do grupo submetido à
transposição ileal deverá ocorrer, no entanto sem desnutrição. Nenhum efeito
adverso da interposição ileal é esperado.
O estudo biomolecular da expressão dos genes de interesse é
fundamental para avaliação personalíssima, de modo mais íntimo e precoce,
do que acontece especificamente após a intervenção cirúrgica realizada. A
análise histológica permite o reconhecimento tardio do processo que foi
instalado.
29
5. MÉTODOS
Modelo Experimental
Comitê de Ética em Pesquisa
O presente projeto de pesquisa será encaminhado ao Comitê de
Ética em Pesquisa Experimental da Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM).
Procedimentos Experimentais
Os procedimentos experimentais serão realizados de acordo com as
orientações do manual “Cuidados e Manejos de Animais de Laboratório”, Ed:
Lapchick, Mattaraia, Ko; Atheneu, 2009, CDD 636.0885.
Amostra
Utilizar-se-ão 40 ratos machos (Rattus norvegicus albinus), Wistar 2BAW Heterogêneos, com 12 semanas de vida, de peso corporal variando
entre 250 e 280 g, fornecidos pelo Laboratório de Experimentação Animal do
Instituto de Farmacologia e Biologia Molecular da Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM), onde serão mantidos
durante todo o procedimento experimental.
Os animais permanecerão alojados em gaiolas individuais e
mantidos por 16 semanas, com temperatura ambiente controlada de 23  2C,
umidade relativa de 55  15%, e com dispositivo automático (Timer – Kienzle)
proporcionando ciclo de alternância de luminosidade entre claro e escuro de 12
em 12 horas (06:00 / 18:00 horas).
Através de sorteio, os animais serão distribuídos em 4 grupos,
conforme organograma abaixo discriminado:
- Grupo Transposição (GT) – submetidos à transposição ileal, com
10 animais, em uso de dieta hipercalórica-hiperlipídica;
30
- Grupo Sham (GS) – submetidos à operação simulada, com 10
animais, e utilizando a mesma dieta;
- Grupo Controle 1 (GC1) – não submetidos a nenhuma intervenção
cirúrgica, mas consumindo a dieta hipercalórica-hiperlipídica; e
- Grupo Controle 2 (GC2) - não submetidos a nenhuma intervenção
cirúrgica, nem à dieta hipercalórica-hiperlipídica, mas apenas ração padrão,
com 10 animais.
Amostra
N ≥ 40
Grupo
Transposição Ileal
(GT)
N ≥ 10
Grupo
Sham
(GS)
N ≥ 10
Grupo
Controle 1
(GC1)
N ≥ 10
Grupo
Controle 2
(GC2)
N ≥ 10
As intervenções cirúrgicas serão realizadas na 20ª semana de vida.
Todos os animais serão acompanhados até a 08ª semana de pós-operatório
(PO), isto é, a 28ª semana de vida, quando serão sacrificados.
Dieta
Os ratos randomizados dos grupos GT, GS e GC1 serão mantidos no
decorrer de todo o experimento com dieta hipercalórica (DH), rica em lípides,
pelletizada, ministrada ad libitum, em ciclos alternados de quatro tipos
diferentes de rações (1, 2, 3 e 4), pelo período de 16 semanas, estimulando a
ingesta. As rações experimentais serão alternadas a cada 24 horas, e a
31
quantidade não ingerida será mensurada. O consumo dessas dietas promoverá
obesidade nos animais, os quais exibirão características comumente
associadas
com a
obesidade
humana, como
resistência
à insulina,
hiperglicemia, hiperinsulinemia, dislipidemia e esteatose hepática. Os animais
do grupo GC2, por sua vez, receberão dieta padrão. A oferta de água será de
livre acesso em todos os grupos.
As rações experimentais 1, 2, 3 e 4, de acordo com as
especificações da Nutrient Requirements of the Laboratory Rat, recomendadas
pela National Academy of Sciences, serão produzidas industrialmente pela
empresa Rhoster®, Araçoiaba da Serra – SP, compostas por ração padrão
para ratos, com suplementação protéica, vitamínica e mineral. Os ingredientes
adicionais hiperenergéticos que serão utilizados no preparo das dietas
experimentais hipercalóricas, em gramas por quilo, serão, respectivamente:
- DH1 – ração padrão, 355; amendoins torrados, 176; caseína, 123;
óleo de milho, 82; chocolate, 88; biscoito de milho, 176; e vitaminas e minerais.
- DH2 - ração padrão, 439; amendoins torrados, 218; caseína, 129;
óleo de milho, 61; batata frita, 153; e vitaminas e minerais.
- DH3 - ração padrão, 371; amendoins torrados, 185; caseína, 99;
óleo de milho, 68; macarrão, 185; queijo ralado, 92; e vitaminas e minerais.
- DH4 - ração padrão, 359; amendoins torrados, 179; caseína, 105;
óleo de milho, 80; leite condensado, 161; bolacha wafer, 116; e vitaminas e
minerais.
A
experimentais
composição
de
macronutrientes
das
hipercalóricas-hiperlipídicas, produzidas
rações
padrão
e analisadas
e
em
laboratório pela empresa Rhoster®, Araçoiaba da Serra – SP, está
apresentada no Quadro 1.
32
Quadro 1- Composição das dietas padrão e experimentais.
Rações
Componentes
Padrão
DH 1
DH 2
DH 3
DH 4
Proteína (%)
26
27
28
28
26
Carboidrato (%)
54
43
36
33
43
Gordura (%)
3
20
23
24
20
Outros (%) †
17
10
13
15
11
Calorias (Kcal/g)
3,5
4,6
4,6
4,6
4,6
† - vitaminas, minerais, umidade, cinzas.
Curva de Peso e Consumo de Ração
A pesagem realizar-se-á duas vezes por semana, em dias préestabelecidos, tão logo se inicie o período claro, com balança apropriada
(Filizola BP-6), de precisão, e a anotação do peso de cada animal será feita em
gramas.
O consumo de ração será anotado três por semana, em dias prédeterminados, calculando-se em cada gaiola a diferença dos pesos das rações
ofertada e consumida, fazendo-se o cálculo aritmético da estimativa diária do
consumo de ração, em gramas.
