Slides da palestra.

"O desenvolvimento de biopesticidas à base de toxinas de
Bacillus thuringiensis para a saúde".
Mario Soberón, e Alejandra Bravo
Instituto de Biotecnologia UNAM
[email protected]
[email protected]
Bacillus thuringiensis
Cry toxina
esporo
As proteínas inseticidas Cry e Cyt
são altamente específicas para os insetos,
são inofensivas para os seres humanos e
biodegradáveis
Proteínas inseticidas Cry e Cyt de Bacillus thuringiensis (Bt)
Cry1
Cry9
Lepidoptera
(mariposas)
Cry
Cry3
Cry7
Cry8
Cry4
Cry19
Cry29
Cry30
Cry40
Coleoptera
(besouros)
Cyt1
Cyt2
Nematoides
Cry11
Cyt
Diptera
(mosquitos)
Bacillus thuringiensis israelensis
Bti
Toxina
Cry4A
Cry4B
Cry11A
Cyt1A
Bti Crystal
130
LC50 (ng/ml)
1125
467
224
1209
10
kDa
70
Atividade sinérgica
Cyt1A é específica contra os mosquitos
Cyt1A é responsável de sinergismo com Cry
Como estas toxinas matam os insetos?
Qual é o mecanismo de sinergismo entre eles?
27
Proposta do modo de ação da toxina Cry11Aa mosquitocida
Protoxin crystal
1
Protease
Monomeric
Cry toxin
5
3
6
2
4
ALP
Pore
Oligomeric
Cry toxin
Cadherin
Cadherin
Chen et al., 2009. Biochemical Journal 424, 191-200
ALP
Fernandez et al., 2009. Biochemistry 48, 8899-8907
Fernandez et al., 2006. Biochemical Journal 394, 77-84
Como é o mecanismo de ação de Cyt1Aa?
Volvatoxin A2 (VVA2) do fungo Volvariella volvacea
é similar à toxina Cyt1A
VVA2 é uma toxina formadora de poros.
É proposto que o N-terminal está envolvido na
oligomerização e o C-terminal na inserção da membrana
para formar a poro
Dada a elevada semelhança estrutural com a toxina Cyt1A
de Bt, é proposto que Cyt1Aa pode ter um mecanismo de
formação de poros e de oligomerização semelhante ao da
VVA
Weng et al 2003 JBC
Lin et al 2004 NSRRC
PCR strategy
kDa
C-terminal
N-terminal
Cyt1Aa
C-terminal
N-terminal
Cyt1Aa
Domínios N e C terminais da toxina Cyt1Aa
kDa
N-terminal 18.9 kDa
C-terminal 8.8 kDa
25
Cyt1Aa 23 kDa
25
20
20
15
15
Silver staining
Western blot
a-Cyt1A
Rodriguez-Almazan et al 2010 Biochemistry
N-terminal induz oligomerização de Cyt1Aa em solução
Soluble Cyt1Aa protoxin + SUV liposomes (PC/Ch/S) + proteinase K
N-terminal induz a agregação de Cyt1Aa em solução, sem membrana
Rodriguez-Almazan et al 2010 Biochemistry
Domínio C-terminal interage com a membrana
Ligação à membrana
Ensaio de liberação de calceína dos lipossomas
c
3
c
20
2
%of Calcein released
AUF
+
d
1
15
b
0
300
10
100
200
Time (sec)
5
a
a
a
0
Control Cyt1Aa
No-toxin 100 nM
S, supernatant
P, Membrane pellet
Cyt1Aa
200 nM
N-terminalN-terminalC-terminal C-terminal
100 nM 200 nM
100 nM 200 nM
Homologous competition
C-terminal é capaz de associar-se com a membrana e competir com a interação de Cyt1Aa aos
lipossomas
C-terminal afeta a permeabilidade da membrana
Rodriguez-Almazan et al 2010 Biochemistry
Efecto de N-terminal o C- terminal nas atividades hemolítica e inseticida de Cyt1Aa
Toxina Cyt1Aa
a
a
80
% hemolysis
80
Cyt1Aa toxin
60
40
X
20
0
C-terminal
N-terminal
P-20
x
x
c
aa
a
80
60
60
b
50
50
40
40
d
30
30
20
20
0
a
a
70
70
b
b
0 20 40 60 80 100 120 140
Cyt1Aa EC50 : 48 ng/ml
Cyt1Aa é hemolítica
os domínios N-e C-terminais, não são
a
a
10
Protein (ng/ml)
mistura com
P-20
mistura com
Domínio C-terminal
% mortality
100
mistura com
Domínio N-terminal
1
1:0.5
b
1:1
1:10
Ratio Cyt1Aa:Fragment
N-terminal pode inibir a hemólise Cyt1Aa
C-terminal mostram baixa inibição da atividade hemolitica
P-20 não inibiu a hemólise de Cyt1Aa
c
d
10
0
e
1
1:0.1
1:0.5
1.1
1:10
Ratio Cyt1Aa:Fragment
Bioassays against Aedes aegypti larvae
e também a toxicidade inseticida
mas não inibiu a toxicidade
e não inibiu a toxicidade
Domínio C-terminal de Cyt1Aa está envolvido na inserção na membrana
Domínio N-terminal de Cyt1Aa induz a agregação da toxina em solução e inibe a ação da
Cyt1Aa com um fenótipo dominante negativo
Cyt1Aa forma estruturas oligoméricas de elevado peso molecular, quando são ativados na
presença de lipossomas.
