EXTG01 - Biometrix

EXTG01
KIT EXTRAÇÃO DE DNA+RNA PARA AMOSTRAS NÃO CELULARES
- EXTRAGEN
1) USO PRETENDIDO
O produto <<EXTRAGEN>> é um sistema de extração de DNA e RNA para partículas virais livres
contidas em amostras não celulares, como plasma coletado em EDTA, soro, Fluido Cérebro-espinhal,
fluido amniótico, urina, e sobrenadantes como: gargarejos, swabs faríngeos e nasais, leite materno e
cultivo celular e de fezes.
O produto tem como intenção de uso a extração de DNA e RNA de não celulares. A extração de
DNA e RNA deve ser usada para diagnósticos através de testes de amplificação de ácidos nucléicos com
a DNA polimerase (como a transcriptase reversa e a DNA polimerase termoestável).
2) DESCRIÇÃO DO PRODUTO
<<EXTRAgen>> É um kit para a extração de DNA e RNA baseado na lise por Guanidina.
O procedimento envolve 4 fases:
-Lise da amostra (aproximadamente 15 minutos) em um reagente de extração com um agente
caotrópico (Hidrocloreto de Guanidina), um detergente (CTAB) e um agente redutor (2mercaptoetanol):
-Precipitação de proteínas por alta temperatura, separação realizada por centrifugação e
remoção (aproximadamente 30 minutos),
-Precipitação de ácidos nucleicos com etanol e um co-precipitante inerte (poliacrilamida
linear) com recuperação feita por centrifugação (aproximadamente 15 minutos)
-Lavagem do pellet de ácidos nucleicos e diluição do pellet em água ultrapura
(aproximadamente 30 minutos).
O <<EXTRAgen>> sistema de extração é uma tecnologia pertencente à Nanogen Advanced
Diagnostic S.r.I. e sob a patente n° 1308663.
3) MATERIAIS FORNECIDOS NO KIT
O kit contém os seguintes componentes:
-O reagente EXTRAgen para extração, aliquotado em 50 microtubos prontos para uso, cada
microtubo contém 800uL de solução,
-Tubos de precipitação, 50 microtubos vazios para biologia Molecular, com capacidade para 2,0
mL.
-O Reagente de lavagem, frasco contendo 15mL de solução que deve ser reconstituído com
45mL de etanol absoluto.
-Água ultrapura, 2 frascos contendo 1,9mL de água ultrapura para Biologia Molecular.
O kit permite a extração de até 50 amostras, incluindo controles positivo e negativo.
Componente
Reagente
EXTRAgen
Microtubos de
precipitação
Descrição
Quantidade
Microtubos de 1,5mL
prontos para uso
50 X 800uL
Microtubos de 2,0mL,
vazios para Biologia
molecular
50
Composição
Hidrocloreto de Guanidina, CTAB,
2-mercaptoetanol, cloreto de
sódio, acetato de sódio, ácido
acético, Poliacrilamida linear
Marcação
-
-
-
1
Reagente de
lavagem
Solução de lavagem,
deve ser reconstituída
com 45mL de etanol
absoluto
Água ultrapura
Água para Biologia
Molecular
15mL
-
2 X 1,9 mL
_
_
Armazenar entre 2 e 8°C.
4) MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS NO KIT
-Etanol absoluto (extra puro específico para analise, ACS equivalente)
-Câmara de fluxo laminar
-Luvas descartáveis livre de talco ou similar,
-Microtubos esterilizados de 1,5mL
-Tubos tipo FALCON de 50mL
-Agitador tipo vortex
-Microcentrífuga de mesa (12.000 a 14.000 RPM)
-Micropipetas e ponteiras com filtros ou de dispensação positiva (2-20uL, 5-50uL, 50-200uL,
200-1000uL.
-Bloco seco para incubação á 80°C para acomodação de microtubos de 1,5mL.
5) ACESSÓRIOS
O reagente para extração de controle positivo não esta incluso no kit. Para a performance
analítica deste procedimento, os seguintes produtos da Nanogen Advanced Diagnostics S.r.I. são
recomendados.
<<CPE - DNA®- controle interno>> (código CTREXTG), controle positivo para extração de DNA
de amostras não celulares, sistema de extração de DNA, permite a extração de até 50 amostras.
<<CPE-RNA® - controle interno>> (código CTRRNA ou incluso em RECK>> código RK 100) fago
controle positivo de RNA sistema de extração de amostras não celulares, o produto permite 50
extrações.
6) ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
Este kit é para uso exclusivo “in vitro”.
Cuidados e precauções especiais:
Manusear e descartar toda amostra biológica como se esta fosse capaz de transmitir agentes
infecciosos. Evitar contato direto com a amostra biológica. Evitar respingos e aerossóis. O material que
entrar em contato com as amostras biológicas deve ser tratado com hipoclorito de sódio 3% ou
autoclavado á 121°C por uma hora e despois descarta-lo.
Manusear todo reagente e todo material usado no ensaio como se o mesmo fosse capaz de
transmitir agentes infecciosos. Evitar contato direto com os reagentes. Evitar respingos e aerossóis. O
lixo deve ser tratado e descartado em concordância com os padrões apropriados de segurança.
Materiais descartáveis combustíveis devem ser incinerados. Lixos que contenham líquidos ácidos ou
alcalinos devem ser neutralizados e depois descartados.
Usar roupas protetoras, luvas, óculos e proteção para o rosto.
Nunca pipetar soluções com a boca,
Não comer, beber, fumar e aplicar cosméticos nos locais de trabalho,
Lavar as mãos com cuidado depois de manusear amostras e reagentes,
Descartar lixo e reagentes conforme regulamentações vigentes.
Seguir a regulamentações do kit enquanto correr o teste.
Não usar o kit após a data de expiração,
Somente usar os reagentes inclusos no kit ou os recomendados pelo fabricante,
Não misturar reagentes de lotes diferentes,
Não usar reagentes de kits produzidos por outros fabricantes.
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Cuidados e precauções em Biologia Molecular:
Procedimentos de biologia molecular, como extração, transcrição reversa, amplificação e
detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal treinado e qualificado para evitar-se liberação de
resultados errôneos, especialmente devido à degradação de ácidos nucleicos contido nas amostras ou
devido à contaminação das amostras por outros produtos de amplificação.
São necessárias áreas separadas para extração / preparação de reações de amplificação e
amplificação / detecção de amplificação. Nunca colocar produtos de amplificação na área de extração
/preparação de reações de amplificação.
É necessário existirem jalecos, luvas e ferramentas exclusivas para a área de extração /
preparação de reações de amplificação / detecção de produtos de amplificação. Nunca transferir
jalecos, luvas e ferramentas da área designada para amplificação / detecção de produtos de
amplificação para as áreas designadas para extração / preparação de reações de amplificação.
As amostras devem ser usadas para exclusivamente este tipo de análise. Amostras devem ser
manuseadas dentro da câmara de fluxo laminar. Os tubos contendo as amostras nunca devem ser
abertos ao mesmo tempo. Pipetas usadas para manusear amostras devem ser exclusivas para este
propósito. É necessário o uso de pipetas de dispensação positiva ou ponteiras contendo filtros. As
ponteiras devem ser esterilizadas, livres de DNAses, RNAses, DNA e RNA.
Reagentes devem ser manuseados dentro da câmara de fluxo laminar. Os reagentes requeridos
para amplificação devem ser preparados na sua área e devem ser usados em uma única sessão. As
pipetas usadas para manusear os reagentes devem ser usadas com este único propósito. É necessário o
uso de pipetas de dispensação positiva ou ponteiras contendo filtros. As ponteiras devem ser
esterilizadas, livres de DNAses, RNAses, DNA e RNA.
Os produtos de amplificação devem ser manuseados em sua área para reduzir-se ao máximo a
dispersão dos mesmos pelos ambientes, na intenção de reduzir a s contaminações. Pipetas usadas para
manusear os produtos de amplificação devem ser usadas para este único propósito.
Cuidados e precauções específicas dos componentes:
O reagente EXTRAgen® apresenta as seguintes precauções de segurança:
S23-24/25 não inale gases / fumaças / vapores / aerossóis. Evitar contato com olhos e pele.
7) AMOSTRAS E CONTROLES
Amostras:
Amostras biológicas não celulares podem ser usadas com este kit:
-Plasma coletado em EDTA
-Soro,
-Fluído Cérebro-espinhal
-Fluído amniótico,
Urina,
-Sobrenadante de gargarejo,
-Sobrenadante de swab faríngeo
Sobrenadante de swab nasal,
Sobrenadante de leite materno,
-Sobrenadante de cultivo celular
-Sobrenadante fecal.
As amostras devem ser de fluídos não-celulares, no qual o ácido nucléico está contido dentro
de partículas virais livres.
