CanAg NSE EIA 420-10

PT
CanAg NSE EIA
420-10
REF
IVD
Instruções de utilização. 2016-02
Use By/Годно до/Použitelné do/
EN
EXPLANATION OF SYMBOLS
Holdbar til/Verwendbar bis/
BG
ОБЯСНЕНИЕ НА СИМВОЛИТЕ
Ημερομηνία λήξης/Fecha
CS
VÝZNAM SYMBOLŮ
DA
SYMBOLFORKLARING
DE
ERKLÄRUNG DER SYMBOLE
EL ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΜΒΟΛΩΝ
ES
SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS
ET
SÜMBOLITE SELGITUS
FR
EXPLICATION DES SYMBOLES
HR
OBJAŠNJENJE SIMBOLA
HU
JELMAGYARÁZAT
IT
SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI
Batch code/Номер на партида/
LT
SIMBOLIŲ PAAIŠKINIMAI
Číslo šarže/Lotnummer/
LV
SIMBOLU SKAIDROJUMS
Chargenbezeichnung/Αριθμός
NL
VERKLARING DER SYMBOLEN
Παρτίδας/Código de lote/Partii
de caducidad/Kõlblik kuni/
Utiliser jusque/Rok valjanosti/
Felhasználható/Utilizzare entro/
Sunaudoti iki/Izlietot līdz/Houdbaar
tot/Brukes innen/ Użyć przed /
Prazo de validade/Expiră la/
Использовать до/Använd före/
Použite´né do/ Uporabno do/
Upotrebljivo do/Son Kullanma Tarihi
kood/Code du lot/Kod serije/
NOSYMBOLFORKLARING
PL
OBJAŚNIENIE SYMBOLI
PT
EXPLICAÇÃO DOS SÍMBOLOS
RO
SEMNIFICAŢIA SIMBOLURILOR
RU
ОБОНАЧЕНИЯ
Sarzsszám/Codice del lotto/
Partijos kodas /Partijas kods /Lot
nummer/Partikode/Kod partii/
Código do lote/Număr de lot/
Номер лота/Lotnummer/Číslo
SVSYMBOLFÖRKLARING
SK
VÝZNAM SYMBOLOV
SL
RAZLAGA SIMBOLOV
SR
OBJAŠNJENJE SIMBOLA
TR
SEMBOLLERİN AÇIKLAMALARI
šarže/Številka serije/Kod partije/
Parti Kodu
1
Date of manufacture/Дата на
8 oC
производство/Datum výroby/
Produktionsdato/Herstellungsdatum/
Ημερομηνία παραγωγής/Fecha de
2 oC
Temperature limitation/
Температурни граници/
Teplotní omezení/
Temperaturbegrænsning/
fabricación/Valmistamise kuupäev/
Temperaturbegrenzung/
Date de fabrication/Datum proizvodnje/
Περιορισμοί θερμοκρασίας/
Gyártási idő/Data di produzione/
Límites de temperatura/
Pagaminimo data/Ražošanas datums/
Temperatuuri piirang/
Productiedatum/Fremstillingsdato/
Limite de température/
Data produkcji/Data de fabrico/Data
Temperaturno ograničenje/
fabricaţiei/Дата производства/
Hőmérsékletre vonatkozó korlátozás/
Tillverkningsdatum/Dátum výroby/Datum
Limiti di temperatura/
izdelave/Datum proizvodnje/Üretim tarihi
Temperatūriniai apribojimai/
Temperatūras ierobežojums/
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device/
Temperatuurbeperking/
Медицински уред за диагностика
Temperaturbegrensninger/
ин витро/Diagnostický zdravotnický
Temperatury graniczne/
prostředek in vitro/Medicinsk udstyr til
Limite de temperatura/
in vitro-diagnostik/In-vitro-Diagnostikum/
Limite de temperatură/
Ιατροτεχνολογικό προϊόν για διάγνωση
Температурный режим/
In Vitro/Dispositivo médico para
Temperaturbegränsning/
diagnóstico in vitro/In vitro diagnostiline
Teplotné obmedzenie
meditsiiniseade/Dispositif médical de
Omejitev temperature/
diagnostic in vitro/Diagnostički medicinski
Temperaturno ograničenje/
uređaj In Vitro/In vitro orvosdiagnosztikai
Sıcaklık sınırlaması/
eszköz/Dispositivo medico per test
diagnostici in vitro/In Vitro Diagnostinė
Contains sufficient for <96> tests/Съдържа
Medicinos Priemonė/Medicīniska ierīce
достатъчно количество за тестове
in vitro diagnostikai/In vitro-diagnostisch
<96>/Lze použit pro <96> testů/Indeholder
medisch instrument/In vitro diagnostisk
tilsttrækkeligt/Inhalt ausreichend für <96>
medisinsk utstyr/Wyrób medyczny do
Prüfungen/Περιεχόμενο επαρκές για
diagnostyki in vitro/Dispositivo Médico
«96» εξετάσεις/Contenido suficiente para
de Diagnóstico In Vitro/Dispozitiv medical
<96> ensayos/Kogusest piisab <96> testi
pentru diagnostic in vitro/Только для
läbiviimiseks/Contenu suffisant pour “96”
диагностики In Vitro/Endast för in
tests/Sadrži dovoljno za <96> testova/A
vitro-diagnostik/ Zdravotnícka pomôcka na
doboz tartalma <96> vizsgálat elvégzéséhez
diagnostiku in vitro/In vitro diagnostični
