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teor de HbA1c situava-se no intervalo de 4,7% e 15,2%. A comparação entre os produtos deu origem à seguinte equação de regressão linear: Y= -0,357 + 1,05x. O coeficiente de correlação foi de 0,995. Evidenciou-se recuperações na faixa de linearidade do método de 98,3% a 104,4%. Repetitividade Foram realizadas 20 dosagens sucessivas, com 03 amostras, obteve-se os seguintes resultados: Parâmetro Estatístico Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Média 4,80 7,30 10,90 DP 0,06 0,07 0,16 CV% 1,25 1,02 1,47 Reprodutibilidade Foram realizadas 20 dosagens, em cada amostra, durante 20 dias consecutivos, obteve-se os seguintes resultados: Parâmetro Estatístico Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Média 4,70 7,30 11,10 DP 0,06 0,08 0,17 CV% 1,31 1,13 1,50 Interferentes • Concentrações de bilirrubina até 50mg/dL, ácido ascórbico até 50mg/dL, triglicérides até 2000mg/dL, hemoglobina acetilada até 5,0mmol/L e hemoglobina carbamilada até 7,5mmol/L não produzem interferência significativas. • Resultados inconsistente foram reportados em pacientes que fizeram uso de opiáceos, envenenamento por chumbo, alcoolismo e ingestão de elevadas doses de aspirina (ácido acetilsalicílico). • Resultados falsamente diminuídos podem ocorrer em amostras com níveis elevados de HbF e em condições que promovem redução real da A1C em função da diminuição do número de eritrócitos, dos níveis de hemoglobina e do hematócrito. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA • Trivelli, L.A., Ranney, H.M., and Lai, H.T., New Eng. J. Med. 284,353 (1971). • Gonen, B., and Rubenstein, A.H., Diabetologia 15, 1 (1978). • Gabbay, K.H., Hasty, K., Breslow, J.L., Ellison, R.C., Bunn, H.F., and Gallop,P.M., J. Clin. Endocrinol. Metab. 44, 859 (1977). 4/4 • Bates, H.M., Lab. Mang., Vol 16 (Jan. 1978). • Tietz, N.W., Textbook of Clinical Chemistry, Philadelphia, W.B. Saunders Company, p.794-795 (1999). • Ceriello, A., et al, Diabetologia 22, p. 379 (1982). • Little, R.R., et al, Clin. Chem. 32, pp. 358-360 (1986). • Fluckiger, R., et al, New Eng.J. Med. 304 pp. 823-827 (1981). • Nathan, D.M., et al, Clin. Chem. 29, pp. 466-469 (1983). • Engbaek, F., et al, Clin. Chem. 35, pp. 93-97 (1989). • American Diabetes Association: Clinical Practice Recommendations (Position Statement). Diabetes Care 24 (Suppl. 1): S33-S55, (2001). • Atualização sobre Hemoglobina Glicada (A1C) para avaliação do controle glicêmico e para o diagnóstico do diabetes: Aspectos Clínicos e Laboratoriais. http://www.diabetes.org.br/ attachmentes/502_posicionamentos_SBD_3_ jan09.pdf. Acesso em 04/2010. • Doles: Dados de Arquivo. TERMOS E CONDIÇÕES DE GARANTIA DA QUALIDADE DO PRODUTO As garantias do fabricante ao consumidor seguem estritamente as relacionadas na Lei no 8.078, de 11 de setembro de 1.990 - Código de Defesa do Consumidor. Os reagentes que compõem este sistema para diagnóstico são garantidos na sua performance, reprodutibilidade e qualidade até a data de vencimento. Todos os produtos que apresentarem problemas técnicos comprovados serão substituídos sem ônus para o consumidor. Doles Reagentes e Equipamentos para Laboratórios Ltda. CNPJ: 01.085.513/0001-05 Rodovia BR 153, Km 493, Conjunto Palmares CEP: 74.775-027 Goiânia - GO - Brasil e-mail: [email protected] www.doles.com.br M.S.: 10231810100 Revisão: 02 (05/2012) HEMOGLOBINA HbA1c FINALIDADE Sistema para determinação quantitativa de HbA1c no sangue humano. Somente para uso diagnóstico in vitro. PRINCÍPIO O método baseia-se na interação de antígeno e anticorpo para a determinação direta da HbA1c no sangue total. Hemoglobina total e HbA1c se ligam igualmente às partículas