universidade federal de minas gerais

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE LEVEDURAS
ISOLADAS DE MADEIRA EM DECOMPOSIÇÃO DO
ARQUIPÉLAGO DAS ILHAS GALÁPAGOS
(EQUADOR)
María Cristina Guamán Burneo
Belo Horizonte
2013
Programa de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
(EQUADOR)
Belo Horizonte
2013
2
(EQUADOR)
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Microbiologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre
em Microbiologia.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
Coorientadores: Prof. Dr. Silvio Silvério da Silva
Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo – Lorena
Prof. Dr. Javier Carvajal Barriga
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
Belo Horizonte
2013
iii
043
Burneo, María Cristina Guamán.
Produção de xilitol a partir de leveduras isoladas de madeira em
decomposição do arquipélago das Ilhas Galápagos (Equador) [manuscrito] /
María Cristina Guamán Burneo. – 2013.
124 f.: il. ; 29,5 cm.
Orientador: Carlos Augusto Rosa. Co-orientadores: Silvio Silvério da Silva,
Javier Carvajal Barriga.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de
Ciências Biológicas.
1. Xilitol – Teses. 2. Levedos – Teses. 3. Bagaço da cana – Teses. 4.
Hidrolisado hemicelulósico. 5. Microbiologia – Teses. 6. Galápagos, Ilhas
Programa de- Pós-graduação
emCarlos
Microbiologia
da UFMG
(Equador)
Teses. I. Rosa,
Augusto.
II. Silva, Silvio Silvério da. III. ii
Barriga, Javier Carvajal. IV. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de
Ciências Biológicas. V. Título.
iii
A mi querida familia,
por ser mi guía, mi apoyo, mi fuerza
y mi ejemplo de lucha y amor constante
iv
AGRADECIMENTOS
Façamos da interrupção um caminho novo.
Da queda um passo de dança,
do medo uma escada,
do sonho uma ponte, da procura um encontro!
Fernando Sabino
Ao meu Senhor, pelo dom da vida, pelas oportunidades e pelas pessoas que tenho
encontrado nesta minha caminhada.
Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia da UFMG, pela oportunidade da
realização do mestrado.
Ao meu orientador, Carlos Rosa, pela paciência, pelos conselhos e pelo apoio. Além
das orientações científicas, ele me ensinou, com seu exemplo, virtudes que serão
sempre valiosas na minha vida profissional e pessoal.
À Escola de Engenharia de Lorena/ USP, pela oportunidade de aprender e poder
realizar parte dos experimentos no Laboratório de Microbiologia Aplicada e
Biotecnologia.
Ao meu coorientador, professor Silvio Silvério, pela confiança, pelas sugestões, pela
amizade e pelo incentivo no desenvolvimento do mestrado.
Ao professor e amigo Javier Carvajal, pelo estímulo e torcida durante minha vida
acadêmica, pelos ensinamentos, pela força e pelo carinho durante estes anos.
À minha família, pelo amor de sempre. Apesar da distância, sempre pude contar
com seu apoio, sua confiança, seus conselhos e sua força, o que me ajudou a
continuar nos momentos difíceis, assim como seu carinho fez o meu caminho mais
leve.
À Tássia (Fofis!), pelo grande apoio e pela amizade. Mais que minha colega de
apartamento, tornou-se minha irmã, aquela pessoa que compartilha minhas alegrias,
e com paciência e carinho me ajuda “arrumar minhas bagunças”.
v
Ao pessoal do Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de
Fungos, pelo agradável convívio dentro e fora do laboratório, pela amizade e pelo
incentivo durante todo este tempo. Em especial a minhas “curicas” Bárbara, Sil,
MariZé, Mona, Larissa (Té), Camila (s), Rê, Fran e Iara. Obrigada à Adri, Fer Piló,
Laurinha, Carla, Luiz e Lú, pela amizade e pelos conselhos.
Às minhas irmãs Mari Rocha, pela força, pela meiguice e pelo carinho. E a minha
querida hermanita del alma, Raquel, por ser meu anjo protetor, porque apesar da
distância nunca deixou de me aconselhar, de dar animo e ajudar no que fosse
preciso, não tenho palavras para agradecer todo o que recebi de vocês neste tempo.
A Karine e Elisa, que acompanharam meu caminho e sempre me incentivaram a
continuar.
Ao pessoal da dança, pela companhia, pela amizade, pelo apoio e pela alegria;
vocês complementaram minha vida e fizeram-na mais feliz. Obrigada aos salseiros,
em especial ao Clarindo, Stephie, Andréa, Agnaldo, Zé Marcos, Alessandra,
Creuzinha, Ana Paula e Fernando, por terem se tornado minha família durante esta
caminhada, por serem meus anjos, meus grandes amigos.
Ao pessoal da EEL/Lorena, em especial à Kelly, pelas dicas, pela paciência e,
sobretudo, pela amizade. Ao meu grande amigo Paulo, pela acolhida, pelos
conselhos, pelo apoio e pelo carinho. A Adriana, Ellen, Samira (s), Bruna, Otavio,
Larissa e Jú, pelo agradável convívio durante minha estadia no laboratório. Aos
amigos “lorenenses” Isabela, Dayelle, Babi, Mayara, Bela, Fernanda, Felipe e
Priscila Arruda, pelos conselhos e pela amizade.
Aos intercambistas, pelas experiências compartilhadas, pela força e pelos momentos
agradáveis, em especial a José Luis, Paola, Germana, Winnie e Sam.
Às amigas de sempre, Yani, Mapri, Nory e Dianita, e às minhas primas que tanto
amo, MaGus e Anita, obrigada por fazerem da distância só um pretexto para
encontrar novos jeitos de conversar, de nos apoiar e de expressar o carinho que
temos entre nós.
vi
Ao SENESCYT (Secretaria Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e
Innovación del Ecuador), pelo financiamento do meu mestrado.
A todos aqueles que fizeram possível a realização deste trabalho, por me ensinar
que os sonhos são simplesmente as pontes para a felicidade.
O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade
com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis e pessoas
incomparáveis.
Fernando Pessoa
vii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... XI
LISTA DE SÍMBOLOS ............................................................................................. XIII
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... XIV
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ XV
LISTA DE APÊNDICES ........................................................................................... XVI
LISTA DE ANEXOS ............................................................................................... XVII
RESUMO ….. ........................................................................................................ XVIII
1
RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ..................................................................... 1
2
REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 3
2.1
Propriedades físico químicas do xilitol ................................................... 3
2.2
Aplicações do xilitol ................................................................................ 4
2.2.1 Uso como adoçante e propriedades anticariogênicas ................ 4
2.2.2 Metabolismo insulina-independente ............................................ 4
2.2.3 Outros usos potenciais................................................................ 5
2.3
Tolerância e toxicidade do xilitol ............................................................ 6
2.4
Ocorrência e obtenção do xilitol ............................................................. 7
2.6
Produção Biotecnológica...................................................................... 10
2.6.1 Resíduos lignocelulósicos como material para obtenção de
soluções de D-xilose ............................................................................ 10
2.6.2 Bagaço de cana-de-açúcar como substrato para obtenção de
soluções contendo D-xilose ................................................................. 12
2.6.3 Processo de hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos ........ 13
2.6.4 Bioconversão de D-xilose em xilitol por micro-organismos ....... 16
3
OBJETIVOS.................................................................................................... 19
3.1
Objetivo geral ....................................................................................... 19
3.2
Objetivos específicos ........................................................................... 19
viii
4
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 20
4.1
Seleção de micro-organismos .............................................................. 20
4.1.1 Áreas de coleta ......................................................................... 20
4.1.2 Coleta, processamento e preservação dos micro-organismos . 21
4.2
Identificação das leveduras por análises fisiológicas e moleculares .... 22
4.2.1 Extração de DNA ...................................................................... 22
4.2.2 Agrupamento das leveduras por PCR-Fingerprinting ............... 23
4.2.3 Amplificação do domínio D1/D2 da subunidade maior do gene
do rRNA ............................................................................................... 23
4.2.4 Amplificação da região ITS (Espaçador Interno Transcrito) ...... 24
4.2.4 Purificação dos produtos de PCR e reação de sequenciamento25
4.3
Seleção de leveduras para produção de xilitol a partir de D-xilose ...... 26
4.3.1
Avaliação das leveduras assimiladoras de D-xilose ................ 26
4.3.2 Seleção das leveduras produtoras de xilitol .............................. 26
4.4
Ensaios de fermentação em meio semi-sintético com D-xilose e em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar ................... 26
4.4.1 Determinação do inóculo inicial ................................................ 27
4.4.2 Fermentação em meio semi-sintético contendo D-xilose .......... 28
4.4.3 Preparo do bagaço de cana-de-açúcar para a hidrólise ........... 28
4.4.4 Obtenção e caracterização do hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana-de-açúcar................................................................... 29
4.4.5 Detoxificação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar ............................................................................................. 29
4.4.6. Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar em escala de bancada ........................................................ 30
4.4.7 Fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar em biorreator .............................................................. 30
4.5
Métodos analíticos ............................................................................... 31
ix
4.5.1 Determinação de carboidratos, ácidos orgânicos, furfural e 5hidroximetilfurfural ................................................................................ 31
4.5.2 Determinação dos parâmetros cinéticos fermentativos............. 32
4.5.3 Determinação do coeficiente volumétrico de transferência de
oxigênio ................................................................................................ 34
4.5.4 Análises estatísticas.................................................................. 34
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 36
5.1
Identificação
das
leveduras
e
seleção
de
micro-organismos
assimiladores de D-xilose .................................................................... 36
5.2
Seleção de leveduras para produção de xilitol a partir de D-xilose ...... 45
5.2.1 Avaliação das leveduras assimiladoras de D-xilose e seleção das
leveduras produtoras de xilitol .............................................................. 45
5.3
Ensaios de fermentação em meio com D-xilose e em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar ..................................... 49
5.3.1 Fermentação em meio semi-sintético contendo D-xilose ............ 49
5.3.2 Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de canade-açúcar em escala de bancada ........................................................ 53
5.3.3 Compostos tóxicos liberados no hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana-de-açúcar................................................................... 60
5.3.4 Fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar em biorreator .............................................................. 63
6
CONCLUSÕES ............................................................................................... 71
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 73
APÊNDICES.............................................................................................................. 85
ANEXOS …………………….……………………………………………………………. 98
x
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATP
Adenosina trifosfato
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLQCA
Colección de Levaduras Quito Católica
CMC
Carboximetilcelulose
DNA
Ácido desoxirribonucleico
DO
Densidade Óptica
FAO
Food and Agriculture Organization of the United Nations
FDA
Food and Drug Administration
GRAS
Generally Regarded As Safe
HMF
5-hidroximetil-2-furaldeido
kg h-1
Quilograma por hora
KM
Constante de Michaelis
M
Concentração molar
MSP-PCR
Micro/Minisatellite-Primed PCR
NADH
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NADPH
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo-Fosfato
nm
nanômetro
PCR
Reação em cadeia da polimerase
PUCE
Pontificia Universidad Católica del Ecuador
SENESCYT Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e
Innovación (Equador)
Qp
Produtividade volumétrica
vvm
Volume de ar/volume de meio/minuto
XDH
Xilitol desidrogenase
XI
D-xilose isomerase
XK
D-xiluloquinase
XR
D-xilose (aldose) redutase
WHO
World Health Organization
YNB
Yeast Nitrogen Base
xi
YM
Yeast extract - Malt extract medium
Yp/s
Fator de conversão de xilose em xilitol
Yx/s
Fator de conversão de substrato em biomassa
UNESCO
Organização das Nações Unidas para a Educação, a Ciência e a
Cultura
m
micrômetro
xii
LISTA DE SÍMBOLOS
®
marca registrada
™
marca comercial
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Fluxogramas das tecnologias disponíveis para produção de xilitol a partir
de hidrólise ácida do material lignocelulósico.............................................................. 8
Figura 2 – Esquema do fracionamento dos principais componentes dos materiais
lignocelulósicos após procedimento de hidrólise....................................................... 11
Figura 3 – Reações e produtos formados durante o processo de hidrólise de
materiais lignocelulósicos. ......................................................................................... 14
Figura 4 – Vias metabólicas da glicose e xilose em leveduras. ................................ 17
Figura 5 - Distribuição do número de espécies de leveduras nos locais de coleta. .. 37
Figura 6 - Impressão digital do DNA utilizando o iniciador EI-1 para discriminação
dos
isolados
das
espécies
Pichia
manshurica,
Candida
(Yamadazyma)
trypodendroni e Galactomyces geotrichum. .............................................................. 43
dos isolados de leveduras das espécies Candida (Kurtzmaniella) natalensis,
Zygowilliopsis californica e Candida (Saturnispora) silvae. ....................................... 43
dos isolados das espécies Candida (Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis, Candida
sinolaborantium, Torulaspora delbrueckii, Debaryomyces nepalensis e Issatchenkia
terricola...................................................................................................................... 44
Figura 9 – Concentração de xilose (-- --), glicose (-- --), produção de células (-- --),
etanol (-- --), glicerol (-- --) e xilitol (-- --) em g.L-1 por Candida tropicalis CLQCA24F-125 em biorreator. .............................................................................................. 65
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Matérias-primas para produção de xilitol e linhagens de leveduras
utilizadas para produção deste poliálcool .................................................................. 12
Tabela 2 - Identificação das espécies, código dos isolados e assimilação de D-xilose
pelas leveduras obtidas neste trabalho a partir de amostras de madeira em
decomposição coletadas no arquipélago de Galápagos, Equador............................ 38
Tabela 3 - Produção (mM) e concentração (g.L-1) de xilitol e etanol no ensaio de
fermentação de D-xilose em tubos com meio YPX ................................................... 47
Tabela 4 - Produção de xilitol [Yp/s (g.g-1)], rendimento de xilitol [Qp (g.L-1.h-1)],
produtividade de xilitol [Yx/s (g.g-1)], conversão de substrato em biomassa [ (%)],
eficiência de conversão e consumo de D-xilose (%), produção de biomassa, etanol e
xilitol (g.L-1) e tempo de fermentação (h) em experimentos de fermentações em meio
semi-sintético com D-xilose para as leveduras testadas. .......................................... 50
Tabela 5 - Produção de xilitol [Yp/s (g.g-1)], rendimento de xilitol [Qp (g.L-1.h-1)],
produtividade de xilitol [Yx/s (g.g-1)], conversão de substrato em biomassa [ (%)],
eficiência de conversão e consumo de D-xilose (%), produção de biomassa, etanol e
xilitol (g.L-1) e tempo de fermentação (h), em fermentações em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar pelas leveduras testadas.................. 55
Tabela 6 - Composição dos hidrolisados antes e após os procedimentos de
concentração e destoxificação por alteração de pH combinado à absorção em
carvão vegetal ativado................................................................................................61
Tabela 7 - Parâmetros fermentativos obtidos para Candida tropicalis CLQC-24F-125
durante experimentos de fermentação com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar em biorreator....................................................................................65
xv
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice 1 – Identificação das espécies, código das amostras, meio de cultura para
isolamento e número de amostra das leveduras isoladas do Arquipélago de
Galápagos, Equador...................................................................................................85
Apêndice 2 – Sequências dos domínios D1/D2 e região ITS do isolado Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025......................................................................................................89
Apêndice 3 - Concentração de xilose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- -) e xilitol (-- --) em g.L-1 ao longo do ensaio de fermentação em meio semi-sintético
com D-xilose como fonte de carbono.........................................................................90
Apêndice 4 - Concentração de xilose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- -) e xilitol (-- --) em g.L-1 ao longo do ensaio de fermentação em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar...........................................................91
Apêndice 5 - Parâmetros fermentativos de produção de xilitol em fermentações
feitas em frascos Erlenmeyer com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar, de acordo com os tempos de amostragem do ensaio, para as leveduras
testadas......................................................................................................................92
Apêndice 6 – Análise estatísticas para as variáveis de produção de xilitol, etanol e
consumo de xilose e para os fatores de fermentação Yp/s e eficiência obtidas da
fermentação das espécies testadas em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar...........................................................................................................93
xvi
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1 – Pontos de coleta das amostras de madeira em decomposição no
Arquipélago das Ilhas Galápagos...............................................................................98
Anexo 2 – Certificado Zoosanitario para la exportación do Ministerio de Agricultura,
Ganadería, Acuacultura y Pesca do Equador, e autorização do Ministerio del
Ambiente para exportação das amostras de leveduras.............................................99
Anexo 3 – Ilustração do sistema do fermentador de 2,4 L empregado nas
fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por
Candida (Lodderomyces/ Spathapora) tropicalis e Lindnera sp..............................101
xvii
RESUMO
O xilitol é um poliálcool de alto valor agregado devido ao poder adoçante
semelhante
ao
da
sacarose.
Apresenta
propriedades
anticariogênicas
e
metabolismo insulina-independente, o que garante sua aplicação nas indústrias
alimentícia e farmacêutica. Além disso, o xilitol é utilizado na área clínica,
principalmente no tratamento da osteoporose e de doenças respiratórias. A
obtenção do xilitol por via biotecnológica utilizando resíduos agroindustriais é uma
alternativa sustentável e economicamente viável, comparada com o processo
químico tradicionalmente utilizado. Sendo assim, a extração por via biotecnológica
se baseia na utilização de micro-organismos e, ou, enzimas que permitam a
liberação da D-xilose a partir de hidrolisados hemicelulósicos. Um dos principais
materiais lignocelulósicos que geram produtos de valor agregado, como o xilitol, é o
bagaço de cana-de-açúcar, matéria-prima disponível em abundância no Brasil e em
outros países. A bioconversão da D-xilose nesse poliálcool mediante o emprego de
leveduras é possível, uma vez que o xilitol é um produto intermediário da via
metabólica da D-xilose. O presente trabalho teve como objetivo a prospecção e a
seleção de espécies de leveduras produtoras de xilitol para serem utilizadas em
processos fermentativos, empregando hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar como substrato. Foram testadas 140 leveduras provenientes de 35
amostras de madeira em decomposição coletadas nas ilhas Florena, Santa Cruz e
Isabela, pertencentes ao arquipélago das Ilhas Galápagos, Equador. Os meios de
cultura utilizados para o isolamento dessas leveduras foram Yeast Nitrogen Base
(YNB)-D-xilose, carboximetilcelulose e YNB-xilana. As espécies do gênero Candida
(incluindo
isolados
relacionados
aos
clados
Yamadazyma,
Kazachstania,
Kurtzmaniella, Lodderomyces/Spathaspora, Metschnikowia e Saturnispora) foram as
mais frequentemente isoladas neste estudo. Candida (Lodderomyces/Spathaspora)
tropicalis foi identificada como a espécie predominante, seguida por Kazachstania
unispora, Candida (Kurtzmaniella) natalensis, Zygowilliopsis californica e Candida
sinolaborantium. Em testes de fermentação utilizando meio semi-sintético com Dxilose (50 g.L-1), C. tropicalis CLQCA-24SC-125 foi a linhagem com maior produção
de xilitol, com fator de rendimento (Yp/s) de 0,67 g.g-1 e produtividade (Qp) de 0,34
xviii
g.L-1.h-1. Em fermentações com hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar como
substrato, essa levedura apresentou também a maior produção de xilitol, com o
mesmo fator de rendimento de 0,67 g.g-1 e produtividade de 0,38 g.L-1.h-1. Uma nova
espécie de Lindnera, representada pela linhagem CLQCA-24SC-025, foi a segunda
com melhores resultados para produção de xilitol em hidrolisado de cana-de-açúcar,
com Yp/s de 0,64 g.g-1 e Qp de 0,33 g.L-1.h-1. Em fermentador de 2,4 L, utilizando
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar suplementado, C. tropicalis
CLQCA-24SC-125 apresentou os melhores resultados, com produção de 37,2 g.L-1
de xilitol em 96 horas de fermentação, com um Yp/s de 0,83 g.g-1, Qp de 0,39 g.L-1.h-1,
eficiência total do 90,9% e Yp/x de 12,53 U.g-1 de células. Esse resultado indicou que
as condições empregadas de disponibilidade de oxigênio e agitação foram as
melhores para essa levedura. Os resultados do presente estudo apontam o potencial
biotecnológico das leveduras isoladas a partir de madeira em decomposição do
arquipélago de Galápagos para produção de xilitol a partir de cultivos realizados em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar.
xix
ABSTRACT
Xylitol is a polyol with high added value due to the sweeteness similar to
sucrose with anticariogenic properties and insulin metabolism independent that
guarantee its application in food and pharmaceutical industries. In addition, it is
mainly used in clinic treatment of osteoporoses and respiratory diseases. It is
currently produced by chemical catalysis of the xylose from lignocellulosic residues.
However, this process needs expensive purification steps to obtain pure xylitol.
Alternatively, it can be produced by biotechnological methods, using micro-organisms
or enzymes, which allowing the release of D-xylose from hemicellulosic hydrolysates.
A major lignocellulosic material that generates value-added products, such as xylitol,
is the sugarcane bagasse, raw material available in abundance in Brazil and other
countries. Bioconversion of D-xylose in this polyalcohol by the use of yeasts is
possible, since the xylitol is an intermediate product of the metabolic pathway of Dxylose. In this context, the present study aimed the screening and selection of yeast
species to fermentation processes using sugarcane bagasse hemicellulosic
hydrolysates for xylitol production. A total of 140 yeast strains were isolated from 35
rotting wood samples collected in the islands Florena, Santa Cruz and Isabela,
belonging to the Galápagos Archipelago, Equador. These samples were cultured in
Yeast Nitrogen Base (YNB)-D-xilose, carboxymethyl cellulose and YNB-xylan media.
Species of the genus Candida (including isolates related to the clades Yamadazyma,
Kazachstania,
Kurtzmaniella,
Lodderomyces/Spathaspora,
Metschnikowia
and
Saturnispora) were predominant in this study. Candida (Lodderomyces/Spathaspora)
tropicalis followed by Kazachstania unispora, Candida (Kurtzmaniella) natalensis,
Zygowilliopsis californica and Candida sinolaborantium were the most frequently
isolated yeasts. In semi-synthetic fermentation assays using D-xylose (50 g.L-1)
culture medium, C. tropicalis CLQCA-24SC-125 show the highest xylitol production
yield (Yp/s: 0.67 g.g-1) and a productivity (Qp: 0.34 g.L-1.h-1). Furthermore, in
fermentations with sugarcane bagasse hydrolysates as a substrate, this yeast
showed the highest production of xylitol with the same yield of 0.67 g.g-1 and a
productivity of 0.38 g.L-1.h-1. Whereas, the second species had better results for
xylitol production in sugarcane hydrolysates it was a new Lindnera species,
xx
represented by strain CLQCA-24SC-025, with Yp/s of 0.64 g.g-1 and Qp 0.33 g.L-1.h-1.
In 2.4 L bioreactor using sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysates, C.
tropicalis CLQCA-24SC-125 showed the best results, with a production of 37.15 g.L-1
in xylitol in 96 h of fermentation, with an Yp/s of 0.83 g.g-1, Qp of 0.39 g.L-1.h-1, total
efficiency of 90.9% and Yp/x of 12,53 U.g-1 cells. This study demonstrates the
biotechnological potential of yeasts isolated from decaying wood of the Galapagos
Archipelago
for
xylitol
production
using
sugarcane
bagasse
hemicellulosic
hydrolysates.
xxi
1
RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Nos últimos anos, a biotecnologia tem dado enfoque à obtenção de produtos
de importância comercial a partir de biomassa agroindustrial residual, devido ao seu
baixo custo. Um dos principais produtos obtidos a partir desses substratos é o xilitol,
um poliálcool com características importantes, como alto poder adoçante,
propriedades anticariogênicas e metabolismo insulina-independente, o que permite
sua aplicação nas indústrias alimentícia e farmacêutica. O xilitol encontra-se
amplamente distribuído na natureza, porém em baixas concentrações em plantas e
frutas, o que torna sua extração a partir desses substratos inviável economicamente.
O interesse na obtenção desse poliálcool a partir de resíduos agroindustriais
tem aumentado nos últimos anos, uma vez que esses resíduos representam fontes
abundantes e não dispendiosas de carboidratos (celulose e hemicelulose), com
potencial aplicação em processos de conversão química ou microbiana em produtos
de interesse comercial. O bagaço de cana-de-açúcar é um dos principais resíduos
de materiais agroindustriais utilizados para geração de vapor e calor nas indústrias,
além de ser usado nas indústrias de açúcar e álcool. O Brasil é o maior produtor de
cana no mundo, seguido pela Índia e pela China. Considerando que cada tonelada
de cana processada gera 140 kg de bagaço seco de cana, pode-se estimar,
dependendo da safra, que sejam produzidas mais de 80 milhões de toneladas
anuais de bagaço com potencial de serem utilizadas em inúmeros processos
industriais.
Em grande escala, o xilitol é produzido mediante processos químicos por
hidrogenação catalítica da xilose presente nos hidrolisados, mas essa metodologia
demanda
processos
caros
para
purificação
da
solução
de
xilose requerida para a catálise, bem como para remoção do catalisador metálico e
purificação do xilitol, o que torna o procedimento dispendioso e, em alguns casos, de
baixo rendimento. Neste sentido, a conversão por via biotecnológica da D-xilose
presente em hidrolisados lignocelulósicos mediante o uso de micro-organismos e,
ou, enzimas é possível, por ser o xilitol um produto intermediário da via metabólica
da D-xilose nas leveduras, representando, assim, uma alternativa promissora para
1
obtenção desse poliol, com a vantagem adicional de não serem necessárias as
etapas de purificação inicial desse açúcar, como as requeridas no processo químico.
Vários
pesquisadores
têm
estudado
o
aproveitamento
de
resíduos
agroindustriais e desenvolvido estratégias de processamento eficiente para
utilização dessa biomassa, o que resulta em baixo impacto ambiental e em alta
rentabilidade econômica. O processo de fracionamento do material lignocelulósico
para aproveitamento por micro-organismos, a determinação das melhores condições
dos processos fermentativos e avaliação dos procedimentos de recuperação do
xilitol do meio fermentado têm sido estudados para obter soluções que possam ser
utilizadas na bioconversão de resíduos lignocelulósicos em produtos de valor
comercial.
Entretanto, um dos principais problemas da bioconversão da xilose presente
no hidrolisado dos materiais lignocelulósicos, após processos fermentativos, é a
presença de compostos tóxicos aos micro-organismos, os quais podem ser