O volume da amostra para extração deve ser de 300uL. Para volumes menores que 300uL,
adicionar solução fisiológica ou PBS esterilizados suficiente para completar 300uL.
Usuários de testes de amplificação quantitativa, como “Duplex Real Time Amplification” e
“Monoreagent Duplex Real Time Amplification” , são advertidos a notar sempre o volume usado na
extração e o volume de água ultra-pura usado para dissolver o pellet de ácidos nucleicos no sentido de
permitir o calculo da quantidade de alvo analisado.
Os tubos, em que cada amostra é transferida para extração, devem ser claramente
identificados usando-se uma caneta de marcação permanente.
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Para uma conservação ótima das amostras, recomenda-se separar em varias amostras de 300uL
e congela-las a -20°C por até 30 dias ou a -70°C por períodos mais prolongados. Isto evita o
congelamento e descongelamento da amostra.
Quando usar amostras congeladas, descongelar as amostras imediatamente antes do inicio da
sessão de extração, no intuito de evitar a degradação dos ácidos nucléicos.
Substâncias interferentes:
Amostras de Plasma não devem conter heparina já que este é um poderoso inibidor de DNA
Polimerase (como a transcriptase reversa e a DNA Polimerase termoestável) permitindo a liberação de
resultados incorretos ou inválidos nos passos subsequentes á extração de DNA.
As amostras não devem conter Ficoll® ou dextran ou hemoglobina, pois, estes são poderosos
inibidores da enzima DNA Polimerase (como a transcriptase reversa e a DNA polimerase termoestável)
permitindo a liberação de resultados errôneos ou inválidos nos passos subseqüentes da análise,
realizados durante a extração de ácidos nucleicos.
Qualquer efeito inibidor causado por drogas devem ser devidos a presença dos mesmos na
amostra inicial, devem ser avaliadas cada vez que usadas, de acordo com a intenção de uso do material
extraído.
Controle de qualidade:
É recomendado validar o procedimento de análise total de cada extração processando uma
amostra negativa e uma amostra positiva.
Para o controle negativo, usar uma amostra negativa que já tenha sido testada para o alvo
analisado ou realizar uma extração de uma amostra de água bidestilada como amostra.
Para o controle positivo, use uma amostra que já tenha sido testada para o alvo ou então uma
amostra referência.
8) PROCEDIMENTO
Reconstituição do Reagente de lavagem:
(Deve ser realizado na área de extração / preparação de reação de amplificação)
Antes de iniciar a extração das amostras, reconstituir o reagente de lavagem adicionando 45 mL de
Etanol absoluto (atentar: Etanol absoluto é inflamável, e não está contido no kit) e 25mL anotando as
alterações na etiqueta do reagente. O reagente de lavagem deve ser mantido de 2 a 8°C por até 1 ano.
9) COLETA, TRANSPORTE, ESTOCAGEM E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
(Deve ser realizado na área de extração / preparação de reação de amplificação)
Atenção: amostras biológicas podem transmitir agentes infecciosos.
Plasma coletado em EDTA:
A amostra de plasma usada para extração de RNA e DNA deve ser coletada em EDTA de acordo
com os procedimentos laboratoriais padrões, transportando á 2° a 8°C e estocadas na mesma
temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira, devem ser estocados congelados a -20°C por 30
dias ou a -70°C por períodos mais longos.
Amostras de plasma não necessitam de pré-tratamentos e devem ser usadas diretamente.
Soro:
A amostra de soro usada para extração de RNA e DNA deve ser coletada de acordo com os
procedimentos laboratoriais padrões, transportando entre 2° e 8°C e estocadas na mesma temperatura
por no máximo 4 horas, de outra maneira, devem ser estocados congelados a -20°C por 30 dias ou a 70°C por períodos mais longos.
Amostras de soro não necessitam de pré-tratamentos e devem ser usadas diretamente.
Fluído Cérebro-espinhal:
A amostra de fluído Cérebro espinhal usada para extração de RNA e DNA deve ser coletada
acordo com os procedimentos laboratoriais padrões impedindo sua contaminação com sangue do
paciente, transportando á 2° a 8°C e estocadas na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de
outra maneira, devem ser estocados congelados a -20°C por 30 dias ou a -70°C por períodos mais
longos.
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Amostras de fluído Cérebro espinhal não necessitam de pré-tratamentos e devem ser usadas
diretamente.
Liquido Amoniótico:
A amostra de plasma usada para extração de RNA e DNA deve ser coletada de acordo com os
procedimentos laboratoriais padrões, impedindo a contaminação com o sangue da mãe, transportando
á 2° a 8°C e estocadas na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira, devem ser
estocados congelados a -20°C por 30 dias ou a -70°C por períodos mais longos.