As curvas de peso e consumo de ração serão realizadas em todos os
grupos, durante todo o experimento.
Jejum
Aos animais de todos os grupos será oferecida somente água nas 6
horas que antecedem os procedimentos de coleta de sangue para testes
laboratoriais e procedimento cirúrgico.
33
Coleta de Sangue e Testes Laboratoriais
Serão realizadas coletas sangüíneas para os testes laboratoriais na
12ª semana de vida dos animais (S12), no dia da operação (S20) e na 08ª
semana de pós-operatório, ou seja, 28ª semana de vida (S28), após pesagem
e sob anestesia prévia.
A coleta sanguínea no dia zero (D0), início da experimentação, visa
obter os parâmetros basais de cada animal, enquanto que a do dia da cirurgia
busca verificar as alterações ocorridas no metabolismo glicídico dos animais,
secundárias à obesidade induzida pelas dietas experimentais hipercalóricashiperlipídicas, e a da 8ª semana de pós-operatório pretende avaliar as
modificações desse mesmo metabolismo, após as intervenções cirúrgicas
realizadas.
Será coletado 0,5 mL de sangue através de punção da veia da cauda
de cada um dos animais, em tubos heparinizados, seguindo-se centrifugação e
posterior armazenamento a –20ºC para as determinações séricas (LABTEST®)
de glicose (GLI) e de insulina (INS), hemoglobina glicada (HBG), peptídeo C
(PTC) e Glucagon-like peptide-1 (GLP1) pelo método ELISA (LINCO®).
Também será realizado na amostra sanguínea estudo biomolecular com
reação de polimerase em cadeia em tempo real (PCR em tempo real).
Procerder-se-ão às análises da expressão gênica de um total de 252 genes
envolvidos especificamente com a apoptose de células beta pancreáticas,
desenvolvimento do diabetes mellitus e diferenciação de células tronco.
Após 10 minutos da coleta do sangue, será feita a determinação da
glicose
sérica
com
fitas
reagentes
em
glicosímetro
(Kit
Accu-Chek
Advantage®) e em seguida será realizado o teste de tolerância insulínica (TTI),
quando será injetada uma solução de insulina regular na concentração de 1
U/Kg de peso corpóreo através da veia peniana. A partir de então serão
coletadas amostras para a determinação da glicemia, utilizando-se lancetas
para a obtenção de uma gota de sangue da cauda do animal, aos 4, 8, 12 e 16
minutos após a injeção de insulina. Os resultados serão registrados para
análise posterior.
34
A determinação da glicose sérica com fitas reagentes em
glicosímetro (Kit Accu-Chek Advantage®) será também realizada em dias prédeterminados, uma vez por semana, durante todo o experimento (S13, S14,
S15, S16, S17, S18, S19, S21, S22, S23, S24, S25, S26, S27).
Anestesia, Pesagem e Antibioticoprofilaxia
Antes do início da anestesia, todos os animais serão pesados em
balança de precisão (Filizola BP-6) e os respectivos pesos anotados em
gramas. Em ambos os grupos GT e GS será realizada anestesia geral com
halotano para a realização da coleta de sangue da cauda e em seguida
anestesia geral dissociativa, para a realização do teste de tolerância insulínica
e intervenções cirúrgicas, utilizando Zoletil 50® (tiletamina+zolazepan) na dose
de 20 mg/kg e Fentanil® na dose de 0,025 mg/kg, coletados na mesma seringa
e injetados simultaneamente por via intramuscular170.
Cada animal será mantido em ventilação espontânea durante os
procedimentos, e o plano anestésico será controlado mediante avaliação
periódica, a cada 45 minutos, dos reflexos auricular e interdigital, que devem
estar abolidos. Constatando-se reaparecimento desses reflexos, será feita
complementação anestésica com um terço da dose inicial. Ao término da
intervenção cirúrgica, será anotada a quantidade total de anestésicos utilizada.
A antibiótico-profilaxia será realizada com cefoxitina na dose de 50
mg/kg de peso, por via intramuscular, logo depois de anestesiados para a
cirurgia.
Procedimentos Operatórios
Nos dias determinados, com 20 semanas de vida (S20), dois ratos
serão separados e aleatoriamente distribuídos no GT e no GS. Adotar-se-ão
todos os princípios de assepsia e antissepsia de Halsted, utilizando-se
instrumental micro-cirúrgico estéril.
Os animais anestesiados terão os pêlos da região abdominal
cortados com tesoura rente à pele, e serão posicionados em decúbito dorsal
horizontal na mesa cirúrgica, com as patas e a cauda devidamente
35
imobilizadas, atadas com esparadrapo. A anti-sepsia da região abdominal será
feita com clorohexidine em veículo aquoso.
Será colocado campo cirúrgico esterilizado fenestrado na região
abdominal do animal, e será realizada uma incisão longitudinal mediana da
parede, com aproximadamente 5 cm de extensão, utilizando-se bisturi
descartável de lâmina número quinze.
No animal componente do GT, o ceco será identificado e exposto,
juntamente com o íleo terminal. A seguir, o intestino delgado será seccionado
perpendicularmente nas regiões distando 3 e 5 cm da transição íleo-cecal,
ressecando-se um segmento ileal de 2 cm para estudo histológico (Figura 1A).
O íleo será novamente seccionado perpendicularmente na região distante 15
cm da transição íleo-cecal, separando-se, dessa forma, um segmento ileal de
10 cm, o qual será envolto em gaze umedecida com solução de cloreto de
sódio a 0,9%, aquecida (Figura 1B). Em seguida, será realizada a anastomose
dos segmentos do íleo remanescente, de forma a ser restabelecida a
continuidade do tubo digestório. Posteriormente, será seccionado o jejuno em
dois locais, distantes 5 e 6 cm da transição duodeno-jejunal, ressecando-se um
segmento jejunal de 1 cm para estudo anatomo-patológico (Figura 1A). O
segmento do íleo distal anteriormente separado será interposto aos segmentos
do jejuno seccionado, em posição isoperistáltica, por entero-enteroanastomose
(Figura 1C).
