Projeto - Cirurgiaonline
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA UNIFESP – EPM PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TRANSLACIONAL Coordenador: Prof. Dr. José Alberto Neder Serafini Projeto de Pesquisa – Doutorado Lucas Pedroso Fernandes Ferreira Leal Repercussões orgânicas da transposição ileal em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta. Orientador: Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo Co-Orientadores: Profa. Dra. Valderez Bastos Valero Lapchick Profa. Dra. Gui Mi Ko Profa. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva Prof. Dr. Sérgio Atala Dib Prof. Dr. Antônio Ricardo de Toledo Gagliardi SÃO PAULO 2011 2 RESUMO INTRODUÇÃO: O tratamento clínico do diabetes mellitus tipo 2 – é sabidamente complexo e permanente, tendo a doença caráter progressivo. Atualmente busca-se procedimento cirúrgico que seja eficaz em sua resolução, inclusive em indivíduos não-obesos. A transposição ileal isolada teoricamente pode constituir-se numa alternativa terapêutica efetiva. Essa intervenção não foi até o momento realizada em humanos, e também não há relatos da sua utilização em modelo experimental de dismetabolismo glicídico induzido por dieta. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo é avaliar os efeitos orgânicos da transposição ileal em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta, considerando suas repercussões no metabolismo da glicose. MÉTODOS: Utilizar-se-ão 40 ratos machos (Rattus norvegicus albinus), Wistar - 2BAW Heterogêneos, com 12 semanas de vida, distribuídos em quatro grupos de 10 animais cada: Grupo Transposição Ileal (GT) com os animais sob dieta hipercalórica-hiperlipídica; Grupo Sham (GS), submetidos à operação simulada e utilizando a mesma dieta; Grupo Controle 1 (GC1), não submetidos a nenhuma intervenção cirúrgica e consumindo a dieta hipercalórica-hiperlipídica; e Grupo Controle 2 (GC2) - não submetidos a nenhuma intervenção cirúrgica e consumindo ração padrão. As intervenções cirúrgicas serão realizadas na 20ª semana de vida. Coletas sangüíneas para os testes laboratoriais serão realizadas na 12ª semana de vida dos animais, no dia da operação e na 08ª semana de pós-operatório, após pesagem e sob anestesia prévia. Serão feitas em todos os animais as determinações séricas de glicose e insulina, assim como de glucagon-like peptide-1, peptídeo C e hemoglobina glicada. Também serão realizados o teste de tolerância à insulina, com a utilização do software PRISMA, e o cálculo da resistência insulínica, pelo teste indireto HOMA-IR. Estudo biomolecular da expressão relativa de 252 genes de interesse será feito com PCR em tempo real. Nos dias determinados, com 20 semanas de vida, dois ratos serão separados e aleatoriamente distribuídos no GT e no GS. Todos serão acompanhados até a 08ª semana de pós-operatório, quando serão sacrificados e então coletados os depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal para pesagem em balança de precisão, e o pâncreas e segmentos de intestino para estudo anátomo-patológico e imunohistoquímico. 3 RESUMO EXPANDIDO INTRODUÇÃO: O tratamento clínico da síndrome metabólica principalmente o dismetabolismo glicídico traduzido por resistência insulínica e diabetes mellitus tipo 2 - é sabidamente complexo e permanente, tendo a doença caráter progressivo. A resistência insulínica e o diabetes mellitus são condições que estão correlacionadas mais comumente à obesidade. Entretanto, ambos não acometem somente a população obesa, uma vez que há uma incidência cada vez maior de DM2 entre indivíduos com índice de massa corporal (IMC) na faixa da eutrofia e do sobrepeso. Sabe-se que a resistência insulínica é que primordialmente causa a doença cardiovascular nesses indivíduos. Atualmente busca-se procedimento cirúrgico que seja eficaz no tratamento da síndrome metabólica, principalmente em relação à diabetes mellitus tipo 2, inclusive em indivíduos não-obesos. Em pacientes obesos mórbidos, é consensual que a intervenção cirúrgica dita padrão-ouro para o tratamento da obesidade mórbida é a gastroplastia vertical com anel de contenção e derivação gastrojejunal em Y-de-Roux (operação de Fobi-Capella, modificada) por atingir os objetivos de perda de peso e controle de comorbidades, mantidos em longo prazo. Por outro lado, em pacientes com dismetabolismo glicídico mas sem obesidade mórbida (com obesidade leve ou apenas sobrepeso), a tecnicamente mais simples e facilmente reversível transposição ileal isolada teoricamente pode constituir-se numa alternativa terapêutica efetiva. Essa intervenção não foi até o momento realizada de forma isolada em humanos - a experiência relatada na Literatura diz respeito a associação com a gastrectomia vertical -, e também não há relatos da sua utilização em modelo experimental de síndrome diabetes mellitus induzida por dieta. OBJETIVOS: O objetivo geral deste estudo é o de avaliar os efeitos orgânicos da transposição ileal no diabetes mellitus tipo 2. Os objetivos específicos são, em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta: (1) investigar as alterações morfológicas e funcionais ocorridas nas células L intestinais num segmento de íleo distal interposto ao jejuno proximal; (2) estudar as modificações estruturais no intestino delgado de animal submetido à transposição de um segmento de íleo distal para uma situação proximal no tubo digestório; (3) avaliar o pâncreas endócrino após a transposição ileal; (4) 4 verificar as alterações do metabolismo glicídico e lipídico após a transposição ileal; e (5) analisar os níveis de expressão relativa dos genes específicos de interesse. MÉTODOS: Utilizar-se-ão 40 ratos machos (Rattus norvegicus albinus), Wistar - 2BAW Heterogêneos, com 12 semanas de vida, distribuídos em quatro grupos de 10 animais cada: Grupo Transposição Ileal (GT) com os animais sob dieta hipercalórica-hiperlipídica; Grupo Sham (GS), submetidos à operação simulada e utilizando a mesma dieta; Grupo Controle 1 (GC1), não submetidos a nenhuma intervenção cirúrgica e consumindo a dieta hipercalórica-hiperlipídica; e Grupo Controle 2 (GC2) - não submetidos a nenhuma intervenção cirúrgica e consumindo ração padrão. As intervenções cirúrgicas serão realizadas na 20ª semana de vida. Coletas sangüíneas para os testes laboratoriais serão realizadas na 12ª semana de vida dos animais, no dia da operação e na 08ª semana de pós-operatório, após pesagem e sob anestesia prévia. Serão feitas em todos os animais as determinações séricas de glicose, insulina, triglicérides, colesterol total e frações, assim como de glucagon-like peptide-1, peptídeo C e hemoglobina glicada. Será realizado o teste de tolerância à insulina, com a utilização do software PRISMA, e o cálculo da resistência insulínica, pelo teste indireto HOMA-IR. Determinar-se-ão os níveis de expressão relativa de 252 genes referentes a apoptose de células beta pancreáticas, desenvolvimento de diabetes mellitus e diferenciação de células-tronco mediante estudo biomolecular específico com PCR em tempo real. Nos dias determinados, com 20 semanas de vida, dois ratos serão aleatoriamente distribuídos no GT e no GS. Todos serão acompanhados até a 08ª semana de pós-operatório, quando serão sacrificados e então coletados os depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal para pesagem em balança de precisão, e o pâncreas, o fígado e segmentos de intestino para estudo anatomopatológico e imunohistoquímico. 5 ABSTRACT INTRODUCTION: The clinical treatment of metabolic syndrome, principally that of glucose dysmetabolism (which is characterized by insulin resistance and type 2 diabetes mellitus), is known to be complex and lifelong, which is due to the progressive nature of the disease. Insulin resistance and diabetes mellitus are more commonly associated with obesity. However, the two conditions are not exclusive to the obese population, as evidenced by an increasingly higher incidence of type 2 diabetes mellitus among normal weight and overweight individuals. Insulin resistance is known to be the primary cause of cardiovascular disease in these individuals. There is currently a search for a surgical procedure that can effectively treat individuals (including non-obese individuals) with metabolic syndrome (principally type 2 diabetes mellitus). The gold standard for the treatment of morbid obesity is vertical banded gastric bypass, since this procedure achieves long-term weight loss and comorbidity control. However, in patients with glucose dysmetabolism without morbid obesity (i.e., mildly obese or overweight), ileal transposition-a technically simpler and more easily reversible procedure-can theoretically be an effective therapeutic alternative. There are reports in the literature regarding the use of ileal transposition in combination with sleeve gastrectomy. However, to date, ileal transposition has not been performed in isolation in humans. There are no reports of the use of ileal transposition in experimental models of diet-induced metabolic syndrome. OBJECTIVES: The overall objective of the present study is to evaluate the clinical effects of ileal transposition on metabolic syndrome. The specific objectives of the study, which will investigate rats with diet-induced obesity, are as follows: 1) to study the morphological and functional changes in L cells in a segment of the distal ileum that will be interposed with the proximal jejunum; 2) to study the structural changes in the small intestines of animals submitted to transposition of a segment of the distal ileum to a proximal position in the digestive tract; 3) to evaluate the endocrine pancreas after ileal transposition; and 4) to analyze changes in glucose and lipid metabolism after ileal transposition. METHODS: Forty 12-week-old male Wistar rats (Rattus norvegicus albinus) of the WAB strain (heterogeneous) will be used. The rats will be divided into four groups of 10 animals: ileal transposition group, 6 comprising animals on a high-calorie, high-fat diet; sham group, comprising sham-operated animals on a high-calorie, high-fat diet; control group 1, comprising animals that will be fed a high-calorie, high-fat diet and will not be submitted to surgical intervention; and control group 2, comprising animals that will be fed standard chow and will not be submitted to surgical intervention. The surgical procedures will be performed when animals are 20 weeks of age. The animals will be weighed, and blood samples will be collected under anesthesia when animals are aged 12 weeks, 20 weeks, and 28 weeks (postoperative week 8). In all animals, serum levels of glucose, insulin, triglycerides, total cholesterol, low-density lipoprotein, high-density lipoprotein, glucagon-like peptide-1, C-peptide, and glycosylated hemoglobin will be determined. The insulin tolerance test will be performed using the PRISMA software, and insulin resistance will be calculated using the homeostasis model assessment of insulin resistance. When rats are aged 20 weeks, two animals will be randomly distributed into the ileal transposition group and the sham group. All animals will be monitored for 8 postoperative weeks, after which they will be sacrificed. Epididymal and retroperitoneal fat pads will be collected and weighed on a precision balance, and the pancreas, the liver, and intestinal segments will be analyzed (anatomic pathology and immunohistochemistry). 