Amostras de plasma não necessitam de pré-tratamentos e devem ser usadas diretamente.
Urina:
A amostra de Urina usada para extração de RNA e DNA deve ser coletada em frascos livre de
conservantes e de acordo com os procedimentos laboratoriais padrões, transportando á temperatura
ambiente (18°C a 25°C) e estocadas na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira,
devem ser estocados congelados a -20°C por 30 dias ou a -70°C por períodos mais longos. O
congelamento das amostras de urina frequentemente ocasiona a formação de precipitados que podem
causar problemas nos passos subsequentes dos teste. Deve-se utilizar o sobrenadante na extração.
Amostras de urina não necessitam de pré-tratamentos e devem ser usadas diretamente.
Gargarejo:
A amostra de Gargarejo usada para extração de RNA e DNA deve ser coletada de acordo com os
procedimentos laboratoriais padrões em solução fisiológica, transportando á 2° a 8°C e estocadas na
mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira, devem ser estocados congelados a 20°C por 30 dias ou a -70°C por períodos mais longos.
Amostras de Gargarejo não necessitam de pré-tratamentos e devem ser usadas diretamente.
Swabs nasal e faríngeo:
Amostras Swabs nasal e faríngeo que serão utilizados para extração de RNA e DNA devem ser
preparadas de acordo com os procedimentos laboratoriais, diluindo o swab em meio de cultivo celular
ou Solução fisiológica ou PBS esterilizados, transportando á 2° a 8°C e estocadas na mesma
temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira, devem ser estocados congelados a -20°C por 30
dias ou a -70°C por períodos mais longos.
a. Transferir 1mL da amostra de swab nasal ou faríngeo diluído em um microtubo de
centrifugação de 1,5mL,
b. Centrifugar a temperatura ambiente por 1 minuto á 12 000 a 14 000 rpm.
c. Com cuidado retirar 300uL do sobrenadante para a extração. O volume restante de
sobrenadante deve ser estocado a -20°C ou -70°.
Leite materno:
A amostra de leite materno usada para extração de RNA e DNA deve ser coletada de acordo
com os procedimentos laboratoriais padrões, transportando á 2° a 8°C e estocadas na mesma
temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira, devem ser estocados congelados a -20°C por 30
dias ou a -70°C por períodos mais longos.
a. Transferir 1mL do leite materno para um microtubo de centrifugação de 1,5mL,
b. Centrifugar a temperatura ambiente por 10minutos á 12 000 a 14 000 rpm,
c. Com cuidado coletar 300uL da fase liquida para a extração. O restante da fase liquida deve
ser estocado á -20° a -70°C.
Sobrenadante de cultivo celular:
A amostra de cultivo celular usada para extração de RNA e DNA deve ser, transportando á 2° a
8°C e estocadas na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira, devem ser
estocados congelados a -20°C por 30 dias ou a -70°C por períodos mais longos.
Amostras de cultivo celular não necessitam de pré-tratamentos e devem ser usadas diretamente.
Sobrenadante fecal:
A amostra fecal usada para extração de RNA e DNA deve ser coletada de acordo com os
procedimentos laboratoriais padrões, transportando á 2° a 8°C e estocadas na mesma temperatura por
no máximo 4 horas, de outra maneira, devem ser estocados congelados a -20°C por 30 dias ou a -70°C
por períodos mais longos.
a. Em um tubo tipo “FALCON” de 15mL transferir 10mL de solução Fisiológica esterilizada ou
PBS
b. Transferir aproximadamente 1grama de fezes para o tubo contendo os 10mL e agitar por 15
segundos
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c.
d.
e.
f.
Centrifugar a temperatura ambiente por 10 minutos a 2500 a 3000 rpm.
Transferir 1mL do sobrenadante para um microtubo de centrifugação de 1,5mL.
Centrifugar a temperatura ambiente por 10 minutos á 12 000 a 14 000 rpm.
Pegar 300uL do sobrenadante para a extração. O sobrenadante restante deve ser estocado
de -20°C a -70°C.