elegendő/Contenuto sufficiente per “96”
pripomoček/Diagnostički medicinski
saggi/Turinys skirtas atlikti <96> tyrimus/
uređaj In Vitro/<96> testleri için yeterlilik
Saturs pietiekams <96> testiem/Inhoud
içerir
voldoende voor “96” testen/til ”96” test/
Tilstrekkelig innhold for <96> prøver/
REF
Catalogue number/Каталожен номер/
Wystarczy na wykonanie <96> testów/
Katalogové číslo/Katalognummer/
Conteúdo suficiente para “96” ensaios/
Bestellnummer/Αριθμός καταλόγου/
Conţinut suficient pentru 96 de teste/
Número de catálogo/Kataloogi number/
Содержит достаточные количества для
Numéro de catalogue/Kataloški broj/
«96» определений/Innehåller tillräckligt
Katalógusszám/Numero di catalogo/
till “96” antal tester/Obsah postačuje na
Katalogo numeris/Numurs katalogā/
tento počet testov: <96>/Vsebina zadostuje
Catalogusnummer/Katalognummer/
za <96> testov/Sadržina dovoljna za <96>
Numer katalogowy/Número do catálogo/
testova/<96> testleri için yeterlilik içerir
Număr de catalog/Номер по каталогу/
Produktnummer/Katalógové číslo/
Kataloška številka/Kataloški broj/
Katalog numarası
2
Consult Instructions for Use/
ORIG
HUM
Human/С човешки произход/Lidské/
Прочетете инструкцията за
Humant/Human/δείγματα αναφοράς/
употреба/Konzultujte s návodem
Humano/Inimpäritolu/Humaine/Ljudskog
k použití/Se brugsanvisning/Siehe
porjekla/Humán/Origine Umana/
Gebrauchsanweisung/Συμβουλευτείτε
Žmogaus kilmės/Cilvēku izcelsmes/
τις Οδηγίες σχετικά με τη χρήση/
Human/Menneske/Ludzka/Humano/
Consulte las instrucciones de uso/
Origine umană/Человеческого
Vt kasutusjuhendit/Consulter le mode
происхождения/Human/Ľudské/
d’emploi/Pročitajte upute za uporabu/
Humanega izvora/Ljudskog porekla/İnsan
Olvassa el a használati utasítást/
Consultare le istruzioni per l’uso/Dėl
ORIG
MOU
From mouse/С миши произход/Myší/
naudojimo žiūrėkite instrukcijas/Izlasiet
Fra mus/Maus/απο ποντίκι/de ratón/
lietošanas instrukciju/Raadpleeg de
Hiirtelt/De souris/Mišijeg porjekla/
instructies voor gebruik/Les instruksene
Egérből/Murino/Pelės kilmės/No peles/
før bruk/Sprawdzić w instrukcji użycia/
Van muizen/Fra mus/Mysia/Do rato/De
Consulte as Instruções de Utilização/
la şoareci/Мышиного происхождения/
Consultaţi instrucţiunile de utilizare/
Från mus/Myšie/Mišjega izvora/Mišijeg
porekla/Fareden
Обратитесь к инструкции по
применению/Se bruksanvisning/
Prečítajte si návod na používanie/
ORIG
BOV
Bovine/С говежди произход/
Pročitajte uputstvo za upotrebu/
Hovězí/Bovin/Rind/από βοοειδή/
Kullanım Talimatlarına Bakınız
Bovino/Veistelt/Bovine/Rogate stoke/
Szarvasmarha/Bovino/Jaučio/No
CONT
Contents of kit/Съдържание на набора/
liellopa/Bovien/Bovin/Wołowy/Bovino/
Obsah soupravy/Kittets indhold/Inhalt
Origine bovină/крупного рогатого
des Kits/Περιεχόμενα του κιτ/Contenido
скота/Från ko/Hovädzie/Govejega
del kit/Komplekt sisaldab/Contenu du
izvora/Rogate krupne stoke/Bovin
kit/Sadržaj opreme/A készlet tartalma/
Contenuto del kit/Rinkinio turinys/
Komplekta saturs/Inhoud van de set/
Settets innhold/Zawartość zestawu/
Reconstitute with/Разтваряне с/
Rozřeďte pomocí/Rekonstitueres med/
Rekonstituieren mit/Ανασύσταση με/
Conteúdo do kit/Conţinutul setului/
Reconstituir con/Lahjendamine/
Компоненты набора/Kit innehåll/
Reconstituer avec/Rekonstituirajte s/
Obsah súpravy/Vsebina kompleta/Sadržaj
Feloldáshoz/Ricostituire con/Atkurti,
opreme/Kitin içindekiler
ištirpdant su/Atšķaidīt ar/Reconstitutie
met/Rekonstitueres med/Odtworzyć
Biological risks/Биологическа
za pomocą/Reconstituir com/A
опасност/Biologická rizika/Biologisk
se reconstitui cu/Растворить в/
fare/Biologische Gefahren/Βιολογικοί
Rekonstituera med/Rozrieďte pomocou/
κίνδυνοι/Riesgos biológicos/
Rekonstituirajte z/s/Ponovno formiranje
Bioloogilised ohud/Risques biologiques/
sa/Yeniden oluşturulur
Biološkli rizici/Biológiai kockázatok/Rischi
biologici/Biologinis pavojus/Bioloģiskais
Manufacturer/Производител/Výrobce/
