Anti-DNA - WAMA Diagnóstica

MS 10310030068
Imuno-CON
Anti-DNA
Kit para determinação qualitativa e semi-quantitativa de
anticorpos anti-DNA no soro humano por
imunofluorescência indireta.
An indirect immunofluorescence kit for the qualitative and
semi-quantitative detection of anti-DNA antibodies in
human serum.
Kit para la determinación cualitativa y semi-cuantitativa de
anticuerpos anti-DNA en el suero humano por
inmunofluorescencia indirecta.
REF
1348-I: 48 determinações / determinations / determinaciones
WAMA Diagnóstica
EC R E P
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PORTUGUÊS
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Anticorpo antinuclear (ANA) é um termo usado para descrever auto-anticorpos
contra várias proteínas do núcleo das células.
Em 1982, a American Rheumatism Association inclui um teste positivo para ANA
como um dos critérios para o diagnóstico de lupus eritematoso sistêmico (LES).
Logo, um resultado negativo descarta um LES, porém, não é específico, já que
pacientes com outras enfermidades do tecido conjuntivo, tais como, artrite
reumatóide, esclerodermia, síndrome de Sjögren e dermatomioses são
frequentemente ANA positivos.
O desempenho desses critérios aumentava consideravelmente, com o uso de um
teste de maior especificidade, como o do anti-DNA. Pacientes com LES podem
produzir anticorpos para uma variedade de antígenos nucleares. Entretanto, os
anticorpos direcionados contra Sm (antígeno Smith) e DNA nativo mostram alta
correlação com a doença. Anticorpos direcionados contra Sm mostram um
padrão pontilhado de coloração na imunofluorescência, enquanto que os
direcionados contra DNA nativo são geralmente de padrão periférico e/ou
homogêneo. Baixos títulos de DNA nativo estão frequentemente presentes no
soro de pacientes com artrite reumatóide, síndrome de Sjögren, esclerose
sistêmica progressiva, dermatomiosite e doença mista do tecido conjuntivo,
enquanto que altos títulos são vistos exclusivamente no LES.
A Crithidia luciliae, parasita hemoflagelado, não-patogênico ao homem, possui
em seu interior uma organela citoplasmática conhecida como cinetoplasto, o qual
é rico em DNA, constituindo o substrato ideal para demonstrar a presença de antiDNA nativo no soro por técnica de imunofluorescência indireta e
imunoperoxidase. Outros métodos existentes para detectar esses anticorpos
são: difusão em gel, fixação de complemento, contraimunoeletroforese,
radioimunoensaio de Farr e imunoenzimáticos (ELISA). Os anticorpos anti-DNA
têm alta correlação com atividade da doença clínica e nefrite lúpica, podendo ser
úteis na monitoração do LES.
PRINCÍPIO DO MÉTODO
Soro do paciente contendo anticorpos anti-DNA, incubado com o substrato
antigênico (Crithidia luciliae) evidenciam a presença desses anticorpos, pois
estes se ligam ao cinetoplasto da C. luciliae e são revelados por uma
antigamaglobulina específica marcada com isotiocianato de fluoresceína.
APRESENTAÇÃO DO KIT
1348-I (48 determinações)
1. Lâminas com 8 áreas reativas de Crithidia luciliae (6 lâminas)
2. Antigamaglobulina G humana marcada com isotiocianato de fluoresceína
diluída em azul de Evans (1 x 3ml)
3. Tampão fosfato salino (PBS) (2 envelopes)
4. Glicerina tamponada (3ml)
5. Soro controle humano positivo (1ml)
6. Soro controle humano negativo (1ml)
7. Lamínulas (12 unidades)
8. Instruções para uso
PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES
• LÂMINAS COM SUSPENSÃO DE Crithidia luciliae (1): deixá-las em
temperatura ambiente por 15 minutos antes de retirá-las do envelope. Estáveis
em geladeira (2-8ºC) até a data do vencimento.
• ANTIGAMAGLOBULINA HUMANA (IgG) MARCADA (2): pronta para uso.
Estável em geladeira (2-8ºC), até a data do vencimento. Proteger da luz.
• TAMPÃO FOSFATO SALINO (PBS) (3): dissolver o conteúdo de 1 envelope
em 1 litro de água destilada. Conservar em geladeira em um recipiente limpo e
fechado. É estável até a data do vencimento sem dissolver. Descartar se ocorrer
turvação.
• GLICERINA TAMPONADA (4): pronta para uso. Estável em geladeira
(2-8ºC), até a data do vencimento. Não conservar em temperaturas inferiores a
2ºC para evitar cristalização. Contém azida sódica 0,095%.
