ROSILEY BERTON PACHECO - UEM/PBC

ROSILEY BERTON PACHECO
ANÁLISE CITOGENÉTICA EM DUAS ESPÉCIES DO
GÊNERO Astyanax DE DIFERENTES BACIAS
HIDROGRÁFICAS:
LOCALIZAÇÃO DOS GENES RIBOSSÔMICOS 18S E 5S
Tese apresentada ao Programa de Pós–
Graduação, em Ciências Biológicas (área
de concentração – Biologia Celular e
Molecular), da Universidade Estadual de
Maringá, para a obtenção do grau de
Doutor em Ciências Biológicas.
MARINGÁ
2008
ROSILEY BERTON PACHECO
ANÁLISE CITOGENÉTICA EM DUAS ESPÉCIES DO
GÊNERO Astyanax DE DIFERENTES BACIAS
HIDROGRÁFICAS:
LOCALIZAÇÃO DOS GENES RIBOSSÔMICOS 18S E 5S
Orientador: Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior
MARINGÁ
2008
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
P116a
Pacheco, Rosiley Berton
Análise citogenética em duas espécies do gênero Astyanax
de diferentes bacias hidrográficas : localização dos genes
ribossômicos 18S e 5S / Rosiley Berton Pacheco. -- Maringá
: [s.n.], 2008.
57 f.
Orientador : Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Maringá,
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (área de
concentração - Biologia Celular e Molecular), 2008.
1. Citogenética de peixes. 2. Astyanax jacuhiensis. 3.
Astyanax altiparanae. 4. Hibridação in situ com
fluorescência (FISH). I. Universidade Estadual de Maringá.
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. II.
Título.
CDD 21.ed. 572.87
BIOGRAFIA
Rosiley Berton Pacheco, nascida em Umuarama/PR no dia 24/01/71. É
Professora pela SEED há 17 anos no Ensino Médio e 6 anos no Ensino Superior.
Possui graduação em Biologia pela Universidade Paranaense (1994),
especialização em Biologia pela Universidade Paranaense (1997), Mestrado em
Genética e Melhoramento pela Universidade Estadual de Londrina (2001), orientada
pela Profa. Dra. Ana Lúcia Dias, em 2004 iniciou Doutorado no Programa de Pós–
Graduação, em Ciências Biológicas (área de concentração – Biologia Celular e
Molecular), da Universidade Estadual de Maringá, sendo orientada pelo Prof. Dr.
Horácio Ferreira Júlio Júnior e tendo como co-orientadora a Profa. Dra. Ana Lúcia
Dias.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Ana Lúcia Dias, a maior responsável pelo meu crescimento,
por toda orientação, confiança e principalmente pela compreensão em todos os
momentos de dificuldades, muito obrigada e minha eterna gratidão, jamais
esquecerei tudo o que fez por mim, você é muito mais do que orientadora.
À amiga e companheira Profa. Dra. Lúcia Giuliano Caetano por toda ajuda
desde que me conheceu inclusive pelas coletas e preparação de materiais, pelas
dicas, sugestões e críticas para que este trabalho fosse concluído.
Ao Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior por me orientar e por toda a
confiança depositada em mim.
Ao Dr. Alberto Sergio Fenocchio, Dra. Ana Cláudia Swarça e ao Dr.
Mário Sérgio Mantovani pela amizade e pela ajuda prestada.
Ao laboratório do LABRE, principalmente ao Prof. Dr. André Luís Laforga
Vanzela, por disponibilizar equipamentos do laboratório.
À Profa. Dra. Isabel Cristina Martins dos Santos, à Profa. Dra. Ana Luiza
Brito Portela Castro e ao Prof. Dr. Carlos Alexandre Fernandes por toda atenção.
Ao programa de Mestrado em Genética e Biologia Molecular e ao
Laboratório de Citogenética de Peixes da Universidade Estadual de Londrina,
pelo apoio e principalmente aos técnicos: Dário, Melissa e Carlos.
Ao programa de Pós-graduação da Universidade Estadual de Maringá na
área de Biologia Celular, aos professores e ao secretário Nelsino sem o qual não
teria sido possível concluir o programa.
Aos companheiros de laboratório Renata, Larissa Lacerda, Tatiane,
Tamara, Vitor, Gabriel, Tatiana, Larissa Pires, Rafael, Treco, Marceléia, Tatiana,
Vivian e Michelli, pelo companheirismo.
Aos meus colegas de doutorado, em especial ao meu amigo Rafael e amiga
Renata, os quais estavam sempre prontos para me ajudar.
Aos meus filhos, Thiago, Thais e Juninho e aos meus sobrinhos José
Henrique e Laisa, aos meus amados pais Aparecido e Izabel, minhas irmãs Ivani
e Roseli por todo amor.
Ao meu cunhado Humberto e ao grande amigo Agnel por todo incentivo e
apoio em todas as horas.
À minha grande amiga Tânia Aparecida pela hospedagem e principalmente
por ouvir e compartilhar as horas difíceis.
Aos meus colegas de trabalho e amigos Pedro, Rosana, Maria Olita,
Danila, Davis, Edner, Cristina, Tânia Regina, Daniela, Márcia, Raquel e Ricardo
e a todos que contribuíram para que eu pudesse concluir este trabalho.
Ao Angelo, por tudo que você fez por mim.
A Deus, por permitir mais esta vitória em minha vida.
Muito obrigada!
Dedico aos meus filhos
Não é no silêncio que os
homens se fazem, mas na
palavra, no trabalho, na
ação-reflexão
Paulo Freire
APRESENTAÇÃO
Esta Tese é composta de dois artigos científicos, onde foram analisados
citogeneticamente exemplares do gênero Astyanax de diferentes localidades e
bacias hidrográficas, contribuindo assim com mais informações sobre este grupo de
peixes. Em consonância com as regras do Programa de Pós graduação em Ciências
Biológicas.
Inicia com o artigo Caracterização citogenética de Astyanax jacuhiensis
(Characidae) da bacia do lago Guaíba/RS
R.B. Pacheco1,2, L.Giuliano-Caetano1, L.R. Malabarba3, A.L. Dias1 e H.F.Julio Junior2
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, CCB, Londrina, PR,
Brasil
2
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá, DBC,
Maringá, PR, Brasil
3
Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
Revista BIOLOGICAL RESEARCH.
Tem continuidade com o artigo Citogenética comparativa entre três
diferentes populações de Astyanax altiparanae, com ênfase à localização do
DNAr 18S e 5S
R.B. Pacheco1,2, L.Giuliano-Caetano1, A.L. Dias1 e H.F.Julio Junior2
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, CCB, Londrina, PR,
Brasil
2
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá, DBC,
Maringá, PR, Brasil
Revista BIOLOGICAL RESEARCH.
PACHECO, Rosiley Berton. Análise citogenética em duas espécies do gênero
Astyanax de diferentes bacias hidrográficas: localização dos genes
ribossômicos 18S e 5S. 2008. 55p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas –
Área de Concentração, Biologia Celular e Molecular) – Universidade Estadual de
Maringá.
RESUMO
Foram estudados citogeneticamente exemplares de Astyanax jacuhiensis cuja
localidade tipo é Jacuhy, Rio Grande do Sul, coletados em três diferentes pontos da
bacia do lago Guaíba: Gasômetro, Arroio do Ribeiro e Barra do Ribeiro e Astyanax
altiparanae de três diferentes localidades: rio Monjolinho (bacia do rio
Monjolinho/SP), Água dos Patos (bacia do Paranapanema/SP) e Lago Igapó (bacia
do rio Tibagi/PR). Todos os exemplares de A. jacuhiensis apresentaram número
diplóide igual a 50 cromossomos com 8m+30sm+4st+8a (NF=92). Todas as
populações de A. altiparanae também apresentaram 2n=50, mas com diferentes
fórmulas cariotípicas: a população do rio Monjolinho com 10m+28sm+4st+8a
(NF=92), a do rio Água dos Patos com 8m+24sm+6st+12a (NF=88) e a população
do Lago Igapó com 8m+28sm+4st+10a (NF=90). Através da técnica de AgNORs nas
duas espécies, foi evidenciada uma variação de 1 até 5 cromossomos nucleolares,
localizadas em regiões teloméricas do braço curto ou longo de diferentes
cromossomos, mostrando também um heteromorfismo de tamanho. Entretanto,
através da hibridação in situ com fluorescência (FISH) com sonda de DNAr 18S foi
observado nas populações de A. altiparanae do rio Monjolinho, Lago do Igapó e A
jacuhiensis do Lago Guaíba apenas um par de cromossomos com marcações
fluorescentes, enquanto que a população do rio Água dos Patos apresentou 4
marcações fluorescentes. Através da hibridação fluorescente in situ (FISH) utilizando
sonda de DNAr 5S, foi visualizado um par de cromossomos com sinais fluorescentes
na posição intersticial em A altiparanae. A coloração com cromomicina A3 (CMA3)
em A. jacuhiensis e A. altiparanae mostrou correspondência com alguns sítios
AgNORs, sendo estes ricos em bases GC. A coloração com DAPI não evidenciou
nenhuma região rica em bases AT. A técnica de banda C utilizada somente na
população A. jacuhiensis do Lago Guaíba, revelou blocos de heterocromatina nas
regiões pericentroméricas na maioria dos cromossomos, sendo observadas algumas
marcações intersticiais, e um par cromossômico (sm), com marcação
heterocromática mais evidente na porção terminal do braço curto. BC+CMA3 em A.
jacuhiensis confirmou que a heterocromatina se encontra associada à NOR, além de
outras marcações fluorescentes em regiões pericentroméricas e intersticiais. Estes
são os primeiros dados citogenéticos de Astyanax jacuhiensis e os dados obtidos
nas 3 populações de A. altiparanae confirmam uma variabilidade cromossômica
neste grupo de peixes.