Preparando a extração:
(deve ser realizado na área de extração / preparação de reações de amplificação)
Antes de iniciar a extração é necessário fazer o seguinte:
-ajustar o bloco seco com bloco para microtubos de centrifugação de 1,5mL para 80°C, esperar
que a temperatura chegue à correta. Se somente um bloco seco com poços cilíndricos esta disponível,
despeje água dentro dos poços para assegurar uma correta transferência de calor,
-Descongelar os tubos de <<CPE RNA® - controle interno>> ou <<CPE DNA® controle
interno>> requisitados para a sessão, relembrando que cada tubo é suficiente para preparar 14
extrações. Agitar gentilmente, centrifugar por 5 segundos para adequar o volume ao fundo do
microtubo e mantê-lo em gelo.
- Pegue um tubo de extração para cada amostra que será analisada, uma para o controle
positivo e outra para o controle negativo, centrifugar por 5 segundos para que o conteúdo esteja
presente no liquido do fundo do microtubo e identifique com caneta de marcação permanente,
-Pegue um mesmo número de testes de precipitação como os de tubos de extração e
identifique-os usando uma caneta de marcação permanente,
-Em um tubo tipo “FALCON” de 50mL (não contido no kit) dispensar uma alíquota de etanol
absoluto (Cuidado: etanol absoluto é inflamável e não esta contido no kit) transferir 1mL de etanol
absoluto para cada amostra a ser analisada, 1 ml para o controle negativo e 1mL do controle positivo,
anotar ainda 1 mL em excesso, marcar o tubo com caneta de marcação permanente.
-Prepara um tubo tipo “FALCON” (não contido no kit) para ser usado como descarte líquido do
procedimento de extração e identifique-o com caneta de marcação permanente.
-Pegue o frasco do reagente de lavagem e certifique0se que o mesmo encontra-se devidamente
reconstituído.
Extração:
(deve ser realizado na área de extração / preparação de reação de extração)
1. Transferir 300uL da amostra (atenção: amostras biológicas podem transmitir agentes
infecciosos) pra o microtubo de extração com o reagente EXTRAgen® , adicionar 10uL de<< CPE
DNA ou CPR RNA – controles internos>> ao microtubo de extração, agitar imediatamente por
inversão algumas vezes e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos,
2. Centrifugar a temperatura ambiente por 5 segundos á 12 000 a 14 000 rpm,
3. Colocar os microtubos testes no bloco seco (cuidado: o bloco seco está quente) e incubar por
10 minutos a 80°C,
4. Centrifugar a temperatura ambiente por 15 minutos á 12 000 a 14 000 rpm,
5. Durante a centrifugação, transferir 900µL de etanol absoluto (cuidado: etanol absoluto é
inflamável) e não esta contido no kit) em um microtubo de centrifugação de 2 mL contido no
kit,
6. Pegue 900uL do sobrenadante do tubo de extração, certificando-se de não drenar com a
ponteira nenhuma proteína precipitada ou lipídeos da superfície ou da parede do microtubo.
Transferir o sobrenadante para o microtubo de precipitação com o etanol absoluto e agitar
imediatamente por inversão 10 vezes.
7. Centrifugar o tubo de precipitação em temperatura ambiente por 10 minutos á 12 000 a 14 000
RPM para coletar o pellet de ácidos nucleicos no fundo do tubo,
Nota: Coloque o microtubo teste na centrífuga com a dobradiça do microtubo voltada para o lado
externo do rotor, isto possibilitará a identificação do pellet que se formará na parede do
microtubo.
8. Remover o sobrenadante despejando com cuidado dentro do tubo “FALCON” de 50mL (Não
contido no kit). Seque as gotas de sobrenadante da borda do tubo de precipitação com papel
absorvente. Não descarte o tubo de 50mL pois o mesmo ainda será usado.
Nota: O pellet de ácidos nucleicos no fundo do microtubo é raramente visível neste passo do
procedimento de extração.
9. Transferir 1mL do reagente de lavagem (já reconstituído) para dentro do microtubo de
precipitação contendo o pellet de ácidos nucleicos e misture por inversão 10 vezes.
10. Centrifugar o microtubo de precipitação á temperatura ambiente por 1 minuto á 12 000 a 14
000 rpm,
6
Nota: Coloque o microtubo teste na centrífuga com a dobradiça do microtubo voltada para o lado
externo do rotor, isto possibilitará a identificação do pellet que se formará na parede do
microtubo.
11. Remover o sobrenadante com o uso de uma pipeta de largo volume, tomando cuidado para não
drenar o pellet de ácidos nucleicos com a ponteira que neste momento é visível no fundo do
microtubo de precipitação. Transferi o sobrenadante para o descarte (tubo falcon de 50mL) ver
ponto 8.
