CONSERVAÇÃO DE GENES DO COMPLEXO TIM/TOM

CONSERVAÇÃO DE GENES DO COMPLEXO TIM/TOM ENTRE Oryza
sativa L. E Avena sativa L.
Mariana M. Kruger1, Solange F. da S. Silveira2, Railson S. dos Santos3,
Danyela C.S. Oliveira4, Camila Pegoraro; Cesar V. Rombaldi5, Antonio Costa
de Oliveira6
A aveia branca é um cereal de ampla aptidão agrícola, adequado para
consumo humano e animal, com potencialidades para a expansão de consumo
e cultivo. Apesar de seus atributos, ainda são poucos os investimentos em
biotecnologia destinados à aveia, quando em comparação a outras espécies
como trigo, arroz e milho.
Por apresentar um genoma pequeno de aproximadamente 390 Mb, alto
grau de sintenia com outros cereais e mapas físicos de alta densidade, o arroz
é considerado o organismo modelo entre as plantas da família Poaceae,
permitindo a transferência de informações genéticas importantes para estudos
de genômica estrutural e funcional entre as poáceas, além de beneficiar as
espécies menos favorecidas tecnologicamente como a aveia (IRGSP, 2005;
BRESOLIN, 2010).
Em plantas cultivadas, estresses bióticos e abióticos podem interferir no
seu crescimento e desenvolvimento normal. Eventos de devastação como o
alagamento e a submergência (anoxia) de plantas resultam na limitação da
produção de alimentos (FUKAO et al., 2011).
A mitocôndria é o centro de regulação da energia celular e do balanço
redox, e integra numerosas rotas metabólicas que são importantes na resposta
a adaptação condições ambientais extremas (SWEETLOVE et al., 2007).
Dentre as respostas podem ser observadas alterações na expressão gênica de
determinadas rotas. Danos nas membranas mitocondriais impedem a entrada
de proteínas codificadas pelo genoma nuclear, as quais tem funções vitais
nessa organela, levando a morte da planta.
A importação de proteínas para a mitocôndria envolve complexos de
proteínas formadas por sub-unidades localizadas nas membranas das
organelas (PEGORARO et al., 2012). Na mitocôndria, esses complexos são
chamados TIM/TOM, o qual é composto pela proteína translocon da membrana
externa da mitocôndria (TOM) e translocon da membrana interna da
mitocôndria (TIM) (NEUPERT, 1997). Em arroz, existem 24 locos para genes
codificadores das subunidades do complexo (TIM/TOM).
Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a conservabilidade e
possibilidade de transferência de informação de um grupo de genes do
complexo TIM/TOM entre arroz (Oryza sativa L.) e aveia (Avena sativa L.).
1
Bióloga, Doutoranda Agronomia/Fitomelhoramento – UFPel - [email protected]
Enga Agrônoma; Doutoranda Agronomia/Fitomelhoramento – UFPel - [email protected]
Eng. Agrônomo, Doutorando em Biotecnologia, no Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTEC) – UFPel –
[email protected]
4
Enga Agrônoma; Mestranda Agronomia/Fitomelhoramento – UFPel - [email protected]
5 Enga Agrônoma; Pós Doutoranda - Embrapa Uva e Vinho – [email protected]
6
Professor Titular, Depto. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial (DCTA) – UFPel - [email protected]
8
Professor Adjunto, Centro de Genômica e Fitomelhoramento (CGF) – UFPel - [email protected]
2
3
O estudo foi desenvolvido no Laboratório do Centro de Genômica e
Fitomelhoramento (CGF) da Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel” (FAEM),
Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Capão do Leão. Plântulas da cultivar
FAEM - Carlasul foram utilizadas neste estudo. Primeiramente as sementes
foram germinadas em papel filtro estéril umedecido com água ultrapura e
mantidas em câmara de germinação (BOD) a 26°C, com fotoperíodo de 16
horas e umidade relativa de 100% por 15 dias. A extração de DNA foi realizada
através do método CTAB.