PACHECO, Rosiley Berton. Análise citogenética em duas espécies do gênero
Astyanax de diferentes bacias hidrográficas: localização dos genes
ribossômicos 18S e 5S. 2008. 55p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas –
Área de Concentração, Biologia Celular e Molecular) – Universidade Estadual de
Maringá.
ABSTRACT
A cytogenetic study was conducted on specimens of two species of Astyanax in
Brazil. A. jacuhiensis whose type-locality is Jacuhy, RS, was collected at three
different points in the Guaíba stream basin: Gasômetro, Arroio do Ribeiro and Barra
do Ribeiro. A. altiparanae was obtained from three different localities: Monjolinho
river (Monjolinho river basin/SP), Água dos Patos river (Paranapanema river
basin/SP) and Igapó stream (Tibagi river basin/PR). All of the specimens of A.
jacuhiensis showed a diploid number of 50 chromosomes with a karyotype of
8m+30sm+4st+8a (NF=92). All the populations of A. altiparanae also had a
chromosome number of 2n=50, but with different karyotype formulas: the population
of the Monjolinho river with 10m, 28sm, 4st and 8a (NF=92), that of the Água dos
Patos river with 8m, 24sm, 6st and 12a (NF=88) and the population of Igapó stream
with 8m, 28sm, 4st and 10a (NF=90). Using the AgNOR technique in the two
species, a variation of 1 to 5 nucleolar chromosomes was demonstrated, showing
localization in the telomeric regions of the short arm of different chromosomes along
with size heteromorphism. Meanwhile, using fluorescence in situ hybridization (FISH)
with an 18S rDNA probe, populations of A. altiparanae from the Monjolinho river and
Igapó stream and of A. jacuhiensis from Guaíba stream were found to have only one
chromosome pair with fluorescent staining, whereas the population from the Água
dos Patos river showed 4 fluorescent regions. FISH utilizing 5S rDNA showed one
chromosome pair with fluorescent signals in the interstitial region in A. altiparanae.
Staining with chromomycin A3 (CMA3) in A. jacuhiensis and A. altiparanae
corresponded with some AgNOR sites, these being rich in GC bases. Treatment with
DAPI showed negative staining of chromosomes that were CMA3 positive, where no
AT-rich region was observed. C banding was used only in the population of A.
jacuhiensis from Guaíba stream, and revealed heterochromatin blocks in the
pericentromeric regions in the majority of the chromosomes, where some interstitial
staining was observed, and one chromosome pair (sm) with heterochromatic staining
more evident in the terminal portion of the short arm. CB+CMA3 in A. jacuhiensis
confirmed that the heterochromatin was associated with NORs besides other
fluorescent bands in pericentromeric and intersticial regions. These are the first
cytogenetic data for Astyanax jacuhiensis, and findings in three populations of A.
altiparanae confirm a chromosome variability in this group of fishes.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - a) Exemplar de Astyanax jacuhiensis; b) Foto satélite do
Lago Guaíba mostrando os diferentes pontos de coletas (*); c) Gasômetro;
d) Arroio do Ribeiro; e) Barra do Ribeiro .................................................................. 17
Figura 2 - a) Exemplar de Astyanax altiparanae; b) Rio Monjolinho; c) rio
Água dos Patos; d) lago Igapó ................................................................................. 18
CAPÍTULO I
Figura 1 - a) Cariótipo de Astyanax jacuhiensis; b) Cromossomos com AgNORs;
c) Metáfases com FISH evidenciando sítios de DNAr 18S (setas);
d) Metáfases evidenciando cromossomos com CMA3/DAPI (setas) ........................ 32
Figura 2 – a) Cariótipo de banca C de Astyanax jacuhiensis; b) par cromossômico
8 com AgNORs, C) par cromossômico 8 com banda C; d) metáfase com
BC + CMA3 com as setas indicando o par cromossômico 8 com heteromorfismo
de tamanho ............................................................................................................... 33
CAPÍTULO II
Figura 1 - Cariótipos de Astyanax altiparanae das populações: a) do rio
Monjolinho; b) do rio Água dos Patos; c) do lago Igapó ........................................... 51
Figura 2 - AgNORs, FISH com sonda de DNAr 18 S e CMA3/DAPI em
Astyanax altiparanae, respectivamente: a, d, g) rio Monjolinho; b, e,
h) rio Água dos Patos; c, f, i) lago Igapó................................................................... 52
Figura 3 - Metáfases de Astyanax altiparanae evidenciando os sítios de
DNAr 5S nas populações: a) do rio Monjolinho; b) do rio Água dos Patos;
c) do lago Igapó ........................................................................................................ 53
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................... 12
1.1
Considerações Gerais e Citogenéticas sobre o Gênero Astyanax
com Ênfase à Localização dos Genes Ribossômicos 18S e 5S .................. 12
2
OBJETIVOS .................................................................................................. 15
Objetivo Geral ................................................................................................ 15
2.2
Objetivos Específicos .....................................................................................15
3
MATERIAL .................................................................................................... 16
3.1
Espécies Estudadas e Locais de Coleta ....................................................... 16
4
REFERÊNCIAS ............................................................................................. 19
CAPÍTULO I
CARACTERIZAÇÃO
CITOGENÉTICA DE
Astyanax jacuhiensis (CHARACIDAE)
DO LAGO
GUAÍBA/RS ................................................................................................................ 23
Resumo .................................................................................................................... 24
Introdução ................................................................................................................. 25
Material e Métodos ................................................................................................... 26
Resultados e Discussão ........................................................................................... 28
Referências .............................................................................................................. 34
CAPÍTULO II
CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE TRÊS DIFERENTES POPULAÇÕES DE
Astyanax altiparanae, COM ÊNFASE À LOCALIZAÇÃO DO DNAR 18S E 5S ................. 39
Resumo .................................................................................................................... 40
Introdução ................................................................................................................. 41
Material e Métodos ................................................................................................... 42
Resultados ................................................................................................................ 43
Discussão ................................................................................................................. 46
Referências .............................................................................................................. 54
1
INTRODUÇÃO
1.1
Considerações Gerais e Citogenéticas sobre o Gênero Astyanax com
Ênfase à Localização dos Genes Ribossômicos 18S e 5S
Incertae Sedis é um termo usado para definir um grupo taxonômico em que
as suas relações filogenéticas são indefinidas ou desconhecidas. Vários gêneros da
família Characidae constituem um grupo heterogêneo de peixes de pequeno a
grande porte e têm sido incluídos na subfamília Tetragonopterinae. Entretanto,
devido a falta de evidências que esta subfamília constituia um grupo monofilético,
Lima et al. (2003) listaram 88 gêneros como “Incertae Sedis” que incluem 620
espécies. Dentre estas, 399 (64%) são taxonomicamente pouco definidas e
constituem,
provavelmente,
grupos
não
monofiléticos
de
Characidae:
Hyphessobrycon (97 espécies), Astyanax (86 espécies), Moenkhausia (58 espécies),
Bryconamericus (51 espécies) e Hemigrammus (43 espécies). Além disso, mais de
47 gêneros (53%) incluídos como Incertae Sedis são monotípicos e 25 gêneros
(26%) contêm somente duas ou três espécies (Lima et al., 2003).
O gênero Astyanax é considerado relativamente comum, sendo o mais
diversificado da família Characidae, segundo Lima et al. (2003), revelando também
várias formas semelhantes, formando um complexo, do ponto de vista taxonômico
(Garutti e Britski, 2000), possui ampla distribuição geográfica e seus representantes
são facilmente encontrados em rios neotropicais (Britski, 1972).
Os representantes deste gênero são popularmente conhecidos como
lambaris, tambiús, tetras ou piabas, sendo caracterizados por apresentarem linha
lateral completa, dentes pré-maxilares dispostos em duas séries, nadadeira caudal
13
nua, com escamas apenas na base (Britski, 1972), e habitam diversos ambientes,
inclusive as águas de cabeceiras de rios e riachos.
O gênero Astyanax é o que possui maior número de dados citogenéticos
dentro da subfamília Tetragonopterinae, onde são relatados alguns aspectos
citogenéticos de diferentes espécies, demonstrando uma extensa variabilidade
cromossômica. Os Astyanax caracterizam-se por apresentar número diplóide
variando de 2n=36 cromossomos em Astyanax schubarti (Morelli et al., 1983; DanielSilva e Almeida-Toledo, 2001) à 2n=50 cromossomos em Astyanax altiparanae, A.
scabripinnis, A. eigenmanniorum, A. mexicanus, entre outros (Oliveira et al. 1988;
Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Fauaz e Moreira-Filho, 1991; Fauaz et al., 1994;
Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2003).
As regiões organizadoras de nucléolos (NORs) têm sido usualmente
evidenciadas através da impregnação pelo nitrato de prata para identificar as regiões
de atividade gênica, onde foi caracterizado um sistema de NORs múltiplas em
diferentes espécies: Astyanax altiparanae (Pacheco et al, 2001; Daniel-Silva e
Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2004; 2006a), em Astyanax
scabripinnis (Mantovani et al. 2000; Ferro et al. 2001; Mantovani e Moreira-Filho,
2005; Fernandes e Martins, 2005), em Astyanax fasciatus (Daniel-Silva e AlmeidaToledo, 2001; Pazza et al., 2006). Entretanto, a técnica de hibridação in situ com
fluorescência (FISH), com sonda de DNAr 18S, têm sido utilizada principalmente em
Astyanax scabripinnis (Souza et al., 2001; Mantovani e Moreira-Filho, 2005;
Fernandes e Martins-Santos, 2006b) assim como em Astyanax altiparanae (AlmeidaToledo et al, 2002 e Fernandes e Martins-Santos, 2006a), confirmando um padrão
de NORs múltiplas neste grupo de peixes, na definição do real número de sítios de
rDNA independente da sua atividade.