12. Centrifugar o microtubo de precipitação por 5 segundos à temperatura ambiente á 12 000 a 14
000 rpm,
Nota: Coloque o microtubo teste na centrífuga com a dobradiça do microtubo voltada para o lado
externo do rotor, isto possibilitará a identificação do pellet que se formará na parede do microtubo.
13. Remova completamente todo o sobrenadante usando uma pipeta de pequeno volume, cuidando
para não drenar o pellet de ácidos nucleicos com a ponteira. Transferir o sobrenadante
drenado para dentro o descarte (observar ponto 8). Mantenha o tubo de descarte fechado até
que o mesmo seja descartado em um lixo específico.
14. Deixe o tubo secar dentro da câmara de fluxo laminar por no mínimo 5 minutos.
15. Dissolver o pellet de ácido nucleico em um volume apropriado de água ultra-pura, conforme
demonstrado na tabela abaixo:
Ácido
nucleico
Volume de
água ultrapura
Recomendado para
Reação de transcriptase reversa<<RT-Kit Plus>>
RNA
15uL
DNA
15uL
<<Nested Amplification>>
<<Duplex Real Time Amplification>>
DNA
60uL
<<Monoreagent Duplex Real Time PCR>>
Procedimento para dissolver o pellet em água ultrapura:
-Despejar a água ultrapura por meio da parede do microtubo no mesmo lado da dobradiça do
microtubo,
-Deixe o pellet de ácidos nucleicos reidratar em temperatura ambiente por 5 minutos,
-Agite vigorosamente o microtubo para dissolver o pellet do fundo do microtubo ou da parede,
-Centrifugue a temperatura ambiente por 5 segundos para que o ácido nucleico fique no fundo
do microtubo.
Nota: O volume de água ultra-pura recomendado na tabela acima permitem que se tenha o
máximo de sensibilidade nos demais passos do diagnóstico e realizar 2 testes com o mesmo
extraído.
Nota: O ácido nucleico extraído deve ser estocado a -20°C por n o máximo 30 dias ou a -70°C
por um período mais prolongado
Nota:Os ácidos nucleicos extraídos podem contaminar os passos subsequentes do teste.
Adequadamente feche o descarte os ácidos nucleicos residuais e o lixo produzido durante o
procedimento.
10) LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Use apenas amostras humanas com este produto: plasma coletado em EDTA, soro, fluído
cérebro espinal, fluido amniótico, urina, sobrenadantes de : gargarejo, swabs faríngeos, swabs nasais,
leite materno, cultura de células e de fezes.
Não use amostras de plasma coletados em Heparina com este produto. Heparina inibe a DNA
polimerase (como a transcriptase reversa e a DNA polimerase termoestável) e pode causar resultados
inválidos ou incorretos nos demais passos da análise realizados com os ácidos nucleicos extraídos.
Não use amostras que contenham FICOLL®, dextran ou hemoglobina. Estas substâncias podem
inibir a enzima DNA polimerase (como a transcriptase reversa e a DNA polimerase termoestável) que
pode causar resultados inválidos ou errados nos demais passos das análises realizadas com os ácidos
nucleicos extraídos.
Qualquer fenômeno de inibição causado por drogas, estas devem estar contidas na amostra
inicial e devem ser avaliadas de acordo com o uso do produto da extração.
7
Os resultados alcançados com estes produtos estão sujeitos a correta identificação, coleta,
transporte, estocagem e preparação das amostras. Para evitar resultados errados se faz necessário
tomar cuidado particular durante estas fases e seguir com cuidados as informações liberadas.
Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado e qualificado em processamento de
amostras com potencial infectante e preparações químicas, com intuito de prevenir acidentes com
sérias consequências ao usuário e outras pessoas.
Este produto requer o uso de roupas de trabalho e premissas que são validadas no
processamento de amostras potencialmente infecciosas e de preparações químicas no intuito de
prevenir acidentes com sérias consequências aos usuários e a outras pessoas.
Este produto deve ser manuseado por pessoal qualificado e treinado em técnicas de biologia
molecular, como a extração, amplificação e detecção de ácidos nucleicos, para evitar resultados
errados nos passos subsequentes do processo de análise pós extração, que pode causar sérias
consequências ao paciente.
Este produto deve ser manuseado em separado na área de extração / preparação de reações de
amplificação e da área de amplificação / detecção de produtos de amplificação, para evitar resultados
falso positivos nos passos subseqüentes da análise pós extração de ácidos nucléicos o que causaria
sérias consequências ao paciente.