7 1. INTRODUÇÃO Nas últimas décadas a população mundial vem experimentando um significativo aumento na prevalência da obesidade1. Na transição do milênio, aproximadamente dois terços dos adultos dos países desenvolvidos eram obesos, e quase 5% deles eram portadores de obesidade mórbida.2 Esse cenário é deletério, uma vez que a obesidade mórbida predispõe os pacientes a comorbidades que afetam quase todos os sistemas orgânicos.3 Quando a obesidade está associada à resistência insulínica (RI), hipertensão arterial sistêmica (HAS), dislipidemia e diabetes mellitus do tipo 2 (DM2), constitui-se a Síndrome Metabólica (SM), a qual representa importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares.4 Em 1998, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu que a SM é caracterizada pela associação de RI ou DM2 a dois ou mais dos seguintes critérios: (1) pressão arterial (PA) maior ou igual a 160/90 mmHg; (2) hiperlipemia, definida com níveis de triglicerídeos acima de 150 mg/dL e/ou HDL-colesterol abaixo de 35 mg/dL em homens e abaixo de 39 mg/dL em mulheres; (3) obesidade central com relação cintura/quadril maior que 0,9 em homens e maior que 0,85 em mulheres e/ou IMC maior que 30 kg/m2 e (4) microalbuminúria de pelo menos 20mg/min ou relação albumina/creatinina maior que 20mg/g4. Ademais, esses indivíduos frequentemente apresentam doença cardiovascular, síndrome de hipoventilação, asma, apneia do sono, acidente vascular cerebral, pseudotumor cerebral, artropatias, diversos tipos de câncer, incontinência urinária, colecistopatias, doença do refluxo gastroesofágico e depressão.4-6 A obesidade encurta a expectativa de vida.7 Essa redução no obeso mórbido é de aproximadamente 12 anos, quando comparado a um indivíduo de peso normal. Isso ocorre de forma diretamente proporcional ao aumento do índice de massa corporal8 (IMC). Em um futuro próximo, a obesidade mórbida deverá ultrapassar o hábito de fumar na liderança das causas de morte em países desenvolvidos.9 Atualmente, só nos Estados Unidos há mais de nove milhões de obesos mórbidos que necessitam de ajuda.2 Contudo, o tratamento conservador da obesidade mórbida, com dieta, exercícios físicos, modificação de hábitos de vida e uso de medicações, apenas muito raramente consegue determinar perda de peso em níveis adequados e de forma duradoura.10 De 8 fato, quatro estudos a longo prazo sobre tratamento conservador da obesidade11-14 mostraram uma média de perda de peso de apenas 4%. Recente estudo prospectivo e controlado demonstrou que o tratamento conservador ao longo de dez anos resultou em aumento do peso corporal da ordem de 1,6%, comparado com 13,2% de perda de peso com a banda gástrica ajustável e 35% com a gastroplastia redutora e derivação gastrojejunal.15 Desde o advento da cirurgia minimamente invasiva tem havido um incremento considerável nos procedimentos gastrointestinais que determinam perda de peso significativa e duradoura, com taxas de complicações muito baixas.16-18 Ao contrário da abordagem conservadora19, a cirurgia bariátrica condiciona melhora ou resolução das doenças associadas à obesidade em 70% a 100% dos pacientes.18 Pode-se observar, ainda, que as taxas de mortalidade em pacientes obesos mórbidos são diminuídas de forma importante após operação bariátrica, quando comparadas com as oriundas de grupos de pacientes obesos tratados clinicamente.20,21 Nessa ordem de ideias, torna-se óbvio que a cirurgia bariátrica é, na atualidade, o tratamento mais efetivo para a obesidade mórbida, promovendo emagrecimento significativo e sustentado, melhorando ou resolvendo definitivamente as comorbidades associadas e prolongando a expectativa de vida dos pacientes acometidos.22 É consensual23 que a intervenção cirúrgica dita padrão-ouro para o tratamento da obesidade mórbida é a gastroplastia vertical com anel de contenção e derivação gastrojejunal em Y-de-Roux (operação de Fobi24Capella,25, modificada) por atingir os objetivos de perda de peso e controle de comorbidades, mantidos em longo prazo.16 O emagrecimento é usualmente atribuído a uma combinação da diminuição acentuada do volume do reservatório gástrico aliada à má-absorção intestinal. Por sua vez, o controle das comorbidades após a derivação gastroduodenal em Y-de-Roux – principalmente aquelas decorrentes dos distúrbios do metabolismo da glicose – é geralmente atribuído à própria diminuição da massa corporal. Não obstante, foi demonstrado efeito endócrino potencialmente controlador da glicemia e promotor de saciedade precoce após operação de Fobi-Capella, antes mesmo de qualquer perda de peso importante.26 9 Adicionalmente, observou-se que estavam aumentadas no sangue periférico – após derivação gastroduodenal – substâncias secretadas pelo intestino diretamente na corrente sanguínea, tais como glucagon-like peptide 1 (GLP-1) e peptide YY (PYY), providas da capacidade de estimular a produção de insulina pelas células beta do pâncreas, de facilitar a ação desse hormônio no transporte da glicose para o interior das células e de agir no hipotálamo, induzindo sensação de saciedade alimentar.27 Ademais, operação de FobiCapella reduz drasticamente os níveis do hormônio orexígeno grelina, o que contribui decisivamente para o efeito de redução de peso corporal inerente a esse procedimento operatório.28 A grelina diminui porque as zonas gástricas produtoras desse hormônio (fundo gástrico e grande curvatura) não recebem o estímulo alimentar porquanto são excluídas do trânsito digestivo.28 O GLP-1 e o PYY aumentam porque a derivação gastrojejunal em Y-de-Roux propicia o estímulo das células L, produtoras desses hormônios, por alimentos que chegam rapidamente e mal digeridos às porções mais distais do intestino delgado.29 Destarte, a gastroplastia vertical redutora com anel e derivação gastrojejunal em Y-de-Roux (operação de Fobi-Capella) constitui-se numa intervenção eminentemente metabólica. Outrossim, tem sido preconizada a construção de outras configurações cirúrgicas do tubo digestório visando provocar resposta metabólica adequada frente ao desafio de tratar mediante cirurgia a doença da obesidade. Dessa forma, diversas técnicas operatórias estão sendo avaliadas no presente momento. Pesquisas estão voltadas também para a correção mediante cirurgia - das comorbidades que o excesso de tecido adiposo no organismo pode acarretar. O tema é relevante porque a obesidade é uma condição de crescentes incidência e prevalência30, de distribuição universal31, sem discriminação de faixas etárias e etnias, a qual acarreta consequências graves na saúde de seus portadores devido à sua associação com numerosas comorbidades32 e que implica importantes repercussões financeiras na economia mundial.33 Constata-se, ainda, que a obesidade também é uma questão candente junto às crianças e aos adolescentes. A crescente pandemia de 10 obesidade cada vez mais os tem afetado, e pode tomar até 20 anos de suas vidas.34 A resistência insulínica e o diabetes mellitus são condições que estão correlacionadas mais comumente à obesidade. Entretanto, ambos não acometem somente a população obesa, uma vez que há uma incidência cada vez maior de DM2 entre indivíduos com índice de massa corporal (IMC) na faixa da eutrofia e do sobrepeso.35,36 Sabe-se que a resistência insulínica é que primordialmente causa a doença cardiovascular nesses indivíduos.37 A etiologia da resistência insulínica na obesidade pode decorrer de fatores genéticos. Postula-se que a Seleção Natural teria elegido como sobreviventes os indivíduos portadores do gene “econômico” de energia, já que essas pessoas são dotadas de uma maior habilidade em estocar calorias no tecido gorduroso, daí advindo nítida vantagem de sobrevivência durante os períodos de escassez alimentar, principalmente em nosso ambiente ancestral.38-41 Não obstante, apesar de indivíduos modernos serem dotados de programação genética adequada à sobrevivência sob eventual restrição calórica, alguns possuem mais desses genes econômicos poupadores de energia que outros, destarte apresentando maior probabilidade de desenvolver obesidade quando expostos ao regime de alimentação com teor calórico elevado. A superalimentação, aliada ao sedentarismo que a vida moderna impõe, condiciona os predispostos geneticamente a acumular gordura em depósitos centrais no corpo. Tal gordura, dita visceral, está diretamente relacionada com o desenvolvimento de resistência insulínica e, eventualmente, diabetes mellitus.42 A qualidade da dieta também tem importante influência no desenvolvimento da resistência insulínica43. Sob esses fatores, ocorrem alterações nos receptores da insulina ou nas suas vias de sinalização, há aumento da produção de citocinas produzidas pelo tecido adiposo e modificações na produção dos enterohormônios do trato gastrointestinal relacionados à dicotomia fome/saciedade e ao metabolismo de carboidratos.4446 Também têm sido propostos como causas primárias de resistência insulínica a disfunção mitocondrial47,48 e o acúmulo intracelular de gordura.49 11 Contudo, longe de ser apenas setor de armazenamento, o tecido adiposo é também considerado atualmente um órgão endócrino, o qual secreta moléculas protetoras contra a ocorrência de diabetes mellitus tipo 2, como a adiponectina.50 Adipócitos produzem, ainda, fatores que desencadeiam fenômenos inflamatórios responsáveis por grande número de doenças associadas à obesidade e à própria resistência insulínica.51-54 No âmbito dessa gama multifacetada e intensamente imbricada de fatores que intervêm na gênese da obesidade e de suas doenças associadas – principalmente na mais importante delas, a que diz respeito aos distúrbios do metabolismo da glicose – sobressaem-se os hormônios produzidos pelo tubo digestório e, mais especificamente, o produzido pelas células L, localizadas no intestino delgado e grosso, e mais densamente concentradas no íleo terminal, isto é, o glucagon-like peptide-1 (GLP-1).55 O GLP-1 é secretado pelas células neuroendócrinas L intestinais em resposta ao estímulo direto gerado por nutrientes dotados de efeito incretínico.56 As incretinas são hormônios secretados no trato gastrointestinal para a circulação sanguínea em resposta à ingestão de certos nutrientes, com o resultante aumento na produção de insulina e, com isso, da captação de glicose. O GLP-1 exerce algumas funções bem definidas, como o estímulo de secreção glicose-dependente da insulina; o aumento da transcrição do gene da insulina, com incremento da biossíntese desse hormônio; a indução da neogênese e da proliferação das células beta das ilhotas de Langerhans; a inibição da apoptose das células beta; o aumento da expressão fenotípica de células betas diferenciadas; o estímulo da produção de somatostatina e a redução da produção de glucagon.57,58 O diabetes mellitus tipo 2 é um problema epidêmico que afeta mais de 150 milhões de pessoas em todo o mundo. Este número deve dobrar nas primeiras décadas do terceiro milênio.59 A abordagem terapêutica do DM2 e da resistência insulínica inclui uma ampla variedade de opções, como o tratamento clínico multidisciplinar com o objetivo de perda ponderal, opções farmacológicas e técnicas operatórias bariátricas e metabólicas. É bem sabido que essas intervenções cirúrgicas podem controlar a DM2, mesmo em longo prazo.60 Curioso é constatar que também no diabetes mellitus tipo 1 as 12 intervenções bariátricas têm se mostrado eficazes na melhora do controle terapêutico da glicemia61. Em contrapartida, a manutenção do controle glicêmico nos pacientes obesos diabéticos por medidas conservadoras é um desafio. As dietas que impõem grande restrição calórica e os programas clínicos multidisciplinares para perda ponderal raramente têm demonstrado benefícios em médio e em longo prazos. Somam-se a isso os efeitos colaterais e as limitações dos fármacos antidiabéticos e da eficácia em longo prazo da insulinoterapia no DM2.62,63 Nessa ordem de ideias, a cirurgia bariátrica e metabólica apresentase como uma alternativa válida para o tratamento da obesidade e de suas comorbidades, inclusive o diabetes tipo 2.64,65 Com a evolução dos estudos de motilidade do tubo digestório e a descrição de neurohormônios – neurogastroenterologia –, houve um melhor entendimento de aspectos da fisiologia gastrointestinal e, assim, as modalidades de intervenções cirúrgicas bariátricas foram evoluindo até o conceito atual de procedimentos mistos que contemplam, ao lado dos aspectos de restrição e disabsorção, também e principalmente os fatores neurohormonais e metabólicos desses procedimentos, sendo que os termos cirurgia baroendócrina e cirurgia metabólica são cada vez mais utilizados, em especial para o tratamento do diabetes mellitus tipo 2.66,67 As modalidades de cirurgias bariátricas ditas mistas representam, na atualidade, o tratamento com maior eficácia para pacientes com obesidade mórbida, com maior segurança e perda ponderal sustentada em longo prazo, além de melhora significativa das comorbidades associadas.68 Há uma série de estudos revelando que, após a realização de um bypass gástrico em Y-deRoux, ocorre uma maior liberação de GLP-1 e um maior controle glicêmico, antes mesmo que advenha uma perda significativa de peso. Isto demonstra que o controle do diabetes mellitus pode estar relacionado a efeitos hormonais secundários à técnica operatória