risks/Biologische risico’s/Biologiske
Producent/Hersteller/Kατασκευαστής/
risikoer/Zagrożenie biologiczne/Riscos
Fabricante/Tootja/Fabricant/Proizvođač/
biológicos/ Biologisk risk/Pericole
Gyártó/Fabbricante/Gamintojas/
biologice/Биологическая опасность/
Ražotājs/Fabrikant/Produsent/
Biologicky rizikové/Biologické riziká/
Producent/Fabricante/Producător/
Biološkli rizici/Biyolojik riskler
Производитель/Tillverkare/ Výrobca/
Izdelovalec/Proizvođač/Üretici
3
CanAg NSE EIA
Instruções de utilização
PT
Kit de ensaio imunométrico de enzima
Para 96 determinações
UTILIZAÇÃO PREVISTA
O kit CanAg NSE EIA destina-se à determinação quantitativa de NSE em soro humano.
RESUMO E EXPLICAÇÃO DO ENSAIO
A enolase da enzima glicolítica (2-fosfo-D-glicerato hidrolase, EC 4.2.1.11) existe como
várias isoenzimas diméricas (αα, αβ, αγ, ββ e γγ) compostas por três subunidades
diferentes α, β e γ. A unidade γ encontra-se numa isoenzima homóloga γγ- ou numa
isoenzima heteróloga αγ- e é conhecida por enolase específica do neurónio (NSE).
Os anticorpos monoclonais utilizados no CanAg NSE EIA ligam-se à subunidade
γ- da enzima detectando assim as formas γγ e αγ (1, 2). Os níveis de NSE são baixos
em indivíduos saudáveis e em indivíduos com doenças benignas. Habitualmente
encontram-se níveis elevados em doentes com tumores malignos com diferenciação
neuroendócrina, particularmente cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) (3)
e neuroblastoma (4). A determinação quantitativa de NSE no soro pode ser valiosa
na gestão de doentes com CPPC ou neuroblastoma diagnosticado ou suspeito, para
auxiliar no diagnóstico diferencial e para monitorizar o efeito do tratamento (5, 6).
PRINCÍPIO DO TESTE
O CanAg NSE EIA é um imunoensaio não concorrente de fase sólida, baseado
em dois anticorpos monoclonais (derivados de ratos) direccionado contra dois
determinantes antigénicos separados da molécula NSE. Os anticorpos monoclonais
(MAb) usados ligam-se à subunidade γ- da enzima, detectando assim as formas γγ e
αγ. Incubam-se calibradores e amostras do doente em conjunto com Anti-NSE MAb
E21 biotinalado e peroxidase de rábano silvestre (HRP) rotulada Anti-NSE MAb E17
em microtiras revestidas com streptavidina. Após a lavagem, adiciona-se reagente
Cromogénio/Substrato (peróxido de hidrogénio e 3, 3’, 5, 5’ tetra-metilbenzidina) a
cada poço e a reacção da enzima pode prosseguir. Durante a reacção da enzima,
desenvolver-se-á uma cor azul se estiver presente antigénio. A intensidade do
desenvolvimento da cor é proporcional à quantidade de NSE presente nas amostras.
Determina-se a intensidade da cor num espectrofotómetro de microplacas a 620 nm
(ou, opcionalmente, a 405 nm após adição de Solução de Paragem).
4
Constroem-se curvas de calibração para cada ensaio comparando o valor da
absorvância com a concentração para cada calibrador. Em seguida, a partir
da curva de calibração, lêem-se as concentrações de NSE das amostras do
doente.
REAGENTES
• Cada kit CanAg NSE EIA contém reagentes para 96 testes.
• O prazo de validade do kit está indicado no rótulo no exterior da caixa do kit.
• Não utilize o kit após o final do prazo de validade.
• Não misture reagentes de lotes de kits diferentes.
• Conserve o kit a 2-8 °C. Não congele.
• Os reagentes abertos encontram-se estáveis de acordo com a tabela abaixo,
desde que não estejam contaminados, sejam conservados nos recipientes
originais e manuseados conforme prescrito. Colocar novamente a 2-8 °C
imediatamente após a utilização.
Componente
Quantidade
Conservação e estabilidade
após a primeira abertura
MICROPLACA
Microplaca1 Placa
2-8 °C até à data do prazo
de validade indicado na placa
12 x 8 poços quebráveis revestidos com Streptavidina. Após a abertura, coloque de
novo imediatamente as tiras não usadas na bolsa de alumínio que contém dissecante
e sele novamente para manter secas.