removidos, por exemplo, por tratamentos de alteração de pH, adsorção em carvão
ativo, utilização de resinas de troca iônica, polímeros vegetais, entre outros.
Um grande desafio no desenvolvimento da tecnologia de produção de xilitol
por via biotecnológica é a busca de micro-organismos assimiladores de D-xilose que
produzam esse poliálcool. As linhagens existentes ainda apresentam algumas
limitações em fermentações de hidrolisados ácidos de resíduos lignocelulósicos e
baixa tolerância aos compostos tóxicos presentes nesse tipo de substrato. Portanto,
o objetivo do presente trabalho foi a prospecção e a seleção de espécies de
leveduras com capacidade de fermentar D-xilose produzindo xilitol, para serem
avaliadas em processos fermentativos em escala de bancada e em biorreator,
utilizando o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar como
substrato.
2
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Propriedades físico químicas do xilitol
O xilitol é um poliálcool que apresenta várias aplicações clínicas,
farmacêuticas e alimentícias, com poder adoçante semelhante ao da sacarose e
superior ao de polióis comuns, além de ter valor calórico reduzido de 2,4 kcal g-1. O
metabolismo do xilitol é insulina independente, podendo ser tolerado por diabéticos.
Representa um composto cariostático, por não ser metabolizado por microorganismos da microbiota bucal, razão pela qual é usado na fabricação de doces e
enxagues bucais. Clinicamente pode ser usado para prevenção da otite média
aguda, pois inibe o crescimento e a adesão de Streptococcus pneumoniae e
Haemophilus influenzae em células da nasofaringe, entre outras aplicações
(SAMPAIO, 2001; GRANSTRÖM, 2002; MUSSATTO & ROBERTO 2002; OOI;
MARKUSZEWSKI, 2002; LIMA, 2006; JUCOSKI et al., 2007).
A fórmula molecular do xilitol é C5H12O5 e a massa molecular é 152,15
g.mol-1. Trata-se de um pó branco, cristalino, sem odor, altamente solúvel em água
(64,2 g 100 mL-1), com ponto de fusão na faixa de 93,4 a 94,7 °C e ponto de
ebulição de 216 °C (TAMANINI & OLIVEIRA, 2004; FREITAS, 2010). Esse poliol é
2,4 vezes mais doce que o manitol e duas vezes mais doce que o sorbitol (SILVA et
al., 1994; TAMANINI & OLIVEIRA, 2004). O calor de solução endotérmico é elevado
(34,8 cal.g-1), o que produz um agradável efeito refrescante na boca, quando entra
em contato com a saliva (MUSSATTO & ROBERTO, 2002; MICKENAUTSCH &
KUZMANOVA, 2007).
Uma das principais vantagens do xilitol sobre a sacarose é sua elevada
estabilidade química e microbiológica, podendo atuar em baixas concentrações
como conservante de produtos alimentícios, oferecendo resistência ao crescimento
de micro-organismos (MUSSATTO & ROBERTO, 2002). Outra característica do
xilitol é que, devido à ausência de grupos aldeídos ou cetônicos na molécula, este
poliálcool não participa de reações com aminoácidos, conhecidas como reações de
Maillard. Sendo assim, não sofre escurecimento nos alimentos nem diminuição do
valor nutricional das proteínas, o que possibilita seu uso na indústria alimentícia no
3
processamento de produtos em que essas reações são indesejáveis (MUSSATTO &
ROBERTO, 2002; TAMANINI & OLIVEIRA, 2004).
2.2 Aplicações do xilitol
2.2.1 Uso como adoçante e propriedades anticariogênicas
O xilitol tem atividade cariostática ao inibir o crescimento de bactérias orais
como Streptococcus mutans. A ação desse poliálcool consiste na redução de
formação de placas bacterianas e, consequentemente, das cáries. As bactérias, em
condições ácidas, produzem uma grande quantidade de ácido lático e sintetizam
polissacarídeos extracelulares, que aumentam a adesão da placa bacteriana na
superfície dos dentes (MÄKINEN, 1979; KANDELMAN, 1997; SOUZA, 2007).
Outra função do xilitol é que este estimula a salivação, produzindo aumento
da concentração dos íons de cálcio e fosfato, importantes na remineralização dos
dentes e reversão de cáries em estágio inicial (MUSSATTO & ROBERTO, 2002;
BONFADA & LORA, 2010). Devido a essas características, o xilitol é muito usado na
indústria para fabricação de doces, e como aditivo nos enxagues bucais, pois ajuda
a estimular o fluxo da saliva e eleva o pH da placa bucal, portanto neutraliza os
ácidos produzidos por alimentos fermentescíveis, melhorando a capacidade de
tamponamento e a atividade bacteriostática da saliva (KANDELMAN, 1997).
2.2.2 Metabolismo insulina-independente
O controle da taxa de glicose no sangue em indivíduos com Diabetes mellitus
tipo I ou II é de grande importância. Em comparação com outros açúcares, o xilitol é
tolerado por diabéticos, pois não dependente de insulina para ser metabolizado
(BARBOSA, 2009). Nenhuma das duas principais vias de absorção do xilitol
(absorção direta pelo fígado e metabolismo indireto por bactérias da microbiota
intestinal) é mediada pela insulina.
Toda glicose proveniente do metabolismo do xilitol é inicialmente estocada
como glicogênio no fígado, que depois é liberado gradualmente. Desse modo, sua
4
concentração não sofre alterações bruscas causadas pela sacarose e pela glicose, o
que faz desse açúcar apropriado para diabéticos (MUSSATTO & ROBERTO, 2002).
2.2.3 Outros usos potenciais
O xilitol, além de poder ser utilizado como ingrediente alimentar, possui várias
aplicações clínicas, sendo indicado para tratar diabetes, anemia hemolítica,
desordem no metabolismo de lipídeos e lesões renais e parenterais, bem como para
prevenir otite, infecções pulmonares e osteoporose. Apesar de alguns desses
estudos ainda estarem em andamento, os resultados obtidos já permitem uma
análise global dos possíveis benefícios da administração de xilitol em pacientes com
diversos tipos de patologias (MUSSATTO & ROBERTO, 2002).
Pacientes com anemia hemolítica apresentam deficiência da enzima glicose
6-fosfato desidrogenase (G6PDH), o que causa produção anormal do cofator
NADPH. Essa deficiência afeta a forma celular dos eritrócitos pela redução da
glutationa, componente dos glóbulos vermelhos. O xilitol ajuda conservar a
integridade dos glóbulos vermelhos porque supre as células de NADPH, mediante a
oxidação da xilulose, o que mantém a glutationa reduzida (YLIKAHRI, 1979; LIMA &
BERLINCK, 2003).
Os efeitos do xilitol no tratamento e, ou, na prevenção da osteoporose foram
comprovados por Mattila e colaboradores (2005), em pesquisas com animais. Os
autores constataram que o xilitol estimula a absorção de cálcio pelo intestino, o que
facilita sua passagem do sangue para os ossos. Por outro lado, o aumento de NADH
durante o metabolismo desse poliol intensifica o transporte de íons de cálcio através
da membrana celular, ativando o processo de calcificação dos ossos e da cartilagem
e aumentando a síntese de colágeno (MATTILA et al., 2005).
O xilitol também pode ser usado no controle de infecções respiratórias. A
superfície interna dos pulmões contém uma fina camada de líquido com substâncias
antimicrobianas que atuam como defesa, prevenindo assim as infecções. Segundo
Zabner e colaboradores (2000), o xilitol, por ter baixa permeabilidade transepitelial, é
pouco metabolizado pelas bactérias e pode diminuir a concentração de sais, o que
permite o aumento da atividade antibiótica natural dos pulmões. Por outro lado, o
5
xilitol diminui a aderência e o crescimento das bactérias, como Streptococcus
pneumoniae, nas células epiteliais, reduzindo a incidência de processos infecciosos
como sinusite e outras infecções pulmonares (TAPIAINEN et al., 2000).
2.3 Tolerância e toxicidade do xilitol
Atualmente, é expressivo o aumento no número de pessoas que, por motivos
diversos, necessitam diminuir ou cessar o consumo diário de sacarose. Portanto,
muitos estudos estão sendo feitos a fim de desenvolver produtos que possam atuar
como substitutos de açúcares. De acordo com a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), por meio da RDC no 18, de 3 de dezembro de 1999, o xilitol
passou a ser considerado alimento funcional. Um alimento funcional é definido como
aquele que, além das funções nutricionais básicas, quando consumido como parte
da dieta usual produz efeitos metabólicos, fisiológicos ou efeitos benéficos à saúde,
devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica (BRASIL, 1999). Desde
2008, a ANVISA reavaliou as alegações admitidas de alimento funcional com base
em evidências científicas, e não foram aprovadas alegações para ingredientes ou
componentes dos alimentos, e sim para o produto final que tenha esses ingredientes
ou componentes, conforme o item 3.3 da Resolução n o 18/1999. Para o xilitol, o
manitol e o sorbitol, a alegação foi aprovada somente para o uso em gomas de
mascar sem açúcar.
Sendo o xilitol uma substância atóxica, classificada pela Food and Drug
Administration (FDA, USA) como um aditivo do tipo GRAS (Generally Regarded As
Safe), a incorporação em alimentos é legalmente permitida. A ingestão diária
aceitável recomendada pela FAO/WHO (Food and Agriculture Organization / World
Health Organization) baseia-se na estimativa de uma quantidade de um aditivo em
alimento ou bebida, expressa em miligrama por quilograma de peso corpóreo, que
possa ser ingerida sem provocar nenhum risco para a saúde (BARBOSA, 2009). O
xilitol é extremamente bem tolerado desde que a quantidade consumida por dia não
ultrapasse 60 g, uma vez que a ingestão de doses mais elevadas produz efeito
laxativo. O xilitol in vivo não leva à alteração na concentração de triglicerídeos e de
colesterol, sendo a diarréia osmótica um dos poucos efeitos colaterais. Por outro
lado, a infusão de grandes quantidades de xilitol por meio de dietas parenterais pode
6
levar à acidose lática e à formação de cristais de oxalato de cálcio. Assim, a infusão
segura é de no máximo 0,25 mg kg-1 h-1 (PARAJÓ, 1998; SAMPAIO, 2001). No
entanto, a Organização Mundial da Saúde (OMS) não estabelece limite para
ingestão diária aceitável desse edulcorante e a FDA indica que o consumo é
permitido na quantidade necessária para atingir o adoçamento desejado
(MUSSATTO & ROBERTO, 2002).
2.4 Ocorrência e obtenção do xilitol
O xilitol pode ser encontrado na natureza em frutas, legumes, liquens, algas e
cogumelos (p. ex., Psalliota campestris); no entanto, sua extração direta não é viável
pelas baixas quantidades presentes nesses materiais (900 mg 100 g-1), o que torna
o processo de obtenção economicamente inviável. Em mamíferos, o xilitol é um
produto intermediário do metabolismo de carboidratos. Um humano adulto pode
produzir de 5 a 15 gramas de xilitol por dia em condições metabólicas normais, e a
concentração dessa substância no sangue varia de 0,03 a 0,06 mg 100 mL-1
(PARAJÓ et al.,1998; SAMPAIO, 2001; MUSSATTO & ROBERTO, 2002; ARRUDA,
2006). Outra alternativa de extração desse poliálcool é pela hidrogenação da Dxilose presente na biomassa vegetal, seja por via química de hidrolisados de
resíduos lignocelulósicos ou por via biotecnológica, por meio de reações enzimáticas
ou de fermentações microbianas (Figura 1).
O xilitol tem sido identificado como um dos 12 melhores produtos químicos
que podem ser produzidos a partir de biomassa agroresidual por via biológica ou
química. Esses derivados podem ser transformados em numerosos materiais ou
químicos de alto valor (WERPEY & PETERSEN, 2004). A produção de xilitol por
processo químico iniciou-se na Finlândia em 1977, por Melaja e Hämäläinen, com a
patente no 4008285. O processo para recuperação de xilitol a partir de pentoses
liberadas de xilana presente em matérias-primas inclui hidrólise ácida seguida de
purificação do hidrolisado por exclusão de íons e de fracionamento cromatográfico,
7
Figura 1 – Fluxogramas das tecnologias disponíveis para produção de xilitol a partir de
hidrólise ácida do material lignocelulósico. Fonte: adaptada de Mussatto & Roberto (2002).
para obter uma solução concentrada de xilose. A solução é hidrogenada utilizando
níquel como catalisador, e o xilitol é recuperado por fracionamento cromatográfico
utilizando resinas de troca iônica (MELAJA & HÄMÄLÄINEN, 1977).
O rendimento do processo químico e a qualidade do xilitol dependem da
pureza inicial da solução inicial de D-xilose, uma vez que a presença de impurezas
interfere na reação catalítica. Os processos de purificação incluem troca iônica,
descoloração ou fracionamento cromatográfico, para remover os subprodutos
indesejáveis e obter uma solução de xilose de elevada pureza. Por outro lado, são
necessárias várias etapas para remoção de catalisador metálico, que é tóxico para a
saúde humana. Após a remoção, a solução de xilitol é concentrada, fracionada por
cromatografia e cristalizada para obtenção do produto puro. Desta forma, o custo da
produção do xilitol por via química é cerca de dez vezes superior ao da sacarose ou
8
do sorbitol (MELAJA & HÄMÄLÄINEN, 1977; PARAJÓ et al.,1998; TAMANINI &
HAULY, 2004).
Diante desse problema, a conversão biotecnológica de soluções contendo
xilose por bactérias, fungos filamentosos, leveduras ou enzimas purificadas capazes
de reduzir a D-xilose em xilitol é uma alternativa promissora ao método
convencional. A produção microbiológica do xilitol é mais econômica e aplicável para
fins industriais, porque a produção microbiana pode ser alcançada sem necessidade
de alta pressão, temperatura ou purificação inicial da D-xilose (convertida em xilitol
no próprio hidrolisado), além disso, o processo facilita a separação do produto, pois
não precisa usar um catalisador metálico (MUSSATTO & ROBERTO, 2002;
SAMPAIO et al., 2005; GUO et al., 2006). No entanto, para tornar o processo viável
em nível industrial, a bioconversão deve ser rápida, oferecer rendimento elevado e
empregar meios de cultura alternativos e baratos que permitam obter resultados
comparáveis aos da tecnologia atual.
Seja por via química ou biotecnológica, um dos mais complexos passos é a
etapa de recuperação do xilitol produzido. Sendo assim, é preciso estabelecer
técnicas
eficientes
e
competitivas
para
tornar
o
processo
biotecnológico
economicamente viável. As técnicas mais utilizadas são a cristalização ou
precipitação, o uso de membranas e a extração com fluidos supercríticos Esta última
técnica (CO2 como solvente adicionado etanol como co-solvente) é um procedimento
ambientalmente limpo que tem mostrado grande potencial para extração e
purificação de compostos orgânicos. O fluido supercrítico apresenta propriedades
físico-químicas intermediárias entre líquido e gás, e sua densidade próxima à dos
líquidos aumenta seu poder de solvente; sua elevada difusividade e sua baixa
viscosidade acelera a transferência de massa (TRESINARI et al., 2011), permitindo
a fácil solubilização do xilitol, tornando-se um processo rápido e eficiente para
exclusão da xilose e retenção do xilitol.
2.5 Potencial econômico do xilitol
Atualmente, o principal fabricante de xilitol no mundo é a empresa Danisco,
da Dinamarca, seguida de empresas chinesas (FRANCESCGIN et al., 2011). O
preço desse açúcar-álcool pode custar na faixa de R$200 por 1 kg, se o produto for
9
100% puro. Os principais países consumidores de xilitol são os Estados Unidos, o
Canadá, a Alemanha, a França e o Japão (GARCÍA, 2005).
No Brasil, o xilitol está na fase de introdução e é aprovado como produto
dietético pela ANVISA. Em outros países industrializados como Finlândia, Suíça,
Alemanha, Canadá, China, França, Estados Unidos, Inglaterra, Japão e México, este
é permitido e produzido para uso nas indústrias alimentícia, farmacêutica e de
cosmetologia. Em países em desenvolvimento como Equador, poucos registros da
importação do xilitol são relatados, e atualmente não existem registros de pesquisas
envolvendo o desenvolvimento de tecnologias para obtenção desse produto no país.
2.6 Produção Biotecnológica
2.6.1 Resíduos lignocelulósicos como material para obtenção de soluções de
D-xilose
A lignocelulose é a biomassa orgânica mais abundante na biosfera, com
produção de 10 até 50 x 109 toneladas por ano (CHANDEL et al., 2010). Vários
pesquisadores têm direcionado esforços no sentido de desenvolver estratégias para
processar
essa
biomassa
com
baixo
impacto
ambiental
e
que
sejam
economicamente viáveis, utilizando procedimentos fermentativos ou enzimáticos. As
substâncias de interesse industrial produzidas por essas tecnologias incluem
combustíveis e solventes (etanol, butanol, 2,3-butanodiol, acetona e 2-propanol),
alditóis (xilitol e glicerol) e ácidos orgânicos (ácido lático, acético e butírico) (LEE et
al., 1995; ROBERTO et al., 2002; OOI et al., 2002; LIMA, 2006; JUCOSKI et al.,
2007).
Os processos biotecnológicos, utilizando materiais lignocelulósicos, na maioria
dos casos requerem etapas preliminares de preparação do material, como hidrólise
química ou enzimática, a fim de liberar os componentes de celulose e as frações de
hemicelulose (FONSECA et al., 2011). O maior componente dos materiais
lignocelulósicos é a celulose (35-50%), seguida pela hemicelulose (20-35%) e lignina
(10-25%); no entanto a concentração desses componentes varia de acordo com o
tipo de madeira ou resíduo agroindustrial (SAHA, 2003).
10
A celulose é o principal constituinte das paredes celulares das plantas e é
encontrada em uma estrutura fibrosa organizada. Esse polímero linear consiste de
subunidades de D-glicose ligadas entre si por ligações glicosídicas β (1,4), que
fazem dela uma estrutura altamente cristalina e compacta. Essa conformação
estrutural, assim como sua estreita associação à lignina, à hemicelulose, ao amido,
às proteínas e aos minerais, torna a celulose resistente à hidrólise e ao ataque
biológico (GRAY et al., 2006; KUMAR et al., 2009).
A hemicelulose, segundo componente principal da lignocelulose, é um
heteropolímero complexo e ramificado presente na parede celular e na lamela média
das células vegetais (COLLINS et al., 2005). Em virtude da natureza amorfa e
ramificada, ao contrário da celulose, a hemicelulose possui subunidades de
monossacarídeos diferentes, que podem ser extraídos com diversas concentrações
de ácido, álcali e outras substâncias químicas (XU et al., 2012).
A lignina,
componente presente em menor proporção em material vegetal, é um polímero
aromático que contém resíduos fenólicos que são inibidores microbianos. Além
disso, a lignina pode estar covalentemente ligada à hemicelulose via ligações éster,
o que confere à estrutura da parede celular vegetal maior solidez e resistência
(GRAY et al., 2006; XU et al., 2012).
Figura 2 – Esquema do fracionamento dos principais componentes dos materiais
lignocelulósicos após procedimento de hidrólise. Fonte: HSU et al. (1980), adaptada por
KUMAR et al. (2009).
Para fracionar os componentes dos materiais lignocelulósicos é preciso
ocorrer a deslignificação para liberar a celulose e a hemicelulose do complexo da
lignina. Subsequentemente é necessária a despolimerização dos polímeros de
11
carboidratos (celulose e hemicelulose) para produzir açúcares livres, e finalmente a
fermentação para produzir xilitol ou etanol. A celulose pode ser hidrolisada em
unidades de glicose pela ação das celulases. A xilana, componente principal da
hemicelulose e segundo componente mais abundante desses materiais, pode ser
hidrolisada por enzimas xilanolíticas, para liberar xilose, que pode ser convertida em
xilitol por fermentação (ARRIZON et al., 2012).
Substratos ricos em xilana representam 11 a 35% de peso seco em materiais
lignocelulósicos, por exemplo, madeiras e resíduos agrícolas, como o bagaço de
cana-de-açúcar (GURGEL et al., 1998; JUCOKSKI et al., 2007), a palha de arroz
(SILVA & ROBERTO, 2001) e a casca de soja (SCHMIRMER, 2007; RIBEIRO,
2010). Esses resíduos têm sido satisfatoriamente utilizados como alternativa para
produção de xilitol por meio de diferentes tratamentos (ALVES et al., 1998),
utilizando distintos micro-organismos, como mostrado na Tabela 1.
Tabela 1 – Matérias-primas para produção de xilitol e linhagens de leveduras utilizadas para
produção deste poliálcool (GRANSTRÖM, 2002; GONZÁLEZ-HERNÁNDEZ et al., 2011)
Material
Linhagem
Eucalyptus spp.
Yp/s
Qp
g.L .h
Debaryomyces hansenii
Candida parapsilopsis
0,57
0,72
0,40
-
Diaz et al. (2002)
Mayerhoff et al. (1997)
Palha de arroz
Pichia capsulata
Pachysolen tannophilus
D.hansenii
0,68
0,49
0,55
0,49
0,02
Converti et al. (1999)
Caroço de milho
C. magnoliae
0,74
002
Tada et al. (2004)
Palha de trigo
C. guilliermondii
0,59
0,42
Canilha et al. (2008)
Bagaço de cana
C. guilliermondii
0,79
0,47
Alves et al.(1998)
Bagaço de cana
C. guilliermondii
0,54
0,44
Carvalho et al. (2003)
Madeira de
Eucalyptus
C. guilliermondii
0,26
0,09
Villareal et al. (2006)
Palha de arroz
C. guilliermondii
0,72
0,61
Mussato et al. (2001)
Palha de trigo
C. guilliermondii
0,90
0,50
Dominguez et al.(2004)
g.g
-1
-1
-1
Referência
-1
-1
-1
Yp/s (g.g ) – grama de xilitol produzida por grama de xilose consumida; Qp (g.L .h ) – produtividade
-1
de xilitol; e concentração de xilitol produzido (g.L ) por hora (h).
2.6.2 Bagaço de cana-de-açúcar como substrato para obtenção de soluções
contendo D-xilose
Um dos principais resíduos lignocelulósicos produzidos no mundo é o bagaço
de cana-de-açúcar, fonte de celulose que pode ser usada nas indústrias de papel e
12
na alimentação bovina. A Organização das Nações Unidas para Alimentação e
Agricultura relata o crescimento do consumo mundial a uma taxa anual de 2% ao
longo das últimas décadas, o que significa cerca de 3 milhões de toneladas a mais
na demanda a cada ano (BIOETANOL, 2008). Tendo em vista que cada tonelada de
cana-de-açúcar processada gera 140 kg de bagaço de cana seco (CENBIO, 2012),
embora o bagaço gerado durante a produção de açúcar e álcool seja utilizado em
grande parte pela própria indústria sucroalcooleira como fonte energética, existe
ainda um excedente de 10-20% que pode ser utilizado em muitos processos
industriais
(ARRUDA,
2011).
Os
principais
fatores
que
impulsionaram
o
aproveitamento do bagaço de cana-de-açúcar em diferentes processos de
bioconversão para obtenção de produtos de interesse industrial, como o xilitol, são:
a elevada concentração de xilose na fração hemicelulósica, que corresponde até
80% do total de açúcar (RODRIGUES et al., 2001), e a capacidade de assimilação
dessa pentose por várias espécies de leveduras (SAHA, 2003).
2.6.3 Processo de hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos
O xilitol tem sido produzido de resíduos lignocelulósicos por microorganismos, utilizando diferentes sistemas de fermentação, a partir de hidrolisados
de fontes agrícolas, obtidos por hidrólises térmica ou química (ARRIZON, 2011). De
acordo com Sun e Cheng (2002), há dois tipos de tratamentos, um com alta e outro
com baixa temperatura (maior e menor que 160 °C, respectivamente). Nos
tratamentos em baixas temperaturas, a hidrólise ácida é um método comumente
utilizado porque há maior conversão de xilanas em xilose, pelo rompimento das
ligações glicosídicas. No entanto, nesse processo é necessário fazer
a
destoxificação subsequente, a fim de eliminar inibidores de fermentação liberados
durante o processo de hidrólise química, como ácido acético, liberado da estrutura
da hemicelulose, furfural, HMF (5- hidroximetil-2-furaldeido) e compostos fenólicos
formados durante a ruptura parcial da lignina (PALMQVIST & HÄHN-HÄGERDAL,
2000; SENE et al., 2011). Esses compostos tóxicos são inibidores potenciais do
metabolismo microbiano, limitam o consumo da fonte de carbono e interferem no
crescimento celular, diminuindo assim a atividade enzimática e as funções celulares
microbianas (FONSECA et al., 2011). Os compostos tóxicos formados após a
hidrólise ácida podem ser reduzidos por métodos físicos e químicos, que incluem
13
destoxificação por alterações do pH do meio com adição de ácidos e bases e
utilização de compostos como carvão ativado, resina de troca iônica, solventes
orgânicos e supercalagem (PALMQVIST & HÄHN-HÄGERDAL, 2000; MUSSATTO &
ROBERTO, 2003; TAMANINI & OLIVEIRA, 2004; FONSECA et al., 2011). Na Figura
3 tem-se o esquema das reações que ocorrem após a hidrólise ácida dos materiais
lignocelulósicos e a liberação de açúcares e compostos tóxicos.
Biomassa Vegetal
Hemicelulose
Celulose
Lignina
Ácido acético
Compostos fenólicos
Xilose
Furfural
Manose
Ácido fórmico
Galactose
Glicose
Hidroximetilfurfural
Ácido levulínico
Figura 3 – Reações e produtos formados durante o processo de hidrólise de materiais
lignocelulósicos. Fonte: Palmqvist & Hähn-Hägerdal (2000).
A destoxificação dos hidrolisados hemicelulósicos com o emprego de microorganismos vivos ou enzimas que assimilem ou degradem ácidos alifáticos e
compostos aromáticos é um procedimento que merece destaque, porque não gera
resíduos tóxicos no ambiente e principalmente não causa diminuição nas
concentrações de açúcar ou perda de volume (FONSECA et al., 2011). O ácido
acético originado da hidrólise ácida de material lignocelulósico é aceito em
concentrações de 0,2 - 0,6 g.L-1 em processos fermentativos (SOUZA et al., 2012),
enquanto concentrações superiores a 3,0 g.L -1 interfere na liberação de produtos da
fermentação ao inibir a capacidade das leveduras de converter a xilose em xilitol
(FELIPE et al., 1995). Quando o pH extracelular é menor do que o pH intracelular,
14
ocorre uma acidificação intracelular e a acumulação desste ácido em forma
dissociada afeta o metabolismo celular (SILVA et al., 1998; BELLISSIMI et al., 2009;
SOUZA et al., 2012). Outro dos efeitos deste ácido no metabolismo celular é a
indução
da
morte
celular
programada.
Ludovico
e
colaboradores
(2002)
demonstraram que o ácido acético em concentrações de 20 e 120 mM induz
exponencialmente o crescimento até a morte celular programada exibindo
condensação da cromatina e fragmentação do DNA. Durante a hidrólise ácida, altos
níveis de furfural e 5-hidrometilfurfural são liberados. Estes compostos inibem a
multiplicação celular afetando a taxa de crescimento e a atividade enzimática celular
(FONSECA et al., 2011). O HMF (hidroximetilfurfural) reduz a permeabilidade da
membrana, o que resulta em uma fase de adaptação maior. Quanto à ação exercida
pelos compostos fenólicos, estes rompem as membranas biológicas, causando a
perda da função de barreira seletiva e de matriz de enzimas, perdendo assim a
integridade celular (PALMQVIST & HÄHN-HÄGERDAL, 2000). As células podem
induzir uma série de alterações funcionais em resposta aos níveis de estresse
causados pelos compostos tóxicos liberados na hidrólise ácida. Estas alterações
incluem a redução de atividades ligadas à proliferação celular, síntese de proteínas
e outros processos associados ao consumo de energia. Por outro lado, incrementam
os mecanismos de proteção e reparo de danos de diferentes moléculas (DNA,
proteínas e lípidos) e estruturas celulares (SOUZA et al., 2012).
A escolha do cultivo e, ou, sistema de conversão é outro ponto crucial para o
sucesso desse bioprocesso. Diferentes sistemas de cultivo em escala de bancada
são utilizados, como batelada, semibatelada e processos contínuos (SAMPAIO et
al., 2005). A eficiência da bioconversão da D-xilose até xilitol pode ser aumentada
por alterações nas condições do processo, como o pH (CONVERTI & DOMINGUEZ,
2001; CHENG et al. 2009); a concentração de açúcar inicial (GRANSTRÖM et al.,
2001), a idade e concentração do inóculo (FELIPE et al., 1997; SILVA et al., 1998), a
temperatura (PARAJÓ & DOMINGUEZ, 1998; CONVERTI & DOMINGUEZ, 2001); a
repressão catabólica exercida pela glicose no meio de fermentação (OOI et al.,
2002; DA SILVA et al., 2007), o nível de ar (WALTHER et al., 2001); e a relação
glicose:xilose (SILVA & FELIPE, 2006), fatores que uma vez estabelecidos como
ideais para cada espécie permitem obter maior produção de xilitol.
15
2.6.4 Bioconversão de D-xilose em xilitol por micro-organismos
A obtenção de micro-organismos capazes de fermentar pentoses presentes
na biomassa celulósica pode ser muito vantajosa para fabricação de produtos
secundários
em
processos
industriais.
Os
micro-organismos
naturalmente
fermentadores considerados como os mais eficazes incluem as leveduras e as
bactérias. As bactérias são de fácil cultivo, têm alta capacidade de produção de
xilitol e toleram compostos tóxicos e condições de estresse (GUO et al., 2006). As
leveduras apresentam vantagens em relação às bactérias em processos de
fermentação comercial por ter melhor crescimento em pH ácido, requerimento
nutricional menos rigoroso e maior resistência a contaminações (JEFFRIES, 2006).
As linhagens mais estudadas, por serem consideradas as melhores fermentadoras
de xilose, incluem espécies dos gêneros Candida, principalmente C. tropicalis e C.
guilliermondii (SENE et al., 2011), e Pichia, e as espécies Debaryomyces hansenii e
Pachysolen tannophilus (MEINANDER e HAHN-HÄGERDAL, 1997; AFFLECK,
2000; LIMA et al., 2003; JUCOSKI et al., 2007; CHANDEL, 2010), por liberarem o
xilitol como subproduto metabólico.
O primeiro passo no metabolismo da D-xilose é o transporte do açúcar
através da membrana celular. Uma vez no interior da célula, a D-xilose é reduzida a
xilitol pela xilose redutase NADPH-dependente. O xilitol por, sua vez, é oxidado para
xilulose pela xilose desidrogenase NAD-dependente. Essas duas reações iniciais
são consideradas limitantes na fermentação da D-xilose. A regeneração do NADPH
ocorre na via da pentose fosfato e a regeneração do NAD+ ocorre somente na cadeia
respiratória, com o oxigênio como aceptor final de elétrons (WINKELHAUSEN &
KUZMANOVA, 1998). Estudos da via catabólica da xilose nas leveduras têm
indicado a importância do balanço redox intracelular na absorção da xilose e no seu
consumo, indicando que a regeneração do cofator NADPH para a atividade da xilose
redutase (XR) pode ser um passo limitante na produção do xilitol (GRANSTRÖM,
2002; HUANG et al., 2011). Silva e colaboradores (1996) sugerem que microorganismos que apresentam a enzima XR dependente de NADH são melhores
produtores de etanol, ao contrário daqueles que apresentam a XR dependente de
NADPH, já que acumulam xilitol. A regeneração de cofatores encontra-se fortemente
ligada à disponibilidade de oxigênio, e pode causar o desbalanço redox, que
interfere na produção de xilitol e dos subprodutos do metabolismo.
16