de látex. Quando o anticorpo monoclonal de camundongo antiHbA1c (R2) é adicionado, forma-se o complexo: [látex + HbA1c (amostra) + anticorpo monoclonal anti-HbA1c]. Em seguida acontece a aglutinação, devido à presença de anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo, que interage com o anticorpo monoclonal. A aglutinação formada é proporcional à concentração de HbA1c na amostra. O valor de HbA1c é obtido através da curva de calibração. PARTICULARIDADES DO SISTEMA O kit de Hemoglobina HbA1c Doles permite quantificar de forma rápida e simples a HbA1c, dispensa a determinação da HbT e é aplicável em sistemas semiautomáticos e automáticos. METODOLOGIA Imunoturbidimetria. REAGENTES E APRESENTAÇÃO Reagentes: R1 Látex – contém partículas de látex 0,13% e preservativo. R2A Tampão – contém tampão 80mmol/L, pH 7,3 e preservativo. R2B Anticorpo – contém tampão 20mmol/L, pH 7,1; anticorpo monoclonal de camundongo antiHbA1c humana; anticorpo policlonal anti-IgG de camundongo e azida sódica 14,6mmol/L. Reagente Hemolisante – contém azida sódica 7,3mmol/L. Apresentação Ref.A/ 24 testes (manual) 120 (automação) R1 Látex 1 x R2A Tampão2 x R2B Anticorpo2 x Reagente Hemolisante1 x Ref.B/ 40 testes (manual) 200 (automação) R1 Látex 1 x R2A Tampão 2 x R2B Anticorpo 2 x Reagente Hemolisante 2 x testes 18mL 2,85mL 0,15mL 120mL testes 30mL 4,75mL 0,25mL 100mL Protocolos para equipamentos semiautomáticos e automáticos, estão disponíveis no site Doles ou através do Serviço de Atendimento ao Consumidor. TURBIDIMETRIA EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSÁRIOS NÃO FORNECIDOS • Calibradores HbA1c Doles • Analisador capaz de medir a absorvância entre 600 e 660nm. • Tubos de ensaio. • Pipetas graduadas. • Pipeta semiautomática 20mL. • Ponteiras descartáveis. • Pera para pipetagem. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES Conservar o kit entre 2 e 8ºC. Estável até a data de vencimento indicada no rótulo do produto, obedecidas as condições de armazenamento. O reagente R2 (2A+2B) possui estabilidade de 30 dias se armazenado na temperatura de 2 a 8ºC. CUIDADOS E PRECAUÇÕES COM O USO DOS REAGENTES Todos os reagentes são somente para uso diagnóstico in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitando-se o contato com pele e mucosas. Os reagentes 2B e hemolisante contêm azida sódica (irritante). Não pipetar o reagente com a boca. O descarte do material utilizado deverá ser feito obedecendo-se aos critérios de biossegurança estabelecidos pelo laboratório, de acordo com as normas locais, estaduais ou federais. Observar a simbologia constante nos rótulos do produto: Irritante AMOSTRA Preparo do paciente - O paciente não precisa estar em jejum, porém resultados mais precisos são obtidos em amostras isentas de turbidez decorrentes da hipertrigliceridemia. É recomendada a coleta de sangue, pelo menos, duas horas após a ingestão de alimentos. Coleta - Sangue total colhido por punção venosa ou capilar. Utilizar como anticoagulante o EDTA (Anticoagulante Universal ou Anticoagulante Glicose Doles). Estabilidade - A amostra permanece estável por uma semana à temperatura de 2 a 8ºC. O sangue total armazenado a –70ºC é estável por pelo menos 18 meses. O armazenamento a – 20ºC por longos períodos, ocasiona o aumento de HbA1a+b, não sendo recomendável. Todas as amostras biológicas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. 