realizada.69,70 Apesar de proporcionarem maiores perdas ponderais, as quais se sustentam por períodos mais prolongados, as técnicas mistas, como a operação de Fobi-Capella apresentam desvantagens, notadamente em longo prazo, como 13 síndrome de dumping71, hérnias internas72, estenose de anastomoses73, fístulas gastrogástricas e enteroentéricas74,75, úlceras pépticas76, diarreia, hipoproteinemia, hipocalcemia e dificuldade do acesso endoscópico às áreas excluídas do tubo digestório77-79. Buscando-se evitar as intercorrências próprias da operação de FobiCapella surgiu a gastrectomia vertical, realizada de forma isolada – previamente parte primeira de operação mista mais complexa denominada “duodenal switch”80 –, com remoção da curvatura maior e do fundo gástricos, e consequente redução da produção de grelina81-82. Trata-se de procedimento bariátrico emergente83,84, restritivo, causador de saciedade, podendo ser utilizado como etapa inicial de operação em dois tempos para doentes de alto risco cirúrgico85-87, ou como operação isolada e definitiva88. A gastrectomia vertical isolada vem demonstrando bons resultados de perda ponderal89, controle glicêmico90 e saciedade precoce, mesmo na avaliação em longo prazo91. O controle glicêmico obtido em seu pós-operatório pode ser devido à chegada de alimentos não totalmente digeridos ao íleo distal, em função da velocidade de esvaziamento gástrico aumentada após essa operação, com consequente incremento da secreção de GLP1 pelas células L92,93. Recentes estudos demonstram que a gastrectomia vertical como procedimento bariátrico isolado e definitivo é tão eficaz quanto a operação de Fobi-Capella no controle das comorbidades, além de ser potencialmente capaz de evitar algumas das suas complicações.94-97 Apesar de ser uma modalidade cirúrgica mais simples, pesquisas realizadas em seres humanos submetidos a gastrectomia vertical isolada demonstram a existência de limitações98 e complicações.99,100 Estudos continuam sendo realizados com vistas ao desenvolvimento de terapêuticas cirúrgicas mais simples e efetivas para as doenças metabólicas associadas ao sobrepeso e à obesidade, principalmente o DM2. Nesse cenário, postula-se que pode haver fatores anti-incretínicos secretados no intestino delgado proximal, os quais deixariam de ser produzidos se esse segmento fosse excluído do trânsito alimentar. A ausência das supostas “anti-incretinas” 14 na circulação potencializaria a ação das incretinas e destarte melhoraria o DM2.101-105 Diversos autores afirmam ter demonstrado que a derivação do trânsito digestório de modo a excluir um curto segmento de intestino delgado proximal produz uma melhora do diabetes mellitus tipo 2 de per si, independentemente dos efeitos de restrição da ingesta alimentar, da perda de peso corporal, de eventual má absorção dos alimentos ou da chegada de alimentos pouco digeridos ao intestino delgado distal. Baseados nos resultados de seus trabalhos, preconizam a intervenção cirúrgica com exclusão duodenal como uma alternativa válida para o tratamento do diabetes mellitus tipo 2. Ademais, alegam que deve haver substâncias ou fatores outros secretados pelo intestino proximal e ainda não descobertos que possam contribuir na etiopatogenia do diabetes mellitus tipo 2.101-105 Mais recentemente foram publicados resultados promissores em humanos de técnicas que associam a gastrectomia vertical à interposição de segmento de íleo distal no trajeto do jejuno proximal. Esse tipo de procedimento operatório pode induzir saciedade precoce associada a benefícios no metabolismo glicídico e causar perda ponderal, em curto e em médio prazos. Em pacientes diabéticos não-obesos essa técnica operatória demonstrou eficácia no controle do diabetes mellitus tipo 2106-111. É interessante observar que nas intervenções cirúrgicas antidiabéticas propostas por essa equipe106-111, um dos tempos operatórios constantes em todas as suas versões, é a gastrectomia vertical. Note-se que a gastrectomia vertical é um procedimento restritivo (pela acentuada redução da capacidade reservatória gástrica) e metabólico (pela diminuição dos níveis circulantes do hormônio orexígeno grelina, produzido pelo fundo e grande curvatura gástricos82,91), o qual visa, primordialmente, a perda de peso. Nesse cenário, surge a questão: qual a finalidade da realização dessa etapa operatória – a gastrectomia vertical – em pacientes que não necessitam da perda ponderal? Pode-se inferir, portanto, que os benefícios metabólicos obtidos mediante esses procedimentos devem-se quase que exclusivamente à interposição ileal. Note-se que o aumento da velocidade do trânsito intestinal que a gastrectomia vertical determina92,93 pode contribuir para a chegada mais 15 rápida de alimentos ainda não digeridos na região onde o segmento ileal foi interposto e assim contribuir para a produção de GLP-1 pelas células L ileais. Não obstante, a interposição ileal isolada já se mostrou eficaz na correção do dismetabolismo experimentação em diversas pesquisas envolvendo animais de 112,113 . Ressalte-se que a avaliação de modalidade operatória, no âmbito da cirurgia bariátrica e metabólica, envolvendo apenas a transposição ileal não foi ainda realizada em humanos. Entretanto, foi demonstrado, em animais de experimentação, que a interposição de um segmento de íleo distal no jejuno proximal acarreta maiores liberação e síntese de GLP-1114. Isso pode ser atribuído a um maior estímulo sobre as células L localizadas no segmento do íleo interposto, provocado por uma quantidade maior de nutrientes parcialmente digeridos que, quando atinge mais precocemente essa porção distal do intestino delgado, ocasiona a liberação de GLP-1 que, por sua vez, estimula uma maior produção de insulina, com efeitos diretos no metabolismo glicídico115. O GLP-1 se eleva no plasma em resposta ao estímulo alimentar e tem efeito sacietógeno no sistema nervoso central116, diminui a absorção de gorduras pelo trato gastrointestinal117 e diminui as motilidades gástrica118 e intestinal119. Finalmente, o efeito mais notório do GLP-1 é o de promover diminuição da resistência insulínica periférica, redução da apoptose das células βpancreáticas, aumento da diferenciação das células primitivas dos canalículos pancreáticos para células beta adultas e incremento da proliferação destas120,121, o que se conhece como “síndrome do íleo vazio”122-124. O GLP-1 é o hormônio incretínico mais associado aos efeitos antidiabéticos da cirurgia bariátrica. Estimular as células L ileais a clivar o proglucagon e liberar o GLP-1 parece ser o meio mais eficaz de se obter o efeito incretínico nos pacientes diabéticos submetidos à cirurgia bariátrica. Várias são as técnicas que podem alcançar este efeito, todas elas baseadas na hipótese do intestino posterior, conhecida como teoria “hindgut”. Esta tem sua base racional no fato de que o íleo, ao ser colocado em contato com alimentos ainda não totalmente digeridos, corrige os efeitos deletérios da “síndrome do intestino distal vazio” que é ocasionada pela falta de estimulação das células L produtoras de GLP-1. 16 O estímulo do íleo por alimentos pouco digeridos libera hormônios intestinais, cujas ações interferem positivamente no controle da obesidade e em seus distúrbios metabólicos associados, sobretudo na resistência periférica à insulina. A simples interposição de um segmento de íleo nos segmentos mais proximais do intestino delgado é o procedimento cujos resultados mais enfatizam essa hipótese. Estudo da interposição de segmento de íleo terminal em jejuno proximal em animais de experimentação submetidos a um modelo de obesidade induzida por dieta demonstrou aumento significante dos níveis de GLP-1125. Do mesmo modo, estudo clínico cuja técnica operatória coloca um segmento de íleo 50 cm distalmente ao ângulo de Treitz demonstrou esse mesmo estímulo endócrino, com melhora do quadro diabético111, 126. Pesquisas que demonstram a capacidade da estimulação alimentar ileal em liberar GLP-1 e provocar o efeito incretínico são atuais e abundantes na literatura. Entretanto, estudos histológicos que investigam as células L são antigos e anteriores ao conhecimento científico atual. Limitam-se a identificar a localização dessas células e marcá-las como capazes de clivar o proglucagon e liberar seus produtos (GLP-1 e GLP-2)127-129. Hoje em dia, confere-se a essas células um papel mais relevante no tratamento cirúrgico do DM2, uma vez que se busca a possibilidade de se instituirem medidas terapêuticas ao DM2 com base no efeito incretínico. Logo, conhecer a reação das células L quando estimuladas a esse efeito parece ser uma etapa importante nesse conhecimento130. Há um grande número de pesquisas e informações produzidas a partir de observações dos resultados em seres humanos na literatura biomédica. Porém, em comparação com os estudos clínicos, escassos são os trabalhos que envolvem animais de experimentação em cirurgia bariátrica e metabólica. Os animais de experimentação, sobretudos ratos, quando utilizados em modelos de obesidade e síndrome metabólica parecem dar mais credibilidade às conclusões que aquelas obtidas em animais sadios. Com isso, vários modelos experimentais têm sido utilizados102,131-134. O modelo animal de obtenção da obesidade por meio de alterações provocadas na dieta – obesidade induzida por dieta – é o que parece melhor mimetizar a condição da obesidade humana. Na maioria dos casos, embora 17 não haja um padrão bem definido, obtém-se obesidade mórbida aumentando a quantidade relativa de gorduras na dieta135-138. Pesquisas experimentais em animais, embora não possam ter suas conclusões diretamente extrapoladas aos seres humanos, são relevantes ao permitirem eutanásia e análise postmortem do animal, especialmente da histopatologia do tubo digestório operado. Embora se conheça o perfil dos enterohormônios após a cirurgia bariátrica com efeito incretínico em humanos, ainda não foi feita uma correlação direta com a reação das células L intestinais nessas situações. Além do “freio ileal” – expressão utilizada para caracterizar a reação de redução da motilidade do trânsito gastrointestinal proximal relacionada à produção de enterohormônios139-142 secundária à cirurgia de interposição ileal – estudos demonstram os efeitos benéficos dessa técnica operatória na estrutura do pâncreas, em especial em animais de experimentação diabéticos e não obesos113, 115 . Observou-se, também, que em ratos euglicêmicos, a interposição ileal melhorou a tolerância à glicose, sem que, no entanto, a avaliação morfológica do pâncreas destes animais fosse realizada143. O diabetes mellitus tipo 2 é uma doença metabólica heterogênea progressiva, cujos mecanismos fisiopatológicos envolvem dois efeitos principais: resistência insulínica periférica e disfunção gradual de células beta pancreáticas144, 145 , surgindo invariavelmente quando as ilhotas pancreáticas não são mais capazes de manter a hiperinsulinemia em um nível suficiente para sobrepor a resistência tissular periférica. Assim, o tratamento é dirigido, inicialmente, para reduzir o peso do paciente e, em conseqüência, a resistência insulínica, melhorando a tolerância à glicose. Com o decorrer dos anos, o diabetes passa por fases intermediárias, em que ambos os efeitos podem coexistir, indicando-se, então, associar-se às drogas sensibilizadoras da ação insulínica, drogas secretagogas de insulina. À medida que a deficiência se acentua, inevitavelmente, as combinações terapêuticas de agentes orais podem não mais serem eficazes em controlar a hiperglicemia e a administração de insulina se impõe, para otimização do tratamento144, 146-148. 