Figura 1A
Figura 1B
Figura 1C
36
Figura 1A – Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal e dos segmentos
ileal e jejunal a serem submetidos a estudo histológico.
Figura 1B – Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal e do segmento
ileal isolado (preenchido em preto) a ser transposto.
Figura 1C – Esquema demonstrativo da anastomose do íleo distal e do segmento ileal
transposto (preenchido em preto) anastomosado nos segmentos iniciais do jejuno.
No animal componente do GS, o ceco será identificado e exposto,
juntamente com o íleo terminal. A seguir, o intestino delgado será seccionado
perpendicularmente nas regiões distando 3 e 5 cm da transição íleo-cecal,
ressecando-se um segmento ileal de 2 cm para estudo histológico, e também
nas regiões distantes 5 e 6 cm da transição duodeno-jejunal, para a remoção
de 1 cm de tecido jejunal para estudo histológico (Figura 1A). Em seguida,
serão realizadas as anastomoses dos segmentos intestinais remanescentes,
de forma a ser restabelecida a continuidade do tubo digestório, sem
transposição (Figuras 1D e 1E).
Figura 1A
Figura 1D
Figura 1E
Figura 1A – Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal e dos segmentos
ileal e jejunal a serem submetidos a estudo histológico.
Figura 1D – Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal.
Figura 1E – Esquema demonstrativo das anastomoses intestinais do íleo distal e do
jejuno proximal.
37
Todas as anastomoses intestinais serão término-terminais e
realizadas com 6 pontos totais separados, utilizando-se fios de polipropileno 70 pré-montados em agulha cilíndrica.
Após a revisão final, terminado o ato cirúrgico, os animais serão
hidratados com 1,0 mL de solução cristalóide (soro fisiológico a 0,9%) para
cada 300g de peso, na temperatura de 36ºC, via intraperitoneal.
A síntese da parede abdominal será realizada com sutura contínua
em monobloco do peritônio parietal, da camada muscular e da aponeurose,
utilizando-se fio de poliglactina 4-0 pré-montado em agulha cilíndrica. Na pele
será feita sutura contínua com pontos invertidos, utilizando-se fio de
poliglactina 4-0 pré-montado em agulha cilíndrica.
Evolução Pós-Operatória
Os animais serão mantidos aquecidos e em observação até a
recuperação completa da anestesia, quando então serão colocados em gaiolas
individuais e encaminhados para a sala de albergue, no mesmo Laboratório,
sob as mesmas condições ambientais pré-operatórias.
Antes da recuperação anestésica, os animais receberão analgesia
com 0,5 mL da solução de 3 g de dipirona diluídos em 1 mL de água, por
gavagem. Será reintroduzida água ad libitum tão logo haja recuperação
anestésica. Durante as primeiras 72 horas seguintes de pós-operatório, serão
mantidos com 1 g de dipirona diluído em 100 mL de água. O acesso à dieta
será permitido após 12 horas do término da cirurgia.
Os animais serão avaliados e acompanhados até a 08ª semana do
pós-operatório, ou seja, a 28ª semana de vida (S28), período equivalente a 5
anos de pós-operatório na espécie humana171.
Eutanásia
Na 28ª semana de vida serão realizados os mesmos procedimentos
de jejum, anestesia, pesagem e coleta de sangue para testes laboratoriais e,
em seguida, será efetuada a eutanásia pela técnica de decapitação, conforme
38
orientações da Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório /
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – SBCAL-COBEA.
Composição Corporal
Após a eutanásia, serão coletados os depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal para pesagem em balança de precisão, em todos
os animais de cada grupo, para quantificação de sua adiposidade.
Coleta do Tecido Pancreático
Após a eutanásia, será coletado o pâncreas dos animais de todos os
grupos, para estudo anátomo-patológico e imunohistoquímico. A ressecção do
órgão será realizada junto à grande curvatura gástrica e à região esplênica, em
monobloco.
Coleta do Tecido Intestinal
No momento da realização das operações, em GT e GS, serão
coletados tecidos para avaliação histológica inicial, nas seguintes regiões
(Figura 2):
- Segmento de íleo distal – I 1 (íleo, no tempo 1).
- Segmento de jejuno proximal – J 1 (jejuno, no tempo 1);
Figura 2
39
Figura 2 – Esquema demonstrativo dos segmentos ileal e jejunal a serem submetidos a
estudo histológico em ambos os grupos.
Após a eutanásia, em todos os grupos, serão coletados os seguintes
tecidos intestinais para uma segunda análise, a fim de se avaliar a morfologia
estrutural do intestino e as células intestinais produtoras dos hormônios
incretínicos (células L), além de as suas possíveis modificações em longo
prazo:
- Segmento de íleo, distal à anastomose íleo-ileal nos GT e
GS, e a 2 cm da transição íleo-cecal nos GC1 e GC2 – I 2 (íleo, no
tempo 2);
- Segmento de jejuno distal à anastomose íleo-jejunal no GT e
jejuno-jejunal no GS, e à cerca de 7 cm da transição duodeno-jejunal
nos GC1 e GC2 – J 2 (jejuno, no tempo 2);
- Segmento mediano do íleo transposto no GT e o seu
correspondente no GS, a 8 cm da transição íleo-cecal – T 2 (segmento
transposto, no tempo 2).
Figura 3A
Figura 3B
Figura 3C
Figura 3A – Esquema demonstrativo dos segmentos I2, J2 e T2 a serem submetidos a
estudo histológico post-mortem nos animais do GT.
Figura 3B – Esquema demonstrativo dos segmentos I2, J2 e T2 a serem submetidos a
estudo histológico post-mortem nos animais do GS.
40
Figura 3C – Esquema demonstrativo dos segmentos I2 e J2 a serem submetidos a
estudo histológico post-mortem nos animais do GC1 e GC2.
Histologia – Microscopia Óptica e Imuno-Histoquímica
Tecido Pancreático:
O pâncreas de cada animal, ressecado em monobloco, destinado à
avaliação com microscopia ótica, será devidamente disposto em cassete e
fixado em formaldeído tamponado a 10% por 12 horas e, em seguida,
processado para inclusão em parafina. Os cortes histológicos serão obtidos em
micrótomo do tipo Minot regulado para a espessura de 5 m e colocados em
lâminas previamente tratadas com silano 5%, utilizando-se o maior eixo da
peça.