= Os efeitos Dominante negativos do domínio N-terminal de Cyt1A
poderia ser utilizado como um anti-toxina para proteger a alguns organismos
que não querem ser afetados em ambientes particulares
Qual é o mecanismo de sinergismo entre eles?
Hipótese:
O sinergismo entre Cyt1Aa e Cry11Aa
sugere que estas duas proteínas interagem umas com as outras
P1
P2
Sistema de dos híbridos
Análisis de unión a un arreglo de péptidos sintéticos
Pérez et al PNAS 2005
Perez et al Cell. Microbiol. 2007
Interação Cyt1A-Cry11A determina sinergismo
A sinergia entre a Cyt1A e Cry11A
ELISA binding
40
35
0.7
30
0.5
25
SF 20
0.3
15
10
0.1
5
0
Kd (nM) =
0.4 4
1.2
Competitive ELISA assays
0.3 1.5
4
30
Pérez, et al. 2005 PNAS
Cry11A forma estruturas oligoméricas
quando ele é ativado na presença de Cyt1Aa
3 mg of Cry11A
+ Ae midgut juice proteases
Cry11Aa
Cyt1A-Protoxin
Cyt1A-Toxin
- + - - - + -
-
+ - +
mg Cyt1A
0.1 0.5 1.0 2.0 3.0. 4.0 6.0
200 kDa
kDa
250
150
100
75
75 kDa
50 kDa
50
36
1 min
2 hr
Western blot using anti-Cry11A antibody
Cyt1A induz a formação de oligomeros do Cry11A
Perez et al Cell. Microbiol. 2007
Cry11Aa
Cry11Aa
Cyt1Aa
P1
P2
1.- Cyt1Aa liga-se com Cry11Aa = induz oligomerização de Cry11Aa
2.- Oligomeros de Cry11Aa se inserem na membrana e matam as larvas
Bti é uma bactéria patogênica altamente eficaz
porque produz toxinas Cry mosquitocidas e também o seu receptor funcional,
no mesmo pacote
A dengue é uma doença endêmica transmitida pelo mosquito Aedes aegypti
Aedes aegypti
A cada ano ocorrem cerca de 390 milhões de infecções por vírus da dengue.
- Maior expansão dos vetores para áreas urbanas por causa do aumento do número de criadouros
gerados pela atividade humana,
- Alta deficiência em saneamento,
-Baixa eficácia dos programas de controle de vetores
-Resistência do mosquito a estes tratamentos
Samir Bhatt et al. Nature 2013
Na América Latina, os países com o maior número de casos sao Brasil (66,11%),
México (26,28%), Venezuela (5,48%) e Argentina (2,03%).
Isolamento de estirpes de Bt de solos mexicanos
Nós selecionamos estirpes de Bt altamente
eficazes contra mosquitos
A formulação de um produto Bt eficaz contra mosquitos
1.
2.
3.
4.
5.
Não-tóxicos para os seres humanos
Matar todas as larvas dentro de 24 h
Estável por um mês
Para o uso em recipientes com alta troca de água
Remanescente na superfície da água
Este é um Produto baseado nas toxinas Cry do
Bt, altamente eficaz, que pode ser utilizado em
áreas rurais
A formulação larvicida
Processo de produção da substância ativa em
fermentadores 500L. Existe um protótipo de um
produto como grânulos flutuantes que não se dissolve
em água
A formulação larvicida foi provada no campo em duas
entidades, mostrando uma eficácia, durabilidade e
resistência a troca de água similar do inseticida
químico usado em campanhas de saúde.
Registro sanitário concedido pela COFEPRIS.
Testes de campo com o produto formulado
Tetiz Yucatan
Chiconcuac Morelos