Em condições aeróbias, as leveduras com atividade XR necessitam dos
cofatores NADH e NADPH (por exemplo, em Scheffersomyces stipitis) e podem
regenerar o NAD+ consumido no segundo passo do metabolismo da xilose. Nesse
caso, o principal produto da reação é o etanol. Em condições limitadas de oxigênio,
leveduras como D. hansenii consomem a xilose por atividade da XR-dependente de
NAD (com ausência completa de NADH ligado à XR), o que permite a acumulação
de xilitol (LEE et al.,1995; PARAJÓ et al., 1998; OOI et al., 2002; ARRUDA, 2006;
LIMA, 2006). Porém, quando submetido ao fornecimento limitado de oxigênio, não
ocorre a completa reoxidação de cofator, levando ao desequilíbrio redox (TAMANINI
& OLIVEIRA, 2004). Portanto, o alto grau de aeração favorece o crescimento celular,
prejudicando o acúmulo de xilitol.
Glicose
Xilose
Via pentose fosfato
Xilitol
Xilitol
O2
Fructose
6-fosfato
Cadéia respiratória
H2O
Xilulose
5-fosfato
Xilulose
Gliceraldeido
3-fosfato
Glicerol
Piruvato
Ácido acético
Etanol
Figura 4 – Vias metabólicas da glicose e xilose em leveduras. Fonte: adaptada de
Granström, 2002.
O presente trabalho poderá ser de grande importância, tanto ecológica como
biotecnológica, pois representa o primeiro estudo de identificação de leveduras
isoladas de madeira em decomposição das ilhas Galápagos, Equador, com enfoque
na seleção de espécies capazes de fermentar D-xilose que sejam potencialmente
produtoras de xilitol em hidrolisados de resíduos lignocelulósicos. As ilhas
Galápagos são reconhecidas como únicas no mundo por serem um centro de
17
endemismo, apresentando uma variabilidade de uma ilha para outra muito forte,
contendo assim populações, raças e até mesmas espécies geneticamente distintas,
características que inspiraram a Charles Darwin no desenvolvimento da teoria da
evolução. Em 1979, a UNESCO declarou este arquipélago de origem vulcânico
como Patrimônio Natural da Humanidade; em 1985 foram declaradas Reserva da
Biosfera; e, em 2001, a Reserva Marinha de Galápagos foi incluída na lista de
Patrimônio Natural da Humanidade. O estudo das espécies de leveduras isoladas
em madeira em decomposição será de grande contribuição para identificação da
riqueza microbiológica dessas ilhas, ainda desconhecida pela ciência. Alem disto,
poderá permitir a avaliação do potencial biotecnológico desses micro-organismos na
produção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos de biomassa
agroindustrial.
18
3
OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Identificar, caracterizar e selecionar leveduras isoladas de madeiras em decomposição do arquipélago das ilhas Galápagos com capacidade de produzir xilitol.
3.2 Objetivos específicos
1.
Identificar leveduras associadas à madeira em decomposição coletadas nas
ilhas Galápagos por métodos fisiológicos e moleculares.
2.
Selecionar leveduras com capacidade de produzir xilitol.
3.
Testar a capacidade de produção de xilitol em meio semi-sintético e em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar em escala de
bancada, pelas leveduras selecionadas.
4.
Avaliar em biorreator contendo hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar as
linhagens mais promissoras quanto à produção de xilitol.
19
4
MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção de micro-organismos
4.1.1 Áreas de coleta
As espécies utilizadas neste trabalho foram coletadas no arquipélago das
ilhas Galápagos (0° 40’ 0” S, 90° 33’ 0” W), Equador. O arquipélago localiza-se a
cerca de 1.000 km da costa continental e apresenta elevada biodiversidade, sendo o
habitat de uma fauna e flora peculiar, que inclui muitas espécies endêmicas. A
vegetação é árida nas áreas baixas das ilhas, com espécies de “palo santo” (Bursera
graveolens, Burseraceae), “arrayancillo” (Maytenus octogona, Celastraceae) e
cactos, como Jasminocereus thouarsii e Opuntia echios (Cactaceae)
(van der
WERFF, 1978). Nas partes altas das ilhas encontram-se bosques úmidos,
caracterizados pelo clima subtropical. As ladeiras vulcânicas se distinguem pela
presença de “cacaotillo” (Miconia sp.) e “lechoso” (Scalesia sp.), cobertas de briófitas
epifíticas (NEILL e JORGENSEN, 2012). A temperatura varia de 17 a 25 °C durante
todo o ano. Os padrões de precipitação e distribuição de chuvas são influenciados
pelas correntes marítimas do oceano Pacífico. A estação chuvosa vai de dezembro
a maio e a estação seca vai de maio a dezembro. A precipitação média anual é de
350 mm ao longo das costas das ilhas, enquanto na zona montanhosa do
arquipélago a média de precipitação chega, em algumas áreas, a 1.100 mm por ano
(NEILL e JORGENSEN, 2012; PARQUE NACIONAL GALÁPAGOS, 2012).
As coletas foram realizadas em outubro de 2009, de acordo com um projeto
de cooperação científica que envolveu pesquisadores do Brasil e do Equador
(PROSUL/CNPq: projeto número: 490430/2008-2, coordenado por Carlos A. RosaUFMG). Neste trabalho, as leveduras foram processadas, purificadas e enviadas
pela CLQCA (Colección de Levaduras Quito Católica da Pontificia Universidad
Católica del Ecuador) para a Coleção de Micro-organismos e Células da UFMG, a
partir do certificado Zoosanitario para la exportación No. 02199 do Ministerio de
Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca do Equador, e a autorização do
Ministerio del Ambiente baixo a Autorización de Exportación Científica pelo código
006-EXP-CIEN-FAN-DPAP/MA (Anexo 2).
20
Das coletas realizadas nas ilhas Galápagos foram isoladas cerca de 800
leveduras proveniente de amostras de madeira em decomposição, flores, frutos,
cascas de árvores e insetos. No presente estudo foram selecionados os isolados
provenientes de 35 amostras de madeira em decomposição. Da ilha Floreana (1° 17′
51″ S 90° 26′ 03″ O), na Estação de Proteção para Tartarugas, foram coletadas 12
amostras. O segundo ponto de coleta foi na ilha Isabela (1° 17′ 51″ S 90° 26′ 03″ O)
obtendo-se quatro amostras no entorno do vulcão “Sierra Negra”. Na ilha Santa Cruz
(0° 37′ 48″ S, 90° 21′ 36″ W) foram coletadas 19 amostras procedentes das crateras
“Los Gemelos” e da localidade “Media Luna”, caracterizada por ser um dos pontos
mais altos da ilha; o último ponto de coleta foi em “Puerto Ayora” (Anexo 1).
4.1.2 Coleta, processamento e preservação dos micro-organismos
As amostras de madeiras em decomposição foram coletadas com auxílio de
espátulas e pinças desinfetadas. As amostras foram armazenadas em sacolas
plásticas estéreis e transportadas em isopor contendo gelo até o processamento.
Cada amostra foi colocada separadamente em tubos Falcon de 50 mL, com 20 mL
de diferentes meios de cultura: YNB-D-xilose (Yeast Nitrogen Base- YNB 0,67%,
xilose 2% e cloranfenicol 0,01%), YNB-xilana (YNB 0,67%, xilana 2% e cloranfenicol
0,01%) e carboximetilcelulose (CMC) (carboximetilcelulose 1%, celobiose 0,05% e
cloranfenicol 0,01%). As amostras foram incubadas a 25 °C em agitação a 150 rpm,
por 3 a 15 dias. Após a detecção de crescimento celular, 100 μL de cada meio foram
transferidos para placas contendo ágar extrato de malte-extrato de levedura (YM)
(glicose 1%, extrato de levedura 0,3%, extrato de malte 0,3%, peptona bacteriológica
0,5%, ágar 2%) e incubadas a 25 °C, até obtenção do crescimento de colônias. Os
diferentes morfotipos foram purificados e preservados em meio GYMP modificado
(glicose 2%, extrato de levedura 0,5%, extrato de malte 1%, fosfato de sódio
monobásico 0,02% e 200 μL de glicerol) em ultrafreezer a -80 °C. As leveduras
foram preservadas na Colección de Levaduras Quito-Católica e posteriormente
enviadas e depositadas na Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade
Federal de Minas Gerais.
21
4.2
Identificação das leveduras por análises fisiológicas e moleculares
As leveduras foram agrupadas de acordo com a similaridade dos perfis
morfológicos e fisiológicos, seguindo as chaves taxonômicas e os protocolos
descritos por Kurtzman e colaboradores (2011). Cada levedura foi inoculada em
tubos com água destilada esterilizada, onde a concentração celular foi medida pelo
cartão de Wickerham (grau +2). Uma alíquota de 400 L de cada levedura foi
colocada individualmente em poços de um replicador, que foi utilizado para inocular
as leveduras em placas com diferentes fontes de açúcar. As placas foram incubadas
por 21 dias e as leituras dos crescimentos das leveduras foram registradas com 7,
14 e 21 dias, em uma escala que variou de negativo (–) até 3 (positivo), de acordo
com o crescimento (-,1,2,3). As leveduras com perfis fisiológicos idênticos foram
submetidas à análise molecular, por meio de PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase), utilizando-se o iniciador EI1 para realização do agrupamento em perfis
moleculares distintos.
4.2.1 Extração de DNA
Para extração do DNA total das leveduras, os isolados foram colocados para
crescer em ágar extrato de malte e extrato de levedura (glicose 1 %, extrato de
levedura 0,3 %, extrato de malte 0,3 %, peptona bacteriológica 0,5 %, ágar 2 %) a
25 °C, por 24 horas. Após o crescimento, as colônias foram ressuspendidas em 100
L de tampão de lise (Tris, EDTA 0,5 M, NaCl 5M, SDS 10%) e incubadas a 65 ºC,
por 30 minutos. Decorrida essa etapa do processo, adicionou-se um volume de 200
L de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) aos tubos, que foram vedados com
parafilme, homogeneizados por inversão e centrifugados a 3.000 x g, durante 15
minutos. O sobrenadante foi transferido com auxílio de uma pipeta e transferido para
outro tubo, ao qual foi adicionado 100 μL (v/v) de isopropanol. Os tubos foram
incubados à temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitação do DNA.
Após essa etapa, os tubos foram centrifugados a 3.000 x g, por 10 minutos, e o
sobrenadante foi descartado por inversão. Foram adicionados 200 L de etanol 70%
gelado ao pellet residual e os tubos foram homogeneizados por inversão. Efetuouse novamente uma centrifugação a 3.000 x g, por 10 minutos. Na última etapa do
processo, o sobrenadante foi descartado com auxílio de pipeta, e os tubos
22
incubados overnight à temperatura ambiente, para total evaporação do álcool. Após
essa etapa, o DNA foi ressuspendido em 100 L de tampão Tris EDTA 0,1 M (TE),
pH 8, e estocado a -20 ºC.
4.2.2 Agrupamento das leveduras por PCR-Fingerprinting
Cada grupo de leveduras formado com base nas características fisiológicas
foi submetido à técnica de PCR- Fingerprinting, utilizando-se o iniciador EI1
(CTGGCTTGGTGTATGT), segundo De Barros Lopes e colaboradores (1996), para
comprovação da similaridade dos perfis obtidos. A reação de PCR foi realizada em
um volume final de 25 L, contendo 2,5 L de tampão de PCR-Fermentans 10X, 1,5
L de MgCl2 1,5M, 1 L de dNTP 0,05 mM, 2 L do iniciador EI1 a 10 pmol L-1, de 1
a 2 L de DNA, 0,2 L de Taq DNA Polimerase 1,25 U L-1 (Taq DNA Polymerase
Fermentans) e água destilada e deionizada (Depc) até completar 25 L.
A reação de PCR foi realizada utilizando-se o termociclador PCR Express
(Eppendorf). O programa de amplificação consistiu na desnaturação inicial a 94 ºC
por 2 minutos, seguida por 40 ciclos de 45 segundos de desnaturação a 93ºC, 1
minuto de anelamento do iniciador a 50 ºC e 1 minuto de extensão a 72 ºC, e uma
extensão final por 6 minutos a 72 ºC. Os produtos da PCR foram analisados por
eletroforese em gel de agarose 1,5%, em tampão TBE 0,5X (54 g de tris base, 27,5
g de ácido bórico, 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0), eluídos durante aproximadamente
90 minutos a 80 V. As bandas foram coradas com solução de Gel-Red, e os géis
foram
visualizados
sob
luz
ultravioleta
e
fotografados
pelo
sistema
de
fotodocumentação de gel (Vilber Lourmat, França).
4.2.3 Amplificação do domínio D1/D2 da subunidade maior do gene do rRNA
Foi selecionado um exemplar de cada grupo de leveduras com perfis
moleculares similares a partir da PCR com o iniciador EI1, para análise da
sequência dos domínios D1/D2 da subunidade maior do gene do rRNA, utilizando-se
os iniciadores NL-1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL-4 (5’GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) (LACHANCE et al., 1999). Linhagens fisiológicamente distintas com padrões de banda únicos também foram selecionadas para
identificação direta pelo sequenciamento da região D1/D2 do gene do rRNA.
23
A reação de PCR foi realizada em um volume final de 50 L, contendo 5 L de
tampão de PCR (Fermentans) 10X, 2 L de MgSO4 1,5M, 2 L de dNTP 0,05 mM,
1 L dos iniciadores NL-1 e NL-4 a 10 pmol L-1 (MWG Biotech), 1 a 2 L de DNA,
0,2 L de Taq DNA Polimerase 1,25 U L-1 (Fermentans) e água Dpec até completar
50 L. As reações de PCR foram realizadas utilizando-se o termociclador PCR
Express (Esplendor). O programa de ciclagem consistiu na desnaturação inicial a
95 ºC por 2 minutos, durante um ciclo, seguido por 35 ciclos de 15 segundos de
desnaturação a 95 ºC, 25 segundos de anelamento do iniciador a 54 ºC e 20
segundos de extensão a 72 ºC, e uma extensão final por 10 minutos a 72 ºC. Os
produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em
tampão TBE 0,5X (54 g de Tris base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL de EDTA 0,5M,
pH 8,0), eluídos durante aproximadamente 20 minutos a 120 V. As bandas foram
coradas com solução de Gel-Red, e os géis foram visualizados sob luz ultravioleta e
fotografados pelo sistema de fotodocumentação de gel (Vilber Lourmat, França).
4.2.4 Amplificação da região ITS (Espaçador Interno Transcrito)
Para as leveduras cuja identificação não foi possível pelo sequenciamento do
domínio D1/D2, foi sequenciado a região ITS do gene do rDNA, utilizando-se os
iniciadores
ITS1
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)
e
ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC), conforme descrito por White e colaboradores
(1990). A PCR foi realizada em um volume final de 50 L, contendo 5 L de tampão
de PCR 5X (Fermentas), 2 L de MgCl2 25mM, 2 L de dNTP 10 mM, 1 L de cada
iniciador ITS1 e ITS4 10 mol-1 (MWG Biotech), 0,2 L de Taq DNA Polimerase 1,25
U L-1 e água Dpec até completar 50 L.
As reações de PCR foram realizadas em termociclador PCR Express. O
programa consistiu na desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos, seguida por 35
ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94 ºC, 1 minuto de anelamento a 55 ºC e 1
minuto de extensão a 72 ºC, e uma extensão final por 5 minutos a 72 ºC. Os
produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em
tampão TBE 0,5X, eluídos durante aproximadamente 30 minutos a 120 V. As
bandas foram coradas com solução de GelRed, e os géis visualizados sob luz
ultravioleta e fotografados pelo sistema de fotodocumentação de gel (Vilber
Lourmat).
24
4.2.4 Purificação dos produtos de PCR e reação de sequenciamento
Os amplicons gerados pela reação de PCR com os iniciadores NL-1/NL-4 e
ITS1/ITS4 foram purificados pela adição de 11,25 L de EDTA 125 mM e 135 L de
etanol absoluto. A reação foi incubada por 15 minutos à temperatura ambiente e os
tubos foram centrifugados a 3.000 x g, por 25 minutos. O sobrenadante foi retirado e
descartado com auxílio de pipeta. Em seguida, foram adicionados 120 L de etanol
a 70% gelado aos tubos, que foram, então, homogeneizados por inversão.
Posteriormente, foram centrifugados a 3.000 x g por 10 minutos e o etanol foi
retirado com auxílio da pipeta. Este último passo de lavagem dos amplicons com
etanol foi realizado duas vezes. Os tubos foram deixados overnight à temperatura
ambiente, para total evaporação do etanol. Decorrida essa etapa, as amostras foram
ressuspendidas com 10 L de água Dpec e armazenadas a -20 °C.
Os produtos purificados foram dosados em NanoDrop ND 1000 (NanoDrop
Technologies). As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando-se o Kit
DYEnamicTM (Amersham Biosciences, EUA), em combinação com o sistema de
sequenciamento automatizado MegaBACETM 1000, no Núcleo de Análise de
Genoma e Expressão Gênica (NAGE) do Departamento de Bioquímica e Imunologia
– ICB/UFMG. Para as espécies novas ou de linhagens de interesse biotecnológico,
as amostras foram confirmadas por sequenciamento por eletroforese capilar em
aparelho ABI3130, utilizando polímero POP7 e BigDye v3.1 (Valid Biotechnology),
no Laboratório de Genética da Faculdade de Veterinária-UFMG.
As sequências de DNA foram analisadas pelo programa BLAST (Basic Local
Alignment Serch Tool - versão 2.215 do BLAST 2.0), disponível no portal NCBI
desenvolvido pelo National Center For Biothecnology (USA). As sequências obtidas
foram comparadas com as sequências já depositadas no GenBank, e as sequências
similares foram alinhadas pelo programa DNA Baser v3.5.3. Isolados apresentando
similaridade na sequência analisada de 99 % ou mais em relação a outro já
depositado no GenBank foram considerados como pertencentes àquela espécie
conhecida. Os isolados que apresentaram três ou mais diferenças nucleotídicas não
contíguas quando comparados às espécies mais proximamente relacionadas foram
considerados potenciais novas espécies (KURTZMAN et al., 2011).
25
4.3 Seleção de leveduras para produção de xilitol a partir de D-xilose
4.3.1
Avaliação das leveduras assimiladoras de D-xilose
Com base nos resultados dos perfis fisiológicos obtidos para cada levedura
(item 4.2), foram selecionadas as leveduras que apresentaram capacidade de
crescer em meio contendo D-xilose como única fonte de carbono. Uma placa de
YNB contendo 0,5 g de glicose (controle positivo para o crescimento das leveduras)
e placas contendo somente YNB (controle negativo para crescimento das leveduras)
foram incluídas.
4.3.2 Seleção das leveduras produtoras de xilitol
As leveduras com crescimento positivo em D-xilose, segundo os testes
utilizados em perfis fisiológicos indicados no item 4.3.1, foram diluídas em água
destilada esterilizada até o número 2 do cartão de Wickerham, e 200 L dessa
solução foram inoculados em tubos contendo 2 mL do meio YPX (extrato de
levedura 1%, peptona 2%, xilose 3%), posteriormente incubado a 25 °C, a 200 rpm,
durante 48 horas. A quantidade de xilitol produzida foi determinada por CLAE
(Cromatografía Líquida de Alta Eficiência), utilizando-se a versão do programa 1.21
do Lc-Solution, Detector SPD-M20A; um detector de índice de refração (RI); e a
coluna Supelco SUPELCOGEL™ C-610H HPLC Column (59320-U) (SigmaAldrich®) (300x 7,8 mm), nas seguintes condições: H2SO4 5mM como eluente; 1.0
ml.min-1 fluxo; temperatura da coluna 65˚C; detector da atenuação 16x; e volume de
injeção da amostra 25 l.
4.4 Ensaios de fermentação em meio semi-sintético com D-xilose e em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar
As espécies que apresentaram a mais alta produção de xilitol nos ensaios de
seleção de bancada em meio YPX foram submetidas a ensaios fermentativos em
escala de bancada, em meio semi-sintético contendo D-xilose como única fonte de
carbono. A partir dos resultados encontrados neste meio, foram selecionadas as
leveduras que apresentaram maior produtividade e rendimento de xilitol para serem
testadas em ensaios fermentativos, utilizando o hidrolisado hemicelulósico de
26
bagaço de cana-de-açúcar. Dos resultados obtidos em escala de bancada com este
substrato, foram selecionadas duas linhagens que apresentaram resultados
promissores para produção de xilitol em biorreator. Os ensaios fermentativos foram
realizados
no
Laboratório
de
Microbiologia
Aplicada
e
Biotecnologia
do
Departamento de Biotecnologia (DEBIQ) da Escola de Engenharia de Lorena (EEL)
da Universidade de São Paulo (USP), sob orientação do Prof. Dr. Silvio Silvério da
Silva, durante os meses de junho a agosto, e de novembro a dezembro de 2012.
4.4.1 Determinação do inóculo inicial
A
concentração
celular
foi
determinada
a
600
nm,
utilizando
um
espectrofotômetro Beckman DU 640 B, onde a concentração de células em g.L-1 foi
calculada, utilizando uma curva-padrão que correlaciona a absorbância medida a
600 nm ao peso seco das células. O inóculo inicial foi feito em frascos Erlenmeyer
de 250 mL contendo 100 mL do meio de cultivo contendo D-xilose (30 g.L-1), extrato
de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0,1 g.L-1). Os frascos
foram incubados a 30 °C por 24 horas em um agitador rotatório a 200 rpm
(ARRUDA, 2011).
As soluções de sulfato de amônio e cloreto de cálcio dihidratado foram
preparadas separadamente nas concentrações de 200 e 10 g.L-1, respectivamente, e
esterilizadas em autoclave a 1 atm por 20 minutos. Para utilização do extrato de
farelo de arroz como nutriente, foram empregados 200 g de farelo para 1 litro de
água destilada, e autoclavados por 15 minutos a 0,5 atm. Após o resfriamento a
solução foi centrifugada a 2.000 x g por 30 minutos, em condições assépticas. A
fração líquida (extrato de farelo de arroz) foi transferida para um frasco previamente
esterilizado e estocado na geladeira até a sua utilização (ARRUDA, 2011).
Após 24 horas, as leveduras foram recuperadas por centrifugação a 3.000 x g
durante 15 minutos, o sobrenadante foi retirado e as células foram lavadas com a
mesma quantidade original de água destilada estéril. As amostras foram
homogeneizadas em vórtex e centrifugadas a 3.000 x g, por 15 minutos. O
sobrenadante foi retirado, e ao pellet adicionou-se água destilada esterilizada,
seguido de homogeneização em vórtex. Três mililitros da solução foram retirados e
colocados em cadinhos previamente secos em estufa, dessecados e pesados, em
27
triplicata. Os recipientes foram colocados na estufa a 100 °C, por 24 horas, e no
desumidificador por 1 hora; posteriormente cada cadinho foi pesado até não se
observar variação significativa do peso. As medições foram feitas por um período de
até 96 horas.
4.4.2 Fermentação em meio semi-sintético contendo D-xilose
As leveduras foram previamente cultivadas em frascos com 100 mL de meio
contendo D-xilose (30 g.L-1), extrato de farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1)
e CaCl2.2H2O (0,1 g.L-1), e incubadas em agitador horizontal (Quimis Q816M20) a
200 rpm, a 30 ºC, por 24 horas. Para obtenção do inóculo, as células foram
recuperadas por centrifugação a 2.000 x g, durante 20 minutos, o pellet formado foi
lavado duas vezes com água destilada esterilizada e ressuspendido diretamente em
10 % (v/v) do meio de fermentação, com a concentração celular em densidade ótica
igual a 1 (DO, 600 nm), que corresponde a aproximadamente 0,5-1,0 g.L-1 de células
(em peso seco). As células foram ressuspendidas diretamente em 10% (v/v) do meio
de fermentação, com a concentração celular em densidade ótica igual a 1 (DO, 600
nm), que corresponde a aproximadamente 0,5-1,0 g.L-1 de células (em peso seco).
As fermentações foram conduzidas em triplicata, em frascos de 250 mL contendo
100 mL de meio com D-xilose (50 g.L-1), extrato de farelo de arroz (20 g.L-1),
(NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0.1 g.L-1), pH 5,5. Os frascos foram incubados a
30 °C sob agitação de 200 rpm, por 72 horas. Alíquotas de 1,5 mL foram retiradas
com 0, 12, 24, 48 e 72 horas de incubação, para serem avaliadas quanto à
concentração celular a 600 nm. As amostras foram centrifugadas a 3.000 x g,
durante 15 minutos, e filtradas para determinação das concentrações de açúcares
(xilose, arabinose e glicose), ácido acético, glicerol, xilitol e etanol, por CLAE
(ARRUDA, 2011). As linhagens que apresentaram produção de xilitol mais elevada e
maior consumo de D-xilose foram escolhidas para serem testadas em ensaios de
fermentação em meio hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar.
4.4.3 Preparo do bagaço de cana-de-açúcar para a hidrólise
O bagaço de cana-de-açúcar utilizado nos experimentos foi fornecido pela
Usina de Açúcar e Álcool Costa Pinto do Grupo COSAN, localizada em Santa
28
Terezinha, na cidade de Piracicaba, São Paulo. O bagaço foi submetido à tripla
lavagem, para remoção de qualquer resíduo de açúcar. Após lavagem, o bagaço foi
seco ao sol por aproximadamente 72 horas, até atingir 10% de umidade, sendo esta
medida obtida por secagem em estufa até que o peso alcançasse um valor
constante (JUCOSKI et al., 2007; ARRUDA, 2011).
4.4.4 Obtenção e caracterização do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar
Os
processos
de
hidrólises
ácida
para
rompimento
da
estrutura
lignocelulósica foram feitos em um reator de aço inoxidável AISI 316 com
capacidade volumétrica de 350 L. O reator foi operado em regime descontínuo a
121 °C, por 20 minutos, utilizando 100 mg de ácido sulfúrico (98%) para 1 g de
bagaço (matéria seca), em uma relação de sólido-líquido de 1:10. O hidrolisado
resultante após este procedimento foi filtrado para remoção da massa residual de
sólidos (celulignina). Posteriormente, o hidrolisado foi caracterizado quanto ao pH e
quanto aos teores de glicose, xilose e arabinose. Também foi caracterizado quanto à
concentração dos compostos tóxicos, como furfural, 5-hidroximetil-furfural e ácido
acético (ALVES, 2006). Após a caracterização, o hidrolisado foi concentrado a
vácuo, utilizando um sistema de condensação à temperatura de 70 ± 5 °C, com a
finalidade de aumentar o teor inicial de xilose (ALVES, 2006; ARRUDA, 2011).
4.4.5 Detoxificação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar
O hidrolisado foi detoxificado pela alteração de pH, combinada à adsorção de
carvão ativo. O pH ácido do hidrolisado, inferior a 2, foi elevado a 7,0 com adição de
CaO, e posteriormente reduzido até 5,5 com H3PO4, seguido pela adição de carvão
ativado (2,5% m/v) (pó refinado), a 30 °C, agitação de 200 rpm durante 60 minutos.
Após cada tratamento, o hidrolisado foi filtrado em papel-filtro, sob vácuo, para
remoção dos precipitados formados. O hidrolisado destoxificado foi autoclavado a
111 °C durante, 15 minutos (ALVES et al., 1998; DA SILVA et al., 2007; SENE et al.,
2011).
29
4.4.6. Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar em escala de bancada
As leveduras selecionadas no item 4.4.2 foram inoculadas em triplicata, em
frascos de 250 mL contendo 100 mL de D-xilose (30 g.L-1), extrato de farelo de arroz
(20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0,1 g.L-1), e incubadas em agitador
rotatório a 200 rpm, a 30°C, por 24 horas. Para obtenção do inóculo as células foram
recuperadas por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos, o pellet formado foi
igual a 1 (DO, 600 nm), que corresponde a aproximadamente 0,5-1,0 g.L-1 de células
(em peso seco).
Os experimentos utilizando-se o meio hidrolisado hemicelulósico de bagaço
de cana-de-açúcar destoxificado e suplementado com extrato de farelo de arroz (20
g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0.1 g.L-1), a pH 5.5, foram realizados em
triplicata para cada isolado. As leveduras foram incubadas sob agitação a 200 rpm, a
30 °C, durante 120 horas. Alíquotas de 1,5 mL foram retiradas às 0, 12, 24, 48, 72,
96 e 120 horas de incubação, para serem avaliadas quanto à concentração celular a
600 nm. As amostras foram centrifugadas a 2.000 x g, por 15 minutos, e filtradas
para determinação das concentrações dos açúcares (xilose, arabinose e glicose),
ácido acético, glicerol, etanol e xilitol, feitas por CLAE (FELIPE et al., 1997; DA
SILVA et al., 2007; HUANG et al., 2011; SENE et al., 2011). As linhagens com o
melhor consumo de D-xilose e maior rendimento e produtividade em xilitol foram
escolhidas para serem testadas em biorreator agitado-STR, com volume nominal de
2,4 L.
4.4.7 Fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar em biorreator
Os inóculos das leveduras selecionadas foram preparados em frascos
Erlenmeyer de 500 mL, contendo D-xilose (30 g.L-1) suplementado com extrato de
farelo de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0,1 g.L-1), em um
agitador rotatório a 200 rpm, a 30°C, por 24 horas. Após este período as células
foram recuperadas por centrifugação a 3.000 x g por 20 minutos, o pellet formado foi
30
igual a 0,5 (DO, 600 nm), que corresponde a aproximadamente 0,2-0,5 g.L-1 de
células (em peso seco).
Os ensaios de fermentação foram realizados no biorreator STR, com volume
nominal de 2,4 L (Anexo 3), contendo 1,5 L de hidrolisado hemicelulósico de bagaço
de cana-de-açúcar concentrado, destoxificado e suplementado com extrato de farelo
de arroz (20 g.L-1), (NH4)2SO4 (2 g.L-1) e CaCl2.2H2O (0.1 g.L-1). A agitação foi de
450 rpm e a aeração de 0,70 vvm. As fermentações foram conduzidas a 30 °C, por
96 horas, e o KLa (coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio) foi de 7 h-1 .
Os ensaios foram feitos em duplicata. As amostras foram coletadas nos tempos 0,
12, 24, 36, 48, 60, 72 e 96 horas, para determinação das concentrações dos
açúcares (xilose, arabinose e glicose), xilitol, glicerol, ácido acético e etanol,
utilizando CLAE.
4.5 Métodos analíticos
4.5.1 Determinação
de
carboidratos,
ácidos
orgânicos,
furfural
e
5-
hidroximetilfurfural
Cada amostra foi previamente filtrada com filtros Sep pak C18 (Waters, USA)
e as diluições apropriadas foram feitas com água milli-Q. As análises quantitativas
das concentrações de glicose, xilose, arabinose, xilitol e glicerol foram feitas por
CLAE (Agilent Technologies 1200 Series) (HUANG et al., 2011), usando um detector
de índice de refração (RI), detector Bio-Rad Aminex HPX-87H, coluna HPX-87-H
(300x 7,8 mm) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), mantida nas seguintes condições:
0,01 N H2SO4 5 mM como eluente; 0,6 ml min-1 fluxo; temperatura da coluna 45 ˚C; e
volume de injeção 20 µL (FELIPE et al., 1997; SENE et al., 2011).
Para determinação das concentrações de furfural e hidroximetilfurfural, as
amostras foram previamente filtradas em membrana Minisart 0,22 μm (Millipore). A
determinação foi feita por CLAE, nas seguintes condições: Coluna Hewlett-Packard
RP18 mantida a 25 °C, detector de ultravioleta (SPD-10A UV-VIS), solução de
acetonitrila /H2O (1:8) com 1% de ácido acético como eluente, fluxo de 0,8 mL min -1
31
e um volume de injeção de 20 μL (ARRUDA, 2011; SENE et al., 2011). A
concentração celular dos inóculos foi determinada comparando-se a densidade ótica
da suspensão celular com a curva-padrão (absorbância a 600 nm x peso seco da
célula) (FELIPE et al., 2007).
4.5.2 Determinação dos parâmetros cinéticos fermentativos