• SORO CONTROLE POSITIVO (5): pronto para uso. Estável em geladeira
(2-8ºC) até a data do vencimento. Contém azida Sódica 0,095%.
• SORO CONTROLE NEGATIVO (6): pronto para uso. Estável em geladeira
(2-8ºC) até a data do vencimento. Contém azida Sódica 0,095%.
Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização e é estável
até a data de validade descrita no rótulo, desde que seja mantido na temperatura
indicada (2-8ºC).
AMOSTRAS
Somente utilizar amostras de soro. As amostras com contaminação bacteriana,
hemolizadas ou lipêmicas devem ser desprezadas. Os soros podem ser
conservados em geladeira (2-8ºC) até 72 horas. Para um tempo maior, devem ser
guardados em freezer a -20ºC. Evitar repetidos congelamentos e
descongelamentos.
MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO
• Microscópio de fluorescência
• Pipetas sorológicas
• Jarra de Coplin ou similar
• Tubos e rack
• Água destilada ou deionizada
• Frasco para 1 litro
• Câmara de incubação
• Papel absorvente
PROCEDIMENTO
a. Teste Qualitativo (screening): para triagem e eliminação dos soros nãoreagentes.
1. Diluir o soro de cada paciente a 1/10 com tampão diluente (3) (0,1ml de soro +
0,9ml do tampão diluente)
2. Deixar a(s) lâmina(s) atingir(em) a temperatura ambiente por 15 minutos antes
de retirá-la(s) do envelope. Removê-la(s), sem tocar no substrato, rotulá-la(s) e
colocá-la(s) em câmara úmida.
3. Pingar 1 gota (50µl) dos controles positivo (5) e negativo (6), sem diluir nas
áreas 1 e 2 da(s) lâmina(s), respectivamente. Evitar transbordar as áreas.
4. Pingar 1 gota (50µl) dos soros desconhecidos, diluídos 1/10 nas áreas
restantes, evitando transbordar.
5. Incubar em câmara úmida por 30 minutos, em temperatura ambiente.
6. Remover a(s) lâmina(s) da câmara úmida. Segurá-la(s) por uma extremidade e
lavá-la(s) com aproximadamente 10ml de tampão fosfato salino (PBS) (3).
Usando uma pipeta, dirigir o PBS pela borda longitudinal da lâmina, tendo o
cuidado de não atingir diretamente as áreas reativas, evitando, com isso,
prejudicar o substrato. Colocar a(s) lâmina(s) em uma jarra de Coplin ou similar e
lavá-la(s) com PBS por 5 minutos, trocar o PBS do Coplin e deixar por mais 5
minutos.
7. Remover a(s) lâmina(s) do Coplin, uma de cada vez. Tirar o excesso de PBS,
sacudindo-a(s) sobre papel absorvente. Secar em torno das áreas reativas e ir
IMEDIATAMENTE para a etapa 8 para não secar o local da reação.
8. Retornar à câmara úmida. Pingar 1 gota (50µl) da antigamaglobulina marcada
(2) em cada área da(s) lâmina(s), tendo o cuidado de recobrí-la(s) totalmente.
9. Incubar em câmara úmida por 30 minutos, em temperatura ambiente,
protegendo do excesso de luz.
10. Remover a(s) lâmina(s) da câmara úmida. Segurá-la(s) por uma extremidade
e lavá-las(s) com aproximadamente 10ml de tampão fosfato salino (PBS) (3).
Usando uma pipeta dirigir, o PBS pela borda longitudinal da lâmina, tendo o
cuidado de não atingir diretamente as áreas reativas, evitando com isso
prejudicar o substrato. Colocar a(s) lâmina(s) em uma jarra de Coplin ou similar e
lavá-la(s) com PBS por 5 minutos, trocar o PBS do Coplin e deixar por mais 5
minutos.
11. Remover a(s) lâmina(s) do Coplin, uma de cada vez. Tirar o excesso de PBS,
sacudindo-a(s) sobre papel absorvente. Secar em torno das áreas reativas e ir
IMEDIATAMENTE para a etapa 12 para não secar o local da reação.
12. Pingar 3 a 4 gotas de glicerina tamponada (4) entre as áreas reativas. Cobrir
a(s) lâmina(s) com lamínula(s), evitando a formação de bolhas. Secar o excesso
da glicerina com papel absorvente. Limpar o dorso da lâmina.