14
O gene RNAr 5S possui uma seqüência em torno de 120pb, menor que o
gene RNAr 45S (18S, 5,8S e 28S), podendo ser localizado através da técnica de
hibridação in situ. Resultados de alguns estudos no gênero Astyanax, têm revelado
que os genes de DNAr 5S apresentam uma alta estabilidade no posicionamento e
no número dos sítios (Almeida-Toledo et al., 2002; Mantovani e Moreira-Filho, 2005;
Fernandes e Martins-Santos, 2006a; 2006b). A localização intersticial pode ser
responsável pela conservação destes sítios nos cromossomos (Mantovani e
Moreira-Filho, 2005).
A utilização de fluorocromo cromomicina A3 (CMA3) evidencia regiões ricas
em bases GC, sendo portanto empregado em diversas espécies de peixes, onde
evidenciaram sítios coincidentes com a AgNORs, como por exemplo: Astyanax
bimaculatus
em Paganelli (1990); A. altiparanae, A. schubarti, A. fasciatus; A.
scabripinnis
em
Daniel-Silva
(1996);
Bryconamericus,
Moenkhausia
sanctafilomenae, Moenkhausia intermedia e Hemigrammus marginatus em Castro
(1999); Markiana nigripinnis em Myiazawa (1997); Bryconops affinis e Moenkhausia
costae em Pfister (1997), A. altiparanae em Pacheco (2001) e Fernandes e MartinsSantos (2004).
Ainda são escassas as informações citogenéticas a respeito deste grupo de
peixes, em comparação ao grande número de espécies existentes, uma vez que
num total de 86 espécies, somente 9 apresentam alguns dados cromossômicos, e
devido aos poucos trabalhos apresentados em relação as sequências de DNAr
através da técnica de FISH, torna-se importante ampliar estes dados, podendo
assim contribuir com os resultados já obtidos, para um melhor entendimento da
caracterização cromossômica do Gênero Astyanax.
2
OBJETIVOS
2.1
Objetivo Geral
O presente trabalho teve como objetivo geral, analisar citogeneticamente
exemplares do gênero Astyanax de diferentes bacias hidrográficas, contribuindo na
caracterização deste grupo de peixes.
2.2
Objetivos Específicos
•
Estudar a macroestrutura cariotípica de Astyanax altiparanae e Astyanax
jacuhiensis de diferentes localidades.
•
Localizar as Regiões Organizadoras de Nucléolos;
•
Analisar o padrão de distribuição da heterocromatina de A. jacuhiensis;
•
Determinar as regiões cromossômicas ricas em pares de bases GC e AT;
•
Comparar os dados obtidos com os da literatura neste do grupo peixes.
3
MATERIAL
3.1
Espécies Estudadas e Locais de Coleta
Vinte e quatro exemplares de Astyanax jacuhiensis (figura 1a) cuja localidade
tipo é Jacuhy, Rio Grande do Sul, foram coletados em três diferentes pontos do lago
Guaíba (figura 1b), no Rio Grande do Sul: Gasômetro (três machos e duas fêmeas),
Arroio do Ribeiro (três machos e uma fêmea) e na Barra do Ribeiro (nove machos e
seis fêmeas), no período de janeiro à setembro de 2006 (figura 1c, d, e
respectivamente).
Astyanax altiparanae (figura 2a), foram coletados no rio Monjolinho/São
Carlos/SP, bacia do rio Monjolinho (dois machos e seis fêmeas), no rio Água dos
Patos/Iepê/SP, bacia do rio Paranapanema (três machos e nove fêmeas) e do lago
Igapó/Londrina/PR bacia do rio Tibagi (nove machos e sete fêmeas), totalizando 36
exemplares (figura 2b, c, d respectivamente).
17
Figura 1: a) Exemplar de Astyanax jacuhiensis; b) Foto satélite do lago Guaíba
mostrando os diferentes pontos de coletas (*); c) Foto do ponto de coleta no
Gasômetro; d) Foto do ponto de coleta no Arroio do Ribeiro; e) Foto do ponto de
coleta na Barra do Ribeiro.
18
Figura 2: a) Exemplar de Astyanax altiparanae; b) Foto do ponto de coleta no rio
Monjolinho; c) Foto do ponto de coleta no rio Água dos Patos; d) Foto do ponto de
coleta no lago Igapó.
4
REFERÊNCIAS
Almeida-Toledo LF, Ozouf-Costaz C, Foresti F, Bonillo C, Porto-Foresti F e DanielSilva MFZ (2002). Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and colocalization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pises,
Characidae).Cytogenetic. Genome Res. 97 (3-4):229-233.
Britski HA (1972). Peixes de água doce do Estado de São Paulo: Sistemática. In:
Poluição e Psicultura. São Paulo: Faculdade de Saúde Pública da USP-Instituto
de Pesca da CPRN da Secretaria de Agricultura. 78-108.
Castro ALB (1999). Citogenética de peixes da subfamília Tetragonopterinae (Pisces,
Characidae): Aspectos Citotaxonômicos e Evolutivos. Tese de Doutorado.
Ecologia de Ambientes Aquáticos Continentais. Univesidade Estadual de
Maringá. 76p.
Daniel-Silva MFZ (1996). Estudos citogenéticos comparativos em quatro espécies do
gênero Astyanax (Pisces, Characidae). Dissertação de Mestrado. Departamento
de Biologia do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (SP).
176p.
Daniel-Silva MFZ e Almeida-Toledo LF (2001). Chromosome R-banding pattern and
conservation of a marker chromosome in four species, genus Astyanax
(Characidae, Tetragonopterinae). Caryologia, 54: 209-215.
Fauaz G e Moreira Filho, O. (1991). Triploidia natural em Astyanax eigenmanniorum
(Pisces, Characidae). Rev. Bras. Genet. Sup. 14 (3): 56.
Fauaz G, Vicente VE e Moreira Filho O. (1994). Natural triploidy and Bchromosomes in the neotropical filh genus Astyanax (Characidae). Rev. Bras.
Genet. 17: 157-163.
20
Fernandes CA e Martins-Santos IC (2003). Cytogenetic characterization of two
populations of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) of the Ivaí basin
PR Brazil. Cytologia, v. 68: 289-293.
Fernandes CA e Martins-Santos IC (2004). Cytogenetic studies in two populations of
Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes). Hereditas, v.141: 328-332.
Fernandes CA e Martins-Santos IC (2005). Sympatric occurrence of three cytotypes
and four morphological types of B chromosomes of Astyanax scabripinnis
(Pisces, Characiformes) in the river Ivaí basin, state of Paraná, Brazil. Genetica,
v.124: 301-306.
Fernandes CA e Martins-Santos IC (2006a). Mapping of the 18S and 5S ribosomal
RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei,
Characidae) from the upper Paraná river basin, Brazil. Genetics and Molecular
Biology, 29: 1-5.
Fernandes CA e Martins-Santos IC (2006b). Chromosomal location of 5S and 18S
rRNA
genes
in
three
sympatric
cytotypes
of
Astyanax
scabripinnis
(Characiformes, Characidae) from the Ivaí river basin, state of Paraná, Brazil.
Caryologia (Firenze), Itália, v. 59, 253-259.
Ferro DAM, Néo DM, Moreira Filho O e Bertollo LAC ( 2001). Nucleolar organizing
regions, 18S and 5S rDNA in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae):
population and functional diversity. Genetica, 110: 55-62.
Garutti V e Britski HA (2000). Descrição de uma espécie nova de Astyanax
(Teleostei: Characidae) da bacia do alto rio Paraná e considerações sobre as
demais espécies do gênero na bacia. Comn. Mus. Ciênc. Tecnol. PUCRS. Sér.
Zool. Porto Alegre. v. 13. 65-88.
21
Lima FCT, Malabarba LR, Buckup PA, Silva JFP, Vari R P, Harold A, Benine R,
Oyakawa OT, Pavanelli CS, Menezes NA, Lucena CAS, Malabarba MCSL,
Lucena ZMS, Reis RE, Langeani F, Cassati L, Bertaco VA, Moreira C e Lucinda
PHF (2003). Genera Incertae Sedis in Characidae. Pp. 106-113. In: Reis RR,
Kullander SO e Feraris Jr.(Eds.). Check list of the freshwater fishes of South
and Central America. Porto Alegre, Edipucrs.
Mantovani M, Abel LDS, Mestriner CA e Moreira-Filho O (2000). Acentuated
polymorfhism of heterochrimatin and nucleolar organizer regions in Astyanax
scabripinnis (Pisces, Characidae): tools understanding karyotypic evolution.
Genetica, 109: 161-168.
Mantovani M, Abel LDS e Moreira Filho O (2005). Conserved 5S and variable 45S
rDNA chromosomal localization revealed by FISH in Astyanax scabripinnis
(Pisces, Characidae). Genetica, 123: 211-216.
Miyazawa CS (1997). Citogenética de caracídeos da bacia do rio Paraguai: Análises
citotaxonômicas
evolutivas
e
considerações
biogeográficas.
Tese
de
Doutorado. Universidade de São Carlos (SP). 175p.
Moreira-Filho O e Bertollo LAC (1991). Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): a
species complex. Rev. Bras. Genet. 14: 331-357.
Morelli, S; Bertollo, LAC; Foresti, F; Moreira-Filho, O e Toledo-Filho, AS (1983)
Cytogenetics considerations on the genus Astyanax (Pisces, Characidae), I
Karyotypic variability. Caryologia, 36(3):235-244.
Oliveira C, Almeida-Toledo LF; Foresti F, Britski HA e Toledo-Filho SA (1988).
Chromosome formulae of Neotropical freshwarter fishes. Rev. Bras. Genet.,
11(3):577-624.
22
Pacheco RB. (2001). Estudos citogenéticos em diferentes populações de Astyanax
altiparanae
(Pisces,
Tetragonopterinae).
Dissertação
de
Mestrado.
Universidade Estadual de Londrina. 97p.