As lâminas serão coradas com hematoxilina-eosina para análise
morfométrica do pâncreas. Serão utilizados anticorpos específicos para estudo
imuno-histoquímico:
- Anticorpo Policlonal H-86:SC-9168 da marcação de células
produtoras de insulina, do tipo policlonal de coelho, Código H-86: SC9168, da empresa Santa Cruz Biotechnology.
- Anticorpo Monoclonal anti-Rat para avaliar células em
proliferação Ki67, Clone MIB-5, Código: M7248-1, Marca Dako.
Tecido Intestinal:
Os segmentos intestinais ressecados de cada animal, destinados à
avaliação com microscopia ótica, serão abertos em sua porção contramesentérica e cautelosamente lavados com soro fisiológico. A seguir, serão
dispostos sobre um fragmento de papel filtro, mantendo contato direto com a
serosa e ficando a face mucosa voltada para cima. Posteriormente, serão
colocados em um frasco de boca larga em formaldeído tamponado a 10% por
12 horas, em quantidade de 10 vezes superior ao volume tecidual,
permanecendo a face mucosa em contato direto com a solução. Em seguida,
serão processados para inclusão em parafina. Os cortes histológicos serão
41
obtidos em micrótomo do tipo Minot regulado para a espessura de 5 m e
colocados em lâminas previamente tratadas com silano 5%, utilizando-se o
perímetro interno da peça.
As lâminas serão coradas com hematoxilina-eosina para análise
morfométrica do intestino, em todos os segmentos ressecados. Serão
utilizados anticorpos específicos para estudo imuno-histoquímico:
- Anticorpo sc7782 Anti-GLP-1, Clone C-17, da empresa Santa
Cruz Biotechnology, em diluição de 1:500.
- Anticorpo Monoclonal anti-Rat para avaliar células em
proliferação Ki67, Clone MIB-5, Código: M7248-1, Marca Dako.
Protocolo da Imunohistoquímica:
As lâminas com os fragmentos do pâncreas seguirão para estudo
imunohistoquímico com dupla marcação antigênica, utilizando o KIT: EnVision
G|2 Doublestain System, Rb/Mo (DAB+/Permanent Red), Código: K5361-1,
Marca: Dako. A visualização basear-se-á na peroxidase (HRP) utilizando como
cromógeno o DAB+ e Fosfatase Alcalina (AP) utilizando como cromógeno o
Permanent Red.
As lâminas com os fragmentos intestinais seguirão para estudo
imunohistoquímico com dupla marcação antigênica, utilizando o KIT: LSAB. A
visualização basear-se-á na peroxidase (HRP) utilizando como cromógeno o
DAB+.
Tem-se o seguinte protocolo para os cortes histológicos:
a) desparafinação: as lâminas serão deixadas em estufa a 60ºC por
12 horas, para melhor adesão do tecido, e em seguida serão desparafinadas
com 3 banhos em xilol por 5 minutos cada em temperatura ambiente;
b) hidratação: as lâminas serão submersas duas vezes em etanol
absoluto por 5 minutos e lavadas com água corrente por 2 minutos para
hidratação dos cortes;
42
c) recuperação antigênica: as lâminas serão colocadas em solução
de citrato de sódio 10 mM pH 6,0 por 30 minutos em panela de vapor (95ºC),
deixando-se depois esfriar a temperatura ambiente por 20 minutos e lavadas
em PBS (Tampão Salina Fosfato) 0,05 M, pH 7,4 quatro vezes por 3 minutos
cada;
d) bloqueio da peroxidase endógena: as lâminas serão incubadas
com peróxido de hidrogênio 3%, quatro vezes por 5 minutos cada e, em
seguida, lavadas com água corrente e tampão PBS pH 7,4 três vezes por 3
minutos cada;
e) bloqueio de sítios inespecíficos: as lâminas serão incubadas em
PBS pH 7,4 + BSA (Soro Albumina Bovina) 1% por 30 minutos em temperatura
ambiente;
f) incubação do anticorpo primário: os cortes histológicos de cada
lâmina serão incubados com anticorpo primário – SC-9168 para marcação das
células produtoras de insulina no caso do tecido pancreático, e SC-7782 para
marcação das células L no caso do tecido intestinal – , diluídos em PBS + BSA
1%, em titulação pré-estabelecida pelo fornecedor, e deixadas em câmara
úmida a 4ºC de 16 a 18 horas e, na seqüência, serão lavadas em PBS pH 7,4
por 3 vezes;
g) ligação do anticorpo secundário: os cortes serão incubados com o
anticorpo secundário, conjugado com biotina do Kit Dako EnVision no caso do
tecido pancreático e do Kit Dako LSAB no caso do tecido intestinal, por 30
minutos a temperatura ambiente, em câmara úmida. Após a incubação, as
lâminas serão lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes e novamente incubadas
com a solução de amplificação (estreptavidina conjugada com peroxidase) do
Kit Dako por 30 minutos e, em seguida, serão lavadas com tampão PBS, pH
7,4 por três vezes;
h) revelação: os cortes serão cobertos com solução de cromógeno
3,3’diaminobenzidina (DAB líquido) por 15 minutos e, seguida, lavados em
água destilada;
43
i) bloqueio da dupla marcação: os cortes dos tecidos pancreático e
intestinal serão cobertos com a solução de bloqueio de dupla marcação por 3
minutos e, em seguida, serão lavados com tampão PBS e cobertos com a
solução de bloqueio de enzimas endógenas do Kit Dako EnVision, novamente
lavados com tampão PBS;
j) incubação do segundo anticorpo primário: os cortes histológicos de
cada lâmina dos tecidos pancreático e intestinal serão incubados com o
segundo anticorpo primário – M7248-1, para avaliar as células em proliferação
– , diluídos em PBS + BSA 1%, em titulação pré-estabelecida pelo fornecedor,
e deixadas em câmara úmida a 4ºC de 16 a 18 horas e, na seqüência, serão
lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes;
k) ligação do segundo anticorpo secundário: os cortes de ambos os
tecidos pancreático e intestinal serão incubados com o segundo anticorpo
secundário, conjugado do kit Dako EnVision por 30 minutos a temperatura
ambiente em câmara úmida. Após a incubação, as lâminas serão lavadas em
PBS pH 7,4 por 3 vezes e novamente incubadas com a solução de
amplificação (estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina) do Kit Dako por
30 minutos e, em seguida, serão lavadas com tampão PBS, pH 7,4 por três
vezes;
l) revelação: os cortes serão cobertos com solução de cromógeno
Permanent Red por 20 minutos;
m) contracoloração: os cortes serão lavados em água corrente por 5
minutos e, em seguida, contracorados com hematoxilina de Harris por 20
segundos;
n) desidratação e montagem: as lâminas serão lavadas em água
corrente por 10 minutos, submersas em etanol absoluto 4 vezes e, a seguir, em
xilol por 3 vezes e levadas para montagem com lamínula e em meio de
montagem Ettelan ® e identificadas.