13. Ler em microscópio de fluorescência. É conveniente fazer a leitura no mesmo
dia. Entretanto, no caso de não ser possível, conservá-la(s) em geladeira (2-8ºC),
REF
protegida(s) da luz, e lê-la(s) no dia seguinte. A glicerina não deve secar. Se isto
ocorrer, colocar mais glicerina.
b. Teste Semi-Quantitativo (titulação): para determinar o título de anticorpos
dos soros positivos no teste screening.
1. Partindo da diluição 1/10, diluir os soros positivos com tampão diluente (3) a
1/20, 1/40, 1/80 ou mais.
2. Deixar a(s) lâmina(s) atingir(em) a temperatura ambiente por 15 minutos antes
de retirá-la(s) do envelope. Removê-la(s) sem tocar no substrato, rotulá-la(s) e
colocá-la(s) em câmara úmida.
3. Pingar 1 gota (50µl) dos controles positivo (5) e negativo (6), sem diluir, nas
áreas 1 e 2 da(s) lâmina(s), respectivamente. Evitar transbordar as áreas.
4. Pingar 1 gota (50µl) do(s) soro(s) diluído(s) do(s) paciente(s) nas áreas
restantes, usando uma área para cada diluição. Evitar transbordar as áreas.
5. Seguir as etapas de 5 a 13 do teste de triagem (screening).
RESULTADO DAS LEITURAS
Reação Negativa: AUSÊNCIA de fluorescência verde-maçã característica no
cinetoplasto.
Reação Positiva: PRESENÇA de fluorescência verde-maçã característica no
cinetoplasto.
OBSERVAÇÃO: Examinar sempre os controles positivo e negativo para controle
da reação.
INTERPRETAÇÃO
É importante, no momento da leitura, distinguir o núcleo, que é maior, do
cinetoplasto que se encontra mais próximo ao flagelo. Deve-se observar os
parasitas que se encontram com sua estrutura característica conservada.
Quando há fluorescência somente no cinetoplasto, o resultado é REAGENTE
para anti-DNA. Quando há fluorescência no cinetoplasto e no núcleo, o resultado
é REAGENTE para anti-DNA, embora o núcleo reagente indique presença de
outros anticorpos. Isto algumas vezes acontece com doenças do tecido
conjuntivo. Quando há fluorescência em todo o parasita ou no flagelo, o resultado
é NÃO REAGENTE para anti-DNA. O significado desta fluorescência não está
bem definido. Como se utiliza razão 2 para titulação, o título final para os
reagentes deverá ser considerado de acordo com a intensidade da fluorescência
na última diluição em que ela ainda aparece. Ex.: Fluorescência de moderada
intensidade na diluição 1/40 e negativa na diluição 1/160, considerar o título como
1/80, ou seja, intermediário.
PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS
1. Reagentes somente para uso diagnóstico in vitro.
2. A conservação das lâminas pode ser feita, selando as bordas da lamínula com
esmalte de unha e guardando-as no escuro, entre 2-8ºC por, no máximo, 2
meses.
3. Como se emprega azida sódica a 0,095% como conservante nos controles,
conjugado, tampão diluente e glicerina tamponada, o descarte dos reativos deve
ser acompanhado de grandes volumes de água para evitar o acúmulo de
resíduos de azida nos encanamentos, pois esta pode reagir com chumbo e cobre
formando sais altamente explosivos. Além disso, a azida é tóxica quando
ingerida.
4. Todos os materiais humanos usados na preparação dos controles foram
testados, com resultados negativos para antígeno de superfície da hepatite B
(HBsAg), HIV-1 e 2 e HCV. Porém, como nenhum método diagnóstico oferece
completa segurança da ausência destes e de outros agentes infecciosos,
recomenda-se tratar os soros controles humanos como materiais potencialmente
infecciosos.
5. Pacientes fazendo uso de terapia esteróide podem ter resultados negativos
para anticorpo anti-DNA nativo.
6. Descartar o material conforme regulamento local.
7. Realizar manutenção periódica do microscópio, pois a extrapolação da vida útil
da lâmina prejudica a análise dos resultados.
8. Seguir as boas práticas laboratoriais (BPLs) na conservação, manuseio e
descarte dos materiais.
TERMO DE GARANTIA
A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o
mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua
assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação
deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizam por falhas
no desempenho do kit sob essas condições.