Fator de conversão de D-xilose em xilitol (Yp/s)
O fator de conversão ou fator de rendimento é aquele que expressa a massa
de xilitol produzido por massa de xilose consumido, em gramas, e foi calculado pela
equação 1:
(1)
em que
Si e Sf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilose (g.L-1); e
Pi e Pf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilitol (g.L-1).

Fator de conversão de substrato em biomassa (Yx/s)
O fator de conversão de D-xilose em biomassa é aquele que expressa a
massa celular produzida por grama de açúcar consumido, e foi calculado segundo a
equação 2:
(2)
em que
Xi e Xf correspondem às concentrações iniciais e finais de biomassa celular (g.L-1); e
Si e Sf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilose (g.L-1).
32

Produtividade volumétrica de xilitol (Qp)
A produtividade volumétrica de xilitol expressa a concentração de xilitol produzido
(g.L-1) por tempo (h), e foi calculada de acordo com a equação 3:
(3)
em que
Pi e Pf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilitol (g.L-1); e
Ti e Tf correspondem aos tempos iniciais e finais de fermentação (h).

Eficiência de conversão ()
Este parâmetro fermentativo, expresso em porcentagem, representa a razão
entre o fator de rendimento (Yp/s) obtido experimentalmente e o fator de rendimento
teórico de 0,917 grama de xilitol/gramas de xilose. O parâmetro foi calculado de
acordo com a equação 4 (BARBOSA et al., 1988):
 =
(Pf – Pi * 100)
(4)
(Sf - Si)* 0,917
em que
Pi e Pf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilitol (g.L-1); e
Si e Sf correspondem às concentrações iniciais e finais de xilose (g.L-1).