Utilizar-se-ão como controles positivos internos das reações
imunohistoquímicas para os respectivos marcadores os cortes histológicos de
44
pâncreas e do íleo terminal de um animal do grupo controle, conforme o caso.
Os controles negativos serão obtidos com a omissão do respectivo anticorpo
primário em cortes histológicos de lâminas semelhantes.
Serão adotados como padrões de positividade, no estudo do tecido
pancreático, o aparecimento de coloração marrom acastanhada, para o
primeiro anticorpo, corado com o cromógeno DAB+, e vermelha, para o
segundo anticorpo, corado com o cromógeno Permanent Red. Será adotado
como padrão de positividade, no estudo do tecido intestinal, o aparecimento de
coloração marrom acastanhada. A imunoexpressão será avaliada utilizando-se
representação de imagem por meio de um sistema computadorizado,
constituído por microscópio de luz (Carl Zeiss), adaptado a uma câmera de alta
resolução (Axio Cam MRC da Carl Zeiss), monitor de vídeo colorido
(Samsung). As imagens serão obtidas utilizando-se o programa de análise de
imagens AxionVision REL 4.2 da Carl Zeiss.
Biologia Molecular – Estudo da expressão relativa dos genes
Extração do RNA
As amostras de sangue serão homogeneizadas em reagente Trizol
(Life Technologies, Grand Island, NY, USA), de acordo com o protocolo do
fabricante, para isolamento do RNA total e proteínas. O RNA precipitado será
lavado com etanol 70%, para eliminar resíduos de fenol e sal, e solubilizado em
água tratada com DEPC. A concentração das amostras de RNA total será
determinada por espectrofotometria e a qualidade do mesmo será avaliada
através análise em gel de agarose/formaldeído a 1,5%.
Reação de Transcriptase Reversa (RT)
A síntese do cDNA (DNA complementar) será feita em alíquotas de 1
micrograma do RNA total extraído das amostras do grupo GT, as quais serão
incubadas com oligo dT a 65°C por 5 min seguida de incubação a 42ºC por 5
minutos na presença de transcriptase reversa, cloreto de magnésio, DNTP´s e
solução tampão, num volume final de 20l de água DEPC, para se obter a
45
primeira fita de cDNA. Assim, o cDNA obtido será estocado a –80°C até a
época da realização de análises posteriores.
Reação de Polimerase em Cadeia em Tempo Real
O cDNA sintetizado na etapa anterior será utilizado como molde na
reação de PCR em tempo real nos kits para estudo da apoptose de células
beta pancreáticas, desenvolvimento do diabetes mellitus e diferenciação de
células-tronco da empresa SABiosciences - QIAGEN. Cada um dos kits
analisa, por PCR em tempo real, 84 genes importantes nas vias referidas,
totalizando 252 genes que serão estudados pela emissão fluorescente
garantida pela presença do agente intercalador fluorescente SYBR GREEN. A
listagem detalhada dos genes de cada kit, cujas atividades transcriptivas serão
analisadas, segue abaixo.
1 - RT² Profiler™ PCR Array para Apoptose de células beta
pancreáticas.
TNF Ligand Family:
Lta, Tnf, Tnfsf10, Tnfsf12, Cd40lg (Tnfsf5), Faslg (Tnfsf6).
TNF Receptor Family:
Ltbr, Tnfrsf10b, Tnfrsf11b, Tnfrsf1a, Tnfrsf1b, Tnfrsf5, Tnfrsf6.
Bcl-2 Family:
Bad (Bbc2), Bag1, Bak1, Bax, Bcl2, Bcl2a1, Bcl2l1, Bcl2l2,
Bcl2l11, Bclaf1, Bid, Bid3 (Hrk), Bik, Bnip1, Bnip2, Bnip3, Bok, Mcl1.
Caspase Family:
Casp1, Casp2, Casp3, Casp6, Casp7, Casp8, Casp8ap2, Casp9,
Casp4 (Casp11), Casp12, Casp14.
IAP Family:
Birc1b, Birc3, Birc4, Birc5.
TRAF Family:
Traf1, Traf2, Traf3, Traf4.
CARD Family:
46
Apaf1, Bcl10, Birc3, Birc4, Card6, Card10, Casp1, Casp2, Casp9,
Casp4 (Casp11), Cradd, Nol3, Pycard (Asc), Ripk2.
Death Domain Family:
Cradd, Dapk1, Fadd, Tnfrsf6, Tnfrsf10b (TRAIL-R), Tnfrsf11b,
Tnfrsf1a, Tradd.
Death Effector Domain Family:
Casp8, Cflar (Cash), Fadd.
CIDE Domain Family:
Cidea, Cideb, Dffa, Dffb.
p53 and DNA Damage-Induced Apoptosis:
Apaf1, Bad (Bbc2), Bax, Bcl2, Bcl2l1, Bid, Casp3, Casp6, Casp7,
Casp9, Gadd45a, Tp53 (p53), Trp53bp2, Trp63, Trp73.