ENGLISH
SUMARY
Antinuclear antibody (ANA) is a commom term used to describe auto-antibodies
against some proteins from cells core. In 1982, American Rheumatism
Association included a positive test for ANA as a criterion for the diagnosis of
Systemic Lupus Erythematosus (SLE). Therefore, a negative result discard SLE,
however, it is not specific, because patients with conective tissue disorders such
as arthritis rheumatoid, scleroderma, Sjogren Syndrome and dermatomiosis are
frequently ANA positive. The utilization of anti-DNA as a good specificity test,
increased considerably the criteria performance. SLE patients can yield
antibodies for diverse nuclear antigens. Antibodies directed against Sm (Smith
Antigen) and native DNA present high correlation with the disease. Antibodies
directed against Sm present stippled pattern of color on immunofluorescence
while the antibodies direct against native DNA normally present periferic and/or
homogeneous pattern. DNA native with low titers is present frequently on the
serum of patients with arthritis rheumatoid, Sjorgren Syndrome, progressive
systemic sclerosis, dermatomiosite and mista disease of conjunctive tissue while
high titers are found exclusively in SLE.
Non-pathogenic hemoflagellate Crithidia luciliae has a cytoplasmic organela
known as kinetoplast, rich in DNA, which constitute an ideal substrate to
visualize native anti-DNA in serum through indirect immunofluorescence and
immunoperoxidase methods. Different methods available to detect these
antibodies are: gel diffusion,complement fixation,contraimmunoeletroforese,Farr
radioimmunoassay and ELISA. Anti-DNA antibodies have a high correlation with
clinical disease activity and lupus nephritis, so they can be useful for monitoring
SLE
PRINCIPLE OF THE METHOD
Patient’s serum with anti-DNA antibodies incubated with antigenic substrate
(Crithidia luciliae) clearly show the presence of these antibodies, since these
antibodies bind to the kinetoplast of Crithidia luciliae and they are revealed by
specific antigamma globulin labeled with FITC.
KIT PRESENTATION
R E F 1348-I (48 determinations)
1. nDNA 8 well Slide (6 slides)
2. FITC IgG Conjugate w/ Evans Blue (1 x 3ml)
3. Phosphate Buffered Saline (PBS) (2 x 50ml)
4. Mounting Medium (1x3ml)
5. Positive Control (1x1ml)
6. Negative Control (1x1ml)
7. Cover Slips (6 units)
8. Package Insert
REAGENT STABILITY AND STORAGE
• nDNA 8 WELL SLIDE (1): Allow slide to equilibrate room temperature for 15
minutes prior removing it from the alluminium pouche. Stable if stored at 2-8ºC up
to expiration date.
• FITC IgG CONJUGATE W/ EVANS BLUE (2):
Ready for Use. Stable if stored at 2-8ºC up to expiration date. Protect from light.
• PHOSPHATE BUFFERED SALINE (PBS) (3):
Dissolve 1 envelope into 1 liter of distilled water. Stored at 2-8ºC in a clean and
closed container. Stable up to expiration date without dissolving. Discard if any
turbidity is present.
•MOUNTING MEDIUM (4): Ready for Use. Stable if stored at 2-8ºC up to
expiration date. Do not store below 2ºC to avoid crystallization. It contains sodium
azide 0,095%.
• POSITIVE CONTROL (5): Ready for Use. Stable if stored at 2-8ºC up to
expiration date. It contains sodium azide 0.095%
• NEGATIVE CONTROL (6): Ready for Use. Stable if stored at 2-8ºC up to
expiration date. It contains sodium azide 0.095%.
Obs.: Kit presents results after its first handling and it is stable up to expiration
date if stored at 2-8ºC.
SPECIMEN COLECTION AND STORAGE
Only serum specimens should be used for this procedure. Grossly haemolyzed,
lipaemic or microbially contaminated specimens may interfere with the
performance of this test and should not be used. Store the serum at 2-8ºC up to
72 hours. For longer storage, the serum should be stored at -20ºC. Avoid repeated
thawing and freezing of specimens.
MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
• Fluorescence microscope
• Micropipette or Pasteur pipette
• Serological pipette
• Coplin jar or similar
• Test Tube and rack
• Distilled or deionized water
• 1 liter container
• Incubation Chamber
• Paper Towel
PROCEDURE
a. Qualitative Test (screening): It is intended to screening and removal of the
negative serum.
1. Dilute patient serum 1:10 with PBS(3) [0.1ml of serum + 0.9ml of PBS].
2. Allow pouch equilibrate room temperature for 15 minutes then remove the slide
from the pouch. Remove carefully the slide without touching on the substrate.
Label it and store into the moisture chamber.
3. Add 1 drop (50µl) of Positive (5) and Negative (6) Control, undiluted, in the wells
1 and 2 of the slide respectively. Avoid overfilling the wells.