Calibradores NSE 5 frascos, liofilizados
4 semanas a 2–8 °C
3 meses a –20 °C
CAL
NSE
A
1 x 0,75 ml
CAL
NSE
B
CAL
NSE
C
CAL
NSE
D
CAL
NSE
E
1 x 0,75 ml
1 x 0,75 ml
1 x 0,75 ml
1 x 0,75 ml
5
Os calibradores liofilizados contêm NSE humano numa matriz de proteína com 0,01 %
de um conservante não azida. Para reconstituir com 0,75 ml de água destilada antes
da utilização.
NOTA: a concentração de NSE exacta é específica do lote e está indicada no rótulo de
cada frasco.
Componente
Quantidade
Conservação e estabilidade
após a primeira abertura
BIOTIN Anti-NSE
Biotina Anti-NSE
1 x 15 ml 2-8 °C até à data do prazo
de validade indicado no frasco
Anticorpo monoclonal Anti-NSE biotina de rato, aproximadamente 2 µg/ml. Contém
tampão fosfato (pH 7,1), albumina de soro bovino, agentes bloqueadores, um corante
azul inerte e 0,01 % de metil-isotiazolona (MIT) como conservante. Para misturar com
Marcador, HRP Anti-NSE antes da utilização.
CONJ
Anti-NSE
Marcador, HRP Anti-NSE
1 x 0,75 ml
2-8 °C até à data do prazo
de validade indicado no frasco
Solução mãe de anticorpo monoclonal HRP Anti-NSE de rato, aproximadamente
40 µg/ml. Para misturar com Biotina Anti-NSE antes da utilização. Contém
0,02 % de metil-isotiazolona (MIT), 0,02 % de bromonitrodioxano e 20 ppm de
Proclin™ 300 como conservantes.
SUBS TMB
Substrato TMB HRP
1 x 12 ml
2-8 °C até à data do prazo
de validade indicado no frasco
Pronto a usar. Contém peróxido de hidrogénio tamponado e 3, 3’, 5, 5’
tetrametil-benzidina (TMB).
6
Componente
Quantidade
Conservação e estabilidade
após a primeira abertura
STOP
Solução de Paragem
1 x 15 ml
2-8 °C até à data do prazo
de validade indicado no frasco
Pronto a usar. Contém 0,12 M de ácido clorídrico.
WASHBUF
25X
Concentrado de Lavagem
1 x 50 ml 2-8 °C até à data do prazo
de validade indicado na garrafa
Para diluir com água 25 vezes antes da utilização. Uma solução salina tamponada TrisHCl com Tween 20. Contém Germall II como conservante.
Indicações de instabilidade
O Substrato TMB HRP deve ser incolor ou ligeiramente azulado. Uma cor azul indica
que o reagente foi contaminado e deve eliminar-se.
AVISOS E PRECAUÇÕES
Para utilização de diagnóstico in vitro
• Apenas para Utilização Profissional.
• Consulte a publicação do Departamento de Saúde e Serviços Humanos
Americano (Bethesda, Md., US) N.º (CDC) 88-8395 sobre segurança laboratorial
e quaisquer outros regulamentos locais ou nacionais.
• Manuseie todas as amostras do doente como potencialmente infecciosas.
• Siga as indicações locais para eliminar todo o material residual.
Aviso
Testou-se a unidade do dador usada na preparação de reagente de origem humana
e descobriu-se ser Não Reactivo para Anticorpo VIH-1/2, Anticorpo VHC e Antigénio
de Superfície de Hepatite B (HBsAg). Uma vez que nenhum método pode regular
totalmente a presença de doenças sanguíneas, o manuseamento e a eliminação
de reagentes de origem humana deste produto deverão fazer-se como se fossem
potencialmente infecciosos.
7
COLHEITA E MANUSEAMENTO DE AMOSTRAS
O CanAg NSE EIA destina-se a utilização com soro. Colha o sangue por venopunção
e separe o soro de acordo com os procedimentos comuns. Deve separar-se o soro do
coágulo no espaço de 60 minutos após a colheita para evitar fugas de NSE de células
sanguíneas. Não utilizar amostras hemolisadas. Não se recomenda o plasma uma vez que
podem libertar-se das plaquetas quantidades de NSE significativas. Podem conservar-se
as amostras a 2-8 °C durante 24 horas. Para períodos mais prolongados, conservar as
amostras a –70 °C ou abaixo. Não devem conservar-se as amostras num congelador
com auto-descongelação e não devem congelar-se e voltar a congelar antes da análise.
Coloque as amostras congeladas à temperatura ambiente e misture CUIDADOSAMENTE
virando ao contrário várias vezes antes da análise. As amostras que contenham partículas
grossas devem centrifugar-se a 10 000 x g durante 10 minutos, antes de utilizar para
eliminar quaisquer partículas que possam ter-se desenvolvido a partir do processo de
descongelação. Analise as amostras descongeladas no espaço de uma hora.