Este produto requer o uso de roupas especiais e instrumentos para extração / preparação de
rações de amplificação e para amplificação / detecção de produtos de amplificação para evitar
resultados falso positivos nos passos subsequentes da extração de ácidos nucleicos, o que causaria
sérias consequências ao paciente.
11) CARACTERÍSTICAS DE PERFORMANCE
Eficiência da extração:
Este sistema de extração permite o uso de 300uL de amostra biológica não celular e permite a
recuperação de aproximadamente 80% do DNA ou RNA existente na amostra inicial.
A eficiência do método de extração, em termos de “existência” dos DNA ou RNA viral nas
amostras, foi checado durante as validações dos produtos da Nanogen Advanced Diagnostics S.r.L,
usando amostras clinicas positivas para os seguintes viroses: CMV, HSV1, HSV2, VZV, HHV6, HHV8, BKV,
JVC, Enterovírus, Influenza A e B e RSV.
De momento, os dados relatados se referem ao RNA de Enterovírus e ao DNA de CMV.
Em caso de vírus de RNA, o teste foi realizado usando um painel de referencia como calibrador,
este pinel possui diferentes diluições de Enterovírus dentro de concentrações limites (QCMD 2007
painel de proficiência Enterovírus e Parechovirus, Qnostics Ltd, Scotland, UK). Cada amostra foi usada
em 2 duplicatas para realizar a análise total, extração, transcriptase reversa e a amplificação real time
foram realizadas com produtos e assessórios da Nanogen Advanced Diagnostics S.r.I. Os resultados
estão expressos na tabela a seguir.
Extração do painel de proficiência
Amostra
EV07-01
EV07 -02
EV07-03
EV07-04
EV07-05
EV07-06
EV07-07
EV07-08
EV07-09
EV07-10
EV07-11
EV07-12
Genótipo e titulo teórico
(TCID 50 / 0,05mL
Coxsackievirus B3,50
Parechovírus3, 5,6
Echovírus 11, 0,13
Echovírus 11 , 1,3
Negativo, NA
Enterovírus 71, 2,8
Coxsackievírus B3 , 5,0
Echovírus 30, 2,5
Echovírus 30, 0,25
Poliovírus 3, 0,063
Parechovírus 3, 0,056
Caxsackievírus B3, 0,5
Resultado
esperado
++
+ /+
++
++
++
++
+/+
Positividade /
replicatas
2
0
2
2
0
2
2
2
2
2
0
2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
Média dos
resultados
Log 10 gEq /
mL
5,122
2,160
3.053
4,878
3,956
4,835
3,910
2,769
2,626
Todas as amostras foram corretamente detectadas. O resultado quantitativo para este painel
não tem sido processado pelo QCMD.
8
Em caso de vírus de DNA, o teste foi realizado usando-se um painel de diluições de CMV como
material de referência (isolado AD 169) com concentrações limitadas (QCMD 2007 painel de proficiência
de Citomegalovírus, Qnostics Ltd, Scotland ,UK). Cada amostra foi usada em duplicatas para realizar a
análise total, extração e amplificação real Time, com produtos e assessórios da Nanogen Advanced
Diagnostics S.r.l. Os resultados estão reportados na tabela a seguir.
Amostras
CMV
CMV
CMV
CMV
CMV
CMV
CMV
CMV
CMV
CMV
07
07
07
07
07
07
07
07
07
07
-01
- 02
- 03
- 04
- 05
- 06
- 07
- 08
- 09
-10
Extração do painel de
Consenso de
sistema
Derivação
comercial
padrão
Log10 da conc.
viral
CMV 4.436
0,349
CMV 2.270
0,600
Negativa NA
CMV 5.413
0.360
Negativa NA
CMV 2.979
0.360
CMV 6.497
0.341
CMV 3.568
0.341
CMV 1.878
0.768
CMV 2.227
0.456
proficiência
Positiva /
replicatas
2
2
0
2
0
2
2
2
2
2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
Média dos resultados
Log 10 gEq / mL
4.355
1.583
5.380
2.854
6.370
3.529
1.808
2.276
Todas as amostras foram corretamente detectadas. Os resultados quantitativos estão dentro de
um range definido pelo Consensus de + ou – 1 Desvio padrão, porém, a amostra CMV 07 – 02 não
apresenta esta padrão. Esta amostra apresentou um titulo menor que o esperado. Entretanto, a
concentração teórica é menor que o limite de mensuração linear (316 gEq / mL ou 2.5 Log 10 gEQ /
mL) da amplificação em Tempo real.