Os primers (Erro! Fonte de referência não encontrada.), foram desenhados
obedecendo regras propostas pela Applied BiosystemsTM para síntese de
primers específicos para reações de qPCR, pertencentes ao genoma do arroz
foram obtidas no Banco de Dados RAP-DB (The Annotation Project)
(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/).
A PCR semiquantitativa realizada com o objetivo de avaliar a
conservabilidade dos genes utilizou o kit GoTaq® Green Master Mix
(Promega®), sendo as condições de amplificação as seguintes: Desnaturação
inicial (94ºC, durante 10 minutos); 40 ciclos (Desnaturação 94ºC, durante 30
segundos; Anelamento 60ºC, durante 45 segundos; Extensão 72ºC, durante 1
minuto e 30 segundos); Extensão final (72ºC, durante 7 minutos). Após a
amplificação, as amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose
(2%) a 100 V, 400 miliamperes por ~ 2horas. Para quantificar
aproximadamente o tamanho de cada amplicom, utilizou-se o marcador 1Kb
plus DNA Mass Ladder (Invitrogen).
De acordo com os resultados obtidos (Figura 1), pode-se observar que
há uma conservabilidade da famílias TIM/TOM entre as espécies de arroz e
aveia.
Com
exceção
dos
genes
TOM20Os01g0921600,
TIM17/22Os12g0514900 e TIM17/22Os04g056670 todos os demais genes
foram transferidos para a aveia. Esse resultados podem ser explicados pelo
fato, evidenciado pelo mapeamento genético, de que o conteúdo gênico, bem
como a ordem dos genes são largamente conservadas ao longo da história
evolutiva das gramíneas (MOORE et al., 1995; GALE e DEVOS, 1998).
Os
genes
TOM7Os01g0626300,
TOM7Os01g0732000
e
TOM10Os07g0243100 amplificaram em regiões específicas originando
amplicons com tamanhos correspondentes ao do arroz. Estes genes parecem
estar sob uma seleção positiva mais forte, o que os mantém como locos
simples.
Entretanto, para os demais genes verificou-se uma inespecificidade de
amplicação dos fragmentos. Em busca de especificidade, uma estratégia que
pode ser adotada é o incremento da temperatura da reação de PCR, o que
talvez seja eficiente para alguns dos genes estudados, como por exemplo para
o TIM17/22Os02g0672500, TIM17/22Os02g0717300 e TIM44Os07g0409700.
Contudo esta inespecificidade observada para alguns destes genes
pode ser devido a eventos de duplicações gênicas que podem ter ocorrido ao
longo da evolução da espécie. Genes duplicados podem evoluir para novas
funções, uma vez que a função original é mantida pela copia mais antiga
(neofuncionalização) (HITTINGER e CARROLL, 2007), ou então, pode manter
a mesma atividade do gene ancestral (subfuncionalização) (GALLEGO –
BARTOLOME et al 2010). Cabe salientar que o nível de ploidia é o triplo da
ploidia do arroz.
Os resultados obtidos confirmam a conservação e a ocorrência de
eventos de duplicação gênica. Constatou-se a viabilidade do uso de alguns
primers estudados, em aveia, o que pode viabilizar estudos de expressão
gênica referentes a importação de proteínas para as mitocôndrias, frente a
estresses.
Referências Bibliográficas
BRESOLIN, A.P.S. Caracterização morfológica e análise da expressão gênica
em arroz (Oryza sativa L.) sob estresse por ferro. 2010. 144f. Tese. (Doutorado
em Agronomia). Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal
de Pelotas, Pelotas.
INTERNATIONAL RICE GENOME SEQUENCING PROJECT (IRGSP). The
map-based sequence of the rice genome. Nature, v.1, n.7052, p.793-800, 2005.
FUKAO, et al., 2011. The Submergence Tolerance Regulator SUB1A Mediates
Crosstalk between Submergence and Drought Tolerance in Rice. The Plant
Cell, v.23, p.412-427.
GALLEGO-BARTOLOME J, et al., 2010. Transcriptional diversification and
functional conservation between DELLA proteins in Arabidopsis. Mol. Biol.