PROCEDIMENTO
Materiais necessários mas não fornecidos com o kit
1.
Agitador de microplacas
A agitação deve ser média a vigorosa, com aproximadamente 700-1100 oscilações/
min.
2.
Dispositivo de lavagem de microplacas
Dispositivo de lavagem de placas automático com capacidade para 1 e 6 ciclos de
lavagem com um volume de enchimento mínimo de 350 μl/poço/ciclo de lavagem.
É recomendada uma pipeta de 8 canais com pontas plásticas descartáveis para
debitar 350 μl, se não se utilizar um dispositivo de lavagem de microplacas automático.
3. Espectrofotómetro de microplacas
Com um comprimento de onda de 620 nm e/ou 405 nm e uma gama de absorvância
de 0 a 3,0.
4. Pipetas de precisão
Com pontas plásticas descartáveis para debitar volumes em microlitros. É útil,
mas não essencial, uma pipeta de 8 canais ou uma pipeta doseadora com pontas
plásticas descartáveis para debitar 100 µl. Pipetas para debitar volumes em mililitros.
5. Água destilada ou desionizada
Para reconstituição de Calibradores NSE e para a preparação de solução
de lavagem diluída.
8
Notas sobre procedimentos
1. É necessária uma compreensão completa do folheto desta embalagem para garantir
a utilização correcta do kit CanAg NSE EIA. Os reagentes fornecidos com o kit
destinam-se a utilização como uma unidade integral. Não misture reagentes idênticos
de kits que tenham números de lote diferentes. Não utilize os reagentes do kit após
a data do prazo de validade indicada no exterior da caixa do kit.
2. Antes da utilização, deve deixar-se que os reagentes atinjam a temperatura ambiente
(20-25 °C). Só deverá realizar-se o ensaio a temperaturas entre 20-25 °C para obter
resultados precisos. Têm de misturar-se os soros congelados suave mas totalmente
após a descongelação.
3. Antes de começar a pipetar calibradores e amostras do doente, aconselha-se marcar
as tiras para que se possa identificar claramente as amostras durante e após o ensaio.
4.
O requisito de uma lavagem eficiente e cuidadosa para a separação de antigénio ligado
e não ligado e reagentes de complexos do antigénio anticorpo de ligação da fase
sólida é um dos passos mais importantes num EIA. Para garantir a lavagem eficiente,
certifique-se de que todos os poços estão totalmente cheios até ao bordo superior
com solução de lavagem durante cada ciclo, que a solução de lavagem é distribuída
a uma boa velocidade de fluxo, que a aspiração dos poços entre e após os ciclos de
lavagem está concluída e que os poços estão vazios. Se sobrar líquido, vire a placa
ao contrário e bata cuidadosamente contra papel absorvente.
-Dispositivo de lavagem de tiras automático: siga as instruções do fabricante
relativamente a limpeza e manutenção e lave o número necessário de ciclos de
lavagem antes e após cada fase de incubação. Recomenda-se vivamente utilizar
o modo de processamento de tira e o modo de lavagem sobrefluxo com um
volume de dosagem de 800 µl. Não se deve deixar na vertical o dispositivo de
aspiração/lavagem com Solução de Lavagem durante períodos prolongados,
uma vez que as agulhas podem entupir, causando má distribuição e aspiração.
5. O Substrato TMB HRP é muito sensível a contaminação. Para conseguir a
estabilidade ideal do Substrato TMB HRP, deite a quantidade necessária do frasco
num recipiente limpo ou, de preferência, numa bandeja de plástico descartável para
evitar a contaminação do reagente. Certifique-se de que utiliza pontas de pipeta
plásticas descartáveis (ou ponta de pipeta doseadora) limpas.
6. Certifique-se de que utiliza pontas de pipeta plásticas descartáveis limpas e uma
técnica de pipetagem adequada quando manusear amostras e reagentes. Evite
transportar segurando a ponta da pipeta ligeiramente acima da parte superior do
poço e evite tocar na tira plástica ou na superfície do líquido. É da maior importância
uma técnica de pipetagem adequada para o manuseamento da solução do Substrato
TMB HRP.
9
10
REF
420-10
Prepare a Solução de Lavagem
Prepare a Solução Anticorpo
3.
Prepare os Calibradores NSE
2.
1.
Passo
NSE
Anti-NSE
Anti-NSE
BIOTIN
25X
CONJ
WASHBUF
A, B, C, D, E
CAL
Frasco/Placa
1
50
2100 3150
4200 1
2
3
4
N.º de Tiras HRP Anti-NSE
Biotina Anti-NSE
(µl)(ml)
Misture 50 µl de Marcador, HRP Anti-NSE com 1 ml
de Biotina Anti-NSE por tira:
Dilua 50 ml de Concentrado de Lavagem com
1200 ml de água destilada ou água desionizada.
Adicione 0,75 ml de água destilada a cada frasco
e misture suavemente. Deixe repousar durante pelo
menos 15 minutos.
NOTA: aconcentração exacta de cada calibrador
está indicada no rótulo. Para fazer os cálculos deve
utilizar-se este valor dos calibradores.
