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ISSN 2236-3866
© 2011 Evolução e Conservação da Biodiversidade e autores
Acesso livre em www.simposiodabiodiversidade.com.br/ecb
AVALIAÇÃO DA TRANSFERIBILIDADE DE LÓCUS DE MICROSSATÉLITES EM OITO ESPÉCIES DE
Astyanax
“EVALUATION OF TRANSFERABILITY OF MICROSATELLITE LOCI IN EIGHT SPECIES OF Astyanax”
Sabrina Alves da Silva1; Pierre Rafael Penteado2; Rubens Pazza3; Karine Frenher Kavalco3
¹
Graduanda em Ciência dos Alimentos, UFVUFV Campus de Rio Paranaíba ([email protected])
²Mestrando, UFV- Campus de Rio Paranaíba
³Professor adjunto, UFV- Campus de Rio Paranaíba
RESUMO
Os peixes do gênero Astyanax são popularmente conhecidos como lambaris ou piabas
e são uns dos mais especiosos da região neotropical. Os microssatélites são um tipo de
marcador molecular formado por arranjos de repetições em tandem de dois a seis
nucleotídeos. São extremamente utilizados
utilizados para identificação de indivíduos e no rastreamento
da história biológica de populações, uma vez que normalmente geram padrões espécieespécie
específicos. Este trabalho teve por objetivo verificar a amplificação cruzada utilizando seis
pares de primers para lócus
cus de microssatélites desenvolvidos a partir da espécie Astyanax
mexicanus em outras espécies de Astyanax. Foram testadas quanto a transferibilidade de lócus
oito espécies do gênero Astyanax. Para definir a melhor temperatura de anelamento de cada
primer testes de amplificação foram realizados utilizando termociclador com gradiente de
temperatura. Quatro primers amplificaram em pelo menos algumas espécies. Quatro espécies
mostram padrão de amplificação positivo para um dos primers, apresentando um padrão
bastante polimórfico.
Palavras-chave: microssatélites, amplificação cruzada, polimorfismo
ABSTRACT
The fish of the genus Astyanax are popularly known as lambaris or piabas and are one
of
the most specious of
the Neotropics. Microsatellites are a type of molecular
nucleotides They are widely
markerformed by arrangements of tandem repetitions up to six nucleotides.
used for individual identification and tracking of the biological history of populations,
populations since
they typically generate species-specific
species
patterns. This study aimed to verify the crossamplification of primers
for six microsatellite loci developed from
Astyanax mexicanus in other Astyanax species. There were tested for the transferability of the
loci eight species of Astyanax.
Astyanax Aiming to determine the best annealing temperature of
each primer amplification, tests were performed using temperature gradient termocycler.
termocycler We
get amplification with four primer sets in at least some species.
species Four species shows positive
amplification pattern for one primer,
primer with a quite polymorphic pattern.
Key words: microsatellites, cross-amplification,
cross
polymorphism
Evolução e Conservação da Biodiversidade |Volume 2 Nº 1 | 2011
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Introdução
Os peixes do gênero Astyanax são
popularmente conhecidos como piabas ou
lambaris e é um dos mais especiosos da
região
neotropical
e
com
vasta
distribuição, desde o sul dos Estados
Unidos até o norte da Argentina.
Atualmente, o gênero encontra-se
encontra
“incertae sedis” na família Characiadae
Characiad
(Lima et al.,2003),
,2003), que apresenta 952
espécies válidas e 400 espécies ainda não
descritas (Reis et al.,, 2003); destas, o
gênero Astyanax forma um grupo
complexo e sua identificação tem sido
difícil por apresentar várias formas
similares (Melo, 2001).