Anti-Apoptosis:
Api5, Aven, Bag1, Bcl2, Bcl2l1, Bcl2l2, Birc1b, Birc3, Birc4, Birc5,
Bnip1, Bnip2, Bnip3, Casp2, Cflar, Dad1, Faim, Il10, Lhx4, Mapk8ip,
Mcl1, Nfkb1, Polb, Prdx2, Prlr, Prok2, Sphk2, Tnf, Tnfrsf6, Cd40lg
(Tnfsf5).
2 - RT² Profiler™ PCR Array para Diabetes mellitus.
Receptors, Transporters & Channels:
Adra1a, Adrb3, Aqp2, Ccr2, Cd28, Ceacam1, Ctla4, Gcgr, Glp1r,
Icam1, Il4ra, Nsf, Rab4a, Sell (LECAM-1), Slc2a4 (GLUT4), Slc14a2,
Snap23, Snap25, Stx4a, Stxbp1, Stxbp2, Stxbp4, Tnfrsf1a, Tnfrsf1b,
Vamp2, Vamp3, Vapa.
Nuclear Receptors:
Ppara, Pparg.
Metabolic Enzymes:
Ace, Acly, Parp1 (Adprt), Dpp4, Enpp1, Fbp1, G6pc, Gck, Gpd1,
Gsk3b, Hmox1, Ide, Nos3, Pygl, Sod2.
Secreted Factors:
47
Agt, Ccl5 (Rantes), Gcg, Ifng, Il6, Il10, Il12b, Ins1, Retn, Tgfb1,
Tnf, Vegfa.
Signal Transduction:
Akt2, Dusp4, Igfbp5, Ikbkb (IKKbeta), Inppl1 (SHIP2), Irs1, Irs2,
Mapk8 (JNK1), Mapk14 (p38 MAPK), Pik3cd, Pik3r1, Ptpn1 (PTP-1B),
Trib3 (Skip3).
Transcription Factors:
Cebpa, Foxc2, Foxg1, Hnf4a, Foxp3 (LOC317382), Neurod1,
Nfkb1, Nrf1, Pdx1 (Ipf1), Ppargc1a, Srebf1, Tcf2 (HNF1b), Titf1.
Others:
Serpine1 (PAI-1), Ucp2.
3 - RT² Profiler™ PCR Array para Células-tronco.
Stem Cell Specific Markers:
Cell Cycle Regulators: Apc, Axin1, Ccna2, Ccnd1, Ccnd2, Ccne1,
Cdc2a, Cdc42, Ep300, Fgf1, Fgf2, Fgf3, Fgf4, Myc, Notch2, Pard6a,
Rb1.
Chromosome and Chromatin Modulators: Gcn5l2, Hdac1, Hdac2,
Myst1, Myst2, Rb1, Tert.
Genes Regulating Symmetric/Asymmetric Cell Division: Dhh, Ihh,
Notch1, Notch2, Numb, Pard6a.
Self-Renewal Markers: Hspa9a, Myst1, Myst2, Neurog2,
RGD1565646 (Sox2).
Cytokines and Growth Factors: Bmp1, Bmp2, Bmp3, Cxcl12, Fgf1,
Fgf2, Fgf3, Fgf4, Igf1, Jag1, LOC306312 (Gdf2), RGD1564178 (Gdf3).
Genes Regulating Cell-Cell Communication: Dhh, Dll1, Gja1,
Gjb1, Jag1.
Cell Adhesion Molecules: Agc1, Apc, Bglap2, Cd4, Cd44, Cdh1,
Cdh2, Catna1 (Ctnna1), Cxcl12, Ncam1.
Metabolic Markers: Abcg2, Aldh1a1, Aldh2, Fgfr1.
48
Stem Cell Differentiation Markers:
Embryonic Cell Lineage Markers: Actc1, Ascl2, Foxa2, Isl1, Ka15
(Krt15), Msx1, Myod1, Pdx1 (Ipf1), T.
Hematopoietic Cell Lineage Markers: Cd19, Cd3d, Cd3e, Cd4,
Cd8a, Cd8b, Mme.
Mesenchymal Cell Lineage Markers: Agc1, Alpi, Bglap2, Col1a1,
Col2a1, Col9a1, Pparg.
Neural Cell Lineage Markers: Cd44, Ncam1, Oprs1, S100b,
Tubb3.
Signaling Pathways Important for Stem Cell Maintenance:
Notch Pathway: Dll1, Dll3, Dtx2, Dvl1, Ep300, Gcn5l2, Hdac1,
Hdac2, Jag1, Notch1, Notch2, Numb.
Wnt Pathway: Adar, Apc, Axin1, Btrc, Ccnd1, Fzd1, Myc, Ppard,
Wnt1.
Parâmetros de Estudo
Peso Corporal: tão logo se inicie o ciclo claro, o peso de cada
animal de cada um dos quatro grupos (GT, GS, GC1 e GC2) será aferido em
balança de precisão e devidamente anotado em gramas (P1, P2, P3, .., P32).
Consumo de Ração: todos os animais receberão diuturnamente
ração em quantidade conhecida e suficiente para as suas necessidades
diárias; três vezes por semana, a ração não ingerida será pesada em balança
apropriada e, por meio da diferença entre o que foi fornecido e a sobra de
ração, será calculado o consumo alimentar diário.
Composição Corporal: no dia da eutanásia serão coletados e
pesados em balança de precisão os depósitos de gordura peri-epididimal e
retroperitoneal de todos os animais de cada grupo; o índice de adiposidade
será calculado através de proporção, considerando-se o peso corporal de cada
animal.
49
Exames Bioquímicos: serão feitas, em todos os animais, as
determinações séricas de glicose (GLI), insulina (INS), assim como de
glucagon-like peptide-1 (GLP-1), peptídeo C (PTC) e hemoglobina glicada
(HBG), nas ocasiões do início do procedimento (12ª semana de vida), da
cirurgia (20ª semana de vida) e da eutanásia (28ª semana de vida),
denominados, respectivamente, tempos 1, 2 e 3.
Resistência Insulínica: será feito o cálculo da resistência insulínica
(RI) pelo teste indireto HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment Insulin
Resistance), calculado pelo produto da insulina sérica (mU/mL), da glicemia
(mg/mL) e da constante 0,05551, dividido por 22,5; nos tempos 1, 2 e 3,
anteriormente enunciados.