Pacheco RB, Giuliano-Caetano L e Dias AL (2001). Occurrence of cytotypes and
multiple
NORs
in
an
Astyanax
altiparanae
population
(Pisces,
Tetragonopterinae). Chromosome Science, 5: 109-114.
Paganelli HH (1990). Diversidade cromossômica no gênero Astyanax, com especial
referência a A. bimaculatus. (Linnaeus, 1758). Considerações citotaxonômicas
e evolutivas. Dissertação de Mestrado. Departamento de Ciências Biológicas.
Universidade Federal de São Carlos. 108p.
Pfister SC (1997). Contribuição aos estudos cariotípicos da família Characidae da
bacia do rio São Francisco – Três Marias (MG). Dissertação Mestrado.
Universidade Federal de são Carlos. São Carlos (SP). 109p.
Pazza R, Kavalco KF e Bertollo LAC (2006). Chromosome polymorphism in
Astyanax fasciatus (Teleostei, Characidae).1. Karyotype analysis, Ag-NORs
and mapping of the 18S and 5S ribosomal genes in sympatric karyotypes and
their possible hybrid forms. Cytogenet Genome Res.112:313-319.
Souza IL, Galiann J, Rúa PDL, Bertollo LAC e Moreira-Filho O (2001). Non-radom
distribution of the GC-rich heterochromatin and nuclear rDNA sites on Astyanax
scabripinnis chromosomes. Cytologia 66:85-91.
CAPÍTULO I
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA
DE
Astyanax jacuhiensis (CHARACIDAE)
DO
LAGO
GUAÍBA/RS. *
*Este capítulo será enviado para publicação no periódico científico BIOLOGICAL
RESEARCH
24
CARACTERIZAÇÃO
CITOGENÉTICA DE
Astyanax jacuhiensis (CHARACIDAE)
DO LAGO
GUAÍBA/RS.
RESUMO
Análises citogenéticas realizadas em 24 exemplares de Astyanax jacuhiensis,
mostraram que o número diplóide é igual a 50 cromossomos distribuídos em
8m+30sm+4st+8a, sendo o número fundamental igual a 92. As regiões
organizadoras de nucléolos (AgNORs) foram observadas em 2 a 5 cromossomos
evidenciando uma variação intra e interindividual nesta espécie, sendo constante a
ocorrência do par 8 (sm), com heteromorfismo de tamanho destas regiões entre os
homólogos. Através da hibridação in situ com fluorescência (FISH), com sonda de
DNAr 18S, cístrons ribossômicos foram localizados em apenas um par de
cromossomos sm, na região terminal mostrando também um heteromorfismo de
tamanho entre os homólogos. O tratamento com o fluorocromo CMA3 mostrou vários
cromossomos com leves marcações fluorescentes terminais e intersticiais, sendo
sempre observado um par com forte marcação terminal, evidenciando o mesmo
heteromorfismo encontrado em AgNOR e FISH. A coloração com DAPI não
evidenciou nenhuma região rica em bases AT. A técnica de banda C revelou
heterocromatina nas regiões pericentroméricas da maioria dos cromossomos, com
algumas marcações intersticiais e o par sm 8 apresentou evidente marcação
heterocromática terminal no braço curto. A associação de BC+CMA3 revelou leves
marcações fluorescentes em diferentes cromossomos e uma forte marcação
terminal no par sm 8 evidenciado, confirmando heterocromatina rica em regiões GC
nesta espécie. Os resultados obtidos no presente estudo relatam a primeira
25
descrição de Astyanax jacuhiensis contribuindo com a citogenética do gênero
Astyanax.
Palavras chave: Astyanax jacuhiensis, AgNOR, Banda C, fluorocromos, DNAr 18S.
INTRODUÇÃO
A bacia do lago Guaíba abrange o maior contingente populacional, sendo um
dos mais importantes recursos hídricos do Rio Grande do Sul. Ela é dividida em 8
sub-bacias interligadas por grandes rios como Vacacaí-Jacuí, Caí, Sinos, Gravataí e
diversos arroios, possuindo uma área de 500 km2, com cerca de 50 km de
comprimento por 12 km de largura, drenando uma área de 85.950 km2. Pela sua
extensão, o Guaíba possui profundidades variando de 5 a 6 metros e alguns trechos
no canal de navegação de 20 e 50 metros (Lopes 2006).
Nos anos de 2002 a 2004 foi realizado um monitoramento deste lago em
relação a ictiofauna incluindo seus tributários, onde foram identificadas 66 espécies
distribuídas em 21 famílias, sendo Astyanax fasciatus e Cheirodon ibicuihensis,
pertencentes a família Characidae, as que ocorreram numa freqüência maior (Lopes
2006).
Segundo Reis et al. (2003), a família Characidae apresenta 952 espécies
válidas e 400 espécies ainda não descritas, totalizando 1352 espécies. Destas, o
gênero Astyanax forma um grupo complexo e sua identificação tem sido difícil por
apresentar várias formas similares (Melo 2001).
26
Vários gêneros desta família constituem um grupo heterogêneo de peixes de
pequeno a grande porte e têm sido incluídos na subfamília Tetragonopterinae.
Entretanto, devido a falta de evidências que esta subfamília constitui um grupo
monofilético, Lima et al. (2003) listaram 88 gêneros como “Incertae Sedis” que
incluem 620 espécies sendo que, dentre estas, 399 (64%) são taxonomicamente
pouco conhecidas e constituem, provavelmente, grupos não monofiléticos de
Characidae: Hyphessobrycon (97 espécies), Astyanax (86 espécies), Moenkhausia
(58 espécies), Bryconamericus (51 espécies) e Hemigrammus (43 espécies). Além
disso, mais de 47 gêneros (53%) incluídos com Incertae Sedis são monotípicos e 25
gêneros (26%) contêm somente duas ou três espécies (Lima et al., 2003).
A
espécie
Astyanax
jacuhiensis
foi
primeiramente
descrita
como
Tetragonopterus jacuhiensis por Cope em 1894, sendo transferida ao gênero
Astyanax por Fowler (1906) e considerado sinônimo de Astyanax bimaculatus por
Eigenmann (1921). Recentemente, Lima et al. (2003), passaram a nomear tal
espécie como Astyanax jacuhiensis conhecida apenas na localidade tipo (rio Jacuí)
sendo, portanto, endêmica desta região (Lima et al., 2007).
O presente estudo mostra a primeira descrição cariotípica de Astyanax
jacuhiensis, através de coloração convencional e diferentes técnicas de bandamento
cromossômico: AgNOR, fluorocromos, FISH com sonda DNAr 18S e banda C.
MATERIAL E MÉTODOS
27
Vinte e quatro exemplares de Astyanax jacuhiensis, foram coletados em três
diferentes pontos do lago Guaíba, no Rio Grande do Sul, sendo três machos e duas
fêmeas no Gasômetro, três machos e uma fêmea no Arroio do Ribeiro e nove
machos e seis fêmeas na Barra do Ribeiro, totalizando quinze machos e nove
fêmeas entre janeiro e setembro de 2006.
As preparações cromossômicas foram obtidas segundo a técnica de
preparação direta, a partir do rim anterior, descrita por Bertollo et al. (1978). As
análises
cariotípicas
foram
realizadas
com
coloração
convencional
e
os
cromossomos foram classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm),
subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), segundo a metodologia proposta por Levan
et al. (1964). Os acrocêntricos foram considerados com um braço e os demais com
dois braços para cálculo do número fundamental (NF).
A detecção da região organizadora de nucléolos foi realizada através da
impregnação por nitrato de prata, proposta por Howell e Black (1980).
O padrão de distribuição da heterocromatina foi evidenciado segundo a
técnica proposta por Sumner (1972). O tratamento com os fluorocromos
cromomicina A3 (GC específico) e DAPI (AT específico), foi realizado de acordo com
Schweizer (1980).
A localização dos sítios de DNAr 18S foi obitda pela hibridação in situ com
fluorescência (FISH), utilizando-se sondas de DNAr 18S obtido do peixe
Oreochromis niloticus e clonado no vetor pGEM-T, sendo que a bactéria
28
recombinante utilizada foi a E. coli JM 109 (Promega), os fragmentos foram isolados
através da técnica de “mini-prep”, e marcados com Biotina-14-dUTP por “nick
translation” conforme especificações do Kit utilizado (Gibco cat N 18247-015). A
técnica de FISH foi realizada segundo Swarça et al. (2001).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Esta é a primeira descrição cariotípica de Astyanax jacuhiensis, da bacia do
lago Guaíba/RS, que apresentou número diplóide igual a 50 cromossomos
distribuídos em 8m+30sm+4st+8a com número fundamental (NF) igual a 92, tanto
para machos quanto para fêmeas (figura 1a). Este número diplóide de 2n = 50
cromossomos foi observado em outras espécies do gênero Astyanax, como em
Astyanax bimaculatus (Morelli et al.,1983; Paganelli, 1990; Alberdi e Fenocchio,
1997; Jorge e Moreira-Filho, 2001), Astyanax altiparanae (Pacheco et al., 2001;
Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2004; 2006a),
Astyanax scabripinnis (Mantovani et al., 2000; Ferro et al., 2001; Mantovani e
Moreira-Filho, 2005; Fernandes e Martins-Santos, 2005), sendo, portanto, uma
característica comum dentro do gênero. A constituição cariotípica observada em
Astyanax jacuhiensis é similar a Astyanax altiparanae (citado como A. bimaculatus)
do rio Mogi Guaçu analisada por Paganelli (1990) e do ribeirão Três Bocas por
Pacheco (2001).
Após impregnação pelo nitrato de prata foram observados em Astyanax
jacuhiensis entre 2 a 5 cromossomos portadores das regiões organizadoras de
nucléolos (AgNORs), evidenciando um sistema de AgNORs múltiplas: par
submetacêntrico 8 com marcação no braço curto, mostrando um heteromorfismo de
29
tamanho entre os cromossomos homólogos, sendo este o par AgNOR mais
freqüente, visualizado em todas as metáfases, um outro par subtelocêntrico 20, com
marcação no braço curto e um cromossomo metacêntrico do par 4 com marcação no
braço longo (figura 1b).