Ass espécies deste gênero estão
alocadas no Filo Chordata, Subfilo
Vertebrata, Classe Osteichthyes, Subclasse
Actinopterygii, Ordem Characiformes e
Família Characidae (Nelson, 1994). Estes
peixes apresentam como principais
características o tamanho reduzido,
nadadeira adiposa geralmente presente;
linha lateral completa, pouco curva na
frente; pré-maxilar
maxilar não protrátil; dentes
pré-maxilares
maxilares dispostos em duas séries, a
interna com cinco dentes; dentes com
cúspides; altura do corpo cerca de três
vezes ou menos no
o comprimento padrão e
escamas de tamanho normal cobrindo
apenas a base dos raios da nadadeira
caudal (Britski et al.,, 1988). São peixes não
migradores, com fecundação externa e
ausência de cuidado parental (Vazzoller et
al., 1992).
Os
microssatélites,
ta
também
conhecidos como STR (repetições curtas
em tandem “Short
Short Tandem Repeats”),
Repeats” são
elementos repetitivos, formados por
arranjos de repetições em tandem, de dois
a seis nucleotídeos de comprimento e
estão entre os locos mais polimórficos dos
genomas. Este tipo
ipo de marcador apresenta
padrão de herança codominante e vêm
sendo utilizados para resolver questões
relacionadas à estrutura genética e a
conservação de recursos genéticos de
determinadas populações (Moretzonh,
2006). A principal desvantagem desses
marcadores
dores é a necessidade de
conhecimento de prévio do genoma para o
desenvolvimento de primers espéciesespecíficos, o que torna o processo
trabalhoso e de alto custo (Grattapaglia,
2008).
Alguns estudos demostraram que é
possível realizar amplificação cruzada
cruzad de
primers
desenvolvidos
para
uma
determinada espécie em outras espécies
próximas do ponto de vista evolutivo. O
sucesso de amplificação dos marcadores
microssatélites entre espécies, associado à
natureza de loco único desses marcadores
de DNA, garante sua
ua validação como
conectores para uma futura consolidação
de mapas de diferentes espécies e permite
a associação desses mapas com fenótipos
de interesse.
Em peixes, diversos loci de
microssatélites tem sido descritos. No
gênero Astyanax,, Strecker (2003) isolou
is
seis loci a partir de Astyanax mexicannus.
Estes loci foram desenvolvidos para um
estudo genético com o objetivo de se
detectar o fluxo gênico existente entre
duas populações de uma mesma espécie,
Astyanax mexicannus: os peixes de
caverna, cegos e sem a cavidade ocular, e
os peixes de superfície, que não
apresentam anomalias.
Este trabalho teve por objetivo
verificar a amplificação cruzada utilizando
primers desenvolvidos para lócus de
microssatélites da espécie Astyanax
mexicannus em outras espécies de
Astyanax.
Material e métodos
Espécies estudadas
Foram estudadas oito espécies do
gênero Astyanax: A. altiparanae,
altiparanae coletados
em Salesópolis- SP; A. bockmanni,
coletados em São Miguel ArcanjoArcanjo SP; A.
scabripinnis, coletados no rio Grande; A.
bifasciatus,, do córrego Sangão; A. lacustris,
do rio São Fransisco; A. fasciatus,
fasciatus coletados
em Angatuba- SP; e A. asuncionesis,
coletados em Bonito- MT.
Extração do DNA a partir do tecido
A extração do DNA foi realizada
seguindo os passos descritos pelo
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mexicanus como controle positivo. Após a
obtenção das melhores temperaturas de
anelamento, foram escolhidas quatro
espécies, A. fasciatus, A. altiparanae, A.
bifasciatus e A. bockmanni, para realizar
testes de polimorfismo para um dos
primers que apresentou melhor padrão de
amplificação. Para isso, foram utilizados 10
indivíduos de A. fasciatus, 10 indivíduos de
A. altiparanae, 9 indivíduos de A.
bifasciatus e 8 indivíduos A. bockmanni. Os
produtos
da
amplificação
foram
observados em gel de agarose
ag
3% corado
com brometo de etídio, utilizando-se
utilizando
transiluminador. As imagens foram
capturadas utilizando o software Lpix
(Loccus).