4. Add 1 drop (50µl) of the unknown serum, diluted at 1:10, in the remaining wells.
Avoid overfilling the wells.
5. Incubate the slide for 30 minutes at room temperature.
6. Remove the slide from the incubation chamber. Hold the slide at tab end and
rinse it using 10ml of PBS(3). With a pipette, lead PBS by the longitudinal edge of
the slide. Be sure not to touch reagent wells to avoid damaging substrate.
Transfer the slide into the Coplin jar or similar and wash it for 5 minutes with PBS.
Replace the PBS and wash for more 5 minutes.
7. Remove the slide from the Coplin jar, one by one. Blot the edge of the slide on a
paper towel to remove the excess of PBS. Dry around reactive wells. To prevent
wells from drying, go IMMEDIATELY to step 8.
8. Place the slide back to incubation chamber. Apply 1 drop (50µl) FITC IgG
Conjugate with Evans Blue (2) in each well of the slide. Be sure to fill the well
completely.
9. Incubate the slide for 30 minutes at room temperature. Protect it from light.
move the slide from incubation chamber. Hold the slide at tab end and rinse
g 10ml PBS(3).With a pipette, lead the PBS by the longitudinal edge of the
Be sure not to touch reagent wells to avoid damaging the substrate.
er the slide into the Coplin jar or similar and wash it for 5 minutes. Replace
S and wash for more 5 minutes.
move the slide from Coplin jar, one by one. Blot the edge of the slide on a
towel to remove the excess of PBS. Dry around reactive wells. To prevent
rom drying, go IMMEDIATELY to step 12.
ply 3 to 4 drops of Mounting Medium (4) in the reactive wells and cover the
with cover slips, be sure to avoid air bubbles. Dry the excess of Mounting
m with a paper towel.
de must be read under a fluorescence microscope as soon as possible.
ver, if it is not possible, store the slide at 2-8ºC, protect it from light and read
e following day. If Mounting Medium dry, you can apply more.
mi-Quantitative Test. (titration): It is intended to determine the titers of
dies for positive serum through the screening test.
rting from the dilution at 1:10 - Dilute the positive serum with PBS (3)
:40, 1:80 and so on.
w the pouch to equilibrate room temperature for 15 minutes then remove
rom the pouch. Remove carefully slide without touching on the substrate.
t and store in the incubation chamber.
1 drop (50µl) of Positive (5) and Negative (6) Control, undiluted, in the wells
2 of the slide respectively. Avoid overfilling the wells.
1 drop (50µl) of the patient diluted serum in the remaining wells, one well
h dilution. Avoid overfilling the wells.
ow the steps 5 through 13 of the screening test.
ING OF RESULTS
ive: ABSENCE of an apple-green fluorescence color in the kinetoplast.
ve:PRESENCE of an apple-green fluorescence in the kinetoplast.
RVATION: Always check positive and negative controls for reaction
l.
RPRETATION
portant, at the time of the interpretation, to distinguish the nucleus fom the
plast, which is nearer to flagellum. One must check parasites which show
reserved structure.
there is fluorescence in kinetoplast only, the result is POSITIVE for antiFluorescence in kinetoplast and nucleus, the result is POSITIVE for antialthough positive nucleus reveals other antibodies. When there is
scence in the parasite or in the flagellum, the result is NEGATIVE for antiThe meaning of this fluorescence is not well defined. As it is used a ratio 2
ation, final titer for reagents should be seen according to the intensity of the
scence in the last dilution in which the fluorescence is still present. Ex:
scence of moderated intensity diluted at 1:40 and negative at the dilution
take the titer at 1:80 into account, i.e., Intermediate
AUTIONS AND WARNINGS
n Vitro Diagnostic Use only.
conservation of the slide can be done by sealing the slide edges with nail
d protect it from light at 2-8ºC no more than 2 months.
dium Azide 0.1% is used in the Controls, Conjugate, PBS and Mounting
m. It can react with lead and cooper plumbing to form highly explosive
azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent azide
p. Sodium Azide may be toxic if ingested.
uman components have been tested for HBsAg, HIV 1&2, HCV and found
negative. However, this does not assure the absence of these and others
ous agents. All human components should be handled as potentially
dous.
roid therapy patients can present negative results for native anti-DNA
dy.
posal in accordance with local regulation.
e periodical maintenance of the microscope is recommended since an
d lamp can interfere in the result analisis.
ow the good laboratory practices (GLP) related to storage, dispensing and
al of these materials.
RANT
A Diagnóstica replaces this kit since it is not beyond expiration date. The
ed kit must be evaluated by Wama´s technical support. The warranty will be
and kit will not be replaced if technical support finds evidence that running,
g and storage were not properly fallowed.
