INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E pH NA EXTRAÇÃO

INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E pH NA EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
SOLÚVEIS DE MICÉLIO DE Trichoderma atroviride
Cantuária, A. L. A.*; Ribeiro, D. P.*; Pedrollo, D.
G.**; Castro-Gómez, R. J. H.**; Ueno, C. T.*
*COALM/UTFPR – Londrina, Brasil
**DCTA/UEL, Londrina, Brasil
e-mail: [email protected]
que micélios de Trichoderma spp resistentes
Resumo/Abstract
podem ser utilizados em conjunto com
The
antimicrobial
properties
of
Trichoderma atroviride metabolites have
shown satisfactory results in agriculture
application. The mycelia residue can also
provide economic interesting biomolecules,
reducing its ambient pollution. This research
aimed to study the effects of pH and
temperature on T. atroviride mycelium
autolysis as a process for soluble proteins
extraction. Soluble proteins determination was
performed using Lowry technique and the
effects of pH and temperature were studied
applying a factorial design 22. The amount of
soluble proteins was not significatively
affected (p<0.05) by this parameters. The best
results were obtained 40 °C and pH 6.5.
Keywords: Trichoderma. Soluble proteins.
Autolysis.
fungicidas para tratamento de sementes,
pulverizações foliares ou aplicações no solo,
uma vez que este fungo apresenta um
comportamento
variável
em
relação
aos
fungicidas. O estudo das proteínas presentes
pode auxiliar no entendimento dos possíveis
mecanismos de antagonismo deste fungo, bem
como
as
possibilidades
de
descobrir
biomoléculas de interesse biotecnológico.
A extração protéica do micélio pode ser
realizada pela autólise, onde em condições
adversas de temperatura e pH ocorre uma
desordem no sistema enzimático levando ao
Introdução
ataque
indiscriminado
das
enzimas
degradativas, resultando na alteração da
O Trichoderma atroviride é um fungo com
integridade da parede celular, permitindo a
propriedades antimicrobianas muito utilizadas
solubilização e liberação dos componentes
em pesquisas nesta área. Pode ser utilizado
intracelulares ao meio externo [3].
como antagonista de alguns fitopatógenos de
importância
econômica,
na
melhoria
A utilização do pH ácido ou alcalino para
da
acelerar processos de autólise de micélios de
germinação de sementes e no aumento do
fungos é estudada há décadas, com o objetivo
crescimento de plantas [1]. Papavizas [2] relata
de
1/5
obter
biomoléculas,
principalmente
aminoácidos, porém alguns processos de
quitina
e
outros
do
inoculo
de
Trichoderma
atroviride – A partir de tubo de ensaio com
autólise requerem tempo [4] [5].
A
Preparo
polissacarídeos
meio Agar Dextrose Batata (ABD) com T.
representam 90% da parede celular em fungos
atroviride,
filamentosos,
contra
inoculados com alça de platina no centro de
fatores ambientais, dissecação e pressão
placas de Petri contendo ABD estéril. O fungo
osmótica [6]. Entre esses polissacarídeos está
foi incubado por quatro dias a 25 °C em estufa
a β-glucana que tem sido utilizada nas
tipo B.O.D. Após crescimento, os fungos foram
indústrias de alimentos como estabilizante de
armazenados a 5 °C por 4 dias até momento de
espumas [7]. Estudos mais recentes têm
uso.
conferindo
proteção
pequenos
fragmentos
foram
utilizado enzimas para a autólise, porém ainda
Produção de micélios – A produção de
de custo relativamente elevado [8].
Desta forma, o presente trabalho teve como
micélios foi realizada segundo metodologia
efeitos de pH e
de Bonnarme et al. [9] modificada, para tal, o
temperatura na autólise do micélio de T.
meio foi constituído por solução de sais
atroviride para extração de proteína solúveis, e
adicionada de glucose e extrato de levedura,
posteriormente verificar possíveis aplicações.
conforme tabela 1.
Material e Métodos
Tabela 1: Meio de cultura para produção de micélios
Glicose
30,0g.L-1
NaNO3
0,6g.L-1
KH2PO4
1,0g.L-1
KCl
0,5g.L-1
MgSO4.7H2O
0,5g.L-1
CaCl2.6H2O
0,008g.L-1
ZnSO4.7H2O
0,001g.L-1
FeSO4.7H2O
0,01g.L-1
Peptona bacteriológica
2,0g.L-1
Extrato de Levedura
1,0g.L-1
Fonte: Bonnarme et al. (2007).
objetivo verificar os
Microrganismos – O fungo T. atroviride,
cepa IMI 206040, foi gentilmente cedido pelo
Dr.
Enrique
Biotecnologia
Galindo
da
do
Instituto
Universidade
de
Nacional
Autônoma de México. O fungo foi armazenado
em meio de cultura ágar batata dextrose (ABD)
até momento de uso.
O meio foi ajustado a pH 6,0 (HCl/ NaOH).
Meios de cultura – Agar Dextrose Batata
(ABD) esterilizado em autoclave 121 ºC
/15min. e vertidos a quente em placas de Petri
de 10 cm de diâmetro, para obtenção de
micélio para extração proteica.