Resultados, discussão e conclusão
Astyanax scabripinnis
Astyanax sp.B
Astyanax lacustris
Astyanax fasciatus
Primer 1
550C
560C
540C
550C
560C
540C
55-560C
560C
Primer 2
530C
-
-
-
53oC
-
-
530C
Primer 4
-
560C
540C
550C
560C
550C
55-560C
560C
Primer 9
540C
-
-
-
540C
-
53-540C
53-540C
Primer 10
-
-
-
-
510C
-
-
-
Primer 13
-
-
-
-
-
-
-
-
Astyanax
asuncionensis
Astyanax mexicannus
Astyanax bockmanni
Foi observada a transferência de
pelo menos quatro loci de microssatélites.
A maioria dos primers utilizados obtiveram
melhores resultados em temperaturas de
anelamento
um
grau
acima
da
temperatura padrão descrita por Strecker
em seu trabalho. A tabela 1 relaciona
r
as
temperaturas de anelamento de cada
primer com as espécies utilizadas neste
estudo.
Astyanax altiparanae
protocolo de extração do Kit Wizard
Purification
Systems
(Promega).
A
quantificação foi realizada em comparação
com um padrão de massa molecular (Low
Mass DNA Ladder – Invitrogen) através de
eletroforese em gel de agarose 1%.
Reações de amplificação
O preparo da reação de PCR, foi
realizado no aparelho DNA workstation.
Nas reações foram utilizados 6 pares de
primers::
Ast1
(F:
CCCAGAAGCCTCATCGATAACA;
R:
ATCGGACAAGCAGAGTGCATTA), Ast 2 (F;
GAGGGTCTGATGTACTGAGA;
GTCTGATGTACTGAGA;
R:
CGAACCCGAGAAACTG), Ast 4
(F:
TCGTTATGAAGAGGCTCAAA;
R:
GCACCTCGGGGAGAC),
Ast9
(F:TCCACAATAGACTCGGAAAGAATC;
R:
GACAAAAGAGGCTTCCATGAACT), Ast10 (F:
ACAGAAACACGTTGATGTATGG;
R:
CAAACTGATTGACTGATGGAGC), Ast13 (F:
GCGCCTCACTGCTCTCACAC;
R:
ATGGCTGCAGGTGCTTTGATA),
GGCTGCAGGTGCTTTGATA),
previamente isolados de A.. mexicanus
(Strecker, 2003).
Os testes de amplificação cruzada
foram realizados em termociclador com
gradiente de temperatura, tendo como
padrão a temperatura descrita por Strecker
(2003) e utilizando-se amostra
mostra de A.
Tabela 1 - Temperatura de anelamento para cada espécie com cada um dos primers testados. A falta de
temperatura de anelamento indica que não houve amplificação em nenhuma temperatura testada.
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Primers como o Ast 10 e o Ast 13
não amplificaram nem para a espécie da
qual foram extraídos, Astyanax mexicanus.
Tal fato pode ser explicado por falhas ou
erros durante a fabricação do primer ou
por variação na espécie utilizada como
padrão, já que a espécie
spécie Astyanax
mexicanus existe em dois diferentes
habitats: os da caverna, que são cegos e
não possuem a cavidade ocular; e os de
superfície, que enxergam normalmente.
Adicionalmente, os exemplares utilizados
no presente trabalho são provenientes de
piscicultura
icultura e, segundo informações dos
vendedores, são linhagens criadas no Brasil
há vários anos, o que pode tê-los
tê
diferenciado bastante das amostras
originais de onde foram obtidos os
primers.
Além da transferibilidade, testoutestou
se o padrão de polimorfismo do
d primer
Ast1 em algumas das espécies.
Em relação à espécie Astyanax
fasciatus observou-se
se padrão polimórfico
com pelo menos dois alelos diferentes e
comprimento variando de 170 a 200 pares
de base; e, o indivíduo 1 é heretorigoto,
evidenciado pela formação
formaçã
de duas
bandas, enquanto os restantes são
homozitogos (Figura 1).
Figura 1 - Padrão eletroforético em gel de agarose
3% de fragmentos de DNA do primer Ast 1 na
espécie Astyanax fasciatus
A espécie Astyanax bockmanni,
bockmanni por
sua vez, apresentou um padrão
eletroforético
bastante
polimórfico,
evidenciando
cinco
indivíduos
heterozigotos e quatro homozigotos, com
o comprimento dos fragmentos variando
de 100 a 200pb (Figura 2).