Procedimento
Misture os componentes directamente antes da utilização. Use condições de agitação de acordo com as instruções.
CanAg NSE EIA
Ficha do Protocolo
11
1 min de agitação à temperatura ambiente
Leia a 405 nm no espaço de 15 min
MICROPLACA
MICROPLACA
Alt.12Incube
Alt.13 Leia a absorvância
100 µl em cada poço
STOP
620 nm
30 min de agitação à temperatura ambiente
100 µl em cada poço
Lave cada poço seis vezes com Solução de Lavagem.
1 hora de agitação à temperatura ambiente
Alt.11 Adicione Solução de Paragem
MICROPLACA
Leia a absorvância
11.
TMB
MICROPLACA
SUBS
MICROPLACA
MICROPLACA
SOLUÇÃO ANTICORPO
100 µl em cada poço
25 µl em cada poço
A, B, C, D, E
CAL
NSE
Lave cada poço uma vez com Solução de Lavagem.
MICROPLACA
10.Incube
Adicione Substrato TMB HRP
Incube
7.
9.
Adicione a Solução Anticorpo
6.
Lave
Adicione calibradores e amostras
5.
8.
Lave
4.
5250 5
6300 6
7350 7
8400 8
9450 9
1050010
1155011
1260012
Preparação dos reagentes
Estabilidade do reagente preparado
Calibradores NSE4 semanas a 2-8 °C
3 meses a –20 °C
Adicione exactamente 0,75 ml de água destilada a cada frasco e misture suavemente.
Deixe repousar durante pelo menos 15 minutos para reconstituir. NOTA: a concentração
dos calibradores está indicada nos rótulos e deve utilizar-se para o cálculo dos resultados.
Solução de Lavagem2 semanas a 2-25 °C
num recipiente selado
Deite o Concentrado de Lavagem de 50 ml num recipiente limpo e dilua 25 vezes adicionando
1200 ml de água destilada ou desionizada para obter uma Solução de Lavagem tamponada.
Solução anticorpo3 semanas a 2-8 °C
Prepare a quantidade necessária de Solução Anticorpo misturando 50 µl de Marcador, HRP
Anti-NSE com 1 ml de Biotina Anti-NSE por tira (veja a tabela abaixo):
N.º de Marcador, HRP Anti-NSE Tiras Biotina Anti-NSE
Tiras(µl)
(ml)
1
50
1
2100 2
3150 3
4200 4
5250 5
6300 6
7350 7
8400 8
9450 9
10500
10
11550
11
12600
12
Certifique-se de que utiliza uma garrafa de plástico ou de vidro limpa para a preparação
da Solução Anticorpo.
Alternativa: deite o conteúdo do Marcador, HRP Anti-NSE no frasco do Biotina Anti-NSE
e misture suavemente. Certifique-se de que todo o conteúdo do Marcador é transferido
para o frasco de Biotina Anti-NSE.
NOTA: a Solução Anticorpo é estável durante 3 semanas a 2-8 °C. Não prepare mais
Solução Anticorpo do que a utilizada neste período e certifique-se de que é conservada
adequadamente.
12
Procedimento de ensaio
Faça cada determinação em duplicado para calibradores e amostras do doente.
Deverá fazer-se uma curva de calibração com cada ensaio. Antes da utilização, têm
de colocar-se todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente (20-25 °C).
1.Comece a preparar os Calibradores NSE, a Solução de Lavagem e a Solução Anticorpo.
É importante utilizar recipientes limpos. Siga cuidadosamente as instruções.
2. Transfira o número necessário de tiras de microplaca para um bastidor de tiras.
(Coloque novamente imediatamente as tiras restantes na bolsa de alumínio que
contém dissecante e volte a selar cuidadosamente). Lave cada tira uma vez
com a Solução de Lavagem. Não lave mais tiras do que as que pode manusear
no espaço de 30 min.
3. Pipete 25 µl dos Calibradores NSE (CAL A, B, C, D, E) e amostras do doente
(desconhecidos-Desc) nos poços da tira, de acordo com o esquema seguinte:
12345
67 etc.
A Cal
Cal
4º
AEDesc
B Cal
Cal
etc.
AE
C Cal
1º
B Desc
D
Cal
1º
B Desc
E
Cal
2º
C Desc
F
Cal 2º
C Desc
G Cal 3º
D Desc
H Cal 3º
D Desc
4. Adicione 100 µl de Solução Anticorpo a cada poço utilizando uma pipeta
de precisão de 100 µl (ou uma pipeta de precisão de 100 µl de 8 canais).
Evite transportar segurando a ponta da pipeta ligeiramente acima da parte
superior do poço e evite tocar na tira plástica ou na superfície do líquido.
5.Incube a placa durante 1 hora (± 10 min) à temperatura ambiente (20-25 °C)
com agitação constante da placa utilizando um agitador de microplacas.