18 É fundamental que se caracterize, em determinado paciente, o seu grau de resistência insulínica, de acordo com a circunstância clínica encontrada, uma vez que disso dependerá a orientação terapêutica. Ocorre que nenhuma das terapêuticas atuais tem um impacto significante na progressão da doença149. Nos indivíduos diabéticos tipo 2, nos quais obesidade e resistência insulínica estão presentes em mais de 80% dos casos, o tratamento deve, inicialmente, se basear em uma mudança substancial do estilo de vida. É dirigido fundamentalmente para a adequação dietética, com dieta hipocalórica, e implementação de atividade física regular150, embora com tendência a desmoronar. No entanto, quando essas medidas comportamentais não são suficientes para atingir ou manter a glicemia nos padrões adequados, com a perda de peso – e isso acontece com a maioria dos pacientes, em virtude, principalmente, da falta de condescendência com essas alterações no estilo de vida e a evolução da doença – os agentes antidiabéticos orais devem ser associados151. Atualmente, existem diferentes classes de fármacos com diferentes mecanismos de ação, os quais podem ser utilizados isoladamente ou em combinações terapêuticas diversas150. Isso porque muitos pacientes não têm controle glicêmico adequado com o uso de uma única droga, necessitando, em longo prazo, de combinações entre dois ou mais agentes orais151-153, às vezes como prelúdio da insulinoterapia. Nos últimos anos, com o objetivo de melhorar a adesão do paciente às combinações medicamentosas, têm surgido no mercado preparações com dois componentes num mesmo comprimido. Contudo, com o decorrer dos anos, o tratamento tradicional com agentes orais passa a não mais ser eficaz e, em conseqüência, os níveis glicêmicos aumentam, não sendo mais possível manter o controle metabólico. Assim, consoante a evolução da afecção, os indivíduos vêm a necessitar do uso de insulina148. Ocorre que o esquema combinado de insulina com agentes orais também pode, com o passar do tempo, não mais ser suficiente, o que é comprovado pelo aumento dos valores glicêmicos obtidos pela 19 automonitoração e pelo aumento progressivo dos níveis de hemoglobina glicada. Passam a ser, então, necessárias maiores e mais doses diárias de insulina. Finalmente, quando não há mais possibilidade do uso de esquemas combinados de agentes orais e insulina, indica-se a insulinização plena. Não obstante, a insulina se mantém como única alternativa terapêutica efetiva, quando as medidas conservadoras e os agentes antidiabéticos orais não são mais suficientes para o controle metabólico144,146,154. A intensificação da insulinoterapia no tratamento do diabetes tipo 2 é a forma mais apropriada para se buscar atingir a normoglicemia e reduzir as complicações da afecção, com controle glicêmico precoce, rigoroso, persistente e efetivo144,155-157. Pacientes submetidos ao tratamento intensivo, apesar de não conseguirem a normalização completa da hemoglobina glicada, mostram substancial redução no risco de eclosão ou na progressão das complicações crônicas e tardias do diabetes – micro e macrovasculares – , as quais constituem importante causa de morbimortalidade na população acometida144, 155, 156 . Pode-se, assim, constatar que o diabetes tipo 2 é uma afecção multifacetada, que necessita de uma abordagem integrada e individualizada nos cuidados de cada paciente150, a qual pode ser desafiadora158. Os pacientes freqüentemente se apresentam com pequeno controle glicêmico apesar das medidas terapêuticas instituídas149, 158. Considera-se ótimo o controle glicêmico de um indivíduo com diabetes tipo 2 quando os valores de sua glicemia são o mais próximo possível dos níveis de um indivíduo sem diabetes159 com vistas à prevenção de suas complicações144. Percebe-se, portanto, que atingir níveis ótimos de controle glicêmico ainda continua sendo um dos maiores desafios na prática clínica, com apenas uma pequena parcela da população com diabetes alcançando as metas terapêuticas157,159. Limitações da maioria das medidas terapêuticas disponíveis tem impedido conquistar esse objetivo159. Algumas das razões incluem baixa adesão a dietas, também pouco efetivas, e iniciativas insuficientes para controle de peso, somadas à limitada eficácia de agentes terapêuticos ou 20 associação com eventos adversos excessivos, ao atraso no início da insulinoterapia e à pobre aceitação de um regime diário de múltiplas injeções pelo próprio paciente157, 160. É bem sabido que a maioria dos indivíduos não sustentará um nível adequado de controle glicêmico valendo-se de medidas comportamentais ou de monoterapia oral151. E, mesmo que as terapias orais tradicionais sejam usualmente efetivas na diminuição da hiperglicemia, não previnem nem impedem a progressão da doença, fazendo com que, assim, muitos pacientes requeiram insulina148. Outros indivíduos podem, ainda, ter alergia ou contraindicações às medicações, não aderir ou ser resistentes à continuidade do tratamento quando se defrontam com efeitos colaterais indesejáveis, como ganho de peso e hipoglicemia, associado a muitas das terapias convencionais, além de reações dermatológicas, distúrbios gastrointestinais, reações hematológicas, eventos coronarianos agudos, alterações visuais e metabólicas, limitando seu uso147-149, 152, 158, 161. A maioria das medicações anti-diabéticas, incluindo sulfoniuréias, tiazolidinadionas, e insulina, melhora o controle glicêmico mas nem sempre corrige as disfunções metabólicas associadas, e se associa a aumento do peso corporal, como ocorre também com a insulina, por estimulação do apetite, o que gera preocupação147, 161, 162 . Note-se que foi demonstrado que as sulfoniuréias aceleram a apoptose de células beta, agravando o declínio linear de suas funções, com a diminuição de sua massa no pâncreas humano145. No caso das tiazolidinadionas, o ganho de peso é promovido por expansão volêmica e edema, o qual pode se manifestar com insuficiência cardíaca em indivíduos susceptíveis ou agravar a pré-existente, podendo, assim, causar ou exacerbar a insuficiência cardíaca congestiva e mesmo eventos cardíacos isquêmicos, mitigando os riscos associados ao incremento da gordura corporal151,152,161. Dados recentes sugerem, também, que tiazolidinadionas podem reduzir a densidade mineral óssea151. Assim, na escolha terapêutica deve-se considerar, além do decréscimo da hemoglobina glicada, a tolerabilidade, os efeitos não-glicêmicos dos agentes anti-diabéticos, os efeitos sobre as comorbidades associadas e o próprio custo151, 154. 21 O inadequado controle glicêmico é, além da natureza progressiva da própria doença, também devido aos atrasos no início do tratamento com antidiabéticos orais e da introdução da insulina, e à falha da intensificação mais precocemente da insulinoterapia em pacientes que não atingem os objetivos glicêmicos148, 155. Existem verdadeiras barreiras, tanto para pacientes quanto para médicos, que comprometem a iniciação e intensificação da insulinoterapia, as quais se correlacionam com a pequena motivação individual, a falta de familiaridade com o ato de aplicação, a necessidade de injeções freqüentes de insulina, medo que serão dolorosas e difíceis de serem administradas, além de preocupações quanto a hipoglicemia e ganho de peso155, 160, 163 atraso inapropriadamente, na inicialização precoce da insulinoterapia, . Destarte, o considerando-se a evolução do diabetes, não permite que se atinjam os níveis recomendados de glicemia, nem que se mantenha um controle glicêmico mais adequado146, 154, 160. É necessário, para que se tenha sucesso com a insulinoterapia, que o paciente esteja motivado e adequadamente informado, merecendo participação e apoio de uma equipe multidisciplinar. Existe, atualmente, grande número de preparações insulínicas disponíveis para o tratamento do diabetes, incluindo várias pré-misturas e apresentações em cartuchos utilizadas em canetas injetoras, que podem tornar o tratamento do diabetes potencialmente mais complexo. O paciente deve, assim, ser orientado quanto às diferentes apresentações, formas, vias e locais de aplicação e cuidados de armazenamento da insulina, assim como quanto às formas e à importância da monitoração glicêmica. Ademais, deve ser enfatizada a necessidade da manutenção das outras medidas de modificação do estilo de vida - regime alimentar adequado e da atividade física. Os riscos do desenvolvimento de hipoglicemia também devem ser explicados ao paciente e aos seus familiares, assim como os mesmos devem ser esclarecidos quando às medidas necessárias para evitá-la e revertê-la. Percebe-se, com isso, que o esquema de tratamento intensivo com insulina exige melhores níveis sócio-econômico e cultural do paciente, além de alto grau de adesão e capacidade de aprendizado, pois será ele mesmo a 22 monitorar o tratamento e a decidir sobre as doses de insulina, a presença de hipoglicemia e a prevenção de complicações agudas. Há que se adquirir conhecimento bastante grande, com discernimento, e disponibilidade de recursos para sua exeqüibilidade, sendo necessário estímulo constante, tanto da parte do paciente quanto de toda a equipe médica multiprofissional. Logo, vê-se que existe uma clara necessidade de novas opções terapêuticas anti-diabéticas, mais agressivas, as quais podem ser combinadas com agentes farmacológicos existentes, focadas para se preservar a função das células beta e interromper a progressão do diabetes mellitus tipo 2147. Nenhuma das terapêuticas disponíveis para o diabetes mellitus mencionadas demonstrou preservar a função das células beta pancreáticas no decorrer do tempo. As limitações desse tratamento mais antigo tornam imperativa a obtenção de novos meios que ofereçam maiores eficácia, durabilidade, conveniência, segurança e tolerabilidade, a fim de se atingir mais precocemente os objetivos de um controle glicêmico adequado e de se evitar ou retardar a necessidade de medidas adicionais145. Tornam-se, assim, necessárias opções mais agressivas, baseadas na etiopatogenia da afecção, e que incluam maior controle tanto da glicemia de jejum quanto da glicemia pósprandial154. As terapias baseadas nas incretinas, como os agonistas dos receptores de GLP-1, adminstrados via subcutânea, e os inibidores da DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4), administrados via oral, oferecem uma nova abordagem no manejo do diabetes tipo 2, mais atual e interessante, havendo ainda novos agentes em desenvolvimento145, 149 . Esses dois grupos já disponíveis na atualidade demonstraram-se seguros e efetivos na diminuição dos níveis glicêmicos, promovendo também efeitos favoráveis em relação ao peso, isto é, redução ou manutenção do mesmo, respectivamente148, 151, 161, 162 . Alguns estudos demonstraram efeitos benéficos dessas drogas promissoras também sobre o perfil lipídico e a pressão arterial dos pacientes145. Tanto os agonistas dos receptores de GLP-1 quanto os inibidores da DPP-4 levam à secreção de insulina e à supressão de glucagon glicosedependente, com conseqüente baixo risco de hipoglicemia quando utilizados isoladamente ou em terapia combinada, exceto se concomitantes com 23 sulfoniuréias. Ademais, estudos experimentais demonstraram que prolongam a sobrevida das células beta pancreáticas, atrasando sua disfunção e promovendo sua regeneração, permitindo, teoricamente, a possibilidade de se diminuir a progressão do diabetes mellitus tipo 2. Não foram verificados, até o momento, esses resultados em estudos clínicos145, 148, 149. Contudo, apesar das atraentes características desses novos agentes, seu alto custo em relação às drogas orais de primeira linha e a indisponibilidade de dados de pesquisas em longo prazo quanto à suas segurança e resultados clínicos, devem ser levados em consideração. Há relatos de náuseas, cefaléia, casos de pancreatite aguda, infecção de vias aéreas superiores, depressão, hipoglicemia severa e reações alérgicas dermatológicas, por seu uso; alguns indivíduos apresentam, ainda, modesta redução dos seus níveis de hemoglobina glicada (HbA1C), de cerca de 1,0%, em comparação com a que ocorre com a utilização de insulina e agentes mais antigos. O desenvolvimento de carcinomas em cobaias, pela sua utilização, ainda não foi confirmado em humanos145, 152,153. Além de novas classes de medicações antidiabéticas, o desenvolvimento de análogos da insulina e de outras alternativas não-invasivas para a utilização da insulina são promissoras opções para o manejo do diabetes mellitus tipo 2146, 163 . Podem auxiliar no vencimento de alguns desafios, visando atingir um melhor controle glicêmico, apesar das dificuldades pela progressão natural da própria doença e pela perda da eficácia em longo prazo dos agentes orais159. Novos análogos da insulina basal, incluindo pré-misturas, como lispro, aspart e glargina, permitem uma reposição mais fisiológica, com mais liberdade, flexibilidade e conveniência na adminstração e em relação ao conteúdo da alimentação, se comparados às formulações da insulina regular, propiciando melhor qualidade de vida144, 146, 163. Formulações inovadoras, sem a necessidade