A hibridação in situ com fluorescência (FISH) utilizando-se a sonda de DNAr
18S mostra exatamente a localização e o número de cístrons ribossômicos de uma
espécie. Em Astyanax jacuhiensis, apesar da observação de até 5 cromossomos
AgNORs, a utilização da sonda de DNAr 18S, através da técnica de FISH,
evidenciou apenas um par de cromossomos sm com marcações fluorescentes no
braço curto, mostrando também um heteromorfismo de tamanho (Figura 1c),
coincidindo com o par 8, frequentemente identificado pelo nitrato de prata
caracterizando, portanto, um sistema de NORs simples, com apenas 1 par de
cromossomos
carregando
os
genes
ribossômicos.
As
demais
marcações
observadas após a impregnação pelo nitrato de prata provavelmente são regiões
apenas heterocromáticas, com proteínas ácidas que têm afinidade pelo nitrato de
prata.
O heteromorfismo de AgNOR confirmado pela técnica de FISH, é devido a
variação no número de cópias de cístrons ribossômicos entre os homólogos, que
pode ter ocorrido por meio de mecanismos de crossing-over desigual, transposição
ou rearranjos, como deleções e duplicações (Galetti-Jr et al., 1995).
Apesar de ser comum o sistema de NORs mútiplas no gênero Astyanax
(Pacheco et al., 2001; Souza et al., 2001; Jorge e Moreira-Filho, 2001; Almeida-
30
Toledo et al., 2002; Mantovani e Moreira-Filho, 2005; Fernandes e Martins-Santos,
2006a,b) também já foi evidenciado sistema de NORs simples em Astyanax
bimaculatus dos rios São Francisco, Doce e Paraguai (Paganelli,1990) e Astyanax
altiparanae do rio Paraná (Fernandes e Martins-Santos, 2004) e rio Monjolinho
(Peres et al., 2008).
A utilização do fluorocromo CMA3 nas preparações cromossômicas de
Astyanax jacuhiensis (figura 1d) mostrou até 4 cromossomos com marcações
terminais
provavelmente
correspondentes
ao
par
AgNOR
e
às
regiões
heterocromáticas com afinidade pela prata, sendo estes portanto, ricos em bases
GC. A sobreposição CMA3/DAPI não mostrou nenhuma banda DAPI positiva (figura
1d), não sendo observada nenhuma região rica em bases AT em Astyanax
jacuhiensis.
A técnica de banda C revelou blocos de heterocromatina nas regiões
pericentroméricas na maioria dos cromossomos, sendo observadas algumas
marcações intersticiais nos pares 6, 9, 11 e 13 e o par cromossômico 8 (sm), com
marcação heterocromática mais evidente na porção terminal do braço curto (figuras
2a, c). Este par cromossômico é o mesmo anteriormente evidenciado pelo nitrato de
prata (figura 2b), FISH e CMA3, portanto pode-se dizer que os cístrons ribossômicos
em Astyanax jacuhiensis estão intercalados com heterocromatina rica em bases GC.
A heterocromatina é um importante marcador citogenético na caracterização e
diferenciação de espécies e/ou populações. O padrão de distribuição de
heterocromatina evidenciado em Astyanax jacuhiensis se assemelha a algumas
31
populações de A. altiparanae (Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e
Martins-Santos, 2004) e de Astyanax bimaculatus dos rios São Francisco e Paraguai
analisadas por Paganelli (1990), onde também foram observados blocos de
heterocromatina em regiões intersticiais.
Resultado obtido com BC+CMA3 confirmou que a heterocromatina se
encontra associada a NOR, que esteve sempre ativa nas intérfases anteriores, pois
foi observado um par de cromossomos submetacêntricos com marcações terminais
bem evidente, mostrando o mesmo heteromorfismo evidenciado pelo CMA3, além de
outras marcações fluorescentes em regiões pericentroméricas e intersticiais (figura
2d) mostrando, portanto, que uma classe de heterocromatina neste estudo é
composta de bases GC.
Os resultados obtidos no presente estudo representam uma importante
contribuição à citogenética do gênero Astyanax, uma vez que relata a primeira
descrição
de
Astyanax
jacuhiensis,
mostrando
que
esta
espécie
possui
características cromossômicas comuns a algumas populações de A. altiparanae e A.
bimaculatus, evidenciando uma maior similaridade com esta última espécie,
tornando-se este fato interessante pois Astyanax jacuhiensis já foi definido
anteriormente como sinônimo de A. bimaculatus.
32
Figura 1 - a) Cariótipo de Astyanax jacuhiensis; b) Cromossomos com AgNORs; c)
Metáfases com FISH evidenciando sítios de DNAr 18S (setas); d) Metáfases
evidenciando cromossomos com CMA3/DAPI (setas).
33
Figura 2 - a) Cariótipo de banda C de Astyanax jacuhiensis; b) par cromossômico 8
com AgNORs; c) par cromossômico 8 com banda C; d) metáfase com BC + CMA3
com as setas indicando o par cromossômico 8 com heteromorfismo de tamanho.
34
REFERÊNCIAS
ALBERDI AJ e FENOCCHIO AS (1997). Karyotypes of five Tetragonopterinae
species (Pisces, Characidae) from Argentina. Cytologia 62(2):171-176.
ALMEIDA-TOLEDO LF, OZOUF-COSTAZ C, FORESTI F, BONILLO C, PORTOFORESTI F e DANIEL-SILVA MFZ (2002). Conservation of the 5S-bearing
chromosome pair and co-localization with major rDNA clusters in five species of
Astyanax (Pisces, Characidae).Cytogenetic Genome Res. 97(3-4):229-233.
BERTOLLO LAC, TAKAHASHI CS e MOREIRA-FILHO O (1978) Cytotaxonomic
considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazilian Journal of
Genetics 1(2):103-120.
DANIEL-SILVA MFZ e ALMEIDA-TOLEDO LF (2001). Chromosome R-banding
pattern and conservation of a marker chromosome in four species, genus
Astyanax (Characidae, Tetragonopterinae). Caryologia 54:209-215.
EIGENMANN CH (1921). The American Characidae; III. Memoirs of. Museum of.
Conwarative Zoology of Harvard College, Cambridge, Mass. 43:209-310.
FOWLER HW (1906). Further Knowledge of some heterognathous part 2.
Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia. Philadelphia
58;431-83.
FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2004). Cytogenetic studies in two
populations
of
Astyanax
altiparanae
(Pisces,
Characiformes).
Hereditas.141:328-332.
FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2005). Sympatric occurrence of three
cytotypes and four morphological types of B chromosomes of Astyanax
scabripinnis (Pisces, Characiformes) in the river Ivaí basin, state of Paraná,
Brazil. Genetica 124: 301-306.
35
FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2006a). Mapping of the 18S and 5S
ribosomal RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei,
Characidae) from the upper Paraná river basin, Brazil. Genetics and Molecular
Biology 29: 1-5.
FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2006b). Chromosomal location of 5S
and 18S rRNA genes in three sympatric cytotypes of Astyanax scabripinnis
(Characiformes, Characidae) from the Ivaí river basin, state of Paraná, Brazil.
Caryologia (Firenze), Itália 59: 253-259.
FERRO DAM, NÉO DM, MOREIRA FILHO O e BERTOLLO LAC (2001). Nucleolar
organizing regions, 18S and 5S rDNA in Astyanax scabripinnis (Pisces,
Characidae): population and functional diversity. Genetica 110: 55-62.
GALETTI-JR. PM; MESTRINER, CA, MONACO, PJ e RASH, EM (1995), Postzygotic modifications and intra and interindividual nucleolar organizing region
variations in fish: report of a case involving Leporinus friderici. Chromosome
Research 3: 285-290.
HOWELL WM e BLACK DA (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer
regions with the protective coloidal developer: a 1-step method. Experientia
36:1014-1015.
JORGE LC e MOREIRA-FILHO O (2001). Estudios citogenéticos en Astyanax
bimaculatus (Pisces, Characidae) del río Paraná, Argentina. Revista de
Ictiologia 9 (1/20):21-24.
LEVAN A, FREDGA K e SANDBERG AA (1964). Nomenclature for centromeric
position on chromosome. Hereditas 52:201-220.
LIMA FCT, MALABARBA LR, BUCKUP PA, SILVA JFP, VARI R P, HAROLD A,
BENINE R, OYAKAWA OT, PAVANELLI CS, MENEZES NA, LUCENA CAS,
36
MALABARBA MCSL, LUCENA ZMS, REIS RE, LANGEANI F, CASSATI L,
BERTACO VA, MOREIRA C e LUCINDA PHF (2003). Genera Incertae Sedis in
Characidae. In: REIS RR, KULLANDER SO E FERRARIS JR. (Eds.). Check list
of the freshwater fishes of South and Central America. Porto Alegre, Edipucrs.
106-113.
LIMA FCT; BUCKUP PA, MENEZES NA; LUCENA CAS; LUCENA ZMS; TOLEDOPIZA M e ZANATA A (2007). Família Characidae: Gêneros Sedis in
Characidae. In: BUCKUP PA; MENEZES NA; GHAZZI MS (Eds.). Catálogo das
espécies de peixes de água doce do Brasil. Rio de Janeiro. Museu Nacional.
44-62.
LOPES FF (2006). Monitoramento ambiental da bacia hidrográfica do lago GuaíbaRS – Brasil, através da utilização de diferentes metodologias aplicadas a
taxocenoses de peixes. Tese, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rio
Grande do Sul. 228p.
MANTOVANI M, ABEL LDS, MESTRINER CA e MOREIRA-FILHO O (2000).