O método de eficiência de extração, em termos de recuperar o ácido nucleico da amostra, foi
checado pela adição de plasmídeos de DNA ao plasma coletado em EDTA.
Os testes foram realizados usando um plasmídeo de DNA como material de referencia de
calibração, e sua concentração inicial foi mensurada por espectrofotometria. O plasmídeo de DNA foi
adicionado ao plasma coletado em EDTA para obter amostras contendo 5ug de plasmídeo de DNA em
300uL de amostra. Estas amostras foram usadas em 10 replicatas para realizar o procedimento de
extração. O plasmídeo recuperado foi dissolvido em 100uL de água, assim a absorbância foi mensurada
por espectrofotometria. Os valores absorbância das amostras extraídas foram comparadas com os 5ug
de plasmídeo de DNA diluídos diretamente em 100uL de água. Os resultados concordam com uma média
apresentando uma eficiência de extração de 80%. Os resultados estão reportados na seguinte tabela.
Valores de absorbância dos
Média dos valores de
plasmídeos diluídos
absorbância do plasmídeo de
Eficiência da
diretamente em 100uL de
DNA dissolvido em 100uL de
extração
água
água
1.01
0.84
83%
A pureza do plasmídeo de DNA recuperado, expresso em média de uma razão de absorbância
dos comprimentos de onda, que foi igual a 1.77
Nota: Os dados completos e resultados realizados para avaliar a performance da extração deste
produto estão gravados na seção 7 dos arquivos técnicos do produto “EXTRAgen®”, FTP EXTG01.
12) TROUBLESHOOTING
Falso negativo
Possíveis causas
Degradação do ácido nucleico contido na
amostra
Precipitação de sais da extração
Sem ácidos nucleicos no pellet
Perda do pellet de ácidos nucleicos
Soluções
Use uma nova amostra. Estocar as amostras
corretamente.
Com cuidado retire 900uL do sobrenadante do
microtubo teste.
Com cuidado misture o etanol absoluto e o
sobrenadante no microtubo de precipitação.
Com cuidado drene o reagente de lavagem, sem
remover o pellet de ácidos nucleicos.
9
Use plásticos livres de RNA e DNA. Mude a alíquota de
etanol absoluto, reagente de lavagem e água
ultrapura.
Degradação do ácido nucleico extraído
Falso positivo
Causas possíveis
Contaminação durante a extração da
amostra
Contaminação dos reagentes usados na
sessão
Contaminação da área de extração /
preparação de reações de amplificação
Soluções
Abra um tubo de cada vez. Evite respingos dos tubos.
Sempre troque as ponteiras
Use uma nova alíquota de etanol absoluto, reagente
de lavagem e água ultra-pura
Limpe as superfícies e instrumentos usando
detergentes aquosos, lavar jalecos. Trocar microtubos
e ponteiras.
Pellet de ácidos nucleicos difíceis de dissolver
Possíveis causas
Soluções
Pellet de ácidos nucleicos que levam muito Deixar todo o líquido do microtubo evaporar, porém,
tempo para hidratar
não deixar o pellet ressecar.
Certificar-se que a temperatura do termobloco esta
em 80°C. Deixar completar o tempo de incubação á
Proteínas presentes no pellet
80°C. Checar se o poço do termobloco adapta-se ao
microtubo. Cuidar quando transferir o sobrenadante
para o microtubo de precipitação.
Quando existem lipídeos na superfície, retire-os com
Lipídeos presentes no pellet de ácidos auxilio de uma ponteira. Tome muito cuidado ao
nucleicos
transferir o sobrenadante para o microtubo de
precipitação.
Origem do produto, indicando o nome do fabricante e seu endereço
País de Origem: Itália
Fabricante: Nanogen Advanced Diagnostics S.r.l.
C.so Torino, 89/d - 10090 Buttigliera Alta (TO)
Nome do solicitante, CNPJ e endereço
Indicação do serviço de atendimento ao consumidor
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba - PR
CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
WWW.biometrix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
Número do cadastro na ANVISA
80298490119
Responsável Técnica
Ana Carolina Martins
CRF/PR: 12700
Revisões
Revisão
00
Descrição da Alteração
Elaboração.
Data
05/2011
01
Inclusão de informações técnicas.
05/2011
02
Inclusão de número de registro na Anvisa, adequação do nome comercial do produto.
01/2012
03
Inclusão de numeração nos tópicos, alteração do DDG.
09/2012
10