Figura 2 - Padrão eletroforético em gel de agarose
de fragmentos de DNA do primer do Ast 1 e a
espécie Astyanax bockmanni
A espécie Astyanax altiparanae
também mostrou padrão polimórfico em
relação ao lócus Ast1 (Figura 3). Observa-se
a presença de quatro indivíduos
heterozigotos,
caracterizados
pelo
surgimento de duas bandas próximas uma
as outras; o restante dos indivíduos são
homozigotos. É importante ressaltar que o
último poço da imagem corresponde a um
“indivíduo teste”, que foi usado para
identificar possíveis problemas erros no
preparo da reação; este indivíduo não
pertence à espécie Astyanax altiparanae.
Figura 3 - Padrão eletroforético em gel de agarose
de fragmentos de DNA do primer Ast 1 e a espécie
Astyanax altiparanae
Testou-se
se o grau de polimorfismo
também para a espécie A. bifasciatus. O
padrão de amplificação
ação mostrou-se
mostrou
polimórfico, evidenciando dois indivíduos
heterozigotos, e os restantes homozigotos;
o indivíduo 2, seguindo a ordem, não
amplificou por motivos desconhecidos, e
em todos os outros poços houve o
surgimento de “bandas fantasmas” (Figura
4). Tal como na imagem anterior, o último
poço da imagem corresponde a um
“indivíduo teste” que não pertence a
espécie analisada.
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Figura 4 - Padrão eletroforético em gel de agarose de
fragmentos de DNA do primer Ast 1 e a espécie
Astyanax spB.
Diversos estudos comprovam que a
utilização de lócus de microssatélites
previamente desenvolvidos para uma
espécie e testados em outra espécie
próxima aumenta a probabilidade de
convervação das sequências e de
amplificação cruzada usando primers
heterólogos.
s. Um exemplo de estudo
realizado para este fim, tal como o
presente trabalho, foi desenvolvido por
Silva (2008) onde ela testa a amplificação
cruzada de primers desenvolvidos para
Aegla longirostri e Aegla uruguayana, que
são espécies de crustáceos de água
águ doce,
em outras sete espécies de crustáceos do
mesmo gênero e de gêneros diferentes.
Observou-se
se que a transferência dos
microssatélites apenas ocorreu em
indivíduos do mesmo gênero, Aegla,
evidenciando
que
os
locos
de
microssatélites
não
se
encontram
conservados
nservados em espécies distantemente
relacionadas; e o loco AlCA135
CA135 foi o que
apresentou maior índice de sucesso na
amplificação cruzada.
Outro recente estudo foi realizado
por Lima (2008) onde 52 lócus de
microssatélites
desenvolvidos
para
diferentes espécies
cies de peixes da ictiofauna
foram testados na espécie Colossoma
macropomum, popularmente conhecido
como Tambaqui. Destes 52 lócus, 16
apresentaram resultados satisfatórios de
amplificação cruzada, o que permite
concluir que existe um grande potencial de
transferibilidade
ransferibilidade
de
marcadores
microssatélites entre diferentes espécies
da ictiofauna.
Através do presente trabalho pode-se
pode
concluir que alguns loci de microssatelites
previamente isolados de Astyanax
mexicannus amplificaram adequadamente
em
outras
espécies
es
do
gênero,
demostrando certo grau de polimorfismo
em relação ao lócus Ast1 nas seguintes
espécies: Astyanax fascistus, Astyanax
bockmanni, Astyanax altiparanae e
Astyanax bifasciatus. Entretanto, novos
testes otimizando as condições de PCR e
utilizando gel de poliacrilamida poderão
melhorar os índices de sucesso na
transferibilidade de lócus e melhor avaliar
o grau de polimorfismo em outras espécies
e com outros loci.
Agradecimentos
A FAPEMIG pelo apoio financeiro e pela
bolsa de iniciação científica.
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