Teste de Tolerância à Insulina (TTI): será realizado em todos os
animais do procedimento experimental, na ocasião do início do mesmo, da
cirurgia e da eutanásia, ditos tempos 1, 2 e 3; a velocidade de
desaparecimento da glicose será calculada pela fórmula In2/t1/2; o t1/2 da
glicose será calculado a partir da inclinação da curva de regressão mínima
durante a fase linear de declínio da concentração plasmática de glicose, com a
utilização do software PRISMA.
Determinação dos níveis de expressão relativa dos genes de
interesse - Apoptose Celular, Diabetes Mellitus e Diferenciação de Células
Tronco:
As reações serão analisadas pelo software do equipamento de PCR
em tempo real criado pela PE Applied Biosystems, Abi Prism 7000 Sequence
Detection System version 1.6.
Durante a reação, a fluorescência aumenta a cada novo ciclo de
PCR e atinge um limiar (threshold), no qual todas as amostras podem ser
comparadas. Este limiar corresponde ao momento utilizado para análise da
fluorescência. Este é um momento que é definido pelo pesquisador e
obrigatoriamente deve estar na faixa em que a quantidade de fluorescência
gerada pela amplificação das amostras torna-se significativamente maior que a
fluorescência de base (background).
50
O limiar é definido na fase exponencial da reação de PCR, quando a
quantidade de produto formada traduz de forma satisfatória a concentração
inicial de fitas molde (cDNA) amplificadas pela reação. O ciclo exato no qual o
limiar de fluorescência é definido denomina-se ciclo limiar (Ct: threshold cycle).
Amostras mais concentradas (com maior número de fitas molde iniciais)
atingem o limiar mais precocemente e mostram valores de Ct mais baixos.
Quando a eficiência da reação de PCR está próxima de 100%, o número de
cópias geradas aumenta de forma exponencial, dobrando a cada ciclo da
reação.
O número de fitas-molde iniciais pode ser calculado a partir do Ct.
Assim a equação Nf=No(1+E)n descreve a amplificação exponencial da PCR,
onde “Nf” é o número de fitas-molde em um determinado ciclo da reação, “No”
é o número de fitas-molde inicial, “E” é a eficiência de amplificação da reação e
“n” é o número de ciclos. Considerando que a eficiência da reação seja de
100% (log E=1) e que “n” seja um ponto escolhido da amplificação idêntico, a
todas as amostras, poderemos obter o número de fitas-molde presentes no
início da reação, com a equação: N0=Nfx2-Ct.
A análise da expressão gênica por meio de PCR em tempo real
usado na presente proposta, representa uma quantificação relativa dos genes
de interesse, uma vez que requer um controle endógeno, ou seja, um gene
cuja expressão não apresente variação estatisticamente significativa entre as
amostras analisadas.
A quantificação relativa por PCR em tempo real para uma
determinada amostra é dada pela relação do Ct do gene de interesse (i) e o Ct
do controle endógeno (e). Assim temos:
Nfi=Noi x 2-Cti (gene de interesse)
Nfe=Noe x 2-Cte (gene endógeno)
Sendo que Nfi/Nfe é a quantidade normalizada de moléculas do gene
de interesse em relação ao número de moléculas do controle endógeno que
51
iremos chamar de X e Nfe e Nfi uma constante que nomeamos por K, a
equação fica:
X=K.2-Ct
A quantificação relativa da expressão gênica é usada para descrever
mudanças na expressão de um gene de interesse em um grupo de amostras
em relação a um grupo de referência. Neste trabalho utilizamos uma amostra
de células HB4a. Assim o valor de X é medido em duas diferentes condições,
logo dividimos a condição A pela condição B e obtemos 2-Ct , como mostra
a equação a seguir:
=2-Ct
=
Xa
Kx2-Cta
Xb
Kx2-Cta
Análise Histopatológica – Interpretações em Microscopia Óptica
e Imunohistoquímica:
Tecido Pancreático:
As lâminas coradas pelo método de hematoxilina-eosina serão para
análise morfométrica do pâncreas, com a mensuração da área das ilhotas de
Langerhans e a contagem total de células das ilhotas. Com a dupla marcação
pela imunohistoquímica será realizada a contagem das células produtoras de
insulina e daquelas em proliferação.
As imagens dos cortes histológicos do pâncreas serão digitalizadas e
analisadas com o software Image J. Serão realizadas medidas do tamanho de
tecido pancreático total analisado em cada rato, que corresponde a todos os
campos captados em aumento de 400 vezes no maior diâmetro de corte de
tecido obtido; posteriormente, serão separadas as ilhotas captadas destes
campos para que sejam efetuadas sua contagem e medição de sua área. Será
estabelecida uma relação entre a área total de ilhotas e a área total de tecido
52
pancreático medida. Calcular-se-á a medida média da área das ilhotas e o
número médio de ilhotas. Em cada ilhota de Langerhans, será feita a seguinte
contagem: células marcadas para insulina; células não-marcadas; células em
proliferação;
e
células
em
proliferação
marcadas
para
insulina,
concomitantemente. Estabelecer-se-á o valor relativo entre células marcadas,
não marcadas, em proliferação e as células marcadas e que proliferam.
Tecido Intestinal:
Através da coloração com hematoxilina-eosina, será feita análise
microscópica global das células da mucosa intestinal, quanto às diferenças de
forma, estrutura, tamanho e número. Serão realizadas contagem do número de
vilosidade e criptas, e medida de altura de 10 vilosidades e de 10 criptas de
cada segmento intestinal, estabelecendo-se uma proporção entre si. A
espessura total da parede também será mensurada.
A identificação das células êntero-endócrinas relacionadas ao
hormônio GLP-1 (células L) será feita pela imunihistoquímica, avaliando-as em
relação à sua estrutura, forma, tamanho e número. Proceder-se-á à contagem
e avaliação das características gerais das células L. Posteriormente, será
determinada sua densidade, pela relação entre o número de células L e área
de tecido mucoso (criptas e vilosidades) estudado. Com a dupla marcação pela
imunohistoquímica será realizada também a contagem das células L em
proliferação.