Evol. 27: 1247-1256.
NEUPERT, W. 1997. Protein import into mitochondria. Annual Review of
Biochemistry. v. 66, p. 863-917.
PEGORARO, C. 2012. Effects of hypoxia storage on gene transcript
accumulation during tomato fruit ripening. Brazilian Journal of Plant
Physiology, v. 24, p. 141-148.
SWEETLOVE, L.J. et al, 2007. The Mitochondrion: An Integration Point of
Cellular Metabolism and Signalling. Critical Reviews in Plant Sciences. v. 26,
p. 17-43.
Tabela 1. Sequências dos primers utilizados no estudo.
N°
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
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14
15
16
17
18
1
Gene
TOM7Os01g0626300
TOM7Os01g0732000
TOM7Os05G0583400
TOM20Os01g0921600
TOM10Os07g0243100
TOM10 Os03g0825400
TOM13Os04g0581300
TIM17/22Os02g0672500
TIM17/22Os02g0717300
TIM17/22Os03g0296300
TIM17/22Os03g0305600
TIM17/22Os04g0376100
TIM17/22Os03g04150
TIM17/22Os10g0519700
TIM17/22Os12g0514900
TIM17/22Os04g056670
TIM44Os07g0409700
TIC21Os06g0638100
2
3
4
5
6
Senso
GAAGCCGAAGCCCAAGGTCAA
CATCGCCCACGTGGTCCACT
TGCTCCACTTCCGCACGAG
GGACATGGGAGCGATGAGCG
GAAAGGTCAGCCGGTGAATGTG
TGGAGAAGGAGCAGATGTTCGG
ATGGACTCGTTCTCGTCGCCGT
CCTCGCCTTCCCCACCTCGTAC
GGGCTCATCCGGACGCTCAA
GGAGGAGATCAAGGGGCAGGAC
CGGCCTGGAGAAGAACTGGATG
TGGAAGGAGCGGATCTTGCTGC
TTCGGGAGGAAGGAGAAGC
CTGTTCCCGTCGGGATCCAA
CGCGAGGAGGAGGAAGGAGG
CAGCCGCGTCCTCAACCAGT
GGAGGGCAGGACACCATCCA
GCCATGCTCGCCCAGGTTAG
7
8
9
M
10
11
12
Antisenso
TGGTCCACGTGGTCCACTCCTT
GGCGGAGAAGGGGAAGGCTC
AGCGCAGGGGCCTCTGAGAG
ACCTTGGCGTTCTGGCATGC
TGCCAATCCAAACATCTGCTCC
CGACCCGGTACTCCATCTCCTT
TGAGATGCTCCGTGGACGCAGT
GCGAGGTGGGCAGGTCGTAGAG
ACGAGCTGCTCGACGCCGAT
ATGACTCCACTGACGACGCTGC
ATGAAGTAAGACTCCCGCGCGA
GAATCCAGCTCCGACCACACCG
AAGGATGGAATTGGAGGGCTGG
AGGGGTTGTACTTCCGGCGG
CTCAGCGTCGGTGGTGTCCC
GATCCCCACGAAGAGCAGCG
TGCTGGATCTCACGCAACCG
CAGAATCCCAGGGTGCCCAA
13
14
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16
17
Figura 1. Gel demonstrando a amplificação dos genes estudados.
1-TOM7Os01g0626300; 2-TOM7Os01g0732000; 3- TOM7Os05G0583400; 4TOM20Os01g0921600; 5-TOM10Os07g0243100;
6-TOM10 Os03g082540; 7TOM13Os04g0581300; 8-TIM17/22Os02g0672500; 9- TIM17/22Os02g071730; MMarcador
Low
Mass
Ladder;
10TIM17/22Os03g0296300;
11TIM17/22Os03g0305600; 12- TIM17/22Os04g0376100; 13- TIM17/22Os03g04150; 14TIM17/22Os10g0519700; 15- TIM17/22Os12g0514900; 16- TIM17/22Os04g056670;
17- TIM44Os07g0409700.