Posteriormente, alíquotas foram transferidas
para recipientes onde ocorreu a incubação para
produção de micélios, respeitando a relação
volume total do recipiente/volume de trabalho
de 1:2. Seguiu- se com autoclavagem por 15
min a 121 °C e 1 atm. A cada 100 mL de
2/5
meio
estéril
foram
inoculados
células
não
rompidas.
Em
seguida, no
aproximadamente 15 fragmentos de dimensões
sobrenadante, foi determinado o teor de
0,5 cm x 0,5 cm de meio ABD contendo
proteínas solúveis de acordo com o método de
micélios de T. atroviride, sem presença de
Lowry
esporos, sendo em seguida incubados por 72
espectrofotométrica a 660nm, contra um
horas a 25 °C e agitação a 100 rpm.
branco de reagentes. O valor protéico foi
et
al.
[10],
com
leitura
Após o período de incubação, o meio
determinado por meio da relação entre a
contendo micélios foi filtrado sob vácuo
leitura obtida com a equação da reta
utilizando kitassato e funil de büchner com
desenvolvida com a proteína padrão de
papel de filtro comum. O micélio extraído foi
albumina bovina. Os resultados obtidos foram
utilizado para determinação de proteínas
transformados e apresentados em µg de
solúveis.
proteínas solúveis por mL.
Determinação de proteínas solúveis – Os
Resultados
micélios de T. atroviride utilizados foram
secos em estufa a 80 °C com circulação de ar,
A quantidade de proteína solúvel nos
para determinação de proteínas solúveis em
extratos líquidos dos autolisados em 48 horas é
base seca.
apresentada na Tabela 2.
Para determinar a melhor condição de
autólise e produção de proteínas solúveis, foi
Tabela 2. Produção de proteínas solúveis/mL
realizado experimento fatorial 22. Os fatores e
Níveis
Temperatura
(+1)
seus níveis utilizados foram: pH 4,5 (-1) e 6,5
Corrida
pH
(-1)
(+1) e temperatura 30 °C (-1) e 40 °C (+1).
1
4,5
30 °C
Proteínas/mL
(µg/ml)
1245,788
2
6,5
30 °C
1330,788
3
4,5
40 °C
1895,788
4
6,5
40 °C
2763,288
Cada corrida foi composta de erlenmeyer com
2,5 g de micélio de T. atroviride adicionados
de 8 mL de água destilada estéril com pH
correspondente.
Os
recipientes
foram
O experimento mostrou que na corrida 4 a
às
temperatura e pH elevados foram fatores
temperaturas determinadas por 48 horas.
importantes para uma maior eficiência em
Posteriormente os valores obtidos foram
extração de proteínas solúveis.
armazenados
em
estufas
reguladas
Por outro lado, é observado na equação (1)
transformados em base seca.
A amostra autolisada foi vertida em tubos
que o coeficiente da temperatura (520,62) é
de Falcon e centrifugadas a 10000 rpm/7min. a
mais que duas vezes maior que o do pH
25 °C, objetivando separação das paredes e/ou
(238,12) e da interação deles (195).
3/5
(Eq. 1):
temperatura de 40ºC e pH de 6,5 . Em análises
realizadas por Oliveira e Gómez [11], as
Y=1808,91+238,12.XpH+520,62.XT+195.XpH.XT
melhores condições para extração de proteínas
Onde: Y = resposta em proteínas/mL;
XpH = valor de pH;
XT = valor de temperatura;
XpH.XT = valor da interação
solúveis
da
cerevisiae
levedura
apresentam
Saccharomyces
uma
faixa
de
temperatura entre 49,0 e 51,0ºC e pH 3,8 a 5,0.
É importante ressaltar que processos de
Ou seja, a obtenção de proteínas/mL
depende muito mais da temperatura que do pH
otimização de autólise variam de acordo com a
fonte de obtenção de proteínas.
e da interação entre eles nas condições do
experimento em questão, que pode ser
observado na Figura 1, onde a região em
vermelho representa o efeito intenso da
temperatura sobre a extração de proteinas.
Conclusão
Estudos atuais mostram que tem crescido o
interesse de Trichoderma atroviride como
fonte de
pesquisa por sua propriedade
antogonista, bem como o estudo de obtenção
de biomoléculas a partir de biomassa de
fungos e leveduras.
Contudo, o presente estudo constatou que
há presença de proteínas solúveis no micélio
de T. atroviride nas variáveis estudadas,
demonstrando que é possível a obtenção de
proteínas a partir do micélio de T. atroviride.
A partir destes dados obtidos, pretende-se
quantificar proteínas presentes, principalmente
Figura 1. Efeito da temperatura e pH sobre o teor de
proteínas solúveis, no extrato líquido com 48 horas de
autólise.
possuem grande importância comercial, bem
como
Discussão
polissacarídeos
que
possam
estar
presentes em frações do micélio após autólise.
De acordo com os resultados obtidos neste
trabalho,
enzimas como quitinase e β-glucanases que
verificou-se
que
as
melhores
condições para a extração de proteínas
solúveis do micélio T. atroviride, foi em
4/5
Agradecimentos
Agradecemos à Fundação Araucária –
Programa Ações Afirmativas, pelo apoio sob a
forma de bolsas.
Referências
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