Acentuated polymorfhism of heterochrimatin and nucleolar organizer regions in
Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): tools understanding karyotypic
evolution. Genetica 109:161-168.
MANTOVANI M, ABEL LDS e MOREIRA FILHO O (2005). Conserved 5S and
variable 45S rDNA chromosomal localization revealed by FISH in Astyanax
scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 123:211-216.
MELO F (2001). Revisão taxonômica das espécies do gênero Astyanax Baird e
Girard,1854 (Teleostei, Characiformes, Characidae) da região da Serra dos
Órgãos. Arq. Mus. Nac. Rio de Janeiro. 59:1-46.
37
MORELLI, S; BERTOLLO, LAC; FORESTI, F; MOREIRA-FILHO, O e TOLEDOFILHO, AS (1983) Cytogenetics considerations on the genus Astyanax (Pisces,
Characidae), I Karyotypic variability. Caryologia 36(3):235-244.
PACHECO, RB. (2001). Estudos citogenéticos em diferentes populações de
Astyanax altiparanae (Pisces, Tetragonopterinae). Dissertação de Mestrado.
Universidade Estadual de Londrina. 97p.
PACHECO RB, GIULIANO-CAETANO L e DIAS AL (2001). Occurrence of cytotypes
and
multiple
NORs
in
an
Astyanax
altiparanae
population
(Pisces,
Tetragonopterinae). Chromosome Science 5:109-114.
PAGANELLI, HH, (1990) Diversidade cromossômica no gênero Astyanax, com
especial referência a A. bimaculatus. (Linnaeus, 1758). Considerações
citotaxonômicas e evolutivas. Dissertação de Mestrado. Departamento de
Ciências Biológicas. Universidade Federal de São Carlos. 108 p.
PERES WAM, BERTOLLO LAC e MOREIRA-FILHO O (2008). Physical mapping of
the 18S and 5S ribosomal genes in nine Characidae species (Teleostei,
Characiformes). Genetics and Molecular Biology, 31,1 (suppl), 222-226.
REIS RR, KULLANDER SO E FERARIS JR. (org). (2003). Check list of the
freshwater fishes of south and central América. Porto Alegre: Edipucrs.
SOUZA IL, GALIANN J, RÚA PDL, BERTOLLO LAC e MOREIRA-FILHO O (2001).
Non-radom distribution of the GC-rich heterochromatin and nuclear rDNA sites
on Astyanax scabripinnis chromosomes. Cytologia 66:85-91.
SUMNER
AT
(1972).
A
simple
technique
heterochromatin. Expl. Cell Res. 75:304-306.
for
demonstrating
centromeric
38
SCHWEIZER D (1980). Simultaneous fluorescent staining of R-bands and specific
heterochromatic regions (DA-DAPI bands) in human chromosomes. Citogenet.
Cell. Genet. 27:190-193.
SWARÇA AC, GIULIANO-CAETANO L e DIAS AL (2001). Analyses of nucleolus
organizer regions and heterocromatin of Pimelodus maculatus (Pisces:
Pimelodidae). Genetica 110:97-100.
CAPÍTULO II
CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE TRÊS DIFERENTES POPULAÇÕES
DE
Astyanax
altiparanae, COM ÊNFASE À LOCALIZAÇÃO DO DNAR 18S E 5S. *
* Este capítulo será enviado para publicação no periódico científico BIOLOGICAL
RESEARCH
40
CITOGENÉTICA
COMPARATIVA ENTRE TRÊS DIFERENTES POPULAÇÕES DE
Astyanax
altiparanae, COM ÊNFASE À LOCALIZAÇÃO DO DNAR 18S E 5S
Palavras-chave: AgNOR, cariótipo, CMA3, DAPI, DNAr 18S, DNAr 5S, Astyanax
altiparanae
RESUMO
Foram analisadas três populações de Astyanax altiparanae pertencentes aos rios
Monjolinho/SP e Água dos Patos/SP e lago Igapó/PR, com todos indivíduos
apresentando número diplóide igual 50 cromossomos entretanto, com diferentes
fórmulas cariotípicas. A população do rio Monjolinho apresentou 10m, 28sm, 4st e
8a (NF=92), a do rio Água dos Patos 8m, 24sm, 6st e 12a (NF=88) e a população do
lago Igapó 8m, 28sm, 4st e 10a (NF=90). As AgNORs foram observadas em regiões
terminais do braço curto ou longo de diferentes cromossomos, em todas as
populações sendo evidenciada uma variação de 1 até 5 cromossomos,
caracterizando um sistema de AgNORs múltiplas nesta espécie. Através da
hibridação fluorescente in situ (FISH) utilizando sonda DNAr 18S, foi visualizado
apenas um par de cromossomos com sinais fluorescentes na região terminal do
braço curto nas populações do rio Monjolinho e lago Igapó, enquanto que, a
população do rio Água dos Patos apresentou 4 marcações fluorescentes terminais.
Através da hibridação fluorescente in situ (FISH) utilizando sonda DNAr 5S, foi
visualizado um par de cromossomos com sinais fluorescentes em posição intersticial
nas 3 populações aqui estudadas. O tratamento com cromomicina A3 (CMA3)
41
mostrou-se coincidente com alguns sítios da AgNORs, evidenciadas pelo nitrato de
prata e não foi observada nenhuma região rica em pares de bases AT.
INTRODUÇÃO
O gênero Astyanax possui ampla distribuição geográfica na América do Sul e
representa um grande grupo de peixes de água doce, sendo o gênero mais comum
e diversificado da família Characidae, segundo Lima et al. (2003), revelando
estreitamente várias formas semelhantes, formando um complexo, do ponto de vista
taxonômico (Garutti e Britski, 2000).
Em Astyanax altiparanae da bacia do alto Paraná (Garutti e Britski, 2000),
previamente
identificados
como
Astyanax
bimaculatus,
todos
os
estudos
citogenéticos até o momento, apresentam número diplóide igual a 50 cromossomos,
com diferenças na fórmula cariotípica entre as populações analisadas, sendo uma
característica da espécie as regiões organizadoras de nucléolos apresentarem-se
variáveis em relação ao número e posição das AgNORs (Daniel-Silva e AlmeidaToledo, 2001; Pacheco et al., 2001; Fernandes e Martins, 2004; entre outros). A
técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH), com sonda de DNAr 18S, foi
utilizada em Astyanax altiparanae por Almeida-Toledo et al. (2002) e Fernandes e
Martins-Santos (2006a) confirmando a presença e a variabilidade de múltiplos sítios
com cístrons ribossômicos nesta espécie.
Entretanto, os estudos com sonda de DNAr 5S, apesar de escassos,
revelaram uma conservação em relação à localização e número de marcações
fluorescentes em diferentes populações de Astyanax altiparanae analisadas por
42
Almeida-Toledo et al. (2002) e Fernandes e Martins-Santos (2006a), mostrando um
par cromossômico com marcação intersticial.
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar e comparar os cariótipos
de três populações de Astyanax altiparanae, com ênfase na localização dos genes
ribossômicos 18S e 5S.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram
analisadas
citogeneticamente
três
populações
de
Astyanax
altiparanae, sendo oito exemplares (dois machos e seis fêmeas) do rio Monjolinho,
São Carlos/SP, doze exemplares (três machos e nove fêmeas) do rio Água dos
Patos/Iepê/SP e dezesseis exemplares (nove machos e sete fêmeas) do lago Igapó,
Londrina/PR.
As preparações cromossômicas foram obtidas segundo a técnica de
preparação direta, a partir do rim anterior, descrita por Bertollo et al. (1978). As
análises
cariotípicas
foram
realizadas
com
coloração
convencional
e
os
cromossomos foram classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm),
subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), segundo a metodologia proposta por Levan
et al. (1964) com modificações. Os acrocêntricos foram considerados com um braço
e os demais com dois braços para cálculo do número fundamental (NF).
A detecção da região organizadora de nucléolos foi realizada através da
impregnação por nitrato de prata, proposta por Howell e Black (1980). O tratamento
43
com os fluorocromos cromomicina A3 (GC específico) e DAPI (AT específico), foi
realizado de acordo com Schweizer (1980). A localização dos sítios de DNAr 18S foi
obtida pela hibridação in situ com fluorescência (FISH), segundo Swarça et al.
(2001), utilizando-se sonda de DNAr 18S contendo cerca de 1700pb obtida do peixe
Oreochromis niloticus, e o segmento de DNAr 5S contendo 200pb obtido do peixe
Leporinus elongatus. Os fragmentos foram isolados através da técnica de “miniprep”,
e
marcados
com
Biotina-14-dUTP
por
“nick
translation”
conforme
especificações do Kit utilizado (Gibco cat N 18247-015).
RESULTADOS
Todas as populações de Astyanax altiparanae apresentaram número diplóide
igual a 50 cromossomos porém, diferentes fórmulas cariotípicas foram evidenciadas.
A população do rio Monjolinho apresentou 10m, 28sm, 4st e 8a (NF=92) (figura 1a),
a do rio Água dos Patos 8m, 24sm, 6st e 12a (NF=88) (figura 1b) e a população do
lago Igapó 8m, 28sm, 4st e 10a (NF=90) (figura 1c).
Através da impregnação pelo nitrato de prata foram detectados vários sítios
AgNORs em todas as populações, com uma variação tanto inter quanto
intraindividual. A população do rio Monjolinho apresentou de 2 a 5 cromossomos
nucleolares: um cromossomo submetacêntrico de tamanho pequeno com marcação
no braço curto, um par submetacêntrico pequeno, também com marcação no braço
curto, com heteromorfismo de tamanho e um par submetacêntrico mediano com
marcação no braço longo, sendo um dos cromossomos com marcação em ambas
regiões terminais (figura 2a).