de injeções subcutâneas, podem suplantar algumas das limitações da insulinoterapia usual e, assim, facilitar a utilização precoce da insulina, permitindo se alcançar e manter em longo prazo um melhor controle glicêmico, aumentando a qualidade de vida dos indivíduos157. Há, por outro lado, clara necessidade de se somar apropriado aconselhamento, com 24 educação individual, também às modernas terapias disponíveis no tratamento clínico do diabetes tipo 2, as quais tentam transpor as conhecidas barreiras da insulinoterapia154. Os objetivos do tratamento do diabetes mellitus tipo 2 resumem-se à melhora da qualidade de vida e à prevenção da mortalidade precoce dos indivíduos acometidos através de um intensivo controle glicêmico, minimizando o risco de seus efeitos microvasculares, ainda que não se tenham demonstrado benefícios substanciais quanto às suas implicações macrovasculares62, 164-167. Entretanto, a manutenção de um adequado controle glicêmico em pacientes obesos com diabetes tipo 2 por meios conservadores é um verdadeiro desafio. As dietas que impõem grande restrição calórica e os programas clínicos multidisciplinares para perda ponderal raramente têm demonstrado benefícios consideráveis em médio e em longo prazos, além das próprias limitações e dos efeitos colaterais dos fármacos antidiabéticos e da insulinoterapia. Até o presente, mesmo regimes de intensificação do controle glicêmico, mediante combinação e instituição otimizada dos agentes tradicionais, falharam na conquista dessas metas terapêuticas. Mesmo os novos agentes orais e os análogos da insulina, os quais necessitam de maiores estudos para sua validação, consideram as necessidades individuais e o estilo de vida de cada paciente. Assim, não é necessário apenas um ótimo controle glicêmico, mas também intervenções sobre o estilo de vida de indivíduos diabéticos, combatendo obesidade, hipertensão arterial, dislipidemia e tabagismo, para que se conquistem os resultados desejados no tratamento do diabetes tipo 262, 145, 154, 168. Na abordagem terapêutica do DM2 e da resistência insulínica, além de uma ampla variedade de opções no tratamento clínico multidisciplinar, com o objetivo de perda ponderal e controle da glicêmica com opções farmacológicas, podem, portanto, ser incluídas técnicas operatórias bariátricas e metabólicas. É bem sabido que essas intervenções cirúrgicas podem controlar a DM2, mesmo em longo prazo169. O tratamento cirúrgico de pacientes portadores de diabetes mellitus do tipo 2, obesos ou não, deve ser visto atualmente como uma alternativa válida para a abordagem dessa enfermidade. 25 2. OBJETIVOS 2.1 Geral Avaliar os efeitos orgânicos da transposição ileal no diabetes mellitus tipo 2. 2.2 Específicos 2.2.1. Investigar as alterações morfológicas e funcionais ocorridas nas células L intestinais num segmento de íleo distal interposto ao jejuno proximal em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta; 2.2.2. Estudar as modificações estruturais no intestino delgado de animal submetido à transposição de um segmento de íleo distal para uma situação proximal no tubo digestório em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta; 2.2.3. Analisar a morfologia e quantificar as células do pâncreas endócrino após a transposição ileal em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta; 2.2.4. Verificar as alterações bioquímicas em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta, submetidos à transposição ileal. 2.2.5. Avaliar os níveis de expressão relativa dos genes relacionados à apoptose celular, diabetes mellitus e diferenciação de células-tronco em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta, submetidos à transposição ileal. 26 3. JUSTIFICATIVA A intervenção cirúrgica a ser estudada nesta pesquisa - interposição de segmento ileal na continuidade do jejuno proximal - pode vir a constituir-se em abordagem terapêutica válida para o controle do diabetes mellitus tipo 2, inclusive em indivíduos não-obesos, uma vez que não produz nenhum distúrbio da absorção dos nutrientes. A cirurgia avaliada é de simples execução, de baixo custo, pode ser facilmente revertida e não requer nenhuma remoção de segmento de tubo disgestório nem condiciona desvio de trânsito alimentar de nenhuma ordem, destarte evitando a incidência de desnutrição e outras complicações. Entretanto, há que se investigar a possibilidade de, com o tempo e com a exposição constante a altos teores dos sucos digestivos oriundos do estômago, pâncreas e fígado, e também com o contato constante entre a mucosa do ileo transposto e alimentos não completamente digeridos, haverá de "jejunizar-se" a mucosa do íleo interposto, isto é, seu fenótipo passar a apresentar características histológicas das células e estruturas da membrana de absorção e de secreção exócrina e endócrina semelhantes ao padrão jejunal. Essa possível jejunização do íleo interposto pode interessar apenas aos componentes exócrinos e absortivos (o que não constituirá problema algum), ou também modificar o padrão endócrino do ileo (alta densidade de células L produtoras de GLP-1) no sentido da adoção do padrão jejunal (baixa densidade dessas células). Esta última circunstância invalidará a eficiência da proposição técnica, em longo prazo. Vale dizer: caso seja afastada, mediante a presente pesquisa, a possibilidade teórica de o epitélio da membrana mucosa do segmento ileal interposto no jejuno proximal adquirir o fenótipo do jejuno inclusive e principalmente adquirindo a configuração de baixa densidade de células L, típica do jejuno proximal - , estaria elidido o único óbice teórico à consecução da interposição ileal em indivíduos diabéticos. Assim, caso o íleo interposto venha a se manter com alta densidade de células L, estará garantida a ação em longo prazo dos efeitos tróficos benéficos já bem estudados do GLP-1, principalmente para o lado do pâncreas endócrino. 27 Uma vez estudada tal intervenção no âmbito da medicina translacional em animais de experimentação, cujas características biológicas são muito semelhantes às dos humanos, no que diz respeito ao metabolismo glicídico e à nutrição em geral, os resultados poderão ser extrapolados para a clínica. A relevância da presente pesquisa reside nos benefícios que a intervenção cirúrgica estuda possa promover para uma imensa população de indivíduos diabéticos, ainda que não-obesos, promovendo o controle substancial e até mesmo a remissão da disglicidemia. 28 4. RESULTADOS ESPERADOS Espera-se que a imunohistoquímica no tecido intestinal venha a demonstrar a preservação da alta densidade de células L no íleo interposto, apesar de ser esperada a transformação do padrão ileal para o padrão jejunal do epitélio mucoso de secreção exócrina e de absorção. Isto porque a diferenciação das células troncos das criptas no sentido das células L não sofrem influências epigenéticas. É esperado que as células tronco do fundo das criptas continuem a se diferenciar em ritmo normal em células L. Sabe-se que esses estímulos induzem à transformação do padrão epitelial secretório exócrino e absortivo do íleo em padrão mucoso jejunal, mas ignora-se se essa "jejunização" também envolve a transformação do padrão de alta densidade de células L do íleo normal, antes da transposição, em baixa densidade dessas células no íleo transposto. A imunohistoquímica no tecido pancreático deve demonstrar a preservação das ilhotas de Langerhans, de células produtoras de insulina e de células em proliferação. A intolerância à glicose e a resistência insulínica deverão atenuar-se ou desaparecer no grupo submetido à transposição ileal. Alguma redução no peso dos animais do grupo submetido à transposição ileal deverá ocorrer, no entanto sem desnutrição. Nenhum efeito adverso da interposição ileal é esperado. O estudo biomolecular da expressão dos genes de interesse é fundamental para avaliação personalíssima, de modo mais íntimo e precoce, do que acontece especificamente após a intervenção cirúrgica realizada. A análise histológica permite o reconhecimento tardio do processo que foi instalado. 29 5. MÉTODOS Modelo Experimental Comitê de Ética em Pesquisa O presente projeto de pesquisa será encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa Experimental da Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM). Procedimentos Experimentais Os procedimentos experimentais serão realizados de acordo com as orientações do manual “Cuidados e Manejos de Animais de Laboratório”, Ed: Lapchick, Mattaraia, Ko; Atheneu, 2009, CDD 636.0885. Amostra Utilizar-se-ão 40 ratos machos (Rattus norvegicus albinus), Wistar 2BAW Heterogêneos, com 12 semanas de vida, de peso corporal variando entre 250 e 280 g, fornecidos pelo Laboratório de Experimentação Animal do Instituto de Farmacologia e Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM), onde serão mantidos durante todo o procedimento experimental. Os animais permanecerão alojados em gaiolas individuais e mantidos por 16 semanas, com temperatura ambiente controlada de 23 2C, umidade relativa de 55 15%, e com dispositivo automático (Timer – Kienzle) proporcionando ciclo de alternância de luminosidade entre claro e escuro de 12 em 12 horas (06:00 / 18:00 horas). Através de sorteio, os animais serão distribuídos em 4 grupos, conforme organograma abaixo discriminado: - Grupo Transposição (GT) – submetidos à transposição ileal, com 10 animais, em uso de dieta hipercalórica-hiperlipídica; 30 - Grupo Sham (GS) – submetidos à operação simulada, com 10 animais, e utilizando a mesma dieta; - Grupo Controle 1 (GC1) – não submetidos a nenhuma intervenção cirúrgica, mas consumindo a dieta hipercalórica-hiperlipídica; e - Grupo Controle 2 (GC2) - não submetidos a nenhuma intervenção cirúrgica, nem à dieta hipercalórica-hiperlipídica, mas apenas ração padrão, com 10 animais. Amostra N ≥ 40 Grupo Transposição Ileal (GT) N ≥ 10 Grupo Sham (GS) N ≥ 10 Grupo Controle 1 (GC1) N ≥ 10 Grupo Controle 2 (GC2) N ≥ 10 As intervenções cirúrgicas serão realizadas na 20ª semana de vida. Todos os animais serão acompanhados até a 08ª semana de pós-operatório (PO), isto é, a 28ª semana de vida, quando serão sacrificados. Dieta Os ratos randomizados dos grupos GT, GS e GC1 serão mantidos no decorrer de todo o experimento com dieta hipercalórica (DH), rica em lípides, pelletizada, ministrada ad libitum, em ciclos alternados de quatro tipos diferentes de rações (1, 2, 3 e 4), pelo período de 16 semanas, estimulando a ingesta. As rações experimentais serão alternadas a cada 24 horas, e a 31 quantidade não ingerida será mensurada. O consumo dessas dietas promoverá obesidade nos animais, os quais exibirão características comumente associadas com a obesidade humana, como resistência à insulina, hiperglicemia, hiperinsulinemia, dislipidemia e esteatose hepática. Os animais do grupo GC2, por sua vez, receberão dieta padrão. A oferta de água será de livre acesso em todos os grupos. As rações experimentais 1, 2, 3 e 4, de acordo com as especificações da Nutrient Requirements of the Laboratory Rat, recomendadas pela National Academy of Sciences, serão produzidas industrialmente pela empresa Rhoster®, Araçoiaba da Serra – SP, compostas por ração padrão para ratos, com suplementação protéica, vitamínica e mineral. Os ingredientes adicionais hiperenergéticos que serão utilizados no preparo das dietas experimentais hipercalóricas, em gramas por quilo, serão, respectivamente: - DH1 – ração padrão, 355; amendoins torrados, 176; caseína, 123; óleo de milho, 82; chocolate, 88; biscoito de milho, 176; e vitaminas e minerais. - DH2 - ração padrão, 439; amendoins torrados, 218; caseína, 129; óleo de milho, 61; batata frita, 153; e vitaminas e minerais. - DH3 - ração padrão, 371; amendoins torrados, 185; caseína, 99; óleo de milho, 68; macarrão, 185; queijo ralado, 92; e vitaminas e minerais. - DH4 - ração padrão, 359; amendoins torrados, 179; caseína, 105; óleo de milho, 80; leite condensado, 161; bolacha wafer, 116; e vitaminas e minerais. A experimentais composição de macronutrientes das hipercalóricas-hiperlipídicas, produzidas rações padrão e analisadas e em laboratório pela empresa Rhoster®, Araçoiaba da Serra – SP, está apresentada no Quadro 1. 