Fator de rendimento produto por biomassa (Yp/x)
Este fator expressa a conversão de massa celular em produto em U.g -1, e foi
calculado pela equação 5:
Yp/x =
P
X
=
(Pf – Pi)
(5)
(Xf - Xi)
33
em que
Pf e Pi correspondem às concentrações iniciais e finais de xilitol; e
Xf e Xi correspondem às concentrações iniciais e finais de biomassa celular.
4.5.3 Determinação do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio
O coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio foi determinada pela
metodologia de “gassing-out”, segundo Pirt (1975). O meio de cultivo sem células foi
aerado com nitrogênio para reduzir o nível de oxigênio dissolvido no meio. O
biorreator foi agitado nas condições desejadas para à fermentação, monitoreando-se
o aumento da concentração do oxigênio dissolvido em função do tempo (cada 5
seg). Foi integrada a Equação 6 baseada no balanço de oxigênio no meio líquido e
posteriormente foi calculada a relação pela Equação 7.
dC
dT
= KLa
c* - c
(6)
Assim teremos:
ln
1-
c
-KLa * t
c* =
(7)
Onde:
c : corresponde a leitura do eletrodo (fração da concentração de oxigênio
c*
dissolvido em relação à concentração de saturação).
O gráfico do logaritmo de 1- c em função do tempo permite a determinação do
c*
valor de KLa em h-1.
4.5.4 Análises estatísticas
As diferenças estatísticas entre os resultados obtidos para produção de xilitol,
etanol e consumo de D-xilose foram determinadas por meio do teste de análise de
variância (ANOVA) de um fator em DCA (Desenho Experimental Aleatório), levando
em consideração análise do intervalo de confiança para as médias dos tratamentos,
utilizando-se probabilidade máxima de erro de 5% (α=0,05). Os efeitos cujo valor foi
menor que 0,05 foram considerados significativos. Para os tratamentos que
34
apresentaram diferenças significativas, foi realizado o agrupamento e a comparação
de cada variável em faixas homogêneas pela prova de Tukey, com probabilidade
máxima de erro de 5%. As análises foram feitas pelo programa SPSS, versão 13.0
(SÁNCHEZ, 2006).
35
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1
Identificação
das
leveduras
e
seleção
de
micro-organismos
assimiladores de D-xilose
Um total de 140 isolados de leveduras foi obtido a partir de 35 amostras de
madeira em decomposição, coletadas no arquipélago das ilhas Galápagos. Na ilha
Floreana foram obtidos 89 isolados a partir de 12 amostras, na ilha Santa Cruz 45
isolados de 19 amostras e na ilha Isabela seis isolados de quatro amostras. Dos
isolados obtidos, foram identificados 15 gêneros e 35 espécies de leveduras.
Bhadra e colaboradores (2008) isolaram 239 leveduras pertencentes a 18
gêneros, a partir de 52 amostras de cascas de árvores da Índia cultivadas em ágar
extrato de malte e extrato de levedura (YMA). O número de isolados do presente
estudo (140) foi menor que os obtidos pelos autores citados, no entanto o número de
gêneros foi similar (15); em ambos os trabalhos foram identificadas espécies
pertencentes aos gêneros Pichia, Debaryomyces e Issatchenkia.
Cadete e colaboradores (2012) coletaram madeira em decomposição em duas
localidades da Floresta Amazônica Brasileira e isolaram 224 leveduras, pertencentes
a 33 espécies. Apesar das leveduras estudadas no presente trabalho terem sido
coletadas em um ambiente com condições naturais diferentes do anterior, por ser
um arquipélago do oceano Pacífico, o número de espécies (35 espécies a partir de
140 isolados) identificadas foi similar. Entretanto, cinco novas espécies de leveduras
foram isoladas por Cadete e colaboradores, enquanto no presente estudo foi obtida
apenas uma nova espécie. Espécies dos gêneros Candida, Cryptococcus,
Debaromyces, Scheffersomyces e Trichosporon coincidiram nos dois estudos.
Dentre as leveduras encontradas no presente estudo, 99 isolados assimilaram
D-xilose (70,7 % do total de isolados). Este resultado foi maior que o obtido por Rao
e colaboradores (2008) no qual foram isoladas 374 leveduras de cascas de árvore e
frutos em decomposição. Destas, somente 27 foram capazes de assimilar xilose
(11,3% do total dos isolados). Várias espécies foram encontradas em ambos os
trabalhos, principalmente as dos gêneros Pichia, Candida, Debaryomyces,
Cryptococcus e Issatchenkia. Na Tabela 2 e no Apêndice 1 são mostrados a
36
identificação das espécies, o número de isolados, o meio de isolamento, o número
da amostra em que cada isolado foi obtido e a capacidade de assimilação de Dxilose pelas leveduras testadas.
Em um estudo similar, Guo e colaboradores (2006) isolaram 274 leveduras
em meio YPX (extrato de levedura, peptona e xilose), dos quais somente 45
apresentaram crescimento positivo em D-xilose como única fonte de carbono,
correspondendo a 16,4% dos isolados. No presente estudo, das 100 leveduras
isoladas em meio YNB-D-xilose, 63 apresentaram crescimento positivo para esta
fonte de carbono, representando 63% dos isolados. Do total de isolados obtidos nos
três meios de cultura utilizados no presente trabalho, 99 apresentaram resultados
positivos para a assimilação de D-xilose. Os gêneros de leveduras assimiladoras
que tiveram resultados positivos em ambos os estudos correspondem a Candida,
Trichosporon, Geotrichum e Pichia.
Das 35 espécies de leveduras identificadas, algumas foram restritas a pelo
menos uma das ilhas e outras foram encontradas em mais de uma localidade. Vinte
e quatro espécies foram identificadas na Ilha Floreana, 20 na ilha Santa Cruz e três
na ilha Isabela. A distribuição das espécies encontradas nessas localidades está
representada na Figura 5.
Figura 5 - Distribuição do número de espécies de leveduras nos locais de coleta.
37
Tabela 2 - Identificação das espécies, código dos isolados e assimilação de D-xilose pelas
leveduras obtidas neste trabalho a partir de amostras de madeira em decomposição
coletadas no arquipélago de Galápagos, Equador
Espécie
1
Candida (Lodderomyces) albicans
C. (Yamadazyma) amphixiae
C. (Yamadazyma) dendronema
C.(Kazachstania) humilis
C. (Metschnikowia) intermedia
C. naeodendra
Assimilação de Dxilose
Código
2 3
CLQCA -24 F -067,
F-157, F-161b, F-163
+
F-171
+
F-137, F-177
4
+
CLQCA-24SC -121
-
F-150, SC-315
+
F-110
+
F-011, F-041, F-065,
C. (Kurtzmaniella) natalensis
F-101, F-105, F-134,
F-136, F-146, F-149,
±
F-169
C. (Lodderomyces) parapsilosis
C. (Metschnikowia) pseudointermedia
SC-266
+
F-005, F-035, F-113, SC-240
+
F-127, SC-027, SC-087,
C. sinolaborantium
SC-144, SC-207, SC-262,
+
SC-331
C. (Saturnispora) silvae
F-047, F-063, F-096,
F-111, F-130, F-156
-
F-042, F-052, F-066,
F-081, F-084, F-087,
F-092, F-109, F-112,
C.(Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis
F-115, F-119, F-123,
F-125, F-126, F-151,
+
F-167,
SC-0111, SC-122, SC-209,
SC-239, SC-246, SC-322
C. (Yamadazyma) trypodendroni
SC-018, SC-019, SC-023,
SC-024, SC-118, SC-325
+
F-143,
1
2 5
CLQCA -24 I -099
+
Cr. (Bulleromyces) humicola
SC-133
+
Cr. (Bulleromyces) laurentii
I-130, I-161, SC-043
+
SC-244
+
Cryptococcus (Bulleromyces) flavescens
D. nepalensis
Galactomyces geotrichum
F-128,
SC-223, SC-232, SC-305
F-020, F-133,
SC-070, SC-114
+
+
Continua…
38
Tabela 2, Cont.
Espécie
Geotrichum silvicola
Issatchenkia terricola
Kazachstania exigua
Código
Assimilação de Dxilose
SC-132
+
F-034, F-068,
F-161a, F-174
SC-173
±
+
F-069, F-070, F-071,
F-072, F-073, F-076,
K. unispora
F-077, F-080, F-086,
-
F-104, F-164, F-165,
F-166, SC-045, SC-185
Lindnera saturnus
SC-206
-
Lindnera sp.
SC-025
+
Pichia manshurica
Scheffersomyces stipitis
Torulaspora delbrueckii
Trichosporon coremiiforme
F-039, F-061, F-079,
F-082, F-083, F-154
SC-320, SC-321
F-040, F-064, F-074,
F-075, F-078, F-093
+
-
F-095
+
Tr. jirovecii
F-006, F-145, SC-217
+
Tr. laibachii
F-094b
+
Tr. multisporon
F-094a
+
F-118, F-178
+
F-129,
I-107, I-154, I-194
+
Wickerhamomyces anomalus
Yamadazyma (Pichia) mexicana
F-097, F-144, F-152,
Zygowilliopsis californica
SC-131, SC-143, SC-164,
+
SC-196, SC-306, SC-314
1
CLQCA = Coleção de Leveduras Quito - Católica.
24 = Número designado para a província das ilhas do arquipélago de Galápagos segundo a base de
dados da CLQCA.
3
F = Leveduras coletadas na ilha Floreana.
4
SC = Leveduras coletadas na ilha Santa Cruz.
5
I = Leveduras coletadas na ilha Isabela.
2
As espécies isoladas na ilha Floreana que também foram encontradas na ilha
Santa Cruz foram Candida intermedia, C. pseudointermedia, C. sinolaborantium, C.
tropicalis, Debaryomyces nepalensis, Galactomyces geotrichum, Kazachstania
unispora, Trichosporon jirovecii e Zygowilliopsis californica. Na ilha Isabela foram
obtidos poucos isolados de leveduras, sendo três de Yamadazyma mexicana e um
de Cryptococcus flavescens, espécies também encontradas na ilha Floreana, e dois
de Cr. laurentii, espécie também presente na Ilha Santa Cruz.
39
O baixo número de isolados coletados na ilha Isabela pode estar relacionado
às condições climáticas desfavoráveis da ilha, caracterizadas pelo clima muito seco
e subtropical nas partes baixas do vulcão “Sierra Negra” (PARQUE NACIONAL
GALÁPAGOS, 2012). Esse é considerado um dos dez vulcões mais perigosos do
mundo, pela constante atividade. Nos últimos 200 anos foram registradas mais de
60 erupções, sendo a última em 2005 (DIARIO EL HOY, 2005; PLANETA AZUL,
2011). Desta forma, essas condições climáticas podem fazer do ambiente um local
hostil e inóspito para a sobrevivência de muitos micro-organismos.
As espécies Candida albicans, C. amphixiae, C. dendronema, C. naeodendra,
C. natalensis, C. silvae, Issatchenkia terricola, Pichia manshurica, Torulaspora
delbrueckii,
Trichosporon
coremiiforme,
Tr.
laibachii,
Tr.
multisporon
e
Wickerhamomyces anomalus foram isoladas somente na ilha Floreana. As espécies
C. humilis, C. parapsilosis, C. trypodendroni, Cr. humicola, Debaryomyces hansenii,
Geotrichum silvicola, Kazachstania exigua, Scheffersomyces stipitis, Lindnera
(Williopsis) saturnus e Lindnera sp. foram encontradas somente na ilha de Santa
Cruz.
A partir das amostras de madeira em decomposição, o meio de cultivo para
isolamento das leveduras em que se observou maior crescimento foi em D-xilose,
com 100 isolados, seguido do meio CMC, com 23 isolados. No meio xilana
cresceram o menor número de isolados, obtendo-se 17 leveduras (Apêndice 1). Em
relação à assimilação de D-xilose, todas as leveduras isoladas em xilana foram
capazes de assimilar essa pentose. Dos isolados crescidos em CMC, 19 foram
capazes de assimilar D-xilose (82,6%) e quatro isolados foram negativos (17,4%).
Em relação às leveduras isoladas em D-xilose, 63 (o que corresponde a 63%)
apresentaram assimilação positiva e 37 (37%) não foram capazes de assimilar Dxilose como única fonte de carbono. O crescimento destas leveduras pode ter sido
devido a presença de nutrientes originários da madeira inoculada nos meios de
cultura. Estas podem conter outros açúcares que tenham favorecido o crescimento
de leveduras não assimiladores de D-xilose (CARVALHO et al., 2009).
Os isolados negativos para a assimilação de D-xilose como única fonte de
carbono, obtidos no presente estudo, pertencem às espécies C. humilis, C.
natalensis, C. silvae, I. terricola, K. unispora, P. manshurica, T. delbrueckii e L.
40
saturnus.
Os
isolados
pertencentes
ao
clado
Lodderomyces/Spathaspora,
Kurtzmaniella e Yamadazyma representados pelas espécies Candida tropicalis, C.
natalensis e C. trypodendroni foram identificados como predominantes no presente
estudo. As espécies do clado Lodderomyces/Spathaspora têm sido caracterizadas
por abrigar os isolados de leveduras melhores produtores de xilitol (FELIPE et al.,
1993; WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998; JUCOSKY et al., 2007). Pessoa
(1997) avaliou 22 espécies diferentes de leveduras em hidrolisado de bagaço de
cana-de-açúcar e constatou que as espécies de Candida foram as que melhor
cresceram nesse meio de cultivo. As espécies mais estudadas dentro desse gênero,
pela alta produtividade e rendimento de xilitol, são C. tropicalis (PESSOA, 1997;
CHOI et al., 2000, RAO et al., 2006; CHENG et al., 2009; MISRA et al., 2011), C.
guilliermondii (BARBOSA et al., 1988; ROBERTO et al., 1995; LEE et al., 1996;
FELIPE et al., 1997; ALVES et al., 1998; OOI et al., 2002; DA SILVA et al.,2007;
JUCOSKI et al., 2007; SENE et al., 2011), C. parapsilosis (PREZIOSI-BELLOY et al.,
1997; DEOK-KUN, 1998), C. boidinii (VANDESKA et al., 1995) e C. peltata (SAHA e
BOTHAST, 1999).
A espécie C. tropicalis, com maior número de isolados no presente estudo
(22), já foi reportada como associada a amostras de árvores, frutas, flores, cactos,
solo, água e espécimes clínicos. As aplicações biotecnológicas dessa levedura têm
sido registradas, por causa de sua habilidade de degradação de hidrocarbonos e
biotransformação de lipídeos, e nos processos de tratamento biológico aeróbio para
degradação de polifenóis em águas residuais (ETTAYEBI et al., 2003; KURTZMAN
et al., 2011). Desde a década de 1970, essa espécie vem sendo estudada pela
capacidade de fermentar resíduos agroindustriais, produzindo xilitol (BARBOSA et
al., 1988; WALTHER et al.,2001; GRANSTRÖM, 2002; LIMA et al., 2003; LIMA,
2006; JUCOSKY et al., 2007; SCHIRMER, 2007).
Na Tabela 2 e Apêndice 2 são mostrados os resultados de identificação das
leveduras segundo as análises das sequências dos domínios D1/D2 e da região ITS.
O poder discriminatório das sequências da região D1/D2 é, na maioria dos casos,
considerado suficiente para descrever novas espécies de leveduras. Isolados da
mesma espécie apresentam no máximo de duas a três bases diferentes não
contíguas em uma região de cerca de 600 nucleotídeos (KURTZMAN e FELL, 2006).
Com base nesse conceito, o isolado CLQCA-24SC-025 representa uma nova
41
espécie, pertencente ao gênero Lindnera. Essa espécie difere em 34 substituições e
seis gaps na região D1/D2 da espécie mais próxima, Lindnera saturnus. Em relação
ao sequenciamento da região ITS, a nova espécie apresentou 28 substituições e dez
gaps, comparada com L. saturnus (Apêndice 2). Especies do gênero Lindnera
geralmente estão associadas a insetos, frutas ou solo (KURTZMAN et al., 2011).
O agrupamento por métodos moleculares utilizando o iniciador EI1 foi
importante para discriminação das espécies de leveduras isoladas. Algumas
espécies apresentaram elevado grau de polimorfismo, principalmente C. tropicalis,
K. unispora e C. natalensis, possivelmente por ser esse iniciador complementar a
uma região muito conservada do genoma das leveduras. A eficácia do iniciador EI1
na discriminação de diferentes espécies de leveduras tem sido reportada por vários
autores. De Barros Lopes e colaboradores (1996) relataram que o método baseado
em PCR com este iniciador tem sido eficaz para diferenciar linhagens de leveduras
presentes em vinhos, com a vantagem de poder analisar várias amostras em pouco
tempo. Outros autores também consideram essa metodologia uma excelente
ferramenta para detectar polimorfismos entre linhagens contaminantes de processos
de fermentação (PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001, COSTA-SILVA et al.,
2010). As Figuras 6, 7 e 8 exibem a impressão digital do DNA para discriminação
dos isolados de leveduras com a utilização desse iniciador.
42
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
2072
1500
600
400
200
100
dos isolados de leveduras. M, marcador de pesos moleculares de 100 bp (Invitrogen
DNA Ladder); canaletas de 1 a 5, amplificação de isolados de Pichia manshurica;
canaletas de 6 a 11, isolados de Candida (Yamadazyma) trypodendroni; e canaletas
de 12 a 14, isolados de Galactomyces geotrichum.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15 16
17
18
2072
1500
600
400
200
100
dos isolados de leveduras. M, marcador de pesos moleculares de 100 bp (Invitrogen
DNA Ladder); canaletas de 1 a 10, amplificação de isolados de Candida
(Kurtzmaniella) natalensis; canaletas de 11 a 16, isolados de Zygowilliopsis
californica; e canaletas 17 e 18, isolados de Candida (Saturnispora) silvae.
43
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14 15 16 17
18 19
2072
1500
600
400
200
100
A
M
20 21 22 23 24
25 26
27 28 29 30 31
32 33 34
35 36
37 38
2072
1500
600
400
200
100
B
dos isolados de leveduras. A. M, marcador de pesos moleculares de 100 bp
(Invitrogen DNA Ladder); e canaletas de 1 a 19, amplificação de isolados de
Candida (Lodderomyces/Spathaspora) tropicalis. B. M, marcador de pesos
moleculares de 100 bp; canaletas de 20 a 24 isolados de Candida sinolaborantium;
canaletas de 25 a 30, isolados de Torulaspora delbrueckii; canaletas de 31 a 34,
isolados de Debaryomyces nepalensis; e canaletas de 35 a 38 representam o perfil
molecular de isolados de Issatchenkia terricola.
44
5.2 Seleção de leveduras para produção de xilitol a partir de D-xilose
5.2.1 Avaliação das leveduras assimiladoras de D-xilose e seleção das
leveduras produtoras de xilitol
Dos 140 isolados testados, 99 foram capazes de assimilar D-xilose como fonte
de carbono. Dentre os isolados positivos para assimilação da D-xilose, 50
produziram xilitol (50,5%). Os exemplares que apresentaram valores acima de 12
g.L-1 em 48 horas, para produção de xilitol no ensaio em tubos contendo o meio
YPX, foram testados nas fermentações posteriores. As leveduras selecionadas
foram C. pseudointermedia CLCQA-24F-113, C. sinolaborantium CLCQA-24F-127,
C. sinolaborantium CLCQA-24SC-027, C. tropicalis CLCQA-24F-125, S. stipitis
CLCQA-24SC-321, Lindnera sp. CLCQA-24SC-025 e Zygowilliopsis californica
CLQCA-24SC-143 (Tabela 3) por ter produzido as maiores quantidades de xilitol nas
condições testadas. O potencial fermentativo destas espécies são avaliadas no
seguinte item.
No metabolismo da D-xilose nas leveduras, esta pentose é reduzida a xilitol
pela xilose redutase NADPH-dependente e o xilitol é oxidado para xilulose pela
xilose desidrogenase NAD-dependente. A regeneração dos cofatores encontra-se
fortemente ligada à disponibilidade de oxigênio, e pode causar o desbalanço redox,
que interfere na produção de xilitol e dos subprodutos do metabolismo
(GRANSTRÖM, 2002). A regeneração do cofator NADPH para a atividade da xilose
redutase (XR) ocorre na via da pentose fosfato e a regeneração do NAD + ocorre
somente na cadeia respiratória, com o oxigênio como aceptor final de elétrons
(WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998). Desta forma, em condições limitadas de
oxigênio observa-se aumento de NADH, que não pode ser oxidado a NAD, evitandose assim a oxidação do xilitol à xilulose, o que permite a acumulação do xilitol no
meio (SENE et al., 2000). Portanto, a disponibilidade de oxigênio desempenha papel
importante na produção de xilitol; a maioria das leveduras produz xilitol,
principalmente sob condições microaeróbicas. Os resultados mostrados na Tabela 3,
referentes à capacidade de diferentes espécies produzir xilitol, variam segundo o
isolado testado. As espécies pertencentes aos clados Lodderomyces/Spathaspora
são consideradas um conjunto de micro-organismos modelo para o estudo da
produção de xilitol por ter bem desenvolvido a via da pentose fosfato e poder crescer
45
em xilose como única fonte de carbono e energia (GRANSTRÖM, 2002). Neste
grupo, C. tropicalis tem sido registrada por vários autores como produtora de xilitol
utilizando-se
meio
sintético
e
hidrolisado
hemicelulósico
de
materiais
lignocelulósicos. Da Silva e Afschar (1994), Choi e colaboradores (2000), e Arrizon e
colaboradores (2010) verificaram a produção de xilitol dessa espécie a partir da
conversão da D-xilose em meio sintético, utilizando condições de microaerofilia. Os
autores sugerem a utilização dessa levedura para produção biológica de xilitol pela
eficiência da conversão da D-xilose, melhor produção de xilitol em comparação a
outros micro-organismos, além dos custos benéficos em comparação com o
processo químico.
46
Tabela 3 - Produção (mM) e concentração (g.L-1) de xilitol e etanol no ensaio de
fermentação de D-xilose em tubos com meio YPX
Código
Espécie
Xilitol
(mM)
Xilitol
-1
(g.L )
Etanol
(mM)
Etanol
-1
(g.L )
CLCQA-24F-171
Candida amphixiae
7,56
3,83
3,61
0,55
CLCQA-24F-150
C. intermedia
8,58
4,35
-
-
CLCQA-24F-110
C. naeodendra
6,77
3,43
1,94
0,3
CLCQA-24F-113
C. pseudointermedia
12,94
6,55
28,35
4,35
CLCQA-24F-127
C. sinolaborantium
15,42
7,81
27,78
4,26
CLQCA-24SC-027
C. sinolaborantium
15,39
7,8
15,76
2,42
CLCQA-24SC-207
C.sinolaborantium
12,08
6,12
-0,4
-0,06
CLCQA-24SC-331
C. sinolaborantium
12
6,08
29,43
4,52
CLCQA-24SC-144
C. sinolaborantium
11,92
6,04
-0,4
-0,06
CLQCA-24SC-262
C. sinolaboratium
11,63
5,89
-0,45
-0,07
CLCQA-24SC-087
C. sinolaborantium
9,53
4,83
-
-
CLCQA-24F-125
C. tropicalis
13,38
6,78
23,43
3,59
CLCQA-24F-151
C. tropicalis
11,14
5,64
24,76
3,8
CLCQA-24SC-111
C. tropicalis
10,77
5,46
-0,51
-0,08
CLCQA-24SC-122
C. tropicalis
9,92
5,03
4,6
0,71
CLCQA-24SC-209
C. tropicalis
9,44
4,78
5,52
0,85
CLCQA-24F-119
C. tropicalis
8,52
4,32
-
-
CLCQA-24SC-239
C. tropicalis
8,47
4,29
-
-
CLCQA-24SC-322
C. tropicalis
8,15
4,13
5,55
0,85
CLCQA-24F-109
C. tropicalis
7,75
3,93
-
-
CLCQA-24F-123
C. tropicalis
7,45
3,78
-
-
CLCQA-24F-084
C. tropicalis
7,42
3,76
-
-
CLCQA-24F-087
C. tropicalis
7,24
3,67
-
-
CLCQA-24F-081
C. tropicalis
7,17
3,63
-
-
CLCQA-24F-042
C. tropicalis
7,04
3,57
-
-
CLCQA-24F-115
C. tropicalis
7,04
3,57
-
-
CLCQA-24F-052
C. tropicalis
7
3,55
-
-
CLCQA-24F-066
C. tropicalis
6,93
3,51
-
-
CLCQA-24F-167
C. tropicalis
6,57
3,33
3,93
0,6
CLCQA-24F-092
C. tropicalis
6,38
3,23
-
-
CLCQA-24F-126
C. tropicalis
6,31
3,2
3,44
0,53
CLCQA-24SC-246
C. tropicalis
6,28
3,18
-
-
CLCQA-24SC-232
Debaryomyces nepalensis
9,64
4,88
-0,45
-0,07
CLCQA-24SC-070
10,94
5,54
5,1
0,78
CLCQA-24SC-025
Lindnera sp.
12,22
6,19
-0,51
-0,08
CLCQA-24SC-321
15,24
7,72
24,82
3,81
CLCQA-24SC-320
S. stipitis
7,36
3,73
2,35
0,36
CLCQA-24F-095
7,46
3,78
-
-
CLCQA-24F-094b
Tr. laibachii
5,76
2,92
-
-
Continua…
47
Tabela 3, Cont.
Código
Espécie
Xilitol
(mM)
Xilitol
-1
(g.L )
Etanol
(mM)
Etanol
-1
(g.L )
CLCQA-24F-118
8,45
4,28
-
-
CLCQA-24SC-143
15,18
7,69
29,24
4,49
CLCQA-24I-194
Yamadazyma mexicana
11,48
5,82
-0,47
-0,07
CLQCA-24I-107
Y. mexicana
11,3
5,73
-
-
CLQCA-24I-154
Y. mexicana
11,01
5,58
-0,34
-0,05
CLCQA-24SC-164
Z. californica
11,35
5,75
-0,33
-0,05
CLCQA-24SC-196
Z. californica
10,85
5,5
-0,42
-0,06
CLQCA-24SC-306
Z. californica
8,5
4,31
4,69
0,72
CLCQA-24F-097
Z. californica
8,04
4,07
4,18
0,64
CLCQA-24F-144
Z. californica
7,4
3,75
3,47
0,53
CLCQA-24F-152
Z. californica
7,39
3,74
4,26
0,65
48
5.3 Ensaios de fermentação em meio com D-xilose e em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar
5.3.1 Fermentação em meio semi-sintético contendo D-xilose
Com base nos ensaios de triagem realizados previamente (item 5.2), foram
selecionadas as leveduras C. pseudointermedia CLCQA-24F-113, C. tropicalis
CLCQA-24F-125,
C.
sinolaborantium
CLCQA-24F-127
e
CLCQA-24SC-027,
Lindnera sp. CLCQA-24SC-025, Z. californica CLQCA-24SC-143 e S. stipitis
CLCQA-24SC-321 para serem testadas em ensaios de fermentação em meio com
D-xilose (50 g.L-1). Em relação à concentração de D-xilose inicial utilizada, Silva e
Afschar (1994) observaram que altas concentrações de xilose (próximas a 200 g.L -1)
inibem o crescimento de C. tropicalis e que a produtividade específica máxima para
essa espécie foi alcançada em concentração inicial de xilose de 50 g.L -1,
concentração esta que foi utilizada no presente estudo. Além disto, os autores
mostraram uma conversão de D-xilose em xilitol muito mais rápida nessa
concentração de açúcar do que em outras concentrações testadas. Esses dados
foram corroborados por estudos feitos por Felipe e colaboradores (1997), com C.
guilliermondii. Sendo assim, uma concentração inicial de xilose de 50 g.L -1 pode ser
considerada ideal para o favorecimento da produção de xilitol em processos
fermentativos para essas espécies de leveduras.
Os resultados dos parâmetros de fermentação, [Yp/s (g.g-1); rendimento de
xilitol, Qp (g.L-1.h-1); produtividade do xilitol, Yx/s (g.g-1); conversão de substrato em
biomassa,  (%); eficiência de conversão; e consumo de D-xilose (%)] estão
resumidos na Tabela 4. Esses resultados foram obtidos segundo o tempo de
produção máxima de xilitol para cada levedura. Todas as espécies testadas
demonstraram capacidade de consumir D-xilose como fonte de carbono, tendo este
consumo variado de 42,18 a 99,22%. As espécies que apresentaram maior consumo
desta pentose foram as linhagens de C. tropicalis CLQCA-24F-125 (99,22%), C.
pseudointermedia CLQCA-24F-113 (87,51%) e Lindnera sp. CLQCA-24SC-025
(85,54%), após 72 horas de fermentação.
49
Tabela 4 - Produção de xilitol [Yp/s (g.g-1)], rendimento de xilitol [Qp (g.L-1.h-1)], produtividade de xilitol [Yx/s (g.g-1)], conversão de substrato em
biomassa [ (%)], eficiência de conversão e consumo de D-xilose (%), produção de biomassa, etanol e xilitol (g.L-1) e tempo de fermentação (h) em
experimentos de fermentações em meio semi-sintético com D-xilose para as leveduras testadas.
Espécies e Linhagens
Candida pseudointermedia
CLQCA-24F-113
C. sinolaborantium
CLQCA-24F-127
C. sinolaborantium
CLQCA-24SC-027
C. tropicalis
CLQCA-24F-125
CLQCA-24SC-321
Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
CLQCA-24SC-143
Consumo de
D-xilose (%)
1
Células
-1
Yx/s
-1 2
Yp/x
-1 3