1/4 B- Preparo dos Reagentes 1. O reagente R1 Látex é pronto para uso. 2. O reagente R2 consiste na mistura do reagente 2A + 2B. Este reagente deve ser preparado pela adição do reagente 2B ao volume do reagente 2A. Homogeneizar suavemente. Depois de preparado o reagente é estável por 30 dias se mantido à temperatura de 2 a 8ºC. C- Ensaio • Curva de Calibração Utilizar os Calibradores HbA1c Doles e proceder de maneira idêntica ao estabelecido para as amostras de pacientes. O último ponto da curva (maior valor) é o ponto limite de determinação da reação. • Ensaio em sistemas manual ou semiautomático pipetar em tubo de ensaio: Calibradores Amostra R1 Látex homogeneizado 750mL 750mL Aquecer em banho maria a 37ºC por 3 minutos. Ponto 01 da Curva de Calibração Água/salina 0,9% Ponto 02 da Curva de Calibração Hemolisado do Calibrador Nível 01 20mL - 20mL - 20mL - 20mL - 20mL - - 20mL Ponto 03 da Curva de Calibração Hemolisado do Calibrador Nível 02 Ponto 04 da Curva de Calibração Hemolisado do Calibrador Nível 03 Ponto 05 da Curva de Calibração Hemolisado do Calibrador Nível 04 Hemolisado amostra/paciente Homogeneizar e incubar em banho maria a 37ºC por 5 minutos. R2 homogeneizado 250mL 250mL Homogeneizar e incubar em banho maria a 37ºC por 5 minutos. 2/4 Zerar o espectrofotômetro/fotômetro com água, no comprimento de onda de 600 a 660nm e obter as absorvância dos calibradores (ordem crescente) e das amostras. Cálculos: Definir a concentração das amostras através da interpolação dos valores obtidos na curva de calibração. Para construção da curva utilizar papel linear ou programas de computação para construção de gráficos do tipo Excel/equipamento de semiautomação. A seguir um exemplo de curva de calibração: Ponto da Curva (HbA1c) 2,5 Absorvância PROCEDIMENTO TÉCNICO A- Hemolisado O procedimento a seguir deverá ser realizado para as amostras, controles e calibradores, conforme o descrito a seguir: 1. Pipetar 1mL do reagente hemolisante (pronto para uso) em tubos (vidro ou plástico), para cada tipo de amostra (paciente, controle e calibradores). 2. Homogeneizar a amostra e pipetar 20mL no tubo respectivo. 3. Agitar bem. 4. Aguardar cinco minutos para a hemólise completa (ausência de turvação). Nota: o hemolisado preparado pode ser armazenado por 10 dias a uma temperatura de 2 a 8ºC. 2 1,5 0 5 1 0,5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 HbA1c (%) Absorvância 0,648 0,999 8,3 1,555 12,0 1,899 15,2 1,940 CONTROLE DA QUALIDADE DO SISTEMA • A limpeza e a secagem adequada do material a ser utilizado são de fundamental importância para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. • Ler cuidadosamente as instruções de uso antes de realizar o teste. • A data de validade do kit fechado corresponde ao último dia do mês assinalado na etiqueta da caixa do kit. • Atenção para o prazo de estabilidade do reagente R2. Não utilizar após 30 dias do preparo. • Não usar componentes do kit após a data de validade. • Utilizar as Boas Práticas de Laboratório (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. • Não substituir componentes deste kit com o de outros fabricantes, nem usar componentes de lotes e códigos diferentes. • O uso de amostra controle de referência deve ser uma prática rotineira do laboratório. Protocolos para equipamentos automáticos, estão disponíveis no site Doles ou através do Serviço de Atendimento ao Consumidor. LINEARIDADE O método possui intervalo de medição de 2,0% a 16,0%. Contudo a faixa de linearidade do sistema é definida pelo último ponto do calibrador utilizado na curva de calibração. Amostras com valores acima do intervalo de calibração não devem ser diluídas. Sendo assim, o resultado deverá ser reportado como superior a ... (relatar o valor de concentração do último ponto da curva de calibração). LIMITAÇÕES DO SISTEMA • Para se obter ótimo desempenho do sistema, é necessário que o procedimento técnico seja rigorosamente seguido conforme instruções de uso. Qualquer alteração poderá levar a resultados