32 Quadro 1- Composição das dietas padrão e experimentais. Rações Componentes Padrão DH 1 DH 2 DH 3 DH 4 Proteína (%) 26 27 28 28 26 Carboidrato (%) 54 43 36 33 43 Gordura (%) 3 20 23 24 20 Outros (%) † 17 10 13 15 11 Calorias (Kcal/g) 3,5 4,6 4,6 4,6 4,6 † - vitaminas, minerais, umidade, cinzas. Curva de Peso e Consumo de Ração A pesagem realizar-se-á duas vezes por semana, em dias préestabelecidos, tão logo se inicie o período claro, com balança apropriada (Filizola BP-6), de precisão, e a anotação do peso de cada animal será feita em gramas. O consumo de ração será anotado três por semana, em dias prédeterminados, calculando-se em cada gaiola a diferença dos pesos das rações ofertada e consumida, fazendo-se o cálculo aritmético da estimativa diária do consumo de ração, em gramas. As curvas de peso e consumo de ração serão realizadas em todos os grupos, durante todo o experimento. Jejum Aos animais de todos os grupos será oferecida somente água nas 6 horas que antecedem os procedimentos de coleta de sangue para testes laboratoriais e procedimento cirúrgico. 33 Coleta de Sangue e Testes Laboratoriais Serão realizadas coletas sangüíneas para os testes laboratoriais na 12ª semana de vida dos animais (S12), no dia da operação (S20) e na 08ª semana de pós-operatório, ou seja, 28ª semana de vida (S28), após pesagem e sob anestesia prévia. A coleta sanguínea no dia zero (D0), início da experimentação, visa obter os parâmetros basais de cada animal, enquanto que a do dia da cirurgia busca verificar as alterações ocorridas no metabolismo glicídico dos animais, secundárias à obesidade induzida pelas dietas experimentais hipercalóricashiperlipídicas, e a da 8ª semana de pós-operatório pretende avaliar as modificações desse mesmo metabolismo, após as intervenções cirúrgicas realizadas. Será coletado 0,5 mL de sangue através de punção da veia da cauda de cada um dos animais, em tubos heparinizados, seguindo-se centrifugação e posterior armazenamento a –20ºC para as determinações séricas (LABTEST®) de glicose (GLI) e de insulina (INS), hemoglobina glicada (HBG), peptídeo C (PTC) e Glucagon-like peptide-1 (GLP1) pelo método ELISA (LINCO®). Também será realizado na amostra sanguínea estudo biomolecular com reação de polimerase em cadeia em tempo real (PCR em tempo real). Procerder-se-ão às análises da expressão gênica de um total de 252 genes envolvidos especificamente com a apoptose de células beta pancreáticas, desenvolvimento do diabetes mellitus e diferenciação de células tronco. Após 10 minutos da coleta do sangue, será feita a determinação da glicose sérica com fitas reagentes em glicosímetro (Kit Accu-Chek Advantage®) e em seguida será realizado o teste de tolerância insulínica (TTI), quando será injetada uma solução de insulina regular na concentração de 1 U/Kg de peso corpóreo através da veia peniana. A partir de então serão coletadas amostras para a determinação da glicemia, utilizando-se lancetas para a obtenção de uma gota de sangue da cauda do animal, aos 4, 8, 12 e 16 minutos após a injeção de insulina. Os resultados serão registrados para análise posterior. 34 A determinação da glicose sérica com fitas reagentes em glicosímetro (Kit Accu-Chek Advantage®) será também realizada em dias prédeterminados, uma vez por semana, durante todo o experimento (S13, S14, S15, S16, S17, S18, S19, S21, S22, S23, S24, S25, S26, S27). Anestesia, Pesagem e Antibioticoprofilaxia Antes do início da anestesia, todos os animais serão pesados em balança de precisão (Filizola BP-6) e os respectivos pesos anotados em gramas. Em ambos os grupos GT e GS será realizada anestesia geral com halotano para a realização da coleta de sangue da cauda e em seguida anestesia geral dissociativa, para a realização do teste de tolerância insulínica e intervenções cirúrgicas, utilizando Zoletil 50® (tiletamina+zolazepan) na dose de 20 mg/kg e Fentanil® na dose de 0,025 mg/kg, coletados na mesma seringa e injetados simultaneamente por via intramuscular170. Cada animal será mantido em ventilação espontânea durante os procedimentos, e o plano anestésico será controlado mediante avaliação periódica, a cada 45 minutos, dos reflexos auricular e interdigital, que devem estar abolidos. Constatando-se reaparecimento desses reflexos, será feita complementação anestésica com um terço da dose inicial. Ao término da intervenção cirúrgica, será anotada a quantidade total de anestésicos utilizada. A antibiótico-profilaxia será realizada com cefoxitina na dose de 50 mg/kg de peso, por via intramuscular, logo depois de anestesiados para a cirurgia. Procedimentos Operatórios Nos dias determinados, com 20 semanas de vida (S20), dois ratos serão separados e aleatoriamente distribuídos no GT e no GS. Adotar-se-ão todos os princípios de assepsia e antissepsia de Halsted, utilizando-se instrumental micro-cirúrgico estéril. Os animais anestesiados terão os pêlos da região abdominal cortados com tesoura rente à pele, e serão posicionados em decúbito dorsal horizontal na mesa cirúrgica, com as patas e a cauda devidamente 35 imobilizadas, atadas com esparadrapo. A anti-sepsia da região abdominal será feita com clorohexidine em veículo aquoso. Será colocado campo cirúrgico esterilizado fenestrado na região abdominal do animal, e será realizada uma incisão longitudinal mediana da parede, com aproximadamente 5 cm de extensão, utilizando-se bisturi descartável de lâmina número quinze. No animal componente do GT, o ceco será identificado e exposto, juntamente com o íleo terminal. A seguir, o intestino delgado será seccionado perpendicularmente nas regiões distando 3 e 5 cm da transição íleo-cecal, ressecando-se um segmento ileal de 2 cm para estudo histológico (Figura 1A). O íleo será novamente seccionado perpendicularmente na região distante 15 cm da transição íleo-cecal, separando-se, dessa forma, um segmento ileal de 10 cm, o qual será envolto em gaze umedecida com solução de cloreto de sódio a 0,9%, aquecida (Figura 1B). Em seguida, será realizada a anastomose dos segmentos do íleo remanescente, de forma a ser restabelecida a continuidade do tubo digestório. Posteriormente, será seccionado o jejuno em dois locais, distantes 5 e 6 cm da transição duodeno-jejunal, ressecando-se um segmento jejunal de 1 cm para estudo anatomo-patológico (Figura 1A). O segmento do íleo distal anteriormente separado será interposto aos segmentos do jejuno seccionado, em posição isoperistáltica, por entero-enteroanastomose (Figura 1C). Figura 1A Figura 1B Figura 1C 36 Figura 1A – Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal e dos segmentos ileal e jejunal a serem submetidos a estudo histológico. Figura 1B – Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal e do segmento ileal isolado (preenchido em preto) a ser transposto. Figura 1C – Esquema demonstrativo da anastomose do íleo distal e do segmento ileal transposto (preenchido em preto) anastomosado nos segmentos iniciais do jejuno. No animal componente do GS, o ceco será identificado e exposto, juntamente com o íleo terminal. A seguir, o intestino delgado será seccionado perpendicularmente nas regiões distando 3 e 5 cm da transição íleo-cecal, ressecando-se um segmento ileal de 2 cm para estudo histológico, e também nas regiões distantes 5 e 6 cm da transição duodeno-jejunal, para a remoção de 1 cm de tecido jejunal para estudo histológico (Figura 1A). Em seguida, serão realizadas as anastomoses dos segmentos intestinais remanescentes, de forma a ser restabelecida a continuidade do tubo digestório, sem transposição (Figuras 1D e 1E). Figura 1A Figura 1D Figura 1E Figura 1A – Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal e dos segmentos ileal e jejunal a serem submetidos a estudo histológico. Figura 1D – Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal. Figura 1E – Esquema demonstrativo das anastomoses intestinais do íleo distal e do jejuno proximal. 37 Todas as anastomoses intestinais serão término-terminais e realizadas com 6 pontos totais separados, utilizando-se fios de polipropileno 70 pré-montados em agulha cilíndrica. Após a revisão final, terminado o ato cirúrgico, os animais serão hidratados com 1,0 mL de solução cristalóide (soro fisiológico a 0,9%) para cada 300g de peso, na temperatura de 36ºC, via intraperitoneal. A síntese da parede abdominal será realizada com sutura contínua em monobloco do peritônio parietal, da camada muscular e da aponeurose, utilizando-se fio de poliglactina 4-0 pré-montado em agulha cilíndrica. Na pele será feita sutura contínua com pontos invertidos, utilizando-se fio de poliglactina 4-0 pré-montado em agulha cilíndrica. Evolução Pós-Operatória Os animais serão mantidos aquecidos e em observação até a recuperação completa da anestesia, quando então serão colocados em gaiolas individuais e encaminhados para a sala de albergue, no mesmo Laboratório, sob as mesmas condições ambientais pré-operatórias. Antes da recuperação anestésica, os animais receberão analgesia com 0,5 mL da solução de 3 g de dipirona diluídos em 1 mL de água, por gavagem. Será reintroduzida água ad libitum tão logo haja recuperação anestésica. Durante as primeiras 72 horas seguintes de pós-operatório, serão mantidos com 1 g de dipirona diluído em 100 mL de água. O acesso à dieta será permitido após 12 horas do término da cirurgia. Os animais serão avaliados e acompanhados até a 08ª semana do pós-operatório, ou seja, a 28ª semana de vida (S28), período equivalente a 5 anos de pós-operatório na espécie humana171. Eutanásia Na 28ª semana de vida serão realizados os mesmos procedimentos de jejum, anestesia, pesagem e coleta de sangue para testes laboratoriais e, em seguida, será efetuada a eutanásia pela técnica de decapitação, conforme 38 orientações da Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório / Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – SBCAL-COBEA. Composição Corporal Após a eutanásia, serão coletados os depósitos de gordura periepididimal e retroperitoneal para pesagem em balança de precisão, em todos os animais de cada grupo, para quantificação de sua adiposidade. Coleta do Tecido Pancreático Após a eutanásia, será coletado o pâncreas dos animais de todos os grupos, para estudo anátomo-patológico e imunohistoquímico. A ressecção do órgão será realizada junto à grande curvatura gástrica e à região esplênica, em monobloco. Coleta do Tecido Intestinal No momento da realização das operações, em GT e GS, serão coletados tecidos para avaliação histológica inicial, nas seguintes regiões (Figura 2): - Segmento de íleo distal – I 1 (íleo, no tempo 1). - Segmento de jejuno proximal – J 1 (jejuno, no tempo 1); Figura 2 39 Figura 2 – Esquema demonstrativo dos segmentos ileal e jejunal a serem submetidos a estudo histológico em ambos os grupos. Após a eutanásia, em todos os grupos, serão coletados os seguintes tecidos intestinais para uma segunda análise, a fim de se avaliar a morfologia estrutural do intestino e as células intestinais produtoras dos hormônios incretínicos (células L), além de as suas possíveis modificações em longo prazo: - Segmento de íleo, distal à anastomose íleo-ileal nos GT e GS, e a 2 cm da transição íleo-cecal nos GC1 e GC2 – I 2 (íleo, no tempo 2); - Segmento de jejuno distal à anastomose íleo-jejunal no GT e jejuno-jejunal no GS, e à cerca de 7 cm da transição duodeno-jejunal nos GC1 e GC2 – J 2 (jejuno, no tempo 2); - Segmento mediano do íleo transposto no GT e o seu correspondente no GS, a 8 cm da transição íleo-cecal – T 2 (segmento transposto, no tempo 2). Figura 3A Figura 3B Figura 3C Figura 3A – Esquema demonstrativo dos segmentos I2, J2 e T2 a serem submetidos a estudo histológico post-mortem nos animais do GT. Figura 3B – Esquema demonstrativo dos segmentos I2, J2 e T2 a serem submetidos a estudo histológico post-mortem nos animais do GS. 40 Figura 3C – Esquema demonstrativo dos segmentos I2 e J2 a serem submetidos a estudo histológico post-mortem nos animais do GC1 e GC2. Histologia – Microscopia Óptica e Imuno-Histoquímica Tecido Pancreático: O pâncreas de cada animal, ressecado em monobloco, destinado à avaliação com microscopia ótica, será devidamente disposto em cassete e fixado em formaldeído tamponado a 10% por 12 horas e, em seguida, processado para inclusão em parafina. Os cortes histológicos serão obtidos em micrótomo do tipo Minot regulado para a espessura de 5 m e colocados em lâminas previamente tratadas com silano 5%, utilizando-se o maior eixo da peça. As lâminas serão coradas com hematoxilina-eosina para análise morfométrica do pâncreas. Serão utilizados