PAÑOL
RTANCIA CLÍNICA
erpo antinuclear (ANA) es un termino usado para describir autoerpos contra varias proteínas del núcleo de las células.
82, la American Rheumatism Association incluyó un teste positivo para ANA
un de los criterios para el diagnóstico de lupus eritema toso sistémico
Luego, un resultado negativo, descarta LES, pero no es específico, ya que
tes con otras enfermedades de tejido conjuntivo, tales como artritis
toide, esclerodermia, síndrome de Sjogrem y dermatomiosis son
frecuentemente ANA positivos.
El desempeño de eses criterios aumentaba considerablemente, con el uso de un
teste de mayor especificidad, como el anti-DNA. Pacientes con LES puede
producir anticuerpos para una variedad de antígenos nucleares. Pero, los
anticuerpos direccionados contra Sm (antígeno Smith) y DNA nativo muestran
alta correlación con la enfermedad. Anticuerpos direccionados contra Sm
muestran un patrón puntilleado de coloración en la inmunofluorescencia,
mientras que los direccionados contra DNA nativo son generalmente de patrón
periférico y/o homogéneo. Bajos títulos de DNA nativo están frecuentemente
presentes en el suero de pacientes con artritis reumatoide, síndrome de Sjogren,
esclerosis sistémica progresiva, dermatomiositis y enfermedad mixta del tejido
conjuntivo, mientras que altos títulos son vistos exclusivamente en LES.
La Crithidia luciliae, parasita hemoflagelado, en el patogénico al hombre, posee
en su interior una organela citoplasmática conocida como cinetoplasto, el cual es
rico en DNA, constituyendo el substrato ideal para demostrar la presencia de antiDNA nativo en el suero por técnica de inmunofluorescencia indirecta y
inmunoperoxidad. Otros métodos existentes para detectar eses anticuerpos son:
difusión en gel, fijación de complemento, contrainmunoelectroforesis,
radioinmunoensayo de Farr y inmunoenzimáticos (ELISA). Los anticuerpos antiDNA tiene alta correlación con actividad de la enfermedad clínica y nefritis lúpica,
pudiendo ser útiles en la monitorización del LES.
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Suero del paciente conteniendo anticuerpos anti-DNA, incubado con el substrato
antigénico (Crithidia luciliae) evidencian la presencia de eses anticuerpos, pues
eses se liga al cinetoplasto de la C. luciliae y son revelados por una
antigamaglobulina específica marcada con isotiocianato de fluoresceína.
PRESENTACIÓN DEL KIT
R E F 1348-I (48 determinaciones)
1. Laminas con 8 áreas reactivas de Crithidia luciliae (6 laminas)
2. Antigamaglobulina G humana marcada con isotiocianato de fluoresceína
diluida en azul de Evans (1x3ml)
3. Tapón fosfato alcalino (PBS) (2 sobres)
4. Glicerina taponada (3ml)
5. Suero control humano positivo (1ml)
6. Suero control humano negativo (1ml)
7. Laminuelas (12 unidades)
8. Instrucciones para el uso
PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS
• Laminas con suspension de Crithidia luciliae (1): dejarlas en temperatura
ambiente por 15 minutos antes de retirarlas del sobre. Estables en nevera (2-8ºC)
hasta la fecha de caducidad.
• Antigamaglobulina humana (IgG) marcada (2): lista para el uso. Estable en
nevera (2-8ºC), hasta la fecha de caducidad. Proteger de la luz.
• apón fosfato salino (3): disolver el contenido de 1 sobre en 1 litro de agua
destilada Conservar en nevera en un recipiente limpio y cerrado. Estable hasta la
fecha de caducidad sin disolver. Descartar se ocurrir turbación.
• Glicerina taponada (4): lista para el uso. Estable en nevera(2-8ºC) hasta la
fecha de caducidad.
No conservar en temperaturas inferiores a 2ºC para evitar cristalización. Contiene
azida sódica 0,095%.
• Suero control positivo (5): lista para el uso. Estable en nevera(2-8ºC) hasta
la fecha de caducidad. Contiene azida sódica 0,095%.
• Suero controle negativo (6): lista para el uso. Estable en nevera(2-8ºC) hasta
la fecha de caducidad. Contiene azida sódica 0,095%.
Obs.: El kit mantiene el mismo desempeño después de la primeira utilización y es
estable hasta la fecha de vencimiento descrita en le rótulo, siempre que sea
conservado a la temperatura indicada (2-8ºC).