Qp
-1
-1 4
Etanol
5
-1
(g.L )
Yp/s
Xilitol
-1 6
(g.g )
-1
(g.L )
Tempo
de
Fermentação
(g.L )
(g.g )
(U.g )
(g.L .h )
(%)
87,51
4,99
0,14
2,89
0,27
43,06
5,36
0,39
13,90
48
55,50
7,61
0,30
0,83
0,08
27,21
0,75
0,25
5,86
72
42,18
6,23
0,33
0,77
0,06
27,85
0,13
0,25
4,41
72
99,22
6,85
0,17
3,96
0,34
73,66
0,02
0,67
25,63
72
52,87
8,53
0,36
0,05
0,005
1,87
3,81
0,02
0,36
72
85,54
5,22
0,14
3,50
0,23
55,47
0,92
0,50
17,01
72
46,94
5,83
0,26
0,32
0,02
9,32
0.,61
0,09
1,86
72
(h)
7
1
Consumo de D-xilose (%) – porcentagem de D-xilose inicial consumida.
-1
Yx/s (g.g )- rendimento de células por grama de massa celular produzida, por grama de xilose consumida.
3
-1
Yp/x (U.g )- rendimento de produto (mgxil) por massa celular (gcél)
4
-1 -1
-1
Qp (g.L .h )- produtividade de xilitol: concentração de xilitol produzido (g.L ) por tempo (h).
2
5
6
 (%)- eficiência de conversão: razão entre o fator de rendimento (YP/S) obtido e o fator de rendimento teórico (0,917 grama de xilitol/gramas de xilose).
-1
Yp/s(g.g )- rendimento de xilitol: xilitol produzido (P) por massa de xilose consumida (S).
7
-1
Tempo no qual foi obtida a máxima produção de xilitol (g.L ).
50
De maneira geral, a linhagem C. tropicalis CLQCA-24F-125 apresentou
resultados promissores para a produção de xilitol de acordo com as condições
testadas, com uma concentração deste poliálcool de 25,6 g.L-1, rendimento de 0,67
g.g-1, eficiência de fermentação de 73,7% e produtividade em xilitol de 0,34 g.L-1.h-1.
Resultados semelhantes foram obtidos por Cadete e colaboradores (2012) onde
relataram a espécie Candida amazonensis como a maior produtora de xilitol em
meio contendo D-xilose (50 g.L-1) suplementado com extrato de levedura e peptona.
A espécie apresentou valores máximos de produção de xilitol de 27,8 g.L-1 e um
rendimento de 0,67 g.g-1 após 48 horas de fermentação. Vários autores já têm
utilizado C. tropicalis como produtora de xilitol. De Mello (2009) obteve uma
produção de xilitol de 32,9 g.L-1 a partir de uma linhagem desta espécie em meio
com 50 g.L-1 de D-xilose suplementado com uréia e peptona, após 72 horas de
fermentação. Os parâmetros fermentativos alcançaram um rendimento de 0,65 g.g-1,
produtividade de 0,35 g.L-1.h-1 e eficiência de 61%. Para a linhagem de C. tropicalis
testada no presente trabalho, foram obtidos parâmetros de fermentação como
rendimento e produtividade similares, além de uma maior eficiência de conversão da
D-xilose em xilitol (73,7%). A segunda espécie com os valores de parâmetros
fermentativos maiores para produção de xilitol foi a nova espécie Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025 apresentando um rendimento (0,5 g.g-1) e eficiência de
fermentação (55,5%). A produtividade em xilitol atingida por esta levedura (0,23 g.L1
.h-1) foi menor que a obtida por C. pseudointermedia CLQCA-24F-113 (Qp 0,27 g.L-
1
.h-1), embora para esta espécie o rendimento (0,39 g.g-1) e a eficiência foram
menores (43%) que os parâmetros obtidos para Lindnera sp. Para a levedura C.
pseudointermedia CLQCA-24F-113 pode se observar no Apêndice 3 (Figura 3.1)
uma diminuição na concentração de xilitol a partir de 48 h, indicando um provável
direcionamento deste produto para a produção de etanol e/ou uso pela levedura
como fonte de carbono em consequência do gasto da xilose a partir do meio
(CADETE et al., 2012). Esta diminuição da produção de xilitol coincide com a maior
produção de etanol obtido pelas leveduras testadas neste ensaio. Por outro lado,
observa-se no Apêndice 3 (Figura 3.4) uma escassa produção de xilitol nas
primeiras horas de fermentação pela espécie Lindnera sp., sugerindo que a levedura
pode ter precisado de maior tempo de adaptação ao meio até conseguir a máxima
produção de xilitol. A última espécie selecionada para ser testada em meio contendo
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar foi C. sinolaborantium
CLQCA-24F-127. Em comparação com linhagem C. sinolaborantium CLQCA-24SCPrograma de Pós-graduação em Microbiologia da UFMG
51
027, esta levedura apresentou maior consumo de D-xilose, produção de xilitol e
produtividade. Esta espécie tem sido isolada de intestino de besouros e de larva de
Cerambycidae, sendo este o primeiro relato do isolamento desta levedura de
madeira em decomposição. Possivelmente, os insetos associados a madeira em
decomposição seriam os vetores desta levedura. As aplicações biotecnológicas,
alimentícias
e
importância
clínica
desta
espécie
de
levedura
ainda
são
desconhecidas (KURTZMAN et al., 2011). Por este motivo, esta levedura foi
selecionada para o estudo sobre a produção de xilitol a partir de hidrolisado
hemicelulósico.
Relatos de estudos de fermentação em meio contendo D-xilose suplementado
para as espécies Candida pseudointermedia, C. sinolaborantium e Zygowilliopsis
californica são desconhecidos. A espécie Scheffersomyces stipitis tem sido estudada
para produção de etanol e xilitol em meio sintético. Esta espécie é considerada uma
espécie fermentadora de D-xilose, produtora de etanol lignocelulósico, com baixa
produção de xilitol (AGBOGBO et al., 2008; CADETE et al., 2012). Agbogbo e
Wenger (2007) mostraram um consumo de xilose acima de 85 % em 48 h por S.
stipitis CBS 6054 em meio sintético contendo aproximadamente 20 g.L-1 de xilose, 5
g.L-1 de glicose suplementado com nutrientes. Estudos realizados por Cadete e
colaboradores (2012) utilizando D-xilose em meio sintético, obtiveram uma eficiência
de consumo de 69,5% de xilose em 24 horas encontrada para a levedura S. stipitis
em meio contendo xilose 50 g.L-1, extrato de levedura 10 g.L-1 e peptona 20 g.L-1,
obtendo uma concentração máxima de 15 g.L-1 de etanol e 1,3 g.L-1 de xilitol. No
presente estudo, a linhagem de S. stipitis obteve a produção mais baixa de xilitol
dentre as leveduras testadas (0,36 g.L-1), enquanto alcançou uma concentração de
3,81 g.L-1 de etanol (Tabela 4), consumindo a metade da D-xilose disponível no
meio. Estes resultados contrastam com os obtidos por outros autores, como Ferreira
e colaboradores (2011), onde o consumo deste açúcar por S. stipitis foi de 93,3%,
com uma produção de etanol de 6,4 g.L-1 em meio com 30 g.L-1 de xilose
suplementada com extrato de levedura. Ferreira e colaboradores (2011) sugerem
que a formação de baixas quantidades de co-produtos é importante para elevar a
formação dos produtos principais da fermentação como o etanol. A produção de
etanol foi observada por todas as leveduras testadas confirmando a habilidade de
fermentar xilose a etanol. Os maiores valores de concentração de etanol foram
produzidos pelas linhagens C. pseudointermedia CLQCA-24F-113, atingindo a maior
52
produção de 6,2 g.L-1 com 72 horas de fermentação (Tabela 4). Z. californica
CLQCA-24SC-143 produziu 2,7 g.L-1 de etanol após 24 horas de fermentação. A
linhagem de S. stipitis CLQCA-24SC-321 atingiu uma concentração de etanol de 4
g.L-1 com 48 horas de fermentação (Apêndice 3).
5.3.2 Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar em escala de bancada
Candida tropicalis CLQCA-24F-125 apresentou a maior produção de xilitol,
tanto no meio contendo D-xilose como única fonte de carbono quanto no hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Observando a Tabela 5 verifica-se
que os melhores resultados de produtividade e rendimento em xilitol foram obtidos
no meio com hidrolisado hemicelulósico suplementado, que alcançou rendimento de
0,67 g.g-1 e produtividade de 0,38 g.L-1.h-1. Arrizon e colaboradores (2011) obtiveram
uma linhagem de C. tropicalis produtora de xilitol em hidrolisados de bagaço de
cana-de-açúcar, com rendimento máximo de 0,4 g.g-1 e produtividade de 0,15 g.L1
.h-1. Pessoa (1997) e Rao e colaboradores (2006), trabalhando com essa espécie,
também obtiveram rendimentos máximos de 0,50 g.g-1 e 0,43 g.g-1, respectivamente.
Esses autores encontraram valores inferiores aos obtidos no presente trabalho para
produção de xilitol. A segunda espécie com maior produção de xilitol foi Lindnera
sp., que produziu 23,9 g.L-1 após 72 horas. Segundo Kurtzman e colaboradores
(2011), Lindnera saturnus, é conhecida pela capacidade de assimilar xilose. Kamat e
colaboradores (2012) relataram essa espécie como produtora de xilitol em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Os autores obtiveram
rendimento de 0,51 g.g-1 após 72 horas, com consumo de 3,74 g.L-1 de xilose, sendo
a concentração inicial de 20 g.L-1. Comparando com os resultados obtidos no
presente estudo para Lindnera sp. CLQCA-24SC-025, pode-se observar maior
rendimento (0,64 g.g-1) no mesmo tempo de fermentação, com consumo de 2,68 g.L1
de xilose, pela nova espécie de levedura. Rao e colaboradores (2007) ressaltam
que isolados com produção acima de 0,5 g.g-1 são considerados produtores de
elevadas concentrações de xilitol; aqueles que produzem entre 0,25 e 0,5 g.g-1 são
produtores médios; e os isolados que produzem menos de 0,25 g.g-1 são referidos
como produtores de baixas concentrações de xilitol. Pelos resultados obtidos no
presente trabalho, pode-se recomendar as espécies C. tropicalis CLQCA-24F-125 e
53
Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 como produtoras de altas concentrações de xilitol
em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar como meio de fermentação.
54
Tabela 5 - Produção de xilitol [Yp/s (g.g-1)], rendimento de xilitol [Qp (g.L-1.h-1)], produtividade de xilitol [Yx/s (g.g-1)], conversão de substrato em
biomassa [ (%)], eficiência de conversão e consumo de D-xilose (%), produção de biomassa, etanol e xilitol (g.L-1) e tempo de fermentação (h), em
fermentações em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar pelas leveduras testadas.
Consumo de
Espécies
D-xilose
(%)
1
Células
-1
Yx/s
Yp/x
-1 2
(g.L )
(g.g )
99,19
11,99
95,71
-1 3

Qp
-1
-1 4
(U.g )
(g.L .h )
0,26
1,48
0,13
11,17
0,27
1,83
99,08
11,07
0,26
93,23
5,96
0,15
(%)
Etanol
5
-1
xy
Yp/s
-1 6
Xilitol
-1
Tempo
de
Fermentação
7
(g.L )
(g.g )
(g.L )
(h)
42,94
4,05
0,39
15,55
120
0,16
53,8
4,08
0,49
19,48
120
2,63
0,38
73,50
2,50
0,67
27,12
72
4,32
0,33
70,58
3,36
0,64
23,98
72
Candida
pseudointermedia
CLQCA-24F-113
C.sinolaborantium
CLQCA-24F-127
C. tropicalis
CLQCA-24F-125
Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
1
-1
Yx/s (g.g )- rendimento de células por grama de massa celular produzida, por grama de xilose consumida.
3
-1
4
-1 -1
-1
5
 (%)- eficiência de conversão: razão entre o fator de rendimento (YP/S) obtido e o fator de rendimento teórico ( 0,917 grama de xilitol/gramas de xilose).
6
-1
Yp/s(g.g ) - rendimento de xilitol: xilitol produzido (P) por massa de xilose consumida (S).
7
-1
Tempo no qual foi obtida a máxima produção de xilitol (g.L ).
2
55
Trabalhos realizados utilizando-se a levedura C. guilliermondii têm sido
reportados com maior rendimento e produtividade em xilitol do que fermentações
conduzidas com C. tropicalis. Alves e colaboradores (1998) obtiveram 0,79 g.g-1 de
xilitol em experimentos com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar fermentado por C. guilliermondii. Resultados similares foram verificados por
Arruda (2011), trabalhando com a mesma espécie, cujo rendimento foi de 0,78 g.g-1
de xilitol quando esse substrato foi utilizado para fermentação em escala de
bancada. As espécies testadas no presente estudo apresentaram produtividade
inferior à obtida para linhagens de C. guilliermondii, relatadas por outros autores. No
entanto, C. tropicalis e Lindnera sp., testadas no presente estudo quanto à produção
de xilitol (Tabela 5), quando comparadas com outras espécies, como Spathaspora
spp., testadas por Cadete e colaboradores (2012), apresentaram rendimento maior.
Dependendo do meio de cultivo, pode-se obter maior ou menor rendimento e
produtividade de xilitol pelas leveduras. A adição de sulfato de amônio e farelo de
arroz como suplementos tanto no meio contendo D-xilose como nas fermentações
com hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar pode ter influenciado o crescimento
das leveduras nos experimentos realizados no presente trabalho. Segundo Carvalho
e colaboradores (2007), a adição de sulfato de amônio e farelo de arroz em
experimentos feitos com C. guilliermondii FTI, em meios contendo D-xilose como
principal fonte de carbono, resultou em melhor produção de xilitol que as
fermentações feitas sem esses suplementos, ou fermentações nas quais foi
adicionado cada suplemento em separado. Rodrigues e colaboradores (2011)
verificaram que a adição do sulfato de amônio aumentou o crescimento celular e o
rendimento na produção de xilitol com células de S. stipitis, independentemente do
ácido empregado para neutralização do hidrolisado utilizado como meio de cultura.
Carvalho e colaboradores (2007) obtiveram 48,7 g.L-1 de xilitol, produtividade de 0,5
g.L-1.h-1 e rendimento de 0,55 g.g-1 para C. guilliermondii FTI20037, com a adição de
suplemento. Quando não houve adição do suplemento, os autores obtiveram
somente uma concentração de xilitol de 12,1 g.L-1 de xilitol, produtividade de 0,13
g.L-1.h-1 e um rendimento menor do que 0,3 g.g-1. No presente trabalho, a
fermentação realizada com C. tropicalis CLQCA-24SC-125, utilizando os mesmos
suplementos e o cloreto de cálcio, resultou em menor produção (27,1 g.L-1) de xilitol
56
e em produtividade de 0,38 g.L-1.h-1. No entanto, o rendimento em xilitol foi maior
(0,67 g.g-1), o que indica que essa levedura obteve maior produção de xilitol por
cada grama de xilose presente no hidrolisado.
No presente estudo, a maior produção de xilitol foi alcançada no hidrolisado
de bagaço de cana-de-açúcar, com valores maiores que os verificados no meio
contendo D-xilose como fonte de carbono. Esses resultados são semelhantes aos
obtidos por Cadete et al. (2012), que constataram que as linhagens de Spathaspora
spp. também atingiram concentração maior de xilitol no hidrolisado do que no meio
com D-xilose. Isto pode ter ocorrido pelo fato do hidrolisado de bagaço de cana-deaçúcar conter açúcares como glicose, xilose e arabinose, além de compostos
inorgânicos como manganês, ferro, magnésio, níquel, cálcio, sódio, potássio e
cromo (ARRUDA, 2011), e vitaminas e aminoácidos; esses podem servir como
macro e micronutrientes para as leveduras, contribuindo para maior produção de
xilitol. A adição desses suplementos acelera o consumo de xilose e a produção de
xilitol pelas células, por prover precursores essenciais, necessários para maximizar o
rendimento (CARVALHO et al., 2007). Rao e colaboradores (2005) descrevem a
bioconversão da D-xilose presente no hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar
como um processo lento em comparação a fermentações realizadas em meio
sintético. No entanto, espécies como C. tropicalis foi avaliada como tolerante aos
diferentes inibidores metabólicos liberados como produto da hidrólise deste
substrato, aludindo assim as vantagens da aplicação desta levedura e bioprocessos
de conversão a xilitol.
Candida tropicais CLQCA-24F-125 e Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 tiveram maior
produção de xilitol, após 72 horas de fermentação (Apêndice 4). Depois desse
período, a concentração de xilitol começou a diminuir, o que indica que o produto
passou a ser utilizado como fonte de carbono pelas leveduras. Candida
pseudointermedia CLQCA-24F-113 e C. sinolaborantium CLQCA-24F-127 atingiram
maior produção de xilitol com 120 horas de fermentação, enquanto Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025 obteve maior produção após 72 horas. No Apêndice 4 (Figura
4.3) constata-se que essa espécie precisa de um período de adaptação ao meio,
uma vez que os resultados mostram que nas primeiras horas de fermentação essa
57
levedura não produz xilitol e apresentou pequeno consumo de xilose. Por outro lado,
a levedura teve a capacidade de consumir 93,9% da fonte de carbono, produzindo
xilitol em uma concentração de 23,98 g.L-1, produtividade de 0,33 g.L-1.h-1 e
rendimento de 0,64 g.L-1, sem aumentar consideravelmente a densidade celular
(Tabela 5), o que seria interessante nos processos de produção desse poliálcool em
escala industrial.
Uma relação aproximada de 1:10 da concentração de glicose inicial no
hidrolisado hemicelulósico em relação à xilose foi obtida. Segundo Da Silva e
colaboradores (2006), quando o hidrolisado se encontra em uma concentração 1:5
de glicose:xilose, as condições são favoráveis para aumentar o rendimento e a
produtividade volumétrica em xilitol ao ser a glicose utilizada para o crescimento
celular e conservação de energia, enquanto a xilose é utilizada para a formação de
xilitol. A máxima produção de xilitol nesta relação glicose:xilose, segundo Da Silva e
colaboradores (2006) pode ser devido à que altas concentrações de glicose
permitem maior formação de NADPH, cofator requerido pela enzima xilose redutase,
promovendo assim maior conversão de xilose em xilitol. Nas leveduras testadas no
presente ensaio, a glicose e a xilose foram inicialmente metabolizadas ao mesmo
tempo, mas a taxa de consumo de glicose foi mais rápida que a de xilose, uma vez
que foi consumida nas primeiras 12 horas, à exceção de Lindnera sp. CLQCA-24SC025, que metabolizou esse açúcar após 48 horas. Depois do consumo da glicose, a
xilose começou a ser assimilada mais rapidamente para todas as linhagens testadas
(dados não mostrados). Segundo du Preez (1994), a preferência dos microorganismos pela utilização de açúcares em meios de cultura com mais de uma fonte
de carbono é observada na seguinte ordem: D-glicose, D-manose, D-xilose, Dgalactose e D-frutose. As hexoses são utilizadas antes da xilose, e seu metabolismo
não é afetado pela presença desse açúcar. No presente estudo observou-se o
consumo simultâneo dos dois açúcares, comportamento esse que pode ser
explicado pelo sistema de captação da levedura para a D-xilose. Segundo Lucas e
van Uden (1986), quando Scheffersomyces shehatae foi cultivada em meio contendo
glicose e xilose, a levedura produziu um sistema de difusão facilitada que pôde
transportar glicose e xilose simultaneamente. Resultados obtidos por Da Silva e
58
colaboradores (2006) evidenciaram o consumo simultâneo da xilose na presença da
glicose, o que corrobora os resultados obtidos no presente estudo.
Quanto
à
assimilação
da
arabinose,
observa-se
que
para
C.
pseudointermedia CLQCA-24F-113 o consumo foi lento, com máximo de 1 g.L-1
(66,9%) após 120 horas. Para C. tropicalis CLQCA-24F-125, o consumo total desse
açúcar foi após 48 horas de fermentação. Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 assimilou
a arabinose de forma mais lenta, alcançando consumo máximo de 0,4 g.L-1 (38,5%)
após 96 horas de fermentação. No entanto, não foi encontrado um padrão de
assimilação desse açúcar para C. sinolaborantium CLQCA-24F-127, pois a levedura
não apresentou consumo regular. No presente estudo constatou-se que, apesar da
presença de glicose e xilose no meio de cultivo, a arabinose foi consumida
simultaneamente pelas leveduras testadas. Cadete e colaboradores (2012) não
obteve consumo da arabinose, e considerou como possível explicação para esse
comportamento à elevada disponibilidade de xilose, cujo consumo, após a glicose,
foi priorizado em relação à arabinose. No entanto outros autores, como Arruda
(2011), observaram que para C. guilliermondii a presença de glicose no hidrolisado
proporcionou maior consumo da arabinose, que atingiu o máximo de 73% em
experimentos de fermentação, resultado este similar aos obtidos para as espécies
de Candida analisadas no presente estudo.
Glicerol e etanol foram detectados como subprodutos do metabolismo dos
açúcares pelas diferentes espécies de leveduras nas fermentações do hidrolisado.
Para todas as leveduras houve formação de glicerol com concentrações máximas de
2, 85 g.L-1 após 72 horas de fermentação, exceto para C. sinolaborantium CLQCA24F-127, que apresentou menor produção desse composto, neste meio (0,53 g.L-1)
(dados não mostrados). Para o etanol, a produção mais alta (6,6 g.L-1) foi obtida
após 72 horas de fermentação utilizando C. pseudointermedia CLQCA-24F-113.
Arruda e colaboradores (2011) constataram rápida formação de glicerol e etanol nas
primeiras 24 horas de fermentação, com valores máximos de 1,32 e 3,2 g.L-1,
respectivamente, que coincidiram com a completa utilização da glicose. Segundo
Arruda e Felipe (2009), e pelos resultados obtidos no presente estudo, pode-se
afirmar que a produção desses metabólitos é constante. Sendo assim, sua formação
59
não depende somente do consumo de glicose, mas também de outros açúcares
como a xilose. A formação desses subprodutos reduz a disponibilidade de NADH,
coenzima essencial para ação da xilose redutase que participa da conversão de
xilose a xilitol em leveduras (SILVA et al., 2007). Dessa forma, a produção lenta e
constante desses compostos não afeta a produção de xilitol, fato este observado nas
fermentações realizadas no presente trabalho, nas quais Lindnera sp. CLQCA24SC-025 obteve máxima produção de glicerol (2,85 g.L-1), enquanto C. tropicalis,
que alcançou maior produção de xilitol (27,1 g.L-1), produziu somente 1,07 g.L-1 de
glicerol.
O valor máximo alcançado na conversão de xilose em xilitol foi obtido por C.
tropicalis
CLQCA-24F-125,
com
elevado
rendimento
(Yp/s=
0,67
g.g-1)
e
produtividade (Qp= 0,38 g.L-1.h-1) em xilitol, obtidos na fermentação em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Os parâmetros fermentativos para C.
pseudointermedia CLQCA-24F-113, C. tropicalis CLQCA-24F-125, Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
e
C.
sinolaborantium
CLQCA-24F-127
no
hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana estão mostrados na Tabela 5. Os Apêndices 4 e
5 ilustram o consumo da xilose e a produção de xilitol, etanol e concentração celular
para essas mesmas leveduras.
5.3.3 Compostos tóxicos liberados no hidrolisado hemicelulósico de bagaço
de cana-de-açúcar
O tratamento de hidrólise com ácido diluído em temperaturas menores que
160 ºC favorece a conversão de xilanas em xilose, segundo Sun e Cheng (2002). Ao
utilizar o ácido sulfúrico como catalisador, prótons que atuam nas ligações
glicosídicas entre os monômeros de açúcar nas cadeias poliméricas são liberados.
O rompimento dessas ligações libera uma série de açúcares, como xilose, glicose e
arabinose (AGUILAR et al., 2002), além de compostos tóxicos para as células. Os
principais compostos tóxicos produzidos pela hidrólise ácida incluem o ácido acético
(ácido orgânico originado da quebra da hemicelulose), furanos (furfural e 5-HMF),
derivados das reações de degradação das pentoses e hexoses, respectivamente
(PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000). Os ácidos orgânicos por meio da inibição
60
das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase, causam danos ao metabolismo
celular, como limitação do consumo da fonte de carbono e interferência na cinética
de crescimento celular, que é dependente da concentração de açúcar, oxigênio
dissolvido e pH do meio de cultivo (FELIPE et al., 1995; TAMANINI e OLIVEIRA,
2004). A ação destes ácidos orgânicos em pH ácido interfere em vários pontos do
metabolismo da levedura, como o transporte de xilose através da membrana
citoplasmática. Segundo Felipe e colaboradores (1997), fermentações com C.
guilliermondii comprovaram que valores maiores que 3 g.L-1 de ácido acético inibem
o metabolismo da xilose, afetando a produtividade e o rendimento em xilitol. Por
outro lado, Carvalho e colaboradores (2005) constataram que o ácido acético em
concentrações de 1 g.L-1 favoreceu a produção de xilitol nos meios em que a
concentração inicial de D-xilose era de 50 g.L-1. Arruda (2011) obteve concentração
de ácido acético de 2,31 g.L-1 e uma concentração de 2,66 g.L-1 foi obtida por
Carvalho (2004). No presente estudo foi obtida uma concentração menor desse
ácido (1,66 g.L-1) no hidrolisado concentrado (Tabela 6). Segundo Felipe e
colaboradores (1997), o ácido acético pode se difundir até o citoplasma, afetando o
pH intracelular, resultando em redução do crescimento celular.
Tabela 6 - Composição dos hidrolisados antes e após os procedimentos de concentração e
destoxificação por alteração de pH combinado à absorção em carvão vegetal ativado
Compostos
Hidrolisado Bruto
Hidrolisado
Concentrado
Hidrolisado Concentrado
e Detoxificado
-1
Açúcares e Ácidos Orgânicos (g.L )
Glicose
0,842
5,76
4,81
Xilose
11.565
61,71
48,72
0,84
4,7
3,36
Ácido fórmico
-
-
-
Ácido acético
0,84
1,66
1,58
Arabinose
-1
Furanos (g.L )
Furfural
0,282
0,168
*
5-Hidroximetilfurfural
0,015
0,036
*
*: dosagem não realizada.
Compostos como furfural e 5-HMF têm efeito inibidor na respiração e na
fosforilação oxidativa das leveduras, dificultando a bioconversão dos açúcares nos
produtos desejados (CANILHA et al., 2010). No presente trabalho, uma
61
concentração de 0,168 g.L-1 e de 0,036 g.L-1 para o furfural e hidroximetilfurfural
após a etapa de concentração do hidrolisado foram observadas (Tabela 6).
Observou-se uma diminuição de furfural de 0,11 g L -1 após a etapa de concentração,
o que corresponde à redução de 40,4%. Em relação ao hidroximetilfurfural, houve
aumento de 2,4 vezes desse inibidor após a etapa de concentração. Arruda (2011),
seguindo a mesma metodologia para concentração do hidrolisado de bagaço de
cana, obteve diminuição de furfural de 0,106 g L -1 (56,4%), no entanto constatou
também aumento de três vezes na concentração de HMF em relação à
concentração inicial. Parajó e colaboradores (1998) relataram que a taxa máxima de
crescimento das leveduras foi reduzida em uma concentração de 0,35 g.L-1 de
furfural e que esta é completamente inibida com uma concentração de 1,75 g.L-1
deste composto. Concentrações similares de furfural (1,0 - 1,5 g.L-1) que inibem o
metabolismo das leveduras foram também sugeridas por outros autores (SANCHES
e BAUTISTA, 1988; FELIPE et al.,1995). O efeito prejudicial do furfural afeta na taxa
de crescimento, e sua acumulação na célula causa a inibição das enzimas
envolvidas no metabolismo central do carbono, alterando o equilíbrio da energia
celular. Além disso, o furfural causa danos nas membranas vacuolares e
mitocondriais, e a acumulação de espécies reativas de oxigênio, por sua vez, pode
causar a morte celular (SÁRVÁRI et al., 2003; HEER e SAUER, 2008). Entretanto,
durante a fermentação, o furfural e o 5-hidroximetilfurfural são reduzidos aos seus
álcoois correspondentes, que são compostos menos tóxicos para a célula
(PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000; HEER e SAUER, 2008). No presente
estudo, as concentrações destes compostos parecem que não interferiram no
crescimento das leveduras nos experimentos de produção de xilitol a partir do
hidrolisado do bagaço de cana de açúcar.
Segundo as análises estatísticas da produção de xilitol em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar do presente trabalho, houve diferenças
altamente significativas entre as linhagens de leveduras (diferenças p<0,05), sendo
que a linhagem de C. tropicalis CLQCA-24F-125 apresentou valores mais elevados
para produção de xilitol. Quando as outras três linhagens foram comparadas,
contatou-se que não houve diferenças significativas. Segundo a variável do tempo
para produção de xilitol, a maior eficiência foi atingida após 72 horas, porém a partir
62
das 96 horas a produção começou a diminuir. A variável da interação horas por
linhagem apresenta diferenças altamente significativas, o que significa que o alcance
da produção máxima de xilitol de cada isolado é dependente do tempo. Por
exemplo, C. sinolaborantium CLQCA-24F-127 demorou mais tempo para produzir
xilitol, pois atingiu a produção máxima em 120 horas (Apêndice 6).
Em relação aos resultados da variável para produção de etanol, foram
constatadas diferenças significativas entre as linhagens e diferenças altamente
significativas para a variável hora.
Os isolados com maior produção de etanol
corresponderam a C. pseudointermedia CLQCA-24F-113 e C. sinolaborantium
CLQCA-24F-127. A produção de etanol ocorreu entre 48 e 120 horas, no entanto as
leveduras atingiram rendimento máximo após 96 horas. Segundo a variável que
correlaciona cada linhagem com a hora, não houve diferenças significativas para
produção de etanol (Apêndice 6).
Para
o
consumo
da
D-xilose,
observaram-se
diferenças
altamente
significativas entre linhagens e entre o tempo de fermentação, assim como para a
interação desses dois fatores. A linhagem com maior consumo de xilose foi C.
tropicalis CLQCA-24F-125 (Apêndice 6).
5.3.4 Fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar em biorreator
No presente estudo, a influência de fatores como pH, temperatura, agitação e
aeração foi estudada utilizando ensaios em biorreator para avaliação do
metabolismo de duas linhagens que apresentaram os melhores resultados de
produção de xilitol em escala de bancada. Essas leveduras foram C. tropicalis
CLQCA-24F-125 e Lindnera sp. CLQCA-24SC-025, uma nova espécie isolada no
presente trabalho. Os resultados dos parâmetros fermentativos Yp/s (g.g-1, fator de
conversão de xilose em xilitol), Qp (g.L-1.h-1, produtividade em xilitol), Yx/s (g.g-1,
conversão de substrato em biomassa),  (% eficiência de conversão) e consumo de
D-xilose (%), produção de células (g.L-1), concentração de etanol e xilitol (g.L-1) e
63
tempo de fermentação (h) para C. tropicalis CLQCA-24F-125 em biorreator estão
mostrados na Tabela 7. O consumo de xilose, a produção de células e a produção
de etanol e xilitol ao longo da fermentação encontram-se representados na Figura 9.
Constatou-se que o consumo da xilose ocorre simultaneamente e de forma
gradual ao consumo da glicose para C. tropicalis CLQCA-24F-125. Esta levedura
consumiu totalmente a glicose após 60 horas da fermentação, enquanto a xilose
demorou 96 horas para ser consumida o 95%. Segundo Parajó e colaboradores
(1998), quando as hexoses, como a glicose, já foram parcialmente consumidas, a
xilose pode ser assimilada, fato que confirma a existência de uma concentração
limite para repressão do metabolismo de xilose por hexoses. Segundo Yahashi e
colaboradores (1996), a adição de glicose no meio de cultura tem efeito benéfico na
produção de xilitol pela espécie C. tropicalis. A conversão da xilose em xilitol foi
realizada mais eficientemente na presença da glicose, além desta ser utilizada para
o crescimento celular mais rapidamente do que a xilose, permitindo a regeneração
do NADPH pelo metabolismo da via pentose fosfato.
64
Tabela 7 - Parâmetros fermentativos obtidos para Candida tropicalis CLQC-24F-125 durante
experimentos de fermentação com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar
em biorreator
Tempo
(h)
pH
Ácido
Acético
-1
(g.L )
Consumo de
1
D-Xilose%
Yp/s
-1 2
(g.g )
Yx/s
-1 3
(g.g )
Yp/x
-1 4
(U.g )
Qp
-1 -1 5
(g.L .h )