anticorpos específicos para estudo imuno-histoquímico: - Anticorpo Policlonal H-86:SC-9168 da marcação de células produtoras de insulina, do tipo policlonal de coelho, Código H-86: SC9168, da empresa Santa Cruz Biotechnology. - Anticorpo Monoclonal anti-Rat para avaliar células em proliferação Ki67, Clone MIB-5, Código: M7248-1, Marca Dako. Tecido Intestinal: Os segmentos intestinais ressecados de cada animal, destinados à avaliação com microscopia ótica, serão abertos em sua porção contramesentérica e cautelosamente lavados com soro fisiológico. A seguir, serão dispostos sobre um fragmento de papel filtro, mantendo contato direto com a serosa e ficando a face mucosa voltada para cima. Posteriormente, serão colocados em um frasco de boca larga em formaldeído tamponado a 10% por 12 horas, em quantidade de 10 vezes superior ao volume tecidual, permanecendo a face mucosa em contato direto com a solução. Em seguida, serão processados para inclusão em parafina. Os cortes histológicos serão 41 obtidos em micrótomo do tipo Minot regulado para a espessura de 5 m e colocados em lâminas previamente tratadas com silano 5%, utilizando-se o perímetro interno da peça. As lâminas serão coradas com hematoxilina-eosina para análise morfométrica do intestino, em todos os segmentos ressecados. Serão utilizados anticorpos específicos para estudo imuno-histoquímico: - Anticorpo sc7782 Anti-GLP-1, Clone C-17, da empresa Santa Cruz Biotechnology, em diluição de 1:500. - Anticorpo Monoclonal anti-Rat para avaliar células em proliferação Ki67, Clone MIB-5, Código: M7248-1, Marca Dako. Protocolo da Imunohistoquímica: As lâminas com os fragmentos do pâncreas seguirão para estudo imunohistoquímico com dupla marcação antigênica, utilizando o KIT: EnVision G|2 Doublestain System, Rb/Mo (DAB+/Permanent Red), Código: K5361-1, Marca: Dako. A visualização basear-se-á na peroxidase (HRP) utilizando como cromógeno o DAB+ e Fosfatase Alcalina (AP) utilizando como cromógeno o Permanent Red. As lâminas com os fragmentos intestinais seguirão para estudo imunohistoquímico com dupla marcação antigênica, utilizando o KIT: LSAB. A visualização basear-se-á na peroxidase (HRP) utilizando como cromógeno o DAB+. Tem-se o seguinte protocolo para os cortes histológicos: a) desparafinação: as lâminas serão deixadas em estufa a 60ºC por 12 horas, para melhor adesão do tecido, e em seguida serão desparafinadas com 3 banhos em xilol por 5 minutos cada em temperatura ambiente; b) hidratação: as lâminas serão submersas duas vezes em etanol absoluto por 5 minutos e lavadas com água corrente por 2 minutos para hidratação dos cortes; 42 c) recuperação antigênica: as lâminas serão colocadas em solução de citrato de sódio 10 mM pH 6,0 por 30 minutos em panela de vapor (95ºC), deixando-se depois esfriar a temperatura ambiente por 20 minutos e lavadas em PBS (Tampão Salina Fosfato) 0,05 M, pH 7,4 quatro vezes por 3 minutos cada; d) bloqueio da peroxidase endógena: as lâminas serão incubadas com peróxido de hidrogênio 3%, quatro vezes por 5 minutos cada e, em seguida, lavadas com água corrente e tampão PBS pH 7,4 três vezes por 3 minutos cada; e) bloqueio de sítios inespecíficos: as lâminas serão incubadas em PBS pH 7,4 + BSA (Soro Albumina Bovina) 1% por 30 minutos em temperatura ambiente; f) incubação do anticorpo primário: os cortes histológicos de cada lâmina serão incubados com anticorpo primário – SC-9168 para marcação das células produtoras de insulina no caso do tecido pancreático, e SC-7782 para marcação das células L no caso do tecido intestinal – , diluídos em PBS + BSA 1%, em titulação pré-estabelecida pelo fornecedor, e deixadas em câmara úmida a 4ºC de 16 a 18 horas e, na seqüência, serão lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes; g) ligação do anticorpo secundário: os cortes serão incubados com o anticorpo secundário, conjugado com biotina do Kit Dako EnVision no caso do tecido pancreático e do Kit Dako LSAB no caso do tecido intestinal, por 30 minutos a temperatura ambiente, em câmara úmida. Após a incubação, as lâminas serão lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes e novamente incubadas com a solução de amplificação (estreptavidina conjugada com peroxidase) do Kit Dako por 30 minutos e, em seguida, serão lavadas com tampão PBS, pH 7,4 por três vezes; h) revelação: os cortes serão cobertos com solução de cromógeno 3,3’diaminobenzidina (DAB líquido) por 15 minutos e, seguida, lavados em água destilada; 43 i) bloqueio da dupla marcação: os cortes dos tecidos pancreático e intestinal serão cobertos com a solução de bloqueio de dupla marcação por 3 minutos e, em seguida, serão lavados com tampão PBS e cobertos com a solução de bloqueio de enzimas endógenas do Kit Dako EnVision, novamente lavados com tampão PBS; j) incubação do segundo anticorpo primário: os cortes histológicos de cada lâmina dos tecidos pancreático e intestinal serão incubados com o segundo anticorpo primário – M7248-1, para avaliar as células em proliferação – , diluídos em PBS + BSA 1%, em titulação pré-estabelecida pelo fornecedor, e deixadas em câmara úmida a 4ºC de 16 a 18 horas e, na seqüência, serão lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes; k) ligação do segundo anticorpo secundário: os cortes de ambos os tecidos pancreático e intestinal serão incubados com o segundo anticorpo secundário, conjugado do kit Dako EnVision por 30 minutos a temperatura ambiente em câmara úmida. Após a incubação, as lâminas serão lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes e novamente incubadas com a solução de amplificação (estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina) do Kit Dako por 30 minutos e, em seguida, serão lavadas com tampão PBS, pH 7,4 por três vezes; l) revelação: os cortes serão cobertos com solução de cromógeno Permanent Red por 20 minutos; m) contracoloração: os cortes serão lavados em água corrente por 5 minutos e, em seguida, contracorados com hematoxilina de Harris por 20 segundos; n) desidratação e montagem: as lâminas serão lavadas em água corrente por 10 minutos, submersas em etanol absoluto 4 vezes e, a seguir, em xilol por 3 vezes e levadas para montagem com lamínula e em meio de montagem Ettelan ® e identificadas. Utilizar-se-ão como controles positivos internos das reações imunohistoquímicas para os respectivos marcadores os cortes histológicos de 44 pâncreas e do íleo terminal de um animal do grupo controle, conforme o caso. Os controles negativos serão obtidos com a omissão do respectivo anticorpo primário em cortes histológicos de lâminas semelhantes. Serão adotados como padrões de positividade, no estudo do tecido pancreático, o aparecimento de coloração marrom acastanhada, para o primeiro anticorpo, corado com o cromógeno DAB+, e vermelha, para o segundo anticorpo, corado com o cromógeno Permanent Red. Será adotado como padrão de positividade, no estudo do tecido intestinal, o aparecimento de coloração marrom acastanhada. A imunoexpressão será avaliada utilizando-se representação de imagem por meio de um sistema computadorizado, constituído por microscópio de luz (Carl Zeiss), adaptado a uma câmera de alta resolução (Axio Cam MRC da Carl Zeiss), monitor de vídeo colorido (Samsung). As imagens serão obtidas utilizando-se o programa de análise de imagens AxionVision REL 4.2 da Carl Zeiss. Biologia Molecular – Estudo da expressão relativa dos genes Extração do RNA As amostras de sangue serão homogeneizadas em reagente Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), de acordo com o protocolo do fabricante, para isolamento do RNA total e proteínas. O RNA precipitado será lavado com etanol 70%, para eliminar resíduos de fenol e sal, e solubilizado em água tratada com DEPC. A concentração das amostras de RNA total será determinada por espectrofotometria e a qualidade do mesmo será avaliada através análise em gel de agarose/formaldeído a 1,5%. Reação de Transcriptase Reversa (RT) A síntese do cDNA (DNA complementar) será feita em alíquotas de 1 micrograma do RNA total extraído das amostras do grupo GT, as quais serão incubadas com oligo dT a 65°C por 5 min seguida de incubação a 42ºC por 5 minutos na presença de transcriptase reversa, cloreto de magnésio, DNTP´s e solução tampão, num volume final de 20l de água DEPC, para se obter a 45 primeira fita de cDNA. Assim, o cDNA obtido será estocado a –80°C até a época da realização de análises posteriores. Reação de Polimerase em Cadeia em Tempo Real O cDNA sintetizado na etapa anterior será utilizado como molde na reação de PCR em tempo real nos kits para estudo da apoptose de células beta pancreáticas, desenvolvimento do diabetes mellitus e diferenciação de células-tronco da empresa SABiosciences - QIAGEN. Cada um dos kits analisa, por PCR em tempo real, 84 genes importantes nas vias referidas, totalizando 252 genes que serão estudados pela emissão fluorescente garantida pela presença do agente intercalador fluorescente SYBR GREEN. A listagem detalhada dos genes de cada kit, cujas atividades transcriptivas serão analisadas, segue abaixo. 1 - RT² Profiler™ PCR Array para Apoptose de células beta pancreáticas. TNF Ligand Family: Lta, Tnf, Tnfsf10, Tnfsf12, Cd40lg (Tnfsf5), Faslg (Tnfsf6). TNF Receptor Family: Ltbr, Tnfrsf10b, Tnfrsf11b, Tnfrsf1a, Tnfrsf1b, Tnfrsf5, Tnfrsf6. Bcl-2 Family: Bad (Bbc2), Bag1, Bak1, Bax, Bcl2, Bcl2a1, Bcl2l1, Bcl2l2, Bcl2l11, Bclaf1, Bid, Bid3 (Hrk), Bik, Bnip1, Bnip2, Bnip3, Bok, Mcl1. Caspase Family: Casp1, Casp2, Casp3, Casp6, Casp7, Casp8, Casp8ap2, Casp9, Casp4 (Casp11), Casp12, Casp14. IAP Family: Birc1b, Birc3, Birc4, Birc5. TRAF Family: Traf1, Traf2, Traf3, Traf4. CARD Family: 46 Apaf1, Bcl10, Birc3, Birc4, Card6, Card10, Casp1, Casp2, Casp9, Casp4 (Casp11), Cradd, Nol3, Pycard (Asc), Ripk2. Death Domain Family: Cradd, Dapk1, Fadd, Tnfrsf6, Tnfrsf10b (TRAIL-R), Tnfrsf11b, Tnfrsf1a, Tradd. Death Effector Domain Family: Casp8, Cflar (Cash), Fadd. CIDE Domain Family: Cidea, Cideb, Dffa, Dffb. p53 and DNA Damage-Induced Apoptosis: Apaf1, Bad (Bbc2), Bax, Bcl2, Bcl2l1, Bid, Casp3, Casp6, Casp7, Casp9, Gadd45a, Tp53 (p53), Trp53bp2, Trp63, Trp73. Anti-Apoptosis: Api5, Aven, Bag1, Bcl2, Bcl2l1, Bcl2l2, Birc1b, Birc3, Birc4, Birc5, Bnip1, Bnip2, Bnip3, Casp2, Cflar, Dad1, Faim, Il10, Lhx4, Mapk8ip, Mcl1, Nfkb1, Polb, Prdx2, Prlr, Prok2, Sphk2, Tnf, Tnfrsf6, Cd40lg (Tnfsf5). 2 - RT² Profiler™ PCR Array para Diabetes mellitus. Receptors, Transporters & Channels: Adra1a, Adrb3, Aqp2, Ccr2, Cd28, Ceacam1, Ctla4, Gcgr, Glp1r, Icam1, Il4ra, Nsf, Rab4a, Sell (LECAM-1), Slc2a4 (GLUT4), Slc14a2, Snap23, Snap25, Stx4a, Stxbp1, Stxbp2, Stxbp4, Tnfrsf1a, Tnfrsf1b, Vamp2, Vamp3, Vapa. Nuclear Receptors: Ppara, Pparg. Metabolic Enzymes: Ace, Acly, Parp1 (Adprt), Dpp4, Enpp1, Fbp1, G6pc, Gck, Gpd1, Gsk3b, Hmox1, Ide, Nos3, Pygl, Sod2. Secreted Factors: 47 Agt, Ccl5 (Rantes), Gcg, Ifng, Il6, Il10, Il12b, Ins1, Retn, Tgfb1, Tnf, Vegfa. Signal Transduction: Akt2, Dusp4, Igfbp5, Ikbkb (IKKbeta), Inppl1 (SHIP2), Irs1, Irs2, Mapk8 (JNK1), Mapk14 (p38 MAPK), Pik3cd, Pik3r1, Ptpn1 (PTP-1B), Trib3 (Skip3). Transcription Factors: Cebpa, Foxc2, Foxg1, Hnf4a, Foxp3 (LOC317382), Neurod1, Nfkb1, Nrf1, Pdx1 (Ipf1), Ppargc1a, Srebf1, Tcf2 (HNF1b), Titf1. Others: Serpine1 (PAI-1), Ucp2. 3 - RT² Profiler™ PCR Array para Células-tronco. Stem Cell Specific Markers: Cell Cycle Regulators: Apc, Axin1, Ccna2, Ccnd1, Ccnd2, Ccne1, Cdc2a, Cdc42, Ep300, Fgf1, Fgf2, Fgf3, Fgf4, Myc, Notch2, Pard6a, Rb1. Chromosome and Chromatin Modulators: Gcn5l2, Hdac1, Hdac2, Myst1, Myst2, Rb1, Tert. Genes Regulating Symmetric/Asymmetric Cell Division: Dhh, Ihh, Notch1, Notch2, Numb, Pard6a. Self-Renewal Markers: Hspa9a, Myst1, Myst2, Neurog2, RGD1565646 (Sox2). Cytokines and Growth Factors: Bmp1, Bmp2, Bmp3, Cxcl12, Fgf1, Fgf2, Fgf3, Fgf4, Igf1, Jag1, LOC306312 (Gdf2), RGD1564178 (Gdf3). Genes Regulating Cell-Cell Communication: Dhh, Dll1, Gja1, Gjb1, Jag1. Cell Adhesion Molecules: Agc1, Apc, Bglap2, Cd4, Cd44, Cdh1, Cdh2, Catna1 (Ctnna1), Cxcl12, Ncam1. Metabolic Markers: Abcg2, Aldh1a1, Aldh2, Fgfr1. 