Análise Estatística
As variáveis serão resumidas por grupo de estudo pelas estatísticas
descritivas pertinentes: freqüência absoluta (n) e relativa (%) ou média, desvio
padrão (d.p.), mediana e valores mínimo e máximo. Os dados serão analisados
por testes paramétricos ou não paramétricos dependo da distribuição
encontrada.
Na presença de distribuição normal dos dados, será aplicada a
técnica de análise de variância com dois fatores fixos: grupos (com 4 níveis:
GT, GS, GC1 e GC2) , avaliação com 3 níveis Semana 12 (S12), Semana 20
53
(S20) e Semana 28 (S28). Para as variáveis avaliadas semanalmente, a
avaliação terá 16 níveis de acordo com a semana (Semana 1(S12); Semana
2(S13), ..., Semana 28(S16)). Caso contrário será aplicado o Teste de MannWhitney para comparar as técnicas dentro de cada avaliação e o Teste de
Friedman para amostras relacionadas para comparar as avaliações dentro de
cada técnica. A presença de associação entre variáveis qualitativas será
avaliada pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. O nível de
significância a ser adotado será de 0,05 ( = 5%) e níveis descritivos (p)
inferiores a esse valor serão considerados significantes.
54
6. CRONOGRAMA
Tempo
06/10-02/11
03/11-06/11
XXXXXX
07/11-10/11
11/11-02/12
XXXXXX
03/12-06/12
XXXXXX
Pesquisa
Bibliográfica
XXXXXX
Elaboração de
Projeto
XXXXXX
Pré-Teste
(Piloto)
XXXXXX
XXXXXX
Coleta de
Dados
XXXXXX
XXXXXX
Tabulação de
Dados
XXXXXX
XXXXXX
Análise dos
Dados
XXXXXX
XXXXXX
Relatório de
Pesquisa
XXXXXX
Conclusão da
Pesquisa
55
7. ORÇAMENTO
QUADRO GERAL DO ORÇAMENTO
Aquisição e Manutenção dos Animais
R$ 24.000,00
Dosagens Bioquímicas
R$ 64.955,00
Anatomia Patológica
R$ 31.481,00
Procedimentos e Materiais Cirúrgicos
R$ 6.736,00
Custos Diversos
R$ 4.500,00
...............................................................................................................................
Material de Consumo
R$ 127.172,00
Serviços de Terceiros
R$ 4.500,00
Total
R$ 131.642,00
DETALHAMENTO DO ORÇAMENTO
Aquisição e Manutenção dos Animais
Animais
R$ 5,00
Wistar 2-BAW
40
R$ 200,00
Albergue
R$ 100,00
Sala / Mês
04
R$ 400,00
Dieta Experimental
R$ 100,00
Kg
200 Kg
R$ 20.000,00
Dieta Padrão
R$ 85,00
Kg
40 Kg
R$ 3.400,00
Subtotal
R$ 24.000,00
Dosagens Bioquímicas
Glucagon-Like Peptide - 1
R$ 6.370,00
Kit para 70 testes
03
R$ 19.110,00
Insulina Sérica
R$ 5.150,00
Kit para 70 testes
03
R$ 15.450,00
Peptídeo C
R$ 6.300,00
Kit para 70 testes
03
R$ 18.900,00
Hemoglobina Glicada
R$ 2.000,00
Kit para 40 testes
05
R$ 10.000,00
Glicose Sérica
R$ 55,00
Kit para 30 testes
05
R$ 275,00
Glicosímetro
R$ 100,00
Aparelho
01
R$ 100,00
Fitas para Glicemia
R$ 80,00
Caixa com 50 uni
14
R$ 1.120,00
Subtotal
R$ 64.955,00
56
Anatomia Patológica
Material Histologia
R$ 1.500,00
Lâmina Processada
R$ 50,00
R$ 1.500,00
8 lâminas / animal
320
R$ 16.000,00
R$ 1.750,00
02
R$ 3.500,00
R$ 1.750,00
02
R$ 3.500,00
R$ 2.290,50
02
R$ 4.581,00
R$ 1.200,00
02
R$ 2.400,00
Subtotal
R$ 31.481,00
Monoclonal Mouse Anti-Rat
Ki67 antigen Clone MIB-5
Código do produto: M7248-1
Marca: Dako
Fornecedor: Biogen Comercial
e Distribuidora Ltda
Anticorpo monoclonal de cam
anti GLP-1 reage com Hu, Rat
e Mouse
Cód. Produto: AB26278
Marca: ABCAM
Fornecedor: Biogen Comercial
e Distribuidora Ltda
EnVision" G|2 Doublestain
System,
Rb/Mo (DAB+/Permanent Red)
Código do produto: K5361-1
Marca: Dako
Fornecedor: Biogen Comercial
e Distribuidora Ltda
Anticorpo Policlonal H-86:SC9168 da marcação de células
produtoras de insulina, do tipo
policlonal de coelho, Código H86: SC-9168, da empresa
Santa Cruz Biotechnology.
Procedimentos e Materiais Cirúrgicos
Anestésico Zoletil
R$ 60,00
12
R$ 720,00
Anestésico Fentanil
R$ 10,00
20
R$ 200,00
Analgésico Dipirona
R$ 2,00
05
R$ 10,00
Instrumental Cirúrgico
R$ 750,00
Pinças Diversas
Macro e Micro
R$ 750,00
Fio cirúrgico - Vicryl 4-0
R$ 352,00
Caixa com 36 uni
02
R$ 704,00
Fio cirúrgico - Prolene 7-0
R$ 784,00
Caixa com 24 uni
03
R$ 2.352,00
Material de Consumo
R$ 50,00
por procedimento
40
R$ 2.000,00
Subtotal
R$ 6.736,00
57
Custos Diversos
Análise estatística
Gráfica
Apoio técnico
R$ 1.500,00
Assessoria
Especializada
R$ 1.500,00
R$ 100,00
por tese
10
R$ 1.000,00
R$ 2.000,00
Assessoria
Especializada
R$ 2.000,00
Subtotal
R$ 4.500,00
TOTAL GERAL DE CUSTOS = R$ 131.642,00
58
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