44
Através da hibridação fluorescente in situ (FISH), utilizando sonda de DNAr
18S, foi visualizado na população do rio Monjolinho apenas um par de cromossomos
submetacêntricos
de
tamanho
pequeno,
com
marcação
no
braço
curto,
apresentando heteromorfismo de tamanho dos sítios ribossômicos entre os
homólogos (figura 2d).
A população do rio Água dos Patos apresentou de 2 a 4 AgNORs no braço
curto, em dois pares subtelocêntricos de tamanho médio, com heteromorfismo de
tamanho desta região em um destes pares, sendo este par visualizado em todas as
metáfases (figura 2b).
Através da hibridação fluorescente in situ (FISH), utilizando sonda de DNAr
18S, a população do rio Água dos Patos apresentou 4 marcações fluorescentes,
sendo dois pares de cromossomos subtelocêntricos medianos, com marcação no
braço curto (figura 2e).
Na população do lago Igapó foram detectadas de 1 a 3 AgNORs: um
cromossomo submetacêntrico de tamanho médio, com marcação no braço longo e
um par subtelocêntrico também mediano com marcação no braço curto,
apresentando um pequeno heteromorfismo de tamanho, sendo este par observado
em quase todas as metáfases (figura 2c).
Através da hibridação fluorescente in situ (FISH), utilizando sonda de DNAr
18S, na população do lago Igapó também foi visualizado apenas um par de
45
cromossomos
subtelocêntricos,
de
tamanho
médio,
apresentando
sinais
fluorescentes no braço curto (figura 2f).
O tratamento com cromomicina A3 (CMA3) mostrou várias marcações
fluorescentes terminais em diferentes cromossomos, nas 3 populações de Astyanax
altiparanae. A do rio Monjolinho mostrou de 1 a 5 cromossomos CMA3 positivos: um
cromossomo acrocêntrico e um par submetacêntrico, todos pequenos, e um outro
par cromossômico submetacêntrico mediano com marcação no braço longo, sendo
um dos cromossomos com marcação em ambas regiões terminais (figura 2g); o par
submetacêntrico pequeno apresentou um heteromorfismo de tamanho no braço
curto entre os homólogos e foi quase sempre evidenciado (figura 2g).
Na população do rio Água dos Patos foram evidenciados de 2 a 4
cromossomos com marcações CMA3 terminais onde foram evidenciadas: um par
subtelocêntrico de tamanho mediano e com heteromorfismo de tamanho dos sinais
no braço curto, sendo o mais frequentemente visualizado nas metáfases, um
cromossomo acrocêntrico de tamanho pequeno com marcação no braço curto, e um
cromossomo subtelocêntrico mediano com marcação no braço longo (figura 2h).
Na população do lago do Igapó foram evidenciadas marcações CMA3 do
braço curto de apenas um par de cromossomos subtelocêntricos de tamanho médio,
e com heteromorfismo de tamanho (figura 2i).
O tratamento com DAPI nas preparações cromossômicas das 3 populações
mostrou-se homogêneo, não sendo observada nenhuma região rica em pares de
46
bases AT, como pode ser observado pela sobreposição destes fluorocromos nas
figuras 2g, h, i.
Através da hibridação fluorescente in situ (FISH), utilizando sonda de DNAr
5S, foi visualizado um par de cromossomos com sinais fluorescentes em posição
intersticial em todas as populações de A. altiparanae analisadas (figura 3a, b, c).
DISCUSSÃO
Os estudos citogenéticos em Astyanax altiparanae do rio Monjolinho, rio Água
dos Patos e lago Igapó, revelam uma conservação do número diplóide igual a 50,
característico da espécie, sendo observado até o momento em todas as populações
analisadas desta espécie porém, diferenças na fórmula cariotípica e no número
fundamental encontradas entre algumas destas populações, provavelmente devido a
eventos
como
as
inversões
pericêntricas,
revelam
uma
variabilidade
na
macroestrutura cariotípica neste grupo de peixes (tabela 1).
Peres et al. (2008) também estudaram indivíduos de A. altiparanae do rio
Monjolinho, encontrando uma fórmula cariotípica diferente da observada no presente
estudo, com 8m+20sm+12st+10a.
As três populações analisadas mostraram um sistema de AgNORs múltiplas,
freqüentemente evidenciado em Astyanax altiparanae (tabela 1), ocorrendo
variações quanto ao número, localização e tipos de cromossomos portadores das
NORs. Foi observado nas três populações aqui analisadas um heteromorfismo de
tamanho destas regiões entre os homólogos, em um par de cromossomos
subtelocêntricos nas populações do rio Água dos Patos e lago Igapó e em um par
47
submetacêntrico na população do rio Monjolinho. Interessante notar, que este par
AgNOR foi o mais frequentemente encontrado nas preparações cromossômicas das
três populações, que pode ser considerado um par principal, com a NOR sempre
ativa, junto com sítios secundários, como observado por Pazza et al. (2006) em
Astyanax fasciatus.
A hibridação in situ com fluorescência (FISH) utilizando a sonda de DNAr 18S
nas populações de A. altiparanae do rio Monjolinho e lago Igapó evidenciou apenas
um par de cromossomos com marcações fluorescentes no braço curto, coincidindo
com o par frequentemente identificado pelo nitrato de prata, caracterizando,
portanto, um sistema de NORs simples. As demais marcações observadas após a
impregnação pelo nitrato de prata provavelmente são regiões heterocromáticas, com
proteínas ácidas que tem afinidade pela prata.
Peres et al. (2008) também observaram apenas um par com cístrons
ribossômicos nos indivíduos de A. altiparanae do rio Monjolinho correspondendo ao
único par AgNOR observado. Mais uma diferença encontrada entre as duas
análises, pois no presente estudo foram encontradas 5 marcações após a
impregnação pelo nitrato de prata.
Na população de Água dos Patos, foram encontrados dois pares
cromossômicos com marcações fluorescentes nos braços curtos, após a hibridação,
coincidindo com os sítios detectados pela prata, confirmando um sistema de
AgNORs múltiplas, assim como na maioria das populações analisadas de Astyanax
altiparanae, onde até 7 cromossomos foram evidenciados com sonda de DNAr 18S
ou 28S (tabela 1).
O sistema de NORs múltiplas, confirmado através da utilização da técnica de
FISH com sonda de DNAr 18S, foi também encontrado em outras espécies do
48
gênero Astyanax, como por exemplo em Astyanax scabripinnis (Souza et al., 2001;
Mantovani et al., 2005; Fernandes e Martins-Santos, 2006b) e em Astyanax
fasciatus (Pazza et al., 2006), sendo portanto uma característica deste grupo de
peixes.
O heteromorfismo de AgNOR, nas três populações aqui estudadas, foi
confirmado pela hibridação apenas na população do rio Monjolinho, provavelmente
devido a variação no número de cópias de cístrons ribossômicos entre os
homólogos, que pode ter ocorrido por meio de mecanismos de crossing-over
desigual, transposição ou rearranjos, como deleções e duplicações (Galetti-Jr et al.,
1995). Este tem sido um evento comum nesta espécie, como evidenciado por
Fernandes e Martins-Santos (2006a) em populações de A. altiparanae do córrego
Tatupeba. O heteromorfismo AgNOR encontrado nas outras duas populações do
presente trabalho, deve estar relacionado a expressão do gene ou devido a uma
maior quantidade de heterocromatina entre os genes, uma vez que foi detectado
pelo CMA3 e pela impregnação de nitrato de prata.
O tratamento com fluorocromo CMA3 nas preparações cromossômicas de
Astyanax altiparanae do presente estudo, mostrou correspondência com alguns
sítios marcados pela prata, inclusive um cromossomo subtelocêntrico com marcação
nos dois telômeros na população do rio Monjolinho, sendo portanto, estes sítios,
ricos em bases GC. Entretanto, AgNORs não visualizadas através do CMA3, talvez
sejam tão pequenas que não foram detectadas por este fluorocromo ou então, nem
todas são ricas em GC, como sugerido por Fernandes e Martins-Santos (2004),
analisando A. altiparanae do rio do Índio, no qual observaram um número maior de
AgNORs do que sítios CMA3.
49
O tratamento com fluorocromo DAPI não apresentou nenhuma marcação nos
cromossomos nas 3 populações, não possuindo, portanto nenhuma região rica em
bases AT, sendo este o primeiro relato com DAPI no gênero Astyanax.
As preparações cromossômicas nas 3 populações de Astyanax altiparanae
com sonda de DNAr 5S, evidenciou um par de cromossomos com sinais
fluorescentes em posição intersticial, demonstrando uma alta estabilidade deste
sítio, corroborando com os dados de outras populações de Astyanax altiparanae
(tabela 1) e de outras espécies do gênero Astyanax (Almeida-Toledo et al., 2002;
Fernandes e Martins-Santos, 2006b; Almeida-Toledo et al., 2002, Pazza et al.,
2006). A conservação deste padrão pode ser devido à localização intersticial destes
sítios nos cromossomos, estando o DNAr 5S protegido dos eventos de dispersão
que pode ocorrer com DNAr 45S, como proposto por Mantovani et al. (2005).
Os dados obtidos nas três populações de A. altiparanae mostram que, apesar
da conservação do número diplóide e da localização do DNAr 5S, foram
encontradas diferenças na distribuição do DNAr 18S e nas fórmulas cariotípicas
entre as populações, facilmente identificadas pelo número de pares acrocêntricos,
corroborando os dados existentes sobre a variabilidade cromossômica de Astyanax
altiparanae, sugerindo a existência de várias espécies que poderiam constituir um
complexo altiparanae.
50
Tabela 1: Dados citogenéticos de diferentes populações de Astyanax altiparanae.
NF: número fundamental; m: metacêntrico; sm: submetacêntrico; st: subtelocêntrico; a:
acrocêntrico; NORs: região organizadora de nucléolos; FISH: hibridação in situ; Ref:
Referências.