48 Stem Cell Differentiation Markers: Embryonic Cell Lineage Markers: Actc1, Ascl2, Foxa2, Isl1, Ka15 (Krt15), Msx1, Myod1, Pdx1 (Ipf1), T. Hematopoietic Cell Lineage Markers: Cd19, Cd3d, Cd3e, Cd4, Cd8a, Cd8b, Mme. Mesenchymal Cell Lineage Markers: Agc1, Alpi, Bglap2, Col1a1, Col2a1, Col9a1, Pparg. Neural Cell Lineage Markers: Cd44, Ncam1, Oprs1, S100b, Tubb3. Signaling Pathways Important for Stem Cell Maintenance: Notch Pathway: Dll1, Dll3, Dtx2, Dvl1, Ep300, Gcn5l2, Hdac1, Hdac2, Jag1, Notch1, Notch2, Numb. Wnt Pathway: Adar, Apc, Axin1, Btrc, Ccnd1, Fzd1, Myc, Ppard, Wnt1. Parâmetros de Estudo Peso Corporal: tão logo se inicie o ciclo claro, o peso de cada animal de cada um dos quatro grupos (GT, GS, GC1 e GC2) será aferido em balança de precisão e devidamente anotado em gramas (P1, P2, P3, .., P32). Consumo de Ração: todos os animais receberão diuturnamente ração em quantidade conhecida e suficiente para as suas necessidades diárias; três vezes por semana, a ração não ingerida será pesada em balança apropriada e, por meio da diferença entre o que foi fornecido e a sobra de ração, será calculado o consumo alimentar diário. Composição Corporal: no dia da eutanásia serão coletados e pesados em balança de precisão os depósitos de gordura peri-epididimal e retroperitoneal de todos os animais de cada grupo; o índice de adiposidade será calculado através de proporção, considerando-se o peso corporal de cada animal. 49 Exames Bioquímicos: serão feitas, em todos os animais, as determinações séricas de glicose (GLI), insulina (INS), assim como de glucagon-like peptide-1 (GLP-1), peptídeo C (PTC) e hemoglobina glicada (HBG), nas ocasiões do início do procedimento (12ª semana de vida), da cirurgia (20ª semana de vida) e da eutanásia (28ª semana de vida), denominados, respectivamente, tempos 1, 2 e 3. Resistência Insulínica: será feito o cálculo da resistência insulínica (RI) pelo teste indireto HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment Insulin Resistance), calculado pelo produto da insulina sérica (mU/mL), da glicemia (mg/mL) e da constante 0,05551, dividido por 22,5; nos tempos 1, 2 e 3, anteriormente enunciados. Teste de Tolerância à Insulina (TTI): será realizado em todos os animais do procedimento experimental, na ocasião do início do mesmo, da cirurgia e da eutanásia, ditos tempos 1, 2 e 3; a velocidade de desaparecimento da glicose será calculada pela fórmula In2/t1/2; o t1/2 da glicose será calculado a partir da inclinação da curva de regressão mínima durante a fase linear de declínio da concentração plasmática de glicose, com a utilização do software PRISMA. Determinação dos níveis de expressão relativa dos genes de interesse - Apoptose Celular, Diabetes Mellitus e Diferenciação de Células Tronco: As reações serão analisadas pelo software do equipamento de PCR em tempo real criado pela PE Applied Biosystems, Abi Prism 7000 Sequence Detection System version 1.6. Durante a reação, a fluorescência aumenta a cada novo ciclo de PCR e atinge um limiar (threshold), no qual todas as amostras podem ser comparadas. Este limiar corresponde ao momento utilizado para análise da fluorescência. Este é um momento que é definido pelo pesquisador e obrigatoriamente deve estar na faixa em que a quantidade de fluorescência gerada pela amplificação das amostras torna-se significativamente maior que a fluorescência de base (background). 50 O limiar é definido na fase exponencial da reação de PCR, quando a quantidade de produto formada traduz de forma satisfatória a concentração inicial de fitas molde (cDNA) amplificadas pela reação. O ciclo exato no qual o limiar de fluorescência é definido denomina-se ciclo limiar (Ct: threshold cycle). Amostras mais concentradas (com maior número de fitas molde iniciais) atingem o limiar mais precocemente e mostram valores de Ct mais baixos. Quando a eficiência da reação de PCR está próxima de 100%, o número de cópias geradas aumenta de forma exponencial, dobrando a cada ciclo da reação. O número de fitas-molde iniciais pode ser calculado a partir do Ct. Assim a equação Nf=No(1+E)n descreve a amplificação exponencial da PCR, onde “Nf” é o número de fitas-molde em um determinado ciclo da reação, “No” é o número de fitas-molde inicial, “E” é a eficiência de amplificação da reação e “n” é o número de ciclos. Considerando que a eficiência da reação seja de 100% (log E=1) e que “n” seja um ponto escolhido da amplificação idêntico, a todas as amostras, poderemos obter o número de fitas-molde presentes no início da reação, com a equação: N0=Nfx2-Ct. A análise da expressão gênica por meio de PCR em tempo real usado na presente proposta, representa uma quantificação relativa dos genes de interesse, uma vez que requer um controle endógeno, ou seja, um gene cuja expressão não apresente variação estatisticamente significativa entre as amostras analisadas. A quantificação relativa por PCR em tempo real para uma determinada amostra é dada pela relação do Ct do gene de interesse (i) e o Ct do controle endógeno (e). Assim temos: Nfi=Noi x 2-Cti (gene de interesse) Nfe=Noe x 2-Cte (gene endógeno) Sendo que Nfi/Nfe é a quantidade normalizada de moléculas do gene de interesse em relação ao número de moléculas do controle endógeno que 51 iremos chamar de X e Nfe e Nfi uma constante que nomeamos por K, a equação fica: X=K.2-Ct A quantificação relativa da expressão gênica é usada para descrever mudanças na expressão de um gene de interesse em um grupo de amostras em relação a um grupo de referência. Neste trabalho utilizamos uma amostra de células HB4a. Assim o valor de X é medido em duas diferentes condições, logo dividimos a condição A pela condição B e obtemos 2-Ct , como mostra a equação a seguir: =2-Ct = Xa Kx2-Cta Xb Kx2-Cta Análise Histopatológica – Interpretações em Microscopia Óptica e Imunohistoquímica: Tecido Pancreático: As lâminas coradas pelo método de hematoxilina-eosina serão para análise morfométrica do pâncreas, com a mensuração da área das ilhotas de Langerhans e a contagem total de células das ilhotas. Com a dupla marcação pela imunohistoquímica será realizada a contagem das células produtoras de insulina e daquelas em proliferação. As imagens dos cortes histológicos do pâncreas serão digitalizadas e analisadas com o software Image J. Serão realizadas medidas do tamanho de tecido pancreático total analisado em cada rato, que corresponde a todos os campos captados em aumento de 400 vezes no maior diâmetro de corte de tecido obtido; posteriormente, serão separadas as ilhotas captadas destes campos para que sejam efetuadas sua contagem e medição de sua área. Será estabelecida uma relação entre a área total de ilhotas e a área total de tecido 52 pancreático medida. Calcular-se-á a medida média da área das ilhotas e o número médio de ilhotas. Em cada ilhota de Langerhans, será feita a seguinte contagem: células marcadas para insulina; células não-marcadas; células em proliferação; e células em proliferação marcadas para insulina, concomitantemente. Estabelecer-se-á o valor relativo entre células marcadas, não marcadas, em proliferação e as células marcadas e que proliferam. Tecido Intestinal: Através da coloração com hematoxilina-eosina, será feita análise microscópica global das células da mucosa intestinal, quanto às diferenças de forma, estrutura, tamanho e número. Serão realizadas contagem do número de vilosidade e criptas, e medida de altura de 10 vilosidades e de 10 criptas de cada segmento intestinal, estabelecendo-se uma proporção entre si. A espessura total da parede também será mensurada. A identificação das células êntero-endócrinas relacionadas ao hormônio GLP-1 (células L) será feita pela imunihistoquímica, avaliando-as em relação à sua estrutura, forma, tamanho e número. Proceder-se-á à contagem e avaliação das características gerais das células L. Posteriormente, será determinada sua densidade, pela relação entre o número de células L e área de tecido mucoso (criptas e vilosidades) estudado. Com a dupla marcação pela imunohistoquímica será realizada também a contagem das células L em proliferação. Análise Estatística As variáveis serão resumidas por grupo de estudo pelas estatísticas descritivas pertinentes: freqüência absoluta (n) e relativa (%) ou média, desvio padrão (d.p.), mediana e valores mínimo e máximo. Os dados serão analisados por testes paramétricos ou não paramétricos dependo da distribuição encontrada. Na presença de distribuição normal dos dados, será aplicada a técnica de análise de variância com dois fatores fixos: grupos (com 4 níveis: GT, GS, GC1 e GC2) , avaliação com 3 níveis Semana 12 (S12), Semana 20 53 (S20) e Semana 28 (S28). Para as variáveis avaliadas semanalmente, a avaliação terá 16 níveis de acordo com a semana (Semana 1(S12); Semana 2(S13), ..., Semana 28(S16)). Caso contrário será aplicado o Teste de MannWhitney para comparar as técnicas dentro de cada avaliação e o Teste de Friedman para amostras relacionadas para comparar as avaliações dentro de cada técnica. A presença de associação entre variáveis qualitativas será avaliada pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. O nível de significância a ser adotado será de 0,05 ( = 5%) e níveis descritivos (p) inferiores a esse valor serão considerados significantes. 54 6. CRONOGRAMA Tempo 06/10-02/11 03/11-06/11 XXXXXX 07/11-10/11 11/11-02/12 XXXXXX 03/12-06/12 XXXXXX Pesquisa Bibliográfica XXXXXX Elaboração de Projeto XXXXXX Pré-Teste (Piloto) XXXXXX XXXXXX Coleta de Dados XXXXXX XXXXXX Tabulação de Dados XXXXXX XXXXXX Análise dos Dados XXXXXX XXXXXX Relatório de Pesquisa XXXXXX Conclusão da Pesquisa 55 7. ORÇAMENTO QUADRO GERAL DO ORÇAMENTO Aquisição e Manutenção dos Animais R$ 24.000,00 Dosagens Bioquímicas R$ 64.955,00 Anatomia Patológica R$ 31.481,00 Procedimentos e Materiais Cirúrgicos R$ 6.736,00 Custos Diversos R$ 4.500,00 ............................................................................................................................... Material de Consumo R$ 127.172,00 Serviços de Terceiros R$ 4.500,00 Total R$ 131.642,00 DETALHAMENTO DO ORÇAMENTO Aquisição e Manutenção dos Animais Animais R$ 5,00 Wistar 2-BAW 40 R$ 200,00 Albergue R$ 100,00 Sala / Mês 04 R$ 400,00 Dieta Experimental R$ 100,00 Kg 200 Kg R$ 20.000,00 Dieta Padrão R$ 85,00 Kg 40 Kg R$ 3.400,00 Subtotal R$ 24.000,00 Dosagens Bioquímicas Glucagon-Like Peptide - 1 R$ 6.370,00 Kit para 70 testes 03 R$ 19.110,00 Insulina Sérica R$ 5.150,00 Kit para 70 testes 03 R$ 15.450,00 Peptídeo C R$ 6.300,00 Kit para 70 testes 03 R$ 18.900,00 Hemoglobina Glicada R$ 2.000,00 Kit para 40 testes 05 R$ 10.000,00 Glicose Sérica R$ 55,00 Kit para 30 testes 05 R$ 275,00 Glicosímetro R$ 100,00 Aparelho 01 R$ 100,00 Fitas para Glicemia R$ 80,00 Caixa com 50 uni 14 R$ 1.120,00 Subtotal R$ 64.955,00 56 Anatomia Patológica Material Histologia R$ 1.500,00 Lâmina Processada R$ 50,00 R$ 1.500,00 8 lâminas / animal 320 R$ 16.000,00 R$ 1.750,00 02 R$ 3.500,00 R$ 1.750,00 02 R$ 3.500,00 R$ 2.290,50 02 R$ 4.581,00 R$ 1.200,00 02 R$ 2.400,00 Subtotal R$ 31.481,00 Monoclonal Mouse Anti-Rat Ki67 antigen Clone MIB-5 Código do produto: M7248-1 Marca: Dako Fornecedor: Biogen Comercial e Distribuidora Ltda Anticorpo monoclonal de cam anti GLP-1 reage com Hu, Rat e Mouse Cód. Produto: AB26278 Marca: ABCAM Fornecedor: Biogen Comercial e Distribuidora Ltda EnVision" G|2 Doublestain System, Rb/Mo (DAB+/Permanent Red) Código do produto: K5361-1 Marca: Dako Fornecedor: Biogen Comercial e Distribuidora Ltda Anticorpo Policlonal H-86:SC9168 da marcação de células produtoras de insulina, do tipo policlonal de coelho, Código H86: SC-9168, da empresa Santa Cruz Biotechnology. Procedimentos e Materiais Cirúrgicos Anestésico Zoletil R$ 60,00 12 R$ 720,00 Anestésico Fentanil R$ 10,00 20 R$ 200,00 Analgésico Dipirona R$ 2,00 05 R$ 10,00 Instrumental Cirúrgico R$ 750,00 Pinças Diversas Macro e Micro R$ 750,00 Fio cirúrgico - Vicryl 4-0 R$ 352,00 Caixa com 36 uni 02 R$ 704,00 Fio cirúrgico - Prolene 7-0 R$ 784,00 Caixa com 24 uni 03 R$ 2.352,00 Material de Consumo R$ 50,00 por procedimento 40 R$ 2.000,00 Subtotal R$ 6.736,00 57 Custos Diversos Análise estatística Gráfica Apoio técnico R$ 1.500,00 Assessoria Especializada R$ 1.500,00 R$ 100,00 por tese 10 R$ 1.000,00 R$ 2.000,00 Assessoria Especializada R$ 2.000,00 Subtotal R$ 4.500,00 TOTAL GERAL DE CUSTOS = R$ 131.642,00 58 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Ogden CL, Fryar CD, Carroll MD, Flegal KM. Mean body weight, height, and body mass index, United States 1960–2002. CDC National Center for Health Statistics, 2004, Number 347. 2. Flegal KM, Carroll MD, Ogden CL, Johnson CL. 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