Separação de lípidos por cromatografia em camada fina

Separação de lípidos por cromatografia em camada fina
Para separar os lípidos contidos nos extractos que obteve
na aula prática anterior, vamos utilizar a técnica da
cromatografia em camada fina. Nesta, como em qualquer
técnica cromatográfica, os compostos são separados de
acordo com as diferentes afinidades (solubilidade) que têm
com a fase móvel e com a fase estacionária da
cromatografia. Na cromatografia de camada fina as amostras são aplicadas numa placa
revestida com gel de sílica – fase estacionária – que é percorrida por uma solução –
eluente ou fase móvel. Ao serem arrastados, os componentes da mistura migrarão mais
rapidamente ou menos, conforme a sua afinidade para a fase estacionária ou para a fase
móvel.
Os lípidos das amostras vão ser identificados por comparação com lípidos padrão aplicados
na mesma placa de cromatografia.
Lípidos de referência em solução (fornecidos)
•
Colesterol 20 mg/mL em clorofórmio
•
Mistura de acilglicerois (trioleina, 1,2-diacilglicerol, 1,3-diacilglicerol e 1-
monoacilglicerol) 20 mg/mL em clorofórmio
•
Fosfatidilcolina (lecitina) 20 mg/mL em clorofórmio
Amostras a analisar (obtidas na aula anterior)
•
Extracto lipídico de gema de ovo em clorofórmio
•
Extracto lipídico de semente oleaginosa em clorofórmio
Eluente
•
Éter de petróleo: éter etílico: ácido acético 75:25:1 (v/v))
CROMATOGRAFIA: Aplicação da amostra
1. Com o auxílio de pipetas de Pasteur, e tendo o cuidado de não tocar na sílica, aplique
cada um dos padrões e amostras sob a forma de uma linha de 2 cm em intervalos de 1cm.
Utilize uma pipeta diferente para cada aplicação. A linha de aplicação (imaginária, claro)
deverá ficar a 1-1,5 cm distanciada da borda da placa. Aplique as amostras e padrões
deixando cerca de 1 cm livre em relação à borda direita e borda esquerda.
2. Segurando a placa pelo bordo, coloque-a verticalmente na tina, de modo a que o bordo
contendo as substâncias a analisar fique na parte inferior da mesma. A linha de aplicação
deverá ficar acima da linha de eluente
3. Tape a tina e deixe-a eluir até o solvente atingir o topo da placa.
4. Retire a placa e deixe secar o solvente na hotte.
REVELAÇÃO DOS COMPOSTOS
A maior parte dos lípidos não tem cor. Para os podermos visualizar, vamos colocar a placa
de cromatografia numa tina com vapores de iodo. Os lípidos vão ficar corados de amarelo,
podendo assim ser visualizados.
Um método alternativo é borrifar a placa com um reagente específico (solução etanólica a
5% de H3(P(MoO16)4) H2O) seguido de aquecimento a 110ºC na estufa.
1. Coloque a placa na câmara de cromatografia saturada com vapor de iodo e tape a tina.
(ou use o método alternativo)
2. Quando as manchas amarelas indicativas da presença dos lípidos forem bem evidentes,
retire a placa.
3. Marque a posição de cada uma das manchas delineando-a cuidadosamente a lápis (a
coloração amarela desaparece ao fim de algum tempo).
4. Meça a distância percorrida por cada mancha, assim como a distância percorrida pelo
eluente. O quociente entre os dois valores é característico de cada substância e designa-se
mobilidade relativa ou factor de retenção (Rf):
Rf= distância percorrida pelo composto) / (distância percorrida pelo eluente)
5. Identifique os lípidos de cada amostra, comparando os valores de Rf das manchas das
amostras com os Rf dos padrões.
Elabore o respectivo relatório seguindo o modelo estabelecido com as adequadas
adaptações. Compare a composição lipídica dos dois extractos. Com base nas fórmulas
tente compreender por que razão uns lípidos se deslocaram mais e outros menos na placa de
cromatografia. Não esqueça os comentários e conclusões
Bibliografia
http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm - Ciberlípidos - tipos de lípidos,
métodos de extracção e de análise, e muito mais) (consultado em 11-03-2008)
http://www.lipidlibrary.co.uk/lipids.html - tudo à cerca de lípidos de uma forma simples.
(consultado em 11-03-2008)