6. Após a incubação, aspire e lave cada tira 6 vezes.
13
7. Adicione 100 µl de Substrato TMB HRP a cada poço, utilizando o mesmo
procedimento conforme descrito no item 4. Deve adicionar-se o Substrato TMB
HRP às tiras o mais rapidamente possível e o tempo entre a adição ao primeiro e
ao último poço não deverá ser superior a 5 min.
8. Incube durante 30 min (± 5 min) à temperatura ambiente com agitação constante.
Evite a exposição à luz solar directa.
9.Leia imediatamente a absorvância a 620 nm num espectrofotómetro de microplacas.
Opção
Se o laboratório não tiver acesso a um espectrofotómetro de microplacas com capacidade
para leitura a 620 nm, pode determinar-se a absorvância como no item 10.
10. Adicione 100 µl de Solução de Paragem, misture e leia a absorvância a 405 nm
num espectrofotómetro de microplacas no espaço de 15 min após a adição
de Solução de Paragem.
Amplitude de medição
O CanAg NSE EIA mede concentrações entre 1 e aproximadamente 150 µg/l. Se se
esperarem concentrações de NSE acima da amplitude de medição, recomenda-se
diluir as amostras com soro humano normal antes da análise. NOTA: também deve
medir-se o soro utilizado para diluição para determinar a concentração de NSE
endógeno (consultar “Cálculo dos resultados”).
Controlo de qualidade
Para a validação da série de ensaios, recomenda-se os Níveis 1 e 2 de Controlo
Marcador de Tumor CanChek (disponíveis individualmente, REF 107-20). Se se
obtiverem valores fora da amplitude especificada, deve fazer-se uma verificação
completa dos reagentes e do desempenho do leitor e repetir a análise.
Materiais de referência
Uma vez que não está disponível material de referência comum para o antigénio NSE,
atribuem-se os valores do Calibrador CanAg NSE EIA contra um conjunto de padrões
de referência internos.
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CÁLCULO DOS RESULTADOS
Se utilizar um leitor espectrofotómetro de microplacas com programa de cálculo
de dados integrado, consulte o manual do espectrofotómetro e crie um programa
utilizando a concentração indicada no rótulo de cada um dos Calibradores NSE.
Para o cálculo automático dos resultados NSE recomenda-se utilizar qualquer
um dos métodos seguintes:
• Método de encaixe de curva canelada cúbica. Deve incluir-se o calibrador A na
curva com o valor 0 µg/l.
• Método de encaixe de curva suavizada. Deve utilizar-se o calibrador A como placa vazia.
• Interpolação com avaliação ponto a ponto. Deve incluir-se o calibrador A na curva
com o valor 0 µg/l.
• Método de encaixe de curva quadrática. Deve incluir-se o calibrador A na curva
com o valor 0 µg/l.
NOTA: não devem utilizar-se os métodos de regressão paramétrica 4 ou linear.
Para avaliação manual, constrói-se uma curva de calibração comparando os valores
de absorvância (A) obtidos para cada Calibrador NSE contra a concentração de NSE
correspondente (em µg/l), ver a figura. Podem então ler-se as concentrações de NSE
desconhecidas a partir da curva de calibração utilizando o valor de absorvância médio
de cada amostra do doente. Se as amostras numa análise inicial derem níveis de NSE
acima da concentração do calibrador E, é necessário diluir a amostra 1/10 com soro
humano normal para obter resultados precisos. Deve então calcular-se o resultado de
acordo com o procedimento seguinte:
Diluição 1/10: 10 x ([NSE] Amostra diluída – (0,9 x [NSE] Soro humano normal))
Exemplo de resultados
Amostra
CAL
NSE
A
CAL
NSE
B
CAL
NSE
C
CAL
NSE
D
CAL
NSE
E
Valores do Valor de abs
NSE
calibradormédio (A)µg/l
0 µg/l
0,037
7,5 µg/l
0,238
22,9 µg/l0,663
68,4 µg/l1,688
138,0 µg/l2,720
Amostra 10,51817,5
Amostra 21,47457,8
15
2.8
2.4
A 620 nm
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
0
20
40
60
80
100
120
140
NSE µg/L
Exemplo, não utilizar esta curva para determinar os resultados do ensaio.
A concentração de NSE exacta está indicada no rótulo de cada frasco de calibrador.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Não pode utilizar-se o nível de NSE como uma prova absoluta da presença ou ausência de doença maligna e não deve utilizar-se o teste NSE em despistagem de cancro.
Devem interpretar-se os resultados do teste apenas em conjunto com outras investigações e procedimentos no diagnóstico da doença e o teste NSE não deve substituir
quaisquer exames clínicos estabelecidos.
Podem ocorrer valores de NSE elevados não devido a tumores em doentes dialisados e em doentes com doenças leucémicas.
O soro não deverá conter hemólise visível (a absorvância a 500 nm para amostra
não turva não deverá ultrapassar 0,3) uma vez que os eritrócitos contêm quantidades
significativas de NSE (7). A conservação prolongada de sangue total pode causar
libertação de NSE das células sanguíneas.
Ocasionalmente, os anticorpos anti-reagente (anticorpo anti-rato humano (HAMA)
ou os anticorpos heterofílicos) na amostra do doente podem interferir com o ensaio,
mesmo que se incluam no tampão agentes bloqueadores específicos.