MUESTRAS
Solamente utilizar muestras de suero. Las muestras con contaminación
bacteriana, hemolizadas o lipemicas deben ser despresadas. El sueros puede
ser conservados en nevera (2-8ºC) hasta 72 horas. Por un tiempo mayor, deben
ser guardados en congelador a -20ºC. Evitar repetidos congelamientos y
descongelamientos.
Material necesario, pero no fornecido
•Microscopio de fluorescencia
•Micro pipeta o pipeta Pasteur
•Pipetas suerológicas
•Jarra de Coplin o similar
•Tubos 13x75mm y rack
• Agua destilada o deionizada
•Frasco para 1 litro
•Cámara de incubación
•Papel absorbente
PROCEDIMIENTO
a. Teste Cualitativo (screening): para selección y eliminación de los sueros no
reactivos
1. Diluir el suero de cada paciente a 1/10 con tapón diluyente (3) (0,1ml de suero
+0,9 ml del tapón diluyente).
2. Dejar las laminas atingieren la temperatura ambiente por 15 minutos antes de
retirarlas del sobre. Removerlas sin tocar en el substrato, rotularlas y colocarlas
en cámara húmeda.
3.Pingar 1 gota (50µl) de los controles positivo(6) y negativo(7), sin diluir, en áreas
1 y 2 de las laminas, respectivamente. Evitar transbordar el área.
4.Pingar 1 gota (50µl) de los sueros desconocidos diluidos 1/10 en áreas
restantes evitando transbordar.
5.Incubar en cámara húmeda por 30 minutos, en temperatura ambiente.
6.Remover las laminas de la cámara húmeda. Aguantar por una extremidad y
aclarar con el tapón fosfato salino (PBS) (4), aproximadamente 10ml. Usando una
pipeta dirigir el PBS por la borda longitudinal de las laminas teniendo el cuidado
de no atingir directamente áreas reactivas, evitando con eso perjudicar el
substrato. Colocar las laminas en una jarra de Coplin o similar y lavar con PBS por
10 minutos, agitando suavemente el Coplin algunas veces.
7.Remover las laminas del Coplin, una de cada vez. Quitar el exceso de PBS
sacudiendo la sobre el papel absorbente. Secar en torno de áreas reactivas y
pasar INMEDIATAMENTE para la etapa 8 para no secar el local de la reacción.
8. Retornar a la cámara húmeda. Pingar 1 gota (50ul) de la antigamaglobulina
marcada (2) en cada área de las laminas , teniendo el cuidado de recubrirlas
totalmente.
9.Incubar las laminas por 30 minutos en cámara húmeda, en temperatura
ambiente, protegiendo del exceso de luz.
10.Remover las laminas de la cámara húmeda. Aguantarlas por una extremidad y
aclarar con tapón fosfato salino (PBS), aproximadamente 10ml.Usando una
pipeta dirigir el PBS por la borda longitudinal de las laminas, teniendo el cuidado
de no atingir directamente áreas reactivas, evitando con eso perjudicar el
substrato. Colocar las laminas en una jarra de Coplin o similar y aclararlas con
PBS por 5 minutos, cambiar el BPS del Coplin dejar por 5 minutos mas.
Atención: Aclaraciones inadecuadas pueden alterar la morfología de las células
polimorfo nucleares (neutro filos) y llevar a un aumento de la fluorescencia de
fondo.
11.Remover las laminas del Coplin, una de cada vez. Tirar o exceso de PBS
sacudiendo las sobre papel absorbente. Secar en torno de áreas reactivas y
pasar INMEDIATAMENTE para la etapa 12 para no secar el local de la reacción.
12.Pingar 3 a 4 gotas de glicerina taponada (5) entre áreas reactivas. Cubrir las
laminas con una laminuela evitando la formación de burbujas. Secar el exceso de
glicerina con papel absorbente. Limpiar el dorso de las laminas.
13. Leer en microscopio de fluorescencia. Es conveniente hacer la lectura en el
mismo día. Pero en el caso de no ser posible, conservarla en nevera (2-8ºC)
protegida de la luz y leerlas en el día siguiente. La glicerina no debe secar. Se esto
ocurrir colocar mas glicerina.
b. Teste Semi-Cuantitativo: (Titilación): para determinar el título del anticuerpo
de los sueros positivos en el teste Cualitativo(screening).
1.Partiendo de la dilución 1/10, diluir los sueros positivos en tapón diluyente (3) la
1/20, 1/40, 1/80 o mas.