6
(%)
0
4,99
1,76
0
0
0
0
0
0
12
5,00
1,58
12,67
0,19
0,21
0,90
0,10
20,96
24
5,16
1,55
24,09
0,74
0,14
5,40
0,35
81,12
36
5,44
0,81
42,91
0,75
0,10
7,24
0,43
82,88
48
5,89
0,93
63,11
0,76
0,07
11,09
0,48
83,78
60
6,33
1,03
78,67
0,73
0,06
12,89
0,46
80,49
72
5,88
1,38
88,67
0,78
0,06
13,70
0,46
85,84
96
5,40
1,98
94,42
0,83
0,07
12,53
0,39
90,86
1
Consumo de D-xilose (%) – porcentagem de D-xilose inicial consumida
-1
Yp/s(g.g )- rendimento de xilitol: xilitol produzido (P) por massa de xilose consumida (S)
3
-1
Yx/s (g.g )- rendimento de células grama de massa celular produzida por grama de xilose consumida
4
-1
5
-1 -1
-1
Qp (g.L .h )- produtividade de xilitol: concentração de xilitol produzido (g.L ) por tempo (h)
6
 (%)- eficiência de conversão: razão entre o fator de rendimento (Y P/S) obtido e o fator de
rendimento teórico (0,917 grama de xilitol/gramas de xilose).
2
40
-1
Glicose, Xilose (g L )
30
25
20
20
15
10
5
0
-1
0
Xilitol, Etanol, Glicerol e Células (g L )
35
40
-5
0
20
40
60
80
100
Tempo (horas)
Figura 9 – Concentração de xilose (-- --), glicose (-- --), produção de células (-- --),
etanol (-- --), glicerol (-- --) e xilitol (-- --) em g.L-1 por Candida tropicalis CLQCA24F-125 em biorreator.
65
Os resultados obtidos em frascos Erlenmeyer, no caso da C. tropicalis
CLQCA-24F-125, confirmam que 99% da xilose foi consumida após 48 horas de
fermentação, enquanto no biorreator o consumo da xilose ocorreu de forma mais
gradual. Em ambos os casos a presença da glicose não afetou o consumo da xilose,
o que sugere que essa levedura tem um sistema de transporte de xilose que não é
afetado pela repressão da glicose, como relatado por Da Silva e colaboradores
(2006). O consumo da arabinose foi de 1,4 g.L-1 a partir de 3,4 g.L-1 após 60 horas
de fermentação, o que corresponde ao consumo de 60%, mostrando uma eficiência
menor do que nos ensaios feitos em frascos Erlenmeyer, onde essa levedura
conseguiu consumir totalmente a arabinose após 48 horas de fermentação. Da Silva
e colaboradores (2006), utilizando o mesmo tipo de hidrolisado em experimento em
biorreator de 1,6 L, obtiveram um consumo da glicose nas primeiras 12 horas de
fermentação. No presente estudo, a glicose foi assimilada nas primeiras 12 horas
até 0,12 g.L-1 alcançando o consumo total após as 60 horas de fermentação.
Enquanto à produção de metabolitos, além de xilitol, o etanol e o glicerol foram
produzidos durante a fermentação de xilose por essa levedura. A maior produção de
etanol foi obtida depois de 48 horas de fermentação, alcançando a concentração de
4,8 g.L-1; para o glicerol foram obtidos 1,22 g.L-1 com 24 horas de fermentação.
Comparando esses dados com a produção de etanol e glicerol obtida em frascos
Erlenmeyer (2,6 g.L-1 às 48 horas e 1,72 g.L-1 após 120 horas, respectivamente),
observa-se uma produção duas vezes maior de etanol em biorreator, no mesmo
tempo de fermentação. A produção de biomassa em escala de bancada variou de
0,74 até uma concentração de 15,9 g.L-1 após 96 h de fermentação sendo maior do
aquela obtida no biorreator que variou de 0,26 até 3,22 g.L-1 no mesmo tempo de
fermentação.
Os parâmetros fermentativos de produção de xilitol para C. tropicalis CLQCA24F-125 apresentaram valores maiores no ensaio no qual utilizou-se biorreator do
que aqueles realizados em escala de bancada. A produtividade nos ensaios de
fermentação no biorreator foi maior que a constatada por Arruda (2011), sendo de
0,48 g.L-1.h-1 após 48 horas no presente trabalho e de 0,27 g.L-1.h-1 após 132 horas
obtido por aquele autor. A concentração de xilitol verificada no presente estudo foi
maior que a obtida por Da Silva e colaboradores (2006), utilizando condições
66
experimentais semelhantes, cuja concentração máxima foi de 27,8 g.L-1, rendimento
de 0,59 g.g−1 e produtividade de 0,53 g.L-1.h-1, após 48 horas de fermentação. No
presente trabalho, a concentração de xilitol atingiu valores de 37,2 g.L-1 e rendimento
de 0,83 g.g−1 após 96 horas de fermentação, com menor produtividade (0,39 g.L-1.h1
) nesse tempo. Outro fator importante a ser considerado é a eficiência total de
conversão para cada fermentação. Assim, em escala de bancada foi obtida
eficiência de 68,9%, enquanto no biorreator a eficiência foi de 90,5% para esta
linhagem de levedura. Considerando todos os parâmetros de fermentação obtidos
para C. tropicalis CLQCA-24F-125, esta linhagem pode ser caracterizada como uma
levedura promissora para produção de xilitol a partir de D-xilose, quando comparada
com outras espécies ou linhagens testadas em estudos de fermentação de
hidrolisados hemicelulósicos.
Os valores máximos de formação de glicerol e etanol foram obtidos após 24
horas (1,22 g.L-1) e 48 horas (4,8 g.L-1) (Figura 9). Resultados similares para esta
mesma espécie foram verificados nos ensaios em frascos Erlenmeyer com uma
produção de glicerol de 1,72 g.L-1 e etanol de 4,4 g.L-1 após 120 horas de
fermentação. Segundo Nevoigt e Stahl (1997), o aumento da concentração
intracelular de glicerol pode ser devido a uma resposta ao estresse osmótico pela
levedura. Os autores demonstraram que S. cerevisiae, quando exposta a um meio
de alta osmolaridade, acumula glicerol na membrana plasmática para neutralizar a
desidratação celular. Ao comparar os resultados obtidos para produção de glicerol
por C. tropicalis CLQCA-24F-125, observou-se que esse composto foi produzido na
concentração máxima de 1,22 g.L-1, após 24 horas. A quantidade diminuiu a partir de
36 horas de fermentação, o que indica que a osmolaridade do hidrolisado não afetou
de maneira drástica a formação de subprodutos do metabolismo dessa levedura,
uma vez que tanto a formação de glicerol quanto de etanol permitiu a manutenção
do equilíbrio redox. A importância do balanço redox no metabolismo das leveduras
tem sido evidenciada (VANDESKA et al., 1995), de onde se conclui que o fuxo
glicolítico é controlado pela reoxidação do NADH pela piruvato decarboxilase.
Segundo Granström (2001), a limitação de oxigênio resulta em aumento da
concentração intracelular de NADH, o que leva ao aumento da taxa de acúmulo de
xilitol por Candida guilliermondii. Bruinenberg e colaboradores (1984), utilizando C.
67
tropicalis, em condições limitadas de oxigênio e altas concentrações de xilose,
verificaram que a levedura consome a D-xilose pela atividade da XR dependente
somente de NADPH (com completa ausência de XR ligada a NADH) e a XDH ligada
a NAD+, permitindo a acumulação de xilitol. De acordo com Parajó e colaboradores
(1998), quando se utiliza leveduras XR dependentes de NADPH, o NADH não pode
ser oxidado a NAD+. Isto leva a um aumento na taxa do sistema redox NADH/NAD+
e à subseqüente inibição da enzima XDH ligada a NAD+, permitindo maior consumo
da D-xilose e acumulação de xilitol (GRANSTRÖM, 2001).
A espécie Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 submetida a ensaio em biorreator
com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar não produziu xilitol
nas condições testadas. Fatores como concentração inicial do substrato e do
inóculo, agitação e nível de oxigênio podem ter afetado diretamente a conversão da
xilose a xilitol por essa levedura. Para utilização de uma espécie em escala de
produção e obtenção de altas concentrações de produto desejado, devem ser
estabelecidos os melhores parâmetros e condições de fermentação, e a composição
mais adequada do meio de fermentação. As habilidades nutricionais variam muito de
acordo com o gênero e a espécie de micro-organismo utilizado, e mesmo entre
linhagens do mesmo gênero (FERREIRA et al., 2011), portanto, as condições para
produção de xilitol para esta linhagem de levedura não foram as ideais.
A baixa concentração celular observada no biorreator está de acordo com o
baixo consumo da glicose e xilose (10 e 7,5%). Em ensaio de bancada, a glicose foi
100% consumida após 72 horas e a xilose foi consumida em 97,7% após 120 horas
de fermentação. Quando compara-se as duas linhagens testadas no biorreator,
constata-se que a concentração celular para Lindnera sp. CLQCA-24SC-025
aumentou o triplo em relação ao inóculo inicial até 96 horas (de 0,21 para 0,61 g.L-1),
enquanto para a linhagem de C. tropicalis CLQCA-24F-125 a biomassa cresceu 12
vezes até 72 horas de fermentação (de 0,26 para 3,22 g.L-1). O consumo da glicose
foi similar para as duas leveduras testadas, sendo consumida a partir da
concentração inicial 4,5 g.L-1 para aproximadamente 0,5 g.L-1 no final da
fermentação. Lindnera sp. CLQCA-24SC-025 consumiu 7,5% da xilose após 72
horas de fermentação, enquanto C. tropicalis CLQCA-24F-125 consumiu 94,9%
68
dessa pentose após 96 horas. Analisando a produção de etanol, constata-se que C.
tropicalis CLQCA-24F-125 teve o pico de produção deste composto após 48 horas,
com 4,8 g.L-1, enquanto para Lindnera sp. CLQCA-24SC-025, a produção máxima
foi de 2,5 g.L-1 após 72 horas. Este fato indica que possivelmente a disponibilidade
de oxigênio dissolvido no meio foi muito baixa, uma vez que Lindnera sp. CLQCA24SC-025 apresentou taxa de multiplicação celular muito baixa em relação aos
resultados observados em escala de bancada. Logo, pode-se constatar que houve
preferência pela via fermentativa de produção de etanol, uma vez que esse fator
determina a divisão do fluxo de carbono entre o crescimento do micro-organismo e a
formação de produtos oriundos da fermentação (DU PREEZ, 1994).
Tanto as respostas de crescimento como de consumo de açúcares e
produção de xilitol e etanol indicam que os níveis de oxigênio utilizados no biorreator
foram muito baixos para o metabolismo de Lindnera sp. CLQCA-24SC-025, já que a
levedura não foi capaz de se multiplicar, nem de assimilar elevadas quantidades dos
açúcares do meio. A formação de xilitol, segundo Ganström (2002), é favorecida em
condições de limitação de oxigênio, uma vez que há acumulação de NADH e
subsequente inibição da XDH-dependente de NAD, impedindo que o xilitol seja
oxidado à xilulose. Os ensaios enzimáticos realizados com C. tropicalis indicam que
esta levedura é NADPH-dependente, no metabolismo da xilose. Concentrações
muito altas ou baixas de oxigênio podem inibir a fermentação pelas leveduras. Em
estudos realizados por Parajó e colaboradores (1998), leveduras com atividade de
XR ligadas a ambos cofatores NADH e NADPH (P. tannophilus, S. stipitis, S.
shehatae) podem regenerar o NAD+ consumido na segunda etapa do metabolismo
da xilose. Neste caso o principal produto da reação é o etanol, e não há ocorrência
de acúmulo de xilitol. Esse fenômeno pode ter ocorrido para a nova espécie
Lindnera sp., que produziu etanol no ensaio em biorreator, mas não xilitol.
Deve-se levar em consideração que o ensaio realizado em biorreator foi um
teste inicial de duas linhagens metabolicamente diferentes. As condições de cultura
e os parâmetros para fermentação de cada uma dessas linhagens devem ser
estudados para melhorar a bioconversão da D-xilose presente nos hidrolisados
hemicelulósicos em xilitol. Pode-se constatar nos testes de screening realizados
69
tanto em meio sintético como em hidrolisado que mesmo pertencendo à mesma
espécie, as linhagens podem ter mecanismos de resposta diferentes aos meios
utilizados para o crescimento e ainda apresentar diferentes respostas de produção
de metabólitos. Por isto, devem ser definidas condições que permitam maior
produção de xilitol, incluindo pH, agitação, aeração, concentração inicial de
nutrientes e de biomassa para cada linhagem a ser estudada. Embora tenha havido
variações nas quantidades de xilitol produzidas, os isolados obtidos no arquipélago
das ilhas Galápagos mostraram potencial para fermentação de hidrolisado
hemicelulósico com a produção deste produto de alto valor econômico.
70
6
CONCLUSÕES
- O isolamento de espécies de leveduras assimiladoras de D-xilose capazes de
produzir xilitol a partir de madeira em decomposição indica que este é um substrato
promissor para a obtenção de linhagens de interesse para uso biotecnológico.
- O uso do meio de cultura com xilana apresentou maior êxito no isolamento de
leveduras assimiladoras de D-xilose, sugerindo a utilização deste meio de cultivo em
futuras pesquisas voltadas para o isolamento de leveduras fermentadoras de
pentoses.
- Uma nova espécie de levedura pertencente ao gênero Lidnera, com um alto
rendimento e produtividade de xilitol a partir de D-xilose, foi isolada das Ilhas
Galápagos no Equador. O isolamento desta levedura comprova a importância de
estudos em biomassa de ecossistemas considerados hot spots da biodiversidade
mundial, como são aqueles encontrados nas Ilhas Galápagos.
- Das leveduras obtidas 70% assimilaram D-xilose como única fonte de carbono,
sendo que destas 50,5% produziram xilitol. Esses resultados demonstram o
potencial biotecnológico das linhagens das Ilhas Galápagos para produção de xilitol
e fomenta novos estudos de otimização dos fatores relacionados à fermentação a
fim de melhorar a síntese de produtos de valor biotecnológico por estas leveduras.
- Os isolados de leveduras testados em ensaios com hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana-de-açúcar apresentaram altas taxas de consumo de açúcares e
produção de xilitol maiores que nos ensaios com meio semi-sintético. Isto indica uma
boa adaptação das leveduras no hidrolisado hemicelulósico e a potencial utilização
das mesmas em estudos futuros para a obtenção de xilitol.
- As leveduras Candida tropicalis e Lindnera sp. foram as melhores produtoras de
xilitol tanto em meio semi-sintético quanto em hidrolisado de bagaço de cana-deaçúcar. A produção de xilitol da linhagem de C. tropicalis já era esperada, uma vez
que esta espécie já foi relatada como produtora deste poliálcool. No entanto, a
71
produção deste metabólito de importância clínica, farmacêutica e alimentícia pela
nova espécie de Lindnera é um aporte ao conhecimento das propriedades
fermentativas desta espécie incentivando futuros estudos de determinação de
parâmetros fermentativos que permitam a maior produção de xilitol e o uso
biotecnológico desta nova espécie.
- Candida tropicalis CLQCA-24F-125 apresentou os melhores valores para
conversão de substrato em xilitol, produtividade e rendimento do que as outras
leveduras testadas, tanto em meio semi-sintético e hidrolisado de bagaço de canade-açúcar em escala de bancada como em biorreator. Essa levedura pode ser
considerada promissora para produção biotecnológica de xilitol em grande escala
utilizando hidrolisado hemicelulósico de resíduos lignocelulósicos.
72
7
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84
APÊNDICES
Apêndice 1 – Identificação das espécies, código das amostras, meio de cultura para
isolamento e número de amostra das leveduras isoladas do Arquipélago de
Galápagos, Equador
Espécie
Candida (Lodderomyces) albicans
Candida (Yamadazyma) amphixiae
Candida (Yamadazyma) dendronema
Candida (Kazachstania) humilis
Candida (Metschnikowia) intermedia
Candida naeodendra
Candida (Kurtzmaniella) natalensis
Candida (Lodderomyces) parapsilosis
Candida (Metschnikowia)
pseudointermedia
Meio de
Cultura para
Isolamento
Amostra
CLQCA-24F-067
Xilana
10
CLQCA-24F-157
Xilana
6
CLQCA-24F-161b
D-xilose
5
CLQCA-24F-163
D-xilose
10
CLQCA-24F-171
CMC
3
Código
CLQCA-24F-137
CLQCA-24F-177
CLQCA-24SC-121
CLQCA-24F-150
CMC
D-xilose
10
39
CMC
3
D-xilose
31
CLQCA-24F-110
CMC
6
CLQCA-24F-011
Xilana
5
CLQCA-24F-041
CMC
5
CLQCA-24F-065
D-xilose
2
CLQCA-24F-101
D-xilose
5
CLQCA-24F-105
Xilana
5
CLQCA-24F-134
D-xilose
2
CLQCA-24F-136
D-xilose
5
CLQCA-24F-146
CMC
6
CLQCA-24F-149
Xilana
5
CLQCA-24F-169
D-xilose
5
CLQCA-24SC-266
D-xilose
38
CLQCA-24F-005
CMC
1
CLQCA-24F-035
CMC
12
CLQCA-24SC-315
CLQCA-24F-113
CLQCA-24SC-240
CMC
1
D-xilose
30
CLQCA-24F-127
Candida sinolaborantium
4
3
CLQCA-24SC-027
27
CLQCA-24SC-087
34
CLQCA-24SC-144
D-xilose
28
CLQCA-24SC-207
36
CLQCA-24SC-262
36
CLQCA-24SC-331
34
Continua...
85
Apêndice 1, Cont.
Espécie
Candida (Saturnispora) silvae
Candida (Lodderomyces/Spathaspora)
tropicalis
Candida (Yamadazyma) trypodendroni
Cryptococcus (Bulleromyces) flavescens
Cryptococcus (Bulleromyces) humicola
Meio de
Cultura para
Isolamento
Amostra
CLQCA-24F-047
CMC
5
CLQCA-24F-063
D-xilose
5
CLQCA-24F-096
D-xilose
5
CLQCA-24F-111
D-xilose
9
CLQCA-24F-130
CMC
8
CLQCA-24F-156
D-xilose
4
CLQCA-24F-042
D-xilose
8
CLQCA-24F-052
Xilana
11
CLQCA-24F-066
D-xilose
8
CLQCA-24F-081
D-xilose
4
CLQCA-24F-084
D-xilose
7
CLQCA-24F-087
D-xilose
7
CLQCA-24F-092
D-xilose
7
CLQCA-24F-109
D-xilose
7
CLQCA-24F-112
Xilana
7
CLQCA-24F-115
D-xilose
8
CLQCA-24F-119
D-xilose
10
CLQCA-24F-123
D-xilose
8
CLQCA-24F-125
D-xilose
2
CLQCA-24F-126
D-xilose
2
CLQCA-24F-151
D-xilose
10
CLQCA-24F-167
D-xilose
7
CLQCA-24SC-111
CMC
35
CLQCA-24SC-122
D-xilose
39
CLQCA-24SC-209
D-xilose
21
CLQCA-24SC-239
D-xilose
30
CLQCA-24SC-246
D-xilose
39
CLQCA-24SC-322
Xilana
29
CLQCA-24SC-018
D-xilose
23
CLQCA-24SC-019
D-xilose
24
CLQCA-24SC-023
D-xilose
26
CLQCA-24SC-024
D-xilose
26
CLQCA-24SC-118
D-xilose
24
CLQCA-24SC-325
CMC
32
CLQCA-24F-143
CMC
4
CLQCA-24I-099
D-xilose
85
CLQCA-24SC-133
D-xilose
39
Código
Continua...
86
Apêndice 1, Cont.
Espécie
Cryptococcus (Bulleromyces) laurentii
Meio de
Cultura para
Isolamento
Amostra
CLQCA-24I-130
D-xilose
92
CLQCA-24I-161
Xilana
91
CLQCA-24SC-043
D-xilose
36
CLQCA-24SC-244
Xilana
40
Código
CLQCA-24F-128
Debaryomyces nepalensis
Geotrichum silvicola
Xilana
4
CLQCA-24SC-223
D-xilose
33
CLQCA-24SC-232
CMC
35
CLQCA-24SC-305
Xilana
40
CLQCA-24F-020
Xilana
10
CLQCA-24F-133
Xilana
2
CLQCA-24SC-070
D-xilose
33
CLQCA-24SC-114
CMC
35
CLQCA-24SC-132
D-xilose
39
CLQCA-24F-034
Issatchenkia terricola
CLQCA-24F-068
CLQCA-24F-161a
3
D-xilose
CLQCA-24F-174
Kazachstania exigua
Kazachstania unispora
CLQCA-24SC-173
10
5
5
D-xilose
30
CLQCA-24F-069
8
CLQCA-24F-070
8
CLQCA-24F-071
2
CLQCA-24F-072
8
CLQCA-24F-073
2
CLQCA-24F-076
6
CLQCA-24F-077
6
CLQCA-24F-080
D-xilose
4
CLQCA-24F-086
2
CLQCA-24F-104
8
CLQCA-24F-164
10
CLQCA-24F-165
3
CLQCA-24F-166
3
CLQCA-24SC-045
28
CLQCA-24SC-185
21
Lindnera saturnus
CLQCA-24SC-206
CMC
36
Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
D-xilose
27
Continua...
87
Apêndice 1, Cont.
Espécie
Pichia manshurica
Torulaspora delbrueckii
Código
Meio de
Cultura para
Isolamento
Amostra
CLQCA-24F-039
10
CLQCA-24F-061
4
CLQCA-24F-079
CLQCA-24F-082
D-xilose
10
4
CLQCA-24F-083
2
CLQCA-24F-154
4
CLQCA-24SC-320
CLQCA-24SC-321
D-xilose
28
28
CLQCA-24F-040
8
CLQCA-24F-064
2
CLQCA-24F-074
CLQCA-24F-075
D-xilose
2
6
CLQCA-24F-078
6
CLQCA-24F-093
8
CLQCA-24F-095
D-xilose
2
CLQCA-24F-006
D-xilose
8
CLQCA-24F-145
D-xilose
6
CLQCA-24SC-217
CMC
32
Trichosporon laibachii
CLQCA-24F-094b
CMC
2
Trichosporon multisporon
CLQCA-24F-094a
CMC
2
Trichosporon jirovecii
Yamadazyma mexicana
CLQCA-24F-118
CLQCA-24F-178
D-xilose
6
10
CLQCA-24F-129
CMC
10
CLQCA-24I-107
D-xilose
93
CLQCA-24I-154
D-xilose
93
CLQCA-24I-194
D-xilose
93
CLQCA-24F-097
Xilana
4
CLQCA-24F-144
CMC
4
CLQCA-24F-152
Xilana
10
CLQCA-24SC-131
D-xilose
37
CLQCA-24SC-143
D-xilose
22
CLQCA-24SC-164
D-xilose
28
CLQCA-24SC-196
D-xilose
22
CLQCA-24SC-306
Xilana
40
CLQCA-24SC-314
D-xilose
28
88
Apêndice 2 – Sequências dos domínios D1/D2 e região ITS do isolado Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
Domínios D1/D2
TGAAGATGGATTTCTGGAGTTGGCCCCTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTC
ACAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGCGGGGTGGTCCAGCTCCATGTAGATTTCC
TTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGAGGTAAATTCCTT
CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAG
ATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGA
AGGGTATTAGATCAGACTTGGTGTTTTGTGATTATCATTCCCTCGTGGGATGTGC
ACTCGCATTGCGCTGGGCCAGCATCGGTTCGAGTGGCAAGATAATGACTTGGG
AACGTGGCTCTGCTTCGGGAGAGTGTTATAGCCCACAGTTGATGTTGCCTACTT
GGACCGAGGACTGCGG
Região ITS
GATCTCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGT
GAATTGCAGGTTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACCCTCTGG
CATTCCAGAGGGTATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAATCGTCAAGATTG
GTATTGAGTGATACTCTGCTTGCAGTGTTAACTTGAAATAGTGTTTTTACGCGGA
CTTGCTTTTTTGTGGCCGCTCTCTGTTTGAGATAATGTATTAGGTTCTACCAACT
CGTTATAGCAGCATGAGTGTGACTAAGCTGGGCTGCCCGAACAACCTAACCTAA
AGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTG
89
3.1 Candida pseudointermedia
3.2 Candida tropicalis
3.3 Candida sinolaborantium
3.4 Lindnera sp.
CLQCA-24F-113
CLQCA-24F-125
CLQCA-24F-127
CLQCA-24SC-025
30
8
14
4
3
2
20
0
0
-1
8
20
6
4
2
0
0
0
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-10
Tempo (h)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-10
0
10
20
30
Tempo (h)
40
50
60
70
-1
1
10
-1
-1
0
14
12
Xilose (g L )
-1
-1
-1
Xilose (g L )
Xilose (g L )
5
-1
2
0
10
5
16
Xilitol, Etanol, Células (g L )
4
15
20
6
40
Xilitol, Etanol, Célular (gL )
6
20
18
7
40
Xilitol, Etanol, Células (gL )
8
20
10
25
40
12
Xilose (g L )
40
80
-2
-10
0
10
20
30
Tempo (h)
40
50
60
70
80
Tempo (h)
3.6 Zygowilliopsis californica
3.7 Scheffersomyces stipitis
CLQCA-24SC-027
CLQCA-24SC-143
CLQCA-24SC-321
7
10
6
6
2
-1
20
-1
0
20
5
-1
1
40
Xilose (g L )
-1
3
-1
1
Xilose (g L )
-1
Xilose (g L )
2
4
0
0
20
-10
0
10
20
30
40
Tempo (h)
50
60
70
80
-10
0
10
20
30
40
Tempo (h)
50
60
70
80
3
5
40
4
5
40
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)
Apêndice 3 - Concentração de xilose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- --) e xilitol (-- --) em g.L-1 ao longo do ensaio de
fermentação em meio semi-sintético com D-xilose como fonte de carbono.
90
4.1 Candida pseudointermedia
4.2 Candida tropicalis
CLQCA-24F-113
CLQCA-24F-125
30
16
14
20
6
4
15
20
10
5
-1
-1
2
0
20
-1
-1
Xilose (g L )
8
10
25
40
12
Xilose (g L )
40
0
0
0
-2
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
Tempo (h)
60
80
100
120
Tempo (h)
4.3 Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
CLQCA-24F-127
25
20
40
40
10
5
-1
20
10
5
-1
-1
0
Xilose (g L )
-1
Xilose (g L )
20
15
0
0
0
0
20
40
60
80
100
120
15
20
0
20
40
Tempo (h)
60
80
100
120
Tempo (h)
Apêndice 4 - Concentração de xilose (-- --), produção de células (-- --), etanol (-- -) e xilitol (-- --) em g.L-1 ao longo do ensaio de fermentação em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar.
91
Apêndice 5 - Parâmetros fermentativos de produção de xilitol em fermentações feitas em frascos Erlenmeyer com hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, de acordo com os tempos de amostragem do ensaio, para as leveduras testadas.
Parâmetro
Fermentativo
Linhagem
12 h
24 h
48 h
72 h
96 h
120 h
1
CLQCA-24F-113
0,08
0,31
0,43
0,34
0,29
0,39
-1
C.sinolaborantium
CLQCA-24F-127
0,22
0,23
0,42
0,43
0,43
0,49
C.tropicalis
CLQCA-24F-125
0,35
0,68
0,54
0,67
0,61
0,63
Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
0
0
0,73
0,64
0,54
0,46
CLQCA-24F-113
0,04
0,16
0,28
0,19
0,12
0,13
C.sinolaborantium
CLQCA-24F-127
0,18
0,12
0,29
0,21
0,18
0,16
C. tropicalis
CLQCA-24F-125
0,28
0,62
0,46
0,38
0,26
0,21
Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
0
0
0,18
0,33
0,22
0,15
 