VALORES ESPERADOS
Utilizou-se o CanAg NSE EIA para medir os níveis de NSE em amostras de
495 dadores de sangue aparentemente saudáveis. Neste estudo, 97,5 % dos
indivíduos tinham uma concentração de NSE de ou inferior a 10,5 μg/l e 95 % dos
indivíduos tinham uma concentração de NSE de ou inferior a 9,9 μg/l. O nível de soro
médio era de 6,5 μg/l.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de
referência com a população de interesse e os procedimentos de recolha de amostras
utilizados no laboratório.
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CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Precisão
Determinou-se a precisão total de acordo com a directriz NCCLS EP5-A (8) utilizando
quatro níveis de soro humano combinado congelado contendo NSE adicionado.
Pipetou-se aleatoriamente cada amostra em duplicados e analisou-se duas vezes todos
os dias durante 20 dias. Realizaram-se as análises durante um período de 40 meses,
por > três técnicos diferentes e utilizando 20 lotes de kit CanAg NSE EIA diferentes.
Amostra Réplicas
Médio
µg/l
Dentro da série Dentro da série
SD (µg/l)
CV %
Entre dia
SD (µg/l)
Entre dia
CV %
NSE 1
NSE 2
NSE 3
NSE 4
10,3
23,7
48,2
92,7
0,24
0,82
1,02
1,60
0,57
0,97
1,93
3,44
5,5
4,1
4,0
3,7
80
80
80
80
2,3
3,5
2,1
1,7
Limite de detecção
O limite de detecção do ensaio CanAg NSE EIA é < 1 μg/l definido como a concentração
correspondente aos valores de absorvância médios do calibrador NSE A mais 2 desvios
padrão de acordo com a fórmula:
2 x SD CAL A
OD CAL B–OD CAL A
x [CAL B] µg/l
Efeito de gancho
Não se observou efeito de gancho para concentrações de NSE até 200 000 µg/l.
Linearidade
Diluíram-se as amostras do doente com soro normal e analisaram-se. Os valores obtidos
situaram-se no intervalo de 93-101 % dos valores esperados.
17
Especificidade
Os anticorpos monoclonais utilizados são específicos para a subunidade γ- da enolase.
Não se observaram reacções cruzadas mensuráveis com outra enolase.
Seguiu-se a directriz NCCLS EP7-P (9) para determinar fontes de interferência possíveis. Testaram-se as substâncias e as concentrações seguintes e não se encontrou
interferência com o teste.
Concentração com interferência
não significativa (± 10%)
Lipemia (Intralipid®)10 mg/ml
Bilirrubina, não conjugada
0,6 mg/ml
GARANTIA
Obtiveram-se os dados de desempenho apresentados aqui utilizando o procedimento
de ensaio indicado. Qualquer alteração ou modificação do procedimento não recomendada pela Fujirebio Diagnostics pode afectar os resultados, em cujo caso a Fujirebio
Diagnostics renuncia a todas as garantias expressas, implícitas ou legais, incluindo a
garantia implícita de comercialização e adequabilidade para utilização.
18
REFERÊNCIAS DA LITERATURA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Paus E. and Nustad K., (1989) Immunoradiometric Assay for αγ- and
γγ-Enolase (Neuron-Specific Enolase), with Use of Monoclonal Antibodies and
Magnetizable Polymer Particles. Clin. Chem. 35: 2034-2038.
Dahlén U., Karlsson B., Nilsson O. and Uhl W., (1995) Development of an
Enzyme Immunoassay, NSE-Enzymun Test For Determination of Neuron-Specific
Enolase. XXIII International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine,
Montréal, Ouébec .
Cooper E.H., (1994) Neuron-specific enolase. The International Journal of
Biological Markers 9(4):205-10.
Cooper E.H., Pritchard J., Bailey C.C. and Ninane J., (1987) Serum neuronspecific enolase in children’s cancer. Br. J. Cancer 56: 65—67.
Schneider, P. M. et al., (2002) Lung Cancer. In “Tumor markers, Physiology,
Pathobiology, Technology and Clinical Applications” Eds. Diamandis E. P. et al.,
AACC Press, Washington pp 287-303.
Bonner J. A., Sloan JA., Rowland KM., Klee GG., Kugler JW., Mailliard JA.,
Wiesenfeld M., Krook JE., Maksymiuk AW., Shaw EG., Marks RS and Perez EA.,
(2000) Significance of Neuron-specific Enolase Levels before and during Therapy
for Small Cell Lung Cancer. Clinical Cancer Research 6: 597-601.
Påhlman S., Esscher T., Bergvall P. and Odelstad L., (1984) Purification
and characterization of human neuron-specific enolase: Radioimmunoassay
development. Tumor Biol. 5: 127—139.
National Committee for Clinical Laboratory Standards, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A
(1999).
National Committee for Clinical Laboratory Standards, National Evaluation
Protocols for Interference Testing, Evaluation protocol Number 7, Vol. 6, No 13,
August (1986).
19
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20
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