errôneos. • Este ensaio não deve ser utilizado como diagnóstico da Diabetes Mellitus. • Os resultados das amostras dos pacientes devem sempre ser obtidos através da curva de calibração. • Resultados inconsistentes foram reportados em pacientes que fizeram uso de opiáceos, envenenamento por chumbo, alcoolismo e ingestão de elevadas doses de aspirina (ácido acetilsalicílico). • Resultados falsamente diminuídos podem ocorrer em amostras com níveis elevados de HbF e em condições que promovem redução real da A1c em função da diminuição do número de eritrócitos, dos níveis de hemoglobina e do hematócrito. VALORES DE REFERÊNCIA • Pacientes não diabéticos 4,0% a 6,0% • Pacientes diabéticos em controle glicêmico na Infância e Adolescência (seg. American Diabetes Association) Idade ( 0 - 6) anos – 7,5% a 8,5% Idade ( 6 - 12) anos – < 8,0% Idade (13 - 19) anos – < 7,5% • Adultos diabéticos em controle glicêmico Até 7,0% ADA (American Diabetes Association) Até 6,5% SBD (Sociedade Brasileira de Diabetes) • Idosos diabéticos em controle glicêmico Até 8,0% Importante ressaltar que os valores estabelecidos para pacientes diabéticos não são de referência. Trata-se de valores acima dos quais os riscos de desenvolvimento de complicações micro e macrovasculares da doença são significativamente elevados. SIGNIFICADO CLÍNICO O termo genérico “Hemoglobina Glicada” ou A1C se refere a um conjunto de substâncias formadas a partir de reações entre a Hemoglobina A (HbA) e alguns açúcares. A ligação entre a HbA e a glicose é um tipo de glicação não-enzimática, contínua, lenta e irreversível. Entretanto, a primeira fase da reação entre a glicose e a hemoglobina é reversível e origina um composto intermediário denominado pré-A1C, HbA1c lábil ou instável, aldimina ou, ainda, base de Schiff. A segunda fase resulta em um composto estável tipo cetoamina, não mais dissociável, agora denominado de HbA1c ou, simplesmente, A1C. No indivíduo normal a fração HbA1c representa, aproximadamente, 80% da hemoglobina A1 total. A hemácia é livremente permeável à molécula de glicose, ficando a hemoglobina, praticamente, exposta às mesmas concentrações da glicose plasmática. A hemoglobina glicada se acumula dentro das hemácias, apresentando, portanto, uma meia-vida dependente da delas. Tradicionalmente, a A1C tem sido considerada como representativa da média ponderada global das glicemias médias diárias (incluindo glicemias de jejum e pós-prandial) durante os últimos 2 a 3 meses, uma vez que os eritrócitos têm um tempo de vida de, aproximadamente, 120 dias. A medida da quantidade de glicose ligada à hemoglobina pode fornecer uma avaliação do controle glicêmico médio no período de 90 a 120 dias antes do exame. Em virtude dos resultados do exame fornecerem informações retrospectivas sobre dois a quatro meses precedentes, a realização de um teste de HbA1C, a cada três meses, fornecerá dados que expressam a glicose sanguínea média no passado recente (2 a 4 meses antes do exame). No decorrer dos anos ou décadas, o quadro de hiperglicemia prolongada acelera lesões átero e arterioloescleróticas com extenso comprometimento do sistema vascular arterial e desenvolvimento de lesões secundárias, com predominância ao nível dos rins, coração, sistema nervoso central e globo ocular. Os testes de HbA1c devem ser realizados regularmente em pacientes diabéticos. Primeiramente, para documentar o grau de controle glicêmico em sua avaliação inicial e, subsequentemente, como parte do atendimento contínuo do paciente. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade Clínica e Especificidade Foram realizados 45 testes em amostras cujo 3/4
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