CLQCA-24F-113
9,158
33,63
47,34
37,14
31,41
42,94

C.sinolaborantium
CLQCA-24F-127
23,81
25,7
46,44
46,83
47,04
53,79
C. tropicalis
CLQCA-24F-125
38,62
74,96
59,67
73,5
66,92
68,79
Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
0
0
80,68
70,58
59,19
50,34
CLQCA-24F-113
14,25
30,67
78,9
98,87
99,17
99,19
C.sinolaborantium
CLQCA-24F-127
12,28
30,07
59,6
85,13
94,31
95,71
C. tropicalis
CLQCA-24F-125
23,39
53,41
99,17
99,08
99,15
99,00
Lindnera sp.
CLQCA-24SC-025
6,39
12,79
29,88
93,88
98,96
97,68
Yp/s
(g.g )
Qp
2
-1
-1
(g.L .h )

Consumo de D4
xilose %
1
Espécie
-1
Yp/s(g.g )- rendimento de xilitol: xilitol produzido (P) por massa de xilose consumida (S).
-1 -1
-1
3
 (%)- eficiência de conversão: razão entre o fator de rendimento (YP/S) obtido e o fator de rendimento (Yp/s) obtido e o fator de rendimento teórico ( 0,917 grama
de xilitol/gramas de xilose).
4
2
92
Apêndice 6 – Análise estatísticas para as variáveis de produção de xilitol, etanol e
consumo de xilose, e para os fatores de fermentação Yp/s e eficiência obtidas da
fermentação das espécies testadas em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar.
ANOVA para produção de xilitol
Origem
Repetições
Hipóteses
Erro
Suma dos
cuadrados tipo III
,999
388,403
Cepas
Hipóteses
Erro
Horas
Linhagens
Horas
*
gl
2
54
Media
quadrática
,499
a
7,193
914,487
388,403
3
54
Hipóteses
Erro
5573,488
388,403
Hipóteses
Erro
664,513
388,403
F
Sig.
,069
,933
304,829
a
7,193
42,381
,000
6
54
928,915
a
7,193
129,148
,000
18
54
36,917
a
7,193
5,133
,000
a. MS (Error)
Medias marginais estimadas
Media
Erro típ.
11,196
,293
Intervalo de confiança 95%
Limite inferior
Limite superior
10,609
11,783
Prova post hoc: DHS de Tukey
Linhagens
N
F-113
21
F-127
21
9,4057
SC-025
21
10,2805
F-125
21
Sig.
Subconjunto
1
2
8,3157
16,7824
,094
1,000
Indicam-se as médias dos grupos de subconjuntos homogêneos.
Baseando-se nas médias observadas, o término erro é a média quadrática= 7,193
a. Usa o tamanho das amostras da media armónica.
Alfa= ,05.
Suma de
quadrados
449,979
14,475
Regressão
Residual
Total
464,454
ANOVA
gl
2
4
Media
quadrática
224,990
3,619
F
Sig.
62,173
,001
6
A variável independente é Horas.
Horas
Horas ** 2
(Constante)
Coeficientes
Coeficientes não
Coeficientes
padronizados
padronizados
B
Erro típico
Beta
,413
,065
2,104
-,002
,001
-1,218
-1,862
1,486
t
Sig.
6,321
-3,659
-1,253
,003
,022
,278
93
ANOVA para produção de Etanol
Origem
Repetições
Hipóteses
Erro
Suma de
quadrados tipo III
1,887
138,554
Linhagens
Hipóteses
Erro
Horas
Linhagens
Horas
*
gl
2
54
Media
quadrática
,943
a
2,566
30,375
138,554
3
54
Hipóteses
Erro
142,877
138,554
Hipóteses
Erro
62,531
138,554
F
Sig.
,368
,694
10,125
a
2,566
3,946
,013
6
54
23,813
a
2,566
9,281
,000
18
54
3,474
a
2,566
1,354
,194
a. MS(Error)
Media
Erro típ.
2,803
,175
Limite inferior
Limite superior
2,453
3,154
Linhagens
N
SC-025
21
Subconjunto
1
2
2,2424
F-125
21
2,3124
F-127
F-113
21
21
2,9190
2,9190
3,7400
,524
,354
Sig.
O término erro é a media quadrática (erro)= 2,566. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica =
21,000. b. Alfa = ,05.
a,b
DHS de Tukey
Horas
d
i
m
e
n
s
i
o
n
1
N
Subconjunto
2
0
12
1
,8383
12
12
1,4058
1,4058
24
12
1,8892
1,8892
48
12
120
12
3,9125
72
12
4,1125
96
12
4,2733
Sig.
3,1925
,678
,110
3
3,1925
,649
Indicam se as medias dos grupos de subconjuntos homogêneos baseadas nas medias observadas.
O término erro é a media quadrática (erro)= 2,566.
a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica= 12,000. b. Alfa = ,05.
94
ANOVA para consumo de D-xilose
Origem
Repeticiones
Hipóteses
Erro
Suma de
quadrados tipo III
4,655
275,766
Cepas
Hipóteses
Erro
Horas
Cepas * Horas
gl
2
54
Media
quadrática
2,327
a
5,107
764,798
275,766
3
54
Hipóteses
Erro
20206,962
275,766
Hipóteses
Erro
1282,913
275,766
F
Sig.
,456
,636
254,933
a
5,107
49,920
,000
6
54
3367,827
a
5,107
659,482
,000
18
54
71,273
a
5,107
13,957
,000
a. MS(Error)
Media
Erro típ.
Limite inferior
Limite superior
16,668
17,657
17,162
,247
Linhagens
Media
F-113
F-125
SC-025
F-127
Erro típ.
15,752
13,021
20,905
18,971
Limite inferior
Limite superior
14,763
16,741
12,032
14,010
19,916
21,893
17,983
19,960
,493
,493
,493
,493
Linhagens
N
F-125
21
F-113
21
F-127
21
SC-025
21
Sig.
1
13,02
10
Subconjunto
2
3
4
15,7519
18,97
14
20,9048
1,000
1,000
1,000
1,000
Indicam se as medias dos grupos de subconjuntos homogêneos baseadas nas medias observadas. O término
erro é a media quadrática (erro)= 5,107. a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 21,000. b. Alfa =
,05.
Horas
N
Subconjunto
1
2
3
4
5
120
12
,8617
d
i
m
e
n
s
i
o
n
1
96
12
,8667
72
12
2,4225
48
12
24
12
12
12
0
12
Sig.
13,4225
28,9217
34,5575
39,0833
,624
1,000
1,000
1,000
1,000
Indicam se as medias dos grupos de subconjuntos homogêneos baseadas nas medias observadas.
O término erro é a media quadrática (erro)= 5,107. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica =
12,000. b. Alfa = ,05.
95
Análises de varianza univariante para Yp/s
Origem
Repeticiones
Hipóteses
Erro
Suma de
quadrados tipo III
,485
13,169
gl
2
54
Media
quadrática
,243
a
,244
Cepas
Hipóteses
Erro
,944
13,169
3
54
Horas
Hipóteses
Erro
2,700
13,169
Cepas * Horas
Hipóteses
Erro
5,781
13,169
F
Sig.
,995
,377
,315
a
,244
1,290
,287
6
54
,450
a
,244
1,845
,108
18
54
,321
a
,244
1,317
,215
a. MS(Error)
Media
Erro típ.
,407
Limite inferior
Limite superior
,299
,515
,054
ANOVA para Fator Eficiência de fermentação
Origem
2
54
Media
quadrática
20,252
a
111,313
7395,718
6010,884
3
54
Hipóteses
Erro
36644,322
6010,884
Hipóteses
Erro
12944,786
6010,884
Repeticiones
Hipóteses
Erro
Cepas
Hipóteses
Erro
Horas
Cepas * Horas
Suma de
quadrados tipo III
40,505
6010,884
gl
F
Sig.
,182
,834
2465,239
a
111,313
22,147
,000
6
54
6107,387
a
111,313
54,867
,000
18
54
719,155
a
111,313
6,461
,000
a. MS(Error)
Media
Error típ.
39,307
1,151
Intervalo de confianza 95%
Límite inferior
Límite superior
36,999
41,615
Linhagens
F-113
21
Subconjunto
1
2
29,4008
F-127
21
35,5618
SC-025
21
37,5642
F-125
21
Sig.
N
54,7011
,070
1,000
erro é a media quadrática (erro)= 111,313. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica = 21,000. b.
Alfa = ,05.
96
Horas
d
i
m
e
n
s
i
o
n
1
N
1
,0000
Subconjunto
2
3
4
0
12
12
12
24
12
96
12
51,3951
120
12
53,2577
72
12
57,2353
48
12
Sig.
18,5960
35,3172
59,3475
1,000
1,000
1,000
,524
erro é a media quadrática (erro)= 111,313. a. Usa o tamanho das amostras da media harmônica = 12,000. b.
Alfa = ,05.
97
ANEXOS
Isabela
Sierra Negra
Media Luna
Los Gemelos
Santa Cruz
Puerto Ayora
Floreana
Estação para
Tartarugas
Anexo 1 – Pontos de coleta das amostras de madeira em decomposição no
Arquipélago das Ilhas Galápagos.
98
Anexo 2 – Certificado Zoosanitario para la exportación do Ministerio de Agricultura,
Ganadería, Acuacultura y Pesca do Equador, e autorização do Ministerio del
Ambiente para exportação das amostras de leveduras
99
100
Anexo 3 – Ilustração do sistema do fermentador de 2,4 L empregado nas
fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por
Candida (Lodderomyces/ Spathapora) tropicalis e Lindnera sp.
101

universidade federal de minas gerais

Transcrição

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