2.Dejar las laminas atingieren la temperatura ambiente por 15 minutos antes de
retirarlas del sobre. Removerlas sin tocar en substrato, rotularlas y colocarlas en
cámara húmeda.
3.Pingar 1 gota(50µl) del control positivo (6) y negativo(7), sin diluir, en las áreas 1
y 2 de la laminas, respectivamente. Evitar transbordar las áreas.
4.Pingar 1 gota (50µl) de los sueros diluidos en las áreas restantes usando un
área para cada dilución. Evitar transbordar el área.
5.Seguir las etapas 5 a 13 del teste de selección(screening).
RESULTADO DE LAS LECTURAS
Reacción negativa: AUSENCIA de fluorescencia verde-manzana característica
del cinetoplasto.
PRESENCIA de fluorescencia verde-manzana
Reacción positiva:
característica en el cinetoplasto.
OBSERVACIÓN: Examinar siempre los controles positivo y negativo para el
control de la reacción.
Interpretación
Es importante, en el momento de la lectura, distinguir el núcleo, que es mayor, del
cinetoplasto que se encuentra mas próximo al flagelo. Debe se observar los
parasitas que se encuentran con su estructura característica conservada.
Cuando ha fluorescencia en el cinetoplasto y el núcleo, el resultado es
REACTIVO para anti-DNA, aun que el núcleo reactivo indique presencia de otros
anticuerpos. Esto algunas veces acontece con enfermedades del tejido
conjuntivo. Cuando ha fluorescencia en todo el parasita o en el flagelo, el
resultado es NO REACTIVO para anti-DNA. El significado de esta fluorescencia
no está bien definido. Como se utiliza razón 2 para titulación, el título final para os
reactivos deberá ser considerado de acuerdo con la intensidad de la
fluorescencia en la última dilución en que ella todavía aparece. Ejemplo.:
Fluorescencia de moderada intensidad en la dilución 1/40 y negativa en la
dilución 1/60, considerar el título como 1/80, es decir, intermediario.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
1.Reactivos solamente para uso diagnóstico in vitro.
2.La conservación de las laminas pueden ser hechas, sellando las bordas de la
laminuela con esmalte de uña y guardando las en el oscuro, entre 2-8ºC por lo
máximo 2 meses.
3.Como se emplea azida sódica 0,1% como conservante en los controles,
conjugado, tapón diluyente y glicerina taponada, el descarte de los reactivos debe
ser acompañado de grandes volúmenes de agua para evitar el acumulo de
residuos de azida en las tuberías, pues esta puede reaccionar con el plomo o
cobre, formando sales altamente explosivos. Además la azida es tóxica cuando
ingerida.
4.Todos los materiales humanos usados en la preparación de los controles fueron
testados, con resultados negativos, para antígeno de superficie de la hepatitis B
(HbsAg), HIV-1 y 2, HCV y HTLV_1. Pero, como ningún método diagnóstico
ofrece completa seguridad de la ausencia de eses y de otros agentes infecc
recomendase tratar los sueros controles humanos como mate
potencialmente infecciosos.
5.Pacientes haciendo uso de terapia esteroide pueden tener resul
negativos para anticuerpo anti-DNA nativo.
6. Eliminación de acuerdo con las reglamentaciones locales.
7.Realizar mantenimiento regular del microscopio, ya que la extrapolación
vida de la hoja afecta al análisis de los resultados.
8.Seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en la conservación, man
y descarte de materiales.
TÉRMINO DE GARANTÍA
La WAMA Diagnostica garantiza el cambio de este conjunto diagnostico si d
el momento que el mismo esté dentro el plazo de caducidad y sea compro
por su accesoria técnica de que no hubieron fallos en la ejecución, mano
conservación de este producto. La
WAMA y sus distribuidores n
responsabilizan por los fallos en el desempeño del kit bajo sobre
condiciones.
BIBLIOGRAFIA/BIBLIOGRAPHY/BIBLIOGRAFÍA
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the determination of anti-ds DNA with the immunofluorescence technique
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10. Tan, E. M.: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune disease
probes for celli biology. Adv. Immunol., 40: 93-151, 1989.
SIMBOLOGIA / SIMBOLS / SIMBOLOGIA
IVD
O conteúdo é suficiente para ( n ) testes
Quantity sufficient for (n) tests
O contenido es suficiente para ( n ) testes
LOT
Número do lote
Lot Number
Número del lote
Data limite de utilização
Expiry Date
Fecha de la caducidad
REF
Número do catálog
Catalog Number
Número del catálo
Produto diagnóstico in vitro
In vitro diagnostic
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Limite de temperat
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Limite de temperat
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