Localidade
AgNORs
CMA3
FISH18S/28S
FISH5S
2n
NF
Fórmula cromossômica
rio Mogi Guaçu/SP
50
88
10m+24sm+4st+12a
rio Mogi Guaçu/SP
Rio
Paranapanema/SP
rio TibagiSertanópolis/PR
rio TibagiLimoeiro/PR
rio TibagiLimoeiro/PR
50
92
6m+24sm+12st+8a
50
88
10m+22sm+6st+12a
50
90
10m+22sm+8st+10a
2a5
5
4
50
86
6m+22sm+8st+14a
2a5
5
4
50
88
10m+22sm+6st+12a
2a5
5
4
rio Couro de Boi/PR
50
88
8m+20sm+10st+12a
1a4
6
4
rib. Três Bocas/PR
50
92
10m+28sm+4st+8a
1a6
8
4
rio Claro/PR
50
90
10m+26sm+4st+10a
1a4
6
5
rio Claro/PR
50
88
10m+24sm+4st+12a
1a4
6
5
rio Claro/PR
50
86
10m+22sm+4st+14a
1a4
6
5
rio Paraná/PR
50
82
32m/sm+18st/a
3
rio dos Índios/PR
50
90
6m+30sm+4st+10a
10
7
rio Paraná/PR
50
88
6m+26sm+6st+12a
2
5
Fazenda do Canquiri
50
94
6m+30st+8st+6a
2
Córrego Keçaba/PR
Córrego
Tatupeba/PR
50
88
6m+26sm+6st+12a
3
7
2
9
50
88
6m+26sm+6st+12a
3
4
2
9
Ribeirão Maringá/PR
50
88
6m+26sm+6st+12a
1
4
2
9
Ribeirão Maringá/PR
50
88
10m+22sm+6st+12a
2a3
rio Iguaçu
50
92
10m+26sm+6st+8a
2a5
1
1a5
2
3
4
50
90
8m+20sm+12st+10a
2
6
7
4
2
7,9
8
10
10
2
rio Monjolinho/SP
Ref.
2
2
rio Monjolinho/SP
50 92
10m+28sm+4st+8a
2a5
1a5
2
2
rio Água dos Patos
/SP
50 88
8m+24sm+6st+12a
2a4
2a4
4
2
Lago
Igapó/PR
2
2
2
50 90
8m+28sm+4st+10a
1a3
Referências 1: Morelli et al., (1983); 2: Paganelli (1990); 3: Daniel-Silva e Almeida-Toledo (2001); 4:
Pacheco (2001); 5: Pacheco et al. (2001); 6: Almeida-Toledo et al. (2002); 7: Fernandes e MartinsSantos (2004); 8: Domingues (2005); 9: Fernandes e Martins-Santos (2006a); 10: Abelini (2007); 11:
Peres et al.(2008); 12: Presente Estudo.
11
12
12
12
51
Figura 1 - Cariótipos de Astyanax altiparanae das populações: a) do rio Monjolinho,
b) do rio Água dos Patos, c) do lago Igapó.
52
Figura 2 - AgNORs, FISH com sonda de DNAr 18S e CMA3/DAPI em Astyanax
altiparanae, respectivamente: a, d, g) rio Monjolinho; b, e, h) rio Água dos Patos; c, f,
i) lago Igapó.
53
Figura 3 - Metáfases de Astyanax altiparanae evidenciando os sítios de DNAr 5S
nas populações: a) do rio Monjolinho, b) do rio Água dos Patos, c) do lago Igapó.
54
REFERÊNCIAS
ABELINI E (2007), Análise citogenética em três espécies do gênero Astyanax
(Pisces, Characiformes). Dissertação de Mestrado da Universidade
Estadual de Maringá. 67p.
ALMEIDA –TOLEDO LF, OZOUF-COSTAZ C, FORESTI F, BONILLO C, PORTOFORESTI F e DANIEL-SILVA MFZ (2002), Conservation of the 5S-bearing
chromosome pair and co-localization with major rDNA clusters in five species of
Astyanax (Pisces, Characidae).Cytogenetic. Genome Res. 97 (3-4):229-233.
BERTOLLO LAC, TAKAHASHI CS. e MOREIRA-FILHO O (1978). Cytotaxonomic
considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazilian Journal of
Genetics, v. 1, n 2, p.103-120.
DANIEL-SILVA MFZ e ALMEIDA-TOLEDO LF (2001). Chromosome R-banding
pattern and conservation of a marker chromosome in four species, genus
Astyanax (Characidae, Tetragonopterinae). Caryologia, 54: 209-215.
DOMINGUES MS (2005). Citogenética comparativa de Astyanax altiparanae Garutti
e Britski, 2000 do alto rio Tibagi e alto rio Iguaçu. Dissertação de mestrado.
Curitiba: Universidade Federal do Paraná. 66p.
FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2004). Cytogenetic studies in two
populations of Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes). Hereditas, v.141:
328-332.
FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2006a). Mapping of the 18S and 5S
ribosomal RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei,
Characidae) from the upper Paraná riverbasin, Brazil. Genetics and Molecular
Biology, 29: 1-5.
55
FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2006b). Chromosomal location of 5S
and 18S rRNA genes in three sympatric cytotypes of Astyanax scabripinnis
(Characiformes, Characidae) from the Ivaí river basin, state of Paraná, Brazil.
Caryologia (Firenze), Itália, v. 59, p. 253-259.
GALETTI JR PM, MESTRINER CA, MONACO PJ e RASH EM (1995). Post-zygotic
modifications and intra and interindividual nucleolar organizing region variations
in fish: report of a case involving Leporinus friderici. Chromosome Research, 3:
285-290.
GARUTTI V e BRITSKI HA (2000). Descrição de uma espécie nova de Astyanax
(Teleostei: Characidae) da bacia do alto rio Paraná e considerações sobre as
demais espécies do gênero na bacia. Comn. Mus. Ciênc. Tecnol. PUCRS. Sér.
Zool. Porto Alegre. v. 13. p 65-88.
GROMICHO M, OZOUF-COSTAZ C e COLLARES-PEREIRA MJ (2005). Lack of
correspondence between CMA3-, Ag-positive signals and 28S rDNA loci in two
Iberian minnows (Teleostei, Cyprinidae) evidenced by sequential banding.
Cytogenetic and Genome Research, 109:507-511.
HOWELL, W.M. e BLACK, D.A. (1980), Controlled silver-staining of nucleolus
organizer regions with the protective coloidal developer: a 1-step method.
Experientia, 36:1014-1015.
LEVAN A, FREDGA K. e SANDBERG AA (1964), Nomenclature for centromeric
position on chromosome. Hereditas, 52:201-220.
LIMA FCT, MALABARBA LR, BUCKUP PA, SILVA JFP, VARI R P, HAROLD A,
BENINE R, OYAKAWA OT, PAVANELLI CS, MENEZES NA, LUCENA CAS,
MALABARBA MCSL, LUCENA ZMS, REIS RE, LANGEANI F, CASSATI L,
BERTACO VA, MOREIRA C e LUCINDA PHF (2003). Genera Incertae Sedis in
56
Characidae. Pp. 106-113. In: Reis RR, Kullander SO e Ferraris Jr.(Eds.). Check
list of the freshwater fishes of South and Central America. Porto Alegre,
Edipucrs.
MANTOVANI M, ABEL LDS e MOREIRA-FILHO O (2005). Conserved 5S and
variable 45S rDNA chromosomal localization revealed by FISH in Astyanax
scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica, 123: 211-216.
MORELLI S, BERTOLLO LAC, FORESTI F, MOREIRA-FILHO O e TOLEDOFILHO SA (1983). Cytogenetics considerations on the genus Astyanax
(Pisces, Characidae), I Karyotypic variability. Caryologia, 36(3):235-244.
PACHECO RB (2001). Estudos citogenéticos em diferentes populações de Astyanax
altiparanae
(Pisces,
Tetragonopterinae).
Dissertação
de
Mestrado.
Universidade Estadual de Londrina. 97p.
PACHECO RB, GIULIANO-CAETANO L e DIAS AL (2001). Occurrence of cytotypes
and
multiple
NORs
in
an
Astyanax
altiparanae
population
(Pisces,
Tetragonopterinae). Chromosome Science, 5: 109-114.
PAGANELLI HH (1990). Diversidade cromossômica no gênero Astyanax, com
especial referência a A. bimaculatus. (Linnaeus, 1758). Considerações
citotaxonômicas e evolutivas. Dissertação de Mestrado. Departamento de
Ciências Biológicas. Universidade Federal de São Carlos. 108p.
PAZZA R, KAVALCO KF e BERTOLLO LAC (2006). Chromosome polymorphism in
Astyanax fasciatus (Teleostei, Characidae).1. Karyotype analysis, Ag-NORs
and mapping of the 18S and 5S ribosomal genes in sympatric karyotypes and
their possible hybrid forms. Cytogenet Genome Res.112:313-319.
57
PERES WAM, BERTOLLO LAC e MOREIRA-FILHO O (2008). Physical mapping of
the 18S and 5S ribosomal genes in nine Characidae species (Teleostei,
Characiformes). Genetics and Molecular Biology, 31,1 (suppl), 222-226.
SCHWEIZER D (1980). Simultaneous fluorescent staining of R-bands and specific
heterochromatic regions (DA-DAPI bandas) in human chromosomes. Citogenet.
Cell. Genet. 27: 190-193.
SOUZA IL, GALIANN J, RUA PDL, BERTOLLO LAC e MOREIRA-FILHO O (2001).
Non-radom distribution of the GC-rich heterochromatin and nuclear rDNA sites
on Astyanax scabripinnis chromosomes. Cytologia 66:85-91.
SWARÇA AC, CESTARI MM, GIULIANO-CAETANO L e DIAS AL (2001).
Cytogenetic Characterization of the Large South American Siluriform Fish
Species Zungaro zungaro (Pisces, Pimelodidae). Chromosome Science, 5: 5155.